Luận văn Bước đầu xây dựng quy trình phát hiện aspergillus flavus sinh độc tố aflatoxin trên ngũ cốc bằng phương pháp phát quang

n. Đứng trên góc độ an toàn thực phẩm các nhà khoa học đều cho rằng tác nhân gây ngộ độc thực phẩm lớn nhất trong gạo và lạc là nấm mốc [4], [6], [7]. Lạc và các sản phẩm từ lạc chắn chắc là nơi phát triển ưa thích nhất của A. flavus. Không phải chỉ có duy nhất loài này, nhiều loài nấm khác thường đi kèm với nó, trong số này một số lớn loài cũng được xem là độc với súc vật : một số loài Fusarium trong đó có F. monoliforme, các loài Rhizopus, các loài Penicillium citrinum, P. purpurogenum...[4], [6], [7]. Lạc là một loại hạt có nước:7,4%, protein:28%, lipid: 44,5%, glucid: 15%...Các nhà khoa học cũng đã phân lập được ở trong lạc có một loài nấm độc Aspergillus flavus và thấy rằng các trường hợp ngộ độc trước đây đều liên quan đến nấm mốc độc đó. Nấm mốc độc này cũng có gặp ở trong một số ngũ cốc khác nhưng với lạc có thể là môi trường thuận lợi nhất cho nó phát triển. Nấm mốc khi xâm nhập vào trong lạc chúng phát triển làm cho lạc bị mốc xanh hoặc mốc vàng. Đặc biệt nấm mốc này sinh ra độc tố Aflatoxin [4], [6], [7]. Trong gạo có chứa các thành phần hoá học như ở gạo tám glucid: 82,2%, protein: 6,6%, nước:10%, lipid: 1,0%, chất khoáng: 0,4%, vitaminB1: 0,08%. Do đó GVHD: TS. LÝ THỊ THANH LOAN 8 TỔNG QUAN HVTH: VÕ THỊ THANH TRANG LUẬN VĂN THẠC SĨ đây là một môi trường rất thuận lợi cho nấm mốc xâm nhập và phát triển khi biện pháp bảo quản không hiệu quả. So với thóc, gạo không còn lớp vỏ trấu để bảo vệ, các chất dinh dưỡng ở lớp ngoài của gạo lại nhiều nên rất dễ bị nấm mốc phá hoại. Đặc biệt ở nước có khí hậu nóng ẩm, đây là một điều kiện tốt để cho nấm mốc sinh trưởng gây ảnh hưởng đến chất lượng của gạo. Các nhà khoa học đã phân lập được nhiều loài nấm mốc trên gạo, trong mỗi loài có nhiều chủng, nhưng có hai loài hay gặp nhất là Aspergillus và Penicilium [4], [6], [7]. 1.1.3. Độc tố aflatoxin do Aspergillus flavus sản sinh Tên Aflatoxin đã được dùng để gọi một hỗn hợp độc tố do Aspergillus flavus sinh ra trước khi bản chất phức tạp của mỗi hợp chất được biết rõ. Thực ra, Apergillus flavus chủ yếu sản sinh ra Aflatoxin B1 và các Aflatoxin khác có bản chất hóa học tương tự gọi là Aflatoxin G1, B2, G2. Trong khi hầu hết các chủng Aspergillus parasiticus đều sinh độc tố thì ở Aspergillus flavus sự sản sinh độc tố Aflatoxin thay đổi theo từng chủng. Mặt khác, nó còn phụ thuộc vào điều kiện xung quanh, sự sản sinh Aflatoxin là kết quả của sự tác động qua lại giữa genotype của chủng đó và điều kiện phát triển của nó [3]. 1.1.3.1. Các chủng sinh độc tố : Đã có một số lớn quan sát về tính chất ít nhiều sinh độc tố của nhiều chủng nấm khác nhau: những quan sát này tiến hành trên các cơ chất tự nhiên hoặc trong những điều kiện nuôi cấy nhất định. Một số tác giả ghi nhận được nhiều biến đổi quan trọng về mặt sinh độc tố tùy theo cơ chất, từ đó đã phân lập chủng Aspergillus flavus và tùy theo nguồn gốc địa lý: trong số 284 mẫu phân lập từ gạo ở Mỹ có 94% số chủng sinh độc tố, 86% đối với các mẫu phân lập từ lạc, và 71% cũng được phân lập từ lạc như ở Ixraen. Các chủng gốc vùng nhiệt đới có nhiều loài sinh độc tố hơn vùng ôn đới [3]. GVHD: TS. LÝ THỊ THANH LOAN 9 TỔNG QUAN HVTH: VÕ THỊ THANH TRANG LUẬN VĂN THẠC SĨ Ngoài ra, số lượng Aflatoxin sản sinh ra cũng thay đổi rất nhiều tùy theo các chủng, người ta đã tìm thấy điều này khi nuôi cấy chúng để so sánh trên cùng một cơ chất và trong những điều kiện như nhau. Người ta đã ghi lại những mức sản sinh từ một vài mg/kg đến 100, 200, 500, 1000 và thậm chí gần 2000 mg/kg cơ chất. Gần đây hơn, ngoài việc định lượng tổng số Aflatoxin, người ta còn quan tâm xác định tỷ lệ riêng phần của các Aflatoxin đã biết. Nói chung, Aflatoxin B1 được tạo ra nhiều nhất trong cả thiên nhiên lẫn trong nuôi cấy, rồi đến Aflatoxin G1, sau đó là Aflatoxin B2, còn về G2 và các chất khác tỷ lệ thấy khá thấp [3]. Người ta đã thử nhận dạng các chủng sinh độc tố và các chủng không sinh độc tố qua những đặc điểm hình thái. Một số người cho rằng các chủng sinh độc tố bao giờ cũng có đầu bào tử đính màu xanh lục, ngay cả ở các giống nuôi cấy lâu ngày, thể bình hai lớp, cuống bào tử đính có vách có gai, ở những chủng sinh độc tố có sự phình to một số phần của sợi nấm tạo thành những cục nhỏ, những dị thường đặc trưng cho các dòng sản sinh Aflatoxin. Tuy nhiên thường có lẻ rất khó thăm dò biết một cách chắc chắn những chủng có sinh Aflatoxin và những chủng không sinh Aflatoxin ngoài cách dùng con đường sinh học và hóa học [3]. 1.1.3.2. Cơ chất và các điều kiện xung quanh để các chủng A. flavus sản sinh aflatoxin : Các chủng phát triển trên hạt có dầu và nhất là trên lạc và những sản phẩm từ lạc được ghi nhận sinh đôc tố nhiều hơn các chủng phân lập từ sản phẩm ngũ cốc ở các nước thuộc địa. Các chủng phân lập từ thịt ôi, bánh mì, các thực phẩm bột sống hoặc pho mát ô nhiễm tự nhiên thường không hoặc ít sinh độc tố. Ngược lại, gần một phần ba số chủng phân lập từ gia vị có sản sinh Aflatoxin [3]. Tính độc của một số chủng được giảm độc tính nếu sau này các chất độc của chúng được những vi sinh vật khác chuyển hóa thành những chất dẫn xuất không hoạt động. Chính vì vậy ở Texas, người ta rất ngạc nhiên khi thấy lạc có vỏ nhiễm Aspergillus flavus rất nặng nhưng lại có độ độc thấp. Nghiên cứu các củ lạc đó, thì phát hiện có những loài vi khuẩn và nấm có khả năng hoặc ức chế sự hình thành các Aflatoxin hoặc biến đổi những Aflatoxin được sản sinh ra thành những chất ít độc GVHD: TS. LÝ THỊ THANH LOAN 10 TỔNG QUAN HVTH: VÕ THỊ THANH TRANG LUẬN VĂN THẠC SĨ hơn. Người ta đã dựa trên hiện tượng này để tìm tòi một biện pháp sinh học nhằm tẩy độc các sản vật đã bị hư hỏng [3]. Sản lượng Aflatoxin thường tỷ lệ với trọng lượng hệ sợi nấm tạo thành khi nuôi cấy: khi số lượng hệ sợi nấm đạt trị số tối ưu thì sản lượng đó lớn nhất, nhưng nó giảm sút rất nhanh chóng bắt đầu từ lúc hệ sợi nấm tự phân giải: sự phân giải này tương ứng với sự phân hủy các Aflatoxin, được đẩy mạnh khi thông khí tốt và lắc mạnh các bình nuôi cấy [3]. Nhìn chung, sự sản xuất Aflatoxin, trong điều kiện nuôi cấy thông thường, bắt đầu từ lúc hình thành các cơ quan mang bào tử đính của Aspergillus flavus, nó tăng dần cho đến giai đoạn sinh bào tử mạnh mẻ, tức là khoảng ngày thứ 6 rồi giảm sút [3]. Nhiều yếu tố vật lý và dinh dưỡng khác cũng ảnh hưởng đến hàm lượng Aflatoxin được sinh ra trong điều kiện nuôi cấy và điều kiện tư nhiên. Những biến thiên về nhiệt độ có thể thấy trong thiên nhiên, với nhiêt độ ở các đỉnh cao là 45- 50oC cho thấy không thuận lợi cho việc sản sinh Aflatoxin bằng nhiệt độ ổn định ở 25oC [3]. Hàm lượng nước của cơ chất có vai trò trong việc sản sinh Aflatoxin, gắn liền với sự phát triển tương đối của A. flavus, ở 32oC trên lạc có hàm lượng nước trong khoảng 15 và 30% Aflatoxin hình thành sau 2 ngày. Như vậy, trong điều kiện nhiệt đới, nếu A. flavus phát triển trên lạc không có Aflatoxin thì 48h sau có thể phát hiện được Aflatoxin. Trên gạo có hàm lượng nước 24-26% hoặc trên ngô 19- 24%, Aflatoxin cũng hình thành nhanh chóng như vậy nếu nhiệt độ khá ấm [3]. Giá trị pH ban đầu có ảnh hưởng rất ít đến sự hình thành Aflatoxin. Giá trị pH thích hợp để A. flavus sinh độc tố aflatoxin ở giá trị pH giữa 4-5. Hàm lượng khí cacbonic tăng lên trong khí quyển làm hạn chế sự sinh trưởng của A. flavus do đó giảm lượng Aflatoxin sinh ra, giảm hàm lượng oxi và tăng hàm lượng nitơ trong khí quyển hàm lượng Aflatoxin cũng giảm [3]. Các Aflatoxin được xem là nhạy cảm với ánh sáng, nhưng thực tế chúng nhạy cảm với tia tử ngoại [3]. GVHD: TS. LÝ THỊ THANH LOAN 11 TỔNG QUAN HVTH: VÕ THỊ THANH TRANG LUẬN VĂN THẠC SĨ Người ta đã tiến hành nhiều công trình nghiên cứu về tầm quan trọng của các yếu tố dinh dưỡng khác nhau lên sản lượng Aflatoxin thể hiện qua các điều kiện nuôi cấy khác nhau [3]: Bảng 1.1 Ảnh hưởng của chủng A. flavus và các điều kiện nuôi cấy để sản sinh ra Aflatoxin Số lượng so sánh (% các Aflatoxin) Chủng Môi trường nuôi cấy Tổng lượng Aflatoxin (mg/l hoặc mg/kg) B1 B2 G1 G2 ATCC 15517 Tổng hợp 45 87 4 9 <1 Chưa xác định Lạc 265 44 1 54 1 Chưa xác định Lạc 14 98 2 0 0 NRRL 2999 Lúa mì 870 35 9 48 7 NRRL 2999 Lúa mì + metionin 1700 44 11 38 7 NRRL 2999 Gạo ? 23,8 6,3 6,8 0,9 NRRL 3000 Sacarose + các acid amin (nuôi cấy chìm) 72h ở 20oC 86 26 0 74 0 NRRL 3000 -Nt- ở 25oC 154 70 0 30 0 Ghi chú: ATCC, NRRL : ký hiệu của bộ sưu tập chủng chuẩn GVHD: TS. LÝ THỊ THANH LOAN 12 TỔNG QUAN HVTH: VÕ THỊ THANH TRANG LUẬN VĂN THẠC SĨ Nguồn Cacbon : Nhiều tác giả đã nghiên cứu ảnh hưởng của việc thêm các đường hexose vào môi trường nuôi cấy chất khoáng lên hàm lượng Aflatoxin do A. flavus sinh ra và ghi nhận các đường glucose, fructose, manose thuận lợi cho sự tổng hợp Aflatoxin [3]. Bảng 1.2. Ảnh hưởng của các đường hexose khác nhau lên lượng Aflatoxin sinh ra. Nồng độ Glucid 1% 3% D glucose +++ +++ D manose +++ +++ D fructose +++ +++ D galactose - ++ D gulose - 0 D arabinose - - D xylose + ++ D ribose - + D eritrose - 0 D glyceraldehyde +++ +++ Ghi chú: Số dấu + chỉ lượng aflatoxin nhiều hay ít, dấu – chỉ không có, số O là không thí nghiệm GVHD: TS. LÝ THỊ THANH LOAN 13 TỔNG QUAN HVTH: VÕ THỊ THANH TRANG LUẬN VĂN THẠC SĨ Nguồn đạm [3]: Sản lượng Aflatoxin cao nhất thu được trên môi trường có tính chất nấm men hoặc có peptone hoăc tốt hơn nữa là có acid amin trong đó glycin hoặc glutamat, alanin và acid aspartic thì kém hơn một ít. Tiamin và các vitamin nhóm B kích thích sự tổng hợp các Aflatoxin. Các ion kim loại [3]: Sự có mặt của kẽm, catmi, magie hoặc sắt kích thích sự sản sinh Aflatoxin, coban, crom, canxi, mangan chỉ có ít hiệu lực. Thêm 3,9 μmol Bari acetate thì sự tạo thành Aflatoxin bị ức chế. 1.1.4. Biện pháp phòng ngừa đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm: Nước ta có khí hậu nóng ẩm mưa nhiều, đây là một điều kiện thuận lợi để cho nấm mốc xâm nhập và phát triển gây hại nông sản thực phẩm nói chung và gây hại đến gạo, lạc nói riêng. Chúng có khả năng phát triển tốt ở trong các thực phẩm có độ ẩm trên 10%, đồng thời có khả năng sản sinh ra độc tố gây bệnh. Cũng chính từ đây chúng sẽ lây nhiễm sang người ăn và gây cho người những căn bệnh hiểm nghèo. Để hạn chế và loại trừ nấm mốc ra khỏi gạo, lạc cần phải có biện pháp kiểm soát, bảo quản hữu hiệu từ giống, phân bón, đồng ruộng, thu hoạch, vận chuyển, bảo quản, chế biến…[4], [6], [7]. Chúng ta biết nấm mốc hiện diện ở rất nhiều nơi, vì thế trong lương thực thực phẩm, thức ăn gia súc hầu như bào tử nấm mốc đều ở tư thế sẵn sàng chờ "cơ hội", chúng phát triển mạnh nếu có độ ẩm, nhiệt độ môi trường thích hợp. GVHD: TS. LÝ THỊ THANH LOAN 14 TỔNG QUAN HVTH: VÕ THỊ THANH TRANG LUẬN VĂN THẠC SĨ • Những giải pháp phòng và chống độc tố nấm mốc: [2] 9 Kiểm tra, khống chế độ ẩm và nhiệt độ thích hợp trong quá trình dự trữ nguyên liệu: Phải sấy khô nguyên liệu trước khi đưa vào kho dự trữ. Muốn nguyên liệu tốt, chúng ta cần có những qui định tình trạng của từng loại hạt trong điều kiện dự trữ cụ thể. Luôn luôn có sự cân bằng giữa độ ẩm không khí và độ ẩm nguyên liệu, cân bằng này thay đổi khi nhiệt độ môi trường thay đổi. Mức phổ biến nhất cho hạt dự trữ an toàn là 13% ẩm độ. 9 Kiểm soát và trừ khử côn trùng, sâu mọt trong kho: Người ta nhận thấy có mối liên hệ giữa sự phá hại của sâu mọt, côn trùng trong nguyên liệu và sự phát triển nấm mốc. Điều này có thể giải thích bởi 2 lý do: ¾ Hoạt động trao đổi chất của côn trùng, sử dụng chất hữu cơ trong nguyên liệu, hô hấp sinh ra nước làm cho môi trường trữ thức ăn ngày càng ẩm thêm, tạo điều kiện thuận lợi cho nấm mốc phát triển. ¾ Côn trùng sâu mọt đục khoét hạt, di chuyển trong nguyên liệu mang trên mình nó những bào tử nấm phát tán nhanh trong nguyên liệu. Theo tài liệu FAO (1979) thì côn trùng sâu mọt có thể làm tăng sự phát triển của nấm mốc lên từ 10 - 30%. 9 Sử dụng hóa chất để phòng chống nấm mốc xâm nhập vào thức ăn: Có nhiều chất hóa học khác nhau có thể khống chế sự nhiễm nấm mốc trong thức ăn. Hợp chất tương đối an toàn không độc hại và có hiệu lực ngăn chặn sự phát triển nấm mốc trong thức ăn là acid propionic và các muối của nó. Theo tài liệu FAO Rome (1979) thì hợp chất này ngăn chặn nấm mốc cho kết quả đầy hứa hẹn. GVHD: TS. LÝ THỊ THANH LOAN 15 TỔNG QUAN HVTH: VÕ THỊ THANH TRANG LUẬN VĂN THẠC SĨ 9 Làm mất hiệu lực aflatoxin bởi ammoniac (NH3): Sự khử độc bằng ammoniac dưới áp suất cao đã được Dollear và Gardner (1966) thực hiện ở áp suất 1,5 - 3 bars để khử độc bánh dầu phộng và bánh dầu hạt bông. Sự phá hủy gần như hoàn toàn Aflatoxin trên đậu phộng được thực hiện trên hạt bông và phương pháp này đã được ứng dụng ở Mỹ năm 1969 như là một phương pháp xử lý bánh dầu, bông vải. Ở Pháp kỹ thuật này được thử trên bánh dầu phộng từ năm 1972 bởi Prevol. Tuy nhiên phương pháp xử lý này làm tổn hại đến acid amin chứa lưu huỳnh trong thức ăn. 9 Làm mất hiệu lực aflatoxin bởi chất hấp phụ bề mặt: Một giải pháp khác ít tốn kém hơn mà cũng có thể cho kết quả tốt, đó là việc sử dụng các chất hấp phụ để kết dính độc tố loại thải ra ngoài theo phân, làm giảm thiểu tính độc hại của chúng đối với cơ thể. Nếu thức ăn thường xuyên bị nhiễm độc tố nấm mốc mà không có điều kiện phân tích kiểm tra thì nên sử dụng chất hấp phụ kết dính độc tố là giải pháp dễ thực hiện và cũng có hiệu quả. Có thể lên men các sản phẩm sau thu hoạch theo nguyên lý ức chế các vi sinh vật khác có thể ức chế sinh tổng hợp Aflatoxin hay hấp thu Aflatoxin. Có thể dùng các tác nhân vật lý như các tia gamma, tia cực tím và các tác nhân hóa học để chiết tách hay làm thay đổi cấu tạo phân tử của mycotoxin. Tuy nhiên các phương pháp này có những hạn chế vì xử lý Aflatoxin kém hiệu quả kinh tế vì chi phí lớn [3]. GVHD: TS. LÝ THỊ THANH LOAN 16 TỔNG QUAN HVTH: VÕ THỊ THANH TRANG LUẬN VĂN THẠC SĨ 1.2. Tổng quan về Aflatoxin 1.2.1. Lịch sử phát hiện aflatoxin [8]: Vào năm 1960, nghề nuôi gia cầm ở nước Anh bị tổn thất rất nặng nề, lúc đầu hơn 10.000 gà tây chết vì một bệnh mới gọi là « bệnh gà tây X» (Turkey X disease). Sau đó, các loại gia cầm khác như vịt, gà lôi cũng bị nhiễm bệnh và chết rất nhiều. Qua điều tra người ta xác định được bệnh đó có liên quan đến một loại độc tố do nấm có trong thức ăn sinh ra. Đến năm 1961, người ta đã tìm ra bản chất hoá học của chất này là Aflatoxin do vi nấm Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus. Aflatoxin có 4 dẫn xuất quan trọng là AFB1, AFB2, AFG1, AFG2. Giữa 4 loại trên thì Aflatoxin B1 chiếm nhiều nhất trong nông sản và gây tác hại nhiều nhất, gây ngộ độc nhanh nhất và phổ biến nhất (Nabil Saad, 2004). Năm 1961, các công trình nghiên cứu công nhận rằng Aflatoxin được sinh ra bởi nấm Aspergillus flavus và có thể là nguyên nhân gây ra khối u gan của động vật (Dollar et al, 1967 ; Sanchehez, 1994). Từ đó trở đi có nhiều công trình nghiên cứu về độc tố Aflatoxin. Các nhà khoa học cũng đã xác định được công thức phân tử và công thức cấu tạo của Aflatoxin : 1.2.2. Công thức cấu tạo và một số tính chất lý hoá của Aflatoxin [8] Công thức phân tử của 4 loại Aflatoxin (AFB1, AFB2, AFG1, AFG2): • AFB1 : C17H12O6 • AFB2 : C17H14O6 • AFG1 : C17H12O7 • AFG2 : C17H14O7 Trong đó, AFB2 và AFG2 là dẫn xuất dihydroxy của B1 và G1 (Victoria, 2001: Nabil Saad, 2004) Ngoài 4 loại trên, Aflatoxin còn có thêm hai sản phẩm trao đổi chất là Aflatoxin M1 và M2. M1 là 4-hydroxy Aflatoxin B1 và M2 là 4-hydroxy Aflatoxin B2. GVHD: TS. LÝ THỊ THANH LOAN 17 TỔNG QUAN HVTH: VÕ THỊ THANH TRANG LUẬN VĂN THẠC SĨ Công thức cấu tạo của 4 loại aflatoxin như sau: Hình 1.4. Công thức cấu tạo hoá học của AFB1, AFB2, AFG1 và AFG2 (Vitoria, 2001) Tính chất lý học của các loại Aflatoxin: AFB1: có điểm nóng chảy 268-269oC, có màu xanh lam trên đèn huỳnh quang AFB2: có điểm nóng chảy 286-289oC, có màu xanh lam trên đèn huỳnh quang AFG1: có điểm nóng chảy 244-246oC, có màu xanh lục trên đèn huỳnh quang AFG2: có điểm nóng chảy 229-231oC, có màu xanh lục trên đèn huỳnh quang (Aflatoxin Home Page) 1.2.3. Sự hiện diện và phát triển của Aflatoxin B1 trong tự nhiên: Aflatoxin thường xuất hiện trong các sản phẩm nông nghiệp trên cánh đồng trước khi thu hoạch hoặc sau khi thu hoạch nếu sản phẩm không được phơi khô ngay hay ẩm độ trong sản phẩm cao tạo điều kiện cho nấm mốc phát triển. Trong điều kiện bảo quản không tốt, sản phẩm bị sâu bọ hoặc các loài gặm nhấm đục khoét cũng là điều kiện thuận lợi làm cho sản phẩm bị nhiễm Aflatoxin. Đôi khi sữa, trứng, thịt cũng bị phát hiện có Aflatoxin do động vật đã ăn những loại thức ăn bị nhiễm Aflatoxin. Các sản phẩm thường có nguy cơ bị nhiễm Aflatoxin cao nhất GVHD: TS. LÝ THỊ THANH LOAN 18 TỔNG QUAN HVTH: VÕ THỊ THANH TRANG LUẬN VĂN THẠC SĨ là bắp, đậu phộng và hạt bông (Nabil Saad, 2004). Theo hagazy (1988), ở Ai Cập 32% số ngũ cốc và 6% số loại bột cá đem kiểm nghiệm bị nhiễm Aflatoxin từ 1- 50ppb; 8% số ngũ cốc và 16% số loại bột cá bị nhiễm từ 201-2000ppb (trích dẫn bởi Diab et al, 2000). Ở Indonesia, người ta cũng đã điều tra phát hiện Aflatoxin ở đậu từ 40 – 4100 ppb và tỷ lệ đậu nhiễm nấm chiếm từ 60-80%, ở bắp là 5,3-291,11 ppb (Sudjadi et al, 1999). Theo Bhatti et al, (2001), trong 3320 mẫu nguyên liệu có nguồn gốc động vật, thực vật ở Pakistan được kiểm nghiệm đều có chứa Aflatoxin B1 (AFB1) với hàm lượng thấp nhất là 13 ppb và cao nhất là 78 ppb. Hầu hết các mẫu cám gạo, cám lúa mì, bột bắp, bột cá, bột hướng dương, bột đậu nành và bột hạt bông đều có hàm lượng AFB1 cao hơn mức khuyến cáo (20 ppb) của tổ chức FDA (Food and Drug Administration, Hoa Kỳ ) [8]. Aflatoxin cũng có thể hiện diện trong các loài thực phẩm chế biến, đặc biệt là các sản phẩm từ bắp. Tuy nhiên, các nhà sản xuất cũng có những phương pháp thích hợp nhằm hạn chế tối đa loại độc tố này. Những sản phẩm từ sữa bột, phomai, sữa chua đôi khi cũng phát hiện có Aflatoxin [8]. Nấm mốc sinh ra độc tố thường phát triển trong điều kiện tự nhiên ở những quốc gia vùng nhiệt đới. Điều kiện dự trữ thức ăn và nguyên liệu thức ăn không thích hợp khi nhiệt độ môi trường trên 27oC, độ ẩm môi trường lớn hơn 62% và độ ẩm trong thức ăn lớn hơn 14% (Juli-Anne and Yanong, 1995; Diab, 2000; Nabil Saad, 2004) và sự sâm nhập của sâu bọ...là những nhân tố quan trọng nhất để nấm mốc phát triển và sinh ra độc tố Aflatoxin [8]. Những phương pháp chế biến thông thường không làm giảm Aflatoxin trong thức ăn do phân tử Aflatoxin rất bền với nhiệt, Aflatoxin chỉ bị nóng chảy ở nhiệt độ rất cao, trên 250oC (Gayatri, 2000) [8]. GVHD: TS. LÝ THỊ THANH LOAN 19 TỔNG QUAN HVTH: VÕ THỊ THANH TRANG LUẬN VĂN THẠC SĨ 1.2.4. Tác hại của Aflatoxin: * Tính chất gây ung thư của các u gan liên quan đến các Aflatoxin [3]: Vấn đề được đặt ra là tìm hiểu các u gan do Aflatoxin gây ra có bản chất ung thư thật không. Theo định nghĩa, các đặc điểm của ung thư là phải mang những tính chất vô tổ chức, thâm nhiễm và có di căn. Một sự tăng sinh bất bình thường các tế bào có thể dẫn đến hoặc là một u lành, gồm những tế bào giống hệt nhau, không có tính chất tràn lấn hoặc là một u ác tính gồm những tế bào tăng sinh vô tổ chức, tế bào này phát triển hơn tế bào kia, gạt các tế bào bên cạnh ra, thâm nhiễm vào tận các tổ chức bên cạnh, ngoài ra từ trung tâm chính có những tế bào tách ra, mượn đường các mạch máu và mạch limpho, tràn lấn các tuyến và tạo nên những trung tâm mới (gan, xương...). Trường hợp ung thư gan việc chẩn đoán sẽ dễ dàng nếu khối u có những di căn, hoặc có thể cấy sang một cơ quan khác. Khi thiếu 2 tiêu chuẩn đó, thì phải dùng các tiêu chuẩn nhìn mắt thường và qua kính hiển vi. Trước hết, về kích thước, người ta đề nghị một hòn nhỏ phải có đường kính tối thiểu là 1cm, khó mà khẳng định là có ung thư hay không khi các hòn nhỏ trong gan bé hơn thế nhiều. Sau đó phải xuất huyết và hoại tử. Về mặt mô học phải quan sát thấy một sự xâm nhập khu vực, một sự biến hình tế bào, sự mất tính phân cực và nhiều dạng gián phân. Kiểu tổn thương này đã được gọi là u gan. Ở đây có chỗ dễ nhầm lẫn bởi vì trong khi một số tác giả dành thuật ngữ này cho các u gan ác tính thì số khác lại dùng nó cho các tổn thương gan lành. * So sánh với tác động của Aflatoxin với những chất gây ung thư gan khác [3]: Các tổn thương do các Aflatoxin (với liều lượng 3-4 mg/kg) về nhiều mặt, gần gũi với các tổn thương và những chất gây ung thư gan quen thuộc khác gây nên. Ngoài sự tăng sinh các tế bào nhu mô lớn, chứng xơ hóa do các tác động của các Aflatoxin cũng giống chứng xơ hóa mà người ta đã thấy ở các ung thư khác. GVHD: TS. LÝ THỊ THANH LOAN 20 TỔNG QUAN HVTH: VÕ THỊ THANH TRANG LUẬN VĂN THẠC SĨ Do tác dụng của 4-dimetylaminoazobenzen, người ta thấy ở giai đoạn đầu của thể ác tính có sự tăng sinh hệ thống mật, những hòn nhỏ tái sinh và một vài tế bào nhu mô lớn. Nếu đem so sánh các biến đổi đó với các biến đổi do các tác nhân khác độc với gan gây ra: • Dưới tác động của cacbontetraclorua, những biến đổi mô học nhanh chóng diễn ra, 18 giờ sau khi nhiễm độc, đã thấy rõ các vết hoại tử chúng ở trung tâm tiểu thùy (chứ không ở ngoại vi). Các tổn thương đó không làm rối loạn kiến trúc ở gan. • Chất dimetyl-nitrozamin (DMN) cũng gây những tổn thương ở trung tâm tiểu thùy, đặc trưng bởi những điểm hoại tử chảy máu, xảy ra vài giờ sau khi có tác động của tác nhân gây độc. Người ta đã chứng minh rằng, chất DMN tác động như là một chất ankyl hóa: khi nhiễm độc mãn tính nó gây ra ung thư mạnh. • Chất xiacin chiết từ hạt cây tuế Cycas circinalis, cũng có khả năng gây ung thư gan khi nhiễm độc mãn tính. Khi nhiễm độc cấp tính nó gây ra những tổn thương ở tiểu thùy rất giống các tổn thương của DMN cũng là những khối u ở thận • Các ancaloit của cỏ lưỡi chó Senecio, như chất laziocacpin và chất retrocxin gây ra ở chuột, khi nhiễm độc cấp tính hoại tử giữa tiểu thùy, nhưng khi liều lượng đổi đi một chút thì gan không thể trở lại trạng thái bình thường. • Tất cả những tác nhân độc với gan đều gây ra những biến đổi ở giữa tiểu thùy. Tuy nhiên một số khá ít chất gây hoại tử quanh cửa như các hoại tử thu được với Aflatoxin. Các rượu alylic, chất mangan, chất photpho thuộc loại đó nhưng chưa chứng minh được là chất gây ung thư. • Trong những tổn thương gan do chất spordesmin gây ra, người ta thấy tăng tính thấm nước ở mao mạch: Aflatoxin có tính chất tương tự nhưng cho đến lúc này Aflatoxin vẫn chưa được cho là chất gây ung thư. GVHD: TS. LÝ THỊ THANH LOAN 21 TỔNG QUAN HVTH: VÕ THỊ THANH TRANG LUẬN VĂN THẠC SĨ * Kết luận về khả năng gây ung thư của các Aflatoxin [3]: Tất cả các chất gây ung thư đều sản sinh ra cùng một dạng khối u. Với Aflatoxin gây bệnh chủ yếu trên tế bào gan ít nhiều có phân hóa, có sinh những di căn và thỉnh thoảng có ung thư túi mật, cũng có di căn. Trong một số trường hợp những di căn như vậy có thể lan tới phổi. Có thể thấy trong khối u đủ mọi loại tế bào, từ những tế bào nhu mô phân hóa rõ rệt qua các ung thư túi mật đến những ung thư giảm biệt hóa. Aflatoxin là một trong những chất gây ung thư mạnh nhất tác động qua đường miệng. Nếu hấp thu một tổng lượng 2,5mg Aflatoxin trong thời gian 89 ngày sẽ đưa đến ung thư gan sau hơn một năm. Nếu so sánh các liều lượng có thề hình thành ung thư trong những điều kiện giống hệt như nhau người ta thấy rằng một liều Aflatoxin ít hơn 1000 lần so với chất nhuộm màu azoic đã đủ để gây ung thư. Những người Bantou, ở Transvaal, ở Swaziland và ở khắp vùng Nam phi nơi mà người ta ăn nhiều lạc có mốc A. flavus con số ung thư gan rất lớn. Những điều quan sát thấy ở Mazambic và ở Uganda lại còn đáng lo ngại hơn: người ta đã ghi nhận các trường hợp ung thư gan ở Mazambic còn nhiều hơn ở Hoa Kỳ đến 58 lần. Mỗi năm cứ 100000 người dân các nước như Hà Lan, Na uy hoặc Canada thì có một người ung thư gan còn ở Bantou cứ 103,8 người, ở Nam Phi 19,2 người, ở Nigieria 9,8 người và ở Hawai 9,7 người thì có một người bị ung thư gan. Năm 1970, ở Uganda một thanh niên người Phi bị chết : anh ta bị phù phổi to tim và bị hoại tử giữa tiểu thùy khuếch tán ở gan. Đó là triệu chứng thường gặp trong các trường hợp bệnh do độc tố Aflatoxin, đồng thời các người trong gia đình cũng bị đau bụng dữ đội mà thực phẩm chủ yếu của họ là sắn có chứa tới 1,7mg/kg Aflatoxin. GVHD: TS. LÝ THỊ THANH LOAN 22 TỔNG QUAN HVTH: VÕ THỊ THANH TRANG LUẬN VĂN THẠC SĨ * Các ảnh hưởng về mặt hóa sinh học của các Aflatoxin [3]: Nhiều công trình nghiên cứu đã được tiến hành nhằm làm sáng tỏ phương thức tác động hóa sinh tác động lên các thành phần cấu tạo tế bào và nhất là lên các chất nucleic acid và lên sự chuyển hóa các protein . Tác động của Aflatoxin B1 giống với chất actimomicin D. Aflatoxin có thể coi là một chất ức chế các quá trình sinh tổng hợp : liều lượng cao có thể gây ức chế hoàn toàn nhưng liều lượng nhẹ có thể cho những kết quả tiệm tiến. Các giai đoạn kế tiếp nhau của tác động hóa sinh học của Aflatoxin ở các tế bào gan mà mỗi giai đoạn là kết quả của giai đoạn trước. • Tác động qua lại với các DNA và ức chế các polymerase chịu trách nhiệm tổng hợp DNA và RNA. • Đình chỉ sự tổng hợp DNA • Tiêu giàm sự tổng hợp RNA và ức chế RNA truyền tin • Xuất hiện những hình thái hạt nhân • Giảm bớt sự tổng hợp protein * Triệu chứng khi vật nuôi bị ngộ độc nấm mốc cùng với một số biện pháp phòng ngừa ngộ độc nấm mốc thức ăn trong chăn nuôi gia súc, gia cầm. Thức ăn sử dụng trong chăn nuôi, nếu có nấm mốc sẽ để lại hậu quả không nhỏ, gây tổn thất về kinh tế cho người chăn nuôi. A. flavus phát triển mạnh trên các thức ăn giàu đạm thực vật, nhất là các loại thức ăn giàu đạm thức vật như lạc, đỗ tương… và còn thấy nhiều ở ngô, cám gạo. Trong quá trình phát triển, chúng sản sinh ra độc tố Aflatoxin M, Aflatoxin B1 gây suy thoái miễn dịch, ngăn cản sự sản sinh kháng thể. Vì vậy, ở các cơ sở chăn nuôi gà, nếu sử dụng thức ăn có nhiễm độc tố này, chắc chắn sẽ xảy ra dịch bệnh truyền nhiễm mặc dù đã tiêm phòng tốt các loại vacxin đó. GVHD: TS. LÝ THỊ THANH LOAN 23 TỔNG QUAN HVTH: VÕ THỊ THANH TRANG LUẬN VĂN THẠC SĨ Sự mẫn cảm của Aflatoxin đối với từng loài rất khác nhau và được chia làm ba nhóm sau: • Mẫn cảm nhất: vịt, gà tây. Hàm lượng Aflatoxin nhỏ hơn 1ppm (phần triệu) trong thức ăn hàng ngày đã gây ngộ độc • Mẫn cảm vừa: bò, lợn và gia cầm khác. Hàm lượng Aflatoxin xấp xỉ 10ppm trong thức ăn hàng ngày sẽ gây ngộ độc. • Mẫn cảm ít: cừu. Hàm lượng Aflatoxin lớn hơn 10ppm trong thức ăn hàng ngày mới gây ngộ độc. Đáng chú ý có bê, chỉ cần hàm lượng 2ppm đã gây ngộ độc. Đặc biệt, gia súc non rất dễ bị ngộ độc do bú sữa. Ngộ độc Aflatoxin được chia làm hai thể sau: • Thể cấp tính: Gan biến đổi, màu nhạt, hoại tử, xuất huyết, … và viêm cầu thận nặng. • Thể mạn tính: Con vật bỏ ăn, chậm lớn, gầy yếu, lông xơ xác. Mổ khám thấy gan biến đổi nặng nhất như: xơ gan, có các khối u hoặc gan nhiễm mỡ, thoái hóa, xuất huyết, hoại tử. Không có phương pháp điều trị đặc biệt cho gia súc, gia cầm bị ngộ độc độc tố do loại nấm này sinh ra, vì vậy điều quan trọng là cần chú ý loại bỏ thức ăn bị mốc có chứa Aflatoxin. GVHD: TS. LÝ THỊ THANH LOAN 24 TỔNG QUAN HVTH: VÕ THỊ THANH TRANG LUẬN VĂN THẠC SĨ 1.2.5. Mức cho phép tối đa của các loại độc tố trong thức ăn chăn nuôi [2]: 9 Những qui định của Việt nam: Qui định về độc tố Aflatoxin B1 và Aflatoxin tổng số của Việt Nam do Bộ nông nghiệp và phát triển nông thôn ký ngày 31/10/2001, Số 104/2001/QĐ/BNN như sau: Bảng 1.3. Qui định hàm lượng tối đa độc tô nấm mốc Aflatoxin B1 và tổng hàm lượng các Aflatoxin (B1+B2+G1+G2) được tính bằng mg trong 1 kg thức ăn hỗn hợp hoàn chỉnh cho gia súc gia cầm (ppb): Loại vật nuôi Aflatoxin B1 (ppb) Tổng số các Aflatoxin (ppb) Gà con từ 1-28 ngày tuổi ≤ 20 ≤ 30 Nhóm gà còn lại ≤ 30 ≤ 50 Vịt con từ 1-28 ngày tuổi Không có ≤ 10 Nhóm vịt còn lại ≤ 10 ≤ 20 Heo con theo mẹ 1-20 ngày tuổi ≤ 10 ≤ 30 Nhóm heo còn lại ≤ 100 ≤ 200 Bò nuôi lấy sữa ≤ 20 ≤ 50 - Đối với các loại vật nuôi còn nhỏ ở độ tuỗi từ 1-28 ngày rất mẫn cảm với Aflatoxin, do đó hàm lượng tối đa độc tố Aflatoxin B1 trong thức ăn hỗn hợp hoàn chỉnh phải nhỏ hơn 20 ppb; đặc biệt đối với vịt con, trong thức ăn không được chứa Aflatoxin B1. GVHD: TS. LÝ THỊ THANH LOAN 25 TỔNG QUAN HVTH: VÕ THỊ THANH TRANG LUẬN VĂN THẠC SĨ 9 Những quy định của Mỹ về độc tố aflatoxin trong thức ăn và thực phẩm: Bảng 1.4. Những quy định mức cho phép Aflatoxin trong thức ăn ở Mỹ (FAO, 1995): Loại thực liệu Loại Aflatoxin Mức cho phép (ppb) Phương pháp phân tích Mọi thức ăn (người), trừ sữa B1+B2+G1+G2 20 TLC, HPLC Sữa (làm thực phẩm cho người) M1 0,5 TLC, HPLC Thực liệu thức ăn gia súc khác B1+B2+G1+G2 20 TLC, HPLC Hạt bông vải làm nguyên liệu thức ăn cho bò thịt, heo, gia cầm B1+B2+G1+G2 300 TLC, HPLC Bắp và khô dầu phộng (cho bò, heo, gia cầm trưởng thành vỗ béo) B1+B2+G1+G2 200 TLC, HPLC Bắp cho thú non và bò sữa B1+B2+G1+G2 20 TLC, HPLC Bắp cho thú, bò thịt, heo, gà giống B1+B2+G1+G2 100 TLC, HPLC Bắp cho bò thịt vỗ béo B1+B2+G1+G2 300 TLC, HPLC Bắp cho heo vỗ béo B1+B2+G1+G2 200 TLC, HPLC - Trong các loại thức ăn trên, sữa là sản phẩm có mức cho phép Aflatoxin rất thấp: 0,5ppb; tiếp đến là thức ăn cho người, thức ăn gia súc, bắp cho thú non và bò sữa có mức cho phép Aflatoxin: 20 ppb; các loại thức ăn khác ở mức cho phép 100 - 300ppb. GVHD: TS. LÝ THỊ THANH LOAN 26 TỔNG QUAN HVTH: VÕ THỊ THANH TRANG LUẬN VĂN THẠC SĨ 9 Những quy định của châu Âu về độc tố aflatoxin: Bảng 1.5. Những quy định về hàm lượng Aflatoxin B1 tối đa trong thức ăn gia súc, gia cầm ở các nước thuộc EU: Các loại nguyên liệu, thức ăn động vật Hàm lượng (mg/kg) tối đa trong thức ăn quy về độ ẩm 12% Các loại thức ăn đơn chất: 50 Thức ăn hỗn hợp cho bò, cừu (ngoại trừ bò sữa, bê và cừu con): 50 Thức ăn hỗn hợp cho heo và gia cầm (ngoại trừ heo con và gia cầm non) 20 Các loại thức ăn hỗn hợp khác còn lại 10 Thức ăn bổ sung cho bò, cừu, dê (ngoại trừ cho bò sữa, bê và cừu non) 50 Thức ăn bổ sung cho heo, gia cầm (ngoại trừ thú non) 30 Những thức ăn khác còn lại đặc biệt là bò sữa 10 Nguyên liệu thức ăn đơn khác như: (đậu phộng, B/d phộng, B/d dừa, B/d cọ, B/d bông vải và sản phẩm chế biến khác) 200 Ghi chú: B/d: Bơ/dầu - Quy định về hàm lượng Aflatoxin B1 tối đa trong thức ăn gia súc đặc biệt là bò sữa rất nghiêm ngặt: 10ppb; các loại thức ăn dành cho heo và gia cầm có quy định về hàm lượng Aflatoxin B1 (20ppb) thấp hơn ở thức ăn cho bò, cừu, dê 50ppb; thức ăn hỗn hợp cho heo và gia cầm có quy định hàm lượng Aflatoxin B1 (20ppb) thấp hơn thức ăn bổ sung (30ppb). GVHD: TS. LÝ THỊ THANH LOAN 27 TỔNG QUAN HVTH: VÕ THỊ THANH TRANG LUẬN VĂN THẠC SĨ 1.3. Phương pháp phát hiện A. flavus 1.3.1. Dựa vào đặc điểm hình thái [17], [18]: Việc phát hiện nấm mốc A. flavus thường dựa vào đặc điểm hình thái. Nếu phân loại đến giống thì rất dễ nhận biết dựa vào cuống đính bào tử, nhưng để phân biệt đến loài thì rất phức tạp, thường dựa vào các đặc điểm sau: + Đặc điểm đại thể: bao gồm màu sắc bào tử và sợi nấm, đường kính khuẩn lạc, màu sắc khuẩn lạc thay đổi, sự tạo sắc tố của các giọt tiết. + Đặc điểm vi thể: phần lớn dựa vào sự sắp xếp, hình dạng và kích thước của bọng, bào tử và hình thái cuống, sự hiện diện tế bào Hülle, và hình thái của nang bào tử. Hơn nữa, tất cả các đặc điểm hình thái phải được xác định trong điều kiện phòng thí nghiệm chuẩn được thực hiện bởi các chuyên gia phân tích nấm để có thể nhận diện chính xác. Thông thường, người ta thường dựa vào một số môi trường nuôi cấy chọn lọc cho nấm như Czapek Dox agar, Potato Dextrose Agar, Malt Extract Agar để nhận diện nấm mốc hoặc sử dụng một số môi trường khác như: để nhận diện nhóm A. flavus dựa trên đặc tính chuyển hóa màu môi trường ở mặt sau đĩa thạch sang vàng cam đối với môi trường Aspergillus flavus and Aspergilus parasiticus agar (AFPA) và Coconut cream agar (CCA) dùng để phát hiện những chủng sinh Aflatoxin, sự tạo Aflatoxin được phát hiện bằng cách quan sát huỳnh quang màu xanh lam dưới đèn UV. GVHD: TS. LÝ THỊ THANH LOAN 28 TỔNG QUAN HVTH: VÕ THỊ THANH TRANG LUẬN VĂN THẠC SĨ Hình 1.5. (a) A. flavus trên môi trường AFPA (Aspergillus flavus and Aspergilus parasiticus agar), sau 7 ngày nuôi cấy ủ ở 25ºC, với đặc tính chuyển màu ở mặt sau môi trường thành màu cam. (b) A. flavus sinh độc tố Aflatoxin phát triển trên đĩa CCA (Coconut cream agar) nhỏ được quan sát dưới đèn UV, sau 7 ngày ủ; đĩa CCA lớn không cấy chủng nấm A. flavus 1.3.2. Dựa trên phương pháp sinh học phân tử [18]: Phương pháp sinh học phân tử được áp dụng rộng rãi để nhận diện các loài A. flavus. Phần lớn thường sử dụng trình tự DNA mục tiêu là một trong những phức rDNA, thường là vùng ITS1 and ITS2 bên trong vùng phiên mã và vùng thay đổi ở đầu 5’ vùng D1-D2 của 28S rRNA. Tuy nhiên, các loài thuộc nhóm A. flavus rất khó phân biệt dựa vào trình tự gen. Các loài A. flavus, A. parasiticus, A. oryzae and A. sojae có trình tự tương đồng cao và kích thước cũng tương tự nhau, trình tự DNA của chúng tương đồng từ 91 đếm 100%. Nhưng, kỹ thuật phân tích Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) có thể phân biệt được 2 loài A. parasiticus and A. sojae. Do đó, để nghiên cứu A. flavus, hoặc để so sánh A. flavus với các loài Aspergillus khác và thậm chí nghiên cứu sự khác biệt về đặc tính sinh Aflatoxin, GVHD: TS. LÝ THỊ THANH LOAN 29 TỔNG QUAN HVTH: VÕ THỊ THANH TRANG LUẬN VĂN THẠC SĨ nhiều vùng phức hợp rDNA và các gen liên quan đến quá trình sản sinh Aflatoxin đã được thử nghiệm dùng làm markers với những mức độ thành công khác nhau. Một số nghiên cứu dựa trên kỹ thuật Polymerase Chain Reaction (PCR) dùng để phân tích sự khác biệt trên trình tự được khuếch đại. Nhưng sự khuếch đại trình tự mục tiêu của PCR phải được thực hiện thêm bằng kỹ thuật Restriction Fragment Length Polymorphisms (RFLP), Single-Strand Conformation Polymorphisms (SSCP) thì mới dễ dàng phân biệt A. flavus với các loài khác dựa trên đoạn 600bp tương ứng với vùng khuếch đại ITS1/5.8S/ITS2 với cặp mồi ITS1-ITS4. Một số tác giả cho rằng khi sử dụng trình tự khuếch đại lớn kết hợp với phân tích PCR-SSCP có thể loại bỏ được khó khăn lớn khi có sự thay đổi về mặt chủng loại. Tuy nhiên, những phân tích này không phân biệt được những chủng có sinh Aflatoxin và không sinh Aflatoxin. Chang và cộng sự (1995) đã tìm thấy gen aflR để có thể nhận biết chủng A. flavus và A. parasiticus, nhưng Somashekar và công sự (2004) có thể phân biệt được riêng biệt 2 chủng A. flavus và A. parasiticus dựa trên kỹ thuật RFLP bằng cách dùng enzyme cắt giới hạn PvuII. Multiplex PCR, sử dụng nhiều cặp mồi để nhận diện vùng mục tiêu là bước tiến nhằm phân biệt các loài này và đã thành công khi sử dụng aflR, ver-1, omt-1 and nor-1 genes. Nhưng phương pháp này không phân biệt được những chủng sinh độc tố hay không sinh độc tố Aflatoxin. Để phân biệt được những chủng sinh độc tố hay không sinh độc tố Aflatoxin phải sử dụng phương pháp reverse transcription PCR (RT-PCR) để xem sự biểu hiện của gen sản sinh Aflatoxin dựa vào các gen liên quan đến quá trình điều hòa và gen cấu trúc trong quá trình sinh tổng hợp Aflatoxin. Scherm và cộng sự (2005) đã nghiên cứu trên 13 chủng ở cả 2 loài A. flavus và A. parasiticus và tìm thấy 3 gen (aflD, aflO [syn. dmtA=omtB] and aflP [syn. omtA]) có thể sử dụng để phát hiện khả năng sinh Aflatoxin và được sử dụng làm marker để nhận diện chúng. Do đó, thật khó để phân biệt được chủng A. flavus với các loài tương tự như A. nomius and A. parasiticus. Người ta thường phải kết hợp nhiều phương pháp khác nhau mới có thể nhận diện và phân biệt chính xác các loài có khả năng sinh Aflatoxin. GVHD: TS. LÝ THỊ THANH LOAN 30 TỔNG QUAN HVTH: VÕ THỊ THANH TRANG LUẬN VĂN THẠC SĨ 1.4. Đặc tính và ứng dụng Cylodextrin [19] 1.4.1. Đặc tính Cyclodextrins đã được biết trong nhiều thập niên qua, vào năm 1881, Villiers đã sản xuất ra cyclodextrin đầu tiên bằng cách cho Bacillus amylobacter phân hủy tinh bột và năm 1993, Schardinger chứng minh được cấu trúc vòng của các hợp chất này. Sự thủy phân tinh bột bằng enzyme tạo ra một chuỗi các đơn phân mạch thẳng hoặc nhánh như là glucose, maltose, maltotriose, v.v. được biết như là các dextrins. Đây là một quá trình thủy phân tinh bột thật sự, khi sản phẩm đầu tiên được cắt ra từ nối glycosidic tương tác với một phân tử nước. Tuy nhiên tinh bột được thủy phân bởi enzyme cyd-glucosyltransferase (CGTase), sản phẩm đầu tiên của chuỗi cắt trãi qua quá trình phản ứng bên trong phân tử mà không có sự tham gia của nước và sản phẩm vòng có nối α-1,4 được hình thành. Các sản phẩm này là các cyclodextrin (Szejtli, 1988). Các enzyme chuyển hóa glucose đối tạo thành các cyclodextrin được tạo ra bởi nhiều vi sinh vật như Bacillus macerans, hoặc B.circulans (Francis và cộng sự, 2002). Cyclodextrin là các đại phân tử gồm các đơn vị đường glucose. Cyclodextrin thường tạo thành dịch đường trong nước. Cyclodextrin thường chứa 6, 7, hoặc 8 glucopyranose. Như vậy hoạt hóa tạo vòng là một trường hợp riêng của hoạt tính không cân xứng. Giả thuyết được đặt ra là enzyme này có hai trung tâm: một trung tâm chịu trách nhiệm gắn kết chất cho và một trung tâm chịu trách nhiệm gắn kết chất nhận nằm ở điểm khoảng cách 2 đơn vị glucose. Sự thủy phân sẽ xảy ra sau khi đã “chuyển glucose” đến tận gốc glucose không khử tận cùng. CGTase có khả năng xúc tác chuyển hóa các mạch thẳng của tinh bột thành các phân tử mạch vòng, chủ yếu là cyclodextrin α, β, γ chứa 6, 7, 8 đơn vị glucose được liên kết bằng liên kết α- 1,4. Các chuỗi amilose dài không phải là cơ chất tốt nhất của enzyme này. Người ta thấy lượng cyclodextrin thu được cao nhất khi phân tử amilose được phân giải thành các chuỗi có mức độ trùng hợp dưới 100 và có lẫn amilopectin. Điều này cho GVHD: TS. LÝ THỊ THANH LOAN 31 TỔNG QUAN HVTH: VÕ THỊ THANH TRANG LUẬN VĂN THẠC SĨ thấy các đầu khử của các mạch bên của phân tử amilopectin đóng vai trò là chất tiếp nhận cho sự thủy phân của amyloza. Các oligozit mạch thẳng của tinh bột là những cơ chất tốt, cũng như các gluxit có nhánh đều có thể tham gia vào trong các cyclodextrin để tạo ra các phân tử vừa có vòng vừa có nhánh. Hình 1.6: Cyclodextrin α, β, γ Các enzyme CGTase được chia thành các nhóm: nhóm tạo ra chủ yếu α- cyclodextrin (Bacillus macerans) và nhóm β-cyclodextrin (ví dụ như B. megaterium). Ngoài ra sự phân bố các sản phẩm mạch vòng còn phụ thuộc vào thời gian phản ứng. Enzyme CGTase từ Bacillus macerans ban đầu tạo ra β-cyclodextrin, sau đó α và γ-cyclodextrin có tỷ lệ là 42, 44, và 14. enzyme này có đặc tính là thủy phân các sản phẩm cyclodextrin của chính mình. Vì các sinh vật chủ yếu sinh tổng hợp được enzyme này là Bacillus macerans, B. stearothermophilus, và một giống thuộc Micrococcus. Nhiệt độ tối ưu của các enzyme này nằm trong khoảng 50-70oC, pH tối ưu nằm giữa 5,0-7,0 và khối lượng phân tử của chúng dao động từ 67000 đến 88000 Da. Còn pH tối ưu để tạo ra các cyclodextrin nằm trong khoảng từ 4,5 – 9,0. GVHD: TS. LÝ THỊ THANH LOAN 32 TỔNG QUAN HVTH: VÕ THỊ THANH TRANG LUẬN VĂN THẠC SĨ 1.4.2. Cấu trúc và tính chất của các cyclodextrin Cyclodextrin là những phân tử vòng lớn được tạo nên từ các đơn vị glucopyranozyl hình ghế C41 được liên kết với nhau bằng liên kết α-1,4. các cyclodextrin được nghiên cứu nhiều nhất thường chứa 6(α-cyclodextrin), 7(β- cyclodextrin) và 8(γ-cyclodextrin) gốc glucose nhưng các đồng đẳng bậc cao của chúng có thể chứa tới 12 gốc glucose. Các nghiên cứu về tinh thể cho thấy các α -, β-, γ-cyclodextrin đều có dạng hình xuyến và được giữ chặt bởi các liên kết hydro giữa các nhóm hydroxyl bậc 2 của các gốc glucose kế nhau. Các nhóm hydroxyl bậc nhất đều hướng ra ngoài mạch vòng. Kích thước trung bình của vòng xuyến là 1,5nm x 0,7nm x 0,8 nm. Điều lý thú là các cyclodextrin có bề mặt bên trong kỵ nước còn bề mặt bên ngoài thì háo nước. Cấu trúc này cho phép tạo ra những phức bao bền vững với những chất hữu cơ, với muối và với halogen. Vì vậy các chất kỵ nước đều có thể được hòa tan. Tùy theo kích thước tương đối của chúng mà các phân tử “khách thể” được bao bọc toàn bộ hay một phần, còn cyclodextrin thì đóng vai trò của phân tử “chủ thể” hay chất tiếp nhận. Phức hợp này có tác dụng làm tăng độ bền của phân tử “Khách thể” không chỉ trong nước mà còn trong không khí đối với các sản phẩm khô ; ngoài ra còn làm tăng độ bền đối với nhiệt độ với oxi hóa và thủy phân. Ở trạng thái rắn các cyclodextrin không màu có vị ngọt nhẹ. Độ hòa tan của chúng nói chung thấp nhưng sẽ tăng lên cùng với nhiệt độ. Độ hòa tan có thể tăng lên nếu thay thế một số nhóm hydroxyl bằng methyl hóa, amin hóa, este hóa hay ete hóa. Trong trường hợp này, kích thước đường kính của cyclodextrin không bị thay đổi, song chiều sâu của lỗ hang thì bị giảm xuống. So với oligosaccharite mạch thẳng tương ứng thì các cyclodextrin là những phân tử rất bền. tuy nhiên, chúng có thể bị phân hủy bởi acid mạnh và bởi tia gamma, bền vững trong môi trường kiềm. Có thể nhận ra các cyclodextrin bằng phương pháp so màu với thuốc thử đặc hiệu. Các α -, β-, γ-cyclodextrin lần lượt có màu tím xanh, màu vàng nâu và màu nâu. GVHD: TS. LÝ THỊ THANH LOAN 33 TỔNG QUAN HVTH: VÕ THỊ THANH TRANG LUẬN VĂN THẠC SĨ Người ta có thể tách phân đoạn các cyclodextrin bằng sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi khai triển là propanol/nước/etyl acetate/ammoniac (6/3/1/1:V/V) hoặc bằng sắc kí khí hoặc bằng sắc kí lỏng cao áp. 1.4.3. Đặc điểm của phức bao cyclodextrin Một phức bao là sự kết hợp ít nhất của 2 phân tử : “ chất chủ thể” và “ chất khách thể”, chất chủ thể có thể bao chứa được toàn bộ hay một phần của phân tử chất khách thể và kết quả là tạo nên một phức ổn định mà không cần liên kết đồng hóa trị tham gia. Hình 1.7: Cấu trúc không gian của phức bao cyclodextrin với phân tử khách thể Một trong những tính chất quan trọng nhất của các cyclodextrin là chúng có khả năng tạo nên các hợp chất bao với nhiều phân tử. Các hợp chất bao này có thể tồn tại trong dung dịch và cả ở trạng thái rắn. Đặc tính nổi bậc này là điểm khác biệt giữa cyclodextrin với đa số các phân tử của chủ thể khác vốn đòi hỏi phải có sự kết tinh thành mạng lưới mới tạo được các lỗ hang thích ứng. Quá trình tạo thành phức hệ cyclodextrin phối trí có thể được theo dõi bằng các phương pháp khác nhau; đo phổ cực tím, hùynh quang, cộng hưởng từ hạt nhân, độ hòa tan. Lúc đầu lỗ hang được chứa đầy nước, khi hình thành phức bao, các phân tử này bị đẩy ra ngoài mà không làm thay đổi hình dạng của các cyclodextrin. Nói chung tất cả các phân tử được bao đều ở cùng độ nghiêng chắc chắn theo cách có lợi cho các liên kết Van GVHD: TS. LÝ THỊ THANH LOAN 34 TỔNG QUAN HVTH: VÕ THỊ THANH TRANG LUẬN VĂN THẠC SĨ der Waals. Tương tác chủ yếu ở đây có bản chất kỵ nước, nó là kết quả của sự tổ hợp các tương tác Van der Waals trong lỗ hang, của sự tăng cường entropy do phá hủy lớp nước bao quanh phân tử chất khách thể và của sự mất entropy do việc giữ cố định phân tử chất khách thể trong lỗ hang. Hiện nay người ta đã biết rõ cách giữ cố định các phức bao thông thường, các phân tử chất khách thể phải có kích thước tương hợp với kích thước của lỗ hang cyclodextrin. Tuy nhiên, các phân tử có thể tích lớn hơn lỗ hang vẫn có thể tạo phức bao qua một số nhóm hay mạch bên của chúng làm môi giới. Nhiều mô hình khác nhau được đưa ra để mô tả sự tương hợp cần thiết giữa cyclodextrin và các phân tử khách thể . sự tạo thành phức bao cũng phụ thuộc vào độ có cực của phân tử chất khách thể. Các phân tử được bao bên trong phân tử cyclodextrin thường được định hướng theo cách có lợi tối đa cho sự tiếp xúc giữa các phần kỵ nước của chúng và lỗ hang vốn có tính kỵ nước của cyclodextrin. Thường các yếu tố hình học quan trọng hơn các yếu tố hóa học. sự tạo thành phức bao bị chi phối bởi các yếu tố sau: - Khả năng của phân tử chất khách thể khớp được hoàn toàn hay một phần vào lỗ hang. - Sự mất nước trên bề mặt trong của than hình nón cụt kéo theo sự mất năng lượng - Sự chuyển dịch một phần năng lượng từ cyclodextrin sang phân tử chất khách thể do môi trường kỵ nước. Phức bao của các cyclodextrin đã được methyl hóa là bền nhất, bởi lẽ lỗ hang về phía các nhóm hydroxyl bật một đã bị bao vây bởi một…kỵ nước, cũng như do đã khử bỏ các liên kết hydro một phân tử nên vòng cyclodextrin trở nên mềm dẻo hơn. Độ bền của phức bao phụ thuộc vào nhiệt độ và bản chất của dung môi. Ta thường biết phức bao được tạo nên trong dung môi hỗn hợp nước – rượu, do đó không một tương tác nào có thể hình thành giữa các cyclodextrin và các phân tử vòng thơm trong dung môi phân cực. GVHD: TS. LÝ THỊ THANH LOAN 35 TỔNG QUAN HVTH: VÕ THỊ THANH TRANG LUẬN VĂN THẠC SĨ Trong phức bao đơn giản nhất, một phân tử chất khách thể được cấm cung một mình ở trong phân tử cyclodextrin theo tỉ lệ 1:1. Đa số các chất được bao toàn bộ trong cyclodextrin thường có khối lượng phân tử xê dịch từ 80-250. Với những phân tử có khối lượng lớn hơn thì chỉ một phần phân tử được bao có nghĩa là tỷ lượng tương hợp có thể là 1:1, 2:1 hay 1:2. 1.4.4. Ứng dụng của phức bao: Phức bao được ứng dụng làm vỏ bọc cho một phân tử có họat tính cao hay dễ bay hơi để giảm độ nhạy của nó trong các quá trình như thủy phân, oxi hóa, hay quang phân. Sử dụng cyclodextrin làm chất bao thường ở 3 tác dụng sau: - Thay đối khả năng phản ứng hóa học của phân tử chất khách thể - Tạo độ bền cho những chất nhạy cảm với ánh sáng hay với oxi - Phối trộn được các phân tử họat động mạnh mà không có bất trắc nào - Lựa chọn phản ứng bằng cách bao bọc các nhóm định chức - Gắn cố định các chất dễ bay hơi: + cải tiến quá trình tàn trữ và bảo quản + giảm lượng chất thơm cần thiết nhờ giảm tổn thất + Thiết lập được công thức về liều lượng cần thiết - Thay đối các tính chất lý hóa + tăng độ hòa tan hoặc khả năng tạo nhũ cho một số chất + cải thiện độ phân tán + Che khuất cục bột một số hợp chất quan trọng trong hỗn hợp phức tạp 1.4.5. Tương tác của cyclodextrin với aflatoxin [12, 15] Người ta chương trình HINT (Hydropathic Interaction) để giải thích tương tác AfB1 và cyclodextrin bằng cách thiết kế đầu dò (chemosensor) để phát hiện độc tố ở nồng độ rất thấp. GVHD: TS. LÝ THỊ THANH LOAN 36 TỔNG QUAN HVTH: VÕ THỊ THANH TRANG LUẬN VĂN THẠC SĨ HINT dựa trên thí nghiệm xác định giá trị Log Poctanol/ water có thể xác định được enthapy và entropy trong việc góp phần tạo nên năng lượng tự do. HINT dùng để dự đoán ΔGo của tương tác Protein – ligand, protein – protein, protein – DNA nhằm giải thích quá trình tương tự như hiện tượng liên quan đến phức hợp chất hữu cơ chủ thể - khách thể. Tỷ lệ HINT cao thì tương tác giữa 2 chất trong phức tốt lúc đó ΔGo<0 và ngược lại. Do đó, đây là phương pháp đầu tiên được áp dụng giải thích cho tương tác của phức hợp cyclodextrin. Sự tăng tính hiệu phát huỳnh quang của alfatoxin B1 trong dung dịch có cyclodextrin là do sự hình thành phức hợp khách thể - chủ thể, trong đó khách thể là Aflatoxin và chủ thể là cyclodextrin (Hình 1.8, 1.9). Aflatoxin có bản chất phát huỳnh quang tự nhiên, tuy nhiên cường độ phát huỳnh quang rất yếu. Phần phát huỳnh quang của độc tố Alfatoxin B1 có thể bị ảnh hưởng khi ở trong dung môi, làm huỳnh quang bị tắt. Do đó, người ta sử dụng cyclodextrin để kích thích sự phát huỳnh quang. Cyclodextrin có cấu trúc hình phễu có bề mặt ngoài hiếu nước và mặt trong kỵ nước. Khi Aflatoxin được gắn vào bên trong cyclodextrin, phần phát huỳnh quang của Aflatoxin được bao bọc và ngăn không bị tắt huỳnh quang khi ở trong nước. Hình 1.8. mô hình tương tác giữa cyclodextrin và Aflatoxin dạng HINT/GOLD Hình 1.9: Bản đồ đường mức cực kỵ nước của alfatoxin B1, phần kỵ nước màu xanh lá và phần hiếu nước màu xanh da trời GVHD: TS. LÝ THỊ THANH LOAN 37 TỔNG QUAN HVTH: VÕ THỊ THANH TRANG LUẬN VĂN THẠC SĨ 1.5. Một số khái niệm trong quy trình xác nhận hiệu lực của phương pháp [14] 1.5.1. Giới hạn phát hiện Ngưỡng tới hạn (Critical level – LC): mật độ vi sinh vật thấp nhất (khác 0) mà phương pháp có thể phát hiện được nhưng không thể cho 1 giá trị định lượng chính xác. Dưới ngưỡng này, không thể chắc chắn được mật độ vi sinh thật sự khác 0 hay không. Ở ngưỡng này, xác suất phương pháp phân tích cho kết quả âm tính giả là 50%. Giới hạn phát hiện (Limit of detection– LOD): mật độ vi sinh vật thấp nhất mà phương pháp có thể phát hiện được ở độ tin cậy 95%, nhưng không thể cho 1 giá trị định lượng chính xác. 1.5.2. Độ nhạy, độ đặc hiệu và tỷ lệ dương tính giả, tỷ lệ âm tính giả Độ nhạy: Tỷ lệ xác định đúng trên tổng số các chủng hoặc khuẩn lạc dương tính giả định. Đại lượng này biểu thị khả năng phát hiện số lượng thật của vi sinh vật đích bằng phương pháp thử thông qua việc xác định tỵ lệ nghiệm đúng (kết quả dương tính) trên tổng số vi sinh vật dương tính giả định. Độ đặc hiệu: Tỷ lệ xác định đúng trên tổng số các chủng hoặc khuẩn lạc âm tính giả định. Đại lượng này biểu thị khả năng phát hiện số lượng thật của vi sinh vật đích bằng phương pháp thử thông qua việc xác định tỷ lệ nghiệm đúng (kết quả âm tính) trên tổng số vi sinh vật âm tính giả định. Tỷ lệ dương tính giả: Tỷ lệ dương tính quan sát được sai với kết quả thực. Tỷ lệ âm tính giả: Tỷ lệ âm tính quan sát được sai với kết quả thực. Đại lượng này biểu thị tỷ lệ số vi sinh vật âm tính bị xác định sai.