Luận văn Chọn giống vi khuẩn và khảo sát một số điều kiện lên men acetic để làm giấm trái cây

ộ thuần khiết bằng cách quan sát hình dạng khuẩn lạc, nhuộm Gram. 2.2.2.3.2..Khảo sát đặc điểm phân loại  Dạng khuẩn lạc Tiến hành cấy vi khuẩn phân lập được trên bề mặt môi trường ethanol- cao nấm men có CaCO3 (MT1) sao cho có được những khuẩn lạc tách rời. Nuôi ở nhiệt độ phòng và theo dõi sự phát triển của khuẩn lạc. Sau 3 ngày quan sát và mô tả đặc điểm của khuẩn lạc.  Hình thái vi khuẩn  Khả năng di động Quan sát khả năng di động của vi khuẩn dưới dạng tiêu bản giọt treo. Tiến hành nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường làm giàu sinh khối (MT2)  Nhuộm Gram Tiến hành nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường cao thịt-pepton (MT7) trong 16-24 giờ. Hút 1ml dịch vi khuẩn pha loãng trong nước cất vô trùng để mật độ tế bào trong thị trường kính hiển vi vừa phải và dễ quan sát. Làm vết bôi vi khuẩn với đối chứng là Bacillus Gram dương, E.coli Gram âm. Sau khi nhuộm, soi kính với vật kính dầu 100X.  Đặc điểm sinh lý, sinh hoá  Khả năng oxy hoá ethanol thành acid acetic  Định tính acid acetic tạo thành Nuôi các chủng khảo sát trên môi trường lên men định tính (MT3) ở nhiệt độ phòng trong 4 ngày. Cho vào ống nghiệm 3ml dịch lên men và 1ml dung dịch NaOH . Nhỏ vào ống nghiệm vài giọt dung dịch FeCl3 5%, lắc đều ống nghiệm và đun sôi trên ngọn đèn cồn. Nếu dung dịch có acid acetic thì sẽ có màu đỏ thẫm do sắt acetate tạo thành. Đối chứng dương là ống đựng acid acetic chuẩn, đối chứng âm là môi trường không nuôi cấy vi khuẩn. Phản ứng diễn ra theo phương trình sau: CH3COOH +NaOH  CH3COONa +H2O CH3COONa + FeCl3  Fe(CH3COO)3 +3NaCl Màu đỏ thẫm  Định lượng acid acetic tạo thành Sau khi nuôi các chủng khảo sát trên môi trường tăng sinh (MT2) rồi chuyển sang môi trường nhân giống cấp 1 (MT5), môi trường nhân giống cấp 2 (MT6). Sau 7 ngày định lượng acid acetic tạo ra theo phương pháp xác định acid tổng.  Khảo sát đặc tính sinh catalase Nguyên tắc Catalase xúc tác sự phân giải H2O2 thành H2O và O2. Nếu vi khuẩn khảo sát có khả năng tạo catalase thì khi nhỏ H2O2 vào dịch nuôi cấy vi khuẩn đó, H2O2 bị phân giải thành H2O và O2, gây hiện tượng sủi bọt. O2 2H2O2 2 H2O Catalase Thực hiện Nuôi cấy các chủng khảo sát trong ống nghiệm chứa môi trường tăng sinh khối (MT2) trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng. Nhỏ 1 giọt dịch nuôi cấy lên tấm lam và nhỏ từ từ H2O2 vào. Quan sát và ghi nhận hiện tượng.  Khả năng tạo H2S Đây là đặc điểm của vi sinh vật có khả năng sử dụng các amino acid trong môi trường có Thiosulfate Natri. Chúng tạo thành những đường cấy màu đen do tạo được sulfua chì theo phản ứng sau: COOH.CH.NH2.CH2S.S.CH2.CH.NH2.COOH + H2 + 4H  2H2S + 2NH3 + 2CH3COOH+ 2HCOOH H2S + Pb(CH3COO)2  PbS + 2CH3COOH Sulfua chì màu đen Thực hiện Cấy chủng khảo sát lên ống thạch đứng chứa môi trường thử khả năng tạo H2S (MT13) bằng những đường cấy thẳng, sâu, gần sát thành ống nghiệm. Ủ ở nhiệt độ phòng, sau 2 ngày, quan sát những đường cấy, nếu vi khuẩn tạo H2S thì đường cấy sẽ có màu đen do tạo sulfua chì.  Khả năng oxy hoá acetate hoặc lactate Tiến hành theo phương pháp của Leifson. Đây là phương pháp nhanh và dễ dàng nhất để phân loại vi khuẩn Acetic đến cấp giống. Nếu chủng khảo sát có khả năng oxy hoá acetate hoặc lactate thì chủng đó thuộc giống Acetobacter còn ngược lại chủng đó thuộc giống Gluconobacter . Nguyên tắc Sử dụng môi trường sodium acetate hoặc sodium lactate có bromothymol-blue làm chất chỉ thị màu. Chỉ thị màu này có pH nhạy cảm trong khoảng pH 5,6-7,4 và biến đổi màu từ màu vàng sang xanh dương. Khi acetate hoặc lactate bị oxy hoá thì môi trường trở nên kiềm tính. Bằng cách quan sát sự chuyển màu của môi trường (vàng chuyển sang xanh dương) cho phép đánh giá được khả năng oxy hoá acetate hoặc lactate của chủng vi sinh vật khảo sát. Thực hiện Cấy chủng khảo sát vào ống nghiệm chứa 5ml môi trường sodium acetate. Nuôi ở nhiệt độ 300C sau 7 ngày quan sát sự chuyển màu của môi trường. 2.2.3. Khảo sát đặc điểm lên men acetic 2.2.3.1.Chọn giống Trong quá trình lên men định lượng acid acetic tạo ra chúng tôi xác định được 2 chủng tạo acid acetic cao nhất là chủng A3 và A6. Do đó những thí nghiệm sau chúng tôi quyết định chọn 2 chủng này để khảo sát. 2.2.3.2. Chọn môi trường  Xác định pH thích hợp Tiến hành nuôi các chủng khảo sát trong môi trường tăng sinh khối (MT2) trong 24 giờ. Đối với mỗi chủng khảo sát huyền phù thật kỹ ống nghiệm chứa dịch nuôi cấy. Sau đó dùng pipetman hút chính xác 1 lượng dịch nuôi cấy (100l) phân vào các ống nghiệm chứa sẵn môi trường khảo sát ở các pH (MT8) tương ứng: 2,5; 3,0; 3,5; 4,0; 4,5; 5,0; 5,5; 6,0; 6,5; 6,8. Nuôi các chủng cần khảo sát trong 4 ngày ở 300C, đo OD ở bước sóng 660nm và ghi nhận kết quả.  Xác định nhiệt độ thích hợp Tiến hành nuôi cấy các chủng khảo sát trên môi trường tăng sinh khối (MT2) trong 24giờ. Đối với mỗi chủng khảo sát huyền phù thật kỹ ống nghiệm chứa dịch nuôi cấy. Sau đó dùng pipetman hút chính xác 1 lượng dịch nuôi cấy (100l) phân vào các ống nghiệm chứa sẵn môi trường khảo sát nhiệt độ (MT 9 ) tương ứng là 150C, 180C, 250C , 300C ,350C, 370C, 400C, 450C. Đo OD ở bước sóng 660nm và ghi nhận kết quả.  Mật độ giống ban đầu thích hợp cho quá trình lên men Nuôi các chủng khảo sát trên môi trường tăng sinh và nhân giống cấp I, II và chuyển vào môi trường định lượng. Sau đó định hàm lượng acid tạo thành bằng phương pháp xác định acid tổng.  Xác định nồng độ ethanol thích hợp -Nuôi cấy chủng vi khuẩn khảo sát ở môi trường tăng sinh và nhân giống cấp I, II. Chuyển dịch nuôi cấy vào môi trường định lượng có nồng độ ethanol tương ứng là 3%, 4%, 5%, 8%, 10%, 12%. -Tiến hành thí nghiệm 2 lô: 1 lô hấp khử trùng và 1 lô không hấp khử trùng. Môi trường 1: hấp khử trùng; Môi trường 2 : không hấp khử trùng. (Mục đích thực hiện môi trường không hấp khử trùng để xem giống có khả năng chống được sự nhiễm khuẩn hay không). -Xác định hàm lượng acid sinh ra bằng phương pháp xác định acid tổng và ghi nhận kết quả. -Sau khi xác định được nồng độ ethanol ban đầu thích hợp cho quá trình lên men chúng tôi sẽ sử dụng nồng độ này cho các thí nghiệm tiếp theo.  Xác định thời gian nuôi cấy thích hợp - Cấy chủng khảo sát vào các erlen chứa môi trường tăng sinh khối (MT2) nuôi cấy lắc. Đo mật độ tế bào của mỗi chủng ở bước sóng 660nm cứ 24 giờ thì đo cho đến khi giá trị OD giảm. Ghi nhận kết quả. - Cho 25% dịch tăng sinh có nuôi cấy chủng vi khuẩn khảo sát vào erlen chứa môi trường nhân giống I (MT5), nuôi cấy lắc. Đo mật độ tế bào của mỗi chủng ở bước sóng 660nm, cứ 24 giờ thì đo cho đến khi giá trị OD giảm. Ghi nhận kết quả.  Xác định mật độ vi khuẩn phát triển trong môi trường nhân giống II để chuẩn bị lên men - Cho 25% dịch nhân giống I có nuôi cấy chủng vi khuẩn khảo sát vào erlen chứa môi trường nhân giống II (MT6), nuôi cấy lắc trong khoảng thời gian thích hợp. Để tính số vi khuẩn trong thể tích khảo sát ta cần đếm số khuẩn lạc trên đĩa petri. Đếm khuẩn lạc trên đĩa thạch  Nguyên tắc: Mỗi sinh vật đứng riêng rẽ sẽ phát triển thành một khuẩn lạc trên môi trường thích hợp. Đếm số khuẩn lạc ta có thể tính ra số vi sinh vật trong 1 thể tích cần nghiên cứu.  Thực hiện: Pha loãng dịch cần đếm bằng cách dùng pipetman hút 1ml dịch vào 9ml nước cất vô trùng. Tùy độ đục của dịch nuôi cấy mà pha loãng ở nhiều nồng độ khác nhau. Sau đó trãi 0,1ml dịch pha loãng khác nhau lên hộp petri chứa môi trường Ethanol-Cao nấm men . Ủ ở 300C sau 48 giờ đếm số khuẩn lạc trên các đĩa (hai đĩa trãi cùng nồng độ pha loãng). Đếm số khuẩn lạc trên những đĩa có từ 30-300 khuẩn lạc để tính kết quả. Tổng vi khuẩn hiếu khí trong 1ml mẫu được tính theo công thức sau: A(CFU/ml) = Error! Trong đó : N: tổng số khuẩn lạc đếm được ni : số đĩa có số khuẩn lạc được chọn tại mỗi nồng độ pha loãng V: thể tích mẫu cấy vào mỗi đĩa fi : độ pha loãng có số khuẩn lạc được chọn tại các đĩa đếm 2.2.4. Các phương pháp nuôi cấy 2.2.4.1. Phương pháp nuôi cấy tĩnh Chuyển 25% dịch nhân giống II của chủng khảo sát vào môi trường định lượng,nuôi cấy tĩnh. Đo hàm lượng acid tổng tạo thành bằng phương pháp chuẩn độ bằng NaOH 0,1N với phenoltalein làm chỉ thị màu. 2.2.4.2. Phương pháp nuôi cấy bằng thiết bị lên men sục khí Chuyển 25% dịch nhân giống II vào môi trường định lượng, nuôi cấy bằng thiết bị lên men sục khí. Đo hàm lượng acid tổng tạo thành bằng phương pháp chuẩn độ bằng NaOH 0,1N với phenoltalein làm chỉ thị màu. Mỗi lần đo cách nhau 24giờ, nuôi cấy cho đến khi hàm lượng acid acetic sinh ra bắt đầu giảm. Mô tả thiết bị lên men sục khí Thiết bị lên men sục khí được cấu tạo như sau: Bình lên men (erlen 1000ml); Trong bình có 1 cá khuấy từ và bình đặt trên máy khuấy từ; Không khí từ bên ngoài vào bình lên men được vô trùng nhờ đi qua 1 phễu lọc, phễu lọc được nối với máy sục khí mục đích cung cấp oxy để quá trình oxy hoá diễn ra nhanh; Ống thoát khí giúp không khí từ trong bình lên men thoát ra bên ngoài môi trường; Ngoài ra còn có ống thu dịch lên men, ống tiếp nguyên liệu trong quá trình lên men. Hình 2.1 :Sơ đồ thiết bị lên men sục khí 6: Thiết bị lọc khí. 1. Bình lên men 7: Ống thoát khí. 2: Cá khuấy từ. 8: Ống thu dịch lên men. 3: Máy khuấy từ. 4: Máy sục khí. 9: Ống tiếp môi trường. 5: Ống thu khí. 2.2.4.3. Phương pháp nuôi cấy bằng thiết bị lên men hồi lưu  Mô tả thiết bị lên men hồi lưu Thiết bị gồm có 2 phần Phần trên : là thùng lên men được thiết kế theo phương pháp nhanh với mục đích tạo bề mặt tiếp xúc lớn hơn giữa vi khuẩn acetic với không khí để 2 7 1 3 8 9 5 4 6 oxy hóa rượu. Dịch lên men được chuyển từ trên xuống và không khí được chuyển từ dưới lên. Phản ứng sinh học được thực hiện trong khối tế bào cố định. Trong thiết bị này dịch lên men được cho thấm dần qua giá thể BC và được tuần hòan nhiều lần qua thiết bị, khi chảy qua giá thể BC rượu dần dần bị oxy hóa thành acid acetic. Phần duới: chứa dịch lên men sau khi đi qua giá thể BC, có lắp thêm bộ phận sục khí tạo thành vùng oxy hóa bổ sung như nồi lên men của phương pháp chìm. Ở phần dưới chúng tôi đặt thêm 1 máy bơm để dịch lên men sau khi qua giá thể BC sẽ được bơm trở lại thùng lên men qua 1 ống dẫn từ máy bơm qua thùng lên men, và dịch lên men được cho chảy xuống từ từ, tưới đều lên giá thể nhờ 1 vòi sen. Ngòai ra, chúng tôi lắp thêm 1 ống dẫn dịch lên men xuống trở lại thùng chứa dịch lên men tạo nên sự hồi lưu của thiết bị, và ống dẫn này nối với thiết bị sục khí mục đích cung cấp oxy làm cho quá trình lên men diễn ra nhanh hơn. 10 9 8 7 6 5 4 3 1 2 Hình 2.2: Sơ đồ thiết bị lên men hồi lưu 1: Bình chứa dịch lên men. 2: Bình lên men. 3: Ống dẫn dịch lên men đi lên bình lên men. 4: Ống dẫn dịch sau khi lên men xuống bình chứa dịch lên men. 5: Lưới đỡ giá thể mang. 6: Giá thể BC. 7: Máy bơm. 8: Vòi sen phân phối dịch lên men. 9: Máy sục khí. 10: Van để lấy dịch sau khi lên men.  Thu nhận cellulose vi khuẩn -Nhân giống I: Cấy giống Acetobacter xilynum dùng sản xuất BC được giữ trên môi trường thạch nghiêng sang ống nghiệm chứa 5ml môi trường sản xuất BC (MT19). Tiến hành lên men tĩnh ở nhiệt độ phòng trong 5 ngày. -Nhân giống II: Giống cấp I được chuyển vào môi trường nhân giống cấp II (sử dụng 150ml MT15). Lượng giống bổ sung chiếm khoảng 10% thể tích môi trường nhân giống cấp II. -Lên men bề mặt để thu BC: Quá trình lên men được tiến hành trong khay nhựa chứa 1000ml MT15 và 10% giống cấp II, để yên ở nhiệt độ phòng. Thời gian thu BC là 1 tuần sau khi cấy giống cấp II vào.  Phương pháp xử lý BC để sử dụng làm chất mang cố định vi khuẩn Sau 7 ngày nuôi cấy tĩnh  Thu BC  Rữa kỹ BC bằng nước máy  Ngâm và thay nước liên tục trong 2ngày đối với BC thu được từ môi trường nước dừa già (4 giờ thay nước 1 lần)  Cân trọng lượng tươi của BC  Vớt các miếng BC ra và sấy cho ráo nước  Cân các miếng BC sau khi sấy  So sánh trọng lượng của miếng BC sau khi sấy với trọng lượng của miếng BC trước khi sấy (trọng lượng giảm khoảng 9 lần)  Đem hấp khử trùng miếng BC ( 1210C, 20 phút)  Phương pháp cố định -Ngâm BC đã xử lý trong dịch nhân giống cấp II trong 24 giờ. -Xác định mật độ vi khuẩn bám trên BC bằng phương pháp đếm gián tíêp khuẩn lạc trên môi trường thạch đĩa .  Cho môi trường định lượng vào thiết bị lên men hồi lưu. Đo hàm lượng acid tổng tạo thành bằng phương pháp chuẩn độ bằng NaOH 0,1N với phenoltalein làm chỉ thị màu. Mỗi lần đo cách nhau 12 giờ, nuôi cấy cho đến khi hàm lượng acid acetic sinh ra bắt đầu giảm. 2.2.5. Lên men giấm bằng cơ chất là trái cây 2.2.5.1 Xử lý trái cây để làm rượu  Xử lý nho để làm rượu Chuẩn bị 2kg nho tiến hành sắt nhỏ và thêm men ( 2 ống giống thạch nghiêng Saccharomyces cerevisiae) và bổ sung đường với hàm lượng là 500g, sau đó thêm 1000ml nước đun sôi, để nguội, khuấy đều. Cho lên men tự nhiên trong vòng 2 tuần.  Xử lý dứa để làm rượu Chuẩn bị 2kg dứa tiến hành sắt nhỏ và thêm men ( 2 ống giống thạch nghiêng Saccharomyces cerevisiae) và bổ sung đường với hàm lượng là 500g, sau đó thêm 1000ml nước đun sôi, để nguội, khuấy đều. Cho lên men tự nhiên trong vòng 2 tuần. 2.2.5.2 Khảo sát hàm lượng acid tổng sinh ra trong môi trường có sử dụng rượu trái cây  Xác định hàm lượng ethanol bằng phương pháp chuẩn độ Số lượng ethanol sinh ra khi lên men được xác định bằng phương pháp đo oxy hoá trên cơ sở oxy hoá ethanol thành acid acetic và nước bằng hỗn hợp bicromat kali và acid sulfurit. 3 CH3CH2OH + 2K2Cr2O7 +8 H2SO4 = 3CH3COOH + 2Cr(SO4)2 + K2SO4 +11H2O Khi kết thúc quá trình oxy hoá rượu, ta chuẩn độ phần bicromat thừa bằng dung dịch muối Morh K2Cr2O7 + 6FeSO4(NH4)2SO4 + 7 H2SO4= Cr2(SO4)3 + 3Fe2(SO4)3 +6(NH4)2SO4 + 7H2O + K2SO4 Dựa vào số lượng bicromat đã được dùng để oxy hoá mà tính ra nồng độ rượu. Phương pháp sẽ cho kết quả chính xác hơn cả khi lượng rượu chứa trong dịch thể khoảng 1-2%. Do đó khi nồng độ rượu cao hơn, ta cần pha loãng dịch nuôi cấy, còn khi nồng độ thấp hơn ta pha loãng muối Morh và bicromat. Các bước thực hiện Trong bình định mức loại 100ml, ta cho 20ml dịch nuôi cấy đã được tách bỏ các tế bào bằng cách để lắng, lọc hoặc li tâm. Bổ sung nước cất cho tới 100ml, khuấy trộn và lấy ra 10ml cho vào bình cầu đáy tròn loại có dung tích 50-75ml. Trong bình nhận có 3 chỗ phình hình cầu, ta rót 25ml dung dịch bicromat và 10ml H2SO4 đặc. Đậy bình cầu bằng nút cao su có gắn với 1 ống dẫn mà đầu cuối của nó phải chạm tới đáy của bình nhận. Sau đó trong 10- 15phút cất 2/3 dung tích bình. Dung dịch bicromat trong thời gian đó sẽ chuyển từ màu da cam sang màu nâu bẩn. Đem chất dịch từ bình nhận chuyển vào bình định mức loại 100ml. Tráng bình nhận và ống dẫn bằng nước cất, sau đó rót nước này vào bình định mức nói trên. Sau đó thêm nước cất đến vạch mức, khuấy trộn, lấy ra 20ml cho vào 1 bình tam giác loại 250ml, thêm 20ml nước cất và chuẩn độ bằng muối Morh. Đồng thời ta tiến hành chuẩn độ đối chứng để xác định xem cần bao nhiêu muối Morh để chuẩn độ 5ml dung dịch bicromat. Muốn vậy trong bình tam giác ta trộn 5ml bicromat, 2ml acid sunfuric đặc, 30-40ml nước cất, rồi chuẩn độ bằng muối Morh. Vì muối Mohr là hợp chất không bền cho nên phải chuẩn độ đối chứng mỗi lần xác định. Kết thúc chuẩn độ bằng cách xác định 1 giọt mẫu với dung dịch ferrixianid. Muốn vậy dung đũa thủy tinh lấy 1 giọt chất dịch chuẩn độ đặt 1 tấm bằng sứ hay bằng gốm trắng và cạnh đó nhỏ 1 giọt ferrixianid, khi hoà lẫn 2 giọt nếu thấy có màu xanh đậm hơn nhiều là phản ứng kết thúc. Chuẩn độ 2 lần dung dịch thí nghiệm và dung dịch đối chứng. Lần chuẩn độ đầu dùng để nhận được các kết quả định hướng, do đó phản ứng của dịch chuẩn độ với dung dịch ferixianid được tiến hành sau mỗi lần thêm 1ml dung dịch muối Morh. Số lượng ethanol tính bằng g/10ml dịch nuôi cấy được tính theo công thức: 01.05.25).( a ba  a :số ml dung dịch muối Morh đã dùng để chuẩn độ mẫu đối chứng b : số ml dung dịch muối Morh đã dùng để chuẩn độ mẫu thí nghiệm 25: Số ml K2Cr2O7 5: Độ pha loãng dịch nuôi cấy (20ml pha loãng tới 100ml) 0,01: g ethanol ứng với 1ml K2Cr2O7 Sau khi xác định độ rượu, tiến hành lên men. Tiếp 25% giống ( dịch nhân giống II) vào môi trường lên men có chứa 20% thể tích rượu trái cây đã xác định độ rượu, từ đó bổ sung rượu trắng cho đủ nồng độ ethanol thích hợp. Theo dõi sự tạo thành acid qua các ngày lên men. Lên men bằng phương pháp sục khí ở nhiệt độ phòng và đo hàm lượng acid sinh ra mỗi ngày cho đến khi hàm lượng này không tăng nữa. 2.2.5.3. Khảo sát hàm lượng acid tổng sinh ra trong môi trường có sử dụng dịch chiết từ xác bã trái cây  Thời gian tự lên men của xác bã Xác bã trái cây sau khi làm rượu trái cây, cho lên men tự nhiên trong vòng 5 ngày và 15 ngày. (Xác bã trái cây: 500g; Đường :150g; Nước đun sôi để nguội : 1000ml) Sau đó vắt xác thu được dịch xác bã từ trái cây.  Lên men acetic dịch chiết từ xác bã trái cây Tiếp 25% giống A6 (nhân giống II) vào môi trường dịch chiết xác bã nho và bổ sung thêm 5% ethanol. Lên men bằng phương pháp sục khí. Theo dõi sự tạo thành acid qua các ngày lên men, đo hàm lượng acid sinh ra mỗi ngày cho đến khi hàm lượng này không tăng nữa. Chương 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 3.1. Thu thập mẫu giấm và khảo sát 1 số đặc tính của mẫu giấm Từ 10 mẫu giấm thu được ở Long An, Thành phố Hồ Chí Minh, Bạc Liêu chúng tôi xác định hàm lượng acid tổng của các mẫu giấm và xác định giá trị pH của các mẫu giấm. 3.1.1. X ác định hàm lượng acid tổng của các mẫu giấm Xác định hàm lượng acid tổng trong các mẫu giấm bằng phương pháp chuẩn độ dùng NaOH 0,1N với phenoltalein làm chất chỉ thị màu ta thu được kết quả trình bày ở bảng 3.1 3.1.2. Xác định giá trị pH của các mẫu giấm Đi đôi với việc xác định hàm lượng acid tổng chúng tôi tiến hành xác định độ pH của các mẫu giấm. Giá trị pH của các mẫu giấm được trình bày ở bảng 3.1. Bảng 3.1 :Hàm lượng acid tổng và giá trị pH của các mẫu giấm Ký hiệu mẫu Địa điểm thu mẫu Hàm lượng acid tổng (g/l) Giá trị pH 1 Long An 18,1 2,8 2 Long An 21,7 2,57 3 Tp HCM 25,6 2,46 4 Tp HCM 17,03 2,89 5 Tp HCM 33,2 2,3 6 Tp HCM 9,4 3,04 7 Tp HCM 13,5 2,95 8 Tp HCM 12,5 3,12 9 Tp HCM 8,3 3,3 10 Bạc Liêu 19,3 2,7 Biểu đồ 3.1 Hàm lượng acid tổng (g/l) của các mẫu giấm 0 10 20 30 40 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 maãu giaám H /l ac id to ång (g /l) H/l acid toång Biểu đồ 3. 2: Giá trị pH của các mẫu giấm 0 1 2 3 4 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 maãu giaám pH pH Nhận xét: Tùy theo phương thức lên men và nguyên liệu lên men và chủng giống sẽ tạo nên sản phẩm có hàm lượng acid khác nhau. Các mẫu 2,3,5,10 có hàm lượng acid cao có khả năng sẽ phân lập đựợc những chủng giống tốt từ nguồn giấm này. 3.2. Phân lập và khảo sát 1 số đặc điểm phân loại của vi khuẩn acetic 3.2.1. Phân lập Qua quá trình phân lập các mẫu giấm trên môi trường ethanol-cao nấm men-CaCO3 trong 3-4 ngày kết quả tạo được những khuẩn lạc có hình dạng, màu sắc, kích thước khác nhau. Trong đó có các chủng tạo vòng tan, chúng tôi tiến hành làm thuần được 11 chủng sinh acid khác nhau. Bảng 3.2 : Các chủng phân lập được từ các mẫu giấm Mẫu giấm Số chủng phân lập được Ky hiệu chủng phân lập 2 3 4 5 7 10 2 1 1 2 2 3 A1, A2 A3 A4 A5, A6 A7, A8 A9, A10, A11 Hình 3.1 : Khả năng làm tan CaCO3 của chủng A3 3.2.2. Một số đặc điểm phân loại của vi khuẩn 3.2.2.1. Dạng khuẩn lạc và hình thái của các chủng khảo sát Đặc tính về hình dạng, kích thước, màu sắc khuẩn lạc trạng thái di động, hình dạng tế bào và trạng thái Gram được trình bày ở bảng 3.3 Hình 3.2 Trạng thái Gram của chủng A3 Hình 3.3:Dạng khuẩn lạc của chủng A3 Bảng 3.3 : Dạng khuẩn lạc và hình thái chủng khảo sát Đặc điểm Hình thái khuẩn lạc Kích Màu sắc Hình thái tế bào Khả Gram Chủng thước khuẩn lạc (mm) khuẩn lạc năng di động A1 Bìa tròn,gom gọn,bề mặt khuẩn lạc lõm 0.3-0.4 Trắng ngã vàng Que,đơn - - A2 Bìa tròn. Gom gọn,bề mặt khuẩn lạc hơi lõm 0.3-0.4 Vàng nhạt Que, đơn - - A3 Bìa tròn, đều,bề mặt khuẩnlạc phẳng,trơnláng 0.4-0.5 Vàng nhạt Que, đơn,kết đôi hoặc kết ba - - A4 Bìa tròn, bề mặt bóng, hơi nhô cao 0,3-0.5 Vàng nhạt Que,kết đôi + - A5 Bìa nhăn, bề mặt lì, 0.3-0.4 Trắng đục Que.đơnhoặc kết đôi - - A6 Bìa tròn đều,bề mặt khuẩn lạc bóng 0.4-0.5 Vàng Que, đơn + - A7 Bìa nhăn,bề mặt khuẩn lạc lõm 0.3-0.4 Trắng đục Que,đơn - - A8 Bìa tròn,bề mặt láng,nhô cao 0.3-0.4 Trắng ngã vàng Que, đơn hoặc kết đôi - - A9 Bìa tròn,bề mặt khuẩn lạc bóng 0.1-0.2 Trắng đục Hình que,đơn hoặc kết đôi - - A10 Bìa tròn, gom gọn.Bề mặt khuẩnlạc nhô cao, bóng 0.1-0.2 Vàng nhạt Que,kết đôi hoặc đơn + - A11 Bìa tròn,bề mặt khuẩn lạc không nhô cao 0.1-0.15 Vàng nhạt Que - - Các đặc tính về khả năng tạo khuẩn lạc trên môi trường Ethanol-Cao nấm men-CaCO3, các đặc trưng về hình thái tế bào,trạng thái Gram đã sơ bộ được các chủng khảo sát mang đặc tính của vi khuẩn sinh acid. Nhưng để định danh sơ bộ các vi khuẩn này đến cấp độ giống chúng tôi tiếp tục khảo sát các đặc tính sinh lý, sinh hóa của các chủng vừa xét. 3.2.2.2 Đặc điểm sinh lý- sinh hóa của các chủng khảo sát Vi khuẩn Acetic có đặc tính chung như sinh catalase, phát triển trên môi trường Glutamate, môi trường manitol, không làm tan chảy gelatin, không phân giải Dextrin….  Định tính acid acetic Trong quá trình phân lập, trên moi trường có nguồn cacbon là ethanol chúng tôi tuyển chọn được các chủng có vòng phân giải là CaCO3, tức là các chủng này có khả năng oxy hóa ethanol thành acid hữu cơ tương ứng là acid acetic. Để kiểm chứng điều này, chúng tôi tiến hành định tính acid acetic tạo thành trong môi trường nuôi cấy các chủng trên bằng phương pháp dùng dung dịch FeCl3 5%. Kết quả là tất cả các chủng phân lập đều có khả năng tạo acetic acid. Hình 3.4. Khả năng tạo acid acetic của các chủng phân lập  Định lượng acid acetic Sau khi nuôi các chủng khảo sát trên môi trường tăng sinh, rồi chuyển sang môi trường nhân giống cấp 1, môi trường nhân giống cấp 2, sau đó là môi trường định lượng. Sau 7 ngày định lượng acid acetic tạo ra theo phương pháp xác định acid tổng. Kết quả trình bày ở bảng 3.4 Bảng 3.4: Hàm lượng acid tổng trong môi trường nuôi cấy các chủng khảo sát Chủng vi khuẩn Hàm lượng acid tổng(%) A1 0,54 A2 1,77 A3 1,98 A4 1,34 A5 1,25 A6 2,01 A7 0,56 A8 1,64 A9 1,728 A10 1,56 A11 0,576 Biểu đồ 3.3: Hàm lượng acid tổng trong môi trường nuôi cấy các chủng phân lập 0 0.5 1 1.5 2 2.5 A1 A3 A5 A7 A9 A1 1 Chuûng H /l ac id to ång (% ) H/l acid toång(%) Nhận xét: Chủng A3 và A6 có hàm lượng acid tổng tạo thành cao hơn các chủng còn lại. Ở những thí nghiệm về các điều kiện lên men chúng tôi chọn 2 chủng này tiếp tục khảo sát.  Đặc tính sinh catalase Khi nhỏ H2O2 vào giọt dịch nuôi cấy các chủng khảo sát trên tiêu bản. Kết quả các chủng đều sủi bọt. Như vậy các chủng đều sinh catalase  Khả năng phân giải Dextrin của vi khuẩn Các chủng đều không có khả năng phân giải dextrin. Hình 3.5: Khả năng không phân giải Dextrin của chủng A3  Khả năng tạo -pyrone của vi khuẩn Kết quả khảo sát cho thấy các chủng không có khả năng tạo -pyrone.  Khả năng tạo H2S của vi khuẩn Kết quả khảo sát cho thấy tất cả các chủng đều không có khảnăng tạo H2S  Khả năng oxy hoá acetate hoặc lactate của vi khuẩn Kết quả cho thấy chủng A3, A4, A5 có khả năng oxy hoá acetate( thể hiện qua sự chuyển màu từ màu vàng hơi xanh sang xanh dương), còn các chủng còn lại không có khả năng oxy hoá acetate( màu vàng hơi xanh). Như vậy, trong 11 chủng khảo sát có 3 chủng thuộc giống Acetobacter (A3 , A4, A5) và 8 chủng thuộc giống Gluconobacter (A1, A2, A6 ,A7, A8, A9, A10, A11 ) Hình 3.6 : khả năng oxy hoá acetate của các chủng phân lập  Khả năng phát triển trên môi trường Mannitol của vi khuẩn Kết quả khảo sát khả năng phát triển trên môi trường Mannitol cho thấy tất cả các chủng đều có khả năng phát triển trên môi trường này. Hình 3.7: Khả năng phát triển trên môi trường Mannitol của chủng A3 và chủng A6 3.3. Khảo sát một số điều kiện ảnh hưởng đến sự lên men acetic 3.3.1. Chọn giống Trong quá trình lên men định lượng acid acetic tạo ra chúng tôi xác định được 2 chủng tạo acid acetic cao nhất là chủng A3 và A6. Do đó những thí nghiệm sau chúng tôi quyết định chọn 2 chủng này để khảo sát. 3.3.2. Chọn môi trường 3.3.2.1 Ảnh hưởng của pH Nuôi cấy các chủng khảo sát ở môi trường có pH khác nhau biến thiên từ 2,5 đến 6,8 và nuôi trong 30 o C trong 4 ngày, đo OD ở bước sóng 660nm thu được kết quả trình bày ở bảng 3.5 Bảng 3.5: Ảnh hưởng của pH lên sự tăng trưởng của các chủng thông qua mật độ quang pH Chủng 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 A3 0,024 0,078 0,085 0,42 0,475 0,67 0,73 0,59 0,53 A6 0,034 0,073 0,178 0,34 0,438 0,56 0,63 0.572 0,475 Biểu đồ 3.4: Ảnh hưởng của pH lên sự tăng trưởng của các chủng khảo sát thông qua mật độ quang 0 0.2 0.4 0.6 0.8 2.5 3 3.5 4 4.5 5 5.5 6 6.5 Trò soá maät ñoä quang pH A3 A6 Nhận xét Qua kết quả thu được chúng tôi nhận thấy các chủng khác nhau có khỏang pH rộng hẹp khác nhau. Khoảng pH thích hợp cho hầu hết các chủng 4,5-> 6,0. pH=5,5 là tối thích đối với chủng khảo sát, ở những thí nghiệm sau chúng tôi sử dụng giá trị pH này để khảo sát. 3.3.2.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ Nuôi các chủng khảo sát ở môi trường pH giống nhau ( pH= 4.5), nhưng nuôi ở các nhiệt độ khác nhau: 150C, 200C, 280C, 300C, 350C, 370C, 400C, 450C. Sau 4 ngày đo OD ở bước sóng 660nm thu được kết quả trình bày ở bảng sau. Bảng 3.6: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự tăng trưởng của các chủng thông qua mật độ quang Nhiệt độ Chủng 150C 200C 280C 300C 350C 370C 400C 450C A3 - 0,095 0,185 0,31 0,227 0,163 - - A6 - 0,098 0,262 0,334 0,23 0,157 - - Biểu đồ 3.5: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự tăng trưởng của các chủng thông qua mật độ quang 0 0.1 0.2 0.3 0.4 15 20 28 30 35 37 40 45 nhiệt độ gi á t r ị O D Chủng A3 Chủng A6 Nhận xét Qua kết quả thu được chúng tôi nhận thấy khoảng nhiệt độ để các chủng có thể tăng trưởng được là 25-370C. Nhiệt độ tối thích là 300C, ở những thí nghiệm sau chúng tôi sử dụng nhiệt độ này để lên men. 3.3.2.3 Ảnh hưởng của mật độ giống ban đầu Nuôi các chủng khảo sát trên môi trường tăng sinh và nhân giống cấp I, II rồi chuyển vào môi trường định lượng, nuôi cấy lắc trong 7 ngày. Sau đó định hàm lượng acid tạo thành bằng phương pháp xác định acid tổng. Bảng 3.7 : Ảnh hưởng của hàm lượng giống ban đầu đối với sự tạo thành acid của các chủng khảo sát 5% 10% 15% 20% 25% 30% 35% A3 13,1 g/l 13,9 g/l 14,3 g/l 19,8 g/l 20,5 g/l 15,9 g/l 15,5 g/l A6 11,2 g/l 14,4 g/l 15,3 g/l 20,3 g/l 21,5 g/l 16,7 g/l 15,5 g/l Biểu đồ 3.6: Ảnh hưởng của mật độ giống ban đầu đối với sự tạo thành acid của các chủng khảo sát 0 5 10 15 20 25 5% 10% 15% 20% 25% 30% 35% maät ñoä gioáng ban ñaàu no àng ñ oä ac id to ång (g /l) A3 A6 Nhận xét Hàm lượng giống ban đầu (chủng A3 và A6) là 25% thì nồng độ acid là cao nhất. Nếu hàm lượng giống ban đầu thấp thì không đủ vi khuẩn để chuyển hóa ethanol thành acid acetic. Nếu hàm lượng giống ban đầu quá cao thì sẽ có sự cạnh tranh của vi khuẩn gây ra ức chế sự oxy hóa ethanol thành acid acetic. Do đó ở những thí nghiệm tiếp theo chúng tôi sử dụng lượng giống ban đầu là 25%. 3.3.2.4. Nồng độ ethanol thích hợp cho quá trình lên men Sau khi nuôi cấy chủng vi khuẩn ở môi trường tăng sinh và nhân giống cấp I, II. Chuyển dịch nuôi cấy vào môi trường định lượng có nồng độ ethanol tương ứng là 3%, 4%, 5%, 8%, 10%, 12%. Kết quả xác định hàm lượng acid tổng sinh ra của 2 chủng: A3, A6 sau 7 ngày được trình bày ở bảng 3.8 Bảng 3.8: ảnh hưởng của nồng độ rượu đến sự tạo thành acid tổng của chủng A3 Nồng độ ethanol Môi trường 3% 4% 5% 6% 8% 10% 12% MT1 15,3 g/l 17,7 g/l 21,3 g/l 19,6 g/l 14,9 g/l 13,5 g/l 9,7 g/l MT2 15,5 g/l 18,5 g/l 22,5 g/l 21,1 g/l 16,8 g/l 12,3 g/l 12,5 g/l Biểu đồ 3.7: ảnh hưởng của nồng độ rượu đến sự tạo thành acid tổng của chủng A3 0 5 10 15 20 25 3% 4% 5% 6% 8% 10% 12% noàng ñoä ethanol ban ñaàu h/ l a ci d to ång (g /l) MT1 MT2 Bảng 3.9: Anh hưởng của nồng độ rượu đến sự tạo thành acid tổng của chủng A6 Nồng độ ethanol MT 3% 4% 5% 6% 8% 10% 12% MT1 15,1 g/l 18,6 g/l 21,8 g/l 21,4 g/l 17,3 12,0 g/l 9,5 g/l MT2 16,3 g/l 19,4 g/l 22,7 g/l 22,7 g/l 18,5 g/l 13,2 g/l 11,5 g/l Biểu đồ 3.8 : Ảnh hưởng của nồng độ rượu đến sự tạo thành acid tổng của chủng A6 0 5 10 15 20 25 3% 4% 5% 6% 8% 10% 12% noàng ñoä ethanol ban ñaàu h/ l a ci d to ång MT1 MT2 Nhận xét: - Nồng độ ethanol ban đầu thích hợp nhất là 5%. Nồng độ ethanol quá thấp hoặc quá cao đều cho hàm lượng acid tổng thấp.Vì ở nồng độ thấp giống đã chuyển hoá hết ethanol mà không còn nguồn cơ chất để chuyển hoá tiếp theo. Còn ở nồng độ cao giống bị ức chế. - Do đó những thí nghiệm sau chúng tôi sử dụng nồng độ ethanol là 5% - Môi trường 2 không hấp khử trùng vẫn lên men tạo được sản phẩm chứng tỏ rằng hàm lượng giống đưa vào môi trường đã khống chế được sự nhiễm. 3.3.2.5. Thời gian nuôi cấy thích hợp Cấy giống từ môi trường thạch nghiêng vào erlen chứa môi trường tăng sinh, nuôi cấy lắc, đo mật độ tế bào, cho đến khi tỉ số OD giảm. Kết quả trình bày ở bảng sau Bảng 3.10: Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy trong môi trường tăng sinh của các chủng thông qua mật độ quang Thời gian Chủng 24 giờ 48 giờ 72 giờ 96 giờ 120 giờ 144 giờ A3 0,065 0,096 0,159 0,237 0,189 0,145 A6 0,090 0,148 0,253 0,173 0,164 0,153 Biểu đồ 3.9: Anh hưởng của thời gian nuôi cấy trong môi trường tăng sinh của các chủng thông qua mật độ quang 0 0.1 0.2 0.3 24 48 72 96 120 144 giôø gi aù tr ò O D A3 A6 Sau đó dịch nuôi cấy sang môi trường nhân giống cấp I, nuôi cấy lắc, đo mật độ tế bào, cho đến khi tỉ số OD giảm. Bảng 3. 11: Anh hưởng của thời gian nuôi cấy trong môi trường nhân giống cấp I của các chủng thông qua mật độ quang Thời gian Chủng 24 giờ 48 giờ 72 giờ 96 giờ 120 giờ 144 giờ A3 0,070 0,166 0,215 0,297 0,264 0,155 A6 0,098 0,53 0,303 0,231 0,217 0,208 Biểu đồ 3.10: Anh hưởng của thời gian nuôi cấy trong môi trường nhân giống cấp I của các chủng thông qua mật độ quang 0 0.1 0.2 0.3 0.4 24 48 72 96 120 144 giôø gi aù tr ò O D A3 A6 Nhận xét Kết quả cho thấy: đối với chủng A3 ở giờ 96 đo được trị số mật độ quang cực đại và sau đó giảm dần; đối với chủng A6 ở giờ 72 đo được trị số mật độ quang cực đại và sau đó giảm dần. Do đó khi chuyển sang môi trường nhân giống II: đối với chủng A3 chúng tôi lấy dịch nhân giống I ở thời điểm 96 giơ; đối với chủng A6 chúng tôi lấy dịch nhân giống I ở thời điểm 72 giờ. 3.3.2.6. Xác định mật độ vi khuẩn trong dịch nhân giống để chuẩn bị lên men Sau đó chuyển 20% dịch nuôi cấy sang môi trường nhân giống cấp II, nuôi cấy lắc: + Chủng A3 sau 96 giờ , đếm khuẩn lạc. + Chủng A6 sau 72 giờ, đếm khuẩn lạc. Bảng 3.12 : Tổng số vi khuẩn hay khuẩn lạc trong 1ml dịch nuôi cấy Chủng Khuẩn lạc (CFU/ml) A3 47.106 A6 53.106 Nhận xét Kết quả thu được cho thấy số vi khuẩn trong dịch nhân giống II của các chủng khảo sát đủ lớn để tiếp tục bước vào giai đoạn lên men. 3.3.3. Các phương pháp nuôi cấy : nuôi cấy tĩnh- nuôi cấy bằng thiết bị lên men sục khí, thiết bị lên men hồi lưu Chuyển khoảng 20% dịch nhân giống cấp II sang môi trường định lượng, đồng thời nuôi cấy bằng 3 phương pháp: phương pháp nuôi cấy tĩnh, phương pháp nuôi cấy sục khí, phương pháp nuôi cấy bằng thiết bị lên men hồi lưu 3.3.3.1 Phương pháp nuôi cấy tĩnh Chuyển khoảng 20% dịch nhân giống cấp II sang môi trường định lượng, nuôi cấy tĩnh, đo hàm lượng acid sinh ra bằng phương pháp xác định acid tổng, kết quả trình bày ở bảng 3.13 Bảng 3.13: Ảnh hưởng của thời gian dối sự tạo thành acid tổng của các chủng khảo sát (phương pháp nuôi cấy tĩnh) 24 giờ 48 giờ 72 giờ 96 giờ 120 giờ A3 1,99 g/l 2,7 g/l 4,03 g/l 4,75 g/l 6,6 g/l A6 2,45 g/l 2,89 g/l 4,52 g/l 5,67 g/l 6,76 g/l Biểu đồ 3.11: Ảnh hưởng của thời gian dối sự tạo thành acid tổng của các chủng khảo sát (phương pháp nuôi cấy tĩnh 0 2 4 6 8 24 48 72 96 120 giôø no àng ñ oä ac id to ång (g /l) A3 A6 3.3.3.2 Phương pháp nuôi cấy bằng thiết bị lên men sục khí Chuyển 20% dịch nhân giống cấp II sang môi trường định lượng, nuôi cấy bằng thiết bị lên men sục khí , đo hàm lượng acid sinh ra bằng phương pháp xác định acid tổng, kết quả trình bày ở bảng 3.14 Bảng 3.14: Ảnh hưởng của thời gian đối sự tạo thành acid tổng của các chủng khảo sát (phương pháp nuôi cấy sục khí 24 giờ 48 giờ 72 giờ 96 giờ 120 giờ A3 10,2 g/l 15,5 g/l 20,1 g/l 27,8 g/l 17,2 g/l A6 9,8 g/l 13,6 g/l 21,6 g/l 29,7 g/l 18,7 g/l Biểu đồ 3.12: Ảnh hưởng của thời gian đối sự tạo thành acid tổng của các chủng khảo sát (phương pháp nuôi cấy sục khí) 0 10 20 30 40 24 48 72 96 120 giôø h/ l a ci d to ång (g /l) A3 A6 3.3.3.3 .Phương pháp nuôi cấy bằng thiết bị lên men hồi lưu  Thu nhận BC sử dụng để làm giá thể Nhân giống 1: Sau khi cấy Acetobacter xilynum trên môi trường sản xuất BC và lên men tĩnh trong vòng 5 ngày nhận thấy 1 lớp màng trắng trên bề mặt môi trường. Nhân giống2: Sau khi cấy giống cấp I vào môi trường , lên men tĩnh nhận thấy xuất hiện 1 lớp màng trắng trên bề mặt môi trường nuôi cấy. Hình 3.8 : Kết quả nhân giống cấp 2 (thu BC) Lên men thu BC: Tiến hành lên men tĩnh trong khay nhựa, sau 1 tuần thu được các miếng BC có bề dày khoảng 1,5cm.  Cố định chủng khảo sát trên chất mang BC: Ngâm miếng BC đã qua xử lý để làm giá thể trong dịch nhân giống 2 của chủng khảo sát (Chủng A3 và chủng A6) trong 24 giờ, đặt trên máy lắc. Mật độ vi khuẩn phát triển trên giá thể BC ta có thể tính được bằng cách đếm gián tiếp khuẩn lạc, thu được kết quả trình bày ở bảng 3.15 Bảng 3.15: tổng số khuẩn lạc hay vi khuẩn hiếu khí trên 1g BC Chủng Khuẩn lạc (CFU/ml hoặc CFU/g) A3 5,1.105 A6 6,8.105 3.3.3.3 Lên men acetic bằng thiết bị lên men hồi lưu Hàm lượng acid sinh ra tính bằng phương pháp xác định acid tổng. Kết quả trình bày ở bảng 3.16 Bảng 3.16: Ảnh hưởng của thời gian đối sự tạo thành acid tổng của các chủng khảo sát (phương pháp nuôi cấy bằng thiết bị lên men hồi lưu) Thời gian Chủng 24 giờ 48 giờ 72 giờ 96 giờ 120 giờ A3 15,5 g/l 17,9 g/l 23,3 g/l 29,5 g/l 24,6 g/l A6 13,4 g/l 19,3 g/l 24,6 g/l 29,8 g/l 23,7 g/l Biểu đồ 3.13: Ảnh hưởng của thời gian dối sự tạo thành acid tổng của các chủng khảo sát (phương pháp nuôi cấy bằng thiết bị lên men hồi lưu) 0 10 20 30 40 24 48 72 96 120 giôø h/ l a ci d( g/ l) A3 A6 Nhận xét Phương pháp nuôi cấy tĩnh tốn nhiều thời gian hơn phương pháp lên men sục khí và lên men bằng phương pháp lên men hồi lưu. Do vi khuẩn acetic là loài hiếu khí bắt buộc nên khi có nhiều oxy thì sự oxy hóa ethanol thành acid acetic sẽ diễn ra nhanh hơn. Ở phương pháp sục khí và hồi lưu: Hàm lượng acid tổng tăng dần từ lúc bắt đâu nuôi cấy cho đến 96 giờ, sau đó bắt đầu giảm dần, nguyên nhân do vi khuẩn đã chuyển hóa hết ethanol, sau đó xảy ra sự quá oxy hóa . Hình 3.9 : Thiết bị lên men hồi lưu Hình 3.10 : Thiết bị lên men sục khí 3.4. Ứng dụng: lên men giấm bằng cơ chất là trái cây 3.4.1 Xử lý trái cây để làm rượu Sử dụng các loại trái cây: dứa, nho để làm rượu thu được, rượu dứa và rượu nho với hàm lượng được trình bày ở bảng sau Bảng 3.17: Hàm lượng rượu trái cây Rượu Rượu nho Rượu dứa Hàm lượng rượu 8g/l 7g/l Dùng rượu này để lên men giấm. Xác bã các loại trái cây sẽ cho lên men tiếp trong khỏang thời gian thích hợp, thu dịch chiết từ xác bã với hàm lượng rượu không đáng kể để lên men giấm. 3.4.2 Lên men giấm từ xác bã trái cây.  Xác bã dứa - Xác bã dứa thu được sau khi làm rượu, cho lên men tự nhiên trong 5 ngày và 15 ngày, vắt lấy dịch chiết. Sử dụng dịch chiết này làm nguyên liệu để lên men giấm bằng phương pháp sục khí. Thu được kết quả sau Bảng 3.18: Hàm lượng acid tổng sinh ra trong môi trường có dịch chiết xác bã dứa 24 giờ 48 giờ 72 giờ 96 giờ 120 giờ 5 ngày 14,2 g/l 16,5 g/l 25,6 g/l 30,8 g/l 19,9 g/l 15 ngày 15,4 g/l 16,8 g/l 26,8 g/l 32,5 g/l 21,4 g/l Biểu đồ 3.14 :Hàm lượng acid tổng sinh ra trong môi trường có dịch chiết xác bã dứa 0 10 20 30 40 24 48 72 96 120 giôø h/ l a ci d to ång (g /l) 5 ngaøy 15 ngaøy Nhận xét Trong môi trường có dịch chiết xác bã trái dứa hàm lượng acid tổng tăng rõ rệt. Lượng acid tổng của xác ba dứa lên men 15 ngày cao hơn xác bã lên men 5 ngày do lượng ethanol trong xác bã lên men 15 ngày cao hơn (do lượng glucozơ chuyển hoá thành ethanol nhiều hơn). Lượng ethanol cao đủ để cho chủng khảo sát chuyển hóa ethanol thành acid acetic.  Xác bã nho Xác bã nho thu được sau khi làm rượu, cho lên men tự nhiên trong 5 ngày và 15 ngày, vắt lấy dịch chiết. Sử dụng dịch chiết này làm nguyên liệu để lên men giấm bằng phương pháp sục khí. Thu được kết quả sau Bảng 3.19: Hàm lượng acid tổng sinh ra trong môi trường có dịch chiết xác bã nho T/g lên men giấm T/g lên men xác bã 24 giờ 48 giờ 72 giờ 96 giờ 120 giờ 5 ngày 14,8 g/l 15,9 g/l 23,8 g/l 31,1 g/l 21,3 g/l 15 ngày 15,3 g/l 17,2 g/l 25,7 g/l 33,5 g/l 21,5 g/l Biểu đồ 3.15 :Hàm lượng acid tổng sinh ra trong môi trường có dịch chiết xác bã nho 0 10 20 30 40 24 48 72 96 120 giôø ha øm lö ôïn g ac id to ång (g /l) 5 ngaøy 15 ngaøy Nhận xét Lượng acid tổng của xác bã nho lên men 15 ngày cao hơn xác bã lên men 5 ngày do lượng ethanol trong xác bã lên men 15 ngày cao hơn (do lượng glucozo chuyển hoá thành ethanol nhiều hơn). Lượng ethanol cao đủ để cho chủng khảo sát chuyển hoá thành acid acetic. Chúng tôi nhận thấy hàm lượng acid tổng trong môi trường có dịch chiết xác bã nho cao hơn trong môi trường dịch chiết xác bã thơm.Vậy nguyên liệu là xác bã nho thích hợp để làm giấm hơn xác bã thơm. 3.4.3. Lên men giấm trong môi trường có rượu trái cây. Trong môi trường lên men có chứa 20% rượu trái cây, cho lên men bằng phương pháp sục khí, thu được kết quả sau: Bảng 3.20 :Hàm lượng acid sinh ra trong môi trường có bổ sung rượu trái cây Thời gian (giờ) 24 48 72 96 120 144 H/l acid tổng sinh ra trong mt có rượu dứa 15,7g/l 17,5g/l 23,5g/l 32,6g/l 23,8g/l 26,4g/l H/l acid tổng sinh ra trong mt có rượu nho 16,2g/l 18,9g/l 24,7g/l 33,8g/l 22,5g/l 27,2g/l Biểu đồ 3.16 :Hàm lượng acid sinh ra trong môi trường có bổ sung rượu trái cây 0 10 20 30 40 24 48 72 96 120 144 giôø ha øm lö ôïn g ac id (g /l) m/t coù röôïu döùa m/t coù röôïu nho Hàm lượng acid tổng tăng dần, đến 120 giờ bắt đầu giảm. Chúng tôi tiếp tục bổ sung thêm 5% lượng ethanol và nhận thấy hàm lượng acid tăng lên.Vậy chứng tỏ hàm lượng acid ở giờ 120 bị giảm có thể là do vi khuẩn đã chuyển hoá hết ethanol mà không còn cơ chất để chuyển hoá tiếp. Do đó khi chúng tôi tiếp thêm ethanol nghĩa là tiếp thêm cơ chất cho giống, giống tiếp tục sử dụng ethanol để chuyển hoá tiếp nên hàm lượng acid lại tăng lên. 3.4.4. Nhận định về các mẫu giấm trái cây. Mẫu giấm lên men từ xác bã trái cây và rượu trái cây có mùi đặc trưng của từng loại trái cây, hương vị thơm ngon hơn các mẫu giấm ở các vị trí đã thu mẫu. Giấm lên men từ xác bã trái cây đục hơn giấm lên men từ rượu trái cây. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 1. Kết luận Qua thời gian thực hiện đề tài, chúng tôi đã thực hiện được 1 số kết quả như sau:  Thu thập được 10 mẫu giấm ở Tp.HCM và một số tỉnh khác, đồng thời khảo sát hàm lượng acid và pH của các mẫu giấm thu được. Từ các mẫu giấm trên, phân lập, khảo sát đặc tính sinh lý, sinh hóa và xác định đến cấp độ giống 11 chủng vi khuẩn. (3 chủng thuộc giống Acetobacter là A3, A4, A5 và 8 chủng thuộc giống Gluconobacter là A1, A2, A6, A7, A8, A9, A10, A11).  Chọn 2 chủng sinh acid cao (Chủng A3 và chủng A6) để tiếp tục khảo sát các điều kiện lên men.  Khảo sát được một số điều kiện lên men acetic để chủng khảo sát cho hàm lượng acid cao như: o Nhiệt độ: 300C. o pH: 5,5. o Mật độ giống bổ sung ban đầu: 25%. o Nồng độ ethanol: 5%.  Thực hiện các phương pháp lên men acetic: o Phương pháp tĩnh hàm lượng acid không cao do độ thoáng khí thấp. o Phương pháp lên men sục khí và hồi lưu tạo được hàm lượng acid cao trong thời gian ngắn do các phương pháp này cung cấp đủ oxy để các chủng khảo sát nhanh chóng chuyển hoá ethanol thành acid acetic. Phương pháp hồi lưu, chủng khảo sát được cố định trên chất mang BC nên hàm lượng acid tạo thành cao hơn phương pháp sục khí.  Ứng dụng trong lên men giấm từ môi trường có bổ sung rượu trái cây và môi trường có bổ sung dịch chiết xác bã trái cây bằng phương pháp sục khí. Thu được giấm trái cây có hàm lượng acid cao trong thời gian ngắn và có hương vị thơm ngon đặc trưng của từng loại trái cây. 2. Đề nghị Vì thời gian có hạn nên còn 1 số vấn đề chưa thực hiện được, do đó chúng tôi xin đề nghị:  Tiếp tục khảo sát hàm lượng acid tổng sinh ra tại điểm 168 giờ, 192 giờ… ở phần lên men giấm bổ sung rượu trái cây có bổ sung thêm ethanol khi hàm lượng acid tổng sinh ra giảm .  Tìm cách nâng cao hiệu suất của phương pháp lên men hồi lưu và ứng dụng phương pháp này để lên men giấm trái cây. TAØI LIEÄU THAM KHAÛO TIEÁNG VIEÄT 1. Nguyeãn Leâ Vaân Anh (2002),Khaûo saùt coâng ngheä saûn xuaát Acetic acid coâng nghieäp, Khoùa luaän cöû nhaân sinh hoïc- Chuyeân ngaønh sinh hoùa ÑH Khoa Hoïc Töï Nhieân TpHCM . 2. Kieàu Höõu AÛnh (1999), Vi sinh vaät coâng nghieäp, Nhaø xuaát baûn Khoa Hoïc Kyõ Thuaät. 3. Ñaùi Duy Ban vaø coäng söï (1998), Phoøng beänh ung thö, NXB Y hoïc-Haø Noäi. 4. Laâm Thò Kim Chaâu, Nguyeãn Thöôïng Leänh, Vaên Ñöùc Chính, Thöïc taäp lôùn sinh hoaù, Tuû saùch ÑH Khoa Hoïc Töï Nhieân-TPHCM. 5. Nguyeãn Laân Duõng (1997), Vi sinh vaät hoïc (taäp 1,2), NXB ÑH & THCN-Haø Noäi. 6. Nguyeãn Laân Duõng ( dòch) N.X.Egoro (hieäu ñính) (1986). Thöïc taäp vi sinh vaät hoïc, NXB Giaùo duïc. 7. Nguyeãn Laân Duõng vaø caùc taùc giaû (1977), Moät soá phöông phaùp nghieân cöùu vi sinh vaät hoïc (taäp 2), NXB KH & KT. 8. Nguyeãn Laân Duõng, Ñoøan Xuaân Möôïu, Nguyeãn Phuøng Tieán, Phaïm Vaên Ty (1975), Moät soá phöông phaùp nghieân cöùu vi sinh vaät hoïc (taäp 1), NXB KH &KT. 9. Nguyeãn Theá Duõng(2006), Khaûo saùt coâng ngheä leân men töø 1 soá dòch traùi caây vuøng nhieät ñôùi, Luaän vaên thaïc só sinh hoïc ÑHSP TPHCM 10. Nguyeãn Thaønh Ñaït (1953), Nguyeãn Duy Thaûo, Vi sinh vaät hoïc, NXB Mir. 11. Phan Thò Hoàng Haûi (2001), Böôùc ñaàu söû duïng cuøi baép coá ñònh vi khuaån acetic ñeå laøm giaám töø nöôùc eùp thôm. Khoùa luaän cöû nhaân khoa hoïc, chuyeân nghaønh vi sinh-sinh hoïc phaân töû, ÑH khoa hoïc töï nhieân TP.HCM 12. Vuõ Thò Hoàng (2000), Choïn vaø khaûo saùt vaøi ñaëc ñieåm phaân loaïi, öùng duïng cuûa vi khuaån acetic, Luaän aùn thaïc syõ khoa hoïc, chuyeân ngaønh vi sinh-Ñaïi Hoïc Khoa Hoïc Töï Nhieân. 13. Vuõ Thò Lan Höông (2007), Ñònh danh caùc chuûng vi khuaån sinh acetic acid phaân laäp taïi Thaùi Lan trong boä söu taäp gioáng BCC ( Biotec Culture Collection, Thaùi Lan), luaän vaên thaïc syõ khoa hoïc, chuyeân ngaønh vi sinh-Ñaïi Hoïc Khoa Hoïc Töï Nhieân. 14. Leâ Duy Linh vaø coäng söï (2001), Thöïc taäp vi sinh cô sôû, NXB ÑH quoác gia TP.HCM 15. Phuøng Ngoïc Thuøy Linh (2004), Phaân laäp vaø Tuyeån choïn caùc chuûng naám men duøng trong röôïu vang döùa, Luaän vaên toát nghieäp sinh hoïc ÑHSP TPHCM 16. Nguyeãn Quang Luaân (2005), Thu nhaän cheá phaåm töø vi khuaån acetic vaø thöû nghieäm khaû naêng baûo quaûn trong thöïc phaåm cheá bieán, Khoùa luaän cöû nhaân khoa hoïc, chuyeân ngaønh vi sinh-Ñaïi Hoïc Khoa Hoïc Töï Nhieân. 17. Nguyeãn Thieän Luaân, Leâ Ñoõan Dieän, Phan Quoác Kinh, Caùc loïai thöïc phaåm thuoác vaø thöïc phaåm chöùc naêng ôû Vieät Nam (1997), NXB Noâng nghieäp-Haø Noäi 18. Nguyeãn Ñöùc Löôïng (1996), Giaùo trình coâng ngheä sinh hoïc vi sinh vaät (taäp 1), tröôøng ÑH Baùch Khoa TPHCM 19. Ñinh Thò Kim Nhung, Nghieân cöùu 1 soá ñaëc ñieåm sinh hoïc cuûa vi khuaån Acetobacter vaø öùng duïng cuûa chuùng trong leân men acetic theo phöông phaùp chìm, Luaän aùn phoù tieán só Khoa hoïc- chuyeân nghaønh vi sinh hoïc,Ñaïi Hoïc Quoác Gia Haø Noäi 20. Löông Ñöùc Phaåm (1998), Coâng ngheä sinh hoïc vi sinh vaät, NXB noâng nghieäp. 21. Nguyeãn Höõu Phuùc (1998), Caùc phöông phaùp leân men thöïc phaåm truyeàn thoáng taïi Vieät Nam vaø caùc nuôùc trong vuøng, ÑH Môû- Baùn Coâng- TPHCM 22. Nguyeãn Höõu Phuùc (1996), Coâng ngheä sinh hoïc, Vi sinh coâng nghieäp, ÑH Môû- Baùn Coâng-TPHCM 23. Ñoøan Thò Ngoïc Thanh, Vuõ Xuaân Thònh,Tröômg Thieän Chí (2006), Leân men acetic acid-Leân men daám, Thöïc taäp chuyeân ñeà vi sinh,chuyeân ngaønh vi sinh-Ñaïi Hoïc Khoa Hoïc Töï Nhieân. 24. Ñoàng Thò Thanh Thu (1995), Hoùa Sinh öùng duïng, Tuû saùch Ñaïi Hoïc Toång Hôïp TPHCM. 25. Buøi Thò Nhu Thuaän, Nguyeãn Phuøng Tieán, Buøi Minh Ñöùc (1991), Kieåm nghieäm chaát löôïng vaø kieåm tra veä sinh an toøan thöïc phaåm ( taäp 1), NXB Y Hoïc. 26. Traàn Linh Thöôùc vaø coäng söï ,Thöïc taäp vi sinh naêm 4, ÑHKHTN TPHCM 27. Traàn Thò Thanh Thuûy (1998), Höôùng daãn thöïc haønh vi sinh vaät hoïc, NXB Giaùo Duïc. 28. Voõ Thò Anh Thy (2005) ,Coá ñònh teá baøo vi khuaän Actobacter aceti treân giaù theå Bacterial cellulose ñeå saûn xuaát acid acetic, Khoùa luaän cöû nhaân sinh hoïc- chuyeân ngaønh vi sinh ÑH Quoác Gia TPHCM 29. Traàn Theá Tuïc- Vuõ Maïnh Haûi (2000), Kyõ thuaät troàng Döùa, NXB Noâng nghieäp TIEÁNG ANH 30. Asai,T.(1935), Taxonomic studies on acetic and bacteria and allied oxidative bacteria isolated from fruits.A new claddification of oxidative bacteria, J.Agric.Chem.Soc.Japan. 31. A.Jorgensen, Microogamism and Fermentation,1988 32. Boehringer Mannheim, Acetic acid-Enzymatic BioAnalysin-Food Analysis – UV Methed, 1997 33. Beijerinck, M. W. (1898), Ueber die Arten der Essigbakterien, Zbl.Bakteriol. Parasitenkde. Infektionskrankh. Hyg., 2Abt. 34. De Ley, J. (1961), Comparative carbohydrate metabolism and a propsal for a phylogenetic relationship of the acetic acid bacterial, J. Gen. Microbio. 35. Dutta, D. and Gachhui, R. (2006), Novel nitrogen-fixing Acetobacter nitogenifigens sp. nov., isolated from Kombucha tea, Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 36. Gillis and Delley (1997), In Accetobacteraceae 37. Jojima, Y., Mahara, Y.,SuZuki, S.,Yokozeki,K., Yamanaka, S., Fudou,R., (2004), Sacharibacter floricola gen, nov., sp. Nov., a novel osmophilic acetic acid bacterium isolated from pollen, Int.J.Syst.Evol.Microbiol.,54,2263-2267. 38. Gossele, F., Swings, J., Kersters, K., and De Ley, J. (1983), Numerical analysis of phenotyphic features and protein gel electropherograms of Gluconobacter asai 1935 emend. mut. char. Asai, Iizuka and Komagata 1964, Int. J. Syst. Bacteriol. 39. Greenberg, D. E., Porcella, S. F., Stock, F., Wong, A., Conville, P. S., Murray, P. R., Holland, S.M, Zelazny, A. M. (2006), Granulibacter bethedensis gen. nov., sp. nov., a distinctive pathogenic acetic acid bacterium in the family Acetobacteraceae, Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 40. Katsura, K., Kawasaki, H., Potacharoen, W., Saono, S., Seki, T., Yamada, Y., Uchimura, T., and Komagata, K. (2001), Asaia siamensis sp. nov., an acetic acid bacterium in the - Proteobacteria, Int. J. Syst. Evol. Microbiol 41. Kondo, K. and Ameyama, M. (1958), Carbohydrate metabolism by Acetobacter species. Part I. Oxidative activity for various carbohydrates, Bull. Chem. Soc. Jpn. 42. Kersters, K., Lisdiyanti, P., Komagata, K and Swings, J. (2006), The family Acetobacteraceae: The genera Acetobacter , Acidomonas, Asaia,Gluconacetobacter, Gluconobacter and Kozakia. In: Dworkin, M., Flacow, S.,Rosenberg, E., Schleifer, K.- H.,Stackebrands, E. (Eds.), The Procaryotes, 3rd ed., vol. 5, Springer, New York. 43. H-J.Rehm and Greed, Biotechnology, Chapter 15 Vinegar, Volum 9 44. Michio Kozaki, Hisakazu Ino, Takashi Matsumoto (1997), Erlinda I.Dizon, Kapti Rahayu. Kuswanto and Priscila C.Sandhez,Studies on the Acid- producing Bacteria of Traditional vinegars from the Philippines and Indonesia. 45. S.A.Norrell, KE.Mersley (1997), Micrology Laboratory. 46. Tanasupawat,S.,Thawai,C.,Yukphan,P.,Moonmangmee,D.,Itoh,T.,Ada chi, O., and Yamada, Y. (2004), Gluconobacter thailandicus sp. Nov., an acetic acid bacterium in the -Proteobacteria, J.Gen. Appl. Microbiol., 50, 159-167. 47. Yamada, Y., Okada, Y., and Kondo, K. (1976), Isolation and characteriazation of “ polarly flagelleted itermediate strains “ in acetic acid bacteria, J. Gen. Appl. Microbiol. 48. Yamada, Y., Hosono, R., Lisdiyanti, P., Widyastyti, Y., Saono, S., Uchimura, T., and Komagata K. (1999), Idenfication of acetic acid bacteria isolated from Indonesia sources, especially of isolates classifield in the genus Gluconobacter, J. Gen. Appl. Microbiol. 49. Yukphan, P., Malimas, M., Potacharoen, W., tanasupawat, S., Tanticharoen, M., and Yamada, Y. (2005a), Neoasaia chiangmaiensis gen.nov., sp. Nov., a novel osmotolerant acetic acid bacterium in the Proteobacteria, J.Gen. Appl.Microbiol. 50. L.A Unkerkofer, J.Hickey (1997), Inductrial Fermentation.