Luận văn Chuyển gen GFP (green fluorescent protein) vào tế bào vi khuẩn pseudomonas fluorescens bằng phương pháp tiếp hợp ba thành phần

quyết định quá trình tái bắt cặp. Ở một nhiệt độ xác định, hai chỉ tiêu ảnh hƣởng đến tần số gặp gỡ là nồng độ DNA và thời gian phản ứng. Nồng 34 độ DNA, nghĩa là số lƣợng các trình tự bổ sung, càng cao thì xác suất chúng tiếp xúc với nhau càng tăng; kết quả là phản ứng lai phân tử tăng lên. Tƣơng tự, thời gian phản ứng càng dài thì xác suất nói trên càng lớn hơn và số lƣợng phân tử lai tăng dần cho đến khi toàn bộ các trình tự bổ sung đều tái bắt cặp. Nhiệt độ: Tốc độ phản ứng lai phụ thuộc nhiệt độ. Thông thƣờng tốc độ phản ứng lai cực đại ở nhiệt độ thấp hơn Tm của chính nucleic acid đó độ 25 %. Độ dài của các trình tự: Tốc độ lai tăng tỉ lệ thuận với căn bình phƣơng của độ dài các trình tự bổ sung. Lực ion: Nồng độ NaCl 1M làm tăng tốc độ phản ứng lên từ 5 đến 10 lần. Nồng độ NaCl vƣợt quá 1,2 M phản ứng lai hoàn toàn không còn tác dụng. 2.9.3 Các kiểu lai phân tử 2.9.3.1 Lai trong pha lỏng Các trình tự bổ sung (các mạch đơn) nằm trong môi trƣờng lỏng là một dung dịch đệm. Sự lai phân tử xảy ra khi các trình tự này gặp nhau do chuyển động nhiệt và khi nhiệt độ môi trƣờng thấp hơn Tm ít nhất vài độ.Trong thực tế , nhiệt độ lai đƣợc chọn thấp hơn Tm khoảng 15 oC; hơn nữa, ngƣời ta còn thêm formmide để làm giảm nhiệt độ lai. Đối với những trình tự ngắn, nhiệt độ lai đƣợc tính theo công thức đã nêu ở phần trên. Đối với các trình tự dài, nhiệt độ lai thông dụng là 42oC. 2.9.3.2 Lai trên pha rắn Lai trên pha rắn có cùng nguyên tắc với lai trên pha lỏng. Điểm khác biệt ở đây là một trong hai trình tự bổ sung (thƣờng là trình tự đích hay trình tự cần tìm) đƣợc cố định trên một giá thể rắn.Thuận lợi của việc sử dụng giá thể rắn là tạo dễ dàng trong thao tác và trong việc tách các trình tự không lai ra khỏi các phân tử lai. Mặt khác còn ngăn sự tái bắt cặp giữa hai mạch của cùng một phân tử. Bù lại việc phân tích định lƣợng các phân tử lai sau đó kém chính xác và hiệu quả lai thấp. Thật vậy, vận tốc lai trên pha rắn thấp hơn 10 lần so với vận tốc lai trong pha lỏng do một phần các nucleic acid đƣợc cố định trên giá thể bị che khuất, không tiếp xúc đƣợc với các trình tự bổ sung. 35 Trong rất nhiều ứng dụng của các phƣơng pháp lai trên pha rắn, nổi bật lên ba phƣơng pháp đƣợc sử dụng rộng rãi nhất là: phƣơng pháp Southern blot, Northern blot và dot blot. Trong đó phƣơng pháp này cho phép định lƣợng tƣơng đối một DNA đặc trƣng trong một hỗn hợp DNA mà không cần phải phân tách chúng ra. Phƣơng pháp này có thể đƣợc sử dụng cho RNA.Trong phƣơng pháp này ngƣời ta không chuyển nucleic acid từ gel lên màng nhƣ phƣơng pháp Southern blot hayNorthern blot mà đặt trực tiếp một lƣợng mẫu nhỏ lên màng lai thành một điểm – dot. Quá trình lai và phát hiện phân tử lai giống nhƣ đề cập ở trên. 36 Phần 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện khóa luận Thời gian:Khóa luận đƣợc tiến hành từ tháng 02 năm 2006 đến tháng 08 năm 2006. Địa điểm: Trung tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh Trƣờng Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh và phòng 118, 105 Bộ Môn Bảo Vệ Thực Vật, Khoa Nông Học, Trƣờng Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. 3.2 Vật liệu và phƣơng pháp nghiên cứu 3.2.1 Vật liệu thí nghiệm 3.2.1.1 Vi khuẩn E.coli DH5α (λ-pir) chứa plasmid pUT-gfp Trong thí nghiệm này sử dụng một biến thể của GFP, đó là thể đột biến P11 có sự thay đổi ở vị trí 167 aa Isoleucine thành aa Threonine làm thay đổi bƣớc sóng kích thích lên mức tối đa từ 396 nm thành 471 nm trong khi khôngg có sự thay đổi bƣớc sóng phát ra 502 nm so với 508 nm của GFP bình thƣờng. Đoạn PpsbA – RBS – gfp đƣợc thiết kế nhƣ sau: Đoạn gfp (P11) đƣợc cắt ra từ plasmid pGEMEX-2(P11) sử dụng cặp enzyme cắt NedI – BamHI, sau đó đƣợc chèn vào sau vùng RBS (T7 gen 10) dài 35 bp của plasmid pET22b, lại tiếp tục đƣợc cắt ra bằng cặp enzyme XbaI – BamHI, đọan này đƣợc chèn tiếp vào vùng MCS của plasmid pIC19H nhằm sử dụng những vị trí chèn này cho quá trình subclone.Promoter psbA là promoter cấu trúc, mạnh, phổ kí chủ rộng phân lập từ Amaranthus hybridus , cắt ra từ plasmid pRL427 bằng enzyme XbaI, đoạn 170 bp này đƣợc chèn vào vùng MCS nằm trƣớc vùng RBS – gfp, lại đƣợc cắt ra bằng cặp enzyme BglII – BamHI chèn vào plasmid pUC18Not, tiếp tục cắt ra bằng enzyme NotI và chèn vào plasmid pUT mini-Tn5 hình thành plasmid pUT-gfp. 37 Hình 3.1 Cấu trúc plasmid pUT-gfp. 3.2.1.2 Vi khuẩn E.coli DH5α (λ-pir) chứa plasmid pRK600 Plasmid pRK600 là một helper plasmid đƣợc sử dụng để huy động những plasmid lớn thông qua oriT, nó không tái bản lên, nhƣng sau một thời gian cho phép biểu hiện gen vận chuyển RK2 (S.Klein) chứa các yếu tố mob+ và tra+. 3.2.1.3 Vi khuẩn Pseudomonas fluorescens Bộ mẫu Pseudomonas fluorescens đƣợc giữ - 70oC, do các anh chị trƣớc đã phân lập và giữ nguồn. Các dòng đƣợc chọn từ bộ mẫu này đƣợc đem ra rã đông và tăng sinh trên môi trƣờng LB. Các dòng đƣợc chọn dựa trên đặc tính: phát sáng mạnh trên môi trƣờng KB, có tính đối kháng cao, có khả năng kí sinh trên rễ cây cà chua.Sau quá trình chọn lọc thấy dòng Pseudomonas fluorescens 73 tƣơng đối tốt hơn những dòng Pseudomonas fluorescens khác. Hình 3.2 Vi khuẩn Pseudomonas fluorescens nuôi trên môi trƣờng KB sau 24 giờ. Khuẩn lạc phát sáng Khuẩn lạc không phát sáng 38 Bảng 3.1 Đặc tính và nguồn gốc một số dòng vi khuẩn và plasmid liên quan trong thí nghiệm Dòng và plasmid Đặc tính Nguồn E.coli DH5α (λ-pir) Thi pro hsdR recA; chromosomal RP4; tra + ; Sm/Sp R Simon và cộng sự, 1983 pRK2013 Km R ; ColE1 ori; RK2-mob; RK2-tra Figurski, D. and Helinski, D.,1979 pRK600 ColE1 replicon with RK2 transfer region, helper plasmid; Cm R Finan và cộng sự, 1986 pUTmini-Tn5 Ap R ; Km R ; delivery plasmid for mini-Tn5 Herrero và cộng sự ,1990 pUC18Not Ap R ; lacZ; oriColE1; MCS flanked by NotI sites Herrero và cộng sự ,1990 pGEMEX-2 (P11) Ap R ; T7 promoter; contains P11 Heim và cộng sự, 1994 pET22B Ap R ; lacI; f1 ori Novagen, Madison, WI pIC19H Ap R ; lacZ Marsh, J.L., Erfle, M. and Wykes, E.J. (1984) pRL427 Ap R ; psbA promoter J. Elhai and C.P. Wolk, unpublished pUTgfp Delivery plasmid for mini-Tn5::gfp; Ap R ; Km R ; oriT(PR4); oriRK6 Tombolini và cộng sự, 1997 Ap R gen kháng Ampicillin Km R gen kháng Kanamycin Sm R gen kháng Streptomycin Sp R gen kháng Spectinomycin 39 3.2.2 Các thiết bị, dụng cụ Máy điện di Máy chụp gel Máy lắc định ôn Máy vortex Máy chiếu tia UV Kính hiển vi có chiếu huỳnh quang Bồn nƣớc ổn nhiệt (water bath) Tủ cấy vô trùng (micro flow) Tủ - 20oC, - 70oC Tủ sấy dụng cụ Nồi hấp (Autoclave) Máy ly tâm Máy đo Ph Cân kỹ thuật Ống nghiệm, đĩa petri Eppendorf 1,5 ml, 200 µl Micropipette (0.5-10 µl ; Pipet và đầu tip các loại 10 - 100 µl; 100 - 1000 µl) 3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 3.3.1 Phƣơng pháp triparental mating tiếp hợp đoạn gen gfp vào vi khuẩn Pseudomonas fluorescens (có tham khảo từ bài báo của Paul D. Shaw tháng 1 năm 1997 trên tạp chí Journal of bacteriology ) Bƣớc 1: Nuôi riêng 3 dòng vi khuẩn trong tủ lắc định ôn ở 28oC, tốc độ lắc 150 vòng/phút, để qua đêm. Vi khuẩn cho:Vi khuẩn E.coli DH5α (λ-pir) chứa plasmid pUT-gfp trong 5ml môi trƣờng LB chứa Ampicillin (50 µg/ml) và Kanamycin (50 µg/ml) Vi khuẩn hỗ trợ: Vi khuẩn E.coli DH5α (λ-pir) chứa plasmid pRK600 trong 5 ml môi trƣờng LB chứa Chloramphenicol (20 µg/ml) Vi khuẩn nhận: Vi khuẩn Pseudomonas fluorescens trong 5ml LB, tùy dòng mà có chứa loại và nồng độ kháng sinh thích hợp. Bƣớc 2: Hút lần lƣợt 3 dòng với tỉ lệ vi khuẩn cho: vi huẩn hỗ trợ: vi khuẩn nhận = 1 : 1: 3 cho vào ependorf 1,5 ml, vortex kỹ, ly tâm 12.000 vòng/phút, 1 phút, 20oC. Thu sinh khối, rửa lại với 1 ml nƣớc hấp vô trùng. Cho thêm vào eppendorf 100 - 200 µl nƣớc hấp vô trùng hòa tan sinh khối, đem vortex kỹ. Bƣớc 3: Cấy dịch vi khuẩn lên đĩa môi trƣờng KB, bằng cách sử dụng pipette nhỏ từng giọt (khoảng 1µl ) lên môi trƣờng ủ 6 – 24 giờ ở 28oC. Bƣớc 4: Sau khi khuẩn lạc hình thành, cho tiếp 1ml nƣớc hấp vô trùng vào đĩa petri hòa tan các khuẩn lạc. Tiếp tục hút khoảng 100 µl dịch vi khuẩn sang đĩa môi 40 trƣờng M9 (chứa Kanamycin 50 µg/ml) tráng đều trên bề mặt môi trƣờng, ủ 12 – 48 giờ ở 28oC. Chọn những khuẩn lạc thuần bằng cách sử dụng que tâm đã hấp, sấy. Cấy điểm sang đĩa môi trƣờng M9 (chứa Kanamycin 50 µg/ml) để giữ mẫu dành cho xem kính hiển vi. Cấy sang 5ml môi trƣờng LB (chứa Kanamycin 50µg/ml) cho vào tủ lắc định ôn, nhiệt độ 28oC, tốc độ lắc 150 vòng/phút. Sau 48 giờ tăng sinh, dịch khuẩn thu đƣợc đem đi ly tâm để thu sinh khối. 3.3.2 Ly trích DNA tổng số từ các dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens đã tiếp hợp Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng phƣơng pháp tách chiết DNA theo phƣơng pháp sử dụng CTAB/NaCl đã có cải tiến, qui trình thực hiện nhƣ sau: Bƣớc1: Sử dụng sinh khối vi khuẩn đã đƣợc tăng sinh ở trên để tiến hành ly trích genomic DNA. Bƣớc 2: Thu sinh khối vi khuẩn bằng cách ly tâm 10000 vòng/phút, 5phút, 4oC. Rửa sinh khối thu đƣợc với 1 ml nƣớc cất hai lần vô trùng và đánh tan bằng vortex (3 lần). Bƣớc 3: Hoà tan sinh khối vi khuẩn thu đƣợc trong 567 µl dung dịch TE và đánh tan bằng vortex, thêm 30 µl dung dịch SDS 10% và đánh tan bằng vortex. Sau đó ủ ở 37oC khoảng 1 - 2 giờ. Bƣớc 4: Cho thêm vào 100 µl dung dịch NaCl 5M, hòa tan thật kỹ bằng vortex. Bƣớc 5: Thêm vào 80 µl dung dịch CTAB/NaCl (khoảng 1/10 thể tích). Pha trộn (đánh tan bằng vortex), ủ ở 65oC trong 10 phút. Bƣớc 6: Thêm 500 µl dung dịch hổn hợp phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25 : 24 : 1; v/v) . Hòa lẫn đều bằng lắc tay, ly tâm ở 14.000 vòng/phút10 phút 4oC. Bƣớc 7: Thu hết dung dịch bên trên (dung dịch DNA) cho vào ống ly tâm mới (nếu không thể phân biệt mặt phân cách chung giữa các dung dịch, có thể ly tâm lần nữa ở tốc độ lớn hơn). Bƣớc 8: Thêm 780 µl dung dịch hổn hợp chloroform/isoamyl alcohol (24 : 1 ; v/v). Hòa lẫn đều bằng cách lắc tay, ly tâm 12.000 vòng/phút, 10 phút, 4oC. 41 Bƣớc 9: Thu lấy dung dịch bên trên cho vào ống ly tâm mới (khoảng 500 µl). Kết tủa DNA với isopropanol, dùng khoảng 0,6 thể tích của dung dịch (khoảng 300 µl) và ủ ở tủ - 20oC, 30 phút. Sau đó ly tâm 12.000 vòng/phút, 10 phút, 4oC, lấy kết tủa sau khi ly tâm. Bƣớc 10: Rửa kết tủa bằng cồn 70% (khoảng 500 µl). Tốt hơn có thể dùng ethanol 70% đƣợc làm lạnh ở - 20 oC, nghiêng nhẹ qua lại, ly tâm 13.000 vòng/phút, 10 phút, 4oC. Đổ cồn ra hết và làm khô bằng cách cho cồn bay hơi. Bƣớc 11: Hòa tan kết tủa trong 40 µl dung dịch TE 1X, đem mẩu giữ ở tủ 4oC trong suốt thời gian thử nghiệm. Kiểm tra kết quả ly trích genomic DNA Chuẩn bị gel agarose 0,8%: Cân 0,1g agarose cho vào 12,5 ml TAE 0,5X, lắc nhẹ cho agarose phân tán đều, đem đun trong lò viba ở 650 W, 2 phút. Để nguội, đổ vào khuôn có gắn lƣợc với số giếng mong muốn. Chờ gel đông (thƣờng 30 phút), rút lƣợc ra và bắt đầu tiến hành nạp mẫu. Nạp mẫu, xác lập các thông số điện di và đọc kết quả: Hút 2 µl genomic DNA đã ly trích ở trên, trộn đều với 2 µl đệm tải mẫu (loading buffer) 6X, sau đó hút hỗn hợp dung dịch bơm vào giếng tương ứng với số mẫu đã xác lập trước của gel agarose 0,8 %. Gel được đặt trong đệm TAE 0,5 X, hiệu điện thế 100 V, 250 mA và thời gian chạy là 15 phút. Sau đó, gel được lấy ra và nhuộm trong ethidium bromide 20 phút, rửa sạch và xem kết quả ly trích bằng máy Gel Doc 2.000, sử dụng phần mềm Quatity One 2.000 (Bio - Rad). 3.3.3 Phƣơng pháp Dot Blot 3.3.3.1 Chuyển DNA lên màng Bƣớc 1: Chuẩn bị màng Hybond N kích thƣớc 20 cm x 12 cm, dùng viết chì kẻ từng ô vuông 2 cm x 2 cm qua một lớp giấy mỏng chỉ để lại nét mờ, chừa 2 biên khoảng 2 cm để dễ thao tác. Bƣớc 2: Làm biến tính DNA:Cho 40 µl DNA đã đƣợc pha loãng vào eppendorf 200 µl, đun sôi mạnh trong 7 phút, chuyển nhanh lên đá giữ trong 2 phút.Cho tiếp 42 40 µl dung dịch đệm biến tính (NaOH 0,5M; NaCl 0,15M), vào eppendorf để 40 phút ở nhiệt độ phòng. Bƣớc 3: Chuyển lên màng.Hút 4 µl dung dịch DNA đã biến tính của từng mẫu lên từng ô, dùng máy sấy sấy khô ô này rồi mới lám ô tiếp theo, tránh để các mẫu tiếp xúc nhau. Bƣớc 4: Làm khô màng.Dùng kẹp giữ một góc màng và làm dấu bề mặt chứa DNA của màng. Đặt màng vào trong tủ sấy, màng đƣợc ủ ở 65oC trong khoảng 1 giờ cho đến khi các góc màng co lại. Bƣớc 5:Cố định DNA trên màng.Màng sau khi đƣợc làm khô, đƣợc đem xử lý dƣới UV trong tủ GS GENE LINKER TM UV CHAMBER (Bio - Rad) trong 50 giây (chú ý bề mặt DNA của màng hƣớng lên). Bƣớc 6: Đổ vào khoảng 150 ml dung dịch đệm trung tính (Tris – HCl 0,5M; NaCl 0,15M; pH 7,0) vào một cái khay, cho màng vào lắc nhẹ trong 1 phút, có thể lặp lại.Màng đƣợc ủ ở 65 oC trong khoảng 1 giờ cho đến khi các góc màng co lại là đƣợc. Sau đó màng đƣợc đem ra để chuẩn bị lai (hoặc cũng có thể giữ lại trong hộp kín cho đến khi tiến hành lai). 3.3.3.2 Phƣơng pháp ly trích DNA plasmid sử dụng SDS_kiềm (theo quy trình của Sambrook và cộng sự, 1989 có sửa đổi) Bƣớc 1:Hút dịch vi khuẩn cho vào eppendorf 1,5ml, ly tâm để thu sinh khối ở 10.000 vòng/phút, 5 phút, 20oC, lặp lại nhiều lần để thu hết dịch vi khuẩn.Rửa sinh khối bằng 1ml nƣớc cất vô trùng . Hình 3.3 Màng Hybon-N sau khi chuyển DNA lên màng. 43 Bƣớc 2: Cho 150 ml dung dịch 1 vào eppendorf chứa sinh khối, vortex cho đến khi sinh khối vi khuẩn tan hết. Cho tiếp 150 m dung dịch 2, đảo nhẹ. Sau đó thêm 150 ml dung dịch 3, đảo nhẹ .Ly tâm 12.000 vòng /phút, 10 phút, 20oC, thu dịch nổi cho vào eppendorf mới tƣơng ứng. Bƣớc 3: Cho vào mỗi eppendorf 300µl phenol/Chloroform/isoamylalchohol (25:24:1), vortex đều, ly tâm 10.000vòng/phút, 5 phút, 20oC, thu dịch nổi cho vào các eppendorf mới tƣơng ứng. Bƣớc 4: Cho vào mỗi eppendorf 300µl Chloroform/isoamylalchohol, lắc đều ly tâm 10.000 vòng/phút, 5 phút 20oC, thu dịch nổi cho vào eppendorf mới tƣơng ứng. Bƣớc 5: Thêm vào mỗi eppendorf 300.µl Isopropanol, ủ ở -20oC trong 30 phút, sau đó ly tâm 13.000vòng/phút, 20 phút 4oC. Hút bỏ dịch nổi thu kế tủa. Bƣớc 6: Rửa tủa bằng cách cho 500 µl ethanol 70 % lạnh vào mỗi eppendorf ly tâm 13.000 vòng/phút, 10 phút 4oC. Hút bỏ dịch nổi thu kết tủa và làm khô bằng cách úp ngƣợc trên giấy thấm. Bƣớc 7: Cho 40 µl TE vào mỗi eppendorf để hòa tan kết tủa. Bƣớc 8: Hút 2 µl DNA trộn đều với 2 µl loading dye chạy điện di trên agaose nồng độ 0,8 % trong 30 phút để xem kết quả tách chiết 3.3.3.3 Thực hiện đánh dấu đoạn DNA plasmid pUT-gfp Sử dụng DNA plasmid pUT-gfp đƣợc ly trích từ vi khuẩn E.coli DH5α (λ-pir) chứa plasmid pUT-gfp có kích thƣớc 8,4 kb để làm mẫu dò.Trƣớc khi thực hiện phản ứng đánh dấu cần phải pha loãng dung dịch cross - linker thành dung dịch có nồng độ sử dụng, dung dịch này có thể bảo quản lạnh 2 – 8oC trong một tuần. Bên cạnh đó, DNA cũng cần phải đƣợc pha loãng với nƣớc tới nồng độ 10 ng/µl dùng để đánh dấu (nồng độ muối trong mẫu DNA nên đƣợc giữ ở mức thấp nhất, không quá 50 mM). Thực hiện phản ứng đánh dấu theo kit của Amersham gồm các bƣớc nhƣ sau: Bƣớc 1: Cho 10 µl DNA đã pha loãng vào eppendorf 200 µl và làm biến tính hoàn toàn bởi nhiệt độ bằng cách đun 5 – 7 phút trong nƣớc đang sôi mạnh. 44 Bƣớc 2: Làm lạnh nhanh trên đá trong 5 phút, đem ly tâm nhanh ở tốc độ 4.000 vòng/phút, 30 giây để dồn dung dịch xuống đáy ống. Bƣớc 3: Thêm 10 µl dung dịch đệm phản ứng reaction buffer (có sẵn trong bộ kit) vào DNA đã đƣợc làm lạnh. Đảo trộn nhẹ cho đều, phản ứng nên giữ trên đá. Bƣớc 4: Thêm 2 µl chất đánh dấu labelling reagent (có sẵn trong bộ kit), trộn nhẹ, đều. Bƣớc 5: Thêm 10 µl dung dịch phản ứng cross - linker. Trộn đều, ly tâm nhanh 4.000 vòng/phút, 30 giây để dồn hỗn hợp xuống đáy. Bƣớc 6: Ủ 30 phút ở 37oC cho phản ứng xảy ra. Bƣớc 7: Mẫu dò (mẫu dò) có thể đƣợc dùng ngay hoặc giữ trên đá đến 2 giờ. Trong trƣờng hợp muốn bảo quản lâu hơn, mẫu dò đã đánh dấu đƣợc giữ trong 50 % glycerol ở - 15oC đến - 30oC trong 6 tháng (không cần xử lý gì thêm dung dịch mẫu dò này sau khi bảo quản). 3.3.3.4 Thực hiện phản ứng lai Trƣớc khi thực hiện phản ứng lai, xác lập nhiệt độ của buồng lai là 55oC, đồng thời làm nóng dung dịch đệm lai ở 55oC. Song song đó, chúng tôi tính toán các thông số sau: Diện tích màng: 12 x 16 = 192 (cm2 ) Thể tích đệm lai: 0,25 x 192 = 48 (ml) Nồng độ mẫu dò cần: 10 x 48 = 480 (ng) Thể tích mẫu dò: 480 / 10 = 48 (µl) Qui trình thực hiện phản ứng lai Bƣớc 1: Tiền lai. Khi nhiệt độ của buồng lai đạt ổn định ở 55oC và dung dịch đệm lai cũng đã đƣợc làm nóng đến 55oC, tiến hành rửa ống lai bằng nƣớc cất vô trùng, sau đó bơm vào ống lai 40 ml dung dịch đệm lai. Dùng kẹp đặt màng vào ống lai sao cho bề không có DNA tiếp xúc với thành ống lai. Bên cạnh đó, dùng một ống lai khác cũng bơm vào đó 40 ml nƣớc. Đặt hai ống lai vào buồng lai theo cách đối song, đậy cửa buồng lai lại và điều chỉnh số vòng quay ở mức trung bình. Thời gian cho bƣớc này là 15 phút. Bƣớc 2: Lai. Trộn 8 ml dung dịch đệm lai với 48 µl mẫu dò, bơm hỗn hợp vào giữa ống lai (tránh nhỏ trực tiếp lên màng). Để phản ứng qua đêm (16 giờ). 45 Rửa màng sau khi lai Trƣớc khi rửa màng cần làm nóng dung dịch rửa 1 (primary wash buffer) đến 55oC. Thực hiện rửa màng theo các bƣớc sau: Bƣớc 1: Loại bỏ dung dịch đệm lai, thêm vào ống lai khoảng 20 ml dung dịch rửa 1. Nhiệt độ và số vòng quay của buồng lai giống nhƣ khi lai, thời gian rửa là 10 phút. Bƣớc 2: Lặp lại bƣớc trên cũng trong 10 phút. Bƣớc 3: Loại bỏ dung dịch rửa 1, dùng kẹp gấp màng ra và cho vào hộp nhựa sạch với bề có DNA nằm trên. Cho vào đó dung dịch rửa 2 (secondary wash buffer) khoảng 50 ml, lắc nhẹ ở nhiệt độ phòng trong 10 phút. Bƣớc 4: Lặp lại bƣớc trên trong 10 phút. Lúc này màng có thể đƣợc giữ trong dung dịch rửa 2 trong 30 phút để chuẩn bị cho bƣớc phát hiện. 3.3.3.5 Phát hiện kết quả trên phim X - ray Chuẩn bị màng với chất phát hiện CDP - Star Màng sau khi đƣợc rửa lần 2, sẽ đƣợc phủ lên trên một lớp dịch của chất phát hiện, chất này làm cho các phân tử mẫu dò phát sáng. Các bƣớc thực hiện nhƣ sau: Bƣớc 1: Dùng saran wrap trải trên một mặt phẳng nằm ngang, phẳng, có phủ một lớp khăn giấy. Bƣớc 2: Lấy màng từ trong dung dịch rửa 2 ra, phải ráo và đặt lên trên miếng saran wrap với bề có DNA hƣớng lên trên. Bƣớc 3: Hút 1 ml chất phát hiện CDP- Star nhỏ lên trên màng. Bƣớc 4: Dùng một tấm saran wrap khác phủ bề mặt màng, trải đều chất phát hiện bằng que thủy tinh, tránh để lại bọt khí. Bƣớc 5: Sau đó màng lai đƣợc lấy ra, và đặt ở giữa hai miếng saran wrap mới với kích thƣớc phù hợp (chú ý trong quá trình thao tác với màng không để màng bị khô). Ủ màng với phim trong cassette:Màng đƣợc đặt giữa Cassette 30 x 40 Konica, sau đó đặt một tấm phim Konica 30 x 40 cm lên trên màng tránh sự dịch chuyển của màng. Đậy cassette lại và tính thời gian ủ 30 phút hoặc 1 giờ (thƣờng phản ứng sẽ có tín hiệu sáng tốt nhất sau 1 giờ từ khi cho chất phát hiện vào). Tùy theo tính chất mẫu 46 dò mà thời gian ủ phản ứng phát hiện khác nhau. Các thao tác trên đƣợc thực hiện trong buồng tối. Rửa phim và làm khô: Khi đã hoàn thành giai đoạn ủ phim với màng, phim sẽ đƣợc đem ra khỏi cassette và ngâm trong dung dịch developer trong 5 phút. Sau đó, lấy phim ra và ngâm trong dung dịch fixer khoảng 3 phút. Cuối cùng đem phim ra rửa dƣới vòi nƣớc sạch và dùng kẹp treo lên giá làm khô ở nhiệt độ phòng. Chú ý các thao tác trên đều đƣợc thực hiện trong buồng tối, khi phim đã ngâm xong trong dung dịch fixer có thể đem phim ra ngoài sáng để rửa dƣới vòi nƣớc. 3.3.4 Quan sát vi khuẩn trên kính hiển vi Nhỏ một giọt nƣớc hấp vô trùng lên lam, dùng que tâm chấm vào khuẩn lạc rồi hòa đều vào giọt nƣớc đậy lame nghiêng 45o quan sát dƣới vật kính 10X, 20X, 40X, 100X (có giọt dầu). Chiếu dƣới tia có bƣớc sóng lam (BW – Blue Wavelength). 47 Phần 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết quả 4.1.1 Kết quả tiếp hợp đoạn gen gfp vào vi khuẩn Pseudomonas fluorescens 4.1.1.1 Nuôi cấy vi khuẩn trong môi trƣờng LB Môi trƣờng LB là môi trƣờng dinh dƣỡng dùng để tăng sinh vi khuẩn. Kết quả nuôi cấy ở các thời gian khác nhau 16 giờ, 20 giờ, 24 giờ.Cho thấy kết quả nuôi cấy sau 16 giờ thì khả năng tiếp hợp cao nhất. Cho thấy các dòng vi khuẩn này có chu kỳ tƣơng đƣơng nhau.Khi Các dòng vi khuẩn cùng bƣớc vào pha cấp số thì trên vách tế bào hình thành những đặc điểm thích hợp cho tiếp hợp (nhƣ hình thành cầu tiếp hợp từ vi khuẩn cho sang vi khuẩn nhận). 4.1.1.2 Nuôi cấy vi khuẩn trên môi trƣờng KB Môi trƣờng KB là môi trƣờng dinh dƣỡng cho các dòng vi khuẩn tiếp hợp. Hút dịch vi khuẩn cho: vi khuẩn hỗ trợ: vi khuẩn nhận ở các tỷ lệ: 1: 1: 1 = 500 µl: 500 µl: 500 µl 1: 1: 2 = 400 µl: 400 µl: 800 µl 1: 1: 3 = 300 µl: 300 µl: 900 µl 1: 1: 4 = 200 µl: 200 µl: 800 µl 1: 1: 5 = 200 µl: 200 µl: 1000 µl Kết quả hút dịch vi khuẩn ở tỷ lệ 1: 1: 3 cho thấy khả năng tiếp hợp cao nhất. Trong khi theo quy trình đề nghị thì ở tỷ lệ 1: 1: 1 cho kết quả cao nhất điều này rút ra tùy vào dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens khác nhau, điều kiện môi trƣờng khác nhau mật độ vi khuẩn phát triển cũng khác nhau, vì không thực hiện thí nghiệm đo OD mật độ từng dòng vi khuẩn nên ta không thể biết chính xác mật độ vi khuẩn. Thời gian nuôi cấy trên môi trƣờng KB từ 6 – 24 giờ, thời gian nuôi chung này càng lâu cho thấy khả năng tiếp hợp càng cao. Khuẩn lạc Hình 4.1 Kết quả cấy vi khuẩn trên môi trƣờng KB sau 24 giờ. 48 4.1.1.3 Nuôi cấy vi khuẩn trên môi trƣờng M9 Môi trƣờng M9 là môi trƣờng tối thiểu dùng để chọn lọc riêng từng dòng vi khuẩn. Mật độ dịch vi khuẩn cấy từ môi trƣờng KB sang môi trƣờng M9 càng loãng thì khuẩn lạc mọc càng rời rạc thuận lợi cho việc chọn lọc. Do đó ta có thể tiến hành pha loãng nhiều lần hoặc cấy riêng từng khuẩn lạc bằng phƣơng pháp cấy điểm để đƣợc mật độ vi khuẩn thích hợp. Thƣờng khoảng sau 12 giờ xuất hiện những khuẩn lạc li ti là có thể cấy chuyển tiếp. a) b) c) d) Hình 4.2 Kết quả cấy trên môi trƣờng M9. (a), (b) Kết cấy vi khuẩn trên môi trường M9 sau 12 giờ; (c), (d) Kết quả cấy chuyển bằng phương pháp cấy điểm để được khuẩn lạc tách rời trên môi trường M9. Hình (a), (b) cho thấy khuẩn lạc mọc li ti dày đặc rất khó cho việc chọn lọc để tách riêng từng dòng đem kiểm tra gen gfp đã chuyển bằng phƣơng pháp Dot Blot rồi xem lại trên kình hiển vi. 49 4.1.1.4 Kết quả làm đối chứng: Đối chứng tiến hành đồng thời và tƣơng tự theo các bƣớc của quy trình tiếp hợp, nhƣng 3 dòng vi khuẩn cho, vi khuẩn hổ trợ, vi khuẩn nhận đƣợc nuôi riêng qua 3 môi trƣờng LB, KB, M9. Kết quả không có sự khác biệt đến môi trƣờng M9, thì trên đĩa môi trƣờng chỉ có vi khuẩn Pseudomonas fluorescencs hình thành khuẩn lạc. Điều này cho thấy môi trƣờng M9 với kháng sinh Km, không phải là môi trƣờng chọn lọc thích hợp nhất cho dòng Pseudomonas fluorescencs đã đƣợc tiếp hợp vì sau khi tiếp hợp trên đĩa môi trƣờng M9 sẽ có 2 dòng Pseudomonas fluorescencs đã đƣợc tiếp hợp và dòng Pseudomonas fluorescencs không tiếp hợp, không có khả năng tách riêng dòng Pseudomonas fluorescencs đã đƣợc tiếp hợp. a) b) c) Hình 4.3 Kết quả đối chứng trên môi tƣờng M9. (a) Dòng vi khuẩn E.coli DH5α (λ-pir) chứa plasmid pUT-gfp; (b) Dòng vi khuẩn E.coli DH5α (λ-pir) chứa plasmid pRK600; (c) Dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens . 50 4.1.2 Kết quả ly trích DNA tổng số từ các dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens đã tiếp hợp Các dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens đƣợc tăng sinh trên môi trƣờng LB 48 giờ ở 27oC. Sau 48 giờ nuôi cấy, các dòng đều cho sinh khối. Chúng tôi đã ly trích đƣợc 48 dòng Hình 4.4 Kết quả ly trích genomic DNA đã pha loãng từ các dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens đã tiếp hợp. Kết quả pha loãng của mẫu 5,10,18, 28, 39 cần tăng nồng độ DNA trong mẫu pha loãng lên gấp đôi. Mẫu 48 khi ly trích thì có băng nhƣng pha loãng lại không có băng sáng cần pha loãng lại để đƣợc nồng độ tƣơng đƣơng với các mẫu khác Các vệt sáng kéo dài phía dƣới DNA tổng số có thể là RNA hoặc DNA bị đứt gãy. Lỗi này có thể do thao tác, khi thu phần dịch nổi chứa DNA , tôi đã hút lẫn phần cặn bên dƣới, hoặc do thao tác quá mạnh nên làm đứt gãy DNA. Mặt khác, trong qui trình Băng DNA tổng số DNA hoặc RNA tạp 51 này tôi không sử dụng men RNAse và protein K để loại bỏ các phân tử RNA và protein còn lẫn tạp trong mẫu. Tuy nhiên, do yêu cầu sử dụng mẫu DNA ly trích không cần đạt độ tinh khiết cao, không cần hiệu chỉnh chính xác nồng độ DNA nên không cần đo OD hoặc sử dụng phân tử Mass, chỉ cần lƣợng DNA trong các mẫu đều nhau, vì thế với kết quả có đƣợc vẫn đảm bảo điều kiện để tôi thiết lập qui trình. Từ thực nghiệm, tôi rút ra đƣợc những điểm cần lƣu ý trong quá trình ly trích: - Dụng cụ ly trích cần khử trùng cẩn thận để phòng ngừa sự tạp nhiễm. - Mang bao tay, khử trùng tay cẩn thận bằng cồn 70 % trƣớc khi tiến hành ly trích. - Bƣớc thu sinh khối vi khuẩn rất dễ xảy ra sự tạp nhiễm giữa các mẫu với nhau, nên khử trùng tay cẩn thận khi thực hiện với những mẫu khác nhau. - Thao tác nhẹ nhàng trong khi ly trích, thao tác mạnh có thể làm đứt gãy DNA. - Thu dung dịch DNA chỉ hút phần dịch nổi, không nên hút lẫn phần cặn phía dƣới. - DNA phải đƣợc làm khô hoàn toàn trƣớc khi hòa tan với TE. - Eppendorf chứa mẫu DNA phải sạch. - Hóa chất ly trích nhƣ: phenol / chloroform / isoamyl alcohol; CTAB có khả năng gây độc cho ngƣời sử dụng, khi sử dụng và pha chế phải thực hiện trong buồng hút. - Khi nhuộm gel và đọc kết quả ly trích, không đƣợc tiếp xúc trực tiếp ethidium bromide và tia UV. Kết quả điện di các mẫu có lƣợng DNA tƣơng đối đều nhau, đƣợc sử dụng làm mẫu DNA để tiến hành chuyển lên màng lai thực hiện phƣơng pháp Dot Blot 4.1.3 Kết quả thực hiện phản ứng lai Dot Blot Hình 4.5 Kết quả lai. Xẩy ra phản ứng lai Không xẩy ra phản ứng lai 52 Kết quả lai 48 mẫu DNA cho thấy có 13 mẫu cho kết quả dƣơng tính, đó là các mẫu 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 17, 20, 27, 31, 44. Trong đó các mẫu 3, 4, 6, 7 mờ hơn các mẫu khác cho thấy sự bắt cặp giữa mẫu dò và DNA ít hơn các mẫu khác.Có thể là số bản sao gfp đƣợc chuyển trong 4 mẫu này ít hơn, mà chỉ dựa vào phƣơng pháp Dot Blot ta không thể biết chính xác số bản sao đã chuyển, đây cũng là khuyết điểm của phƣơng pháp này. Có thể tiến hành thêm phƣơng pháp Sounthern Blot sử dụng đoạn gen gfp là mẫu dò để biết chính xác số bản sao đã chuyển. Những điều cần lƣu ý khi thực hiện chuyển DNA đến màng lai 1. Mang bao tay không phấn, sử dụng kẹp không răng khi thao tác với màng lai. 2. Cắt một góc màng để đánh dấu mặt có DNA. 3. Làm khô màng hoàn toàn trƣớc khi chiếu dƣới tia UV, màng có thể đƣợc làm khô ở nhiệt độ 80oC hoặc có thể làm khô ở nhiệt độ phòng qua đêm. Những lƣu ý trong quá trình lai 1. Dung dịch lai phải đƣợc làm nóng đến nhiệt độ lai trƣớc khi tiền lai. 2. Khi đặt màng vào dung dịch lai, màng phải đƣợc thấm ƣớt hoàn toàn, giữa màng lai và thành ống lai không đƣợc có bọt khí. 3. Không nên cho mẫu dò trực tiếp lên màng lai. Không đƣợc biến tính mẫu dò trƣớc khi sử dụng. 4. Nhiệt độ lai có thể dao động trong khoảng 50oC - 70oC. Nhiệt độ lai dƣới 50oC chỉ thích hợp cho những mẫu dò ngắn. Không nên lai ở nhiệt độ trên 85oC. Lƣu ý khi rửa màng lai 1. Dung dịch rửa 1 phải làm nóng đến nhiệt độ lai. 2. Sau khi rửa bằng dung dịch rửa 2, màng có thể để ở nhiệt độ phòng khoảng 30 phút trƣớc khi phát hiện. Lƣu ý trong khi phát hiện 1. Tác nhân phát hiện nên đƣợc chuyển qua một tip sạch với lƣợng thích hợp cho mỗi lần sử dụng. Không đƣợc làm bẩn tác nhân phát hiện. 2. Màng đặt trong saran wrap không đƣợc có bọt khí. Nếu có bọt khí, cần loại bỏ bằng cách dùng que thủy tinh gạt nhẹ nhàng trên bề mặt màng, tác nhân phát hiện còn dƣ cũng đƣợc loại bỏ. 53 3. Không đƣợc dịch chuyển phim khi đặt phim lên trên màng. Kéo dài thời gian tiếp xúc phim với màng lai sẽ làm cho phần nền của phim bị đậm màu hoặc có thể làm phim bị đen hoàn toàn. Chú ý khi rửa phim phát hiện 1. Khi lấy phim ra ủ với màng lai, phải thực hiện trong buồng tối, không đƣợc cho phim tiếp xúc với ánh sáng. 2. Vì phim rất nhạy với ánh sáng nên buồng tối rửa phim phải đảm bảo tối hoàn toàn. Dung dịch rửa phim phải pha đúng theo hƣớng dẫn của nhà sản xuất. Khi thực hiện rửa phim không nên để phim tiếp xúc với thành chứa dung dịch. 4.1.4 Kết quả xem trên kính hiển vi phát huỳnh quang Olympus BX51 a) b) c) d) Hình 4.6 Vi khuẩn Pseudomonas fluorescens chụp qua màn hình monitor. (a) Chụp ở vật kính 10X; (b) Chụp ở vật kính 20X; (c) Chụp ở vật kính 40X; (d) Chụp ở vật kính 100X A:Vi khuẩn Pseudomonas fluorescens dƣới các độ phóng đại khác nhau. A A A A 54 Hình 4.7 Vi khuẩn Pseudomonas fluorescens phát sáng dƣới tia UV đƣợc chụp qua thị kính. B :Vi khuẩn Pseudomonas fluorescens chứa gen gfp phát sáng dƣới tia UV. Trong 13 mẫu có kết quả lai dƣơng tính thì chỉ có 4 mẫu phát sáng dƣới tia UV, còn 9 mẫu là không phát sáng. Điều này có thể do nhiều nguyên nhân, có thể chia ra hai trƣờng hợp: Trong 9 mẫu lai cho kết quả dƣơng tính đó vốn cũng không có gen gfp. Do khi thực hiện phản ứng Dot Blot, chúng tôi đã sử dụng toàn bộ plasmid pUT-gfp để làm mẫu dò mà plasmid pUT-gfp là một loại plasmid lớn (8,4 kb) và có thể trong quá trình tiếp hơp những đoạn đƣợc chuyển từ vi khuẩn cho sang vi khuẩn nhận chỉ là một phần của plasmid pUT-gfp mà lại không chứa đoạn gen gfp thì vẫn xảy ra sự bắt cặp giữa mẫu DNA và mẫu dò (phản ứng dƣơng tính giả). Trong 9 mẫu lai cho kết quả dƣơng tính đó vốn có gen gfp nhƣng lai không biểu hiện ra kiểu hình điều này phụ thuộc vào promoter (hoặc xảy ra sự im lặng gen – giải thích ở phần phụ lục), có thể do trong quá trình tiếp hợp promoter đã không đƣợc B B B B 55 chuyển, hoặc chỉ chuyển một phần nên mất đi hoạt tính, hoặc đƣơc chuyển toàn bộ nhƣng lại gặp một yếu tố ức chế rong vi khuẩn nhận làm promoter bất hoạt. 4.2 Thảo luận Cơ chế quá trình tiếp hợp ba thành phần Vi khuẩn hỗ trợ có plasmid pRK600 chứa vùng hổ trợ chuyển gen RK2 chứa các yếu tố tra+ mob+ giúp vi khuẩn cho hình thành cầu tiếp hợp và chuyển gen vào vi khuẩn nhận. Vi khuẩn cho sử dụng hệ thống transposon mini-Tn5 đột biến hai lần mang gen gfp để chuyển gen. Đây không phải hệ thống chuyển gen đặc hiệu nó có thể xâm nhập bất kì vị trí nào trong bộ gen vi khuẩn nhận, cũng có thể tồn tại ngoài bộ gen (nhƣng trƣờng hợp này vi khuẩn thƣờng chết do sự nhân lên quá nhiều của gen lạ) Sơ đồ 4.1 Cơ chế quá trình tiếp hợp ba thành phần. 56 Phƣơng pháp tiếp hợp ba thành phần (triparental mating) 1. Nuôi riêng 3 dòng vi khuẩn trong tủ lắc định ôn ở 28oC, tốc độ lắc 150 vòng/phút, trong 16 giờ. Vi khuẩn cho:Vi khuẩn E.coli DH5α (λ-pir) chứa plasmid pUT-gfp trong 5ml môi trƣờng LB chứa Ampicillin (50 µg/ml) và Kanamycin (50 µg/ml) Vi khuẩn hỗ trợ: Vi khuẩn E.coli DH5α (λ-pir) chứa plasmid pRK600 trong 5 ml môi trƣờng LB chứa Chloramphenicol (20 µg/ml) Vi khuẩn nhận: Vi khuẩn Pseudomonas fluorescens trong 5ml LB, tùy dòng mà có chứa lọai và nồng độ kháng sinh thích hợp 2. Hút lần lƣợt 3 dòng với tỉ lệ vi khuẩn cho: vi khuẩn hỗ trợ: vi khuẩn nhận = 1 : 1: 3 = 300 µl: 300 µl: 900 µl cho vào ependorf 1.5 ml, vortex kỹ, ly tâm 12.000 vòng/phút, 1 phút, 200C. Thu sinh khối, rửa lại với 1 ml nƣớc hấp vô trùng. Cho thêm vào ependorf 100 - 200 µl nƣớc hấp vô trùng hòa tan sinh khối, đem vortex kỹ. 3. Cấy dịch vi khuẩn lên đĩa môi trƣờng KB, bằng cách sử dụng pipet nhỏ từng giọt (khoảng 1µl ) lên môi trƣờng ủ 24 giờ ở 28oC. 4. Sau khi khuẩn lạc hình thành, cho tiếp 1ml nƣớc hấp vô trùng vào đĩa petri hòa tan các khuẩn lạc. Tiếp tục hút khoảng 100 µl dịch vi khuẩn sang đĩa môi trƣờng M9 (chứa Kanamycin 50µg/ml) trang đều trên mặt đĩa, ủ 12 giờ ở 280C. Chọn những khuẩn lạc riêng biệt, sử dụng que tâm đã hấp, sấy Cấy điểm sang đĩa môi trƣờng M9 (chứa Kanamycin 50µg/ml) để giữ mẫu dành cho xem kính hiển vi. Cấy sang 5ml môi trƣờng LB (chứa Kanamycin 50µg/ml) cho vào tủ lắc định ôn, nhiệt độ 28oC, tốc độ lắc 150 vòng/phút. Sau 48 giờ tăng sinh, dịch khuẩn thu đƣợc đem đi ly tâm để thu sinh khối. Ly trích DNA plasmid 1. Hút dịch vi khuẩn cho vào eppendorf 1,5 ml, ly tâm để thu sinh khối ở 10.000 vòng/phút trong 5 phút ở 20oC, lặp laị nhiều lần để thu hết dịch vi khuẩn. Rửa sinh khối bằng 1 ml nƣớc cất vô trùng . 57 2. Cho 150 ml dung dịch 1 vào eppendorf chứa sinh khối, vortex cho đến khi sinh khối vi khuẩn tan hết. Cho tiếp 150 m dung dịch 2, đảo nhẹ. Sau đó thêm 150 ml dung dịch 3, đảo nhẹ. Ly tâm 12.000 vòng /phút trong 10 phút ở 20oC, thu dịch nổi cho vào eppendorf mới tƣơng ứng. 3. Cho vào mỗi eppendorf 300µl phenol/Chloroform/isoamylalchohol (25:24:1), vortex đều, ly tâm 10.000vòng/phút trong 5 phút ở 20oC, thu dịch nổi cho vào các eppendorf mới tƣơng ứng. 4. Cho vào mỗi eppendorf 300µl Chloroform/isoamylalchohol, lắc đều ly tâm 10.000 vòng/phút trong 5 phút ở 20o C, thu dịch nổi cho vào eppendorf mới tƣơng ứng. 5. Thêm vào mỗi eppendorf 300µl Isopropanol, ủ ở -20oC trong 30 phút, sau đó ly tâm 13.000vòng/phút trong 20 phút ở 4oC. Hút bỏ dịch nổi thu kế tủa. 6. Rửa tủa bằng cách cho 500 µl ethanol 70% lạnh vào mỗi eppendorf ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút ở 4oC. Hút bỏ dịch nổi thu kết tủa và làm khô bằng cách úp ngƣợc trên giấy thấm. 7. Cho 40 µl TE vào mỗi eppendorf để hòa tan kết tủa. 8. Hút 2 µl DNA + 2 µl loading dye chạy điện di trên agaose nồng độ 0,8% trong 30 phút để xem kết quả tách chiết. Tạo mẫu dò đánh dấu từ sản phẩm DNA plasmid 1. Cho 10 µl DNA đã pha loãng vào eppendorf 200 µl và làm biến tính hoàn toàn bởi nhiệt độ bằng cách đun 5 – 7 phút trong nƣớc đang sôi mạnh. 2. Làm lạnh nhanh trên đá trong 5 phút, đem ly tâm nhanh ở tốc đô 4.000 vòng / 30 giây để dồn dung dịch xuống đáy ống. 3. Thêm 10 µl dung dịch đệm phản ứng reaction buffer (có sẵn trong bộ kit) vào DNA đã đƣợc làm lạnh. Đảo trộn nhẹ cho đều, phản ứng nên giữ trên đá. 4. Thêm 2 µl chất đánh dấu labelling reagent (có sẵn trong bộ kit), trộn nhẹ, đều. 5. Thêm 10 µl dung dịch phản ứng cross-linker. Trộn đều, ly tâm nhanh 4.000 vòng trong 30 giây để dồn hỗn hợp xuống đáy. 6. Ủ 30 phút ở 37oC cho phản ứng xảy ra. 58 Ly trích DNA tổng số 1. Thu sinh khối vi khuẩn bằng cách ly tâm 10.000 vòng / 5 phút / 4oC. Rửa sinh khối thu đƣợc với 1 ml nƣớc cất hai lần vô trùng và đánh tan bằng vortex (2 – 3 lần). 2. Hoà tan sinh khối vi khuẩn thu đƣợc trong 567 µl dung dịch TE, đánh tan bằng vortex, thêm 30 µl dung dịch SDS 10% , đánh tan bằng vortex. Sau đó ủ ở 37oC khoảng 1 - 2 giờ. 3. Cho thêm vào 100 µl dung dịch NaCl, hòa tan thật kỹ bằng vortex. 4.Thêm vào 80 µl dung dịch CTAB / NaCl (khoảng 1/10 thể tích). Pha trộn (đánh tan bằng vortex), ủ ở 65oC trong 10 phút. 5. Thêm 500 µl dung dịch hổn hợp phenol / chloroform / isoamyl alcohol (25: 24: 1; v/v). Hòa lẫn đều (lắc tay), ly tâm 10 phút ở 14.000 vòng, 4oC (hoặc 13500 vòng). 6. Thu dung dịch bên trên (dung dịch DNA) cho vào ống ly tâm mới (nếu không thể phân biệt bề mặt chung giữa các dung dịch, ly tâm lại lần nữa ở tốc độ lớn hơn). 7. Thêm 780 µl dung dịch hổn hợp chloroform / isoamyl alcohol (24: 1; v/v). Hòa lẫn đều bằng cách lắc tay, ly tâm 12.000 vòng / phút 10 phút, 4oC. 8. Thu lấy dung dịch bên trên cho vào ống ly tâm mới (khoảng 500 µl). Kết tủa DNA với isopropanol, dùng khoảng 0,6 thể tích cùa dung dịch (khoảng 300µl) và ủ ở - 20oC / 30 phút. Sau đó ly tâm 12000 vòng / phút, 10 phút, 4oC, lấy kết tủa sau khi ly tâm. 9. Rửa kết tủa bằng ethanol 70 % (khoảng 500 µl) lạnh, nghiêng nhẹ qua lại, ly tâm 13.000 vòng / phút, 10 phút, 4oC. Đổ ethanol ra hết và làm khô bằng cách cho cồn bay hơi. 10. Hòa tan kết tủa trong 40 µl dung dịch TE, đem mẫu giữ ở tủ mát 4oC. 11. Hút 2 µl DNA + 2 µl loading dye chạy điện di trên agaose nồng độ 0.8% trong 30 phút để xem kết quả tách chiết. 59 Chuyển DNA lên màng 1. Chuẩn bị màng Hybond N kích thƣớc 20cm x 12cm, dùng viết chì kẻ từng ô vuông 2cm x 2cm qua một lớp giấy mỏng chỉ đẻ lại nét mờ, chừa 2 biên khoảng 2cm để dễ thao tác. 2. Làm biến tính DNA Cho 40 µl DNA đã đƣợc pha loãng vào eppendorf 200 µl, đun sôi mạnh trong 7 phút, chuyển nhanh lên đá giữ trong 2 phút. Cho tiếp 40 µl dung dịch đệm biến tính (NaOH 0,5 M; NaCl 0,15 M), vào eppendorf để 40 phút ở nhiệt độ phòng. 3. Chuyển lên màng Hút 4 µl dung dịch DNA đã biến tính của từng mẫu lên từng ô, dùng máy sấy sấy khô ô này rồi mới lám ô tiếp theo, tránh để các mẫu tiếp xúc nhau. 4. Làm khô màng Dùng kẹp giữ một góc màng và làm dấu bề mặt chứa DNA của màng. Đặt màng vào trong tủ sấy, màng đƣợc ủ ở 65 oC trong khoảng 1 giờ cho đến khi các góc màng co lại là đƣợc. 5. Cố định DNA trên màng. Cắt một góc màng để đánh dấu mặt có DNA trên màng nylon Màng sau khi đƣợc làm khô, đƣợc đem xử lý dƣới UV trong tủ GS GENE LINKER TM UV CHAMBER (Bio - Rad) trong 50 giây (chú ý bề mặt DNA của màng hƣớng lên 6. Đổ vào khoảng 150 ml dung dịch đệm trung tính (Tris – HCl 0,5 M; NaCl 0,15 M; pH 7,0) vào một cái khay, cho màng vào lắc nhẹ trong 1 phút, có thể lặp lại . Màng đƣợc ủ ở 65 oC trong khoảng 1 giờ cho đến khi các góc màng co lại là đƣợc. Sau đó màng đƣợc đem ra để chuẩn bị lai (hoặc cũng có thể giữ lại trong hộp kín cho đến khi tiến hành lai). Thực hiện phản ứng lai 1. Cho 48 ml dung dịch lai vào ống lai và làm nóng đến 55oC trong tủ lai. 60 2. Đặt màng lai vào dung dịch lai đã làm nóng và tiền lai 15 phút trong ống lai. 3. Cho 48 µl mẫu dò đã đánh dấu vào ống lai. 4. Quá trình lai đƣợc thực hiện 16 giờ trong tủ lai. Rửa màng sau khi lai 1. Cho 40 ml dung dịch rửa 1 vào bình tam giác sạch và làm nóng đến 55oC. 2. Đổ hết dung dịch lai trong ống lai ra, cho 40 ml dung dịch rửa 1 vào ống lai. Rửa màng lai bằng dung dịch rửa 1 khoảng 10 phút ở 55oC trong tủ lai. 3. Lấy hết dung dịch rửa 1 trong ống lai ra. Rửa màng lai lần thứ 2 bằng dung dịch rửa 1 mới với thời gian và nhiệt độ nhƣ trên. 4. Cho dung dịch rửa 2 vào khay sạch, chuyển màng lai vào dung dịch rửa 2, lắc nhẹ trong 5 phút ở nhiệt độ phòng. 5. Đổ hết dung dịch rửa 2, cho vào khay dung dịch rửa 2 mới, tiếp tục rửa màng trong 5 phút ở nhiệt độ phòng. Phát hiện sản phẩm lai trên phim Mang bao tay không phấn trƣớc khi tiến hành. 1. Đổ bỏ dung dịch rửa 2 đi và đặt màng lên tấm Saran wrap (mặt có DNA hƣớng lên trên) 2. Hút 2ml tác nhân phát hiện cho lên màng. Sau đó phủ tấm Saran wrap lên trên màng. Dùng que thủy tinh gạt nhẹ trên bề mặt màng sao cho tác nhân phát hiện trải đều trên màng trong 5 phút. 3. Bao kín màng bằng tấm saran wrap khác. Đặt màng vào cassette (mặt có DNA hƣớng lên trên). 4. Trong phòng tối, đặt phim lên trên màng và đậy cassette lại. Thời gian để phim tiếp xúc với màng là 30 phút ở nhiệt độ phòng. 5. Rửa phim, ngâm phim trong dung dịch developer 5 phút ở nhiệt độ phòng. Sau đó chuyển phim sang dung dịch fixer, ngâm 3 phút ở nhiệt độ phòng. 6. Lấy phim ra và phân tích kết quả. 61 Phần 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Chúng tôi đã bƣớc đầu xây dựng đƣợc quy trình tiếp hợp đoạn gen gfp vào dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens bằng phƣơng pháp tiếp hợp ba thành phần và kiểm tra lại bằng phƣơng pháp Dot Blot rồi quan sát dòng vi khuẩn đã chuyển gen gfp trên kính hiển vi phát huỳnh quang. 5.2 Đề nghị Một số hƣớng phát triển của đề tài Trong đề tài tuy đã thiết lập đƣợc quy trình tiếp hợp bằng phƣơng pháp triparental mating nhƣng tần số tiếp hợp vẫn chƣa cao, cần khảo sát về các yếu tố nhiệt độ môi trƣờng, pH, thời gian nuôi cấy, tốc độ lắc, nhiệt độ, mật độ vi khuẩn … có ảnh hƣởng nhƣ thế nào đến quá trình tiếp hợp và lọai môi trƣờng chọn lọc riêng biệt cho vi khuẩn Pseudomonas fluorescens sau khi tiếp hợp. Có thể tiến lên phƣơng pháp Southern Blot sử dụng đoạn gen gfp làm mẫu dò để kiểm tra chính xác số bản sao gen gfp đã chuyển. Khảo sát đặc tính kháng nấm, kí sinh trên rễ của vi khuẩn Pseudomonas fluorescens sau khi tiếp hợp có bị ảnh hƣởng hay không bằng cách chạy PCR đoạn 2,4-DAPG kết hợp chạy sắc kí, chủng lại lên rễ quan sát trên kính hiển vi phát huỳnh quang. 62 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt 1. Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang, 1999. Di truyền phân tử những nguyên tắc cơ bản trong chọn giống cây trồng. Nhà xuất bản Nông Nghiệp Thành Phố Hồ Chí Minh. 2. Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang, 2000. Di truyền phân tử những nguyên tắc cơ bản trong chọn giống cây trồng (Quyển II: Chuyển nạp gen). Nhà xuất bản Nông Nghiệp Thành Phố Hồ Chí Minh. 3. Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang, 2005. Sinh học phân tử giới thiệu phương pháp và ứng dụng. Nhà xuất bản Nông Nghiệp Thành Phố Hồ Chí Minh. 4. Khuất Hữu Thanh, 2003. Cơ sở di truyền phân tử kỹ thuật gen.Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật. 5. Lê Minh Kha, Nguyễn Văn Lẫm, 2005. Thiết lập quy trình Southern Blot. Khóa luận tốt nghiệp Kỹ sƣ Công Nghệ Sinh Học. Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, Việt Nam. 6. Nguyễn Duy Bình, 2004. Chọn lọc và đánh giá dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens đối kháng với nấm Rhizoctonia solani gây hại trên cây bông vải. Khóa luận tốt nghiệp Kỹ sƣ Nông Học. Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, Việt Nam. 7. Nguyễn Đình Huyên, 1999. Những điều cơ bản của kỹ thuật di truyền. Nhà xuất bản Nông Nghiệp Thành Phố Hồ Chí Minh. 8. Phạm Duy, Huỳnh Văn Thái, 2005. Xây dựng quy trình biến nạp đoạn DNA vào tế bào vi khuẩn E. coli DH5α. Khóa luận tốt nghiệp Kỹ sƣ Công Nghệ Sinh Học. Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, Việt Nam. 9. Phạm Mỹ Liên, 2004. Chọn lọc và đánh giá dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens đối kháng với nấm Sclerotium rolfsii gây bệnh trên cây cà chua. Khóa luận tốt nghiệp Kỹ sƣ Nông Học. Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, Việt Nam. 63 10. Tô Minh Châu, Vƣơng Thị Việt Hoa, Vũ Thị Lâm An, Lâm Thanh Hiền, Nguyễn Thị Ngọc Điệp, Nguyễn thúy Hƣơng, 2000. Bài giảng vi sinh vật học đại cương. Trƣờng Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh Tài liệu tiếng nƣớc ngoài 11. Christine Josenhans, Susanne Friedrich and Sebastian Suerbaum,1998. Green fluorecens protein as a novel marker and reporter system in Helicobacter sp. FEMS Microbiology Ecology 161: 263 – 273. 12. Lxia Liu and Paul D. Shaw, 1997. Characterization of dapB, a gene required by Pseudomonas syringae pv. tabaci BR2.024 for lysine and tabtoxinine-β-lactam biosythesis.Journal of Bacteriology vol. 179: 507 – 513. 13. Marta Herroero, Victor de Lorenzo and Kenneth N. Timmis, 1990. Transposon vector containing non-antibiotic resistance selection marker for cloning and stable chromosomal insertion of foreign genes in gram-negative bacteria. Journal of Bacteriology 72: 57 – 6567. 14. Riccardo Tombolini, Arrnika Unge, Marry Ellen Davey, Frans J. de Bruijn and Janet K. Janson, 1997. Flow cytometric and microscopic analysis of GFP- tagged Pseudomonas fluorescens bacteria. FEMS Microbiology Ecology 22: 17 – 28. 15. Sambrook Joseph and Rusell W.David, 2001. Molecular Cloning A Laboratory Manual. Volume 1. 3 rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York. 16. Turlough M. Finan, Barbara Kunkel, Guido F. de Vos and Ethan R. Signer, 1986.Second symbiotic megaplasmid in Rhizobium meliloti carrying exopolysaccharide and thiamine synthesis genes. Journal of Bacteriology 167: 66 - 72. 17. Zhang Liqun, 2001. Studies on biologycal control mechanism with Pseudomonas fluorescens FPT9601. Ph. D. Thesis, The Graduate school of Science and Technology Kobe University. 64 18. Zhou Hengyou, Wei Hailei, Liu Xili, Wang Ye, Zhang Liqun and Tang Wenhua, 2005.Improving biocontrol activity of Pseudomonas fluorescens through chromosomal integratio of 2,4-diacelphloroglucinol biosynthesis genes.Chinese Science Bulletin 50: 775 – 781. Các Website 1. 2. 3. 4. 5. 1483241.html 65 PHỤ LỤC Công thức pha một số môi trƣờng dùng trong thí nghiệm Môi trƣờng LB (Luria – Bertain) lỏng Tryptone 10g Bacto yeast extract 5g NaCl 10g Thêm nƣớc cho tới 1000ml Chuẩn độ pH=7.0 bằng NaOH 1N Hấp khử trùng ở 1210C trong 20 phút Môi trƣờng KB (King’s B) agar Proteose peptone 20g Glycerol 15ml K2HPO4 1.5g MgSO4.7H2O 1.5g Thêm nƣớc cho tới 1000ml Chuẩn độ pH=7.2 bằng NaOH 1N Agar 15g Hấp khử trùng ở 1210C trong 20 phút Môi trƣờng M9 Na2HPO4.7H2O 6g KH2PO4 3g NaCl 0.5g NH4Cl 1g Thêm 950ml nƣớc Chuẩn độ pH=7.4 bằng NaOH 1N Bacto agar 15g Hấp khử trùng 1210C trong 20 phút, để nhiệt độ hạ xuống 600C thêm 10ml Glucose 20% đã đƣợc lọc 66 1ml CaCl2 0.1M đã hấp khử trùng 1ml MgSO4 1M đã hấp khử trùng 50 µl Thiamine 100 µg/ml đã đƣợc lọc Thêm nƣớc tới 1000ml Các dung dịch stock kháng sinh Pha các dung dịch stock có nồng độ 100µg/µl Cân 100 mg kháng sinh Ampicillin cho vào 1ml nƣớc hấp vô trùng trong eppendorf 1,5 ml, trộn đều rồi lọc qua đầu lọc 0.22 µm. Dung dịch kháng sinh đƣợc chiết ra các eppendorf 200µl. Cất ống eppendorf dùng thƣờng vào tủ mát 5 0C, các ống còn lại bảo quản trong tủ -200C, tất cả các ôngg đều đƣợc bọc giấy bạc và bảo quản trong tối. Pha tƣơng tự cho Kanamycin. Còn Chloramphenicol cũng đƣợc pha tƣơng tự nhƣng thay nƣớc bằng ethanol nguyên chất. Các dung dịch dùng cho ly trích DNA plasmid Dung dịch 1 Tris – HCl (pH=8) 25mM Glucose 50mM EDTA 10mM Dung dịch 2 (nên pha trƣớc khi dùng) Sodium dodecyl sulfat (SDS) 10% 100 µl NaOH 5N 40 µl Nƣớc cất 2 lần 860 µl Dung dịch 3 Glacial acetic 0.2M Potassium acetat 0.2M Dung dịch TE (pH=8) Tris – HCl (pH=8) 10mM EDTA (pH=8) 1mM 67 Loading dye Bromophenol blue 0.25% Glycerol trong TAE 1X 40% Các hóa chất ly trích DNA tổng số SDS 10 % NaCl 5 M CTAB / NaCl Chloroform / isoamyl alcohol (24 :1) Phenol / chloroform / isoamyl alcohol (25 : 24 : 1) Isopropanol Ethanol 70 % TE1X (pH 8.0) Vật liệu để tiến hành phƣơng pháp Dot Blot Vật liệu cần để chuyển DNA lên màng Màng Hybond - N Đệm biến tính: NaOH 0,5 M; NaCl 0,15 M Đệm trung tính: Tris – HCl 0,5 M; NaCl 0,15 M; pH 7,0 Đệm chuyển (transfer buffer): SSC 20X, SSC 6X, SSC 2X Máy sấy Máy cross - linker: GS GENE LINKER TM UV CHAMBER (Bio - Rad) Vật liệu cần để tạo mẫu dò Sản phẩm PCR đã đƣợc tinh sạch Reaction buffer Labelling reagent Cross – linker working Vật liệu cần để lai Buồng lai: HB – 1000 Hybridizer Dung dịch đệm lai: Alkphos Direct hybridization buffer (Amersham) 68 Dung dịch rửa 1 (Primary wash buffer): Urea 2 M; SDS 0,1%; natri phosphate 50 mM (pH 7,0); NaCl 50 mM; MgCl2 1 mM; blocking reagent 0,2% (w/v) Dung dịch rửa 2 (Secondary wash buffer ): Tris - base 1 M; NaCl 2 M, pH 10,0. Vật liệu cần để phát hiện kết quả lai Saran Wrap Chất phát hiện: detection reagent with CDP – star (Amersham) Phim Konica 30 x 40 cm (100 tấm / hộp) Bộ thuốc rửa phim Konica (developer + fixer) Cassette 30 x 40 Konica Buồng tối để rửa phim Vật liệu dùng để xem kính hiển vi Lam Lame Dầu soi kính Giấy lau kính Chú thích một số thuật ngữ tiếng anh Genome: toàn bộ gen vi khuẩn Ori (origin): là một đoạn mã hóa của DNA, tại đó sự tái bản đƣợc bắt đầu. P (promoter): là một vùng DNA tại đó có sự gắn kết RNA polymerase để bắt đầu sự giải mã. Reporter gene: là một đơn vị mã hóa mà sảm phẩm của nó đƣợc trắc nghiệm dễ dàng (ví dụ nhƣ Chloramphenicol transacetylase); nó có thể gắn với bất kì một promoter nào sao cho sự thể hiện của gen này đƣợc dùng để thử nghiệm chức năng của promoter. Saran wrap: là loại giấy kính trong dùng bọc hoa quả. Tn (tranposon): là một đoạn mã hóa DNA có thể tự nó gắn vào ở một vi trí mới trong genome mà không cần bất kì sự liên quan nào về mã di truyền. 69 Hiện tƣợng im lặng gen (Gene silencing) Chúng ta biết rằng DNA vi khuẩn sử dụng hệ thống R – M (restrriction - modification) với R biểu thị tính chất giới hạn, M biểu thị tính chất cải tiến. Hệ thống R – M trong vi khuẩn giúp nó chống lại sự xâm nhập của những nhân tố lạ về di truyền. Trong hệ thống này, DNA của tế bào sẽ bị methyl hóa tại các chuỗi mã xác định 4 – 8 bp, do một phản ứng xúc tác của methyl transferase. DNA lạ thuộc nhóm “non- self” không bị methyl hóa, chứa những chuỗi mã bị phân hóa thông qua hoạt động của enzyme “endonuclease”. Chính sự methyl hóa là yếu tố vô cùng quan trọng của hiện tƣợng im lặng gen. Ngƣời ta đặt giả thiết có ba yếu tố chính xảy ra trong phản ứng đối với sự xâm nhập DNA là: phát hiện, làm bất hoạt và loại trừ. Hầu hết các sự kiện chuyển đổi vị trí đều có thể trở thành mục tiêu mồi đối với hệ enzyme DNA methyltransferase. Phân tử DNA xâm nhập vào có thể làm thay đổi những cấu trúc vùng (domain), gây bất hoạt nộ phần bìa của locus nào đó, làm cho vùng dị nhiễm sắc đậm đặc hơn và làm cho gen trở nên im lặng. Nghiên cứu vùng không gian của gen cho thấy cấu trúc của bộ gen có khả năng xác định và làm bất hoạt những chuỗi mã lạ ở những vùng cụ thể. Phân tử DNA lạ xâm nhập vào vùng không gian giàu GC, nếu phân tử DNA này cũng giàu GC nó co thể tiếp hợp và đƣợc cài đặt ở đây một cách ổn định và đƣợc chuyển mã, nếu phân tử này giàu AT hiện tƣợng im lặng sẽ xảy ra. Trƣờng hợp nó xâm nhập vào vùng không gian giàu AT, nó sẽ im lặng hoàn toàn cho dù nó chứa chuỗi mã giàu AT hay GC.