Luận văn Đánh giá chất lượng hạt và nghiên cứu đặc điểm cấu trúc gen LTP ở đậu xanh (Vigna radiata L.Wilczek)

tiếp tục tiến hành chiết bằng dung dịch NaCl 1M và nước cất. Dịch chiết chứa protein hoà tan đem xác định hàm lượng cùng protein chuẩn là albumin huyết thanh bò theo phương pháp quang phổ hấp thụ bước sóng 750 nm với thuốc thử Foling. Đơn vị tính hàm lượng protein là phần trăm khối lượng khô. Hàm lượng protein được xác định dựa trên đồ thị chuẩn định lượng protein theo phương pháp Lowry (hình 2.2). Cách tính hàm lượng protein: Trong đó: a: số đo trên máy quang phổ H : hệ số pha loãng G : số mg mẫu phân tích 2.3.2. Phương pháp sinh học phân tử 2.3.2.1. Phương pháp tách chiết DNA tổng số Phương pháp tách chiết DNA tổng số theo Gawel và Jarret (1991) [31] như sau: (1) Lấy 200mg lá non nghiền trong nito lỏng thành bột mịn. (2) Bổ sung 0,8 ml đệm rửa (Tris HCl 1M, EDTA 0,5M, pH=8, Sobitol 2M, NaH2PO4 0,4 %, H2O), li tâm 15 phút tốc độ 12000 vòng /phút, loại bỏ dịch nổi. Thêm 700 μl đệm tách (Tris HCl 1M, pH=8, NaCl 5M, EDTA 0,5M, CTAB 4%, H2O), trộn nhẹ. Ủ 650C ít nhất 1 giờ, 5 phút lắc đều 1 lần, lấy ra để ở nhiệt độ phòng 5 phút. (3) Thêm 600 μl chloroform : isoamyl (24:1), trộn đều 20 phút. (4) Li tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút. (5) Hút 500 μl dịch trong sang ống 1,5 ml, bỏ tủa. (6) Thêm 500 μl isoprropanol, trộn nhẹ đặt lên đá chờ có tủa trắng. (7) Li tâm 13000 vòng /phút trong 5 phút, bỏ dịch, úp xuống giấy cho khô. (8) Bổ sung 300 μl cồn 70% búng nhẹ. (9) Li tâm 13000 vòng/phút, 5 phút, loại bỏ cồn. (10) Làm khô DNA bằng máy speed vac. (11) Hoà tan DNA trong H2O khử ion. 2.3.2.2. Định lượng và kiểm tra độ tinh sạch của DNA tổng số Kiểm tra độ tinh sạch của DNA bằng 2 phương pháp: (1) Phương pháp quang phổ hấp thụ: Kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch của DNA trên máy quang phổ ở bước sóng 260nm và 280nm. Nồng độ DNA trong dung dịch tách chiết được tính theo công thức: Nồng độ DNA (ng/μl) = A260 x 50 x hệ số pha loãng. Độ sạch của DNA được xác định bằng tỷ lệ A260/A280. Dung dịch chứa DNA có tỷ lệ A260/A280 là 1,8- 2,0 được coi là đảm bảo chất lượng. (2) Phương pháp điện di: Điện di kiểm tra DNA của các mẫu thí nghiệm trên gel agarose 0,8%. Sản phẩm điện di được nhuộm bằng ethidium bromide, soi và chụp ảnh dưới ánh sáng cực tím. Dựa vào hình ảnh điện di kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch của DNA trong mẫu thí nghiệm đã tách chiết. 2.3.2.3. Kỹ thuật PCR Sau khi tách chiết và kiểm tra được độ tinh sạch của DNA tiến hành nhân gen LTP bằng kỹ thuật PCR theo Mullis và cs (1985) với cặp mồi đặc hiệu được trình bày trong bảng 2.3. Bảng 2.3. Trình tự cặp mồi nhân gen LTP Mồi Trình tự mồi (5’-3’) Xuôi ATGGCTAGCCTGAAGGTTGC Ngược TTACTTGATGTTAGCGCAGTT Thành phần, chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR được trình bày trong bảng 2.4 và bảng 2.5. Bảng 2.4. Thành phần phản ứng PCR STT Thành phần Thể tích (µl) 1 Nước cất khử ion khử trùng 12,5 2 Dung dịch đệm 10X 2,5 3 MgCl2 (25mM) 2,5 4 dNTPs (2,5 mM) 2,0 5 Mồi xuôi (10 pM/µl) 2,0 6 Mồi ngược (10 pM/µl) 2,0 7 Taq-polymerase (5U/1µl) 0,5 8 DNA mẫu 1 Tổng 25 Bảng 2.5. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR Bước Phản ứng Nhiệt độ (0C) Thời gian Chu kỳ 1 Biến tính 94 3 phút 1 2 Biến tính 94 1 phút 30 3 Gắn mồi 56 1 phút 4 Kéo dài chuỗi 72 1 phút 30 giây 5 Hoàn tất kéo dài 72 10 phút 1 6 Kết thúc phản ứng 4 ∞ Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 1% trong TAE 1X, với sự có mặt của marker chuẩn và chụp ảnh dưới ánh sáng cực tím. Sau đó, sản phẩm được tinh sạch (thôi gel) theo bộ Kit DNA extraction Kit K05013 của hãng Fermentas. 2.3.2.4. Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1% và cắt lấy băng quan tâm có kích thước khoảng 350 bp cho vào ống eppendort 1,5 ml . Bổ sung 1000µl dung dịch Binding esdution. Ủ ở 550C trong khoảng 20 phút, 5 phút trộn nhẹ cho gel tan hoàn toàn thành dịch trong suốt. Bổ sung 5 - 10µl Silica power vào và ủ sản phẩm ở 550C khoảng 5 phút rồi vontex khoảng 2 phút. Li tâm 10000 vòng/phút trong 1 phút, loại dịch nổi, thu cặn màu trắng. Bổ sung tiếp khoảng 500µl Buffer wash, vontex 2 phút. Li tâm 10000 vòng/phút trong 1 phút để loại dịch nổi, thu tủa (bước này lặp lại 3 lần). Làm khô DNA trong box. Hoà tan DNA trong 20µl H2O deion khử trùng rồi ủ sản phẩm ở 550C trong 5 - 10 phút. Li tâm 10000 vòng/phút trong 1 phút để thu dịch nổi, bỏ tủa. Điện di kiểm tra sản phẩm thôi gel trên gel agarose 1%. Sản phẩm điện di được nhuộm bằng ethidium bromide, soi và chụp ảnh dưới ánh sáng cực tím. 2.3.2.5. Phương pháp gắn gen vào vector tách dòng Sản phẩm PCR sau khi được tinh sạch sẽ được gắn trực tiếp vào vector tách dòng pBT. Thành phần phản ứng gắn gen vào vector tách dòng pBT được thể hiện ở bảng 2.6. Bảng 2.6. Thành phần phản ứng gắn gen vào vector tách dòng pBT STT Thành phần Thể tích (µl) 1 Nước cất khử ion khử trùng 12,2 2 DNA 4 3 Ligation buffer 10X 2 4 Vector pBT 1 5 Enzyme T4 ligase 0,8 Tổng 20 Hỗn hợp được ủ ở 220C trong 1h, sau đó được biến nạp vào tế bào khả biến E.coli DH5α Hình 2.3. Sơ đồ vector pBT 2.3.2.6. Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α Bổ sung 7µl vector đã gắn gen vào ống đựng tế bào khả biến và trộn nhẹ. Đặt hỗn hợp vào đá trong 30 phút, rồi ủ ở 420C chính xác 1 phút. Sau đó tiếp tục đặt hỗn hợp vào đá 5 phút. Bổ sung 400µl môi trường LB lỏng (pepton, cao nấm men, NaCl) vào hỗn hợp rồi đem hỗn hợp nuôi lắc 200 vòng/phút trong 1 giờ ở 370C. Sử dụng que cấy trải, trải 200µl dịch khuẩn lên đĩa môi trường LB đặc (pepton, cao nấm men, NaCl, agarose) có chứa kháng sinh ampicillin (100mg/l), X-gal (40mg/l) và IPTG (100µM). Ủ đĩa ở 370C trong 16 giờ. Sau đó, chọn những khuẩn lạc có màu trắng nuôi trong môi trường LB lỏng (có bổ sung ampicillin) qua đêm. 2.3.2.7. Phương pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (clony-PCR) Lấy dịch nuôi chứa vi khuẩn kiểm tra sản phẩm chọn dòng bằng phản ứng clony-PCR. Thành phần của phản ứng clony-PCR tương tự như trong phản ứng PCR chỉ khác mẫu DNA thay bằng DNA plasmid. Chu trình nhiệt của phản ứng clony-PCR tương tự như trong phản ứng PCR, chỉ thay đổi nhiệt độ gắn mồi là 540C. Sản phẩm clony-PCR được kiểm tra trên gel agarose 1% trong đệm TAE 1X, nhuộm gel trong ethidium bromide 1% và chụp ảnh dưới ánh sáng đèn cực tím. 2.3.2.8. Tách chiết plasmid Sau khi kiểm tra sản phẩm clony-PCR tiến hành tách plasmid bằng bộ Kit AccuPrep Plasmid Extraction của hãng Bioneer. Các bước tách chiết plasmid: Lấy dịch vi khuẩn li tâm 3000 vòng/phút trong 7 phút, bỏ dịch thu cặn. Hòa cặn trong 250 ml Resuspension Buffer for plasmid (Buffer 1), đảo nhẹ. Bổ sung 250 ml Lysis Buffer for plasmid (Buffer 2) vào ống trên, đảo nhẹ. Bổ sung 350 ml Neutralization Buffer for plasmid (Buffer 3), đảo nhẹ để tránh kết tủa cục bộ. Li tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút. Hút dịch nổi cho chảy qua cột tinh sạch plasmid của hãng Bioneer. Li tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, loại bỏ dịch chảy qua cột. Bổ sung 500 ml Denaturation Buffer for plasmid (Buffer D), li tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, loại bỏ dịch chảy qua cột. Bổ sung 700 ml Washing Buffer for plasmid (Buffer 4), li tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, loại bỏ dịch chảy qua cột. Đặt cột sang ống 1,5 ml mới, cho 20 ml H2O vào chính giữa cột, để ở nhiệt độ phòng khoảng 3 phút và li tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút. Thu nhận plasmid. Kiểm tra sản phẩm tách plasmid trên gel agarose 1% trong đệm TAE 1X, nhuộm gel trong ethidium bromide 1% và chụp ảnh dưới ánh sáng đèn cực tím. 2.3.2.9. Phương pháp xác định trình tự nucleotide Trình tự của gen được xác định trên máy đọc trình tự nucleotide tự động ABI PRISM@ 3100 Advant Genetic Analyzer (Applied Biosystem) sử dụng bộ hoá chất sinh chuẩn BigDyeÒ Terminator v3.1 Cycle Sequencing. 2.3.3. Phương pháp xử lí số liệu 2.3.3.1. Phương pháp thống kê bằng chương trình Excel Xác định giá trị trung bình, phương sai, độ lệch chuẩn, sai số trung bình mẫu ... bằng chương trình Excel trên máy vi tính theo Chu Văn Mẫn (2003) [14]. 2.3.3.2. Phương pháp xử lý trình tự gen Sử dụng phần mềm DNAstar và Bioedit để phân tích, so sánh trình tự gen. CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. PHÂN TÍCH ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, HOÁ SINH HẠT CỦA CÁC GIỐNG ĐẬU XANH NGHIÊN CỨU 3.1.1. Đặc điểm hình thái và khối lượng 1000 hạt của các giống đậu xanh Kết quả nghiên cứu một số đặc điểm hình thái và khối lượng 1000 hạt của các giống đậu xanh nghiên cứu được trình bày ở bảng 3.1. Bảng 3.1. Một số đặc điểm hình thái của các giống đậu xanh nghiên cứu TT Tên giống Màu gốc thân mầm Hình dạng hạt Màu vỏ hạt P 1000 hạt (g) 1 ĐXVN 4 Tím Bầu dục Xanh mỡ 51,50±0.20 2 ĐXVN 5 Xanh Trụ Xanh mốc 53,40 ± 0,25 3 VN 99-3 Tím Ô van Xanh mốc 52,36 ± 0,28 4 044/ĐX06 Xanh Trụ Xanh mốc 46,40 ± 0,44 5 TN Tím Ô van Xanh mốc 48,10 ± 0,62 6 LS Tím Ô van Xanh mốc 50,20 ± 0,84 7 HN 1 Xanh Trụ Xanh mốc 51,46 ± 0,18 8 HN 2 Tím Ô van Xanh mốc 53,15 ± 0,24 9 BG 1 Xanh Trụ Xanh mốc 54,30 ± 0,47 10 BG 2 Xanh Bầu dục Xanh mỡ 58,00 ± 0,60 11 BG 3 Xanh Ô van Vàng 47,25 ± 0,55 12 HG 1 Tím Ô van Xanh mốc 52,20 ± 0,55 13 HG 2 Xanh Trụ Xanh mỡ 57,32 ± 0,33 Qua bảng 3.1, chúng tôi rút ra một số nhận xét sau: * Về màu gốc thân mầm: sau khi hạt đậu xanh nảy mầm khoảng 7 ngày thì màu gốc thân được phân biệt rõ, gồm màu xanh và màu tím. Các giống có màu gốc thân mầm màu xanh là ĐXVN 5, 044/ĐX06, HN 1, BG 1, BG 2, BG 3 và HG 2, còn các giống có màu gốc thân mầm màu tím là ĐXVN 4, VN 99-3, TN, LS, HN 2 và HG 1. Cây càng lớn thì màu sắc gốc thân càng không rõ và có màu nâu gần như nhau. Hiện chưa có nghiên cứu nào tìm thấy mối liên quan giữa màu sắc gốc thân với một tính trạng nào của cây đậu xanh. * Về hình dạng hạt: các giống đậu xanh nghiên cứu có nhiều hình dạng khác nhau, bao gồm hình trụ, ô van và bầu dục. Trong đó, hạt có hình trụ có các giống ĐXVN 5, 044/ĐX06, HN 1, BG 1 và HG 2. Hạt có hình ô van có các giống VN 99-3, TN, LS, HN 2, BG 3 và HG 1. Còn lại hai giống ĐXVN 4 và BG 2 thì hạt có dạng hình bầu dục. Tuy nhiên, tìm hiểu về mối quan hệ giữa hình dạng hạt với các đặc tính sinh lý, hoá sinh của cây đậu xanh chưa có công trình khoa học nào công bố. * Về màu sắc vỏ hạt: màu vỏ hạt của các giống đậu xanh nghiên cứu bao gồm xanh bóng, xanh mốc và vàng bóng. Trong đó, màu xanh mốc là màu chủ đạo. Có tới 9 giống trong tổng số 13 giống đậu xanh nghiên cứu là vỏ hạt có màu xanh mốc, bao gồm các giống ĐXVN 5, VN 99-3, 044/ĐX06, TN, LS, HN 1, HN 2, BG 1 và HG 1. Ba giống là ĐXVN 4, BG 2 và HG 2 vỏ hạt có màu xanh mỡ. Còn lại giống BG 3 vỏ hạt có màu vàng bóng. Trong các màu trên, màu xanh mốc là màu được người tiêu dùng ưa chuộng và cho là có vị thơm ngon hơn hai màu còn lại nhưng chưa có nghiên cứu nào khẳng định mối tương quan giữa màu sắc vỏ hạt với chất lượng hạt. * Về khối lượng 1000 hạt: khối lượng 1000 hạt là một trong các yếu tố quan trọng cấu thành năng suất của cây đậu xanh. Khối lượng 1000 hạt của 13 giống đậu xanh nghiên cứu dao động trong khoảng 46,40g (044/ĐX06) đến 58,00g (BG 2). Khối lượng 1000 hạt của các giống xếp theo thứ tự giảm dần như sau: BG 2 > HG 2 > BG 1 > ĐXVN 5 > HN 2 > VN 99-3 > HG 1 > ĐXVN 4 > HN 1 > LS > TN > BG 3 > 044/ĐX06. Khối lượng hạt có thể thay đổi do chế độ chăm sóc, mùa vụ và điều kiện môi trường. 3.1.2. Chiều dài rễ, thân của các giống đậu xanh ở giai đoạn cây non Mối quan hệ giữa rễ và thân là mối quan hệ kích thích: Rễ sinh trưởng tốt sẽ kích thích các bộ phận trên mặt đất, trong đó có thân sinh trưởng và ngược lại. Rễ cung cấp nước và chất khoáng cho thân lá, còn thân lá lại cung cấp cho hệ thống rễ các sản phẩm quang hợp để sinh trưởng. Mối quan hệ hữu cơ này biểu hiện hết sức chặt chẽ trong giai đoạn cây còn non. Vì vậy, nghiên cứu kích thước của rễ và thân ở giai đoạn cây non là cơ sở để đánh giá năng suất và khả năng chống chịu của cây. Kết quả nghiên cứu kích thước rễ và thân của các giống đậu xanh nghiên cứu ở giai đoạn cây non được thể hiện ở bảng 3.2. Bảng 3.2. Kích thước rễ, thân của các giống đậu xanh ở giai đoạn cây non STT Tên giống Chiều dài thân (cm) Chiều dài rễ (cm) 1 ĐXVN 4 11,22 ± 0,17 9,35 ± 0,21 2 ĐXVN 5 9,50 ± 0,20  8,13 ± 0,14 3 VN 99-3 8,32 ± 0,07  7,15 ± 0,09 4 044/ĐX06 14,12 ± 0,09  11,45 ± 0,16 5 TN 8,7 8 ± 0,12 7,59 ± 0,20 6 LS 11,50 ± 0,13  10,47 ± 0,22 7 HN 1 8,29 ± 0,03 6,80 ± 0,10 8 HN 2 8,05 ± 0,21  6,24 ± 0,12 9 BG 1 10,45 ± 0,15  8,15 ± 0,15 10 BG 2 10,80 ± 0,31  8,29 ± 0,12 11 BG 3 12,14 ± 0,10 10,65 ± 0,15 12 HG 1 11,75 ± 0,05 10,80 ± 0,32 13 HG 2 11,65 ± 0,13  10,50 ± 0,27 Qua bảng 3.2 cho thấy: Chiều dài thân ở giai đoạn cây non của các giống đậu xanh nghiên cứu dao động từ 8,05 - 14,12 cm. Giống có chiều dài thân ngắn nhất là HN 2 (8,05 cm), giống có chiều dài thân dài nhất là 044/ĐX06 (14,12 cm). Chiều dài thân của các giống đậu xanh nghiên cứu có thể xếp theo thứ tự giảm dần như sau: 044/ĐX06 > BG 3 > HG 1> HG 2 > LS > ĐXVN 4 > BG 2 > BG 1 > ĐXVN 5 > TN > VN 99-3 > HN 1 > HN 2. Chiều dài rễ ở giai đoạn cây non của các giống đậu xanh nghiên cứu dao động từ 6,24 - 11,45 cm. Giống có chiều dài rễ ngắn nhất là HN 2 (6,24 cm), giống có chiều dài rễ dài nhất là 044/ĐX06 (11,45 cm). Chiều dài rễ của các giống đậu xanh nghiên cứu có thể xếp theo thứ tự giảm dần như sau: 044/ĐX06 > HG 1 > BG 3 > HG 2 > LS > ĐXVN 4 > BG 2> BG 1 > ĐXVN 5 > TN > VN 99-3 > HN 1 > HN 2. Những giống đậu xanh 044/ĐX06, HG 1, BG 3, HG 2 có chiều dài thân và rễ dài nhất nên rất có thể đây là những giống có khả năng chịu hạn cao nhất trong các giống mà chúng tôi nghiên cứu. Còn hai giống HN 1 và HN 2 có chiều dài thân và rễ ngắn nhất nên đây cũng rất có thể là những giống có khả năng chịu hạn kém nhất. Vì vậy, cần tiếp tục nghiên cứu khả năng chịu hạn của các giống đậu xanh để làm sáng tỏ mối liên quan này. Theo Nguyễn Vũ Thanh Thanh (2003), chiều dài thân của các giống đậu xanh tác giả nghiên cứu dao động từ 9,53 - 15,60 cm. Chiều dài rễ của các giống đậu xanh tác giả nghiên cứu dao động từ 8,61 - 13,22 cm [17]. Như vậy, các giống đậu xanh mà chúng tôi nghiên cứu có chiều dài thân và chiều dài rễ ngắn hơn các giống đậu xanh mà tác giả Nguyễn Vũ Thanh Thanh nghiên cứu. 3.1.3. Đặc điểm hoá sinh hạt của các giống đậu xanh Hạt đậu xanh gồm có lipid, protein, glucid, các chất khoáng như Ca, Fe, Na, K, P... cùng nhiều loại vitamin hoà tan trong nước như vitamin B1, B2, C… Trong đó, protein và lipid là hai thành phần quan trọng được sử dụng để đánh giá chất lượng hạt trên phương diện hoá sinh. Kết quả phân tích hàm lượng lipid và protein của 13 giống đậu xanh nghiên cứu được trình bày trong bảng 3.3. Bảng 3.3. Hàm lượng lipid và protein của các giống đậu xanh nghiên cứu Đơn vị: (% khối lượng khô) STT Tên giống Hàm lượng lipid (%) Hàm lượng protein (%) 1 ĐXVN 4 2,68 ± 0,37 26,80 ± 0,18 2 ĐXVN 5 3,78 ± 0,39  24,31 ± 0,16 3 VN 99-3 4,13 ± 0,34  20,93± 0,32 4 044/ĐX06 2,17 ± 0,30  28,78 ± 0,87 5 TN 3,98 ± 0,02 21,89± 0,12 6 LS 2,80 ± 0,18 26,59± 0,42 7 HN 1 4,58± 0,27 20,04± 0,52 8 HN 2 4,78 ± 0,31  18,54± 0,43 9 BG 1 3,88± 0,30  23,42 ± 0,15 10 BG 2 3,92± 0,10  22,16 ± 0,32 11 BG 3 2,50 ± 0,45  27,69 ± 0,40 12 HG 1 3,17 ± 0,24 25,51 ± 0,52 13 HG 2 3,45 ± 0,05  24,36 ± 0,57 Qua bảng 3.3 cho thấy, hàm lượng lipid trong hạt đậu xanh của các giống nghiên cứu dao động từ 2,17% đến 4,78%. Giống có hàm lượng lipid thấp nhất là 044/ĐX06 (2,17%), giống có hàm lượng lipid cao nhất là HN 2 (4,78%). Hàm lượng lipid trong hạt đậu xanh của các giống nghiên cứu có thể xếp theo thứ tự giảm dần như sau: HN 2 > HN 1 > VN 99-3 > TN > BG 2 > BG 1 > ĐXVN 5 > HG 2 > HG 1 > LS > ĐXVN 4 > BG 3 > 044/ĐX06. Theo Trần Đình Long (1991), hàm lượng lipid trung bình trong hạt đậu xanh không tách vỏ đạt 1,3% [12]. Theo Chu Hoàng Mậu (2001), hàm lượng lipid của các dòng đậu xanh đột biến và giống gốc tương đối cao (4,15% - 6,53%) [15]. Như vậy, các giống đậu xanh mà chúng tôi nghiên cứu đều có hàm lượng lipid cao hơn mức trung bình so với thống kê của Trần Đình Long nhưng lại thấp hơn so với những dòng đậu xanh đột biến của tác giả Chu Hoàng Mậu nghiên cứu. Bảng 3.3 còn cho thấy, hàm lượng protein trong hạt đậu xanh của các giống nghiên cứu dao động từ 18,54% - 28,78%. Giống có hàm lượng protein thấp nhất là HN 2 (18,54%), giống có hàm lượng protein cao nhất là 044/ĐX06 (28,78%). Hàm lượng protein trong hạt đậu xanh của các giống nghiên cứu có thể xếp theo thứ tự giảm dần như sau: 044/ĐX06 > BG 3 > ĐXVN 4 > LS > HG 1 > HG 2 > ĐXVN 5 > BG 1 > BG2 > TN > VN 99-3 > HN 1 > HN 2. Theo Trần Đình Long (1991), hàm lượng protein trung bình trong hạt đậu xanh không tách vỏ đạt 23% - 28% [12]. Theo Chu Hoàng Mậu (2001), hàm lượng protein của các dòng đậu xanh đột biến và giống gốc tương đối cao (15,12% - 20,58%) [15]. Như vậy, các giống đậu xanh mà chúng tôi nghiên cứu đều có hàm lượng protein mức trung bình giống như thống kê của Trần Đình Long nhưng lại cao hơn so với những dòng đậu xanh đột biến của tác giả Chu Hoàng Mậu nghiên cứu. Từ số liệu trong bảng 3.3, chúng tôi rút ra nhận xét: các giống có hàm lượng lipid thấp thì có hàm lượng protein cao và ngược lại. Như vậy, hàm lượng lipid và protein trong hạt đậu xanh có mối tương quan nghịch. Kết quả này phù hợp với các nghiên cứu của Chu Hoàng Mậu (1991) [15] và Trần Thị Phương Liên (1999) [10]. Để xác định mối tương quan giữa hàm lượng lipid và protein, chúng tôi đã xử lý số liệu bằng phần mềm Excel theo Chu Văn Mẫn (2003) [14] để xác định hệ số tương quan R. Kết quả thu được R=0,983 > 0,9 nên đây là mối tương quan chặt. Phương trình biểu diễn mối tương quan giữa hàm lượng lipid và protein của các giống đậu xanh nghiên cứu là : Y= -3,784X + 37,263. Hình 3.1. Mối tương quan giữa hàm lượng lipid và protein của các giống đậu xanh nghiên cứu 3.2. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHỊU HẠN CỦA CÁC GIỐNG ĐẬU XANH NGHIÊN CỨU Ở GIAI ĐOẠN CÂY NON Để đánh giá khả năng chịu hạn của các giống đậu xanh nghiên cứu góp phần định hướng cho việc chọn các giống đậu xanh chịu hạn có hiệu quả, chúng tôi tiến hành nghiên cứu, đánh giá nhanh khả năng chịu hạn của các giống đậu xanh ở giai đoạn cây non theo các chỉ tiêu: tỉ lệ cây không héo, tỉ lệ cây phục hồi sau 3, 5, 7, 9, 11 ngày thí nghiệm. Từ đó xác định chỉ số chịu hạn tương đối của các giống đậu xanh. Giống nào có chỉ số chịu hạn tương đối càng lớn thì khả năng chịu hạn càng cao và ngược lại. Kết quả đánh giá nhanh khả năng chịu hạn ở giai đoạn cây non của các giống đậu xanh nghiên cứu được trình bày ở bảng 3.4. Bảng 3.4. Khả năng chịu hạn ở giai đoạn cây non của các giống đậu xanh nghiên cứu Tên giống 3 ngày 5 ngày 7 ngày 9 ngày 11 ngày Chỉ số chịu hạn %CKH %CPH %CKH %CPH %CKH %CPH %CKH %CPH %CKH %CPH ĐXVN 4 93,33 46,66 76,66 46,66 56,66 33,33 36,66 16,66 13,33 6,66 5524 ĐXVN 5 93,33 46,66 76,66 33,33 43,33 20,00 30,00 10,00 16,66 6,66 4288 VN 99-3 90,00 40,00 70,00 23,33 30,00 16,66 23,33 10,00 6,66 0,00 2915 044/ĐX06 100,0 73,33 86,66 46,66 66,66 60,00 46,66 26,66 36,66 10,00 9174 TN 93,33 50,00 73,33 30,00 33,33 23,33 23,33 13,33 10,00 6,66 4109 LS 96,66 56,66 73,33 43,33 53,33 30,00 36,66 13,33 10,00 6,66 5626 HN 1 90,00 40,00 70,00 23,33 30,00 10,00 20,00 6,66 6,66 3,33 2859 HN 2 86,66 40,00 66,66 20,00 26,66 6,66 16,66 6,66 0,00 0,00 2467 BG 1 93,33 53,33 76,66 33,33 36,66 23,33 20,00 10,00 6,66 6,66 4435 BG 2 93,33 53,33 76,66 33,33 40,00 26,66 23,33 10,00 6,66 6,66 4585 BG3 100,0 63,33 83,33 50,00 63,33 43,33 46,66 20,00 26,66 10,00 7768 HG 1 96,66 63,33 73,33 43,33 56,66 43,33 36,66 16,66 16,66 6,66 6488 HG 2 96,66 60,00 73,33 40,00 53,33 43,33 33,33 10,00 13,33 6,66 5940 Khả năng chịu hạn của các giống đậu xanh còn được biểu diễn bằng đồ thị rada ở các ngưỡng thời gian hạn là 3, 5, 7, 9, 11 ngày (hình 3.2). Diện tích hình tam giác càng lớn thì khả năng chịu hạn càng cao. Hình 3.2. Đồ thị hình rada biểu diễn khả năng chịu hạn Qua bảng 3.4 và hình 3.2 cho thấy: giống 044/ĐX06 và giống BG 3 là hai giống chịu hạn tốt nhất với chỉ số chịu hạn lần lượt là 9174 và 7768. Còn giống HN 1 và HN 2 là hai giống chịu hạn kém nhất với chỉ số chịu hạn lần lượt là 2859 và 2467. Khả năng chịu hạn của các giống đậu xanh nghiên cứu có thể xếp theo thứ tự giảm dần như sau: 044/ĐX06 > BG 3 > HG 1> HG 2 > LS > ĐXVN 4> BG 2 > BG 1 > ĐXVN 5 > TN > VN 99-3 > HN 1 > HN 2. Như vậy, những giống có bộ rễ càng dài thì khả năng chịu hạn càng tốt. Còn những giống có bộ rễ càng ngắn thì khả năng chịu hạn càng kém. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu trước đây, thực vật có bộ rễ phát triển sẽ giúp cây phát triển tốt và có khả năng chống chịu cao. Để xác định mối tương quan giữa khả năng chịu hạn với chiều dài của rễ, chúng tôi xử lý số liệu bằng phần mềm Excel theo Chu Văn Mẫn (2003) [14] để xác định hệ số tương quan R. Kết quả cho thấy R=0,91 nên đây là mối tương quan chặt. Phương trình biểu diễn mối tương quan giữa chiều dài rễ với chỉ số chịu hạn của các giống đậu xanh nghiên cứu là : Y=972,57X-3611,7. Hình 3.3. Mối tương quan giữa chỉ số chịu hạn và chiều dài rễ của các giống đậu xanh nghiên cứu Theo Nguyễn Thị Thu Trang (2008), chỉ số chịu hạn của các giống đậu xanh mà tác giả nghiên cứu dao động từ 4610 - 11640 [21]. Như vậy, các giống đậu xanh mà chúng tôi nghiên cứu có chỉ số chịu hạn thấp hơn các giống đậu xanh mà tác giả Nguyễn Thị Thu Trang nghiên cứu. Điều đó chứng tỏ các giống đậu xanh chúng tôi nghiên cứu có khả năng chịu hạn thấp hơn các giống đậu xanh tác giả Nguyễn Thị Thu Trang nghiên cứu năm 2008. Hình 3.4. Hình ảnh của 4 giống đậu xanh nghiên cứu sau 11 ngày gây hạn HN 1 HN 2 044/ĐX06 BG 3 Từ kết quả đánh giá khả năng chịu hạn ở trên, chúng tôi lựa chọn giống có chỉ số chịu hạn cao nhất là 044/ĐX06 và giống có chỉ số chịu hạn thấp nhất HN 2 để tiếp tục nghiên cứu phân lập gen LTP. 3.3. KẾT QUẢ PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ GEN LTP 3.3.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số DNA tổng số là vật liệu khởi đầu cho mọi nghiên cứu ở cấp độ phân tử. Chất lượng của DNA tổng số có vai trò quan trọng quyết định sự thành công của các thí nghiệm. Do đó, chúng tôi đã tiến hành tách chiết DNA tổng số của hai giống đậu xanh là 044/ĐX06 và HN 2 theo phương pháp của Gawel và Jarret (1991). Sau khi tách DNA tổng số, chúng tôi tiến hành kiểm tra chất lượng DNA tổng số bằng cách điện di trên gel agarose 0,8% trong TAE 1X, nhuộm bản gel trong ethydium bromide và soi dưới ánh đèn cực tím. Kết quả được thể hiện trong hình 3.5. Hình 3.5. DNA tổng số của giống đậu xanh 044/ĐX06 và HN 2 Ký hiệu : 1. 044/ĐX06; 2. HN 2 Tiếp theo, chúng tôi tiến hành kiểm tra độ tinh sạch và hàm lượng của DNA tổng số bằng phương pháp đo trên máy quang phổ. Kết quả thu được thể hiện ở bảng 3.5. Bảng 3.5. Phổ hấp thụ DNA ở bước sóng 260nm và 280nm của giống đậu xanh 044/ĐX06 và BG 3 Tên giống A260 A280 A260/A280 Hàm lượng DNA (ng/ml) 044/ĐX06 0,318 0,165 1,927 795 HN 2 0,223 0,121 1,843 557,5 Bảng 3.5 cho thấy: tỷ số A260/A280 dao động trong khoảng 1,8 - 2,0 chứng tỏ rằng các mẫu DNA tách chiết có độ tinh sạch cao, ít lẫn protein có thể sử dụng để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo. 3.3.2. Kết quả nhân gen LTP Dựa trên cơ sở dữ liệu khai thác từ Ngân hàng gen Quốc tế với mã số AY300807, chúng tôi đã thiết kế cặp mồi đặc hiệu để nhân và phát hiện sự có mặt của gen LTP ở hai giống đậu xanh là 044/ĐX06 và HN 2. M 1 2 3 4 ¬ 350 bp 500bp ® Hình 3.6. Hình ảnh điện di kết quả nhân gen LTP Kí hiệu: M. Marker 1 Kb; 1,2. 044/ĐX06; 3,4. HN 2 Đoạn gen LTP được nhân từ DNA tổng số bằng phương pháp PCR. Kết quả nhân gen được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1% trong TAE 1X, với sự có mặt của marker chuẩn và chụp ảnh dưới ánh sáng cực tím. Hình ảnh điện di được thể hiện ở hình 3.6. Qua hình 3.6 cho thấy, đã nhân được một đoạn DNA đặc hiệu có kích thước khoảng 350 bp, hàm lượng của sản phẩm đủ lớn để thực hiện cho các nghiên cứu tiếp theo. Độ dài của đoạn DNA vừa nhân được cũng phù hợp với lý thuyết khi chúng tôi thiết kế mồi và chiều dài cũng tương tự như với gen LTP đã đăng ký trên Ngân hàng gen Quốc tế với mã số AY300807 [34]. 3.3.3. Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR Vì sản phẩm PCR ngoài đoạn gen mong muốn còn có sản phẩm phụ, các nucleotide dư thừa sau phản ứng, mồi, enzyme… Vì vậy, để quá trình biến nạp đạt hiệu quả cao nhất, chúng tôi đã tiến hành tinh sạch (thôi gel) sản phẩm PCR theo bộ Kit DNA extraction Kit K05013 của hãng Fermentas để thu nhận đoạn gen mong muốn trước khi biến nạp. Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR được thể hiện ở hình 3.7. ¬ 350 bp M 1 2 500bp ® Hình 3.7. Kết quả điện di DNA thu được từ kỹ thuật thôi gel Kí hiệu: M. Marker 1 Kb; 1. 044/ĐX06; 2. HN 2. p Qua hình 3.7 cho thấy: sản phẩm thôi gel có hàm lượng cao, không bị đứt gẫy đảm bảo cho việc tiến hành các thí nghiệm tiếp theo. 3.3.4. Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α Sản phẩm PCR sau khi được tinh sạch được gắn vào vector tách dòng pBT nhờ enzyme nối T4 ligase. Phản ứng ghép nối dựa trên nguyên tắc bổ sung giữa hai đầu nucleotide A thò ra ở sản phẩm PCR với Taq - polymerase và hai đầu nucleotide T trên vector tách dòng pBT. Hỗn hợp được ủ ở 220C trong 1h cho phản ứng xảy ra hoàn toàn, sau đó được biến nạp vào tế bào khả biến chủng E.coli DH5α và được cấy trải trên môi trường LB đặc (pepton, cao nấm men, NaCl, agarose) có bổ sung kháng sinh ampicillin (100mg/l), X-gal (40mg/l) và IPTG (100µM). Ủ đĩa ở 370C trong 16 giờ. Kết quả thu được có cả khuẩn lạc màu xanh và màu trắng được thể hiện ở hình 3.8. Hình 3.8. Hình ảnh khuẩn lạc Tiến hành chọn 4 khuẩn lạc có màu trắng chuyển sang nuôi trong môi trường LB lỏng (có bổ sung ampicillin 100mg/l) qua đêm. 3.3.5. Kết quả chọn lọc plasmid tái tổ hợp bằng clony-PCR Lấy dịch nuôi chứa vi khuẩn kiểm tra sản phẩm chọn dòng bằng PCR với cặp mồi pUC 18 để xác định khuẩn lạc có mang gen mong muốn. Sản phẩm clony-PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1% trong TAE 1X, với sự có mặt của marker chuẩn và chụp ảnh dưới ánh sáng cực tím. Kết quả điện di sản phẩm clony-PCR được thể hiện ở hình 3.9. Vì pUC là mồi thiết kế chung cho các vector tách dòng nên khi kiểm tra sản phẩm clony-PCR vừa dòng hoá thì kích thước của đoạn gen sẽ cao hơn 124 bp. Điều này có nghĩa là kích thước của đoạn gen vừa nhân khoảng 474 bp. Từ kết quả điện di ở hình 3.9 cho thấy, sản phẩm clony-PCR từ những khuẩn lạc màu trắng đều cho kết quả dương tính. Tất cả hai mẫu đều cho một băng duy nhất đúng kích thước, chứng tỏ kết quả biến nạp và chọn dòng đã được thực hiện tốt, phản ứng PCR đã đạt mức tối ưu. Hình 3.9. Kết quả điện di sản phẩm clony-PCR Kí hiệu: M. Marker 1Kb; 1. 044/ĐX06; 2. HN 2 474 bp 500 bp 3.3.6. Kết quả tách plasmid từ các khuẩn lạc của 2 mẫu nghiên cứu Hình 3.10. Kết quả điện di sản phẩm tách plasmid mang gen LTP của giống đậu xanh 044/ĐX06 và HN 2 Kí hiệu: 1. 044/ĐX06; 2. HN 2 Sau khi kết quả biến nạp và chọn dòng đã được thực hiện tốt, phản ứng PCR đã đạt mức tối ưu, chúng tôi tiếp tục tiến hành tách plasmid theo bộ Kit AccuPrep Plasmid Extraction của hãng Bioneer. Sản phẩm tách plasmid được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1% trong TAE 1X, với sự có mặt của marker chuẩn và chụp ảnh dưới ánh sáng cực tím. Hình ảnh điện di sản phẩm tách plasmid mang gen LTP của hai giống đậu xanh nghiên cứu được thể hiện ở hình 3.10. Kết quả điện di ở hình 3.10 cho thấy, sản phẩm tách plasmid sạch, đảm bảo chất lượng và số lượng phục vụ cho việc xác định trình tự nucleotide. 3.3.7. Kết quả xác định và so sánh trình tự nucleotide của gen LTP Để xác định chính xác trình tự nucleotide của gen LTP đã được tách dòng, chúng tôi tiến hành đọc trình tự nucleotide của gen LTP trên máy đọc trình tự nucleotide tự động ABI PRISM@ 3100 Advant Genetic Analyzer. Kết quả đọc trình tự gen của 2 mẫu nghiên cứu được thể hiện ở hình 3.11. ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 10 20 30 40 50 044/ĐX06 ATGGCTAGCC TGAAGGTTGC ATGCATGGTT GCGGTGGTGT TCATGGTCGT HN 2 ATGGCTAGCC TGAAGGTTGC ATGCATGGTT GCGGTGGTGT TCATGGTCGT ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 60 70 80 90 100 044/ĐX06 GGTGAGTGCA CATATGGCAC ATGCGATCAC GTGCGGGCAA GTGGCCTCTT HN 2 GGTGAGTGCA CATATGGCAC ATGCGATCAC GTGCGGGCAA GTGGCCTCTT ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 110 120 130 140 150 044/ĐX06 CTTTGGCTCC ATGCATCTCC TACCTCCAAA AGGGCGGAGT TCCGTCGGCG HN 2 CTTTGGAATC ATCCATCTCC TACCTCCAAA AGGGCGGAGT TCCGTCGGCG ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 160 170 180 190 200 044/ĐX06 TCGTGTTGCA GCGGAGTGAA GGCCCTGAAC AGCGCCGCAA GTACCACCGC HN 2 TCGTGTTGCA GCGGAGTGAA GGCCCTGAAC AGCGCCGCAA GTACCACCGC ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 210 220 230 240 250 044/ĐX06 TGACCGCAAA ACCGCGTGCA ACTGTCTGAA AAACCTTGCC GGTCCAAAGT HN 2 TGACCGCAAA ACCGCGTGCA ACTGTCTGAA AAACCTTGCC GGTCCAAAGT ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 260 270 280 290 300 044/ĐX06 CGGGTATCAA CGAGGGCAAC GCCGCATCAC TCCCAGGCAA ATGTAAAGTC HN 2 CGGGTATCAA CGAGGGCAAC GCCGCTTCAC TCCCAGGCAA ATGTAAAGTC ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 310 320 330 340 350 044/ĐX06 ATCGTGCCCT ACTGGATCAG CACCTTCACC AACTGCGCTA ACATCAAGTA HN 2 AACGTGCCCT ACAAGATCAG CACCTTCACC AACTGCGCTA ACATCAAGTA . 044/ĐX06 A HN 2 A Hình 3.11. Trình tự nucleotide của gen LTP ở 2 giống đậu xanh nghiên cứu Kết quả hình 3.11 cho thấy, chiều dài gen LTP của hai mẫu nghiên cứu đều có kích thước 351 nucleotide. Khi so sánh 2 trình tự này trong BLAST của NCBI, kết quả cho biết đây là các trình tự gen mã hoá LTP của đậu xanh. Chúng tôi kết luận đã nhân, tách dòng và đọc trình tự thành công đoạn gen mã hoá LTP của đậu xanh. Mức độ tương đồng về trình tự nucleotide của giống đậu xanh chịu hạn tốt 044/ĐX06 với giống đậu xanh chịu hạn kém HN 2 đạt 97,7% (chỉ sai khác 8 nucleotide lần lượt ở các vị trí 107, 108, 109, 113, 276, 302, 313 và 314). Sự sai khác của các nucleotide giữa giống đậu xanh chịu hạn tốt 044/ĐX06 với giống đậu xanh chịu hạn kém HN 2 được thể hiện ở bảng 3.6. Bảng 3.6. Vị trí sai khác trong trình tự nucleotide của gen LTP ở giống đậu xanh 044/ĐX06, HN 2 STT Vị trí 044/ĐX06 HN 2 1 107 C A 2 108 T A 3 109 C T 4 113 G C 5 276 A T 6 302 T A 7 313 T A 8 314 G A Qua bảng 3.6 cho thấy, ở vị trí 107, 108, 109, 113, 276, 302, 313 và 314 nucleotide của giống đậu xanh 044/ĐX06 lần lượt là C, T, C, G, A, T, T và G, còn ở giống đậu xanh HN 2 lần lượt được thay bằng A, A, T, C, T, A, A và A. Các vị trí sai khác này có thể liên quan đến khả năng chịu hạn của cây đậu xanh. Từ kết quả xác định trình tự ở trên, chúng tôi tiếp tục so sánh trình tự gen LTP của hai giống đậu xanh nghiên cứu với trình tự của giống đậu xanh trên Ngân hàng gen Quốc tế có mã số AY300807. Kết quả so sánh trình tự nucleotide được thể hiện ở hình 3.12. ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 10 20 30 40 50 AY300807 ATGGCTAGCC TGAAGGTTGC ATGCATGGTT GCGGTGGTGT TCATGGTCGT 044/ĐX06 ATGGCTAGCC TGAAGGTTGC ATGCATGGTT GCGGTGGTGT TCATGGTCGT HN 2 ATGGCTAGCC TGAAGGTTGC ATGCATGGTT GCGGTGGTGT TCATGGTCGT ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 60 70 80 90 100 AY300807 GGTGAGTGCA CATATGGCAC ATGCGATCAC GTGCGGGCAA GTGGCCTCTT 044/ĐX06 GGTGAGTGCA CATATGGCAC ATGCGATCAC GTGCGGGCAA GTGGCCTCTT HN 2 GGTGAGTGCA CATATGGCAC ATGCGATCAC GTGCGGGCAA GTGGCCTCTT ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 110 120 130 140 150 AY300807 CTTTGGCTCC ATGCATCTCC TACCTCCAAA AGGGCGGAGT TCCGTCGGCG 044/ĐX06 CTTTGGCTCC ATGCATCTCC TACCTCCAAA AGGGCGGAGT TCCGTCGGCG HN 2 CTTTGGAATC ATCCATCTCC TACCTCCAAA AGGGCGGAGT TCCGTCGGCG ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 160 170 180 190 200 AY300807 TCGTGTTGCA GCGGAGTGAA GGCCCTGAAC AGCGCCGCAA GTACCACCGC 044/ĐX06 TCGTGTTGCA GCGGAGTGAA GGCCCTGAAC AGCGCCGCAA GTACCACCGC HN 2 TCGTGTTGCA GCGGAGTGAA GGCCCTGAAC AGCGCCGCAA GTACCACCGC ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 210 220 230 240 250 AY300807 TGACCGCAAA ACCGCGTGCA ACTGTCTGAA AAACCTTGCC GGTCCAAAGT 044/ĐX06 TGACCGCAAA ACCGCGTGCA ACTGTCTGAA AAACCTTGCC GGTCCAAAGT HN 2 TGACCGCAAA ACCGCGTGCA ACTGTCTGAA AAACCTTGCC GGTCCAAAGT ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 260 270 280 290 300 AY300807 CGGGTATCAA CGAGGGCAAC GCCGCTTCAC TCCCAGGCAA ATGTAAAGTC 044/ĐX06 CGGGTATCAA CGAGGGCAAC GCCGCATCAC TCCCAGGCAA ATGTAAAGTC HN 2 CGGGTATCAA CGAGGGCAAC GCCGCTTCAC TCCCAGGCAA ATGTAAAGTC ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 310 320 330 340 350 AY300807 AACGTGCCCT ACAAGATCAG CACCTTCACC AACTGCGCTA ACATCAAGTA 044/ĐX06 ATCGTGCCCT ACTGGATCAG CACCTTCACC AACTGCGCTA ACATCAAGTA HN 2 AACGTGCCCT ACAAGATCAG CACCTTCACC AACTGCGCTA ACATCAAGTA . AY300807 A 044/ĐX06 A HN 2 A Hình 3.12. So sánh trình tự nucleotide của gen LTP ở giống đậu xanh 044/ĐX06 và HN 2 với trình tự đã công bố AY300807 Qua hình 3.12 cho thấy, trình tự nucleotide của gen LTP ở giống đậu xanh 044/ĐX06 và HN 2 đều có hệ tương đồng với trình tự nucleotide của giống đã công bố với mã số AY300807 là 98,8%. Các vị trí sai khác trong trình tự nucleotide của gen LTP ở 3 giống đậu xanh trên được thể hiện ở bảng 3.7. Bảng 3.7. Vị trí sai khác trong trình tự nucleotide của gen LTP ở giống đậu xanh 044/ĐX06, HN 2 và AY300807 STT Vị trí AY300807 044/ĐX06 HN 2 1 107 C C A 2 108 T T A 3 109 C C T 4 113 G G C 5 276 T A T 6 302 A T A 7 313 A T A 8 314 A G A Qua bảng 3.7 cho thấy, trình tự nucleotide ở vị trí 107, 108, 109 và 113 của giống có mã số AY300807 lần lượt là C, T, C và G, còn ở giống đậu xanh HN 2 lần lượt được thay bằng A, A, T và C. Trình tự nucleotide ở vị trí 276, 302, 313 và 314 của giống có mã số AY300807 lần lượt là T, A, A và A, còn ở giống đậu xanh 044/ĐX06 lần lượt được thay bằng A, T, T và G. So sánh trình tự amino acid trong protein của gen LTP ở giống đậu xanh 044/ĐX06 và HN 2 cho kết quả được thể hiện ở hình 3.13. ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 10 20 30 40 50 044/ĐX06 MASLKVACMV AVVFMVVVSA HMAHAITCGQ VASSLAPCIS YLQKGGVPSA HN 2 MASLKVACMV AVVFMVVVSA HMAHAITCGQ VASSLESSIS YLQKGGVPSA ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 60 70 80 90 100 044/ĐX06 SCCSGVKALN SAASTTADRK TACNCLKNLA GPKSGINEGN AASLPGKCKV HN 2 SCCSGVKALN SAASTTADRK TACNCLKNLA GPKSGINEGN AASLPGKCKV ....|....| ....|. 110 044/ĐX06 IVPYWISTFT NCANIK HN 2 NVPYKISTFT NCANIK Hình 3.13. So sánh trình tự amino acid trong protein của gen LTP ở giống đậu xanh 044/ĐX06 và HN 2 Qua hình 3.13 cho thấy, giữa giống đậu xanh 044/ĐX06 và HN 2 có độ tương đồng về trình tự amino acid trong protein của gen LTP đạt 95,6% với 5 vị trí sai khác được thể hiện ở bảng 3.8. Bảng 3.8. Vị trí sai khác về trình tự amino acid trong protein của gen LTP ở giống đậu xanh 044/ĐX06, HN 2 STT Vị trí 044/ĐX06 HN 2 1 36 A E 2 37 P S 3 38 C S 4 101 I N 5 105 W K Qua bảng 3.8 cho thấy, trình tự amino acid ở vị trí 36, 37, 38, 101 và 105 của giống đậu xanh 044/ĐX06 lần lượt là A, P, C, I và W, còn ở giống đậu xanh HN 2 lần lượt được thay bằng E, S, S, N và K. So sánh trình tự amino acid trong protein của gen LTP ở giống đậu xanh 044/ĐX06 và HN 2 với giống đậu xanh có mã số AY300807 cho kết quả được thể hiện ở hình 3.14. ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 10 20 30 40 50 AY300807 MASLKVACMV AVVFMVVVSA HMAHAITCGQ VASSLAPCIS YLQKGGVPSA 044/ĐX06 MASLKVACMV AVVFMVVVSA HMAHAITCGQ VASSLAPCIS YLQKGGVPSA HN 2 MASLKVACMV AVVFMVVVSA HMAHAITCGQ VASSLESSIS YLQKGGVPSA ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 60 70 80 90 100 AY300807 SCCSGVKALN SAASTTADRK TACNCLKNLA GPKSGINEGN AASLPGKCKV 044/ĐX06 SCCSGVKALN SAASTTADRK TACNCLKNLA GPKSGINEGN AASLPGKCKV HN 2 SCCSGVKALN SAASTTADRK TACNCLKNLA GPKSGINEGN AASLPGKCKV ....|....| ....|. 110 AY300807 NVPYKISTFT NCANIK 044/ĐX06 IVPYWISTFT NCANIK HN 2 NVPYKISTFT NCANIK Hình 3.14. So sánh trình tự amino acid trong protein của gen LTP ở giống đậu xanh 044/ĐX06, HN 2 và AY300807 Qua hình 3.14 cho thấy, độ tương đồng về trình tự amino acid trong protein của gen LTP ở giống đậu xanh có mã số AY300807 với giống đậu xanh 044/ĐX06 và HN 2 lần lượt là 98,2% và 97,4%. Các vị trí sai khác được thể hiện ở bảng 3.9. Bảng 3.9. Vị trí sai khác về trình tự amino acid trong protein của gen LTP ở giống đậu xanh 044/ĐX06, HN 2 và AY300807 STT Vị trí AY300807 044/ĐX06 HN 2 1 36 A A E 2 37 P P S 3 38 C C S 4 101 N I N 5 105 K W K Qua bảng 3.9 cho thấy, trình tự amino acid ở vị trí 36, 37và 38 của giống đậu xanh có mã số AY300807 lần lượt là A, P và C, còn ở giống đậu xanh HN 2 lần lượt được thay bằng E, S và S. Trình tự amino acid ở vị trí101 và 105 của giống đậu xanh có mã số AY300807 lần lượt là N và K, còn ở giống đậu xanh 044/ĐX06 lần lượt được thay bằng I và W. Sự sai khác về trình tự nucleotide và trình tự amino acid ở trên là cơ sở để chúng tôi có những nghiên cứu tiếp theo trên nhiều giống đậu xanh hơn nữa và so sánh giữa hai nhóm chịu hạn tốt và kém nhằm tìm kiếm sự thay đổi vị trí các nucleotide và amino acid liên quan đến tính trạng chịu hạn của các giống đậu xanh. Đây là tiền đề tạo cơ sở cho việc nghiên cứu chọn tạo các giống đậu xanh có khả năng chịu hạn tốt, phục vụ cho phát triển cây đậu xanh ở vùng trung du và miền núi phía Bắc. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ I. Kết luận 13 giống đậu xanh có nguồn gốc khác nhau được sử dụng trong nghiên cứu có: khối lượng 1000 hạt dao dộng từ 46,40 g (ở giống 044/ĐX06) đến 58,00 g (ở giống BG 2), chiều dài thân ở giai đoạn cây non dao động từ 8,05cm (ở giống HN 2) đến 14,12 cm (ở giống 044/ĐX06), chiều dài rễ ở giai đoạn cây non dao động từ 6,24 cm (ở giống HN 2) đến 11,45 cm (ở giống 044/ĐX06). Các giống đậu xanh nghiên cứu có hàm lượng lipid dao động từ 2,17 % (ở giống 044/ĐX06) đến 4,78 % (ở giống HN 2), hàm lượng protein dao động từ 18,54 % (HN 2) đến 28,78 % (ở giống 044/ĐX06). Khả năng chịu hạn của các giống đậu xanh nghiên cứu có sự khác biệt. Hai giống có khả năng chịu hạn cao nhất là 044/ĐX06 và BG 3 còn hai giống có khả năng chịu hạn kém nhất là HN 1 và HN 2. Đã nhân bản, chọn dòng và đọc trình tự gen LTP của giống chịu hạn tốt (044/ĐX06) và giống chịu hạn kém (HN 2) thành công. Chiều dài gen LTP ở hai giống đậu xanh trên có kích thước 351 nucleotide với độ tương đồng là 97,7 %. Độ tương đồng về trình tự amino acid trong protein của gen LTP ở hai giống đậu xanh trên đạt 95,6 %. Độ tương đồng giữa trình tự gen LTP của hai giống đậu xanh nghiên cứu với trình tự gen LTP trên đậu xanh đã được công bố trong ngân hàng gen đều là 98,8 %. Độ tương đồng về trình tự amino acid trong protein của gen LTP ở giống đậu xanh có mã số AY300807 với giống đậu xanh 044/ĐX06 và HN 2 lần lượt là 98,2 % và 97,4 %. II. Đề nghị Cần tiếp tục nhân bản, chọn dòng và đọc trình tự gen LTP của nhiều giống đậu xanh khác nhau để tìm ra chỉ thị phân tử về tính chịu hạn của cây đậu xanh. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt: Lê Trần Bình và cs (1998), Công nghệ sinh học thực vật trong cải tiến giống cây trồng, NXB Nông nghiệp. Lê Trần Bình, Lê Thị Muội (1998), Phân lập gen và chọn dòng chống chịu ngoại cảnh bất lợi ở cây lúa, NXB Đại học Quốc Gia, Hà Nội. Phạm Thị Trân Châu, Nguyễn thị Hiền, Phùng Gia Tường (1998), Thực hành Hoá sinh học, NXB Giáo dục. Nguyễn Mạnh Chính, Nguyễn Mạnh Cường (2008), Trồng đậu xanh, NXB Nông Nghiệp, Hà Nội, tr: 3-9. Đường Hồng Dật (2006), Cây đậu xanh. Kỹ thuật thâm canh và biện pháp tăng năng suất, chất lượng sản phẩm, NXB Lao Động - Xã Hội, tr: 5-31. Điêu Thị Mai Hoa, Lê Trần Bình (2005), ‘‘ Nghiên cứu tính đa dạng di truyền của 57 giống đậu xanh (Vigna radiata L.) bằng kỹ thuật RAPD’’, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 3(1), tr: 57-66. Nguyễn Đăng Khôi (1997), “Các cây đậu ăn hạt ở Việt Nam”, Tạp chí Sinh học, số 2, tr: 5-6. Kết quả nghiên cứu khoa học đậu đỗ 1991- 1995 (1996), Viện Khoa học kỹ thuật Nông nghiệp, Việt Nam, tr: 4-188. Kết quả nghiên cứu khoa học nông nghiệp 2000 (2001), NXB Nông Nghiệp. Trần Thị Phương Liên (1999), Nghiên cứu đặc tính hoá sinh và sinh học phân tử của một số giống đậu tương có khả năng chịu nóng, chịu hạn ở Việt Nam, Luận án tiến sĩ Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học, Hà Nội. Trần Đình Long, Lê Khả Tường (1998), Cây đậu xanh, NXB Nông Nghiệp. Trần Đình Long, Lê Khả Tường (1991), Những nghiên cứu mới về chọn tạo giống đậu đỗ, NXB Nông nghiệp, Hà Nội, tr: 2-20. Đỗ Tất Lợi (1997), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội. Chu Văn Mẫn (2003), Ứng dụng tin học trong sinh học, NXB Đại học Quốc Gia, Hà Nội, tr: 20-215. Chu Hoàng Mậu (2001), Sử dụng phương pháp đột biến thực nghiệm để tạo các dòng đậu tương và đậu xanh thích hợp cho miền núi Đông Bắc Việt Nam, Luận án tiến sĩ Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học, Hà Nội. Chu Hoàng Mậu, Lê Trần Bình (2001), “Hàm lượng axit amin trong hạt của các dòng đậu tương và đậu xanh đột biến”, Tạp chí Sinh học, 23(4). Nguyễn Vũ Thanh Thanh (2003), Nghiên cứu thành phần hoá sinh hạt và tính đa dạng di truyền của một số giống đậu xanh có khả năng chịu hạn khác nhau, Luận văn thạc sĩ Sinh học, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên. Nguyễn Vũ Thanh Thanh (2006), Nghiên cứu đặc điểm sinh học phân tử ở một số giống đậu xanh chịu hạn, Báo cáo tổng kết đề tài nghiên cứu khoa học và công nghệ cấp Bộ. Nguyễn Vũ Thanh Thanh (2008), Nghiên cứu tính đa dạng di truyền và phân lập một số gen liên quan đến tính chịu hạn của cây đậu xanh (Vigna radiata (L.) Wilczeck), Luận án tiến sĩ Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học, Hà Nội. Phạm văn Thiều (1997), Cây đậu xanh. Kỹ thuật trồng và chế biến sản phẩm, NXB Nông nghiệp. Nguyễn Thị Thu Trang (2008), Đánh giá chất lượng hạt, khả năng chịu hạn và phân lập gen cystatin của một số giống đậu xanh (Vigna radiata (L.) Wilczek), Luận văn thạc sĩ Sinh học, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên. Tài liệu tiếng Anh: Arondel V., Vergnolle C., Cantrel C., Kader J.C. (2000), “Lipid transfer protein are encoded by a small multigen familly in Arabidopsis thaniana”, Plant Science, 157, pp: 1-12. Blein J.P., Coutos P.T., Marion D., Ponchet M. (2002), “From elicitins to lipid-transfer proteins: a new insight in cell signalling involved in plant defence mechanisms”, Trends in Plant Science, 7, pp: 293-296. Blilou I., Ocampo J.A., Garcia - Garrido J.M. (2005), ‘‘ Induction of LTP and Pal gene expression in rice roots clonized by the arbuscular mycorrhizal fungus Glomus mosseae’’, www.ncbi.nlm.nih.gov. Bourgis F., Kader J.C. (1997), “Lipid-transfer proteins: Tools for manipulating membrane lipids”, Physiologia Plantarum, Volume 100, Number 1, pp: 78-84. Carvalho A.O., Souza-Filho G.A., Ferreira B.S., Branco A.T., Araujo I.S., Fernandes K.V., Retamal C.A., Gomes V.M. (2006), ‘‘Cloning and characterization of a cowpea seed lipid transfer protein cDNA: expression analysis during seed development and under fungal and cold stresses in seedling tissues’’, Plant Physiol Biochem, 44(11-12), pp: 732-742. Carvalho A.O., Tavares O.L.M., Santos I.S., Cunha M., Gomes V.M. (2001), “Antimicrobial peptides and imunolocatization of a LTP in Vigna radiata seeds’’, Plant physiol Biochem, 39, pp: 137-146. Chen Y.J., Wu M.F., Yu Y.H., Tam M.F., Lin T.Y. (2004), “Developmental expression of three mungbean Hsc70s and substrate-binding specificity of the encoded protein”, Plant and Cell Physiology, 45(110), pp: 1603-1614. Douliez J.P., Michon T., Elmorjani K. and Marion D. (2000), “Structure, Biological and Technological Functions of Lipid Transfer Proteins and Indolines, the Major Lipid Binding Proteins from Cereal Kernels”, Journal of Cereal Science, Volume 32, Issue 1, pp: 1-20. Dure L.III., Crouch M., Harada J, T-H Ho, Mundy J, Quatrano R.S., Thomas T., Sung Z.R. (1989), ‘‘Common amino acid sequence domains among the LEA proteins of higher plants’’, Plant Mol Biol, 12, pp: 475-486. Gawel N.J., Jarret R.H. (1991), Genomic DNA isolation. Goyal K., Walton L.J., Tunnacliffe A. (2005), ‘‘LEA proteins prevent protein aggrevation due to water stress’’, Biochem, 388, pp: 151-157. Guerbette F., Grosbois M., Jolliot C.A., Kader J.C. and Zachowski A. (1999), “Lipid-transfer proteins from plants: Structure and binding properties”, Molecular and Cellular Biochemistry, 192, pp: 157-161. Kader J.C. (1996), “Lipid-transfer proteins in plants”, Annual Review of Plant Physiology Plant Molecular Biology , 47, pp: 627-654. Kang S.J., Kim M.C., Yoo D.W., Park K.S. (2002), Vigna rariata cystatin mRNA, complete cds, EMBL GenBank, Accession AF454396. Karen S. and John M. (1990), “Gene expression in respone to abscisic acid and osmotic stress”, The plant cell, 2, pp: 503-512. Kimberly D.C., Mark A.T. and Lawrence B.M. (2005), ‘‘Increased Accumulation of Cuticular Wax and Expresion of Lipid Transfer Protein in Response to Periodic Drying Events in Leaves of Tree Tobacco’’, www.ncbi.nlm.nih.gov. Kim Y.J, Kim J.E, Lee J.H., Lee M.H., Jung H.W., Bahk Y.Y, Hwang B.K., Hwang I., Kim W.T. (2003), ‘‘The Vr - PLC3 gene encodes a pultative plasma membrane - localized phosphoinoside - specific phospholipase C whose expression is induces by abiotic stress in mungbean (Vigna radiata L.)”, Federation of Eropean Biochemical Societies Letters, 556, pp: 127-136. Liu K.H., Lin T.Y. (2003), “Cloning and characterization of two novel lipid transfer protein I genes in Vigna radiate”, DNA sequence - The Journal of sequencing and mapping, 14(6), pp: 420-426. Malgorzata G., Barbara Z. (2004), “Multifunctional role of plant cysteine proteinases”, Acta Biochimica Polonica, 51(3), pp: 609-624. Masuta C., Furuno M., Tanaka H., Yamada M., Koiwai A. (2005), ‘‘Molecular cloning of a cDNA clone for tobacco lipid transfer protein and expression of the functional protein in Escherichia’’, www.ncbi.nlm.nih.gov. Molina A., Garcia O.F. (1993), “Developmental and pathogen-induced expression of three barley genes encoding lipid transfer proteins”, The Plant Journal, 4, pp: 983-991. Molina A., Diaz I., Vasil I.K., Carbonero P., Garcisa O.F. (1996), “Two cold-inducible genes encoding lipid transfer protein LTP4 from barley show differential responses to bacterial pathogens”, Molercular and General Genetics, 252, pp:162-168. Ouvrard O., Cellier F., Ferrare K.,Tousch D., Lamaze T., Dupuis J.M. and Casse D.F. (1996), “Identification and expression of water stress- and abscisic acid-regulated genes in a drought-tolerant sunflower genotype”, Plant Molecular Biology, Volume 31, Number 4, pp: 819-829. Pandurangam V., Sharma - Natu P., Sreekanth B., Ghildiyal M.C. (2006), ‘‘Photosynthetic acclimation to elevated CO2 in relation to Rubisco genee expression in three C3 species’’, Indian Journal of Experimental Biology, 44(5), pp: 408-415. Park C.J., Shin R., Park J.M., Lee G.J., You J.S. and Paek K.H. (2002), “Induction of pepper cDNA encoding a lipid transfer protein during the resistance response to tobacco mosaic virus”, Plant Molecular Biology, Volume 48, Number 3, pp: 243-254 Pe M. E. (1993), “Mapping quantitative trait loci (QTLs) for resistance to gibberella zeae infection in maize”, Molercular Gene Geneet, 241(1-2), pp: 11-16. Raesh S., Manickam A. (2006), ‘‘Prediction of functions for two LEA proteins from mungbean”, Bioinformation, 1(4), pp: 133-138. Sossountzov L., Ruiz A.L., Vignols F., Jolliot A., Arondel V., Tchang F., Grosbois M., Guerbette F., Miginiac E., Delseny M., Puigdomenech P. and Kader J.C. (1991), “Spatial and Temporal Expression of a Maize Lipid Transfer Protein Gene”, The Plant Cell, Vol 3, pp: 923-933. Sterk P., Booij H., Schellekens G.A., Van Kammen A., De Vries S.C. (1991), “Cell-specific expression of the carrot EP2 lipid transfer protein gene”, The Plant Cell, 3, pp: 907-921. Terras F.R., Schoofs H.M., De Bolle M.F. (1992), “Analysis of two novel classes of plant antifungal proteins from radish (Raphanus sativus L.) seeds”, The Journal of Biological Chemistry, 267, pp:15301-15309. Terres S.S., Godoy J.A., Pintor-Toro J.A. (1992), ‘‘A probable lipid transfer protein is induced by NaCl in stems of tomato plants’’, Plants Molecular Biology, 105, pp: 749-756. Verma D.P.S. (1990), “Genetic engineering for prolin biosynthesis and the role prolin in salt stress and symbiotic nitrogene fixation”, In: Proccedings of the international symposium on molecular and genetic approaches to plant stres, Newdelhi, pp: 14-17. Vignols F. Lund G., Pammi S., Tremousaygue D., Grellet F., Kader J.C., Puigdomenech P., Delseny M. (1994), “ Characterizarion of a rice gene coding for a lipid transfer protein”, Gene, 142, pp: 420-426. Wise (2003), ‘‘Leaping to conclusions a computational reanalysis of latte embryogenesis abundant proteins and their possible roles’’, BMC Bioinformatics, 4, pp: 52-57. Xiao B., Huang Y., Tang N., Xiong L. (2007), ‘‘Over-expression of a LEA gene in rice improves drought resistance under the field conditions’’, TAG, 115, pp: 35-46. Xu D., Duan X., Wang B., Hong B., Ho T., Wu R. (1996), ‘‘Expression of a late embyogenesis abundant protein gene, HVA1, from barley confers tolerance to water deficit and salt stress in transgenic rice’’, Plant Physiol, 110, pp: 249-257. Zhencai W. and Jacqueline K. B. (2003), “Isolation and characterization of a cDNA encoding a lipid transfer protein expressed in Valencia orange during abscission”, Journal of Experimental Botany, 385, pp: 1183-1191. MỤC LỤC Trang phụ bìa Lời cam đoan Lời cảm ơn Danh mục những chữ viết tắt trong luận văn Danh mục các bảng trong luận văn Danh mục các hình trong luận văn