Luận văn Định danh nấm Phytophthora spp. bằng các kỹ thuật sinh học phân tử

i thiệu một số kỹ thuật phổ biến nhằm phát hiện và định danh một số giống nấm gây bệnh thường gặp (James C. Correll. Genetic, Biochemical, and Molecular Techniques for the Identification and Detection of Soilborne Plant-Pathogenic Fungi) 2.3.2. So sánh sự tƣơng đồng về sinh sản và sinh dƣỡng Kỹ thuật so sánh tính tương đồng về sinh sản thường được sử dụng để xác định và mô tả mật độ lai của loài, đặc tính sinh học giữa các loài, bên trong loài. Kỹ thuật so sánh tính tương đồng về sinh dưỡng thường được sử dụng để xác định các tiểu quần thể clone hoặc các cá thể trong một loài. Hai kỹ thuật này khác nhau không nhiều về di truyền và cơ chế. Giới hạn của kiểm tra tính tương quan sinh sản bao gồm những điều sau: khó khăn phải đối mặt trong việc tái sinh những điều kiện lai thích hợp trong môi trường thuần khiết; tất cả những chủng kiểm tra thích hợp trong những quần thể lai khác nhau của các loài định sẵn có thể không có giá trị; một số cá thể trong quần thể nấm có thể không có bộ phận sinh sản, và do đó không thể tái sản xuất với bất kì những chủng kiểm tra đã biết. 12 So sánh về sinh dưỡng, hay thể dị hạch (heterokaryon) giúp ta hiểu thêm về mối liên hệ di truyền của những chủng nấm trong một loài. Kỹ thuật này đơn giản dựa vào khả năng nối nhau của sợi nấm của hai chủng khác nhau, nó rất giống với sự đánh giá những đặc điểm di truyền khác. Kỹ thuật này được sử dụng như một kỹ thuật xác định sự đa dạng di truyền trong các loài nấm, đột biến dinh dưỡng – sinh trưỡng, đột biến nitrate- nonutilizing (nit ). 2.3.3. Kỹ thuật protein profile Điện di protein hòa tan trong ứng dụng ở cấp độ loài và dưới loài. Kỹ thuật này bao gồm ly trích protein tổng số từ sợi nấm và bào tử đính., phân tách trên gel polyacrylamide bằng điện di, nhuộm màu để kiểm tra sản phẩm protein phân tách. Kỹ thuật này được áp dụng trên nhiều giống nấm bệnh có nguồn gốc từ đất (soilborne). 2.3.4. Isozymes Trong phân tách Isozyme, nhiều enzyme có thể không kiểm tra được trong các mẫu đã định. Các enzyme cắt này được xác định có thể ở dạng đơn hình trong khi có rất ít sự khác nhau giữa các loài, dưới loài hoặc chúng có độ đa hình rất cao. Các enzyme sau khi điện di trên tinh bột, gel polyacrylamide, hoặc màng cellulose acetate cơ chất enzyme được cho vào cùng với thuốc nhuộm chlorogenic. Phản ứng giữa enzyme với cơ chất và với thuốc nhuộm, phức tạp của phản ứng màu phản ánh sự hiện diện của enzyme. Sự khác nhau nhỏ giữa trong cấu hình acid amino có thể thay đổi trong cấu trúc hay vật mang của protein. Sự xác định và tính biến động của những enzyme này phụ thuộc nhiều yếu tố khác nhaubao gồm những điều kiện trên sinh vật như tốc độ tăng trưởng, độ pH, dòng điện, hệ thống đệm, tuổi, độ đậm của dung dịch nhuộm,và chuẩn bị mẫu. Gel cellulose acetate thường được sử dụng do nó hạn chế thấp nhất thời gian chuẩn bị so với điện di bằng gel polyacrylamide và tinh bột 2.3.5. Huyết thanh học và kit chẩn đoán Việc ứng dụng kháng thể trong việc kiểm tra và phát hiện nấm gây bệnh có nguồn gốc từ đất đã ra đời 5 - 10 năm trước. Nhiều phương pháp thường được sử dụng để sản xuất ra huyết thanh miễn dịch các loại bệnh cây do nấm gây ra mà không cần phải hiểu biết về mặt di truyền của nguyên liệu nấm bệnh (vách tế bào, bào tử, các protein hòa tan,…) đã tạo ra huyết thanh miễn dịch đa dòng đặc biệt. Vấn đề gặp phải 13 với kháng thể sử dụng là sự thiếu tính chuyên biệt và đặc hiệu trong hầu hết chất nền là mô cây hay đất. Kháng thể đơn dòng được chấp nhận như một dụng cụ chẩn đoán và phát hiện ở mức độ loài và dưới loài. Kháng thể đơn dòng có thể ở cấp độ giống, loài, hay các chủng đặc biệt. Các kit chẩn đoán thường kiểm tra và phát hiện các mầm bệnh từ đất dựa vào kỹ thuật kháng thể đơn dòng hay đa dòng. Những kit này có thể chứng minh rằng sự cần thiết của các chẩn đoán nhanh và chính xác. Những phát hiện nhanh thường cần thiết khi điều đó cần được cung cấp lời giải thích cho việc sử dụng các loại thuốc diệt nấm. Các kit chuẩn đoán thông thường nhằm cung cấp hai mục đích: chẩn đoán và nghiên cứu. Câu hỏi được đặt ra là các kit này có hiệu quả như thế nào khi quản lí bệnh. 2.3.6. Phân tích đa dạng độ dài các đoạn đoạn đƣợc phân cắt (RFLP) Phân tích RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) được dùng để xác định mối quan hệ phân loài của nấm. Phản ứng RFLP bao gồm nhiều bước sau: ly trích và tinh sạch DNA từ cơ quan hay genome; sử dụng enzyme cắt để phân cắt các đoạn DNA; điện di phân tích các đoạn DNA trên gel agarose; thu hình các đoạn DNA bằng cách nhuộm với ethidium bromide hoặc chuyển các đoạn DNA sang màng nitrocellulose hay màng nylon (kỹ thuật Southern blot) và đánh dấu với các probe có đánh dấu hay không đánh dấu phóng xạ lai với các các đoạn DNA. Blot sau khi lai được chuyển qua phim rửa hay giấy nhạy cảm với hóa chất. Sự khác nhau về kích cở các đoạn đa dạng là sự đa dạng di truyền (sự mất đoạn cắt, lặp lại đoạn, hay thêm đoạn DNA). Giá cả để thực hiện phản ứng RFLP cao nhưng giá cả sẽ giảm, và ứng dụng của phản ứng này tăng khi thay thế các probe đánh dấu phóng xạ thành các probe không đánh dấu. Phân tách RFLP thường dùng để nghiên cứu đa dạng di truyền trên DNA ribosome (rDNA) và DNA ti thể ở mức độ loài hay dưới loài . 2.3.7. Kỹ thuật dùng probe acid nucleic, DNA fingerprinting và Molecular karyotyping Sử dụng DNA như probe phân tử để xác định các loài nấm bệnh. Một đoạn DNA giới hạn được clone dòng và được dùng để xác định ở cấp độ loài nấm P.parasitica ( Goodwin và cộng sự, 1989). Hiệu quả của các probe acid nucleic khi 14 xác định các loài nấm phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau bao gồm cả mức độ đa dạng di truyền hiện diện trong các loài đã biết. Một ứng dụng khác của các probe acid nuceic gần đây là việc sử dụng các probe DNA minisatellite trong kỹ thuật DNA fingerprinting (Jeffreys và cộng sự, 1985). Các probe rất nhỏ được sử dụng trên nhiều sinh vật để xác định cá thể và theo dỏi phả hệ, chúng chỉ hiện diện để xác định độ đa dạng di truyền trên nấm. Minisatellite probe, probe oligonucleotide có thể được ứng dụng cho cấp độ loài, dưới loài và cả những dòng clone.( Rodriguez, 1989). 2.3.8. Sự lai DNA-DNA Sự lai DNA-DNA (DNA-DNA hydridization) được ứng dụng ở một mức độ giới hạn trong quá trình phân loại nấm bệnh trên. Qui trình thực hiện gồm: tách DNA của dòng phân lập; trộn với DNA từ chủng khác hay loài khác nhằm mục đích cho chúng sáp nhập lại; mức độ sáp nhập của chúng phụ thuộc vào sự tương đồng hay giống nhau giữa các phân tử DNA khác nhau. Kỹ thuật này không được sử dụng rộng rãi bởi vì giá cả của bộ dụng cụ thực hiện thí nghiệm cao, tuy nhiên tỉ lệ tương đồng giữa các loài thường rất đáng kể. 2.3.9. Kỹ thuật PCR và RAPD Phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction) là kỹ thuật nhân đoạn DNA dựa vào các base trình tự. Kỹ thuật này thường dùng để xác đinh mối quan hệ phát sinh loài giữa các loài và là kỹ thuật ứng dụng rộng rãi trong nghiên cứu sinh học (Amheim và cộng sự, 1990; White và cộng sự, 1990). PCR bao gồm enzyme khuếch đại một trình tự DNA đặc hiệu. Vùng thường được sử dụng để khuếch đại là vùng lập lại không mã hóa ITS ( Internal Transcribed Spacer) trong RNA ribosome, vùng này có giá trị thay đổi giữa các loài nấm và do đó có thể xác định mối quan hệ giữa các loài (Bruns và cộng sự, 1992). Kỹ thuật này rất có giá trị bởi tính tiến hóa ở mức độ cao của các loài và các chủng có thể được so sánh. PCR rất có giá trị trong việc xác định ở mức độ loài và chủng. Nó phù hợp để xác đinh các nhóm, các chủng đặc biệt. Gần đây, kỹ thuật khuếch đại các đoạn đa hình RAPD (Randomly Amplified Polymorphic DNA) được phát triển (William và cộng sự, 1990). RAPD nhằm sử dụng những cặp mồi khoảng 10 base để nhận ra nhiều đoạn DNA khác nhau trên toàn DNA sinh vật (đoạn lớn nhất có kích thước khoảng 1kb). Sự xuất hiện, vắng mặt và sự khác nhau về các band DNA cho phép xác định sự đa dạng giữa chúng. 15 2.4. Một số công trình nghiên cứu định danh nấm Phytophthora 2.4.1. Một số công trình nghiên cứu ngoài nƣớc: Sử dụng cặp mồi ITS để khuếch đại vùng ITS trên nấm Phytopthora. Sản phẩm PCR đem đi phân tích mối quan hệ di truyền với hơn 35 loài bằng ba enzyme cắt AluI, TaqI, MspI hoặc được giải trình tự để so sánh với 17 loài nấm Phytophthora khác bằng cách dùng phần mềm so sánh trình tự PHYLIP [7]. P. palmivora được phân lập từ cây cacao và cây dừa. P. capsici được phân lập từ ca cao, tiêu đen và tiêu chuông đã được chọn lọc từ nhiều địa phương khác nhau của Ấn Độ. Tác giả sử dụng cập mồi ITS1, ITS2 để khuếch đại vùng ITS của gen rDNA bằng kỹ thuật PCR và phân tích AFLP. Dòng phân lập của P. capsici (P575) từ cacao ở Mehico cũng bao gồm trong sự so sánh đa dạng di truyền ở trên. Phân tích AFLP của P. palmivora phân lập từ cây ca cao và cây dừa cũng giống như các mẫu khác. Nhưng các phân tích AFLP của loài P. capsici cho thấy sự khác nhau một cách hiển nhiên với loài P. palmivora. Do đó, vùng ITS được dùng như marker phân loại để xác định giống Phytophthora và AFLP được dùng cho việc ước định những thay đổi đặc biệt bên trong [14]. Sử dụng kết hợp 2 phương pháp: quan sát hình thái và sinh học phân tử. Phương pháp sinh học phân tử dùng cho những nghiên cứu chi tiết, sử dụng PCR- RFLP phân tích đoạn gen ITS1-5,8S-ITS2 trên vùng ITS thuộc DNA ribosome của 180 dòng phân lập. Phân tích trình tự trên ITS2 cho 50 dòng phân lập được dùng cho điều tra mối quan hệ giữa sự thay đổi di truyền và sự phát sinh loài giữa các loài phân lập. Dòng phân lập được chia làm 12 nhóm dựa theo kiểu phát triển của chúng trên môi trường CMA (Corn Meal Agar). Phân cắt bằng 3 enzyme cắt nhằm tìm ra sự phát sinh loài trong vùng ITS2 [11]. Nghiên cứu trình tự lặp lại ITS (internal transcribed spacer) của gen rDNA và đa dạng độ dài các đoạn khuếch đại (AFLP) DNA tổng của loài mới (mầm bệnh Phytophthora trên cây dương đỏ ở Châu Âu). Kỹ thuật lai (heteroploid-interspecific hydrid) trên P.cambivora, một số loài khác và một loài chưa rõ giống như P. fragariae. Phương pháp này đánh dấu tính biến đổi di truyền đang tăng, sự thay đổi hình thái một cách khác thường, sự tái tổ hợp trên vùng ITS [15]. Kỹ thuật PCR dùng để xác định Phytophthora capsici trên cây tiêu. Ba mồi PCR ( CAPFW, CAPRV1 và CAPRV2) được thiết kế đặc biệt dựa trên trình tự của 16 Hình 2.3. Vùng trình tự ITS trong DNA ribosome (A.Drenth và J.A.G Irwin,2001) vùng ITS của chúng. Cặp mồi CAPFW/CAPRV1 khuếch đại sản phẩm 452bp trong khi cặp mồi CAPFW/CAPRV2 khuếch đại đoạn 595bp. Cặp mồi CAPFW/CAPRV2 trong PCR dùng để phát hiện đoạn gel của P.capsici trong cây được chủng bệnh. Kết quả xuất hiện sau 8 giờ chủng bệnh trên mẫu gốc bị ảnh hưởng trong khi cây vẫn chưa thấy sự biểu hiện bệnh của cây [8]. 2.4.2. Nghiên cứu trong nƣớc Sử dụng hai kỹ thuật mô tả hình thái và PCR định danh được một số loài nấm như Phytophthora capsici gây bệnh trên hồ tiêu ở Bà Rịa Vũng Tàu, Phytophthora parasitica gây bệnh trên sầu riêng Đồng Nai, Phytophthora palmivora gây bệnh trên sầu riêng và lan Dendrobium ở Đắc Lắc và Tp. HCM [1]. 2.5. Sơ lƣợc về trình tự ITS và danh mục các loài Phytophthora ở Việt Nam 2.6.1. Sơ lƣợc về trình tự ITS (Internal Transcribed Spacer) Sự lựa chọn trình tự DNA dùng cho việc phát hiện đặc biệt giống Phytophthora và các loài thuộc giống này giữ vai trò quan trọng trong quá trình tìm ra những trình tự có tính ổn định cao. Các trình tự đó phải thể hiện sự khác biệt đặc biệt sao cho ta có thể phân biệt được dòng phân lập ở cấp độ loài hay giống của chúng. Gen mã hóa vùng ribosomal RNA trên sinh vật Eukaryote đảm bảo được chất lượng này. Chúng là một phần thiết yếu của sự sống tế bào và các vùng biểu hiện mà vùng này có sự khác biệt về sự thay đổi trình tự giữa các loài. Mặt khác, độ nhạy của các kiểm tra chẩn đoán tăng khi gen mục tiêu tồn tại ở một số lượng lớn trong genome. Trong hầu hết các sinh vật Eukaryote gen ribosomal RNA (rDNA) gồm một họ đa gen, trong đó các bản sao được sắp xếp lặp lại liên tiếp nhau. Mỗi đoạn lặp lại gồm một đơn vị phiên mã 17 đơn bao gồm một cấu trúc tiểu đơn vị nhỏ 5,8S và một cấu trúc tiểu đơn vị lớn (chia làm hai phần ) là ITS1, ITS2 (A. Drenth và J.A.G. Irwin, 2001) Primer ITS4 và ITS5 là các Universal primer được White và cộng sự (1990) thiết kế để khuếch đại đoạn gen nằm trong vùng ITS. Đoạn gen của giống Phytophthora có kích thước 900bp. Vùng ITS cũng có một số ứng dụng như: tính toán các đột biến điểm trong quá trình hình thành loài, đo lường sự giống nhau bên trong trình tự DNA, dùng các phần mềm chuyên dụng tạo ra cây tiến hóa loài không chỉ bao gồm các loài giống nhau mà còn phân biệt sự khác nhau giữa các loài; mô tả vùng ITS bằng các enzyme cắt chuyên dụng như: TaqI, AluI, MspI. 2.6.2. Danh mục các loài Phytophthora đƣợc tìm thấy ở Việt Nam Bảng 2.2. Danh mục các loài nấm Phytophthora đƣợc tìm thấy ở Việt Nam (A. Drenth và I. Guest, 2004) Tên loài Kí chủ Bệnh Năm Tài liệu tham khảo P.botryosa Cao su Rụng lá 1961 Đặng Vũ Thị Thanh Vệt đen và Hà Minh Trung (1999) P.cactorum Mận Thối trái 1996 Đặng Vũ Thị Thanh và Hà Minh Trung (1999) P.capsici Tiêu đen Thối rễ 1998 NguyễnViết Trọng (2002) P.cinnamomi Dứa Thối nõn 2001 Đặng Vũ Thị Thanh và cộng sự (2004) P.citrophthora Họ cam chanh Thối trái Roger (1951) Loét thân P.colocasiae Khoai mỡ Tàn lụi lá 1951 Roger (1951) P. infestans Khoai tây Tàn lụi lá 1951 Roger (1951) Cà chua Tàn lụi lá Cà trứng Tàn lụi lá P.nicotianae Dứa Thối nõn 2001 Đặng Vũ Thị Thanh và cộng sự (2004) Thuốc lá Thân đen 1967 NIPP (1975) Họ cam chanh Loét thân 2002 Đặng Vũ Thị Thanh và cộng sự (2004) P.palmivora Sầu riêng Tàn lụi lá 2000 Đặng Vũ Thị Thanh 18 và cộng sự (2004) Dừa Loét thân 2002 Đặng Vũ Thị Thanh và cộng sự (2004) Cacao Thối trái 2002 Đặng Vũ Thị Thanh và cộng sự (2004) Caosu Tàn lụi lá 1965 Đặng Vũ Thị Thanh Vệt đen và Hà Minh Trung (1999) Rụng lá P.durian Sầu riêng Loét 2002 Đặng Vũ Thị Thanh và cộng sự (2004) Phytophthora sp Cao su Loét thân 1965 Đặng Vũ Thị Thanh và Hà Minh Trung (1999) Phytophthora sp Ziziphus Thối trái 1997 Đặng Vũ Thị Thanh và Hà Minh Trung (1999) Phytophthora sp Nhãn Thối trái 1995 Đặng Vũ Thị Thanh Tàn lụi lá và Hà Minh Trung (1999) 19 Phần 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện 3.1.1 Thời gian Đề tài được thực hiện từ ngày 06/02/2006 cho đến ngày 15/08/2006 3.1.2 Địa điểm thực hiện: - Quá trình tăng sinh, nhân sinh khối được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Bệnh Cây – Bộ Môn Bảo Vệ Thực Vật – Trường Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. - Quá trình chiết tách DNA và phản ứng PCR được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Công Nghệ Sinh Học Thực Vật – Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh – Trường Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. 3.2 Vật liệu và hóa chất: Chúng tôi tiến hành tăng sinh nhân sinh khối 2 mẫu nấm Phytophthora phân lập trên sầu riêng Đồng Nai, tiêu Bà Rịa và 2 mẫu nấm Phytophthora trên địa lan Đà Lạt của kỹ sư Trịnh Thị Phương Vy. Các mẫu nấm này đã được định danh bằng kỹ thuật quan sát hình thái. 3.2.1 Phục hồi và nhân sinh khối a. Vật liệu và hóa chất Đường Glucose Agar Khoai tây Cồn 70% và Cồn 96% Cà rốt CaCO3 3.2.2 Ly trích DNA a. Vật liệu và dụng cụ:  Máy vortex  Máy ủ nhiệt độ 600C  Máy li tâm Siqma  Ống nghiệm(eppendorf) 1,5 ml 20  Pipetman và đầu tip các loại ( hãng Nichikyo Le) b. Hóa chất: ( Merk)  Lysis buffer( 50 mM Tris HCl; 50mM EDTA; 3% SDS; 1% -mercaptoethanol) pH 8,0.  Nitơ lỏng  Hỗn hợp Phenol: Chloroform: Isoamyl alcohol (25: 24: 1).  Isopropanol.  Ethanol 70%.  Dung dịch TE ( 10mM Tris HCl; 1mM EDTA; pH 8,0). 3.2.3 Kỹ thuật điện di a. Vật liệu và hóa chất  Dung dịch TAE( Tris HCl; Na2EDTA 0,5 M; Glacial acetic acid).  Agarose.  Thuốc nhuộm gel Ethidium bromide 1%. 3.2.4 Kỹ thuật PCR a. Vật liệu  Mẫu nấm ly trích. b. Hóa chất ( Biorad)  dNTPs(dATP; dTTP; dGTP; dCTP), MgCl2, 10X PCR buffer.  Taq DNA polymerase( BioRad).  Ethidium bromide; dung dịch đệm TAE 0,5%. 3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 3.3.1 Tăng sinh và nhân sinh khối Mẫu nấm đã thu thập trên nhiều mẫu khác nhau được tăng sinh trên môi trường PGA. Thành phần trong 1lít môi trường tăng sinh PGA ( Potato – Glucose Agar) - Khoai tây 200gram - Glucose 20gram - Agar 15gram - Nước cất vừa đủ 1000ml Môi trường PGA được hấp tiệt trùng ở 1210C/ 1 atm / 20 phút, được đổ ra đĩa petri. 21 Tiến hành cấy các dòng nấm Phytophthora từ các mẫu khác nhau vào các đĩa môi trường PGA. Sau đó, các đĩa môi trường này được ủ ở nhiệt độ 250C – 280C. Sau khoảng 3 – 4 ngày, khi tản nấm đã hình thành và có đường kính khá lớn ( 4 – 5 mm) ta tiến hành cấy mẫu nấm vào môi trường nhân sinh khối lỏng ( môi trường cà rốt ). Thành phần có trong 1l môi trường cà rốt - Cà rốt 600gram - CaCO3 15gram - Nước cất vừa đủ 1000ml Cách thực hiện: Cà rốt gọt vỏ, rửa sạch, bào mỏng xay nhuyễn cùng với 700 ml nước cất; hấp tiệt trùng 1000C / 20 phút. Để nguội lọc qua rây và 4 lớp vải lọc, lấy dịch trong. Thêm 15gram CaCO3 vào dung dịch khuấy đều, sau đó lắng 20 phút. Gạn lấy dịch lỏng, bỏ CaCO3. Chia đều dung dịch vào bình tam giác hay chai nước biển với thể tích khoảng 100 ml/chai. Hấp tiệt trùng 1210C/ 1atm / 20 phút. Cách cấy nấm sang môi trường nhân sinh khối - Sử dụng đĩa petri mang các khuẩn lạc nấm có đường kính 4 – 5 mm. - Cắt nhỏ ( băm nhuyễn ) rìa mép tản nấm. - Cấy mẫu nấm đã được băm nhuyễn sang bình chứa môi trường cà rốt. Sau khi cấy, những bình nhân sinh khối phải được ủ tối từ 7 đến 10 ngày trong điều kiện nhiệt độ phòng, tĩnh lặng. Quá trình thu sinh khối: mẫu nấm sau khi nhân sinh khối sẽ được lọc qua vải lọc và làm cho khô kiệt bằng giấy thấm. Bảo quản mẫu ở -700C. 3.3.2 Ly trích DNA Mẫu nấm trước khi chiết tách DNA phải qua quá trình nghiền mẫu trong Nitơ lỏng và được cho vào các eppendorf. Qui trình ly trích DNA tổng số: dựa trên qui trình ly trích được của Lee và Taylor (1990) có cải tiến thêm một số bước. Các hóa chất cần pha để thực hiện qui trình ly trích - Lysis buffer(50mM Tris-HCl; 50mM EDTA; 3% SDS; 1% -mercaptoethanol). - Hỗn hợp Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25:24:1). - TE(10mM Tris-HCl; 1mM EDTA; pH 8,0). Có hai qui trình ly trích DNA được sử dụng 22 3.3.2.1 Qui trình 1 - Mỗi eppendorf ly trích chứa khoảng một phần ba eppendorf nấm. - Cho vào mỗi eppendorf 750 l Lysis buffer. - Ủ ở nhiệt độ 650C trong 1 giờ. - Cho thêm 500 l hỗn hợp Phenol /Chloroform/ Isoamyl alcohol (25:24:1), lắc nhẹ dung dịch có màu trắng đục. - Ly tâm 13000 rpm/ 15 phút/ 280C, hút pha trên cho vào một eppendorf mới. - Cho isopropanol vào theo tỉ lệ 2:1, dung dịch xuất hiện kết tủa. - Ly tâm 13000 rpm/ 5 phút/280C, thu nhận DNA cô đặc có màu trắng đục ở đáy eppendorf. - Rửa mẫu nhiều lần bằng Ethanol 70%. - Hong khô mẫu. - Hòa tan mẫu với lượng TE 0,5X hay nước cất hai lần vô trùng. 3.3.2.2 Qui trình 2 - Sử dụng mỗi eppendorf chứa khoãng một phần ba eppendorf mẫu. - Cho vào mỗi eppendorf 750 l Lysis Buffer. - Ủ ở 650C trong một giờ. - Cho thêm 500 l hỗn hợp Phenol /Chloroform/ Isoamyl alcohol (25:24:1), lắc nhẹ dung dịch có màu trắng đục. - Ly tâm 13000 rpm/5 phút/ 280C, hút pha trên cho vào một eppendorf mới. - Cho 2 l RNase vào eppendorf trên, ủ ở 370C trong một giờ. - Hút khoảng 400 l Chloroform/ Isoamyl alcohol cho vào, lắc nhẹ đều. - Ly tâm 13000 rpm/ 5 phút/ 280C, hút pha trên vào một eppendorf mới. - Thêm Isopropanol theo tỉ lệ 2:1, dung dịch xuất hiện kết tủa. - Ly tâm 13000 rpm/ 5 phút/ 280C, thu nhận DNA cô đặc có màu trắng đục ở đáy eppendorf. - Rửa mẫu bằng Ethanol 70%. - Hong khô mẫu. - Pha loãng mẫu với TE 0,5X hay nước cất hai lần vô trùng. Mẫu ly trích được bảo quản ở 40C. Kiểm tra kết quả ly trích bằng kỹ thuật chạy điện di trên gel agarose 0,8%. 23 Thành phần trong bản gel agarose 0,8% - Dung dịch TAE 0,5X 12,5ml - Agarose 0,1gram Sản phẩm ly trích DNA được chạy điện di trong dung dịch TAE và chạy 100V/ 20 phút/ 250mA. Sau đó, miếng gel được nhuộm Ethidium Bromide trước khi đọc kết quả trên máy Geldoc. DNA tổng số thu được phải được pha loãng ở nồng độ thích hợp để tiến hành phản ứng PCR. Nồng độ DNA chạy phản ứng PCR nằm trong một khoảng khá rộng từ 3ng đến 100ng tùy thuộc mẫu DNA. 3.3.3 Kỹ thuật PCR Hóa chất cần pha cho phản ứng PCR.Chủ yếu có 3 loại - Pha dNTPs có nồng độ là 2,5mM. - Pha loãng hai primer ITS4, ITS5 ra nồng độ 100pmol/ l. - Pha loãng mẫu DNA sau cho lượng DNA < 100ngram/ l. - Nhiệt độ bắt cặp Tm = 2*(A+T) + 4*(G+C). - Trình tự cặp primer chạy PCR lần lượt là: ITS4 ( 5’ TCCTCCGCTTATTGATATGC 3’) ITS5 ( 5’ GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG 3’) Bảng 3.1.Thành phần cho phản ứng PCR thể tích 25 l Thành phần phản ứng Nồng độ đầu Nồng độ cuối Thể tích PCR buffer 10X 1X 2,5 l MgCl2 50mM 1,5mM 0,75 l dNTPs 2,5mM 0,2mM 2 l Primer ITS4 100pmol/ l 10pmol/ l 0,1 l Primer ITS5 100pmol/ l 10pmol/ l 0,1 l Taq DNA polymerase 5UI 0,5UI 0,1 l DNA khuôn mẫu <100ngram 1 l 24 Nước cất vừa đủ 25 l Bảng 3.2.Thành phần cho phản ứng PCR thể tích 50 l Thành phần phản ứng Nồng độ đầu Nồng độ cuối Thể tích PCR buffer 10X 1X 5 l MgCl2 50mM 1,5mM 2 l dNTPs 2,5mM 0,2mM 2 l Primer ITS4 100pmol/ l 10pmol/ l 2 l Primer ITS5 100pmol/ l 10pmol/ l 2 l Taq DNA polymerase 5UI 0,5UI 0,2 l DNA khuôn mẫu <100ngram 1 l Nước cất vừa đủ 50 l Bảng 3.3.Chu kì nhiệt cho phản ứng PCR Các bƣớc của phản ứng Nhiệt độ Thời gian Giai đoạn khởi động Giai đoạn chạy phản ứng (30 chu kỳ) Tách DNA khuôn Bắt cặp Kéo dài Giai đoạn kết thúc 94 o C 94 o C 56 o C 72 o C 72 o C 3 phút 1 phút 45 giây 1 phút 5 phút Kiểm tra sản phẩm PCR : Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng kỹ thuật điện di trên gel agarose nồng độ 1% - 1,5%. Thành phần gel 1% chạy điện di: Dung dịch TAE 0,5X 12,5ml Agarose 1,25g 25 Điều kiện chạy điện di kiểm tra sản phẩm PCR 50V/40 phút/250mA. Sau đó, ta nhuộm gel và chụp hình nhuộm bằng máy Geldoc. 26 3.3.4 Kỹ thuật tinh sạch Kỹ thuật tinh sạch đọc trình tự : có hai kỹ thuật tinh sạch chính 3.3.4.1 Kỹ thuật tinh sạch bằng thao tác tay: - Lấy eppendorf chứa khoảng 20 l mẫu PCR. - Thêm 180 l TE, trộn đều với mẫu. - Cho vào 200 l Chloroform/ Isoamyl alcohol, trộn với lương mẫu trên. - Ly tâm 13500 rpm/ 5 phút/ 280C, hút dịch nổi cho vào một eppendorf mới. - Thêm 100 l Ethanol 70%, ủ ở -700C trong 30 phút. - Ly tâm 13500 rpm/ 5 phút, bỏ phần dịch nổi ở trên. - Rửa lại bằng Ethanol 70% . - Ly tâm 13500 rpm/ 2 phút. - Làm khô mẫu. - Hòa tan mẫu với TE 0,5X. 3.3.4.2 Kỹ thuật tinh sạch bằng cột GMX - Sản phẩm PCR được chạy điện di trên gel agarose đặc biêt 0,8% ( có thể tan ở nhiệt độ thấp) với thể tích từ 15 l cho đến 20 l. Miếng gel chạy điện di được nhuộm Ethidium bromide trong thời gian ngắn (1-2 phút) và được cắt band trên máy chiếu UV. Sản phẩm cắt cho vào một eppendorf mới. - Cân lượng gel chứa band PCR. - Cho vào eppendorf dung dịch capture buffer tỉ lệ 1:2 (10 mg gel ≈ 20 l capture buffer), ủ hỗn hợp trên ở 600C trong 15 phút. - Ly tâm 3000 rpm/ 30 giây. - Hút mẫu cho vào cột GFX, để mẫu ổn định trong 1 phút. - Ly tâm 9000 rpm/ 30 giây. - Thêm dung dịch wash buffer với lượng tương đương capture buffer cho vào. - Ly tâm 9000 rpm/ 30 giây. - Đặt cột vào eppendorf mới. - Hút 15 l elution buffer nhỏ vào cột GFX, ủ khoảng 3 phút ở nhiệt độ phòng. - Ly tâm 9500 rpm/ 2 phút, lấy cột GFX ra. - Giữ mẫu tinh sạch ở 40C. Mẫu PCR tinh sạch được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1%. 27 Trình tự được giải trực tiếp bằng máy giải trình tự ABI TRISM 3100. 3.3.5. Xử lý kết quả giải trình tự: Ta sử dụng một số phần mềm như sau: - Sử dụng phần mềm Chromas145-95 để xử lý trình tự - Phần mềm BLAST để so sánh trình tự với các loài Phytophthora đã được giải trình tự trên ngân hàng gen.( - Phần mềm ClustalX để so sánh độ tương đồng của trình tự và vẽ cây sinh loài bằng phần mềm Treeview. 28 Phần 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Quá trình tăng sinh, nhân sinh khối Chúng tôi áp dụng qui trình tăng sinh nhân sinh khối nấm Phytophthora của kỹ sư Trịnh Thị Phương Vy (2005) để nhân sinh khối 4 mẫu nấm trên và rút ra một số nhận xét: - Tất cả 4 mẫu nấm đều phát triển tốt trong điều kiện ánh sáng tối. - Nhiệt độ thích hợp cho sự tăng sinh mẫu nấm trên sầu riêng Đồng Nai và trên tiêu Bà Rịa là nhiệt độ phòng trong khi nhiệt độ thích hợp trên 2 mẫu địa lan là 200C – 22 0 C. Chúng tôi kí hiệu cho 4 mẫu nấm như sau: Kí hiệu Cây kí chủ Địa điểm SRDN Sầu riêng Đồng Nai TBR Tiêu Bà Rịa-Vũng Tàu DL1 Địa lan Lâm Đồng DL2 Địa lan Lâm Đồng. 4.2 Quá trình ly trích Kỹ thuật chiết tách DNA tổng số được xem là một kỹ thuật đơn giản, dễ thực hiện. Nhưng qui trình tách chiết DNA là một trong những qui trình khởi đầu cho các kỹ thuật sinh học phân tử quan trọng. Do đó nó đóng vai trò thu nhận sản phẩm DNA cho những phản ứng tiếp theo sau bao gồm kỹ thuật PCR và kỹ thuật giải trình tự. Chúng tôi đã tham khảo qui trình ly trích của Lee và Taylor (1990) sau đó cải tiến thêm một số bước cho phù hợp với mẫu nấm Phytophthora. Trong bước ly trích này chúng tôi áp dụng 2 qui trình ly trích khác nhau đã được đề cập ở trên. Kết quả điện di 100 V/ 15 phút/ 400 mA sản phẩm trên gel agarose 0,8% chúng tôi thu nhận được ở hai qui trình ly trích có sự khác nhau khá rõ: 29 DNA tổng số Hình 4.2. Sản phẩm của qui trình ly trích 2 Qui trình ly trích 1 cho kết quả ly trích chưa đạt được hiệu quả. Chúng tôi không thu được DNA. Phần tạp còn quá nhiều Qui trình ly trích 2 đạt được nhiều hiệu quả hơn. Sản phẩm DNA thu được ở dạng tinh sạch khá cao, loại bỏ được tạp nhiễm. Khi so sánh kết quả của hai qui trình ly trích này ta thấy qui trình ly trích 2 có thêm một số các hóa chất khác như: RNase và Chloroform/Isoamyl alcohol (24:1). Vai trò của Chloroform/Isoamyl alcohol (24:1) là hòa tan các protein thừa, chất cặn còn lại sau khi đã loại bỏ chúng bằng hỗn hợp Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25:24:1). RNase có vai trò loại bỏ RNA nằm trong lượng DNA thu được. Qui trình ly trích 2 (qui trình ly trích tinh sạch) loại bỏ hầu hết những phần tạp nhiễm nhưng vẫn không ảnh hưởng đến chất lượng DNA. Như vậy, chúng tôi đã chiết tách DNA thành công bằng qui trình ly trích 2. 4.3 Quá trình PCR Phản ứng PCR bao gồm nhiều thành phần khác nhau trong một chu trình nhiệt, và các thành phần này đều có ảnh hưởng đến kết quả PCR trong đó nồng độ và độ tinh sạch của DNA khuôn đóng vai trò quan trọng. Sản phẩm tách chiết được chúng tôi hoàn thiện ở quy trình ly trích 2 đã đủ độ tinh sạch cho phản ứng PCR. Nhưng nồng độ của nó cao hơn gấp nhiều lần so với nồng độ cần cho phản ứng PCR ( khoảng 3 – 100 ng/ l). DNA mẫu được pha loãng bằng TE 0,5X hoặc nước cất vô trùng. Thang nồng độ DNA chuẩn được sử dụng để định lượng DNA cho phản ứng PCR. DNA tổng số phần tạp Hình 4.1. Sản phẩm của qui trình ly trích 1 30 Sau khi hoàn thiện được quy trình phản ứng PCR đáng tin cậy cho mục đích khuếch đại vùng ITS chúng tôi tiến hành những phân tích đồng thời thực hiện phản ứng khuếch đại vùng ITS của dòng nấm Trichoderma làm đối chứng định danh nấm Phytopthora. Chạy điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 0,8% trong 75 V/45 phút/ 250 mA. Sản phẩm DNA khuếch đại vùng lặp lại ITS có kích thước khoảng 900bp. Trong bốn mẫu nấm phân tích chỉ có ba mẫu cho kết quả band 900bp. Trong cùng điều kiện đó, phản ứng khuếch đại vùng ITS của nấm Trichoderma cho band có kích thước khoảng 650 – 700bp. Kết quả này khá phù hợp với những nghiên cứu định danh nấm Phytopthora trên vùng ITS (Cooke và Duncan, 1997; Trịnh Thị Phương Vy, 2005). Tuy nhiên, kết quả PCR mẫu DL2 trái với kết quả định danh bằng kỹ thuật quan sát hình thái. Kết quả định danh hình thái của kỹ sư Trịnh Thị Phương Vy khẳng định mẫu DL2 thuộc giống Phytophthora nhưng kết quả PCR trên vùng ITS cho band có kích thước khoảng 800bp. Hình 4.3. Thang nồng độ DNA chuẩn ( Nguyễn Văn Lẫm và Lê Minh Kha, 2005) 31 Một số lý do giải thích cho kết quả trên bao gồm: Sự sai khác về vùng bắt cặp của primer trên gen do ITS là vùng có trình tự lặp lại cho nên primer có thể bắt cặp sai vị trí. Quá trình tăng sinh, nhân sinh khối đã bị tạp nhiễm một giống nấm khác và sản phẩm thu sinh khối dùng cho phản ứng PCR thuộc giống Phytophthora. Phản ứng PCR chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố như nồng độ DNA chạy phản ứng, nhiệt độ bắt cặp, nồng độ đoạn mồi bắt cặp. Do giới hạn của thời gian thực hiện đề tài nên chúng tôi chỉ tiến hành kiểm tra kết quả PCR ở yếu tố nồng độ DNA mẫu trên hai mẫu nấm DL1 và DL2. Để hạn chế khả năng tạp nhiễm chúng tôi đã tiến hành tăng sinh nhân sinh khối và ly trích lại hai mẫu này. DNA mẫu được pha loãng ở hai nồng độ 30ng và 10ng. phản ứng PCR lặp lại với cùng điều kiện phản ứng trên hai mẫu ở hai nồng độ này. Kết quả điện di trên gel agarose 1% cho ta thấy rằng, sự phụ thuộc của sản phẩm PCR vào nồng độ DNA mẫu. 900bp Hình 4.4. Kết qủa phản ứng PCR (1) TBR; (2) SRDN; (3) ladder; (4) DL1 ; (5) DL2; (6) mẫu Trichoderma làm đối chứng 32 Ở hai mẫu một và hai là sản phẩm PCR của hai mẫu Phytophthora trên địa lan với nồng độ 30ng. Trong khi hai mẫu còn lại là kết quả thu được khi chạy PCR hai mẫu trên với nồng độ 10ng. Chúng tôi tạm thời không thể giải thích rõ ràng kết quả trên tuy nhiên nó cho ta thấy nồng độ DNA mẫu cũng quyết định kết quả PCR.. Ở nồng độ 30ng mẫu chỉ cho ra sản phẩm là một band DNA duy nhất chứng tỏ mẫu DNA ly trích là mẫu tinh sạch không tạp nhiểm với DNA của bất kì một loài nào khác. Sản phẩm PCR của hai mẫu Phytophthora trên địa lan ở nồng độ 10ng cho hai band rõ ràng, độ sáng như nhau. Kích thước hai band này chênh lệch nhau khoảng 100bp. Chúng tôi có thể giải thích kết quả trên như sau: thứ nhất nguyên nhân này có thể là do hai mẫu nấm này đã bị tạp nhiễm trong quá trình pha loãng ở nồng độ 10 ng cho nên sản phẩm PCR ở nồng độ 10 ng cho ra hai band khác; thứ hai do quá trình pha loãng không đáng tin cậy. Sản phẩm pha loãng ở 10 ng có nồng độ cao hơn sản phẩm pha loãng ở 30 ng và kích thước đoạn trình tự này có vùng lập lại cho nên trong điều kiện nhất định cặp mồi ITS4 – ITS5 có thể bắt cặp ở nhiều vị trí khác nhau và cho ra sản phẩm PCR có đến hai hay ba band khác nhau trên cùng một vùng trình tự, các band này có độ sáng như nhau. 900bp Hình 4.5. Sản phẩm PCR lần thứ hai (1) và (3) PCR mẫu DL1 ở nồng độ 30ng và 10ng (2) và (4) PCR mẫu DL2 ở nồng độ 30ng và 10ng 33 Như vậy, kết quả chạy PCR ở trên không thể định danh được hai mẫu Phytophthora. Để định danh được hai mẫu nấm trên, chúng tôi đã tiến hành tinh sạch sản phẩm PCR nhằm mục đích giải trình tự chúng một cách chính xác hơn. 4.4 Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR Tinh sạch sản phẩm PCR dùng để giải trình tự cũng nhằm mục đích như tinh sạch mẫu DNA dùng cho phản ứng PCR. Cả hai nguyên tắc tinh sạch này là như nhau nhưng với qui trình tinh sạch để giải trình tự đòi hỏi phải được thực hiện nghiêm ngặt hơn. Bởi vì qui trình này phải đảm bảo độ tinh sạch của sản phẩm PCR là tối ưu nhất đủ để thực hiện phương pháp giải trình tự bằng máy giải trình tự trực tiếp. Qui trình tinh sạch được chúng tôi đề nghị thực hiện theo hai phương pháp khác nhau: - Phƣơng pháp tinh sạch bằng thao tác tay: phương pháp này thực hiện khá đơn giản, ta có thể sử dụng các hoá chất dùng cho tinh sạch mẫu DNA ly trích để tinh sạch phẩm PCR với mục đích đọc trình tự. Vấn đề đòi hỏi của phương pháp này là thao tác thực hiện phải chính xác. Do thao tác thực hiện trong quá trình tinh sạch còn kém nên. Chúng tôi đã không thu được sản phẩm tinh sạch từ phương pháp này. Nguyên nhân chính có thể là do công đoạn tủa DNA và rửa DNA bằng ethanol không đạt hiệu quả làm mất đi sản phẩm khuếch đại. - Phƣơng pháp tinh sạch bằng cột GFX: Đây là phương pháp tinh sạch bằng kit; thao tác thực hiện đơn giản, nhanh và cho sản phẩm tinh sạch với nồng độ cao. DNA của hai mẫu nấm Phytophthora trên địa lan trước khi được tinh sạch bằng cột phải được chạy điện di và thông qua công đoạn cắt gel để đảm bảo độ tinh sạch cho sản phẩm. Tuy nhiên, ta cũng nên lưu ý một số điểm sau: công đoạn cắt gel đòi hỏi phải chính xác cắt dúng vị trí band DNA trên gel; công đoạn dùng hoá chất phải nhỏ chính xác giữa cột ,... 34 4.5 Xử lý kết quả giải trình tự Đoạn gen khuếch đại được giải trình tự bằng máy đọc trình tự ABI PRISM 3100. Chúng tôi đã thu được trình tự hai mẫu nấm này trên hai chiều ( xuôi và ngược) phản ứng của kỹ thuật giải trình tự. Độ dài mỗi đoạn trình tự trên hai chiều xuôi và ngược của phản ứng khoảng 840- 850 bp. Để đơn giản cho quá trình so sánh trình tự với các loài nấm khác, chúng tôi chỉ chọn trình tự hai mẫu DL1, DL2 trên mồi ITS5. 4.5.1. Trình tự mẫu DL1 TTANGAAGAGGNAGGACATTACCACACCTAAAAAACTTTCCACGTGAACCGTATCAACCC CTTTAGTTGGGGGTCTTGCTTGGCGTGCGGCTGCTGGCCTTTATTGGTTGGCTGGCTGCG TGCTGGGCGAGCCCTATCATGGCGATCGTTTGGACCTCGGTCTGAGCTAGTAGCTTTTGT TTTAAACCCATTCTTTAATACTGATTATACTGTGGGGACGAAAGTCTCTGCTTTTAACTA GATAGCAACTTTCAGCAGTGGATGTCTAGGCTCGCACATCGATGAAGAACGCTGCGAACT GCGATACGTAATGCGAATTGCAGGATTCAGTGAGTCATCGAAATTTTGAACGCATATTGC ACTTCCGGGTTAGTCCTGGGAGTATGCCTGTATCAGTGTCCGTACATCAAACTTGGCTTT CTTCCTTCCGTGTAGTCGGTGGAGGAGACGTCAGATGTGAAGTGTCTTGCGGTTGGCCTT CGGGTCGTCTGCGAGTCCTTTGAAATGTACTGAACTGTACTCTCTCTTTGCTCGAAAAGC GTGGTATTGTTGGTTGTGGAGACTGCCTGTGTGGCCAGTCGGCGACCGGTTTGTCTGCTA CGGCGTTTAATGGAGGAGTGTTCGATTCGCGGTATGGTTGGCTTCGGCTGAACAGACGCT TATTGGACGTTTTTCCTGCTGTGGCGTGATGGGCTGGTGAACCGTAGCTGTGTTTGGCTT GGTCTTTGAATCGGCTTTGCTGTTGCGAAGTAGAGCGGCGGCTTCGGCTGTCGAGGGGTC GATCCATTTTGGGAAGTTTGTGTGTACTTCGGTGCGCATCTCAATTGGACCTGATATCAG GCAAGATTAC 4.5.2. Trình tự mẫu DL2 GACTGCGGAAGACATTACCACACCTAAAAAACTTTCCACGTGAACCGTATCAACCCCTTT AGTTGGGGGTCTTGCTTGGCGTGCGGCTGCTGGCCTTTATTGGTTGGCTGGCTGCGTGCT GGGCGAGCCCTATCATGGCGATCGTTTGGACCTCGGTCTGAGCTAGTAGCTTTTGTTTTA Hình 4.6. Mẫu tinh sạch dùng cho phản ứng giải trình tự (1) Sản phẩm PCR của DL1; (2) Sản phẩm PCR của DL2 900bp 35 AACCCATTCTTTAATACTGATTATACTGTGGGGACGAAAGTCTCTGCTTTTAACTAGATA GCAACTTTCAGCAGTGGATGTCTAGGCTCGCACATCGATGAAGAACGCTGCGAACTGCGA TACGTAATGCGAATTGCAGGATTCAGTGAGTCATCGAAATTTTGAACGCATATTGCACTT CCGGGTTAGTCCTGGGAGTATGCCTGTATCAGTGTCCGTACATCAAACTTGGCTTTCTTC CTTCCGTGTAGTCGGTGGAGGAGACGTCAGATGTGAAGTGTCTTGCGGTTGGCCTTCGGG TCGTCTGCGAGTCCTTTGAAATGTACTGAACTGTACTCTCTCTTTGCTCGAAAAGCGTGG TATTGTTGGTTGTGGAGACTGCCTGTGTGGCCAGTCGGCGACCGGTTTGTCTGCTACGGC GTTTAATGGAGGAGTGTTCGATTCGCGGTATGGTTGGCTTCGGCTGAACAGACGCTTATT GGACGTTTTTCCTGCTGTGGCGTGATGGGCTGGTGAACCGTAGCTGTGTTTGGCTTGGTC TTTGAATCGGCTTTGCTGTTGCGAAGTAGAGCGGCGGCTTCGGCTGTCGAGGGGTCGATC CATTTTGGGAAGTTTGTGTGTACTTCGGTGCGCATCTCAATTGGACCTGATATCAGGCAA GATTACCCGC Kết quả giải trình tự (ngược và xuôi) hai mẫu nấm này được xử lý độ chính xác bằng phầm mềm CLUSTALX. So sánh độ tương đồng các mẫu giải trình tự với các nguồn nấm đã công bố trên ngân hàng gen của NCBI (Mỹ) bằng phần mềm BLAST. Bảng 4.1. Các nguồn nấm trên ngân hàng gen đƣợc dùng để so sánh Tên dòng nấm Accession Number linear Tác giả 1 P.multivesiculata AF266790 24- FEB- 2005 Cooke,D.E., Drenth,A., Duncan,J.M., Wagels,G. Brasier,C.M 2 P.multivesiculata CBS545.96 DQ335639 16- JAN- 2006 Belbahri,L., Calmin,G. Lefort,F. 3 P.syringae L41386 01-JUL- 2005 Crawford,A.R., Bassam,B.J., Drenth,A., Maclean,D.J. Irwin,J.A.G. 4 P.citricola AY995355 25- APR- 2005 Catal,M., Fulbright,D.W., Stadt,S. Jacobs,J. Thực hiện thí nghiệm so sánh trình tự của hai mẫu nấm trên địa lan với một số loài trong bảng 4.2 bằng phần mềm ClustalX. 36 Bảng 4.2. So sánh trình tự nucleotide vùng ITS của hai mẫu DL1, DL2 Dl1 CCACACCT-AAAAAACTTTCCACGTGAACCGTATCAACCCCTTTAGTTGGGGGTCTTGCT P.multivesiculata CCACACCT-AAAAAACTTTCCACGTGAACCGTATCAACCCCTTTAGTTGGGGGTCTTGCT P.multiCBS545.96 CCACACCT-AAAAAACTTTCCACGTGAACCGTATCAACCCCTTTAGTTGGGGGTCTTGCT Dl2 CCACACCT-AAAAAACTTTCCACGTGAACCGTATCAACCCCTTTAGTTGGGGGTCTTGCT P.syringae CCACACCT-AAAAAACTTTCCACGTGAACCGTATCAACCCCTTTAGTTGGGGGTCTTGCT P.citricola CCACACCTTAAAAAACTTTTCACGTGAACCGTATCAACCCTTTTAGTTGGGGGTCTTGCT ******** ********** ******************** ******************* Dl1 TGGCGTGCGGCTGCTGGCCTTTATTGGTTGGCTGGCTGCGTGCTGGGCGAGCCCTATCAT P.multivesiculata TGGCGTGCGGCTGCTGGCCTTTATTGGTTGGCTGGCTGCGTGCTGGGCGAGCCCTATCAT P.multiCBS545.96 TGGCGTGCGGCTGCTGGCCTTTATTGGTTGGCTGGCTGCGTGCTGGGCGAGCCCTATCAT Dl2 TGGCGTGCGGCTGCTGGCCTTTATTGGTTGGCTGGCTGCGTGCTGGGCGAGCCCTATCAT P.syringae TGGCGTGCGGCTGCTGGCCTTTATTGGTTGGCTGGCTGCGTGCTGGGCGAGCCCTATCAT P.citricola T-----------------TTTT------------------------GCGAGCCCTATCAT * *** ************** Dl1 GGCGATCGTTTGGACCTCGGTCTGAGCTAGTAGCTTTT-GTTTTAAACCCATTCTTTAAT P.multivesiculata GGCGATCGTTTGGACCTCGGTCTGAGCTAGTAGCTTTT-GTTTTAAACCCATTCTTTAAT P.multiCBS545.96 GGCGATCGTTTGGACCTCGGTCTGAGCTAGTAGCTTTT-GTTTTAAACCCATTCTTTAAT Dl2 GGCGATCGTTTGGACCTCGGTCTGAGCTAGTAGCTTTT-GTTTTAAACCCATTCTTTAAT P.syringae GGCGATCGTTTGGACCTCGGTCTGAGCTAGTAGCTTTT-GTTTTAAACCCATTCTTTAAT P.citricola GGCGAATGTTTGGACTTCGGTCTGGGCTAGTAGCTTTTTGTTTTAAACCCATTCTACAAT ***** ******** ******** ************* **************** *** Dl1 ACTGATTATACTGTGGGGACGAAAGTCTCTGCTTTTAACTAGATAGCAACTTTCAGCAGT P.multivesiculata ACTGATTATACTGTGGGGACGAAAGTCTCTGCTTTTAACTAGATAGCAACTTTCAGCAGT P.multiCBS545.96 ACTGATTATACTGTGGGGACGAAAGTCTCTGCTTTTAACTAGATAGCAACTTTCAGCAGT Dl2 ACTGATTATACTGTGGGGACGAAAGTCTCTGCTTTTAACTAGATAGCAACTTTCAGCAGT P.syringae ACTGATTATACTGTGGGGACGAAAGTCTCTGCTTTTAACTAGATAGCAACTTTCAGCAGT P.citricola ACTGATTATACTGTGGGGACGAAAGTCTCTGCTTTTAACTAGATAGCAACTTTCAGCAGT ************************************************************ Dl1 GGATGTCTAGGCTCGCACATCGATGAAGAACGCTGCGAACTGCGATACGTAATGCGAATT P.multivesiculata GGATGTCTAGGCTCGCACATCGATGAAGAACGCTGCGAACTGCGATACGTAATGCGAATT P.multiCBS545.96 GGATGTCTAGGCTCGCACATCGATGAAGAACGCTGCGAACTGCGATACGTAATGCGAATT Dl2 GGATGTCTAGGCTCGCACATCGATGAAGAACGCTGCGAACTGCGATACGTAATGCGAATT P.syringae GGATGTCTAGGCTCGCACATCGATGAAGAACGCTGCGAACTGCGATACGTAATGCGAATT P.citricola GGATGTCTAGGCTCGCACATCGATGAAGAACGCTGCGAACTGCGATACGTAATGCGAATT ************************************************************ Dl1 GCAGGATTCAGTGAGTCATCGAAATTTTGAACGCATATTGCACTTCCGGGTTAGTCCTGG P.multivesiculata GCAGGATTCAGTGAGTCATCGAAATTTTGAACGCATATTGCACTTCCGGGTTAGTCCTGG P.multiCBS545.96 GCAGGATTCAGTGAGTCATCGAAATTTTGAACGCATATTGCACTTCCGGGTTAGTCCTGG Dl2 GCAGGATTCAGTGAGTCATCGAAATTTTGAACGCATATTGCACTTCCGGGTTAGTCCTGG P.syringae GCAGGATTCAGTGAGTCATCGAAATTTGGAACGCATATTGCACTTCCGGGTTAGTCCTGG P.citricola GCAGGATTCAGTGAGTCATCGAAATTTTGAACGCATATTGCACTTCCGGGTTAGTCCTGG *************************** ******************************** Dl1 GAGTATGCCTGTATCAGTGTCCGTACATCAAACTTGGCTTTCTTCCTTCCGTGTAGTCGG P.multivesiculata GAGTATGCCTGTATCAGTGTCCGTACATCAAACTTGGCTTTCTTCCTTCCGTGTAGTCGG P.multiCBS545.96 GAGTATGCCTGTATCAGTGTCCGTACATCAAACTTGGCTTTCTTCCTTCCGTGTAGTCGG Dl2 GAGTATGCCTGTATCAGTGTCCGTACATCAAACTTGGCTTTCTTCCTTCCGTGTAGTCGG P.syringae GAGTATGCCTGTATCAGTGTCCGTACATCAAACTTGGCTTTCTTCCTTCCGTGTAGTCGG P.citricola GAGTATGCCTGTATCAGTGTCCGTACATCAAACTTGGCTTTCTTCCTTCCGTGTAGTCGG ************************************************************ Dl1 TGGAGGAGACGTCAGATGTGAAGTGTCTTGCGGTTGGCCTTCGGGTCGTCTGCGAGTCCT P.multivesiculata TGGAGGAGACGTCAGATGTGAAGTGTCTTGCGGTTGGCCTTCGGGTCGTCTGCGAGTCCT P.multiCBS545.96 TGGAGGAGACGTCAGATGTGAAGTGTCTTGCGGTTGGCCTTCGGGTCGTCTGCGAGTCCT Dl2 TGGAGGAGACGTCAGATGTGAAGTGTCTTGCGGTTGGCCTTCGGGTCGTCTGCGAGTCCT P.syringae TGGAGGAGACGTCAGATGTGAAGTGTCTTGCGGTTGGCCTTCGGGTCGTCTGCGAGTCCT P.citricola TGGAGGATGTGCCAGATGTGAAGTGTCTTGCGGGTGTCCTTCGGGTCGTCTGCGAGTCCT ******* * ********************* ** *********************** Dl1 TTGAAATGTACTGAACTGTACTCTCTCTTTGCTCGAAAAGCGTGGTATTGTTGGTTGTGG P.multivesiculata TTGAAATGTACTGAACTGTACTCTCTCTTTGCTCGAAAAGCGTGGTATTGTTGGTTGTGG 37 P.multiCBS545.96 TTGAAATGTACTGAACTGTACTCTCTCTTTGCTCGAAAAGCGTGGTATTGTTGGTTGTGG Dl2 TTGAAATGTACTGAACTGTACTCTCTCTTTGCTCGAAAAGCGTGGTATTGTTGGTTGTGG P.syringae TTGAAATGTACTGAACTGTACTCTCTCTTTGCTCGAAAAGCGTGGTATTGTTGGTTGTGG P.citricola TTGAAATGTACTGAACTGTACT-TCTCTTTGCTCGAAAAGCGTGGTGTTGCTGGTTGTGG ********************** *********************** *** ********* Dl1 AGACTGCCTGTGTGGCCAGTCGGCGACCGGTTTGTCTGCTACGGCGTTTAATGGAGGAGT P.multivesiculata AGACTGCCTGTGTGGCCAGTCGGCGACCGGTTTGTCTGCTACGGCGTTTAATGGAGGAGT P.multiCBS545.96 AGACTGCCTGTGTGGCCAGTCGGCGACCGGTTTGTCTGCTACGGCGTTTAATGGAGGAGT Dl2 AGACTGCCTGTGTGGCCAGTCGGCGACCGGTTTGTCTGCTACGGCGTTTAATGGAGGAGT P.syringae AGACTGCCTGTGTGGCCAGTCGGCGACCGGTTTGTCTGCTACGGCGTTTAATGGAGGAGT P.citricola AGGCTGCCTGCGTGGCCAGTCGGCGACCGGTTTGTCTGCTGCGGCGTTTAATGGAGGAGT ** ******* ***************************** ******************* Dl1 GTTCGATTCGCGGTATGGTTGGCTTCGGCTGAACAGACGCTTATTGGACGTTTTTCCTGC P.multivesiculata GTTCGATTCGCGGTATGGTTGGCTTCGGCTGAACAGACGCTTATTGGACGTTTTTCCTGC P.multiCBS545.96 GTTCGATTCGCGGTATGGTTGGCTTCGGCTGAACAGACGCTTATTGGACGTTTTTCCTGC Dl2 GTTCGATTCGCGGTATGGTTGGCTTCGGCTGAACAGACGCTTATTGGACGTTTTTCCTGC P.syringae GTTCGATTCGCGGTATGGTTGGCTTCGGCTGAACAGACGCTTATTGGACGTTTTTCCTCC P.citricola GTTCGATTCGCGGTATGGTTGGCTTCGGCTGAACAGGCGCTTATTGTATGCTTTTCCTGC ************************************ ********* * * ******* * Dl1 TGTGGCGTGATGGGCTGGTGAACCGTAGCTGTGTTT-GGCTTGGTCTTTGAATCGGCTTT P.multivesiculata TGTGGCGTGATGGGCTGGTGAACCGTAGCTGTGTTT-GGCTTGGTCTTTGAATCGGCTTT P.multiCBS545.96 TGTGGCGTGATGGGCTGGTGAACCGTAGCTGTGTTNTGGCTTGGTCTTTGAATCGGCTTT Dl2 TGTGGCGTGATGGGCTGGTGAACCGTAGCTGTGTTT-GGCTTGGTCTTTGAATCGGCTTT P.syringae TGTGGCGTGATGGGCTGGTGAACCGTACCTGTGTTT-GGCTTGGTCTTTGAATCGGCTTT P.citricola TGTGGCGTGATGGGCTGGTGAACCGTAGCTGTGTGT-GGCTTGGCTTTTGAATCGGCTTT *************************** ****** ******* ************** Dl1 GCTGTTGCGAAGTAGAGCGGCGGCTTCGGCTGTCGAGGGGTCGATCCATTTTGGGAAGTT P.multivesiculata GCTGTTGCGAAGTAGAGCGGCGGCTTCGGCTGTCGAGGGGTCGATCCATTTTGGGAAGTT P.multiCBS545.96 GCTGTTGCGAAGTAGAGCGGCGGCTTCGGCTGTCGAGGGGTCGATCCATTTTGGGAAGTT Dl2 GCTGTTGCGAAGTAGAGCGGCGGCTTCGGCTGTCGAGGGGTCGATCCATTTTGGGAAGTT P.syringae GCTGTTGCGAAGTAGAGCGGCGGCTTCGCCTGTCGAGGGGTCGATCCATTTTGGGAAGTT P.citricola GCTGTTGCGAAGTAGAGTGGCGGCTTCGGCTGTCGAGGG-TCGATCCATTT-GGGAACTT ***************** ********** ********** *********** ***** ** Dl1 TGTGTGTACTTCGGTGCGCATCTCAATT P.multivesiculata TGTGTGTACTTCGGTGCGCATCTCAA-- P.multiCBS545.96 TGTGTGTACTTCGGTGCGCATCTCAA-- Dl2 TGTGTGTACTTCGGTGCGCATCTCAATT P.syringae TGTGTGTACTTCGGTGCGCATCTCAATT P.citricola TGTGTGCACCTCGGTGCGCATCTCAATT ****** ** **************** Dựa trên kết quả so sánh ở bảng 4.2 ta thấy hai mẫu địa lan có cấu trúc trình tự rất giống nhau và khá tương đồng với trình tự của ba dòng nấm là P.multivesiculata, P.multivesiculata CBS545.96 và P.syringae Chúng tôi tiến hành so sánh cây phát sinh loài của hai mẫu nấm trên địa lan với ba dòng nấm trên bằng phần mềm Treeview 38 Hình 4.7. Cây phát sinh loài của hai mẫu địa lan Theo hình 4.7 hai mẫu nấm này có thể có chung một nguồn gốc thuộc loài P.multivesiculata ( dòng CBS545.96). Chúng tôi đã thực hiện thêm một số so sánh nhằm xác định các tiểu phần gen trong vùng (ITS1-5,8S-ITS2) dựa trên trình tự tương đồng vùng ITS của dòng nấm P.multivesiculata chủng CBS545.96. Bảng 4.3. Kết quả so sánh từng vùng trên đoạn gen ITS1- 5,8S- ITS2 P.multi CBS545.96 Độ tương đồng Số lượng Nucleotide DL1 DL2 DL1 DL2 ITS1 5,8S ITS2 100% 100% 99,99% 100% 100% 99,99% 225 160 420 225 160 420 Tỉ lệ tương đồng trên vùng ITS1 của mẫu là 100%; trên vùng ITS2 là 99,5%; trên vùng 5,8S là 100%. Dựa trên trình tự ITS1, trình tự ITS2 và trình tự vùng 5.8S chúng tôi đã thu được bảng kết quả sau 39 Bảng 4.4. Trình tự vùng gen (ITS1-5.8S-ITS2) của mẫu Phytophthora địa lan #18S NAAGCTGGAGAGAGACTTCCCC #ITS1 CCACACCTAAAAAACTTTCCACGTGAACCGTATCAACCCCTTTAGTTGGGGGTCTTGCTT GGCGTGCGGCTGCTGGCCTTTATTGGTTGGCTGGCTGCGTGCTGGGCGAGCCCTATCATG GCGATCGTTTGGACCTCGGTCTGAGCTAGTAGCTTTTGTTTTAAACCCATTCTTTAATAC TGATTATACTGTGGGGACGAAAGTCTCTGCTTTTAACTAGATAG #5_8S AACTTTCAGCAGTGGATGTCTAGGCTCGCACATCGATGAAGAACGCTGCGAACTGCGATA CGTAATGCGAATTGCAGGATTCAGTGAGTCATCGAAATTTTGAACGCATATTGCACTTCC GGGTTAGTCCTGGGAGTATGCCTGTATCAGTGTCCGTA #ITS2 GTACATCAAACTTGGCTTTCTTCCTTCCGTGTAGTCGGTGGAGGAGACGTCAGATGTGAA GTGTCTTGCGGTTGGCCTTCGGGTCGTCTGCGAGTCCTTTGAAATGTACTGAACTGTACT CTCTCTTTGCTCGAAAAGCGTGGTATTGTTGGTTGTGGAGACTGCCTGTGTGGCCAGTCG GCGACCGGTTTGTCTGCTACGGCGTTTAATGGAGGAGTGTTCGATTCGCGGTATGGTTG GCTTCGGCTGAACAGACGCTTATTGGACGTTTTTCCTGCTGTGGCGTGATGGGCTGGTG AACCGTAGCTGTGTTNTGGCTTGGTCTTTGAATCGGCTTTGCTGTTGCGAAGTAGAGCGG CGGCTTCGGCTGTCGAGGGGTCGATCCATTTTGGGAAGTTTGTGTGTACTTCGGTGCGCA TCTCAA #28S ATATCAGGCAAGATTA Theo kết quả ở bảng 4.4, chúng tôi đi đến một số điều cần thảo luận như: - Kết quả BLAST đoạn trình tự trên ngân hàng gen cho thấy sản phẩm hai mẫu nấm trên thuộc giống Phytophthora ( phù hợp với kết quả định danh bằng quan sát hình thái của kỹ sư Trịnh Thị Phương Vy). - Vùng ITS1- 5,8S- ITS2 của hai mẫu nấm này có 850 nucleotide. Điều này cũng khá phù hợp khi kết quả PCR của hai mẫu nấm này cho ra sản phẩm khoảng 800 bp. - Kết quả so sánh bằng phần mềm ClustalX trên toàn vùng ITS1- 5,8S- ITS2 và vẽ cây phát sinh loài bằng phần mềm Treeview cho thấy hai mẫu nấm trên có quan hệ rất gần với loài P. multivesiculata, đặc biệt là dòng P. multivesiculata CBS545.96. - Để khẳng định lại kết quả trên chúng tôi đã tiến hành so sánh các trình tự ngay trên từng tiểu phần nhỏ như ITS1; ITS2; 5,8S. Tỉ lệ tương đồng của phép so sánh này đạt gần 100%. Chúng tôi kết luận hai mẫu trên cùng thuộc loài P. multivesiculata dòng CBS545.96. - Đối chiếu với bảng danh mục các loài Phytophthora có mặt tại Việt Nam ( A. Drenth và I. Guest, 2004) chứng minh rằng đây là một loài mới xuất hiện tại Việt Nam kể từ năm 2004. 40 Phần 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận Kết quả giải trình tự cho ta một số kết luận như: - Ứng dụng của kỹ thuật PCR chúng tôi phát hiện hai mẫu nấm trên tiêu Bà Rịa và sầu riêng Đồng Nai đều thuộc giống Phytophthora nhưng chưa xác định rõ hai mẫu nấm trên địa lan. - Kết quả giải trình tự hai mẫu nấm trên địa lan có cấu trúc trình tự gần giống nhau. -- Trình tự của hai mẫu nấm này sau khi so sánh trên ngân hàng gen cho kết quả rất gần với ba dòng nấm bao gồm P.multivesiculata, P. multivesiculata CBS545.96 và P. syringae. Kết quả thu được trên cây phát sinh loài cho thấy hai mẫu nấm này có trình tự tương đồng với dòng P. multivesiculata CBS545.96. - So với bảng danh mục các loài Phytophthora xuất hiện tại Việt Nam do A. Drenth và I. Guest điều tra năm 2004 cho thấy loài nấm này không có mặt trong bảng danh mục các loài nấm Phytophthora gây bệnh ở Việt Nam. 5.2. Đề nghị - Giải trình tự trực tiếp hai nấm Phytophthora trên tiêu Bà Rịa và sầu riêng Đồng Nai. - Tăng số lượng các mẫu phân tích nhằm phát hiện mức độ đa dạng của các loài nấm trên cùng một đối tượng. - Áp dụng qui trình định danh trên cho những nghiên cứu về các loài nấm trên các loại lan ở Lâm Đồng. 41 Phần 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt 1. Trịnh Thị Phương Vy, 2005. Định danh nấm Phytopthora spp. bằng kỹ thuật PCR ( Polymerase Chain Reaction) kết hợp mô tả hình thái học. 2. Nguyễn Thị Lang, Bùi Chí Bửu, 2005. Sinh học phân tử, giới thiệu phương pháp và ứng dụng, NXB Nông Nghiệp Thành Phố Hồ Chí Minh. Tiếng Anh 3. André Drenth và David I. Guest, 2004. Diversity and Management of Phytophthora in Southeast Asia, Australian Centre for International Agricultural Research Canberra. 4. James C. Correll . Genetic, Biochemical, và Molecular Techniques for the Identification and Detection of Soilborne Plant-Pathogenic Fungi. 5. Alex A. Appiad, Isaac Y. Opoku và Andrews Y. Akrofi, 2004. Natural occurrence and distribution of stem cankers caused by Phytophthora palmivora on cocoa. 6. S.E. Zitko và L.W. Timmer,1994. Competitive Parasitc Abilities of Phytophthora parasitica and P. palmivora on Fibrous Roots of Citrus. 7. D. Cooke, N. Williams và J. M. Duncan, The uses of ITS regions in Phytophthora species. 8. C. Silvar, J. M. Duncan, D.E.L. Cooke, N.A. Williams, J. Diaz và F. Merino, 2004. Development of specific PCR primers for identification and detection of Phytophthora capsici Leon. 9. T. Wangsomboondee và J.B. Ristaino, 2002. Optimization of Sample Size and DNA Extraction Methods to Improve PCR Detection of Different Propagules of Phytophthora infestans. 10. A. Drenth và J.A.G. Irwin, 2001. Routine DNA based Diagnostic Test for Phytophthora. 11. F. Yamak, T.L. Peever, G.G. Grove, và R.J. Boal, 2002. Occurrence and Identification of Phtophthora spp. Pathogenic to Pear Fruit in Irrigation Water in the Wenatchee River Valley of Washington State. 42 12. Frank N. Martin và Paul W. Tooley, 2004. Identification of Phtophthora to Species Level Using Restriction Fragment Length Polymophism Analysis of a Polymerase chain Reaction-Amplified Region of Mitochondrial DNA. 13. P. Chowdappa, D. Brayford, J. Smith và J. Flood, 2003. Molecular discrimination of Phytophthora isolates on cocoa and their relationship with coconut, black pepper and bell pepper isolates based on rDNA repeat and AFLP fingerprints, CURRENT SCIENCE, VOL. 84, NO. 9. 14. C.M. Brasier, D.E.L Cooke và J.M. Duncan, 1999. Origin of a new Phytophthora pathogen through interspecific hydridization. 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52