Luận văn Định danh nấm trichoderma dựa vào trình tự vùng Its – Rdna và vùng TEF

a gel và chạy điện di với các thành phần sau: + Tris HCl 4,48 g + Na 2 EDTA 0,5M (pH 8,0) 2ml + Glacial acetic acid 1,14ml + Nƣớc cất vừa đủ 1lít Dung dịch nhuộm trên gel: 1% ethidium bromide 3.2.1.6 Hoá chất cho phản ứng PCR - Taq DNA polymerase. - Đệm 10X PCR: đi kèm với Taq polymerase. - dNTP 10 mM - MgCl2 25mM - Forward primer, reverse primer. 3.2.1.7 Hoá chất trong tinh sạch sản phẩm PCR - Agar polyacryamid dùng cho diện đi để thu sản phẩm PCR. - Bộ kit GFX gồm: cột GFX, capture buffer, wash buffer, elution buffer. 3.2.2 Dụng cụ và thiết bị - Bình tam giác:250ml, 500ml - Nồi nấp khử trùng Tommy ( Mỹ). - Cân điện tử (Ohaus, Mỹ) - Tủ sấy. - Tủ ấm. - Tủ cấy nấm - Máy lắc. - Ống nghiệm với dung tích 15 ml. - Bộ cối chày nghiền mẫu (Đức) - Micropipette: 10 l ,100 l,1000 l. 28 - Máy ly tâm. - Tủ giữ mẫu: tủ lạnh (-700C, 200C), tủ mát (- 40C). - Bộ chạy điện di. - Máy cất nƣớc 2 lần. - Máy đo pH. - Máy PCR ( biorad). - Máy chụp hình gel. 3.3 Phục hồi các dòng nấm trichoderma từ những ống nghiệm chứa các bào tử nấm trichoderme bằng môi trƣờng PGA Chuẩn bị cho 1 lít môi trƣờng PGA : - Chuẩn bị phần dịch tiết của khoai tây: 200 khoai tây đƣợc gọt vỏ cắt nhỏ và đun sôi, chỉ lấy phần nƣớc. - Bổ sung các thành phần cần thiết: thêm vào đó lƣợng glucose, agarose nhƣ trên và lƣợng nƣớc cho vừa đủ 1 lít. - Đun hỗn hợp trên cho đến khi agarose và glucose tan ra. - Môi trƣờng PGA đƣợc cho vào bình tam giác - Hấp môi trƣờng PGA bằng nồi nấp Autoclave ở 1210C trong 20 phút để khử trùng môi trƣờng không bị nhiễm khuẩn. - Để môi trƣờng nguội bớt rồi đổ môi trƣờng từ những bình tam giác vào đĩa petri sạch (9cm) khoảng 15ml môi trƣờng. - Đĩa petri có chứa môi trƣờng để nguội, đông cứng lại thì ta có thể cấy những bào tử nấm Trichoderma vào. Sau 4 ngày các khuẩn ty của nấm sẽ mọc bên trên bề mặt đĩa. 3.4 Nhân sinh khối nấm và thu lấy các mẫu nấm  Nhân sinh khối nấm Nấm tricoderma đƣợc tăng sinh trong môi trƣờng lỏng. Môi trƣờng molas. Chuẩn bị môi trƣờng Molas: 30 g mật rỉ đƣợc hoà chung vào nƣớc cất lọc qua tấm vải lọc đƣợc khử trùng. 29 Tất cả đƣợc cho vào một chiếc cốc với lƣợng nƣớc cất vừa đủ dung lƣợng cần thiết. Dùng máy khuấy từ hoà tan các chất. Cho vào mỗi bình tam giác 100ml môi trƣờng. Hấp khử trùng trong 20 phút ở 1210 C để diệt những loại vi sinh vật khác có thể làm tạp nhiễm môi trƣờng nhân sinh khối nấm Trichoderma. - Những sợi nấm mọc trên môi trƣờng thạch đƣợc thu lấy cho vào môi trƣờng lỏng trong những bình tam giác. Đặt những bình tam giác vào máy lắc, điều chỉnh ở mức 200 vòng/phút lắc liên tục khoảng 5 ngày không để cho những sợi nấm mọc bào tử. Dừng lại và thu lấy khối sợi nấm.  Cách thu lấy khối sợi nấm: Vải lọc và phễu lọc phải đƣợc khử trùng sấy khô dùng để lọc thu lấy phần sợi nấm. Ép khô rồi đặt trên giấy bạc. Rồi cất giữ vào tủ lạnh ở -700C. 3.5 Ly trích DNA từ nấm đã đƣợc nghiền mịn Lƣợng mẫu cần ly trích trong mỗi ống nghiệm chiếm 1/6 thể tích ống. Bƣớc 1: Nghiền mẫu nấm trong dung dịch nitơ lỏng. Mẫu nấm đƣợc nghiền mịn cho vào các ống nghiệm có thể tích 15 ml. Trong quá trình nghiền cho nitơ lỏng vào liên tục để mẫu nấm không bị tan. Bứơc 2: Thêm vào 4ml lysis buffer vào trong ống nghiệm. Trộn đều, ủ ấm ở 650C trong vòng 1 giờ. Bƣớc 3: Thêm vào 3 ml phenol / chloroform / isoamylalcohol (25:24:1). Lắc đều, nhẹ. Ly tâm 10 phút với tốc độ 3000 vòng/phút ở nhiệt độ phòng. Bƣớc 4: Hút lấy phần dịch nổi ở trên (3 – 5 ml). Cho vào ống nghiệm có dung tích 15ml khác. Bƣớc 5: Thêm vào ống ly tâm mới 3ml chloroform / isoamylalcohol (24:1). Trộn đều, ly tâm với tốc độ 3000 vòng/ phút trong 10 phút. Bƣớc 6: Hút lấy phần dịch nổi ở trên (3-5 ml). Cho vào ống nghiệm có dung tích 15ml khác. Bƣớc 7: Thêm vào isopropanol lƣợng chất : 0.6 tổng thể tích của ống nghiệm. Lắc nhẹ, để ở nhiệt độ phòng 5’- 10’,ly tâm. Bƣớc 8: Dùng que thu DNA tủa ở đáy ống 30 Bƣớc 9: Dùng ethanol 70% để rửa tủa DNA. Rửa lại nhiều lần 3-4 lần. Bƣớc 10: Phơi khô mẫu (khoảng 2-3 giờ). Mẫu DNA khô, thì thêm vào 200 l TE 1X. 3.6 Kiểm tra kết quả ly trích DNA và pha loãng DNA  Bƣớc 1: Chuẩn bị gel agarose 1% (w/v) : Cân 0,125 g agarose cho vào 12,5 ml TAE 0,5X, lắc nhẹ cho agarose phân tán đều, đun nóng trong lò viba ở 650W trong 2 phút. Để nhiệt độ trong chai giảm xuống dần, đổ vào khuôn có gắn lƣợc với số giếng mong muốn. Chờ gel đông (thƣờng 30 phút), lấy lƣợc ra và bắt đầu tiến hành nạp mẫu.  Bƣớc 2: Nạp mẫu, xác định các thông số điện di và đọc kết quả: - Đối với DNA tổng số: Dùng micropipette hút lấy 2 l mẫu, trộn đều với 2 l loading buffer 6X, hút tổng lƣợng thể tích là 4 l bơm vào giếng tƣơng ứng đã bố trí sẳn. Lần lƣợt bơm các mẫu khác đã đƣợc trộn đều với thuốc nhuộm vào tất cả các giếng còn lại. Tiến hành điện di trên gel agarose 1% trong dung dịch đệm TAE 0,5X, hiệu điện thế là 100V, cƣờng độ dòng điện 250A trong khoảng 15 - 20 phút. Kết thúc quá trình điện di, bảng gel đƣợc chuyển vào thuốc nhuộm ethidium bromide (1%) trong khoảng 15 - 20 phút, rửa sạch gel và đọc kết quả bằng phần mềm Quality One của máy Gel doc 2000 (Biorad). Kết quả điện di thể hiện qua chƣơng trình của máy đọc gel ta có thể dự đoán đƣợc độ pha loãng cần thực hiện đối với từng mẫu DNA tổng số. Đối với DNA đƣợc pha loãng, mỗi nồng độ lấy 4 l với 2 l loading buffer 6X, thao tác tiến hành tƣơng tự nhƣ trên. Kết quả thu đƣợc qua chƣơng trình của máy gel doc cho ta xác định đƣợc nồng độ cần thiết để chọn lấy và thực hiện phản ứng PCR. Đối với sản phẩm PCR, kiểm tra kết quả phản ứng PCR và lƣợng DNA đƣợc khuyết đại lên trong phản ứng cũng thông qua quá trình nạp mẫu lƣợng mẫu cần lấy 4 l, điện di trong dung dịch đệm TAE 0,5X, hiệu điện thế là 50V khoảng 90 phút , nhuộm gel trong ethidium bromide (1%) và đọc kết quả trên máy chụp hình gel doc bằng chƣơng trình Quality One. Band xuất hiện trên 31 miếng gel cho ta kết quả dƣơng tính, chỉ một band duy nhất cho kết quả kiểm tra sản phẩm DNA trong phản ứng PCR. 3.7 Thực hiện phản ứng PCR khuếch đại vùng ITS – rDNA các dòng nấm Trichoderma 3.7.1 Vật liệu và thành phần hoá chất cho phản ứng PCR  Primer: Primer Trình tự primer theo chiều 5’- 3’ ITS4 TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC ITS5 GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G ElongR GCC ATC CTT GGA GAC CGA Elong F GTG AGC GTG GTA TCA CCA TCG  DNA khuôn đƣợc thu nhận qua quá trình ly trích DNA và pha loãng kiểm tra nồng độ DNA thích hơp phản ứng PCR. Các dòng Trichoderma làm khuôn mẫu để chạy PCR: Trichoderma asperellum dòng của nƣớc ngoài để làm đối chứng cho 4 dòng nấm trichoderma của Việt Nam: T4., T6, T19 và 2-41-2 (Trichoderma). Thành phần phản ứng PCR và lƣợng cần dùng đủ cho một phản ứng: Thành phần Liều lƣợng ( l) Nồng độ cuối PCR buffer 10X 2,5 1X MgCl2 0,75 1,5mM dNTP 0,5 0,2 mM Primer 1 1 10 pmol/ l Primer 2 1 10 pmol/ l Khuôn DNA 1 20 ng/ l Taq polymerase 0,2 Nƣớc cất 18,05 Tổng cộng 25 32 H ìn h 3 .1 . Ứ n g d ụ n g k ỹ t h u ậ t P C R đ ể k h u ếc h đ ạ i tr ìn h t ự đ o ạ n g en t ef 1 fw - t ef 2 re v 33 3.7.2 Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR (Wang C. Z., 2002)  Cho primer ITS4 và ITS5: Giai đoạn 1: 940C trong 3 phút Giai đoạn 2: Bƣớc 1: 940C trong 1 phút Bƣớc 2: 580C trong 45 giây 30chu kỳ Bƣớc 3: 720C trong 1 phút Giai đoạn 3: 720C trong 5 phút  Cho primer Elong R và Elong F: Giai đoạn 1: 94 0C trong 3 phút Giai đoạn 2: Bƣớc 1: 940C trong 1 phút Bƣớc 2: 560C trong 45giây 30chu kỳ Bƣớc 3: 720C trong 1 phút Giai đoạn 3: 720C trong 5 phút Trong chu trình nhiệt phản ứng PCR: khác biệt duy nhất là nhiệt độ bắt cặp của 2 cặp primer khác nhau vì kích thƣớc và nhiệt độ Tm của 2 cặp primer khác nhau. 3.7.3 Đánh giá kết quả PCR  Sản phẩm PCR đƣợc điện di trên agarose gel 0,8 %, dịch đệm TAE 0,5 X.  Chạy điện di: 100 V, 250 mA, 25 phút.  Nhuộm gel bằng dung dịch ethidium bromide từ trong vòng 15 phút  Kết quả đƣợc ghi lại nhờ đọc tia UV và chụp ảnh bằng phần mềm Quality One của máy Gel Doc 2000 (Biorad). Bảng tóm tắt quy trình khuếch đại vùng ITS-rDNA bằng primer ITS4 và ITS5; primer Elong R và Elong F: 34 Hình 3.2 Quy trình khuếch đại vùng ITS-rDNA bằng primer ITS4 và ITS5 và Elong R vàElong F ( với T= 560C đới với cặp primer ITS4 và ITS5 T=58 0C với cặp primer Elong R vàElong F Dòng nấm Trichoderma ở dạng bào tử Phục hồi nấm trong môi trƣờng PGA Nhân sinh khối nấm trong môi trƣờng Molas Thu sợi nấm Ly trích DNA Thực hiện phản ứng PCR Hoá chất: PCR Buffer 10X MgCl2 Primer ITS4 Primer ITS5 dNTP Taq polymerase DNA khuôn Nƣớc cất Chu kỳ nhiệt: 94 0C/3 phút 94 0C/1 phút T 0C/45 giây 72 0C/1 phút 72 0 C/5 phút 30 chu kỳ Nghiền sợi nấm 35 3.8 Đọc trình tự sản phẩm PCR 3.8.1 Chuẩn bị DNA khuôn 3.8.1.1 Tinh sạch sản phẩm PCR Nguồn DNA dùng làm khuôn để đọc trình tự là sản phẩm PCR: thực hiện khuếch đại bằng 2 cặp primer ITS 4, ITS 5 và Elong R, Elong F trên dòng nấm Trichoderma Harzianum ( phân lập từ đất Củ Chi – Thành phố Hồ Chí Minh – Việt Nam) . Thực hiện bƣớc tinh sạch sản phẩm PCR bằng cột GFX (Amersham). Phƣơng pháp này cho phép tinh sạch trực tiếp từ dung dịch DNA hay tinh sạch DNA từ gel. Lƣợng DNA thu lại sau khi tinh sạch từ dung dịch khoảng 80% và từ gel là 60% so với lƣợng DNA ban đầu. Đối với sản phẩm PCR những thành phần còn dƣ nhƣ primer hay DNTP có thể đƣợc loại bỏ hoàn toàn sau khi tinh sạch. - Biến tính protein: capture buffer có tác dụng biến tính protein và tăng cƣờng khả năng liên kết chuỗi DNA với cột GFX. - Thu giữ DNA: cột GFX giữ DNA bám dính vào cột. - Rửa: DNA đƣợc rửa bằng dung dịch wash buffer để loại bỏ muối và các thành phần khác. - Hoà tan DNA: DNA tinh sạch đƣợc hoà tan trong TE (elution buffer).  Cách 1: Quy trình tinh sạch từ dung dịch DNA (Amersham): 1. Đặt cột GFX vào 1 eppendorf 1,5ml. 2. Dùng micropipette hút capture buffer cho vào cột GFX. Sau đó cho dung dịch DNA cần tinh sạch vào cột GFX chứa capture buffer. 3. Trộn nhẹ hỗn hợp bằng micropipette khoảng 4-6 lần. 4. Ly tâm 10.000 vòng/phút trong 30 giây, lấy cột GFX ra đặt vào eppendorf 1,5 ml mới. 5. Hút lấy 500 l wash buffer nhỏ vào cột GFX, ly tâm 10.000vòng/phút trong 30 giây. Chuyển cột GFX vào eppendorf 1,5 ml mới. 6. Hút 50 l elution buffer nhỏ vào cột GFX, ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 phút. 36 7. Ly tâm tốc độ 10.000 vòng/phút trong 1 phút, lấy cột GFX ra, thu lấy dung dịch DNA.  Cách 2: Quy trình tinh sạch DNA sản phẩm PCR bằng phƣơng pháp cắt gel (Amersham):  Bƣớc 1: Điện di sản phẩm PCR và cắt gel có chứa band DNA cần tinh sạch: Mẫu cần đƣợc tinh sạch là sản phẩm PCR đƣợc chạy điện di trên gel agarose 0,8% tan ở nhiệt độ thấp. Gel sau khi chạy điện di đƣợc nhuộm ngắn (2 – 3 phút) trong ethidium bromide nồng độ thấp. Bảng gel đƣợc nhuộm xong đƣợc rửa sạch bằng nƣớc cất vô trùng, gel đƣợc đặt trên máy chiếu tia UV đã đƣợc bọc kỹ bằng saran wrap và phủ lên trên lớp giấy bạc đƣợc cắt lỗ có kích thƣớc bằng kích thƣớc miếng gel. Bật UV, định vị band cần cắt lấy,dùng dao lam cắt gel có chứa band DNA cần tinh sạch cho vào eppendorf 1,5 ml. Dùng cân điện tử để xác định trọng lƣợng của gel chứa band vừa cắt trên. Mảnh gel đƣợc cắt có chứa band DNA cần tinh sạch có thể đƣợc cất giữ trong tủ -700C nếu nhƣ chƣa thể tinh sạch ngay đƣợc.  Bƣớc 2: thao tác tinh sạch DNA từ gel đƣợc cắt lấy ở trên. 1. Dùng tăm tre đã đƣợc khử trùng để phân nhỏ phần gel có chứa band DNA cần tinh sạch ở trong eppendorf 1,5 ml. 2. Dùng micropipette hút capture buffer theo tỷ lệ khối lƣợng / thể tích (10 mg trọng lƣợng gel chứa DNA cần 10 l capture buffer, đậy nắp eppendorf, vortex nhẹ, ủ ở 600 C cho đến khi agarose có chứa DNA cần tinh sạch tan hết. 3. Sau khi agarose tan hoàn toàn, ly tâm 10.000 vòng/phút trong 30 giây để tập trung mẫu ở đáy eppendorf. 4. Dùng micropipette hút mẫu cho vào cột GFX, ủ ở nhiệt độ phòng trong 1phút. 5. Ly tâm 10.000vòng/phút trong 30 giây, lấy cột GFX ra đặt vào eppendorf. 6. Hút 500 l wash buffer nhỏ vào cột GFX, ly tâm 10.000 vòng/phút trong 30 giây. 7. Lấy cột ra và đặt vào eppendorf 1,5 ml mới. 37 8. Hút 50 l elution buffer nhỏ vào cột GFX, ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 phút. 9. Ly tâm tốc độ 10.000vòng/phút trong 1 phút, lấy cột GFX ra, thu lấy dung dịch DNA.  Những điều cần lƣu ý khi tinh sạch sản phẩm từ gel: - Bồn điện di cần phải đƣợc vệ sinh sạch trƣớc khi chạy điện di. - Dung dịch dùng cho chạy điện di mới, không bị cặn bẩn. - Sử dụng loại agarose: low melting agar. - Dòng điện chạy trong điện di 50V, mục đích: giúp cho độ phân tách DNA với các phần tạp tốt hơn. - Cân eppendorf trƣớc và sau khi tiến hành cắt gel. Để xác định trọng lƣợng phần gel có chứa sản phẩm DNA. - Trong quá trình nhuộm gel bằng ethidium bromide nồng độ sử dụng để nhuộm là 15 l ethidium bromide + 300ml TAE 0,5 M, nồng độ này loãng hơn 1/2 so với nồng độ thƣờng dùng trong nhuộm gel để đọc bằng máy đọc gel với chƣơng trình gel doc. - Thời gian nhuộm gel từ 2- 3 phút. - Bảng gel sau khi nhuộm cần phải đƣợc rửa sạch bằng nƣớc cất vô trùng. - Thời gian mẫu tiếp xúc dƣới tia UV trong quá trình cắt gel phải ngắn (<40 giây), muc đích là tránh tình trạng tia UV gây mất lƣợng DNA. - Các dụng cụ dùng cho việc tinh sạch DNA nhƣ: bồn điện di, lọ nấu agarose, eppendorf, dao cắt, giấy lót ….phải tuyệt đối đảm bảo sạch, vô trùng. - Sau quá trình ủ 600C agarose phải tan hết. - Khi nhỏ dung dịch capture buffer, hay dung dịch rửa cột wash buffer phải nhỏ từ từ trên thành của cột GFX. - Khi nhỏ elution buffer phải nhỏ ngay giữa cột GFX, từng giọt một. Trong suốt quá trình tinh sạch DNA phải đảm bảo các dụng cụ sạch, vô trùng và thao tác nhanh, chính xác để không bị xâm nhiễm từ những tác nhân bên ngoài. 38 3.8.1.2 Định lƣợng sản phẩm PCR đã tinh sạch Sau khi tinh sạch DNA, chạy điện di với hiệu điện thế 50 V và cƣờng độ dòng điện 250A, trong khoảng 60 phút. Thu nhận kết quả thông qua phƣơng pháp nhuộm gel trong ethidium bromide (1%) và đọc kết quả trên máy chụp hình gel doc bằng chƣơng trình Quality One (Biorad). Kết quả điện di trên đƣợc phân tích và dựa vào đó pha loãng 2, 4, 6 lần. Ở độ pha loãng ra 4 lần cho nồng độ DNA thích hợp cho việc đọc trình tự. 3.8.3 Chạy điện di và ghi nhận tín hiệu trên máy sequencer Sản phẩm DNA sau khi khuếch đại đƣợc load vào các cột mao dẫn chứa polymer để điện di phân tích kết quả. Kết quả thu đƣợc từ tín hiệu huỳnh quang sẽ đƣợc ghi nhận bằng phần mềm của máy sequencer. Quy trình tóm tắt các bƣớc đọc trình tự Hình 3.3 Sơ đồ tóm tắt quy trình đọc trình tự sản phẩm PCR. Sản phẩm PCR CR Tinh sạch GFX PCR DNA and gel band Purification kit Phản ứng đọc trình tự Hoá chất:  BDT mix  Buffer  DNA khuôn  Primer  Nƣớc khử ion  Chu kỳ nhiệt:  950C/5 phút  950C/30 giây  550C/10 giây  600C/4 phút 25 chu kỳ Tinh sạch Điện di, ghi nhận tín hiệu 39 PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết quả phục hồi nấm Trichoderma từ những ống nghiệm chứa những bào tử nấm  Sau khi cấy những bào tử lên trên phần thạch của đĩa petri chứa môi trƣờng PGA phục hồi nấm và trên phần thạch nghiêng trong ống nghiệm chứa môi trƣờng CAM để giữ nấm. Đậy kín và giữ trong điều kiện ở nhiệt độ phòng, ở nơi mát. Sau 4 – 6 ngày khuẩn ty và đính bào tử nấm Trichoderma mọc ở mặt trên của phần thạch nghiêng và đĩa petri. Khuẩn ty của nấm Trichoderma có màu trắng còn bào tử có màu xanh đặc trƣng của dòng nấm Trichoderma. Các dòng nấm cần phải đƣợc lƣu giữ để cho những nghiên cứu sau và là nguồn dự trữ cho những nghiệm thức sau nếu nhƣ các kết quả thực hiện chƣa đạt yêu cầu.  So với môi trƣờng CAM lƣu trữ nấm thì trên môi trƣờng PGA nấm Trichoderma phát triển mạnh và nhanh hơn, sự hình thành bào tử sớm hơn vì trên môi trƣờng PGA nấm Trichoderma sẽ sử dụng trực tiếp ngay thành phần glucose bổ sung và lƣợng glucose trong khoai tây nên sợi nấm Trichoderma phát triển mau chóng. Trong môi trƣờng CAM nấm Trichoderma phải qua giai đoạn phân giải đƣờng Dextrose thành 2 phân tử Glucose và tinh bột từ bột bắp phân giải thành n-glucose cho nên thời gian nấm Trichoderma phát triển chậm hơn, bù lại thì có thể giữ nấm đƣợc lâu hơn (có thể 2-3 năm), còn đối với môi trƣờng PGA chỉ có thể giữ nấm không quá 4 tháng.  Kết quả nhân sinh khối sau khi cấy sợi nấm có hoặc không có đính bào tử vào những bình tam giác có chứa môi trƣờng nhân sinh khối lỏng (MOLAS – YEAST EXTRAX) giữ ở nhiệt độ 270C, đặt vào máy lắc điều chỉnh với tốc độ 200 vòng/phút. Sau 4-5 ngày, kết quả thu đƣợc từ 10 dòng nấm Trichoderma của Việt Nam đƣợc phân lập từ những địa điểm khác nhau và 10 dòng nấm Trichoderma của nƣớc ngoài. Tất cả các dòng Trichoderma của Việt Nam và nƣớc ngoài đều có khả năng tạo ra sợi nấm trong môi trƣờng MOLAS. 40 4.2. Kết quả ly trích thu DNA từ các dòng nấm Trichoderma Ly trích 10 dòng nấm Trichoderma của Việt Nam và 10 dòng nấm Trichoderma của nƣớc ngoài. Kết quả ly trích thể hiện qua hình sau: DNA tổng số phần tạp Kết quả ly trích cho thấy DNA tổng số không tinh sạch hoàn toàn. Ngoài DNA tổng số còn có thêm những đoạn DNA bị đứt gãy mà quá trình ly trích không thể loại bỏ đƣợc. Nguyên nhân tạo ra những đoạn DNA đứt gãy:  Quá trình nghiền chƣa tốt hoặc do hoá chất nhƣ Phenol, chloroform.  Thời gian cho phenol để phá huỷ lớp vỏ, lớp màng nhân, loại bỏ protein. Nếu nhƣ thời gian quá dài sẽ gây nên sự đứt gãy DNA một lƣợng rất đáng kể.  Ly tâm (tốc độ, thời gian, thao tác): - Ly tâm với thời gian ngắn, tốc độ thấp thì sự phân lớp chƣa tốt giữa phần dịch chứa DNA, lớp xác tế bào, lớp phenol. - Ly tâm với thời gian quá dài thì phenol phá huỷ nhiều DNA hơn gây ra nhiều đoạn đứt gãy - Ly tâm với tốc độ quá cao và thời gian dài thì DNA sẽ bị gãy rất nhiều.  Nguyên nhân thu lƣợng DNA tổng số ít là do: - Mẫu nghiền chƣa mịn. Hình 4.1 kết quả ly trích DNA tổng số từ các dòng Trichoderma 41 - Thời gian và nhiệt độ ủ chƣa đủ để phá vỡ vách tế bào. - Sự phân lớp chƣa tốt ở các bƣớc ly tâm.  Thực hiện càng nhiều bƣớc ly tâm thì lƣợng DNA đứt gãy càng nhiều cho nên bƣớc tủa DNA không cần phải ly tâm để tập trung lƣợng DNA mà để lắng khoảng 30 phút sẽ thu đƣợc DNA tinh hơn.  Nhƣ vậy mức độ DNA tinh sạch có hoặc không có bị đứt gãy, lƣợng DNA tổng số thu đƣợc nhiều hay ít là do việc nghiền nấm và quá trình ly trích.  Các dòng Trichoderma đƣợc chọn để chạy PCR: T.harzianum (T4), T.Koningii (T6), L35.5 ( chƣa định danh), 2-41-2( chƣa định danh), và một dòng của nƣớc ngoài làm đối chứng: Trichoderma harzianum (GJS 00-39). Tiến hành pha loãng các mẫu trên với độ pha loãng thích hợp. DNA pha loãng trƣớc khi chạy PCR Dựa vào band DNA thu nhận đƣợc từ kết quả điện di sản phẩm ly trích DNA, tiến hành pha loãng các nguồn DNA tổng số xuống nồng độ thấp hơn, dựa vào đó chọn lựa thang biểu thị nồng độ DNA thích hợp cho quá trình chạy PCR. Kết quả điện di ở hình 4.2 cho thấy band thứ 2 đƣợc chọn làm chuẩn để tiến hành chạy PCR DNA pha loãng Hình 4.2 DNA tổng số đƣợc pha loãng trƣớc khi chạy PCR. 1 2 3 4 42 4.4 Kết quả khuếch đại vùng ITS1 – 5,8S – ITS2 Với: 1,1’: T4 , 2,2’: T6, 3,3’: T19, 4,4’: L35.5, 5: GJS 00-39 (dòng Trichoderma .harzianumcủa nƣớc ngoài đƣợc dùng làm mẫu đối chứng)  Dựa vào thang ladder, cho thấy các dòng nấm Trichoderma chạy với primer ITS4 - ITS5 có kích thƣớc khoảng 670 bp. Tƣơng tự với primer ElongR - ElongF so sánh với ladder thì kích thƣớc vùng elong khoảng 260 bp.  Primer là đoạn mồi có tính đặc hiệu khác với tính ngẫu nhiên do primer ITS4 - ITS5 thực hiện trên vùng ITS1 – 5,8S – ITS2.  Nếu quá trình ly trích tốt ít DNA bị đứt gãy, không bị tạp, sản phẩm DNA trƣớc khi chạy PCR cần tinh sạch thì kết quả PCR tốt hơn. Cần phải tinh sạch sản phẩm PCR vì theo nguyên tắc và thực nghiệm thì trong ống eppendorf chứa hàng triệu DNA đƣợc nhân lên nhờ vào quá trình khuếch đại thì vẫn còn sót lại lƣợng hoá chất cần để chạy PCR cũng nhƣ lƣợng DNA đứt gãy có lẫn trong lƣợng DNA mẫu ban đầu. Do đó cần phải tinh sạch sản phẩm PCR trƣớc khi đọc trình tự DNA. Hình 4.3 Sản phẩm PCR khi khuếch đại bằng cặp primer Elong R-Elong F. Hình 4.4 Sản phẩm PCR khi khuếch đại bằng cặp primer ITS4 &ITS5. 1 2 3 4 1’ 2’ 3’ 4’ 5 43  Sau khi tinh sạch sản phẩm PCR. Chuẩn bị pha loãng để có thể đọc trình tự DNA vùng ITS1 – 5,8S – ITS2 và vùng Tef. 4.5 Sản phẩm PCR tinh sạch của dòng Trichoderma harzianum Trong số các sản phẩm PCR đƣợc khuếch đại, chọn lấy dòng Trichoderma harzianum (T4). Band 1: sản phẩm PCR khuếch đại với cặp primer Elong R và ElongF. Band 2: sản phẩm PCR khuếch đại với cặp primer ITS 4 và ITS 5 của cùng dòng nấm Trichoderma harzianum. Pha loãng sản phẩm PCR làm ở mức độ 2, 4, 6, lần. Độ pha loãng 4 có thể sử dụng để tiến hành đọc trình tự vùng gene cần thiết. Hình 4.5 Sản phẩm PCR đƣợc tinh sạch trƣớc khi đọc trình tự DNA. 4.6 Kết quả giải trình tự vùng ITS-rDNA và vùng Tef 4.6.1 So sánh trình tự nucleotid giữa vùng ITS – rDNA và vùng Tef Sản phẩm khuếch đại vùng bảo tồn ITS – rDNA và vùng chức năng Tef của dòng nấm Trichorderma đƣợc đọc trực tiếp bằng máy Sequencer. Trình tự vùng ITS – rDNA và vùng Tef đƣợc đối chiếu trên nguồn gen (dữ liệu NCBI). Chọn những dòng Trichoderma đối chiếu có trình tự DNA tƣơng đồng là cao nhất trong hàng loạt những dòng khác nhau .  So sánh vùng trình tự ITS – rDNA dòng T4 (mẫu nấm Trichoderma harzianum - Việt Nam) với các dòng Trichodrma trên ngân hàng gene (GeneBank): kết quả thể hiện nhƣ sau: Band 1: Với cặp primer ElongR - ElongF Band 2: Với cặp primer ITS4 – ITS5 1 2 44 Bảng 4.1: Các nguồn nấm Trichoderma trên genbank đƣợc dùng để so sánh vùng ITS1 – 5,8S – ITS2 Tên Trichoderma Tác giả Địa điểm Năm T.asperellum.TUB Nyla N. Ấn Độ 2004 T.asperellum.RRLF-20 Hermosa M.R Nhật 1998 T.harzianum.THAJ4020 Hermosa M.R Nhật 1998 T.viride.GJS90-95 Gary J.Semuels Mỹ 2000 T.viride.TVRRNATR3 Kula N. Đức 1996 T.viride.TVAJ3773 Hermosa M.R Nhật 1998 T.hamatum.GJS Gary J.Semuels Mỹ 2000 T.hamatum.MA Wuczkowsd N. Úc 2000 T.atroviride.BBA Lieckfeldt E. Đức 1998 So sánh trình tự nucleotid vùmg ITS – rDNA dòng T4 với các dòng Trichoderma khác trên geneBank. Sử dụng phần mềm CLUSTAL. DQ315455-T.viride.GJS90-95 ------------------------TCATTACCGAGTTTACAACTCCCAAA AY857218-T.asperellum.TUB --------------AGCGGAGGGATCATTACCGAGTTTACAACTCCCAAA X93981-T.viride.TVRRNATR3 TCCGTTGGTGAACCAGCGGAGGGATCATTACCGAGTTTACAACTCCCAAA AJ230660-T.atroviride.BBA TCCGTTGGTGAACCAGCGGAGGGATCATTACCGAGTTTACAACTCCCAAA AJ223773-T.viride.TVAJ3773 -------------------AGGGATCATTACCGAGTTTACAACTCCCAAA AJ224020-T.harzianum.THAJ4020 -------------------AGGGATCATTACCGAGTTTACAACTCCCAAA AJ849895-T.asperellum.RRLF-20 -------CCGTGAACCATGGGGGATCAT-ACCGAGTTTACAACTCCCAAA DQ109530-T.hamatum.GJS -------------CTGCGGAGGGATCATTACCGAGTTTACAACTCCCAAA AJ507086-T.hamatum.MA ------------------------------CCGAGTTTACAACTCCCAAA T4-ITS5 -----NAAAGCTATGGAGCGGAGGATATTAC-GAGTTTACAACTCCCAAA * ****************** DQ315455-T.viride.GJS90-95 CCCAATGTGAACCATACCAAACTGTTGCCTCGGCGGGGTCACGCCCCGGG AY857218-T.asperellum.TUB CCCAATGTGAACGTTACCAAACTGTTGCCTCGGCGGGGTCACGCCCCGGG X93981-T.viride.TVRRNATR3 CCCAATGTGAACGTTACCAAACTGTTGCCTCGGCGGGGTCACGCCCCGGG AJ230660-T.atroviride.BBA CCCAATGTGAACGTTACCAAACTGTTGCCTCGGCGGGGTCACGCCCCGGG AJ223773-T.viride.TVAJ3773 CCCAATGTGAACGTTACCAAACTGTTGCCTCGGCGGGGTCACGCCCCGGG AJ224020-T.harzianum.THAJ4020 CCCAATGTGAACGTTACCAAACTGTTGCCTCGGCGGGGTCACGCCCCGGG AJ849895-T.asperellum.RRLF-20 CCCAATGTGAACGTTACCAAACTGTTGCCTCGGCGGGGTCACGCCCCGGG DQ109530-T.hamatum.GJS CCCAATGTGAACGTTACCAAACTGTTGCCTCGGCGGGGTCACGCCCCGGG AJ507086-T.hamatum.MA CCCAATGTGAACGTTACCAAACTGTTGCCTCGGCGGGGTCACGCCCCGGG T4-ITS5 CCCAATGTGAACGTTACCAAACTGTTGCCTCGGCGGGGTCACGCCCCGGG ************ ************************************ 45 DQ315455-T.viride.GJS90-95 TGCGTCGCAGCCCCGGAACCAGGCGCCCGCCGGAGGGACCAACCAAACTC AY857218-T.asperellum.TUB TGCGTCGCAGCCCCGGAACCAGGCGCCCGCCGGAGGAACCAACCAAACTC X93981-T.viride.TVRRNATR3 TGCGTCGCAGCCCCGGAACCAGGCGCCCGCCGGAGGAACCAACCAAACTC AJ230660-T.atroviride.BBA TGCGTCGCAGCCCCGGAACCAGGCGCCCGCCGGAGGAACCAACCAAACTC AJ223773-T.viride.TVAJ3773 TGCGTCGCAGCCCCGGAACCAGGCGCCCGCCGGAGGAACCAACCAAACTC AJ224020-T.harzianum.THAJ4020 TGCGTCGCAGCCCCGGAACCAGGCGCCCGCCGGAGGAACCAACCAAACTC AJ849895-T.asperellum.RRLF-20 TGCGTCGCAGCCCCGGAACCAGGCGCCCGCCGGAGGAACCAACCAAACTC DQ109530-T.hamatum.GJS TGCGTAAAAGCCCCGGAACCAGGCGCCCGCCGGAGGAACCAACCAAACTC AJ507086-T.hamatum.MA TGCGTAAAAGCCCCGGAACCAGGCGCCCGCCGGAGGAACCAACCAAACTC T4-ITS5 TGCGTCGCAGCCCCGGAACCAGGCGCCCGCCGGAGGAACCAACCAAACTC ***** **************************** ************* DQ315455-T.viride.GJS90-95 TTTCTGTAGTCCCCTCGCGGACGTTATTTCTTACAGCTCTGAGCAAAAAT AY857218-T.asperellum.TUB TTTCTGTAGTCCCCTCGCGGACGT-ATTTCTTACAGCTCTGAGCAAAAAT X93981-T.viride.TVRRNATR3 TTTCTGTAGTCCCCTCGCGGACGTATTTCTTTACAGCTCTGAGCAAAAAT AJ230660-T.atroviride.BBA TTTCTGTAGTCCCCTCGCGGACGTATTTCTTTACAGCTCTGAGCAAAAAT AJ223773-T.viride.TVAJ3773 TTTCTGTAGTCCCCTCGCGGACGTATTTCTTTACAGCTCTGAGCAAAAAT AJ224020-T.harzianum.THAJ4020 TTTCTGTAGTCCCCTCGCGGACGT-ATTTCTTACAGCTCTGAGCAAAAAT AJ849895-T.asperellum.RRLF-20 TTTCTGTAGTCCCCTCGCGGACGT-ATTTCTTACAGCTCTGAGCAAAAAT DQ109530-T.hamatum.GJS TTTCTGTAGTCCCCTCGCGGACGT-ATTTCTTACAGCTCTGAGCAAAAAT AJ507086-T.hamatum.MA TTTCTGTAGTCCCCTCGCGGACGT-ATTTCTTACAGCTCTGAGCAAAAAT T4-ITS5 TTTCTGTAGTCCCCTCGCGGACGT-ATTTCTTACAGCTCTGAGCAAAAAT ************************ ** ******************** DQ315455-T.viride.GJS90-95 TCAAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGA AY857218-T.asperellum.TUB TCAAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGA X93981-T.viride.TVRRNATR3 TCAAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGA AJ230660-T.atroviride.BBA TCAAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGA AJ223773-T.viride.TVAJ3773 TCAAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGA AJ224020-T.harzianum.THAJ4020 TCAAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGA AJ849895-T.asperellum.RRLF-20 TCAAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGA DQ109530-T.hamatum.GJS TCAAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGA AJ507086-T.hamatum.MA TCAAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGA T4-ITS5 TCAAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGA ************************************************** DQ315455-T.viride.GJS90-95 TGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCA-GT AY857218-T.asperellum.TUB TGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCA-GT X93981-T.viride.TVRRNATR3 TGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCA-GT AJ230660-T.atroviride.BBA TGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCA-GT AJ223773-T.viride.TVAJ3773 TGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCA-GT AJ224020-T.harzianum.THAJ4020 TGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCA-GT AJ849895-T.asperellum.RRLF-20 TGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCA-GT DQ109530-T.hamatum.GJS TGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCA-GT AJ507086-T.hamatum.MA TGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCA-GT T4-ITS5 TGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCATGT *********************************************** ** DQ315455-T.viride.GJS90-95 GAATCATCG-AATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGG AY857218-T.asperellum.TUB GAATCATCG-AATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGG X93981-T.viride.TVRRNATR3 GAATCATCG-AATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGG AJ230660-T.atroviride.BBA GAATCATCG-AATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGG AJ223773-T.viride.TVAJ3773 GAATCATCG-AATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGG AJ224020-T.harzianum.THAJ4020 GAATCATCG-AATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGG AJ849895-T.asperellum.RRLF-20 GAATCATCG-AATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGG DQ109530-T.hamatum.GJS GAATCATCG-AATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGG AJ507086-T.hamatum.MA GAATCATCG-AATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGG T4-ITS5 GAATCATCATAATCATTGAACGCACGTTGCGCCCGTCAATACACTGACTG ******** **** ********** ********* ** ** *** * * DQ315455-T.viride.GJS90-95 GCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCAACCCTCGAACCCCTCCGGGGGGTCG AY857218-T.asperellum.TUB GCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCAACCCTCGAACCCCTCCGGGGGATCG X93981-T.viride.TVRRNATR3 GCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCAACCCTCGAACCCCTCCGGGGGATCG AJ230660-T.atroviride.BBA GCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCAACCCTCGAACCCCTCCGGGGGATCG AJ223773-T.viride.TVAJ3773 GCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCAACCCTCGAACCCCTCCGGGGGATCG AJ224020-T.harzianum.THAJ4020 GCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCAACCCTCGAACCCCTCCGGGGGATCG AJ849895-T.asperellum.RRLF-20 GCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCAACCCTCGAACCCCTCCGGGGGATCG DQ109530-T.hamatum.GJS GCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCAACCCTCGAACCCCTCCGGGGGATCG AJ507086-T.hamatum.MA GCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCAACCCTCGAACCCCTCCGGGGGATCG T4-ITS5 GCTTGCCTGTCCTACCGACTTTACTACCCTCACATCTTTCCCCTGGAACG ** ********* * ** * ** * ****** * * *** ** ** 46 DQ315455-T.viride.GJS90-95 GCGTTGGGGACTTCGGGAACCCCTAAGACGGGATCCCGGCCCCTAAATAC AY857218-T.asperellum.TUB GCGTTGGGGA--TCGGGACCCCTCACAC--GGGTGCCGGCCCCTAAATAC X93981-T.viride.TVRRNATR3 GCGTTGGGGA--TCGGGACCCCTCACAC--GGGTGCCGGCCCCTAAATAC AJ230660-T.atroviride.BBA GCGTTGGGGA--TCGGGACCCCTCACAC--GGGTGCCGGCCCCTAAATAC AJ223773-T.viride.TVAJ3773 GCGTTGGGGA--TCGGGACCCCTCACAC--GGGTGCCGGCCCCTAAATAC AJ224020-T.harzianum.THAJ4020 GCGTTGGGGA--TCGGGACCCCTCACAC--GGGTGCCGGCCCCTAAATAC AJ849895-T.asperellum.RRLF-20 GCGTTGGGGA--TCGGGACCCCTCACAC--GGGTGCCGGCCCCGAAATAC DQ109530-T.hamatum.GJS GCGTTGGGGA--TCGGGACCCCTCACC---GGGTGCCGGCCCTGAAATAC AJ507086-T.hamatum.MA GCGTTGGGGA--TCGGGACCCCTCACC---GGGTGCCGGCCCTGAAATAC T4-ITS5 GTGGCGGAAA--CCGAGACCCCACATGC--GAATTCTTTTTCTTACATCC * * ** * ** ** *** * * * * * * ** * DQ315455-T.viride.GJS90-95 AGTGGCGGTCTCGCCGCAGCCTCTCCTGCGCAGTAGT-TTGCACAACTCG AY857218-T.asperellum.TUB AGTGGCGGTCTCGCCGCAGCCTCTCCTGCGCAGTAGT-TTGCACAACTCG X93981-T.viride.TVRRNATR3 AGTGGCGGTCTCGCCGCAGCCTCTCCTGCGCAGTAGT-TTGCACAACTCG AJ230660-T.atroviride.BBA AGTGGCGGTCTCGCCGCAGCCTCTCCTGCGCAGTAGT-TTGCACAACTCG AJ223773-T.viride.TVAJ3773 AGTGGCGGTCTCGCCGCAGCCTCTCCTGCGCAGTAGT-TTGCACAACTCG AJ224020-T.harzianum.THAJ4020 AGTGGCGGTCTCGCCGCAGCCTCTCCTGCGCAGTAGT-TTGCACAACTCG AJ849895-T.asperellum.RRLF-20 AGTGGCGGTCTCGCCGCAGCCTCTCCTGCGCAGTAGT-TTGCACAACTCG DQ109530-T.hamatum.GJS AGTGGCGGTCTCGCCGCAGCCTCTCCTGCGCAGTAGT-TTGCACAACTCG AJ507086-T.hamatum.MA AGTGGCGGTCTCGCCGCAGCCTCTCCTGCGCAGTAGT-TTGCACAACTCG T4-ITS5 GTTACCTCTTTCACCTACACCTCACAAGTAATAGAGTCTTGCAAAAGCCC * * * ** ** **** * * *** ***** ** * DQ315455-T.viride.GJS90-95 CACCGGGAGCGCGGCGCGTCCACG---TCCGTAAAACA---CCCAACTT- AY857218-T.asperellum.TUB CACCGGGAGCGCGGCGCGTCCACG---TCCGTAAAACA---CCCAACTTT X93981-T.viride.TVRRNATR3 CACCGGGAGCGCGGCGCGTCCACG---TCCGTAAAACA---CCCAACTTT AJ230660-T.atroviride.BBA CACCGGGAGCGCGGCGCGTCCACG---TCCGTAAAACA---CCCAACTTT AJ223773-T.viride.TVAJ3773 CACCGGGAGCGCGGCGCGTCCACG---TCCGTAAAACA---CCCAACTTT AJ224020-T.harzianum.THAJ4020 CACCGGGAGCGCGGCGCGTCCACG---TCCGTAAAACA---CCCAACTTT AJ849895-T.asperellum.RRLF-20 CACCGGGAGCGCGGCGCGTCCACG---TCCGTAAAACA---CCCAACTTT DQ109530-T.hamatum.GJS CACCGGGAGCGCGGCGCGTCCACG---TCCGTAAAACA---CCCAACTT- AJ507086-T.hamatum.MA CACCGGGAGCGCGGCGCGTCCACG---TCCGTAAAACA---CCCAACTT- T4-ITS5 TTCCAGTCAACTGCTGAGCCAATAAAATCTACCAACCTGTTTCCCCCCTT ** * * * * * * ** ** * ** * * DQ315455-T.viride.GJS90-95 CTGAAATGTTGACCTCGGATCAGGTAGGA--ATACCCGCTGA-ACTTAA- AY857218-T.asperellum.TUB CTGAAATGTTGACCTCGGATCAGGTAGGA--ATACCCGCTGA-ACTTAAG X93981-T.viride.TVRRNATR3 CTGAAATGTTGACCTCGGATCAGGTAGGA--ATACCCGCTGA-ACTTAAG AJ230660-T.atroviride.BBA CTGAAATGTTGACCTCGGATCAGGTAGGA--ATACCCGCTGA-ACTTAAG AJ223773-T.viride.TVAJ3773 CTGAAATGTTGACCTCGGATCAGGTAGGA--ATACCCGCTGA-ACTTAA- AJ224020-T.harzianum.THAJ4020 CTGAAATGTTGACCTCGGATCAGGTAGGA--ATACCCGCTGA-ACTTAA- AJ849895-T.asperellum.RRLF-20 CTGAAATGTTGACCTCGGATCAGGTAGGA--ATACCCGCTGA-ACTTAAG DQ109530-T.hamatum.GJS CTGAAATGTTGACCTCGGATCAGGTAGGA--ATACCCGCTGA-ACTTAAG AJ507086-T.hamatum.MA CTGAAATG------------------------------------------ T4-ITS5 CGCACATATGGGTGTTGATTGATGAATTATGATACGTGCTCATGCCCCCC * * ** DQ315455-T.viride.GJS90-95 ----------- AY857218-T.asperellum.TUB C---------- X93981-T.viride.TVRRNATR3 CATATCAATAA AJ230660-T.atroviride.BBA CATATCAATAA AJ223773-T.viride.TVAJ3773 ----------- AJ224020-T.harzianum.THAJ4020 ----------- AJ849895-T.asperellum.RRLF-20 CATATCAATAG DQ109530-T.hamatum.GJS CATATCA---- AJ507086-T.hamatum.MA ----------- T4-ITS5 CCTTTCAAATA Trình tự vùng ITS1 – 5,8S – ITS2 của dòng T4 (mẫu nấm Trichoderma harzianum -Việt Nam) so với các dòng Trichoderma trên ngân hàng gene (geneBank) cho thấy mức độ tƣơng đồng ở vùng ITS – rDNA là 98%. Kết quả so sánh vùng bảo tồn ITS – rDNA giữa các dòng nấm Trichoderma vẫn chƣa thể khẳng định chính xác T4 thuộc dòng nấm nào trong số các dòng nấm trên. 47 Vì thế, việc khuếch đại vùng Tef (vùng chức năng). Sau đó, giải mã trình tự vùng Tef1fw – Tef2rev trở nên cần thiết hơn để định danh dòng T4 (trichoderma harzianum- định danh dựa vào hình thái học, Việt Nam).  so sánh vùng tef1fw – tef2rev của dòng nấm Trichoderma (T4) với các dòng nấm Trichoderma trên ngân hàng gen (geneBank). Kết quả thể hiện qua bảng sau: Bảng 5.2 Các nguồn nấm Trichoderma trên genbank đƣợc dùng để so sánh vùng Tef Tên Trichoderma Tác giả Địa điểm T.asperellum.TUBF-106 Druzhinina T.S Úc T.asperellum.TUB Druzhinina T.S Úc T.hamatum. Zhang C.C Trung Quốc T.hamatum.T-382 Gary J. semuel Mỹ T.viride.ATCC Kulling G.M Úc So sánh trình tự nucleotide vùng tef1fw – tef2rev dòng T4 với các dòng Trichoderma trên genbank. Sử dụng phần mềm CLUSTAL. AY857292-T.asperellum.TUBF-106 GAAGTTCGAGAC---TCCCAAGTACTAT-GTCACCGTCATTGGTATGTTT AY857299-T.asperellum.TUB GAAGTTCGAGAC---TCCCAAGTACTAT-GTCACCGTCATTGGTATGTTT AY298863-T.hamatum. GAAGTTCGAGAC---TCCCAAGTACTAT-GTCACCGTCATTGGTATGTTT DQ151582-T.hamatum.T-382 GAAGTTCGAGAC---TCCCAAGTACTAT-GTCACCGTCATTGGTATGTTT AF400992-T.viride.ATCC -------------------AAGTACTAT-GTCACCGTCATTGGTATGTTT T4-Sequence_tef_ ----TTCCACCCCCTTCCCAAGTACTATAGTCACCGTCATTGGTATGTTT ********* ********************* AY857292-T.asperellum.TUBF-106 TGGA-CTCTTCTCTCTAGCTATCGACATTCCAAGTCCGCCATTCTAACAT AY857299-T.asperellum.TUB TGGA-CTCTTCTCTCTAGCTATCGACATTCCAAGTCCGCCATTCTAACAT AY298863-T.hamatum. TCAG-TCCGACTG-------GTCACTATCCCAACATCATCATGCTAACGT DQ151582-T.hamatum.T-382 TCAG-TCCGACTG-------GTCACTATCCCAACATCATCATGCTAACGT AF400992-T.viride.ATCC TCGC-TTTTCCTC-------ATTGATACTTGGAGACCAAGATTCTAACGT T4-Sequence_tef_ TGGACTCCTTCTCTCTAGCTATCGACATTCCAAGTCCGCCATTCTAACAT * ** * * * * ** ***** * AY857292-T.asperellum.TUBF-106 GCTCTTCCCACAGACGCTCCCGGTCACCGTGATTTCATCAAGAACATGAT AY857299-T.asperellum.TUB GCTCTTCCCACAGACGCTCCCGGTCACCGTGATTTCATCAAGAACATGAT AY298863-T.hamatum. GCGACTCC-ACAGACGCTCCCGGTCACCGTGATTTCATCAAGAACATGAT DQ151582-T.hamatum.T-382 GCGACTCC-ACAGACGCTCCCGGTCACCGTGATTTCATCAAGAACATGAT AF400992-T.viride.ATCC GCCGCTCT-GTAGACGCTCCCGGTCACCGTGATTTCATCAAGAACATGAT T4-Sequence_tef_ GCTCTTCCCACAGACGCTCCCGGTCACCGTGATTTCATCAAGAACATGAT ** ** *************************************** AY857292-T.asperellum.TUBF-106 CACTGGTACCTCCCAGGCTGACTGCGCTATCCTGATTATCGCTGCCGGTA AY857299-T.asperellum.TUB CACTGGTACCTCCCAGGCTGACTGCGCTATCCTGATTATCGCTGCCGGTA AY298863-T.hamatum. CACTGGTACCTCCCAGGCCGATTGCGCTATCCTCATTATCGCTGCCGGTA DQ151582-T.hamatum.T-382 CACTGGTACCTCCCAGGCCGATTGCGCTATCCTCATTATCGCTGCCGGTA AF400992-T.viride.ATCC CACTGGTACTTCCCAGGCTGACTGCGCTATCCTGATTATCGCTGCCGGTA T4-Sequence_tef_ CACTGGTACCTCCCAGGCTGACTGCGCTATCCTGATTATCGCTGCCGGTA ********* ******** ** *********** **************** 48 AY857292-T.asperellum.TUBF-106 CTGGTGAGTTCGAGGCTGGTATCTCCAAGGATGGCCAGACCCGTGAGCAC AY857299-T.asperellum.TUB CTGGTGAGTTCGAGGCTGGTATCTCCAAGGATGGCCAGACCCGTGAGCAC AY298863-T.hamatum. CTGGTGAGTTCGAGGCTGGTCTCCAAGG---------------------- DQ151582-T.hamatum.T-382 CTGGTGAGTTCGAGGCTGGTAT---------------------------- AF400992-T.viride.ATCC CTGGTGAGTTCGAGGCTGGTATCTCCAAG--------------------- T4-Sequence_tef_ CTGGTGAGTTCGAGGCTGGTCTC--CAAGGATGGCAAAGGCGAGGGGGAT ******************** * AY857292-T.asperellum.TUBF-106 GCTCTGCTCGCCTACACCCTGGGTGTCAAGCAGCTCATCGTTGCCATCAA AY857299-T.asperellum.TUB GCTCTGCTCGCC-------------------------------------- AY298863-T.hamatum. -------------------------------------------------- DQ151582-T.hamatum.T-382 -------------------------------------------------- AF400992-T.viride.ATCC -------------------------------------------------- T4-Sequence_tef_ TGTCAATGGAGTACATACGGTGTCGGGAGGTCTGTGCGGAGAGATGTAAA AY857292-T.asperellum.TUBF-106 CAAGATGGACA AY857299-T.asperellum.TUB ----------- AY298863-T.hamatum. ----------- DQ151582-T.hamatum.T-382 ----------- AF400992-T.viride.ATCC ----------- T4-Sequence_tef_ AGGGG------ Trình tự so sánh trên vùng Tef giữa các dòng Trichoderma cho thấy mức độ tƣơng đồng của dòng nấm T.asperellum.TUBF–106, T.asperellum.TUB, T.viride.ATCC là 98% , dòng T.hamatum, T.hamatum.T – 382 có mức độ tƣơng đồng là 96%, vùng Tef không tìm ra sự tƣơng đồng của dòng T4 với dòng Trichoderma harzianum trong dữ liệu geneBank . Trên cơ sở đối chiếu vùng ITS1-5,8S-ITS2 kết hợp vùng tef1fw-tef2rev . Ta xác định dòng nấm T4 là dòng Trichoderma asperellum. Qua đó cho thấy định danh bằng hình thái không chính xác vì môi trƣờng sống của các giống loài ở những điều kiện khác nhau thì hình thái cũng có sự thay đổi dần để thích nghi, tồn tại và phát triển. Cho nên, định danh phân tử hiệu quả hơn, chính xác hơn định danh bằng hình thái học các dòng nấm. Công cụ trong sinh học phân tử nhƣ: kỹ thuật khuếch đại các vùng bảo tồn giống loài và những vùng chức năng khác, các probe đánh dấu và giải trình tự sản phẩm khuếch đại cung cấp những thông tin chính xác hơn về giống loài. 4.6.2 Kết quả giải trình tự vùng ITS1 – 5,8S – ITS2  T4 là dòng Trichoderma asperellum, kết quả đọc trình tự vùng ITS-rDNA của dòng nấm T4 đƣợc 758 nucleotid, trong đó: #18S NAAAGCTATG GAGCGGAGGA TATTACGAGT TTACAACTCC CAAACCCAAT GTGAACGTTA CCA 49 #ITS1 GCAGCCCCGG AACCAGGCGC CCGCCGGAGG AACCAACCAA ACTCTTTCTG TAGTCCCCTC GCGGACGTAT TTCTTACAGC TCTGAGCAAA AATTCAAAAT GAATCAAAAC TTTCAACAAC GGATCTCTTG GTTCTGGCAT CGATGAAGAA CGCAGCGAAA TGCGATA #5.8S CATAATCATT GAACGCACGT TGCGCCCGTC AATACACTGA CTGGCTTGCC TGTCCTACCG ACTTTACTAC CCTCACATCT TTCCCCTGGA ACGGTGGCGG AAACCGAGAC CCCACATGCG AATT #ITS2 CACCTACACC TCACAAGTAA TAGAGTCTTG CAAAAGCCCT TCCAGTCAAC TGCTGAGCCA ATAAAATCTA CCAACCTGTT TCCCCCCTTC GCACATATGG GTGTTGATTG ATGAATTATG ATACGTGCTC ATGCCCCCCC CTTTCAAATA GTAAGTGTAA TAAACGACTC AACCCACCTC CGTACTATTC ATAATATA #28S GTAAGTGTAA TAAACGACTC AACCCACCTC CGTACTATTC ATAATATACA TGTGCCCCCC CCAAAGTACC CCTAAGAAAC CTTCTACTAT TTTTTCACAC AAGGCTGACA AACCTTACCT TTTTTGATTT CCCTTTAAAT CCGCCACTCC CTTACCAA  So sánh sự tƣơng đồng trình tự nucleotide trong vùng ITS-rDNA của dòng T4 (Trichoderma asperellum của Việt Nam) và dòng T.Asperellum.RRLF-20 (Úc).  So sánh vùng ITS1 cho thấy trình tự nucleoted của dòng T4 và dòng T.Asperellum.RRLF-20 (Úc) có độ tƣơng đồng 100%, không có bất kỳ sự sai khác nào trong trình tự DNA vùng ITS1. Sử dụng phần mềm CLUSTAL. ITS1-T.Asperellum.RRLF-20 ---AAACTGTTGCCTCGGCGGGGTCACGCCCCGGGTGCGTCGCAGCCCCG T4-ITS5 ACCAAACTGTTGCCTCGGCGGGGTCACGCCCCGGGTGCGTCGCAGCCCCG *********************************************** ITS1-T.Asperellum.RRLF-20 GAACCAGGCGCCCGCCGGAGGAACCAACCAAACTCTTTCTGTAGTCCCCT T4-ITS5 GAACCAGGCGCCCGCCGGAGGAACCAACCAAACTCTTTCTGTAGTCCCCT ************************************************** ITS1-T.Asperellum.RRLF-20 CGCGGACGTATTTCTTACAGCTCTGAGCAAAAATTCAAAATGAATCA--- T4-ITS5 CGCGGACGTATTTCTTACAGCTCTGAGCAAAAATTCAAAATGAATCAAAA *********************************************** ITS1-T.Asperellum.RRLF-20 ----------- T4-ITS5 CTTTCAACAAC 50  So sánh vùng 5,8S cho thấy trình tự nucleoted của dòng T4 và dòng T.Asperellum.RRLF – 20 (Úc) có 15 nucleoted sai khác trong tổng số 205 nucleoted. Độ tƣơng đồng giữa hai dòng Trichoderma này ở vùng 5,8S là 93%,. Sử dụng phần mềm CLUSTAL. T4-ITS5 TCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTC 5.8S-T.Asperellum.RRLF-20 ---ATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTC *********************************************** T4-ITS5 ATGTGAATCATCATAATCATTGAACGCACGTTGCGCCCGTCAATACACTG 5.8S-T.Asperellum.RRLF-20 A-GTGAATCATCG-AATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTG * ********** **** ********** ********* ** ** *** T4-ITS5 ACTGGCTTGCCTGTCCTACCGACTTTACTAC 5.8S-T.Asperellum.RRLF-20 GCGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTT---- * *** ********* * ** * **  So sánh vùng ITS2 cho thấy trình tự nucleoted của dòng T4 và dòng T.Asperellum.RRLF-20 (Úc) có 76 nucleoted sai khác trong tổng số 172 nucleoted. Độ tƣơng đồng giữa hai dòng Trichoderma này ở vùng ITS2 là 55%,. Sử dụng phần mềm CLUSTAL T4-ITS5 GACTTTACTACCCTCACATCTTTCCCCTGGAACGGTGGCGGAAACCGAGA ITS2-T.asperellum.RRLF-20 -------CAACCCTCGAACCCCTCCGGGGGATCGGCGTTGGGGATCGGGA * ****** * * *** *** *** * ** * ** ** T4-ITS5 CCCCACATGCGAATTCTTTTTCTTACATCCGTTACCTCTTTCACCTACAC ITS2-T.asperellum.RRLF-20 CCCCTCACACGGGTGCCGGCCCCGAAATACAGTGGCGGTCTCGCCGCAGC **** ** ** * * * * ** * * * * ** ** * T4-ITS5 CTCACAAGTAATAGAGTCTTGCAAAAGCCCTTCCAGTCAACTGCTGAGCC ITS2-T.asperellum.RRLF-20 CTCTCCTGCG-CAGTAGTTTGCACAACTCGCACCGGGAGCGCGGCGCGTC *** * * ** ***** ** * ** * * * * * T4-ITS5 AATAAAATCTACCAACCTGTTTCCCCCCTTCGCACATATGG ITS2-T.asperellum.RRLF-20 CACG---TCCGTAAAAC---ACCCAACTTTCTGAAATG--- * ** ** * ** * *** * ** Kết quả so sánh giữa các vùng cho thấy mức độ tƣơng đồng của vùng ITS1 là 100% , vùng ITS2 cho thấy sự sai khác rất nhiều dù xét trên cả vùng rITS – rDNA trình tự nucleoted có sự tƣơng đồng là 98%. Qua đó cho thấy vùng ITS2 có sự biến đổi nhiều nhất trong vùng ITS – rDNA. 4.6.3 Kết quả giải trình tự vùng Tef1fw – Tef2rev của dòng T4 TTCCACCCCCTTCCCAAGTACTATAGTCACCGTCATTGGTATGTTTTGGACTCCTTCTCTCTAGCTATCGACATTCCAAG TCCGCCATTCTAACATGCTCTTCCCACAGACGCTCCCGGTCACCGTGATTTCATCAAGAACATGATCACTGGTACCTCCC AGGCTGACTGCGCTATCCTGATTATCGCTGCCGGTACTGGTGAGTTCGAGGCTGGTCTCCAAGGATGGCAAAGGCGAGGG GGATTGTCAATGGAGTACATACGGTGTCGGGAGGTCTGTGCGGAGAGATGTAAAAGGGG 51 PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận  Phục hồi các dòng nấm Trichoderma và từ đó tiến hành nhân sinh khối ly trích các dòng nấm qua các bƣớc khác nhau và sử dụng các loại hoá chất cũng nhƣ tác nhân cơ học để nghiền mịn sợi nấm thu DNA tổng số.  Tiến hành khuếch đại vùng gene rDNA-ITS và Tef với 2 cặp primer: ITS1- ITS2 thu đƣợc sản phẩm khuếch đại có kích thƣớc 670 bp (căn cứ trên thang ladder), tƣơng tự nhƣ trên đối với cặp primer: ElongR, ElongF thu đƣợc sản phẩm khuếch đại có kích thƣớc 260 bp (căn cứ trên thang ladder) trên 4 dòng Trichoderma của Việt Nam và 1 dòng đối chứng của nƣớc ngoài Trichoderma harzianum.  Tiến hành đọc trình tự vùng ITS1 – 5,8S – ITS2 và vùng Tef của dòng Trichoderma harzianum (T4)  So sánh trình tự DNA vùng ITS1 – 5,8S – ITS2 giữa dòng Trichoderma nghiên cứu với cơ sở dữ liệu NCBI và dựa vào phần mềm CLUSTALX chƣa khẳng định T4 là T.harzianum hay T. asperellum .  Qua đó cho thấy, định danh bằng hình thái không chính xác, trình tự DNA vùng ITS1 – 5,8S – ITS2 đối chiếu trên cơ sở dữ liệu NBCI cũng chƣa thật sự đáng tin cậy khi mà chỉ dựa trên mỗi trình tự vùng ITS1 – 5,8S – ITS2 (vùng bảo tồn của sinh vật). Do đó phải phân tích thêm trình tự DNA vùng Tef (vùng có chức năng chuyên biệt và đặc trƣng cho từng loài).  So sánh kết quả đọc trình tự các vùng ITS1 – 5,8S – ITS2 kết hợp vùng Tef  Định danh T4: Trichoderma asperellum.  Kích thƣớc của vùng ITS1 – 5,8S – ITS2 là 54 5bp.  Kích thƣớc vùng Tef là 223bp.  Trình tự nucleoted ở vùng ITS1 – 5,8S – ITS2 của dòng Trichoderma asperellum (T4) của Việt Nam so với dòng Trichoderma asperellum có mức độ tƣơng đồng là 98%. 52  Trình tự nucleoted ở vùng Tef1fw – Tef2rev của dòng Trichoderma asperellum (T4) của Việt Nam so với dòng Trichoderma asperellum có mức độ tƣơng đồng 98%. 5.2 Đề nghị  Tiếp tục tìm kiếm thêm những dòng Trichoderma hoang dại từ tự nhiên.  Nghiên cứu khả năng đối kháng cao và những điều kiện phát triển tối ƣu.  Đƣa những các dòng Trichoderma. spp nghiên cứu ở mức độ phân tử: vùng bảo tồn của các dòng nấm ITS1 – 5,8S – ITS2, và những vùng chức năng khác. Từ đó phục vụ cho những nghiên cứu chuyên sâu . 5.3 Hạn chế đề tài  Chƣa tìm ra mối liên hệ giữa khả năng kháng bệnh của nấm với trình tự vùng rDNA- ITS và vùng Tef.  Chƣa so sánh đƣợc trình tự vùng rDNA-ITS giữa các dòng Trichoderma đƣợc phân lập từ những địa điểm khác nhau ở Việt Nam.  Chƣa xác định trình tự DNA biểu hiện tính độc của nấm Trichoderma với sâu bệnh hại trồng.  Chƣa xác định trình tự vùng chức năng kiểm soát sinh học của Trichoderma với sâu bệnh hại trồng, và sự thay đổi trình tự của từng dòng ảnh hƣởng lên mức độ kháng lại sâu bệnh. 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT 1. Di truyền phân tử (TS Nguyễn Thị Lang- GSTS Bùi Chí Bữu,2004). Nhà xuất bản Nông nghiệp TPHCM. 2. Sinh học phân tử – giới thiệu phƣơng pháp và ứng dụng ( Nguyễn Thị Lang- Bùi Chí Bửu,2005). Nhà xuất bản Nông nghiệp TPHCM. 3. Sinh học phân tử (Hồ Huỳnh Thuỳ Dƣơng- chuyên ngành Sinh học phân tử – Khoa Sinh - Đại học Khoa học Tự Nhiên thuộc Đại học Quốc gia TPHCM). Nhà xuất bản giáo dục 4. Giáo trình Sinh học phân tử 2002 ( Bùi Trang Việt – Khoa Sinh - Đại học Khoa học Tự Nhiên thuộc Đại học Quốc gia TPHCM). 5. Cơ sở di truyền phân tử và kỹ thuật gen (Khuất Bửu Thanh,2003). Nhà xuất bản Khoa học và kỹ thuật. 6. Nhóm nấm Hyphomytes ở Việt Nam. Tập I (Bùi Xuân Đồng, 1982). Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội. 7. Nguyễn Ngọc Tú - Nguyễn Cửu Thị Hƣơng Giang, 1997. Bảo vệ cây trồng bằng các chế phẩm từ vi nấm. Nhà xuất bản Nông nghiệp, TPHCM. 8. Nguyễn Xuân Thành. 2003. Giáo trình công nghệ vi sinh vật trong sản xuất nông nghiệp và xử lý ô nhiễm môi trƣờng. Nhà xuất bản nông nghiệp Hà Nội. Việt Nam. 9. Nguyễn Văn Tuất – Lê Văn Thuyết. 2001. Sản xuất chế biến và sử dụngthuốc bảo vệ thực vật thảo mộc và sinh học. Nhà xuất bản Nông Nghiệp. TIẾNG NƢỚC NGOÀI 10. Papavizas, 1985. Trichoderma and Gliocladium: Biology, ecology, and potential for biocontrol. Ann. Rev. Phytopath. 23: 23-54. 54 11. Gary J. Samuels. Trichoderma aguide to identification and biology. RM. United States Department of Agriculture Agricultural Research Service Systematic Botany and Mycology Laboratory 304, B-011A Beltsville, MD 20705-2350 USA. 12. Gary J. Samuels, 9-2005. Trichoderma: Systematic, the Sexual State, and Ecology. United States Department of Agriculture Agricultural Research Service Systematic Botany and Mycology Laboratory 304, B-011A Beltsville, MD 20705. Acepted for publication. 13. Kerstin Voigt, Johannes Wostemeyer, 2001. Phylogeny and origin of 82 Zygomycetes from all genera of the Mucorales and Mortierellales based on combined analysis of actin and translation elongation factor EF-1 genes. 14. Chirstian P. Kubicek - et.al, 2002. Genetic and metabolic diversity of Trichoderma: a case study on South-East Asian isolation. 15. Pricila Chaverri, Lisa A. Castlebury, Gary J. Samuels, David M.Geiser ,2002. Multilocus phylogenetic structure within the Trichodrma harzianum/ Hypocrea lixii complex. TRANG WEB 16. Trichoderma spp, including T. harzianum, T. viride, T. koningii, T. hamatum and other spp.Deuteromycetes, Moniliales, 2000 (Gary. E. Harman Cornell University, Geneva, NY 14456) 17. (Gary. J. Semuels). 55 PHỤ LỤC Cách pha và tác dụng của các hoá chất dùng trong quá trình ly trích DNA từ nấm: - Tris-HCl 1M (C4H12ClNO3 , M=157,60g/ml): Cách pha: Dùng 39,4g bột Tris – HCl 1M pha với 200ml nƣớc cất 2 lần và vô trùng. Chỉnh pH đạt 8,0 sau đó hấp trong nồi Autoclave ở 1210C trong 20 phút trƣớc khi dùng. Tác dụng: Tris- HCl 1M là dung dịch đệm, bảo quản môi trƣờng ly trích mẫu là 8,0 vì ở pH này DNA ổn định. Nếu trong môi trƣờng acid, các acid nucleotid rất dễ bị loại thải và cầu nối phosphodieste dễ bị phá vỡ thì cấu trúc DNA không bền vững. - EDTA 0,5M(C10H14N2Na2O3, M=372,54g/ml) Cách pha : Dùng 37,244g bột EDTA pha với với 200ml nƣớc cất 2 lần và vô trùng. Chỉnh pH đạt 8,0 sau đó hấp trong nồi Autoclave ở 1210C trong 20 phút trƣớc khi dùng. Tác dụng:EDTA gắn nối các ion có hoá trị II ( nhƣ Mg2+, Ca2+) có trong dịch trích mẫu, ngăn chặn sự hoạt động của các enzyme phân huỷ DNA, vì các enzyme này hoạt động rất mạnh nếu có mặt của các ion hoá trị II nhất là sự có mặt của Mg2+ - Mercaptro ethanol: Có tác dụng bảo vệ DNA. - Phenol: Có tác dụng phá vỡ hoàn toàn lớp vỏ tế bào và màng nhân, làm biến tính protein, ngoài ra phenol còn có tác dụng tách lớp sau khi ly tâm. - Chloroform: Làm biến tính protein và các sắc tố có sẵn trong mẫu, ngoài ra chloroform còn có tác dụng tách lớp sau khi ly tâm, DNA đƣợc giải phóng tồn tại trong pha nƣớc nằm ở lớp trên. - Isoamyl Alcohol: Giúp mẫu không bị sủi bọt trong quá trình vortex hay ly tâm với tốc độ cao. - Isopropanol: Giúp tủa DNA. - TE: Dung dịch bảo quản DNA. 56 Kết quả đọc trình tự vùng ITS – rDNA dòng T4, kết quả đọc đƣợc mạch DNA bắt cặp với primer ITS4 57 58 59 60 Kết quả đọc trình tự vùng ITS – rDNA dòng T4, kết quả đọc đƣợc mạch DNA bắt cặp với primer ITS5 61 62 63 64 Kết quả đọc trình tự vùng Tef1fw – Tef2rev dòng T4, kết quả đọc đƣợc mạch DNA bắt cặp với primer ElongF 65 Kết quả đọc trình tự vùng Tef1fw – Tef2rev dòng T4, kết quả đọc đƣợc mạch DNA bắt cặp với primer ElongR