Luận văn Dùng cột sắc ký ái lực miễn dịch và huỳnh quang kế định lượng Ochratoxin a

arch on Cancer Cơ quan quốc tế nghiên cứu về ung thư LD50 Lethal Dose 50, liều gây chết 50 % OTA Ochratoxin A OD Optical density, mật độ quang đo ppm Part per million (μg/g) ppb Part per billion (ng/g) SD Standard deviation, độ lệch chuẩn TLC Thin Layer Chromatography, sắc ký lớp mỏng UV Ultra Violet, bức xạ tử ngoại IgGOTA Kháng thể kháng OTA ix DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Trang Bảng 2.1 Một số độc tố nấm mốc .................................................................................. 4 Bảng 2.2 Một số độc tố nấm mốc trong nông sản ........................................................ 4 Bảng 2.3 Ảnh hưởng độc tố nấm mốc đối với các cơ quan trong cơ thể ...................... 5 Bảng 2.4 Cơ quan đích của một số nấm mốc ................................................................ 5 Bảng 2.5 Độc tính của OTA đối với động vật thí nghiệm ............................................ 8 Bảng 2.6 Tình hìnhnhiễm OTA trong máu người ......................................................... 9 Bảng 3.1 Mối tương quan giữa lượng OTA trong dịch đẩy chuẩn và dịch đẩy thay thế. .................................................................................................. 20 Bảng 3.2 Bố trí thí nghiệm dựng đường chuẩn OTA ................................................... 21 Bảng 3.3 Bố trí thí nghiệm khảo sát hiệu suất thu hồi OTA của cột IAC đối với mẫu trắng ................................................................................................................... 23 Bảng 3.4 Bố trí thí nghiệm khảo sát hiệu suất thu hồi OTA của cột IAC đối với mẫu tự tạo ................................................................................................ 24 Bảng 3.5 Bố trí thí nghiệm khảo sát tình hình nhiễm OTA của một số mẫu trên thị trường ................................................................................................ 24 Bảng 4.1 Mối tương quan giữa lượng OTA trong dịch đẩy chuẩn và dịch đẩy thay thế .......................................................................................................... 25 Bảng 4.2 Kết quả dựng đường chuẩn OTA .................................................................. 27 Bảng 4.3 Hiệu suất thu hồi của cột IAC đối với mẫu trắng ......................................... 28 Bảng 4.4 Hiệu suất thu hồi của cột IAC đối với mẫu tự tạo ........................................ 29 Bảng 4.5 Tình hình nhiễm OTA của một số mẫu thực phẩm trên thị trường .............. 30 x DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ HÌNH TRANG Hình 2.1 Khuẩn lạc A. ochraceus trong môi trường MA 250C .................................... 6 Hình 2.2 Bào tử A. ochraceus ........................................................................................ 6 Hình 2.3 Khuẩn lạc P. verrucosum trên môi trường CYA ở 250C ............................... 7 Hình 2.4 Cấu tạo OTA ................................................................................................... 7 Hình 2.5 Nguyên tắc họat động của cột IAC .............................................................. 13 Hình 3.1 Sơ đồ hoạt động của máy quang phổ tử ngoại ............................................ 17 Hình 3.2 Sơ đồ hoạt động của huỳnh quang kế ........................................................... 18 Hình 4.1 Cột IAC ....................................................................................................... 25 BIỂU ĐỒ TRANG Biểu đồ 2.1 Tình hình nhiễm OTA trong cà phê hạt ..................................................... 9 Biểu đồ 4.1 Mối tương quan giữa lượng OTA trong dịch đẩy chuẩn và dịch đẩy thay thế .................................................................................................... 26 Biểu đồ 4.2 Đường chuẩn OTA .................................................................................... 27 Biểu đồ 4.3 Hiệu suất thu hồi của cột IAC đối với mẫu trắng ..................................... 28 Biểu đồ 4.4 Hiệu suất thu hồi của cột IAC đối với mẫu bia......................................... 29 1 Chƣơng 1. MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Sự hiện diện của vi sinh vật nói chung và nấm mốc nói riêng là một trong những rào cản kinh tế đối với việc xuất khẩu thực phẩm của nước ta. Trong tình hình phát triển kinh tế theo hướng hội nhập như hiện nay, công tác kiểm tra chất lượng thực phẩm cần phải được chú trọng. Với khí hậu nhiệt đới nóng ẩm, Việt Nam là nước thích hợp cho sự sinh sản và phát triển của nấm mốc. Do đó nấm mốc có mặt khắp mọi nơi: đất, nước, không khí, nguyên vật liệu, lương thực, thực phẩm…Cùng với việc bảo quản chưa tốt, các loại thực phẩm như: bia, cà phê, ngũ cốc dễ dàng bị nhiễm nấm mốc và sinh độc tố. Ochratoxin là một trong những độc tố nguy hiểm. Ngộ độc cấp tính do ăn phải thức ăn có nồng độ ochratoxin cao dẫn đến co giật, nôn, mệt lã, tê liệt và có thể gây tử vong. Dài hạn ochratoxin còn gây, viêm thận, ung thư, sẩy thai. Vì vậy công tác định lượng và định tính ochratoxin là rất cần thiết. Quy trình phân tích ochratoxin bằng các phương pháp như: sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký lỏng cao áp (HPLC) thường phải qua nhiều giai đoạn chiết xuất, làm sạch, cô đặc, dễ bị sai số do phải qua nhiều thao tác, tăng thất thoát trong các công đoạn. Trước những khó khăn trên, sắc ký ái lực miễn dịch (Immuno Affinity Chromatography – IAC) ra đời, sử dụng trong công đoạn vừa tinh sạch vừa cô đặc độc tố, dựa trên nguyên lý gắn kết đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể, tạo khả năng chọn lọc cao mà các phương pháp khác không có được, quy trình chiết và tinh chế ochratoxin của phương pháp IAC lại đơn giản đã đáp ứng được nhu cầu về độ tin cậy cao trong các kết quả phân tích. Từ những cơ sở trên, phòng Miễn Dịch – Viện Pasteur Tp. Hồ Chí Minh đã tiến hành thực hiện đề tài “ Sản xuất giá ái lực miễn dịch bắt ochratoxin A ”. Cột sắc ký ái lực tạo nên đã cho hiệu quả cao trong phân tích định lượng ochratoxin A. Được sự đồng ý của Bộ môn CNSH, trường Đại Học Nông Lâm TPHCM, dưới sự hướng dẫn của PGS. TSKH. Nguyễn Lê Trang, TS. Nguyễn Ngọc Hải, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài: “Dùng cột sắc ký ái lực miễn dịch và huỳnh quang kế định lƣợng ochratoxin A”. 1.2 Mục đích của đề tài 2 Tạo cột sắt ký ái lực bắt ochratoxin. Xác định các điều kiện tối ưu trong việc dùng cột sắc ký ái lực miễn dịch và huỳnh quang kế trong định lượng ochratoxin A (OTA). 1.3 Nội dung thực hiện Tạo giá ái lực bắt ochratoxin A trên cơ sở đã có kháng thể kháng OTA. Tiến hành xác định hiệu suất thu hồi của cột IAC đối với OTA trong mẫu trắng và mẫu tự tạo. Đánh giá tình hình nhiễm OTA của một số mẫu thực phẩm trên thị trường. 3 Chƣơng 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Nấm mốc Nấm mốc phân bố rộng rãi trong tự nhiên (đất, nước, không khí, nguyên vật liệu, lương thực, thực phẩm…). Nấm mốc là loài vi nấm sống ký sinh hay hoại sinh trên nhiều cơ chất khác nhau, đặc biệt là chất hữu cơ. Nấm mốc phát triển rất nhanh nhất là khi gặp khí hậu nóng ẩm. Điều kiện tối ưu cho nấm mốc phát triển có ẩm độ trên 80%, nhiệt độ: 20 – 300C. Sự phát triển của nấm mốc còn phụ thuộc vào ánh sáng, cơ chất dinh dưỡng, pH, hàm lượng O2 , ngoài ra có tác động tương hỗ của nhiều loài có mặt trên cùng cơ chất. Nấm mốc sống nhờ vào hệ sợi bám vào chất hữu cơ, gọi là khuẩn ty. Một số khuẩn ty ăn sâu vào cơ chất gọi là khuẩn ty dinh dưỡng hay khuẩn ty cơ chất, một số mọc ra bề ngoài gọi là khuẩn ty khí sinh. Những khuẩn ty khí sinh là những lông tơ màu trắng, mọc thành lớp sợi mềm, sẽ có một số sợi phát triển thành cơ quan đặc biệt mang bào tử. Có hai hình thức sinh sản ở nấm mốc: Sinh sản vô tính: tự tế bào hoặc sợi nấm phân chia. Cách thông thường nhất là tạo thành bào tử: bào tử kín, bào tử trần. Sinh sản hữu tính: hai đầu sợi nấm tiếp hợp với nhau. Trong tự nhiên, nấm mốc tham gia tích cực vào vòng tuần hoàn vật chất, nhất là quá trình phân giải chất hữu cơ và hình thành chất mùn. Nấm mốc giữ vai trò quan trọng trong công nghiệp lên men sản xuất enzyme, kháng sinh, vitamin, acid amin và trong công nghệ thực phẩm: tương, chao… Bên cạnh đó, nấm mốc cũng là nguyên nhân gây nên những bệnh khá phổ biến và khó điều trị ở người (hắc lào, nấm vảy rồng, nấm kẻ chân…). Đặc biệt những loài tiết ra độc tố gây ngộ độc và quan trọng hơn gây viêm thận, ung thư, sẩy thai (Bảng 2.1, trang 4). 2.2 Độc tố nấm mốc Trong điều kiện thích hợp về nhiệt độ, ẩm độ môi trường, hàm lượng nước trong vật chất, phương thức bảo quản đã tạo điều kiện để nấm mốc phát triển, sinh sản và sinh ra độc tố. Độc tố nấm mốc là sản phẩm thứ cấp do nấm mốc sinh ra, là những hợp chất có khối lượng phân tử thấp, khó bị phân hủy khi chế biến, gây độc cho người 4 ở nồng độ cực thấp (ppb). Cho đến nay người ta phát hiện trên 300 độc tố nấm mốc trong đó có khoảng 20 chất có độc lực cao thường hay gây nguy hiểm cho người và vật nuôi. Chủ yếu sinh ra bởi 4 giống Aspergillus, Pennicillin, Fusarium, Claviceps [5]. Bảng 2.1: Một số độc tố nấm mốc [ 14 ] Độc tố nấm mốc Loài nấm mốc Aflatoxins Aspergillus flavus và A. parasiticus Ochratoxins A. ochraceus, A. alliaceus, A. niger aggregate, A. carbonarius, Penicillium verrucosum, Penicillium nordicum. Trichothecenes Fusarium species; Trichothecium roseum Zearalenone F. culmorum Fumonisins F. verticillioides, F. proliferatum Patulin P. expansum Theo số liệu của tổ chức Nông nghiệp và Lương thực của Liên Hiệp Quốc (FAO, 1974), lương thực thực phẩm trên thế giới hư hao khoảng 20%, trong đó một nửa là do nấm mốc gây ra. Ngoài ra còn tổn thất khác mà chưa tính toán được do độc tố nấm mốc nhiễm vào nông sản gây ảnh hưởng sức khỏe người và gia súc. Bảng 2.2: Một số độc tố nấm mốc trong nông sản [5]. Độc tố Ngô Gạo Lúa mì Aflatoxins + + Cinitrin + + + Ochratoxins + + + Sterigmatocystin + + Zearalenone + + T – 2 toxin + + Nivalenon + + Diacetocyscirpenol (DAS) + + Một độc tố nấm ít gây ảnh hưởng nhưng khi kết hợp các nhóm khác thì trở nên trầm trọng. Do một số độc tố có khả năng kết hợp hoặc có thể gây phản ứng hóa học với các phân tử trong cơ thể, đặc biệt khi được gắn đồng trị vào các phân tử có chức năng quan trọng và tồn tại lâu trong cơ thể (protein, DHA). 5 Bảng 2.3: Ảnh hƣởng độc tố nấm mốc đối với các cơ quan trong cơ thể [5]. Đối với cơ quan nội tạng Độc tố tác động Gây ung thư gan Aflatoxins, Patulin, Sterigmatocystin, Lutroskyrin Độc với gan Aflatoxins, Ochratoxins, Rubratoxin, Lutroskyrin Độ với thận Ochratoxins, Cinitrin Độc với cơ quan sinh dục Zearalenone Độc với thần kinh Esgotamin,Citroviridin Độc với da và niêm mạc T – 2 toxin, Nivalenol, Diacetocyscirpenol Con người bị đe dọa bởi các độc tố nấm theo 2 cách, thứ nhất là tiêu thụ trực tiếp các nguyên liệu bị nhiễm nấm sinh độc tố, thứ hai thông qua thịt sữa, trứng của động vật ăn phải thức ăn bị nhiễm khuẩn lạc nấm, con người hấp thu độc tố này, đặc biệt là gan, thận là nơi độc tố nấm được lưu giữ trong thời gian giải độc và đào thải . Ngộ độc cấp tính do ăn phải thức ăn có nồng độ độc tố cao dẫn đến co giật, nôn, mệt lã, tê liệt và có thể gây tử vong. Nếu ở nồng độ thấp thì độc tố được chuyển hóa bởi các enzyme ở gan, thận, các cơ quan thuộc hệ tiêu hóa và được tích lũy trong mô bào, nội tạng, trứng, sữa… đây là nguyên nhân gây nhiễm độc ở người. Tác động lâu dài của độc tố gây đột biến, ung thư, dị tật thai… Bảng 2.4: Cơ quan đích của một số nấm mốc [5]. Độc tố Gan Thận Hệ thần kinh Hạch nội tiết Da Aflatoxins + + + + Cinitrin + + Ochratoxins + + + Trichothecenes + + Zearalenone + + + 2.3 Độc tố ochratoxin A 2.3.1 Giới thiệu độc tố Ochratoxin là độc tố gây tác hại vào các cơ quan quan trọng của cơ thể: thần kinh, gan và thận, hệ miễn dịch gây hậu quả nghiêm trọng đối với người và động vật nuôi. Là độc tố có tác hại nghiêm trọng đến sức khỏe con người. 6 Trong nhóm ochratoxin thì ochratoxin A (OTA) là chất độc nhất. OTA là tác nhân gây biến đổi steroid như progesterol. Được phát hiện đầu tiên bởi Scott, VanderMerve và ctv (1965) [4]. Cơ quan quốc tế nghiên cứu về ung thư (International Agency for Research on Cancer – IARC) phân loại OTA thuộc nhóm dương tính đối với ung thư (nhóm 2B) [11]. Ochratoxin được tìm thấy nhiều ở ngũ cốc, rau củ, cà phê, trái cây khô, sản phẩm sữa, rượu, bia… 2.3.2 Các loài nấm mốc sinh Ochratoxin Ochratoxin là độc tố vi nấm được sản sinh bởi một số loài nấm thuộc giống Aspergillus và Penicillium. Qua phân lập và định danh hệ nấm mốc trong cà phê nhân Robusta cho thấy hệ nấm mốc phát triển khá phong phú và đa dạng gồm 15 loài thuộc giống Aspergillus và Penicillium, trong đó A. ochraceus và P. verrucosum là hai loài nấm mốc chủ yếu sinh ra ochratoxin, những loài thuộc A. ochraceus nhiễm với tần suất 7 – 25% [6]. Ngoài ra, nhiều loài có thể tạo ochratoxin như: A. alliaceus, A. ostianus, A. carbonarius, A. melleus, Penicillium nordicum… A. ochraceus Khuẩn ty có vách ngăn, các bào tử đính xòe ra như những bông cúc và mang màu sắc đặc trưng (màu vàng nâu). Hình 2.1: Khuẩn lạc A. ochraceus Hình 2.2: Bào tử A. ochraceus trong môi trƣờng MA 25OC [16] 7 P. verrucosum : Khuẩn ty có vách ngăn và phân nhánh, bào tử đính có màu xanh khi chín nên còn được gọi là mốc xanh. Hình 2.3: Khuẩn lạc P. verrucosum trên môi trƣờng CYA ở 250C [17]. 2.3.3 Cấu trúc hóa học của ochratoxin Hiện nay, người ta biết OTA, OTB và những dẫn xuất ester của nó: ester ethylic của OTA (gọi là OTC) và ester methylic của nó. Các ochratoxin B, C được tạo thành trong điều kiện nuôi cấy trong phòng thí nghiệm hoặc phát hiện trong nước tiểu súc vật ăn thức ăn nhiễm OTA. 8 Hình 2.4: Cấu tạo OTA [15] 2.3.4 Tính chất hóa lý của ochratoxin A Trọng lượng phân tử OTA: 403,8 Điểm nóng chảy: 1690C Phổ hấp phụ UV: 2 đỉnh: 216 – 333 nm Cấu tạo: C20H18O6HN 7–carboxy–5–chloro–8–hydroxy–3,4–dihydro–3R–methylicosomarin (nhóm 7–carboxy liên kết với L- -phenylalanine bằng nối amide) Là tinh thể không màu, bền với nhiệt, tan trong dung môi hữu cơ phân cực như: chloroform, methanol, ethanol, ít tan trong nước và tan trong đệm carbornat loãng. Dễ bị phân hủy bởi ánh sáng, trong môi trường kiềm hoặc chất tẩy (như sodium hypochlorite). 2.3.5 Độc tính và tình hình nhiễm của ochratoxin A OTA được chứng minh là chất gây hư thận, ức chế miễn dịch (sự suy giảm miễn dịch là do sự teo giảm đi của tuyến ức (Thymus), hàm lượng globulin huyết thanh giảm). Ngoài ra OTA còn ức chế sinh tổng hợp protein do ức chế cạnh tranh tổng hợp phenylalanin–tRNA. OTA còn gây mẫn cảm với bệnh truyền nhiễm như Coccidiose (cầu trùng). Trong đó chủ yếu gây tổn thương gan và thận. Liều 70 µg/1 kg cơ thể hằng ngày trong hai năm gây ung thư thận ở chuột đực. Đối với lợn, ăn liều thấp 200 ppb trong nhiều tuần lễ gây tổn thương thận. Đối với gia cầm, ảnh hưởng đến gan, thận, hệ miễn dịch và tạo máu. Liều cấp tính có thể làm giảm trọng lượng, tiêu tốn thức ăn, sản lượng trứng, tỷ lệ ấp nở. Bảng 2.5: Độc tính của OTA đối với động vật thí nghiệm [5] Động vật thí nghiệm LD50 (mg/kg trọng lượng) Vịt con 0,5 Chuột cống 32 Lợn con 6 9 Gà con 3,4 Độc tố này chủ yếu gây độc mãn tính hơn là cấp tính. Nấm mốc sinh ra độc tố OTA đã sinh sôi nẩy nở ở một vùng rộng của vùng trồng ngũ cốc và gây bệnh địa phương tại Thụy Điển và Đan Mạch. Lúa mạch với ẩm độ cao tạo điều kiện nấm mốc phát triển là nguyên nhân gây nhiễm OTA với nồng độ 2 mg/ml máu trong 35% mẫu thịt lấy trong đợt khảo sát lợn giết thịt của đàn lợn tại Thụy Điển (theo Holmberg và cộng sự 1990). Tình hình nhiễm OTA ở cà phê hạt từ những nguồn gốc khác nhau được trình bày trong Biểu đồ 2.1 Tỷ lệ cà phê nhiễm OTA (%) Nồng độ OTA (µg/kg) African American Asian Biểu đồ 2.1: Tình hình nhiễm OTA trong cà phê hạt [11]. Ở người, OTA được tìm thấy nhiều trong huyết thanh và trong sữa. Tình hình nhiễm OTA trong máu người được thống kê trong Bảng 2.6. Bảng 2.6: Tình hình nhiễm OTA trong máu ngƣời [12] Quốc gia Số mẫu Tỷ lệ nhiễm (%) Đức 306 57 Canada 159 40 10 Switzerland 386 100 Sweden 297 13 2.3.6 Các quy định về ochratoxin trong thực phẩm Theo cộng đồng chung châu Âu, mức độ thấp nhất hằng ngày cơ thể lấy vào có thể chịu đựng được là 1 – 16 ng/kg thể trọng. Trong đó giới hạn OTA nhiễm trong thực phẩm là 5 µg/kg (5 ppb). Theo tiêu chuẩn Việt Nam: < 35 µg/kg. 2.4 Các phƣơng pháp phân tích ochratoxin 2.4.1 Các phƣơng pháp hóa lý Tất cả phương pháp hóa lý đều phải qua các bước sau: Lấy mẫu Chiết ochratoxin Tinh sạch dịch chiết Cô đặc Phát hiện và định lượng ochratoxin Lấy mẫu: Do lượng độc tố phân bố không đồng đều nên cần lấy một số mẫu có tính phân bố đủ để đại diện cho sản phẩm cần kiểm tra. Mẫu phải được lấy từ nhiều vị trí khác nhau với những lượng khác nhau. Các mẫu này được gộp lại thành mẫu duy nhất và nghiền đồng đều. Và từ mẫu đồng nhất này, một lượng thích hợp sẽ được trích ra để tiến hành phân tích ochratoxin, thường từ 20 – 100 g tuỳ thuộc vào loại thực phẩm và hàm lượng ochratoxin cao hay thấp trong mẫu. Chiết ochratoxin Loại chất béo Đối với mẫu có thành phần béo từ 5% trở lên, sử dụng các dung môi: hexane, petrolium ether, ethyl dioxide, pentane nhằm tách chất béo trước khi tiến hành chiết ochratoxin. Chiết ochratoxin Dựa vào đặc tính tan của ochratoxin trong các dung môi hữu cơ nên chúng thường được chiết với các dung môi hữu cơ như: dichloromethane, benzene, acetonitril, acetone, chloroform hay methanol. Ochratoxin được chiết bằng cách lắc 11 với dung môi ở nhiệt độ phòng, nước được thêm vào để làm ẩm cơ chất giúp dung môi dễ dàng thấm sâu vào bên trong mẫu. Tinh sạch dịch chiết Loại bỏ các hợp chất khác có thể hiện diện cùng ochratoxin trong dịch chiết mẫu. Có ba cách tinh sạch phổ biến: Loại các tạp chất không mong muốn bằng các tác nhân gây tủa: thường dùng để cho mẫu có nguồn gốc thực vật. Các chất gây tủa thường dùng là các muối kim loại nặng như: AgNO3, Zn(CH3COO)2, CuCO3… Loại bằng cách phân chia trên hai pha lỏng (partition): Chiết bằng cách chuyển ochratoxin từ dung môi chiết ban đầu (ví dụ như methanol) vào dung môi khác (ví dụ như chloroform). Loại tạp bằng cột sắc ký hấp phụ (adsorption chromatography column): Kỹ thuật này có ưu điểm dễ sử dụng và hiệu quả loại tạp rất tốt trên nhiều loại mẫu khác nhau. Ví dụ, cột chiết xuất pha rắn SPE (solid-phase extraction) được chế tạo sẵn chứa các chất hấp phụ thường là silicagel, thích hợp cho phân tích bằng HPLC với hệ dung môi lần lượt là n–hexan, ethyl ether, hỗn hợp chloroform: methanol. Cô đặc mẫu Nồng độ ochratoxin trong dịch chiết thường thấp nên cần cô đặc bằng cách cho bốc hơi trong máy cô quay (Rotary Evaporator) dưới áp suất thấp hoặc dùng nồi chưng cách thủy dưới luồng khí nitơ nhẹ. Phát hiện và xác định hàm lượng Các phương pháp sắc ký thường được sử dụng, dựa trên nguyên tắc phân tách giữa 2 pha: pha tĩnh và pha động (lỏng hoặc khí) khi cho chất cần tách qua lớp sắc ký. Pha tĩnh có tính liên kết với ochratoxin làm chậm sự di chuyển của các chất (do các đặc điểm lý hóa khác nhau) nên tạo ra sự phân biệt giữa chúng. 2.4.1.1 Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography – TCL) Phương pháp này dựa trên sự hấp phụ khác nhau của các ochratoxin trên lớp silicagel (pha tĩnh) và khả năng hòa tan của chúng trong hệ dung môi (pha động). Các ochratoxin lần lượt được tách trong quá trình hệ dung môi di chuyển theo lực mao dẫn trên bản silicagel. Silicagel được phết lên một bản mỏng (nhôm hoặc nhựa) có kích 12 thước thường là 20 cm x 20 cm, dịch chiết sau khi cô đặc sẽ được hòa vào hỗn hợp dung môi benzen: acetonitril. Chấm khoảng 10 – 50 µl dung dịch ochratoxin đã hòa tan lên bản silicagel, tiến hành song song với chuẩn đã biết trước nồng độ. Sau khi sắc ký, sấy khô bản, soi dưới đèn huỳnh quang ở bước sóng 333 nm. Sự hiện diện của ochratoxin trong mẫu được xác định bằng cách so sánh dựa vào vị trí so với vệt huỳnh quang chuẩn. Sự định tính bằng mắt cho kết quả tương đối. Dùng máy đo mật độ phát huỳnh quang (fluorodensimeter) thay mắt thường để giảm sai số. 2.4.1.2 Sắc ký lỏng cao áp (High Performance Liquid Chromatography – HPLC). Kỹ thuật HPLC nhanh, nhậy, cho kết quả phân tích chính xác hơn TCL. Gồm 2 giai đoạn: Giai đoạn tách các chất phân tích: gồm pha tĩnh và pha động. Pha tĩnh (stationary phase) Thường dùng cột pha đảo, các chất dùng nhồi trong cột sắc ký có tính phân cực thấp (thường dùng là hợp chất silicagel có gắn các chuỗi alkyl từ C8 đến C18). Pha động (mobile phase) Là hỗn hợp các dung môi có độ phân cực khác nhau, qua cột với vận tốc dòng 1 – 10 ml/phút nhờ hệ thống bơm cao áp. Thường sử dụng hệ dung môi gồm nước, alcol (methanol), acetonitril. Giai đoạn phân tích các chất sau khi ra khỏi cột: Dựa vào tính chất của các chất cần phân tích, một thiết bị thích hợp gọi là đầu dò (detector) sẽ được nối trực tiếp vào đầu ra của cột sắc ký để phát hiện từng chất phân giải ra khỏi cột. Đầu dò huỳnh quang thường được sử dụng ở bước sóng kích thích 333 nm, phát xạ ở bước sóng 460 nm.Việc định tính hoàn toàn dựa vào thời gian lưu của các chất phân tích và chuẩn. Sau khi xác định thời gian ra khỏi cột các chất cần phân tích là ochratoxin, dựa vào diện tích của mẫu so với diện tích của chuẩn đã biết trước nồng độ để định lượng ochratoxin có trong mẫu cần phân tích. 2.4.2 Các phƣơng pháp sinh học 2.4.2.1 Phƣơng pháp thử nghiệm miễn dịch liên kết với enzyme (Enzyme Linked Immunosorbent Assay – ELISA): 13 Phương pháp cho kết quả nhanh, tiết kiệm dung môi, có thể phân tích nhiều mẫu cùng lúc nhưng dễ cho kết quả dương tính giả hoặc âm tính giả. Nguyên tắc dựa trên sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể. Ochratoxin chuẩn được cộng hợp với enzyme, tạo thành phức hợp ochratoxin – enzyme và được sử dụng như một kháng nguyên ở nồng độ nhất định, cạnh tranh với ochratoxin có trong mẫu. Kháng thể đặc hiệu với ochratoxin được gắn lên bề mặt giếng nhựa polystryren. Dịch chiết mẫu trong methanol 70% được trộn với cộng hợp ochratoxin- enzyme và được cho vào giếng có phủ kháng thể, các ochratoxin trong mẫu (nếu có) sẽ cạnh tranh với phức hợp ochratoxin – enzyme để gắn vào kháng thể cố định trên polystyren. Sau đó rửa sạch các phức hợp thừa, cơ chất phản ứng với enzyme được đưa vào để tạo màu. Ủ một thời gian sau đó thêm vào dung dịch ngưng phát màu để tạo điều kiện đồng đều về thời gian cho mọi giếng. Tiến hành đo độ hấp thu của mẫu và dãy chuẩn bằng máy so màu, từ đó tính được nồng độ của ochratoxin có trong mẫu. Màu càng đậm chứng tỏ cộng hợp ochratoxin – enzyme được giữ trên giếng càng nhiều, đồng nghĩa với nồng độ ochratoxin trong mẫu càng thấp. Ngược lại, màu càng nhạt thì nồng độ ochratoxin trong mẫu càng cao. 2.4.2.2 Phƣơng pháp sắc ký ái lực miễn dịch (Immuno affinity chromatography – IAC) Giống như ELISA, IAC cũng dựa trên sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể. Kháng thể đặc hiệu với ochratoxin được gắn lên giá rắn của cột sắc ký (thường dùng Sepharose 4B), tạo cho IAC đặc tính vừa tinh sạch vừa cô đặc ochratoxin. Mẫu được chiết với methanol, sau đó được pha loãng và cho qua cột IAC. Cột được rửa sạch những tạp chất không gắn lên kháng thể và được giải hấp bằng methanol. Tiến hành định lượng bằng HPLC hoặc huỳnh quang kế. Nguyên tắc hoạt động của cột IAC được trình bày trong Hình 2.5. 14 Tinh chế kháng thể Cộng hợp kháng thể và tạo cột IAC Gây miễn dịch thỏ và thu huyết thanh kháng ochratoxin Hình 2.5: Nguyên tắc họat động của cột IAC Ưu điểm của phương pháp IAC: Kết quả xét nghiệm đáng tin cậy. Tỷ lệ thu hồi ochratoxin rất cao Rất đơn giản Thời gian phân tích nhanh Sử dụng ít dung môi hữu cơ (chloroform... nên ít ảnh hưởng đến môi trường ) Đồng thời vừa cô đặc vừa tinh chế ochratoxin. Ochratoxin tinh chế không kèm theo tạp chất như với các cột hoạt động theo qui tắc lý hóa Giá ái lực miễn dịch giữ hoạt tính ổn định ít nhất là 1 năm 2.4.3 Sơ lƣợc cách chế tạo cột IAC do viện Pasteur sản xuất: (Phụ lục 1) 2.4.3.1 Gây miễn dịch thỏ và thu kháng huyết thanh kháng OTA Với bản chất là hapten, không có đặc tính sinh đáp ứng miễn dịch, không tạo được kháng thể nên ochratoxin phải cộng hợp với một protein giá (BSA – Bovine serum albumin). Cộng hợp OTA – BSA được tiêm vào thỏ để gây miễn dịch. Khi đó, kháng thể tạo thành sẽ là: 15 Kháng thể kháng OTA và BSA Kháng thể kháng OTA (không phản ứng với BSA) (IgGOTA) Kháng thể kháng BSA Kháng thể khác 2.4.3.2 Tinh chế kháng thể kháng OTA Tinh chế kháng thể kháng OTA bằng cách tủa huyết thanh với amoniumsulfate 45% S. Sau đó loại bỏ kháng thể kháng BSA bằng cột sắc ký ái lực miễn dịch với cộng hợp gel Sepharose 4B – BSA. Khi đó, các kháng thể kháng OTA cùng với các kháng thể còn lại đi qua cột. 2.4.3.3 Cộng hợp IgGOTA lên polymer Sepharose 4B và tạo cột IAC Tiến hành cộng hợp IgGOTA lên Sepharose 4B và tạo cột IAC (mục 3.3.2). Cột được qua thử nghiệm cho kết quả 100% về khả năng thu hồi, tính lặp lại cao, cho thấy sử dụng cột ái lực miễn dịch sản xuất tại Việt Nam với tính hiệu quả cao tương đương với các cột ngoại nhập và giá thành thấp hơn. 16 Chƣơng 3: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài Thời gian thực hiện: 6/2/2006 – 30/6/2006 Địa điểm thực hiện đề tài: Phòng Miễn Dịch – Viện Pasteur TPHCM 3.2 Vật liệu 3.2.1 Đối tƣợng nghiên cứu Ochratoxin A chuẩn có nồng độ 10 ppm Kháng thể kháng ochratoxin do viện Pasteur tinh chế Gel: CN–Br activate Sepharose 4B Cột: là cột nhựa, có kích thước 0,4 x 10 cm 3.2.2 Thiết bị Huỳnh quang kế (A1501, Vicam, USA) Máy khuấy từ đứng (Stuare Sientific Stirrer SS10, UK) Cân phân tích (E14130, OHAUS, Switzerland) Máy votex (D–79219, IKA, Germany) Máy lắc (D–79219, IKA, Germany) Tủ hút, tủ lạnh 3.2.3 Dụng cụ Ống đong, phễu thuỷ tinh, bechers Cột sắc ký Pippetman 100 µl – 1000 µl, đầu tip 3.2.4 Hóa chất Methanol (Merk) NaCl, Tween 20 Nước cất Hóa chất tẩy rửa Dung dịch 1: NaN3 0,05% (dd1) 17 Dung dịch 2: PBS, NaN3 0,05% 40 (dd 2) Dung dịch 3: HCl 1 mM, pH = 3 (dd 3) Dung dịch 4: NaHCO3 0,1 M; NaCl 0,5 M; Thimerosal 0,01%; pH = 8,7 (dd 4) Dung dịch 5: Tris – HCl 0,1 M; NaCl 0,5 M; pH = 8 (dd 5) Dung dịch 6: NaCl 0,5 M; CH3COOH 0,1 M; pH = 4 (dd 6) Dung dịch 7: Tris – HCl 0,1 M; NaN3 0,05%; NaCl 0,5M; pH = 4 (dd 7) 3.3 Phƣơng pháp 3.3.1 Các phƣơng pháp phục vụ nghiên cứu 3.3.1.1 Phƣơng pháp quang phổ kế để xác định nồng độ OTA Nguyên tắc Quang phổ kế cấu tạo gồm nguồn sáng sau khi qua bộ tạo ánh sáng đơn sắc chỉ cho qua ánh sáng với bước sóng nhất định, và khi qua dung dịch OTA trong cuvet sẽ tác động vào OTA và ánh sáng bị OTA hấp thụ một phần. Ở mỗi dung dịch pha loãng khác nhau, lượng ánh sáng hấp thu thay đổi ở một độ dài sóng nhất định (chỉ có điện tử ở các hợp chất có nối đôi hay/và nối ba mới hấp thụ ánh sáng ở vùng tử ngoại). Bộ nhận tín hiệu, bộ khuếch đại tín hiệu sẽ đo mật độ quang của dung dịch. Cực đại hấp thụ (λmax) là bước sóng mà ở đó chất cho độ hấp thụ lớn nhất. Và ở mỗi cực đại hấp thụ, mỗi chất lại có hệ số hấp thụ mol nhất định (Σ) . Nồng độ của chất phân tích được tính theo công thức: OD *a *V µg OTA = OD: giá trị hấp thụ ở cực đại hấp thụ (λmax) a: độ pha loãng dung dịch V: thể tích dung dịch màu : hệ số hấp phụ phân tử của chất tại cực đại hấp thụ Sơ đồ hoạt động của máy quang phổ tử ngoại được trình bày trong Hình 3.1. Đèn nguồn Bộ tạo ánh sáng đơn sắc Cốc đựng mẫu đo Bộ nhận tín hiệu Bộ khuếch đại tín hiệu Đồng hồ đo Hình 3.1: Sơ đồ hoạt động của máy quang phổ tử ngoại (UV.Vis) 18 3.3.1.2 Phƣơng pháp dùng huỳnh quang kế đo lƣờng hàm lƣợng ochratoxin Nguyên tắc Ánh sáng từ nguồn sáng phát ra được điều chỉnh bởi hệ thống kiểm soát độ dài sóng nhằm tạo nên bước sóng kích thích phù hợp. Các phân tử hấp thụ photon ánh sáng chuyển từ trạng thái cơ bản lên trạng thái kích thích. Tuy nhiên do trạng thái kích thích không bền nên các phân tử ở trạng thái kích thích có thể trở về trạng thái cơ bản bằng cách giải phóng năng lượng dưới dạng photon, tức là tự phát ra ánh sáng, với năng lượng kém đi. Ở bước sóng phát xạ 460 nm, các bức xạ được tế bào quang điện tại đầu dò chuyển thành tín hiệu điện tử. Lượng ochratoxin có trong mẫu đươc so sánh với dung dịch ochratoxin chuẩn và máy tự tính ra kết quả. Sơ đồ hoạt động của huỳnh quang kế được trình bày trong Hình 3.2. 3.3.1.3 Chuẩn bị dung dịch OTA chuẩn và xác định nồng độ Mục đích: pha loãng dung dịch OTA chuẩn Tiến hành Pha OTA nồng độ 0,25 ppm từ OTA chuẩn có nồng độ 10 ppm trong methanol. Nguồn sáng Bộ tạo ánh sáng kích thích đơn sắc Cốc đựng mẫu đo Bộ nhận tín hiệu Bộ khuếch đại tín hiệu Xác định lƣợng tín hiệu Khe sáng vào Khe sáng ra Bộ hấp phụ ánh sáng bức xạ đơn sắc Hình 3.2: Sơ đồ hoạt động của huỳnh quang kế 19 Lấy OTA chuẩn nồng độ 10 ppm để nguội ở nhiệt độ phòng khoảng 20 phút. Lấy một thể tích OTA cần sử dụng vào lọ mới, để khô hoàn toàn trong tủ hút. Sau đó thêm methanol theo tỷ lệ mong muốn. Tiến hành xác định nồng độ OTA bằng huỳnh quang kế. 3.3.2 Quy trình tạo cột IAC: 3.3.2.1 Chuẩn bị kháng thể  Kháng thể kháng OTA dưới dạng tủa trong amoniumsulfate được tiến hành thẩm tích trong dung dịch Thẩm tích tủa trong dung dịch NaN3 (dd 1): 1 lít x 2 lần Thẩm tích tủa trong dung dịch PBS (dd 2): 1 lít x 2 lần  Ly tâm 2000 vòng/phút, thu dịch nổi  Xác định nồng độ IgG bằng quang phổ kế ở λ = 280 nm 3.3.2.2 Chuẩn bị gel Gel CNBr – activated Sepharose 4B 1 g gel khô trương phồng thành 3,5 ml gel Rửa gel với dung dịch HCl 1 mM (dd 3), thể tích 200 ml dung dịch/1g gel Cách rửa gel: Cho HCl vào, lắc để gel nở hoàn toàn. Sau đó tiến hành ly tâm Ly tâm lần 1: 2500 vòng/phút, trong 5 phút Ly tâm lần 2 – 8: 2500 vòng/phút, trong 2 phút Ly tâm lần 9: 2500 vòng/phút, trong 5 phút 3.3.2.3 Cộng hợp IgG vào Sepharose 4B Quá trình cộng hợp thực hiện qua các bước: Cho dung dịch IgGOTA vào gel đã rửa (nồng độ 5 mg IgGOTA/1 ml gel), để 2 giờ ở nhiệt độ phòng (lắc) Qua đêm ở 40C (lắc) Ly tâm 2500 vòng/phút, trong 5 phút Lấy dịch nổi đo hấp phụ quang ở λ = 280 nm (OD = 0 chứng tỏ kháng thể cộng hợp hoàn toàn) Rửa lại 3 lần với đệm carbonat (dd 4) (ly tâm 2500 vòng/phút, 2 phút/ lần) Bất hoạt nhóm –C N+ với đệm Tris (dd 5) (lắc ở nhiệt độ phòng trong 2 giờ) 20 Rửa với đệm acetic (dd 6) (lắc ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ) Lần cuối rửa với đệm Tris – HCl (dd 7) 3.3.2.4 Nén cột Các bước nén cột: Thể tích gel trên cột là: 0,1 ml gel/cột Ngâm frit và cột bằng ethanol trong 3 phút để đuổi hết khí bên trong Rửa lại bằng nước cất. Nén frit vào đáy của cột Rửa 3 lần với đệm Tris (dd 7) Cho gel đã cộng hợp IgG vào cột Lưu ý: + Khuấy từ đứng hỗn hợp dịch gel trong điều kiện lạnh + Pha loãng hỗn hợp 10 lần ( hút 1 ml cho vào cột) Rửa 3 lần với đệm Cho dd đệm (dd 7) vào cột, bảo quản ở 40C 3.3.3 Xây dựng mối tƣơng quan tuyến tính giữa lƣợng OTA trong dịch đẩy chuẩn và dịch đẩy thay thế (methanol) Trong quá trình thực hiện cho thấy nếu sử dụng dịch đẩy chuẩn của hãng Vicam giá thành rất cao. Nên chúng tôi đã tiến hành đẩy bằng dịch đẩy thay thế (methalnol tuyệt đối). Do đó để có hiệu quả cần xây dựng mối tương quan giữa lượng OTA trong methanol (dịch đẩy thay thế) và trong dịch đẩy chuẩn. Từ đó, tiến hành đẩy bằng methanol trong các thí nghiệm sau và suy ra được lượng OTA chính xác. Bố trí thí nghiệm khảo sát mối tương quan: Chuẩn bị dung dịch OTA có nồng độ 0,25 ppm từ dd OTA chuẩn 10 ppm (mục 3.3.1.3), tiến hành đo hàm lượng OTA bằng huỳnh quang kế. Bố trí thí nghiệm theo Bảng 3.1 Bảng 3.1:Bố trí thí nghiệm khảo sát mối tƣơng quan tuyến tính giữa lƣợng OTA trong dịch đẩy chuẩn và dịch đẩy thay thế (methanol) Lượng OTA (ng) Thể tích dung dịch OTA nồng độ 0,25 ppm (µl) Thể tích methanol hoặc dung dịch đẩy (µl) 21 2,5 5 10 20 40 10 20 40 80 160 1490 1480 1460 1420 1340 3.3.4 Dựng đƣờng chuẩn OTA Dựa vào đặc tính phát huỳnh quang của ochratoxin để dựng đường chuẩn nhằm khảo sát mối tương quan tuyến tính giữa lượng OTA và cường độ phát huỳnh quang (đo bằng huỳnh quang kế). Từ dung dịch OTA chuẩn nồng độ 10 ppm pha thành dung dịch OTA 0,25 ppm trong methanol (mục 3.3.1.3). Thí nghiệm theo Bảng 3.2, mỗi hàm lượng thực hiện 2 lần. Tiến hành đo hàm lượng OTA bằng huỳnh quang kế. Bảng 3.2: Bố trí thí nghiệm dựng đƣờng chuẩn OTA Lượng OTA (ng) Số lần lặp lại (n) Thể tích dịch đẩy (µl) 2,5 5 10 20 40 2 2 2 2 2 1490 1480 1460 1420 1340 * n: Số lần lặp lại. 3.3.5 Quy trình tinh chế, cô đặc bằng cột IAC và định lƣợng bằng huỳnh quang kế Quy trình: Sử dụng quy trình của hãng Vicam (Mỹ) Để cột cân bằng ở nhiệt độ phòng Sau đó rửa cột bằng 10 ml nước 22 10 g mẫu + 1g NaCl 20 ml methanol: H2O (8: 2) Khuấy từ 500 vòng/phút, 30 phút Lọc qua giấy lọc thường Pha loãng: 10 ml dịch lọc + 40 ml PBS 10 ml dịch pha loãng Cho chảy trực tiếp qua cột Rửa cộ bằng (1): 10 ml dung dịch rửa * (2): 10 ml nước cất hai lần qua lọc Giải hấp bằng 1,5 ml methanol Đo huỳnh quang dd giải hấp * Dung dịch rửa: 20 ml PBS + 20 µl Tween 20 (0,01 %.) 3.3.6 Hiệu suất thu hồi của cột IAC đối với mẫu trắng Xác định hiệu suất thu hồi nhằm đánh giá khả năng bắt giữ OTA của cột IAC. Cho vào cột lượng OTA chuẩn đã biết trước nồng độ (3.3.1.3). Lượng bố trí theo Bảng. Thực hiện theo quy trình (3.3.5). Dịch sau giải hấp tiến hành định lượng bằng huỳnh quang kế. Tiến hành song song với hai cột không bổ sung OTA để làm đối chứng. Tiến hành bố trí thí nghiệm dựng xác định hiệu suất thu hồi đối với mẫu trắng theo Bảng 3.3. 23 Bảng 3.3: Bố trí thí nghiệm khảo sát hiệu suất thu hồi của cột IAC đối với OTA chuẩn Lượng OTA chuẩn qua IAC (ng) n 2,5 5 10 20 30 40 2 2 2 2 2 2 Cách tính hiệu suất thu hồi của cột IAC: 3.3.7 Hiệu xuất thu hồi của cột IAC đối với mẫu tự tạo 3.3.7.1 Phƣơng pháp chọn mẫu nền Mẫu nền được chọn sao cho không bị nhiễm OTA, trong thí nghiệm mẫu nền là mẫu bia Sài Gòn (bia 333). Tiến hành kiểm tra nền của mẫu bia bằng huỳnh quang kế. 3.3.7.2 Phƣơng pháp tạo mẫu giả Lượng mẫu dùng để phân tích là 5 ml, chiết mẫu theo quy trình (phụ lục 2). Gây nhiễm mẫu bằng một lượng OTA đã biết trước hàm lượng (5, 10, 20 và 40 ng). 3.3.7.3 Hiệu suất thu hồi của cột IAC đối với mẫu bia Sài Gòn Mục đích thí nghiệm nhằm đánh giá độ thu hồi của OTA đối với mẫu bia được gây nhiễm nhân tạo. Mẫu bia được chiết theo quy trình, gây nhiễm mẫu, cho qua IAC, dịch sau giải hấp được định lượng bằng huỳnh quang kế. Bố trí thí nghiệm theo Bảng 3.4. Lƣợng OTA sau khi qua cột H% = x 100 Lƣợng OTA trƣớc khi qua cột 24 Bảng 3.4: Bố trí thí nghiệm khảo sát hiệu suất thu hồi OTA của cột IAC đối với mẫu tự tạo 3.3.8 Tình hình nhiễm OTA của một số mẫu thực phẩm trên thị trƣờng Bố trí thí nghiệm theo Bảng 3.5 Bảng 3.5: Bố trí thí nghiệm khảo sát tình hình nhiễm OTA của một số mẫu trên thị trƣờng STT Mẫu Lượng OTA (ng) theo kết quả huỳnh quang 1 Cà phê Hiệp Nga 2 Vinacafe 3 Millo 4 Bột ngũ cốc 5 Nescafe 6 Bắp (mua ngoài chợ) 7 Bắp (Viện Pasteur) 8 Đậu nành (Viện Pasteur) 9 Tấm (Viện Pasteur) 10 Bia Sài Gòn (333) 3.4 Phƣơng pháp xử lí số liệu Số liệu được thu thập và xử lý bằng phần mềm Excel 2003. Lượng OTA chuẩn qua IAC (ng) Khối lượng mẫu (ml) Số lần lặp lại (n) 2,5 5 10 20 30 40 5 5 5 5 5 5 2 2 2 2 2 2 25 Chƣơng 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Tạo cột sắc ký ái lực miễn dịch Cột nhựa có kích thước 0,4 x 10 cm. Nồng độ kháng thể kháng OTA gắn lên cột bằng 5 mg/ml gel Sepharose 4B, có khả năng bắt giữ OTA. Hình 4.1: Cột IAC 4.2 Xây dựng mối tƣơng quan tuyến tính giữa lƣợng OTA (đo bằng huỳnh quang kế) trong dịch đẩy chuẩn và dịch đẩy thay thế (methanol). Tiến hành xây dựng mối tương quan tuyến tính giữa lượng OTA trong methanol (dịch đẩy thay thế) và dịch đẩy chuẩn. Từ đó, tiến hành đẩy bằng methanol trong các thí nghiệm sau và suy ra được lượng OTA chính xác. Pha dung dịch OTA nồng độ 0,25 ppm từ dung dịch OTA chuẩn 10 ppm. Định lượng bằng huỳnh quang kế lượng đã biết trước (2,5; 5; 10; 20 và 40 ng) trong dịch đẩy chuẩn và dịch đẩy thay thế (methanol). Kết quả xây dựng mối tương quan được trình bày ở Bảng 4.1 và Biểu đồ 4.1 Bảng 4.1: Mối tƣơng quan giữa lƣợng OTA trong dịch đẩy chuẩn và dịch đẩy thay thế Lượng OTA (ng) n Lượng OTA dựa trên kết quả huỳnh quang Trong dịch đẩy methanol Trong dịch đẩy chuẩn Lượng OTA (ng) SD Cv Lượng OTA (ng) SD Cv 2,5 2 3 0 0 1 0 0 5 2 7 1 14,3 4 0 0 10 2 16,5 0,7 4,2 9 0 0 20 2 36 1,4 3,9 21 0 0 40 2 71 1,4 1,97 44 0 0 26 Lượng OTA trong dịch đẩy chuẩn (ng) y = 0.6285x - 0.9817 R 2 = 0.9992 0 10 20 30 40 50 0 10 20 30 40 50 60 70 80 Lượng OTA trong dịch đẩy methanol (ng) Biểu đồ 4.1: Mối tƣơng quan giữa lƣợng OTA trong dịch đẩy chuẩn và dịch đẩy thay thế dựa trên kết quả hùynh quang Nhận xét: Độ lệch chuẩn (SD) nói lên mức độ chênh lệch giữa các số liệu; số liệu càng rời rạc thì SD càng lớn, ngược lại số liệu càng tập trung thì SD càng nhỏ [8]. Bảng 4.1, SD biến thiên từ 0 – 1,4 và có thể thấy với lượng OTA càng lớn thì SD càng tăng tương ứng với mức độ sai số xảy ra càng cao. Các sai số có thể là thao tác hút bằng micropipet không chuẩn xác, sự thất thoát OTA trong quá trình thực hiện… Hệ số biến động (CV) là một chỉ số khá tốt để đánh giá độ chính xác và tính khách quan của các số liệu thu thập được. Phạm vi chấp nhận được của hệ số biến động là nhỏ hơn 20% [8]. Bảng 4.1, CV nhỏ hơn 20% (0 – 14,3%) nên đạt mức chấp nhận trong phân tích. Biểu đồ 4.1 đã thể hiện mối tương quan tuyến tính giữa lượng OTA đo bằng huỳnh quang kế trong dịch đẩy chuẩn và dịch đẩy thay thế qua phương trình: y = 0,6285x – 0,9817 với R2 = 0,9992 Dựa trên mối tương quan tuyến tính, tiến hành đẩy OTA bằng dịch đẩy thay thế (methalnol) trong các thí nghiệm sau, từ đó suy ra lượng OTA chính xác 27 4.3 Dựng đƣờng chuẩn OTA Pha dung dịch OTA nồng độ 0,25 ppm từ dung dịch OTA chuẩn 10 ppm. Định lượng bằng huỳnh quang kế lượng đã biết trước (2,5; 5; 10; 20 và 40 ng), mỗi nồng độ thực hiện 2 lần, dựng đường chuẩn bằng phần mềm Microsoft Office Exel 2003. Kết quả dựng đường chuẩn được trình bày ở Bảng 4.2 và Biểu đồ 4.2 Bảng 4.2: Kết quả dựng đƣờng chuẩn OTA Lượng OTA (ng) (n) Kết quả huỳnh quang Lượng OTA (ng) SD Cv 2,5 2 1 0 0 5 2 3,4 0,6 17,6 10 2 9,4 0,44 4,7 20 2 21,6 0,79 3,6 40 2 43,6 0,79 1,8 Lượng OAT theo huỳnh quang (ng) y = 1.1452x - 1.95 R 2 = 0.9995 0 10 20 30 40 50 0 10 20 30 40 50 Lượng OTA (ng) Biểu đồ 4.2: Đường chuẩn OTA Nhận xét: Bảng 4.2, SD biến thiên từ 0 – 0,79 và có thể thấy với lượng OTA càng lớn thì SD càng tăng tương ứng với mức độ sai số xảy ra càng cao. Bảng 4.2, CV nhỏ hơn 20% (0 – 14,3%) nên đạt mức chấp nhận trong phân tích. Biểu đồ 4.2 thể hiện mối tương quan tuyến tính giữa lượng OTA đo bằng huỳnh quang kế với lượng OTA trong mẫu chuẩn qua phương trình: 28 y = 1,1452x – 1,95 với R2 = 0,9995 4.4 Hiệu suất thu hồi của cột IAC đối với mẫu trắng Cho OTA đã biết trước ở các hàm lượng qua cột IAC theo quy trình (3.3.4), mỗi lượng thực hiện 2 lần. Tiến hành định lượng bằng huỳnh quang kế lượng OTA trước khi qua cột và sau khi thu hồi. Kết quả được trình bày trong Bảng 4.3 và Biểu đồ 4.3 Bảng 4.3: Hiệu suất thu hồi của cột IAC đối với mẫu trắng Lượng OTA trước qua cột (ng) N Lượng OTA thu hồi trung bình (ng) Hiệu suất thu hồi trung bình (%) SD CV 4,02 2 4,17 103,73 0,1 2,44 10,02 2 10,02 100 0 0 21,65 2 21,64 99,95 0 0 47,42 2 43,02 90,72 3,1 6,86 Hiệu suất thu hồi (%) y = -0.2798x + 104.41 R 2 = 0.9402 90 93 96 99 102 10 0 10 20 30 40 50 Lượng OTA qua IAC (ng) Biểu đồ 4.3: Hiệu suất thu hồi của cột IAC đối với mẫu trắng Nhận xét: Hiệu suất thu hồi đánh giá khả năng bắt giữ OTA của cột IAC, hiệu suất có thể chấp nhận ở mức 80%. Theo Biểu đồ 4.3 và Bảng 4.3 thì hiệu suất thu hồi càng giảm khi lượng OTA cho qua cột tăng, và hiệu suất thu hồi trong điều kiện mẫu trắng là đạt yêu cầu (90,72 – 103,73%). 29 Bảng 4.3, CV nhỏ hơn 20% (2,44 – 6,86%), SD thấp (0,1 – 3,1) nên đạt mức chấp nhận trong phân tích. Biểu đồ 4.3 thể hiện được mối liên hệ tuyến tính giữa lượng OTA cho qua cột và hiệu suất thu hồi của cột qua phương trình: y = - 0,2798 x + 104,41 với R2 = 0,9833 4.5 Hiệu suất thu hồi của cột IAC đối với mẫu bia Gây nhiễm mẫu bia bằng cách thêm OTA vào 5 ml bia lượng đã biết trước các hàm lượng, cho qua cột IAC theo quy trình (phụ lục 2), mỗi lượng thực hiện 2 lần. Tiến hành định lượng bằng huỳnh quang kế lượng OTA trước khi qua cột và sau khi thu hồi. Kết quả được trình bày ở Bảng 4.4 và Biểu đồ 4.4 Bảng 4.4 Hiệu suất thu hồi của cột IAC đối với mẫu bia Hiệu suất thu hồi (%) Lượng OTA nhiễm vào 5ml bia (ng) n Lượng OTA thu hồi trung bình (ng) Hiệu suất thu hồi trung bình (%) SD CV 4,42 2 4,86 109,95 0,3 6,47 10,33 2 10,52 101,84 0,13 1,25 22,9 2 20,89 91,22 1,42 6,49 48,67 2 37 76,02 8,2 19,14 30 y = -0.7372x + 110.67 R 2 = 0.9751 0 20 40 60 80 100 120 0 10 20 30 40 50 60 Lượng OTA qua IAC (ng) Biểu đồ 4.4: Hiệu suất thu hồi của cột IAC đối với mẫu bia Nhận xét: Theo Biểu đồ 4.4 và Bảng 4.4 thì hiệu suất thu hồi càng giảm khi lượng OTA cho qua cột càng tăng, hiệu suất thu hồi khi mẫu nền là bia đạt yêu cầu khi lượng mẫu nhiễm nhỏ hơn 22,9 ng (91,22 – 109%), ở lượng cao hơn (> 48 ng) thì hiệu suất thu hồi giảm (76,02%). Sự chênh lệch về hiệu suất thu hồi ở mẫu nền là bia và không có mẫu nền có thể là do lượng OTA bị thất thoát trong quá trình chiết mẫu và thao tác pipet không chuẩn xác. Ở Bảng 4.4, CV < 20% (6,47 – 19,14%), SD thấp (0,1 – 8,2) nên đạt mức chấp nhận trong phân tích. Biểu đồ 4.4 thể hiện được mối liên hệ tuyến tính giữa lượng OTA cho qua cột và hiệu suất thu hồi của cột qua phương trình: y = - 0,7372 x + 110,67 với R2 = 0,9751 4.6 Tình hình nhiễm OTA của một số mẫu thực phẩm trên thị trƣờng Thu thập mẫu, thực hiện theo quy trình chiết và tinh chế IAC, sau đó định lượng bằng huỳnh quang kế. Kết quả kiểm tra được trình bày ở Bảng 4.5 31 Bảng 4.5: Tình hình nhiễm OTA của một số mẫu thực phẩm trên thị trƣờng STT Mẫu Lượng OTA (ng /1 ml mẫu) 1 Cà phê Hiệp Nga 14,88 2 Vinacafe 4,05 3 Millo 2,12 4 Bột ngũ cốc 2,43 5 Nescafe 0,99 6 Bắp (mua ngoài chợ) 9,9 7 Bắp (Viện Pasteur) 1,43 8 Đậu nành (Viện Pasteur) 1,99 9 Tấm (Viện Pasteur) 2,3 10 Bia Sài Gòn (333) 0 Qua kết quả Bảng 4.5, nhận thấy tình hình nhiễm OTA trên thị trường rất nhiều. Vì vậy công tác định lượng OTA bằng cột sắc ký ái lực miễn dịch là rất cần thiết. 32 Chƣơng 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Tạo cột sắc ký ái lực miễn dịch (IAC) có kích thước 0,4 cm x 10 cm với nồng độ kháng thể kháng OTA là 5 mg/ml gel Sepharose 4B, có khả năng bắt giữ OTA đạt yêu cầu. Hiệu suất thu hồi của cột IAC đối với OTA chuẩn tốt (trên 90%). Hiệu suất thu hồi của cột IAC đối với mẫu tự tạo (bia) đạt yêu cầu khi lượng OTA qua cột trong khoảng từ 0 – 20 ng. 5.2 Đề nghị Nếu có điều kiện chúng tôi đề nghị tiến hành thử nghiệm xác định các thông số kĩ thuật của cột như: dung tích cột, độ nhậy và độ lập lại của cột để có thể kết luận thuyết phục về khả năng bắt OTA của cột IAC. 33 TÀI LIỆU KHAM KHẢO TIẾNG VIỆT 1. Âu Thị Ngọc Ánh, 2005. Dùng cột sắc ký ái lực miễn dịch và huỳnh quang kế định lượng Aflatoxin G1. Khóa luận tốt nghiệp, khoa Sinh học, trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên, Tp. Hồ Chí Minh, Việt Nam. 2. Dương Ngọc Diễm, 2003. Tạo kháng thể kháng ochratoxin và giá ái lực bắt ochratoxin. Khóa luận tốt nghiệp, khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học tự nhiên, Tp. Hồ Chí Minh, Việt Nam. 3. Nguyễn Lân Dũng – Nguyễn Đình Quyến – Phạm Văn Ty, 2000. Vi sinh vật học. Nhà xuất bản Giáo Dục. 4. Bùi Xuân Đồng, 2003. Nguyên lý phòng chống nấm mốc và mycotoxin. Nhà xuất bản Khoa Học và Kỹ Thuật Hà Nội. 5. Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc Diệp, 2003. Nấm mốc và độc tố aflatoxin trong thức ăn chăn nuôi. Nhà xuất bản Nông Nghiệp, Hà Nội. 210 trang. 6. Từ Thị Hường và cộng sự. Nghiên cứu hệ nấm mốc và định lượng OTA trong cà phê nhân ROBUSTA. Viện vệ sinh y tế công cộng. 7. Nguyễn Ngọc Kiểng, 2000. Toán – Thống kê sinh vật, lý thuyết xác suất. Trường Đại học Nông Lâm, Tp. Hồ Chí Minh, Việt Nam. 8. Đỗ Ngọc Liên, 2004. Thực hành hóa sinh miễn dịch. Nhà xuất bản Đại Học Quốc Gia Hà Nội. 9. Lương Đức Phẩm, 2002. Vi sinh học và vệ sinh an toàn thực phẩm. Nhà xuất bản Hà Nội. 10. Nguyễn Xuân Thành – Nguyễn Như Thành – Dương Đức Tiến, 2004. Vi sinh vật học nông nghiệp. Nhà xuất bản Đại Học Sư Phạm. Dự án đào tạo giáo viên trung học cơ sở. 34 TIẾNG ANH 11. E. Pardo, S. Marın, A.J. Ramos and V. Sanchis, Occurrence of ochratoxigenic fungi and ochratoxin A in green coffee from different origins. Food Technology Department, Universitat de Lleida, Rovira Roure 191, 25198 Lleida, Spain, 2004. 12. Hana Valenta, 1998. Chromatographic methods for the determination of ochratoxin A in animal and human tissues and fluids. Journal of chromatography A, 815, 75 – 92. 13. Paul Bayman et al, 2001. Ochratoxin production by the Aspergillus ochraceus Group and Aspergillus alliaceus. Applied and envirronmental microbiology, May 2002, Vol. 68, No. 5, p. 2326 – 2329. 14. Rita Serra, Ana Braga, Armando Venancio, 2005. Mycotoxin-producing and other fungi isolated from grapes for wine production, with particular emphasis on ochratoxin A. Research in Microbiology 156 (2005) 515 – 521. TRANG WEB 15. www.univ-brest.fr/.../ fiches/fusagramin.html. 16. www.dehs.umn.edu/.../ verrucosum/meath.jpg. 35 PHỤ LỤC Phụ lục 1. Quy trình tinh chế kháng thể kháng OTA 1. Quy trình gây miễn dịch thỏ Thỏ dùng gây miễn dịch phải hoàn toàn khỏe mạnh, 2 – 3 tháng tuổi, trọng lượng trên 2 kg. Tiến hành gây miễn dịch trên 2 thỏ để sản xuất kháng huyết thanh kháng độc tố nấm (ochratoxin A ). Lấy 1 ml máu tai trước khi tiêm mũi mẫn cảm để làm đối chứng. Các mũi tiêm 1, 2, 3, 4 và 5 lần lượt cách nhau 28 ngày và sau 14 ngày của các mũi tiêm tiến hành lấy máu, ly tâm, tách huyết thanh, bảo quản ở (- 200C). Mũi mẫn cảm Cho NaCl 0,9% và cộng hợp OTA – BSA 2500 µg/ml vào ống, thêm tá chất hoàn toàn vào với cùng thể tích, vortex 30 phút. Thu được huyền dịch OTA – BSA, lấy 2 ml cho vào ống tiêm (tương ứng 300 µg OTA – BSA). Tiêm nhiều mũi trên lưng, còn lại 100 µl huyền dịch tiêm vào đùi. Ở đùi còn lại tiêm 100 µl vaccin ho gà. Mũi nhắc lại 1, 2, 3, 4, 5 Quy trình tiêm tương tự nhưng lượng kháng nguyên OTA-BSA giảm dần (lần 1:150 µg OTA – BSA, lần 2 – 5: 125 µg OTA – BSA ). Sử dụng tá chất không hoàn toàn và không có vaccine ho gà. Sau mũi nhắc lại thứ 3, tiến hành lấy máu thỏ tinh chế kháng thể và tạo cột IAC. Theo dõi đáp ứng miễn dịch và kiểm tra chất lượng kháng thể Theo dõi đáp ứng miễn dịch bằng phương pháp khuếch tán kép trên thạch Huyết thanh sau mũi nhắc lại thứ 3 được làm phản ứng khuếch tán kép. 1g agarose đuợc hòa tan trong 100 ml đệm phosphat, pH = 7,2. Đun đến khi agarose tan hoàn toàn. Đổ thạch 6,5 cm x 6 cm, dày 3 mm trên tấm film trong, tạo các giếng trên thạch. Sau đó cho kháng nguyên và kháng thể vào giếng tương ứng, ủ buồng ẩm 40C. Khoảng 24 – 48 giờ quan sát đường tủa, ép khô thạch và nhuộm với đỏ Ponceau S 0,2%. Sau đó rửa với nước và để khô tự nhiên. 36 Kiểm tra chất lượng kháng thể Dùng phương pháp Bradford định lượng protêin và điện di trên thạch SDS – polyacrylamide để kiểm tra chất lượng kháng thể. 2. Tinh chế kháng thể kháng OTA Tinh chế kháng thể kháng OTA bằng cách tủa huyết thanh với amoniumsulfate 45%S, sau đó loại bỏ kháng thể kháng BSA bằng cột sắc ký ái lực miễn dịch với cộng hợp gel CNBr – activated Sepharose 4B – BSA. Khi đó, chỉ có các kháng thể kháng OTA đi qua cột còn các loại kháng thể còn lại bị giữ lại do tương tác kháng nguyên – kháng thể của BSA. 3. Cộng hợp IgGOTA lên polymer Sepharose 4B và tạo cột IAC Tiến hành cộng hợp IgGOTA lên polymer Sepharose 4B và tạo cột IAC Cột được bảo quản ở nhiệt độ 40C – 80C. Giá ái lực miễn dịch giữ hoạt tính ổn định ít nhất 1 năm Phụ lục 2. Quy trình chiết OTA đối với một số mẫu thực phẩm 1. Mẫu bia: 5 ml bia loại khí 1 ml NaCl 15%, NaHCO3 2% Cho chảy trực tiếp qua IAC Rửa 10 ml NaCl 2,5%, NaHCO3 0,5% 10 ml nước Giải hấp bằng 1,5 methanol Đo huỳnh quang dịch giải hấp 37 2. Mẫu cà phê : 3. Mẫu bắp: 25 g mẫu 50 g mẫu , 5 g NaCl 100 ml MEOH : H2O (8: 2) 50 ml MEOH: H2O (8: 2) Khuấy từ 500 vòng/phút, 30 phút Khuấy từ 500 vòng/phút,30 phút Lọc qua giấy lọc Lọc qua giấy lọc Pha loãng 10ml dịch lọc Pha loãng 10ml dịch lọc 40 ml nước sạch 40 ml PBS, 2% Tween 10 ml dịch pha loãng qua cột 10 ml dịch pha loãng qua cột Rửa 10 ml đệm rửa mycotoxin Rửa 10 ml PBS, 2% Tween 10 ml nước 10 ml nước Giải hấp bằng 1,5 methanol Giải hấp bằng 1,5 methanol Đo huỳnh quang dịch giải hấp Đo huỳnh quang dịch giải hấp Phụ lục 3. Các giai đọan phân tích OTA bằng cột IAC và huỳnh quang kế 38 1. Chiết mẫu và lọc dịch chiết 2. Cho dịch chiết chảy qua cột IAC 3. Giải hấp 4. Định lượng bằng huỳnh quang kế 39