Luận văn Góp phần nghiên cứu thiết lập quy trình sản xuất củ bi giống khoai tây (Solanum tuberosum L.) từ củ siêu bi in vitro

m (virus Y). Khi chắc chắn cây khoai tây không mang virus thì sẽ đƣợc đƣa vào nhân giống đại trà. 1.6.3.2 Tạo phôi và cây con khoai tây đơn bội bằng cách nuôi cấy túi phấn. Việc tạo các cây khoai tây đơn bội thông qua phƣơng pháp nuôi cấy túi phấn có thể việc trồng khoai tây bằng củ thành trồng khoai tây bằng hạt và còn có thuận lợi khác là cây trồng không bị virus nhƣ trồng từ củ. Thí nghiệm đƣợc tiến hành trên một dòng nhị bội H3-703 đƣợc chọn từ một quần thể lớn từ sự thụ phấn chéo giữa thể đơn bội Hồng Hà 236 và Hồng Hà 439. Việc chọn lọc dựa trên khả năng tạo phôi in vitro của cây mẹ. Chồi hoa đƣợc thu từ cây đang tăng trƣởng trong nhà kính, các chồi hoa sẽ đƣợc vô trùng, tui phấn đƣợc lấy ra và nuôi cấy trên môi trƣờng vô trùng. Trong quá trình nuôi cấy túi phấn về mặt tế bào học thì hạt phấn bắt đầu lần phân chia đầu tiên sau 2-4 ngày nuôi cấy và tiếp tục phát triển thành các cấu trúc đa bào, thoát ra khỏi lớp màng của hạt phấn sau 8-10 ngày. Sự phát triển thành phôi trọn vẹn diễn ra sau 19-22 ngày cấy trên môi trƣờng đặc. Môi trƣờng tốt nhất cho sự phát triển của phôi là môi trƣờng MS có bổ sung zeatin 10-6M và nƣớc dừa 10%. 1.6.4 Phƣơng pháp sản xuất củ giống mini sạch bệnh Là tiến bộ kỹ thuật trong sản xuất khoai tây ở Việt Nam và một số nƣớc trên thế giới. Hợp tác với CIP từ năm 1991, trung tâm nghiên cứu cây thực phẩm Đà Lạt đã tiến hành nghiên cứu và xây dựng quy trình công nghệ sản xuất củ giống mini sạch bệnh, nhờ điều kiện khí hậu ở Đà Lạt có thể ứng dụng kỹ thuật nuôi cây mô nhân nhanh giống khoai tây sạch bệnh quanh năm. Công nghệ này cho phép sản xuất với khối lƣợng lớn củ giống mini sạch bệnh các giống khoai tây có chất lƣợng cao cho một hệ thống sản xuất, cung cấp giống có phẩm chất tốt ở Việt Nam. 36 Sơ đồ sản xuất: Nhân giống trong ống nghiệm cắt một đoạn thân có lá Nhân trên khay cát Nhân trên luống mạ với đất nhiều dinh dƣỡng Cấy vào bầu đất 15 – 20 ngày Cây đạt tiêu chuẩn đƣa ra đồng ruộng Khoai tây củ nhỏ 2. Giới thiệu chung về kỹ thuật thuỷ canh (Hydroponics) Đất là giá thể tự nhiên, là môi trƣờng cung cấp đầy đủ các yếu tố cần thiết cho cây trồng sinh trƣởng và phát triển. Mặt khác đất cũng là nơi cƣ trú của các loại vi sinh vật gây bệnh, côn trùng gây hại – đó là những tác nhân hạn chế sự phát triển của cây trồng. Thuỷ canh là kỹ thuật trồng cây không dùng đất mà dùng các dung dịch dinh dƣỡng. Đây là một trong những phƣơng pháp canh tác tiên tiến nhất trong nền sản xuất hiện đại. Các nghiên cứu về thuỷ canh cho thấy sự sinh trƣởng và phát triển của cây trồng không nhất thiết dùng đất nhƣng các chất khoáng và dinh dƣỡng trong đất lại rất cần thiết cho sự sinh trƣởng và phát triển đó. Bằng hệ thống thuỷ canh, cây trồng có thể tăng trƣởng và phát triển mạnh do đƣợc cung cấp khoáng chất trực tiếp thông qua hệ thống rễ luôn đƣợc tiếp xúc trực tiếp với môi trƣờng dinh dƣỡng. Ngoài ra trong hệ thống nhà lƣới có thể điều chỉnh nhiệt độ môi trƣờng, độ ẩm và chế độ chiếu sáng phù hợp cho phép có thể trồng cây ở bất cứ thời điểm nào trong năm. Vì vậy bằng phƣơng pháp thuỷ canh chúng ta có thể nghiên cứu cây trồng chính xác hơn và có thể sản xuất với năng suất và phẩm chất tốt hơn. 37 Tình hình sản xuất thuỷ canh trong nƣớc và thế giới Tình hình thế giới Trƣớc sự phát triển của khoa học kỹ thuật, kỹ thuật thuỷ canh không ngừng đƣợc cải tiến. Những tiến bộ trong việc cải tạo hệ thống thuỷ canh những năm gần đây đã đƣợc áp dụng rộng rãi ở Châu Âu, đặc biệt là ở Anh, Đức, Hà Lan,… Thí dụ ở Hà Lan, diện tích nhà kính sử dụng cho trồng cây không dùng đất đã tăng từ khoảng 515 ha năm 1982 lên 800 ha năm 1983, ƣớc chừng khoảng 1000 ha năm 1984 (Van Or, 1982 và thông báo cá nhân) và trên 2000 ha năm 1986 (ISOSC, 1986). Tuy nhiên, không chỉ ở Châu Âu mà Hoa Kỳ cũng có lịch sử lâu dài đi tiên phong trong việc sử dụng kỹ thuật thuỷ canh, Nhật bản có công nghiệp nhà kính đặc biệt lớn đạt mức 27.079 ha năm 1977 (Shimidu, 1979) trong đó có 135 ha trồng thuỷ canh. Việc thƣơng mại hoá thuỷ canh đã đƣợc áp dụng hầu hết ở các nƣớc phát triển có khí hậu ôn hoà và không ngừng tại đó, kỹ thuật thuỷ canh đã mở rộng sang các nƣớc có điều kiện khí hậu và kinh tế kém thuận lợi hơn nhƣ Kuwait, Malaysia,… Tóm lại, kỹ thuật thuỷ canh đã phát triển đến một trình độ cao và trở thành thƣơng mại hoá để thu dƣợc nhiều lợi nhuận hơn từ trồng trọt. Vì vậy, kỹ thuật thuỷ canh đƣợc coi là công nghệ trồng cây của thế kỷ 21. Bảng 2.1:Tình hình sản xuất thuỷ canh của các nƣớc trên thế giới TT Tên nƣớc Năm Diện tích Cây trồng 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Hà Lan Tây Ban Nha Canada Pháp Nhật Bản Israen Bỉ Đức Newzealand Úc 1987 2001 1996 2001 1987 2001 1996 1984 1996 1996 1996 1996 2001 1996 3500 1.000 1.000 4.000 100 1.574 1.000 293 650 600 650 200 550 500 - Cà chua, dƣa leo, ớt, hoa cắt cành, cà tím, đậu, rau diếp - Cà chua, dƣa leo, ớt cà tím, dâu tây, rau diếp, hoa cúc, cảI củ - Rau diếp, dƣa leo, ớt - Cà chua - Cà chua, dƣa leo, rau diếp - Dƣa leo, ớt - Dƣa leo, ớt, cà chua, cà tím, hoa cắt cành - Cà chua, hành lá, rau diếp, dƣa hƣơng, dƣa leo - Hoa cắt cành, dâu tây, cà chua - Ớt, dƣa chili, dƣa leo, dƣa tây, rau diếp, Asian vegetables - Cà chua, dƣa leo, rau diếp, hoa cắt cành, 38 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 Anh Nam Phi Ý Mỹ Phần Lan Triều Tiên Mexico Trung Quốc Hi Lạp Braxil Đài Loan Singapo 1998 1984 1996 1990 1999 1984 1999 1996 1987 1996 1996 1999 1987 1999 1996 1999 1999 1996 392 75 420 50 400 228 400 370 274 15 120 5 120 33 60 50 35 30 dây tây, cây làm thuốc - Cà chua, dƣa leo, ớt - Cà chua, dƣa leo, rau diếp, hoa - Hoa hồng, cà chua, dâu tây, ephenra - Cà chua, dƣa leo, rau diếp - Cà chua, dƣa leo, rau diếp - Cà chua, dƣa leo, dƣa tây, rau diếp, ớt, cảI thìa, hẹ tây, hoa - Cà chua, dƣa leo, dƣa tây, ớt giòn, rau diếp, dâu tây - Cà chua, dƣa leo, ớt, rau diếp - Rau diếp, anugula, water caress Tổng diện tích: Thập niên 80 : 5.000 ha  6.000 ha Năm 2001 : 20.000 ha  25.000 ha Nguồn: www.ride.gov.au/reports/Index.htm Tình hình trong nƣớc Ở nƣớc ta, từ năm 1993, Đại học quốc gia Hà Nội đã phối hợp với Tổ Chức Nghiên Cứu và Triển Khai Hồng Kông (R & D Hồng Kông) đã tiến hành nghiên cứu toàn diện các khía cạnh khoa học kỹ thuật và kinh tế xã hội cho việc chuyển giao công nghệ và phát triển thuỷ canh tại Việt Nam. Năm 1995, dƣới sự chủ trì của Đại học Quốc Gia Hà Nội đã hình thành một mạng lƣới đồng bộ các cơ sở nghiên cứu và triển khai hàng đầu của đất nƣớc: Đại học Quốc Gia Hà Nội, Đại học Nông Nghiệp I, Sở Khoa Học Công Nghệ và Môi Trƣờng Hà Nội, Trung tâm giống cây trồng Việt-Nga, Viện dƣợc liệu và Viện nghiên cứu rau quả Trung Ƣơng. Tháng 10 năm 1995 kỹ thuật thuỷ canh đã đƣợc triển khai rộng rãi ở Hà Nội, TP Hồ Chí Minh, Côn Đảo… của các sở công nghệ, phân viện công nghệ sau thu hoạch ở một số tỉnh thành. Mục đích là thiết kế, sản xuất vật liệu cho thuỷ canh và trồng các loại cây khác nhau. 39 Tuy nhiên, kỹ thuật canh tác này còn rất mới mẻ so với tâp quán canh tác sản xuất của nông dân Việt nam. Đồng thời với chi phí sản xuất cao và kỹ thuật phức tạp cho nên hiện nay việc trồng thuỷ canh vẫn chƣa đƣợc phổ biến trên diện rộng. Những ƣu điểm và nhƣợc điểm của kỹ thuật thuỷ canh Ƣu điểm Không cần đất, chỉ cần không gian thì có thể tiến hành trồng đƣợc ở những nơi mà điều kiện trồng trọt bị hạn chế nhƣ hải đảo, vùng núi xa xôi, trong đô thị lớn… Điều chỉnh đƣợc dinh dƣỡng cho cây trồng tức là đảm bảo tính đồng đều trong việc cung cấp các chất dinh dƣỡng không thể thiếu cho tất cả các bộ phận của khu vực trồng trọt. Ít sử dụng thuốc trừ sâu bệnh và các chất độc hại khác, năng suất cao và có thể trồng liên tục, sản phẩm sạch, giàu chất dinh dƣỡng và tƣơi, sản phẩm không tích luỹ chất độc và không gây ô nhiễm môi trƣờng. Giảm bớt yêu cầu về lao động và cải thiện đƣợc điều kiện làm việc khỏi các công việc nặng nhọc nguy hiểm. Tiệc kiệm sử dụng nƣớc. Cải thiện năng suất và phẩm chất, đây là ƣu điểm quan trọng nhất của phƣơng pháp thuỷ canh. Rút ngắn đƣợc thời gian trồng trọt. Nhƣợc điểm Chi phí ban đầu cho hệ thống thuỷ canh còn khá cao, chƣa thuyết phục đƣợc ngƣời trồng trọt. Nếu trong hệ thống bị nhiễm bệnh thì bệnh này sẽ nhanh chóng lan truyền cho cả hệ thống. Yêu cầu phải nâng cao trình độ chuyên môn cho ngƣời lao động để đảm bảo quản lý hệ thống một cách an toàn và hiệu quả. 40 Các yếu tố ảnh hƣởng đến nuôi trồng thuỷ canh Ảnh hƣởng của dinh dƣỡng khoáng Dinh dƣỡng khoáng thực vật là một thành phần đặc biệt quan trọng của sự trao đổi chất trong cơ thể thực vật. Vì nó quyết định chiều hƣớng biến đổi sinh hoá các chất, sinh trƣởng, phát triển, năng suất và chất lƣợng cây trồng. Không phải mọi nguyên tố hiện diện trong sinh quyển và đƣợc thực vật hấp thu đều là nguyên tố thiết yếu. Một nguyên tố thiết yếu phải hội tụ đủ 3 yêu cầu: Cần thiết cho sự tăng trƣởng và phát triển bình thƣờng của thực vật Không thể thay thế bởi nguyên tố khác Có vai trò xác định sự biến dƣỡng thực vật, mà khi thiếu thực vật sẽ có triệu chứng thiếu đặc biệt và chết. Thực vật bậc cao cần rất nhiều nguyên tố dinh dƣỡng cho quá trình sinh trƣởng và phát triển. Nhƣng thực vật sử dung chủ yếu 16 nguyên tố dinh dƣỡng thiết yếu sau: 9 nguyên tố dinh dƣỡng đa lƣợng gồm: C.H,O,K,N,P,Ca,Mg,S. 7 nguyên tố dinh dƣỡng vi lƣợng gồm: Cu,Zn,Fe,Mn,B,Cl,Mo. Nguồn: theo tài liệu “Độ phì và Phân bón” Ảnh hƣởng của các loại môi trƣờng dinh dƣỡng và cách pha chế dung dịch dinh dƣỡng đến nuôi trồng thuỷ canh Ảnh hƣởng của các loại môi trƣờng dinh dƣỡng Việc xác định môi trƣờng dinh dƣỡng thích hợp cho các loại cây trồng là một yếu tố quan trọng trong phƣơng pháp trồng thuỷ canh. Việc trồng cây trong dung dịch dinh dƣỡng đầu tiên đƣợc thiết kế và triển khai phục vụ cho công tác nghiên cứu khoa học, đã đƣa ra cơ sở cho sự hiểu biết của chúng ta về dinh dƣỡng cây trồng. Cho dù trồng trong giá thể trơ hoặc là trồng trực tiếp trong dung dịch dinh dƣỡng có hay không có hồi lƣu thì việc xác định môi trƣờng dinh dƣỡng thích hợp nhất đòi hỏi trải qua nhiều thời gian để tiến hành thí nghiệm. Hewitt đã nhận xét rằng: “…có bao nhiêu thí nghiệm thì đã có bấy nhiêu chất dinh dƣỡng đƣợc ứng dụng thử”. Các công thức dinh dƣỡng hiện đại có chiều hƣớng cho thấy sự đồng nhất cao hơn bởi vì cây trồng muốn sinh trƣởng tốt thì cần đầy đủ các chất dinh dƣỡng cả vi lƣợng và đa lƣợng. 41 Bảng 2.2: Nồng độ một số dung dịch thƣờng đƣợc sử dụng trong thí nghiệm trồng cây bằng hệ thống thuỷ canh Nguyên tố Hoaland và Annon (1938) Hewitt (1996) Steiner (1984) Nitơ Photpho Kali Magiê Canxi Lƣu huỳnh Sắt Mangan Bo Đồng Kẽm Molyplen 210 31 234 48 160 64 2.5 0.5 0.5 0.02 0.05 0.01 168 41 156 36 16 48 2.8 0.55 0.54 0.064 0.065 0.048 167 31 277 49 183 111 1.33 0.62 0.44 0.02 0.11 0.048 Nguồn: theo L.Brader và Ctv 2.3.2.2 Ảnh hƣởng của cách pha chế đến nuôi trồng thuỷ canh Việc pha chế ảnh hƣởng rất lớn đến tính linh động của các nguyên tố trong môi trƣờng dinh dƣỡng vì nếu pha chế không đúng sẽ dẫn đến kết tủa các nguyên tố khoáng. Cho nên cần sắp xếp thứ tự các hoá chất dinh dƣỡng cho vào của công thức phải từ trên xuống, các ion khoáng phải cân bằng, pH phải không đổi. Biên độ pH phát triển tốt là từ 5.56.8 (tốt nhất là từ 5.86.2). 42 2.3.3 Ảnh hƣởng của điều kiện bên ngoài đến việc hấp thu dinh dƣỡng của cây trồng trong hệ thống thuỷ canh 2.3.3.1 Ánh sáng Trong quang hợp cây hấp thu năng lƣợng ánh sáng mặt trời. Quang hợp dự trữ năng lƣợng dạng hoá học để quá trình hô hấp diễn ra và giải phóng năng lƣợng nhờ sự oxy hoá cấc hợp chất hữu cơ phức tạp thành các chất đơn giản hơn nhằm cung cấp năng lƣợng cho mọi hoạt động sống của tế bào 2.3.3.2 Nhiệt độ Một số nghiên cứu đã thống nhất rằng: khi nhiệt độ ở một giới hạn hẹp đã làm tăng sự hút các chất dinh dƣỡng. Cây phát triển tốt trong dãy nhiệt độ giới hạn, nhiệt độ quá cao hay quá thấp sẽ làm cây phát triển bất bình thƣờng làm ảnh hƣởng đến năng suất. 2.3.3.3 Nƣớc Nƣớc là yếu tố ảnh hƣởng rất lớn đến chất lƣợng dung dịch dinh dƣỡng, nƣớc càng tinh khiết thì càng tốt. Nếu nƣớc hoá kiềm hay nhiễm mặn sẽ làm mất cân bằng dung dịch dinh dƣỡng. Cho nên nƣớc sử dụng pha dung dịch phải đảm bảo không ảnh hƣởng xấu làm thay đổi thành phần các nguyên tố của dung dịch đem pha ban đầu. 2.3.3.4 Nồng độ CO2 Nồng độ CO2 ảnh hƣởng trực tiếp đến sự quang hợp của cây, CO2 bình thƣờng bên ngoài trung bình khoảng 300ppm. Trong môi trƣờng ít CO2 cần cung cấp CO2 thuần khiết để đạt đến 100-1400ppm, nhƣ vậy sẽ làm tăng tính hấp thu nƣớc và chất dinh dƣỡng của cây. 2.3.3.5 Độ thoáng khí Cây cần một môi trƣờng thoáng khí, đặc biệt cần không khí cho vùng rễ. Đây là chỉ tiêu quan trọng nhất liên quan đến việc kiểm soát ô nhiễn dòng chảy. Độ thoáng khí càng cao thì càng thuận lợi cho hoạt động hô hấp và biến dƣỡng của bộ rễ. 2.3.3.6 pH Độ pH ảnh hƣởng trực tiếp đến khả năng hấp thu khoáng chất của cây trồng. Nếu pH cao sẽ làm giảm khả năng hấp thu Fe, Mn, Cu, Zn, P,…còn nếu pH thấp sẽ làm giảm khả năng hấp thu K, S, Ca, Mg. Vì thế pH thích hợp nhất cho dung dịch vào khoảng 5.5→6.8. 43 2.3.3.7 Độ dẫn điện Chỉ số EC chỉ diễn tả nồng độ ion hoà tan trong dung dịch chứ không thể hiện đƣợc nồng độ của từng thành phần riêng biệt. Trong suốt quá trình tăng trƣởng cây hấp thu khoáng chất mà chúng cần, do vậy duy trì EC ở một mức ổn định là rất quan trọng. 2.4 Một số giá thể sử dụng trong phƣơng pháp nuôi trồng thuỷ canh 2.4.1 Xơ dừa Đây là một loại giá thể rất dễ tìm và rẻ tiền. Trong xơ dừa có chứa 45% ligin, do đó thời gian phân huỷ chậm nên có thể tái sử dụng nhiều lần. Xơ dừa có khả năng giữ ẩm tốt và tạo đƣợc độ thông thoáng cao giúp cho bộ rễ của cây hô hấp tối đa. Tuy nhiên, trƣớc khi sử dụng xơ dừa phải xả nƣớc nhiều lần để giảm thành phần Na và K tự nhiên có trong xơ dừa, nếu không thì chính những thành phần này sẽ gây hại cho cây trồng. 2.4.2 Tro trấu Cũng nhƣ xơ dừa, tro trấu là vật liệu rất thƣờng đƣợc dùng cho trồng trọt thuỷ canh ở nƣớc ta. Tro trấu xốp, thoáng khí và giữ ẩm tốt nên thƣờng đƣợc dung làm giá thể cho việc trồng các loại rau quả. 2.4.3 Cát Cát đƣợc biết đến nhƣ một giá thể sử dụng rất sớm trong nuôi trồng thuỷ canh. Tuy nhiên, cát hấp thu nhiệt nhiều và không tạo độ thông thoáng do đó ít đƣợc sử dụng rộng rãi. 2.4.4 Perlite Perlite là một loại giá thể nhẹ, xốp và là sản phẩm từ đá núi lửa. Perlite có pH trung tính và đặc biệt perlite không còn thành phần hữu cơ nên tránh đƣợc sự phát triển của rong rêu. 2.4.5 Vermiculite Vermiculite có cấu trúc tƣơng tự nhƣ mica, có pH trung tính. Tuy nhiên, do vermiculite có chứa thành phần Mg và K tự nhiên nên chúng sẽ phóng thích những cation này ra môi trƣờng làm cho môi trƣờng hơi có tính acid. Bên cạnh đó, vermiculite phân huỷ theo thời gian nên làm nghẹt bơm trong các hệ thống thuỷ canh hồi lƣu. 44 2.4.6 Clay Pebbles Đây là một loại vật liệu xốp nhẹ, pH trung tính, thích hợp trong nuôi trồng thuỷ canh. Tuy nhiên, do tính mao dẫn kém nên không đƣợc dùng cho các loại cây lớn trong các chậu lớn. 2.5 Phân loại hệ thống thuỷ canh Hệ thống thuỷ canh đƣợc phân loại thành các dạng: Hệ thống hồi lƣu (dung dịch dinh dƣỡng đƣợc phân phối đến rễ, thu hồi lƣợng dƣ sau đó phục hồi thay mới và tái sử dụng trong vòng quay). Hệ thống không hồi lƣu (dung dịch dinh dƣỡng phân phối đến rễ cây trồng và không đƣợc tái sử dụng). Thuỷ canh thƣờng tận dụng những vật liệu sẵn có. Khi thực hiện cần lƣu ý một vài điều sau: o Dựa vào không gian để xây dựng một hệ thống thích hợp. o Chọn giá thể trồng thích hợp và có sẵn o Đạt năng suất phẩm chất và màu sắc hình dáng thích hợp, tránh côn trùng gây hại… Sơ đồ I.1: Phân loại hệ thống thuỷ canh Hệ thống phân loại thuỷ canh Canh tác trong dung dịch Canh tác trên giá thể Khí canh PP hồi lƣu - KT màng dinh dƣỡng (NFT) - KT dòng sâu (DFT) PP không hồi lƣu - KT ngâm rể - KT nổi - KT mao dẫn - KT túi treo - KT trồng trên túi - KT mƣơng hay rãnh - KT trồng chậu - KT phun bụi nƣớc - KT phun sƣơng 45 PHẦN 3: VẬT LIỆU – PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 1.Thời gian - địa điểm Đề tài đƣợc thực hiện tại phòng Công nghệ sinh học thuộc Viện nghiên cứu hạt nhân Đà Lạt trong khoảng thời gian từ tháng 02/2006 đến tháng 08/2006 2. Trang thiết bị vật liệu 2.1 Phòng thí nghiệm 2.1.1 Phòng rửa dụng cụ Bồn rửa dụng cụ Kệ để thiết bị nhƣ máy cất nƣớc, kệ đựng dụng cụ thuỷ tinh 2.1.2 Phòng chuẩn bị môi trƣờng Tủ để hoá chất Bình thuỷ tinh Các dụng cu cần thiết để pha môi trƣờng Cân kĩ thuật pH kế Tủ sấy đối lƣu Autoclave Tủ lạnh đựng hoá chất Dụng cụ nấu môi trƣờng 2.1.3 Phòng cấy vô trùng 2.1.4 Phòng nuôi cấy mẫu Kệ để mẫu Đèn huỳnh quang có hệ thống điều chỉnh cƣờng độ và thời gian chiếu sáng Tủ tối để sản xuất củ siêu bi 2.1.5 Một số thiết bị khác Ngoài các thiết bị máy móc đƣợc trang bị ở các phòng nhƣ kể trên, phòng thí nghiệm còn có một số dụng cụ khác: Erlen (bình tam giác) 46 Đĩa petri Pipet, ống đong Kẹp dài, dao cấy, kéo Becher, bình định mức 2.2 Nhà lƣới Hệ thống thuỷ canh trên cát (Drip system) 3. Môi trƣờng 3.1 Môi trƣờng sử dụng trong thí nghiệm tạo củ siêu bi Sử dụng môi trƣờng MS (Murashige & Skoog). Gồm các thành phần sau: Khoáng đa lƣợng Amonium nitrat NH4NO3 1,650 (mg/l) Kalium nitrat KNO3 1,90 Monokalium nitrat KH2PO4 1,70 Magiesium sulfat MgSO4.7H2O 370 Calcium clorua CaCl2.2H2O 440 Khoáng vi lƣợng Dinatrium ethylen diamin tetra acetic Na2EDTA 37,3 Sắt sulfat FeSO4.7H2O 27,8 Mangan sulfat MgSO4.H2O 22,3 Acid boric H3PO4 6,2 Kẽm sulfat ZnSO4.4H2O 8,6 Kalium iodua KI 0,83 Natrium molypolat Na2MoO4.2H2O 0,25 Đồng sulfat CuSO4.5H2O 0,025 Coban clorua CoCl.6H2O 0,025 Vitamin Myo – inositol 200 Pyridoxine (B6) 0,50 Glycine 2 47 Acid nicotine 0,50 Thiamin.HCl (B1) 0.1 Các chất khác Đƣờng saccarose 80g/l Agar 7g/l Chất điều hoà sinh trƣởng BAP 3.2 Môi trƣờng sử dụng trong thí nghiệm tạo củ bi bằng hệ thống thuỷ canh trên cát. Đa lƣợng CT chung (mg/l) CT1 CT2 CT3 CaNO3 400 300 300 300 KNO3 200 200 300 400 KH2PO4 200 300 400 600 MgSO4 350 350 350 400 KCl 100 200 Vi lƣợng Fe 5 (ppm) Mg 0.5 Cu 0.03 Zn 0.05 B 0.5 Mo 0.02 4. Vật liệu Củ siêu bi khoai tây đƣợc tạo ra từ cây khoai tây nuôi cấy mô nuôi cấy trong phòng thí nghiệm của phòng Công nghệ sinh học thuộc Viện nghiên cứu hạt nhân Đà Lạt. 5. Quy trình thực hiện thí nghiệm  Bƣớc 1: Từ mẫu khoai tây do phòng thí nghiệm cung cấp, tiến hành nuôi cấy in vitro tạo củ siêu bi để làm nguyên liệu cho thí nghiệm. Đồng thời tiến hành thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng của một số chất hoá học lên quá trình tạo củ. 48  Bƣớc 2: Trồng thuỷ canh củ khoai tây siêu bi đã qua giai đoạn xử lý cho nảy mầm trong nhà lƣới với các điều kiện thí nghiệm khác nhau.  Bƣớc 3: Nghiên cứu sự sinh trƣởng, phát triển của cây và năng suất tạo củ bi của cây nuôi cấy mô ở các điều thí nghiệm khác nhau. 6. Phƣơng pháp thí nghiệm 6.1 Thí nghiệm về tạo củ siêu bi ống nghiệm 6.1.1 Thí nghiệm về ảnh hƣởng của BAP lên quá trình tạo củ siêu bi Theo nhận định của các nhà khoa học, BAP là yếu tố rất cần thiết cho quá trình tạo củ ở cây khoai tây. Chúng tôi tiến hành thí nghiệm này nhằm khảo sát ảnh hƣởng của các nồng độ BAP lên quá trình tạo củ in vitro. 6.1.2 Thí nghiệm về ảnh hƣởng của Vanadium lên quá trình tạo củ siêu bi Theo nhận định của Pratt năm 1966 thì Vanadium là tác nhân gây ức chế sự phát triển của thân, lá, rễ ở thực vật. Chúng tôi tiến hành thí nghiệm nhằm đánh giá ảnh hƣởng của Vanadium lên khả năng tạo củ khoai tây in vitro. 6.1.3 Thí nghiêm về ảnh hƣởng của Chitosan lên quá trình tạo củ siêu bi Chitosan là chất có tác dụng làm tăng kích cỡ củ và khả năng kháng bệnh của củ. Thí nghiệm này nhằm khẳng định lại nhận định trên và tìm ra khoảng nồng độ có tác động thích hợp nhất đối với sự tạo củ khoai tây in vitro.  Mô tả thí nghiệm Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên gồm 3 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức lặp lại 4 lần, mỗi lần 1 chai, mỗi chai gồm 10 mẫu. Số chai dùng cho 1 nghiệm thức: 4 chai. Số mẫu dùng cho mỗi nghiệm thức: 40 mẫu. Mẫu đƣợc cắt từ cây khoai tây nuôi cấy in vitro dài khoảng 1 cm sao cho mỗi mẫu có một lá (tức mỗi mẫu chứa một chồi nách), mẫu đƣợc cấy vào môi trƣờng nuôi cấy có bổ sung BAP (theo nồng độ thí nghiệm) và một số chất khác (Chitosan và Vanadium). Các thao tác đều đƣợc tiến hành trong điều kiện vô trùng. Mẫu đƣợc nuôi trong điều kiện không có ánh sáng. Thời gian thực hiện thí nghiệm là 45 ngày. 49 Các thí nghiệm đƣợc tiến hành nhƣ mô tả ở các bảng: Bảng 3.1: Mô tả thí nghiệm về ảnh hƣởng của BAP lên quá trình tạo củ siêu bi Tên NT Nồng độ BAP (mg/l) Mẫu cấy Số chai Số mẫu cấy B1 B2 B3 2 2.5 3 Chồi nách cây KT Chồi nách cây KT Chồi nách cây KT 4 4 4 40 40 40 Bảng 3.2 : Mô tả thí nghiệm về ảnh hƣởng của Vanadium lên quá trình tạo củ siêu bi (sử dụng BAP với nồng độ 2.5mg/l) Tên NT Nồng độ Vanadium (mg/l) Mẫu cấy Số chai Số mẫu cấy V0 V20 V50 V100 V150 V200 0 20 50 100 150 200 Chồi nách cây KT Chồi nách cây KT Chồi nách cây KT Chồi nách cây KT Chồi nách cây KT Chồi nách cây KT 4 4 4 4 4 4 40 40 40 40 40 40 50 Bảng 3.3 : Mô tả thí nghiệm về ảnh hƣởng của Chitosan lên quá trình tạo củ siêu bi (sử dụng BAP với nồng độ 2.5mg/l) Tên NT Nồng độ Chitosan (mg/l) Mẫu cấy Số chai Số mẫu cấy C0 C50 C100 C150 C200 C500 C1000 0 50 100 150 200 500 1000 Chồi nách cây KT Chồi nách cây KT Chồi nách cây KT Chồi nách cây KT Chồi nách cây KT Chồi nách cây KT Chồi nách cây KT 4 4 4 4 4 4 4 40 40 40 40 40 40 40  Chỉ tiêu theo dõi Số mẫu tạo củ Tỷ lệ các kích cỡ củ 6.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hƣởng của các công thức dinh dƣỡng lên quá trình tạo củ bi ở cây khoai tây  Mục đích của thí nghiệm Thí nghiệm nhằm mục đích khảo sát ảnh hƣởng của các thành phần dinh dƣỡng đến quá trình tạo củ của cây khoai tây nuôi trồng trên hệ thống thuỷ canh trên cát để tìm ra công thức dinh dƣỡng thích hợp nhất cho tỷ lệ tạo củ nhiều, số lƣợng củ đạt yêu cầu cao và đồng đều về kích cỡ.  Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên gồm 3 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần, mỗi lần 80 củ siêu bi đã qua giai đoạn tiền xử lý cho nảy mầm, trồng với mật độ 8 8 cm. 51 Tiến hành thí nghiệm với mỗi nghiệm thức một công thức dinh dƣỡng, tƣới tuần 2 lần, mỗi lần tƣới phải đảm bảo 1 cây nhận đƣợc 200ml dung dịch dinh dƣỡng. Thời gian thực hiện thí nghiệm: 80 ngày. Thí nghiệm đƣợc bố trí theo mô tả ở bảng: Bảng 3.4: Mô tả thí nghiệm về ảnh hƣởng của các công thức dinh dƣỡng lên quá trình tạo củ bi. Tên NT Mẫu thí nghiệm Số mẫu /lần lặp lại Số lần lặp lại Tổng số mẫu CT1 CT2 CT3 Củ siêu bi KT Củ siêu bi KT Củ siêu bi KT 80 80 80 3 3 3 240 240 240  Chỉ tiêu theo dõi Số củ trung bình / gốc Tỷ lệ các kích cỡ củ 6.3 Thí nghiệm 3: Ảnh hƣởng của tần số cung cấp dinh dƣỡng lên quá trình tạo củ bi của cây khoai tây  Mục đích của thí nghiệm Thí nghiệm nhằm khảo sát ảnh hƣởng của tần số cung cấp các thành phần dinh dƣỡng lên quá trình tạo củ bi khoai tây để tìm ra tần số cung cấp dinh dƣỡng thích hợp nhất cho tỷ lệ tạo củ đạt yêu cầu cao, củ đồng đều về kích cỡ.  Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên gồm 3 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần, mỗi lần 80 củ khoai tây siêu bi đã qua giai đoạn xử lý cho nảy mầm, trồng với mật độ 8 8 cm. 52 Tiến hành tƣới với mỗi nghiệm thức một tần số cung cấp dinh dƣỡng khác nhau, sử dụng công thức dinh dƣỡng 2 (CT2), mỗi lần tƣới phải đảm bảo mỗi cây phải nhận đƣợc 200ml dinh dƣỡng. Thời gian thực hiện đề tài:80 ngày. Thí nghiệm đƣợc bố trí theo bảng: Bảng 3.5: Mô tả thí nghiệm về ảnh hƣởng của tần số cung cấp dinh dƣỡng lên quá trình tạo củ bi Tên NT Tần số tƣới (lần/tuần) Mẫu thí nghiệm Số mẫu /lần lặp lại Số lần lặp lại Tổng số mẫu T1 T2 T3 1 2 3 Củ siêu bi KT Củ siêu bi KT Củ siêu bi KT 80 80 80 3 3 3 240 240 240  Chỉ tiêu theo dõi Số củ trung bình / gốc Tỷ lệ các kích cỡ củ 6.4 Thí nghiệm 4: Ảnh hƣởng của mật độ trồng lên quá trình tạo củ bi của cây khoai tây  Mục đích của thí nghiệm Thí nghiệm nhằm mục đích xác định ảnh hƣởng của mật độ trồng lên khả năng tạo củ của cây khoai tây để tìm ra mật độ trồng thích hợp nhất cho kết quả tạo củ cao, tỷ lệ củ đạt yêu cầu lớn, củ đồng đều về kích thƣớc.  Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm gồm 3 nghiệm thức đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần, mỗi lần 80 củ khoai tây siêu bi đã qua giai đoạn xử lý cho nảy mầm, trồng với mật độ 8 8 cm. Mỗi nghiệm thức là một mật độ trồng khác nhau, sử dụng công thức dinh dƣỡng 2 (CT2), tuần tƣới 2 lần, mỗi lần tƣới đảm bảo mỗi cây nhận đƣợc 200ml dinh dƣỡng. 53 Thời gian thực hiện thí nghiệm: 80 ngày Thí nghiệm đƣợc bố trí theo bảng: Bảng 3.6: Mô tả thí nghiệm về ảnh hƣởng của mật độ trồng lên quá trình tạo củ bi Tên NT Mật độ trồng (cm) Mẫu thí nghiệm Số mẫu /lần lặp lại Số lần lặp lại Tổng số mẫu M1 M2 M3 5 5 8 8 12 12 Củ siêu bi KT Củ siêu bi KT Củ siêu bi KT 80 80 80 3 3 3 240 240 240 Mật độ 5 x 5cm Mật độ 8 x 8cm Mật độ 12 x 12cm Hình 3.1: Mật độ trồng  Chỉ tiêu theo dõi Số củ trung bình / gốc Tỷ lệ các kích cỡ củ 54 6.5 Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hƣởng của BAP lên quá trình tạo củ bi của cây khoai tây  Mục đích của thí nghiệm BAP nội sinh là yếu tố cần thiết cho sự tạo củ của cây khoai tây. Chúng tôi tiến hành thí nghiệm này nhằm khảo sát ảnh hƣởng của BAP ngoại sinh lên quá trình tạo củ của cây khoai tây nhằm đƣa ra kết luận có hay không nên phun bổ sung BAP ngoại sinh lên lá khoai tây vào giai đoạn hình thành tia củ.  Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm gồm 4 nghiệm thức đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần, mỗi lần 80 củ khoai tây siêu bi đã qua giai đoạn xử lý cho nảy mầm, đƣợc trồng với mật độ 8 8 cm. Mỗi lô đƣợc phun BAP với nồng độ khác nhau vào thời kì hình thành tia củ (sau khi trồng khoảng 30 ngày) cho đến trƣớc ngày thu hoạch 10 ngày, BAP đƣợc phun trên lá mỗi tuần 2 lần. Sử dụng công thức dinh dƣỡng 2, tuần tƣới 2 lần, mỗi lần tƣới phải đảm bảo mỗi cây nhận đƣợc 200ml dung dịch dinh dƣỡng. Thời gian thực hiện thí nghiệm: 80 ngày Thí nghiệm đƣợc bố trí theo bảng: Bảng 3.7: Mô tả thí nghiệm về ảnh hƣởng của BAP lên quá trình tạo củ bi Tên NT Nồng độ BAP (mg/l) Mẫu thí nghiệm Số mẫu /lần lặp lại Số lần lặp lại Tổng số mẫu BA0 BA1 BA2 BA3 0 2 5 10 Củ siêu bi KT Củ siêu bi KT Củ siêu bi KT Củ siêu bi KT 80 80 80 80 3 3 3 3 240 240 240 240  Chỉ tiêu theo dõi Số củ trung bình / gốc Tỷ lệ các kích cỡ củ 55 7. Xử lý kết quả Kết quả đƣợc xƣ lý bằng phần mềm EXCEL. 56 PHẦN IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Thí nghiệm 1: 4.1.1 Thí nghiệm về ảnh hƣởng của BAP lên quá trình tạo củ siêu bi khoai tây Sau 45 ngày thực hiện thí nghiệm, các mẫu phát triển rất tốt, bắt đầu tạo củ sau khoảng 7 ngày nuôi cấy. Ở nghiệm thức B3 các mẫu phát triển thân nhanh, tất cả các củ đƣợc tạo trên đọan thân này. Còn ở nghiệm thức B1 có cả củ đƣợc tạo trên thân và ngay tại vị trí nách lá. Củ siêu bi ở nghiệm thức B3 lớn nhanh, củ to tròn đều, còn các củ đƣợc tạo ngay trên nách lá có hình bầu dục không đều. Kết quả của thí nghiệm đƣợc trình bày ở bảng sau: Bảng 4.1: Kết quả thí nghiệm về ảnh hƣởng của BAP lên quá trình tạo củ siêu bi. Tên NT Tỷ lệ kích cỡ củ Số mẫu tạo củ (%) Trọng lƣợng trung bình (mg) L (%) M (%) S (%) B1 B2 B3 6 14 30 72 76 65 22 10 5 95 100 100 22.87 ± 1.94 29.78 ± 1.35 39.5 ± 0.96 Biểu đồ 4.1: Tỷ lệ các kích cỡ củ trong thí nghiệm ảnh hƣởng của BAP lên sự tạo củ siêu bi ống nghiệm. 0 10 20 30 40 0 60 70 80 B1 B2 B3 L M S 57 Biểu đồ 4.2: Biểu đồ thể hiện trọng lƣợng củ trung bình trong thí nghiệm ảnh hƣởng của BAP lên sự tạo củ siêu bi. Kết quả tốt nhất khi bổ sung vào môi trƣờng tạo củ BAP với nồng độ 3mg/l. Khi tăng nồng độ BAP, sẽ làm tăng tỷ lệ củ lớn và làm giảm tỷ lệ củ nhỏ, điều này có nghĩa nồng độ BAP cao làm tăng đáng kể kích cỡ củ siêu bi ống nghiệm. Nghiệm thức B3 cho tỷ lệ củ lớn cao (30%) và giảm đáng kể tỷ lệ củ nhỏ (5%) trong khi nồng độ BAP thƣờng đƣợc sử dụng trong môi trƣờng tạo củ là 2mg/l cho tỷ lệ củ trung cao (72%) nhƣng tỷ lệ củ nhỏ là cao nhất trong các nghiệm thức (22%), củ lớn ít. Điều này đã làm cho trọng lƣợng củ trung bình ở B3 cao hơn hẳn ở B1. Nhƣ vậy qua thí nghiệm này chúng tôi đƣa ra nhận định nồng độ BAP có ảnh hƣởng đến kích cỡ củ, cụ thể là khi tăng nồng độ BAP bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy sẽ làm tăng kích cỡ củ siêu bi ống nghiệm. Trong các thí nghiệm nghiên cứu về cây khoai tây, các nhà khoa học nhận thấy có sự xuất hiện của BAP nội sinh trong quá trình hình thành củ của cây khoai tây, nhƣ vậy trong điều kiện nuôi cấy trong tối cây khoai tây không thể tổng hợp để tạo các chất cần thiết cho việc tạo củ, cụ thể là chất BAP nội sinh, vì vậy việc bổ sung thêm BAP vào môi trƣờng tạo củ là rất cần thiết. Vậy để giải thích nhận định chúng tôi đã đƣa ra trong quá trình thực hiện thí nghiệm, chúng tôi cho rằng sở dĩ có kết quả nhƣ trên là do khi bổ sung BAP với nồng độ thấp thì sẽ không đủ cung cấp cho cây 58 tạo củ, vì vậy củ sẽ nhỏ và không đồng đều. Còn khi ta tăng nồng độ BAP bổ sung thí sẽ thúc đẩy quá trình tạo củ của cây nên củ to và đồng đều hơn. Kết quả nghiên cứu sự ảnh hƣởng của BAP lên sự hình thành của ở cây khoai tây ống nghiệm đã đƣợc thực hiện bởi Badawi, năm 1995. Một nhóm các khoa học là Xuan Chun Piao, Debasis Chakrabarty, Eun Joo Hahn và Kee Yoeup Paek cũng đã đƣa ra kết quả tƣơng tự khi tiến hành nghiên cứu ảnh hƣởng của BAP lên sự sản xuất củ siêu bi ống nghiệm trong hệ thống bioreactor. A B C Hình 4.1: Ảnh hƣởng của BAP lên sự tạo củ siêu bi A: nồng độ BAP 2mg/l B: nồng độ BAP 2.5mg/l C: nồng độ BAP 3mg/l 4.1.2 Thí nghiêm về ảnh hƣởng của Vanadium lên quá trình tạo của siêu bi Sự hình thành củ siêu bi của các mẫu khoai tây ống nghiệm có sự khác nhau giữa các lô nghiệm thức. Có một nhận xét là tất cả các củ đều đƣợc tạo thành trên thân. Ở lô nghiệm thức V50 và V100 củ lớn nhanh, tròn to đều hơn so với các nghiệm thức còn lại. Ở các nghiệm thức có nồng độ Vanadium cao kết quả cho củ rất xấu, củ nhỏ và không đều nhau, sự phát triển của củ chậm. Kết quả của thí nghiệm đƣợc mô tả ở bảng sau: 59 Bảng 4.2: Kết quả thí nghiệm ảnh hƣởng của Vanadium lên quá trình tạo củ siêu bi Tên NT Nồng độ Vanadium (mg/l) Tỷ lệ kích cỡ củ Số mẫu tạo củ (%) Trọng lƣợng trung bình (mg) L (%) M (%) S (%) V0 V20 V50 V100 V150 V200 0 20 50 100 150 200 14 25 57 52 12 76 70 43 45 26 23 10 5 3 62 77 100 100 100 95 75 64 24.15 ± 0.86 28.18 ± 1.07 39.1 ± 1.25 35.27 ± 1.08 22.15 ± 0.78 14.07 ± 0.95 Biểu đồ 4.3: Tỷ lệ các kích cỡ củ trong thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng của Vanadium lên quá trình tạo củ siêu bi 0 10 20 30 40 50 60 70 80 V0 V20 V50 V100 V150 V200 L M S 60 Biểu đồ 4.4: Biểu đồ thể hiện trọng lƣợng củ trung bình trong thí nghiệm về ảnh hƣởng của Vanadium lên quá trình tạo củ siêu bi Dựa trên kết quả thu đƣợc chúng tôi nhận thấy bổ sung Vanadium với nồng độ trong khoảng 50 – 100mg/l cho kết quả tốt nhất. Khi nồng độ Vanadium càng cao thì càng làm giảm tỷ lệ tạo củ. Ở nghiệm thức V150 và V200 ta thấy tỷ lệ củ nhỏ cao, có sự khác biệt đáng kể so với các nghiệm thức khác. Ở nghiệm thức V200 hoàn toàn không có củ có kích thƣớc to, ở V150 có củ to nhƣng tỷ lệ rất thấp. So sánh kết quả thu đƣợc ở hai nghiệm thức này với lô đối chứng V0 thì thấy kết quả không tốt bằng. Ở khoảng nồng độ 50 – 100mg/l, Vanadium có tác dụng làm tăng kích cỡ củ. Ở đây ta thấy tỷ lệ củ lớn tăng, giảm đáng kể tỷ lệ củ nhỏ. So với lô đối chứng thì kết quả cho thấy ở 2 lô nghiệm thức này cho kết quả tốt hơn. Qua kết quả thu đƣợc qua thí nghiệm này chúng tôi thấy khi sử dụng Vanadium với nồng độ cao sẽ gây ức chế khả năng tạo củ của cây khoai tây trong điều kiện thí nghiệm của chúng tôi. Chúng tôi cho rằng hiện tƣợng này là do Vanadium đã gây độc đối với cây trồng trong điều kiện thí nghiệm, điều này đã làm cho cây trồng giảm sức sống, kiềm hãm sự phát triển của củ. Thí nghiệm của Pratt năm 1966 về ảnh hƣởng của Vanadium lên cây 61 trồng cũng đã đƣa ra nhận xét những cây trồng trong điều kiện chứa Vanadium cao sẽ mang một số triệu chứng bị độc nhƣ cây bị úa vàng lá, thấp lùn, kiềm hãm sự phát triển của rễ. Peterson và Girling năm 1981 trong thí nghiệm của mình cũng đã đƣa ra kết luận Vanadium ngăn cản các hệ thống enzyme khác nhau trong khi lại kích thích những cái khác, gây ảnh hƣởng đến toàn bộ làm cây sinh trƣởng trong thế bị động. 4.1.3 Thí nghiệm về ảnh hƣởng của Chitosan lên quá trình tạo củ siêu bi Sau 45 ngày quan sát quá trình tạo củ của mẫu khoai tây trên môi trƣờng có bổ sung Chitosan, chúng tôi nhận thấy củ siêu bi ở các nghiệm thức có sự phát triển không đều. Sau 7 ngày nuôi cấy trong điều kiện không có ánh sáng các mẫu bắt đầu tạo củ, củ hầu hết đƣợc tạo ra từ thân. Ở C50 và C100 củ phát triển rất nhanh, củ to và đều, hoàn toàn không thu hoạch đƣợc củ nhỏ. Ở các nghiệm thức sau kết quả tạo củ bắt đầu xấu đi theo chiều tăng của nồng độ Chitosan. Nghiệm thức C1000 cho kết quả rất xấu, củ chỉ hơi phình to, hoàn toàn không thu đƣợc củ trung và lớn. Kết quả về khả năng tạo củ ở các nghiệm thức thu đƣợc sau 45 ngày nuôi cấy mẫu đƣợc thể hiện ở bảng sau: Bảng 4.3: Kết quả thí nghiệm ảnh hƣởng của Chitosan lên quá trình tạo củ siêu bi Tên NT Nồng độ Chitosan (mg/l) Tỷ lệ kích cỡ củ Số mẫu tạo củ (%) Trọng lƣợng trung bình (mg) L (%) M (%) S (%) C0 C50 C100 C150 C200 C500 C1000 0 50 100 150 200 500 1000 14 55 50 20 5 76 45 50 15 15 5 10 65 80 90 100 100 100 100 95 71 64 50 24.63 ± 1.56 40.12 ± 1.19 41.28 ± 1.54 29.32 ± 1.19 18.68 ± 0.9 10.85 ± 0.95 7.42 ± 0.57 62 Biểu đồ 4.5: Tỷ lệ các kích cỡ củ trong thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng của Chitosan quá trình tạo củ siêu bi. 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 C0 C50 C100 C150 C200 C500 C1000 L M S Biểu đồ 4.6: Biểu đồ thể hiện trọng lƣợng củ trung bình trong thí nghiệm về ảnh hƣởng của Chitosan lên quá trình tạo củ siêu bi 63 Dựa trên kết quả thu đƣợc chúng tôi nhận thấy khi tăng nồng độ Chitosan càng cao thì càng làm giảm tỷ lệ tạo củ. Ở nghiệm thức C1000 chu chỉ hơi phình to, tỷ lệ tạo củ rất thấp, chỉ có cỡ củ nhỏ với tỷ lệ 100%. Nghiệm thức C200 và C500 cũng có hiện tƣợng làm giảm tỷ lệ tạo củ và kích cỡ củ nhƣng ít hơn so với C1000, kết quả xấu hơn so với đối chứng C0. Ở nghiệm thức C50 và C100 cho kết quả rất tốt, có sự sai khác rõ rệt so với đối chứng. Ở 2 nghiệm thức này tỷ lệ tạo củ rất cao, đạt 100% mẫu cấy tạo củ. Kích thƣớc củ tăng lên đáng kể, hoàn toàn không có củ nhỏ, củ lớn nhiều, củ đồng đều. Kết luận: khi bổ sung vào môi trƣờng tạo củ Chitosan với nồng độ trong khoảng 50 – 100mg/l cho kết quả tạo củ rất tốt. Nhƣ vậy ở đây chúng tôi có nhận định là Chitosan có tác dụng làm tăng kích cỡ củ, nhƣng khi bổ sung Chitosan vào môi trƣờng tạo củ với nồng độ quá cao ( khoảng 200 – 1000mg/l) thì có tác dụng ngƣợc lại tức nó gây ức chế khả năng tạo củ của cây. 4.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hƣởng của các công thức dinh dƣỡng lên quá trình tạo củ bi ở cây khoai tây Quan sát sự sinh trƣởng và phát triển của các cây khoai tây ở các nghiệm thức chúng tôi nhận thấy không có sự khác biệt rõ rệt giữa các lô nghiệm thức. Chỉ có sự khác biệt về màu sắc của lá ở các nghiệm thức, ở nghiệm thức CT1 lá xanh đậm hơn so với 2 nghiệm thức còn lại, còn ở nghiệm thức CT3 lá hơi vàng. Kết quả thu đƣợc về năng suất tạo củ ở các lô nghiệm thức đƣợc thể hiện ở bảng sau: Bảng 4.4: Kết quả thí nghiệm về ảnh hƣởng của các công thức dinh dƣỡng lên quá trình tạo củ bi. Tên NT Tỷ lệ kích cỡ củ Số củ / gốc L (%) M (%) S (%) CT1 CT2 CT3 13.8 5.28 2.82 57.01 38.91 45.51 29.14 55.8 51.67 9.87 13.5 6.95 64 Biểu đồ 4.7: Tỷ lệ các kích cỡ củ trong thí nghiệm về ảnh hƣởng của các công thức dinh dƣỡng lên quá trình tạo củ bi. 0 10 20 30 40 50 60 CT1 CT2 CT3 L M S Qua kết quả thu đƣợc ở bảng 4.4 và biểu đồ 4.7, chúng tôi nhận thấy sử dụng công thức dinh dƣỡng 1 (CT1) cho kết quả tốt nhất. Ở CT2 có sự sai khác rõ rệt về số củ trung bình / gốc so với CT1 và CT3, nhƣng ở CT2 cho tỷ lệ củ nhỏ (S) khá cao (55.8%), làm giảm đáng kể tỷ lệ củ đạt yêu cầu đề ra (có trọng lƣợng 3 – 7g / củ). CT1 cho tỷ lệ củ lớn (L) và trung (M) cao, có sự sai khác rõ rệt so với các công thức khác, làm giảm đáng kể tỷ lệ củ nhỏ không đạt yêu cầu (29.14%). Nhƣ vậy ta thấy ở lô nghiệm thức sử dụng công thức dinh dƣỡng 1 cho kết quả rất tốt với tỷ lệ củ đạt yêu cầu cao, giảm đáng kể tỷ lệ củ nhỏ so với hai nghiệm thức còn lại, rất phù hợp cho việc áp dụng để sản xuất củ bi khoai tây làm giống. 65 Hình 4.2: Tỷ lệ các kích cỡ củ trong thí nghiệm về ảnh hƣởng của các công thức dinh dƣỡng lên quá trình tạo củ bi. 4.3 Thí nghiệm 3: Ảnh hƣởng của tần số cung cấp dinh dƣỡng lên quá trình tạo củ bi của cây khoai tây Quan sát sự sinh trƣởng và phát triển ở cây khoai tây sau 80 ngày trồng thí nghiệm chúng tôi có nhận xét: Cây khoai tây ở lô nghiệm thức T1 sinh trƣởng rất chậm so với hai nghiệm thức còn lại. Ở nghiệm thức này cây thấp lá vàng, khả năng chống chịu bệnh kém, bệnh dễ lây lan qua các cây ở xung quanh trong cùng lô. Cây khoai tây ở nghiệm thức T3 sinh trƣởng và phát triển rất tốt, cây lớn nhanh, lá to và xanh đậm, nhiều nhánh. Lô nghiệm thức này cây ít bị bệnh, khi bị nhiễm bệnh thì sự lây lan qua các cây khác chậm, chứng tỏ cây chống chịu bệnh tốt hơn so với nghiệm thức T1. So sánh cả 3 nghiệm thức thì cây ở nghiệm thức T3 sinh trƣởng và phát triển tốt nhất. Kết quả thu đƣợc về năng suất tạo củ của các lô nghiệm thức đƣợc thể hiện ở bảng sau: Bảng 4.5: Kết quả thí nghiệm về ảnh hƣởng của tần số cung cấp dinh dƣỡng lên quá trình tạo củ bi Tên NT Tỷ lệ kích cỡ củ Số củ / gốc L (%) M (%) S (%) T1 T2 T3 14.2 5.28 20.27 51.19 38.91 57.19 34.61 55.8 21.73 8.17 13.5 10.82 CT1 CT2 CT3 CT1 CT2 CT3 66 Biểu đồ 4.8: Tỷ lệ các kích cỡ củ trong thí nghiệm về ảnh hƣởng của tần số cung cấp dinh dƣỡng lên quá trình tạo củ bi. 0 10 20 30 40 50 60 T1 T2 T3 L M S Qua kết quả thu đƣợc ở bảng 4.5 và biểu đồ 4.8 chúng tôi nhận thấy tần số cung cấp dinh dƣỡng 3 lần / tuần cho kết quả tốt nhất. Ở nghiệm thức T3 cho tỷ lệ tạo củ cao hơn so với nghiệm thức đối chứng (T2), tỷ lệ củ trung rất cao (57.19%), làm giảm đáng kể tỷ lệ tạo củ nhỏ. Nhƣ vậy tỷ lệ củ đạt yêu cầu đề ra rất cao, rất phù hợp với việc sản xuất khoai tây bi giống. Ở nghiệm thức T1 cũng cho tỷ lệ củ trung cao nhƣng tỷ lệ tạo củ thấp, không tốt bằng nghiệm thức T2. Nhƣng ở lô nghiệm thức T2 tỷ lệ tạo củ lớn thấp, chủ yếu cây chỉ tạo cỡ củ nhỏ với tỷ lệ khá cao (55.8%), nhƣ vậy là không đạt yêu cầu đề ra. Vậy qua kết quả thu đƣợc ở thú nghiệm này chúng tôi đƣa ra nhận định tần số tƣới dinh dƣỡng 3 lần / tuần là tốt nhất, cho tỷ lệ củ đạt yêu cầu nhiều nhất đối với các nghiệm thức của thí nghiệm. Để giải thích cho nhận định này chúng tôi cho rằng cây khoai tây là loại cây đòi hỏi chế độ dinh dƣỡng cao, nhất là vào giai đoạn hình thành củ. Ở T1 chúng tôi cung cấp dinh dƣỡng cho cây với tần số 1 lần/tuần, nhƣ vậy cây không đƣợc cung cấp dinh dƣỡng đầy đủ, điều này đã làm cây sinh trƣởng kém, khả năng tạo củ của cây bị giảm và củ nhỏ do thiếu dinh dƣỡng. Ở nghiệm thức T3 với tần số cung cấp dinh dƣỡng 3 67 lần/tuần, cây đƣợc cung cấp đầy đủ dinh dƣỡng hơn, cây sinh trƣởng và phát triển mạnh, cành lá xanh tốt, khả năng tạo củ cao và cho củ lớn. Hình 4.3: Tỷ lệ các kích cỡ củ trong thí nghiệm về ảnh hƣởng của tần số cung cấp dinh dƣỡng lên quá trình tạo củ bi 4.4 Thí nghiệm 4: Ảnh hƣởng của mật độ trồng lên quá trình tạo củ bi của cây khoai tây Theo quan sát về sự sinh trƣởng và phát triển của cây trong thời gian thí nghiệm, chúng tôi nhận thấy cây ở nghiệm thức M1 lớn chậm, cây thấp thân nhỏ, lá vàng và nhỏ, có ít nhánh, trung bình có khoảng 3-4 nhánh/cây. Cón ở nghiệm thức M3 cây lớn nhanh, phát triển tốt, lá xanh đậm và to, thân to khỏe, nhánh nhiều trung bình có khoảng 5-6 nhánh/cây. Nhƣ vậy khi trồng cây ở mật độ thấp cây phát triển tốt hơn so với khi trồng ở mật độ cao. Bảng 4.6: Kết quả thí nghiệm về ảnh hƣởng của mật độ trồng lên quá trình tạo củ bi Tên NT Tỷ lệ kích cỡ củ Số củ / gốc L (%) M (%) S (%) M1 M2 M3 2.74 5.28 7.64 36.5 38.91 52.85 60.76 55.8 39.51 13.41 13.5 11.69 T1 T2 T3 T1 T2 T3 T1 T2 T3 68 Biểu đồ 4.9: Tỷ lệ các kích cỡ củ trong thí nghiệm về ảnh hƣởng của mật độ trồng lên quá trình tạo củ bi 0 10 20 30 40 50 60 70 M1 M2 M3 L M S Qua kết quả thu đƣợc ở bảng 4.6 và biểu đồ 4.9 chúng tôi nhận thấy ở mật độ trồng 12 12cm cho kết quả tốt nhất. Ở cả 3 mật độ khảo sát đều cho tỷ lệ củ trung bình / gốc là nhƣ nhau, không có sự khác biệt đáng kể. Chúng tôi nhận thấy ở đây có sự liên hệ giữa mật độ trồng và kích cỡ củ, khi mật độ trồng càng giảm thì kích cỡ củ càng tăng. Ở mật độ trồng 5 x 5 kích cỡ củ bị hạn chế đáng kể. Ở lô nghiệm thức này tỷ lệ củ lớn rất thấp, chủ yếu cây chỉ tạo ra kích cỡ củ nhỏ (60.76%) và trung. Nhƣ vậy tỷ lệ củ đạt yêu cầu là rất thấp, không phù hợp cho việc sản xuất khoai tây bi giống. Ở mật độ trồng 12 12cm tỷ lệ củ trung (M) tăng (52.85%) và tỷ lệ củ nhỏ (S) giảm một cách đáng kể so với các mật độ khảo sát khác, nhƣ vậy tỷ lệ củ đạt yêu cầu lớn hơn. Ngoài ra ở mật độ trồng 12 12cm thì số lƣợng củ siêu bi phải sử dụng trên một đơn vị diện tích ít hơn so với mật độ 5 5cm và 8 8cm, nhƣ vậy tiết kiệm hơn. Kết luận: nhƣ vậy trồng cây ở mật độ 12 12cm là thích hợp nhất cho việc trồng khoai tây tạo củ bi giống, đồng thời tiếc kiệm chi phí nhất trong các mật độ khảo sát. Một số nhà khoa học trên thế giới cũng đã tiến hành thí nghiệm về sự ảnh hƣởng của mật độ trồng lên kích cỡ và năng suất tạo củ của cây khoai tây cũng đã đƣa ra kết quả 69 tƣơng tự nhƣ chúng tôi. Để giải thích cho hiện tƣợng này chúng tôi cho rằng chính khoảng cách giữa các cây quyết định năng suất và kích cỡ củ. Ở mật độ trồng cao thì khoảng cách giữa các cây trên một đơn vị diện tích bị thu hẹp lại, khoảng không gian để củ phát triển ít trong khi đó cây khoai tây giống O7 có đặc điểm tia củ phát triển rộng, vì vậy với mật độ trồng dày sẽ làm hạn chế sự phát triển của tia củ, làm cho củ không lớn đƣợc nên tỷ lệ củ nhỏ cao. Khi giảm mật độ trồng thì sẽ giãn khoảng cách giữa các cây trên một đơn vị diện tích, khoảng không gian để củ phát triển tăng làm cho củ có điều kiện phát triển lớn, giảm đáng kể tỷ lệ củ nhỏ. Hình 4.4: Tỷ lệ các kích cỡ củ trong thí nghiệm về ảnh hƣởng của mật độ trồng lên quá trình tạo củ bi 4.5 Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hƣởng của BAP lên quá trình tạo củ bi của cây khoai tây Qua thời gian làm thí nghiệm chúng tôi nhận thấy sự sinh trƣởng và phát triển của các cây khoai tây ở các nghiệm thức giống nhau, không có sự khác nhau rõ rệt. Nhƣ vậy sự khác nhau giữa các lô thí nghiệm là ở khả năng tạo củ của cây ở các nghiệm thức khác nhau. Kết quả thu đƣợc của thí nghiệm đƣợc mô tả ở bảng sau: M1 M2 M3 M1 M2 M3 70 Bảng 4.7: Kết quả thí nghiệm về ảnh hƣởng của BAP lên quá trình tạo củ bi Tên NT Tỷ lệ kích cỡ củ Số củ / gốc L (%) M (%) S (%) BA0 BA1 BA2 BA3 5.28 10.58 15.38 9.33 38.91 50.73 46.15 55.33 55.8 38.69 38.46 35.33 13.5 9.13 15.17 7.5 Biểu đồ 4.10: Tỷ lệ các kích cỡ củ trong thí nghiệm về ảnh hƣởng của BAP lên quá trình tạo củ bi 0 10 20 30 40 50 60 BA0 BA1 BA2 BA3 L M S Kết quả phân tích số liệu cho thấy nghiệm thức BA2 cho kết quả tốt nhất. Ở chỉ tiêu số củ trung bình / gốc, nghiệm thức BA2 cho kết quả có sự khác biệt lớn so với nghiệm thức BA0 và BA1 (15.17 củ so với 9.13 và 7.5 củ). Nhƣ vậy ta có thể kết luận khi cung cấp cho cây BAP ngoại sinh với nồng độ cao có thể làm giảm số củ trên gốc, tức hạn chế tia củ phát triển. Ở chỉ tiêu tỷ lệ các kích cỡ củ, việc cung cấp BAP ngoại sinh cho cây làm tăng kích thƣớc củ, giảm tỷ lệ củ nhỏ so với đối chứng. Nghiệm thức BA3 cho tỷ lệ củ trung cao nhất (55.33%) nhƣng tỷ lệ cho củ thấp. Nghiệm thức BA2 tuy có tỷ lệ củ trung thấp hơn 71 BA1 và BA2 nhƣng tỷ lệ cho củ cao hơn hẳn hai nghiệm thức này nên tổng số củ trung của nghiệm thức này vẫn cao hơn so với 2 nghiệm thức kia. Nhƣ vậy qua thí nghiệm này chúng tôi thấy có sự ảnh hƣởng của BAP ngoại sinh lên tỷ lệ tạo củ và kích cở củ của cây khoai tây. Những năm 1989 – 1990 Daniel O.Caldiz làm thí nghiệm về ảnh hƣởng của BAP lên giống khoai tây Mailén trồng trong nhà lƣới trong giai đoạn hình thành tia củ đã đƣa ra kết quả là làm tăng đáng kể số lƣợng củ trung bình trên gốc và làm kích cỡ củ tăng lên. Năm 1991 – 1992 ông làm thí nghiệm tƣơng tự trên giống khoai tây Spunta cũng cho kết quả tƣơng tự nhƣ trên. Hình 4.5: Tỷ lệ các kích cỡ củ trong thí nghiệm về ảnh hƣởng của BAP lên quá trình tạo củ bi BA0 BA1 BA2 BA3 BA0 BA1 BA2 BA3 72 PHẦN V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Từ các kết quả thu đƣợc qua các thí nghiệm chúng tôi có những kết luận sau: Môi trƣờng tạo củ siêu bi ống nghiệm gồm môi trƣờng MS + 3mg/l BAP là môi trƣờng tốt nhất, cho củ to và đồng đều. Trong thí nghiệm về các công thức dinh dƣỡng, chúng tôi nhận thấy sử dụng công thức dinh dƣỡng 1 là tốt nhất, tuy số củ /gốc ít hơn CT2 nhƣng ở CT1 cho tỷ lệ củ đạt yêu cầu (3 – 7g /củ) nhiều, giảm tỷ lệ củ nhỏ đáng kể. Trong thí nghiệm về mật độ trồng chúng tôi thấy ở mật độ 12 12 cm là thích hợp nhất vì cho tỷ lệ củ /gốc so với các mật độ khảo sát 8 8cm, 5 5cm có sai khác không đáng kể nhƣng cho tỷ lệ củ trung nhiều, tỷ lệ củ nhỏ thấp. Trong thí nghiệm về tần số tƣới, với tần số tƣới 3 lần / tuần cho kết quả tốt với số củ trung bình / gốc là 10.82%, cao nhất trong các nghiệm thức và cho tỷ lệ củ đạt yêu cầu cao nhất. Trong thí nghiệm bổ sung thêm BAP vào thời kỳ hình thành tia củ, nghiệm thức BA2 cho kết quả khá tốt, tỷ lệ toạ củ cao. Qua kết quả thu đƣợc từ các thí nghiệm, chúng tôi đƣa ra mô hình sản xuất củ bi khoai tây làm giống đối với vật liệu ban đầu là củ siêu bi khoai tây: trồng với mật độ 12 12cm, sử dụng công thức dinh dƣỡng 1 (CT1) với tần số tƣới 3 lần / tuần. Vào thời kì cây hình thành tia củ có thể bổ sung thêm BAP với nồng độ 5mg/l phun trên lá tuần 2 lần. 5.2 Đề nghị Tiếp tục nghiên cứu sự ảnh hƣởng của một số hoá chất khác lên quá trình tạo củ siêu bi ống nghiệm. Bố trí nghiên cứu sự ảnh hƣởng của mật độ cấy mẫu để đạt đƣợc yêu cầu: củ to và đƣợc tạo ra ngay trên đốt thân. Bố trí các thí nghiệm tƣơng tự đối với việc tạo giống khoai tây bi từ các đối tƣợng là cây khoai tây cấy mô và hạt nhân tạo, so sánh với kết quả thu đƣợc đối với đối tƣợng củ siêu bi để hoàn thiện quy trình sản xuất giống khoai tây bi sạch bệnh. 73 PHẦN VI. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt: Fao.1990. Trồng trọt không dùng đất trong nghề làm vườn (bản quyền tiếng việt năm 1992 thuộc trung tâm thông tin nông nghiệp- CNTP). Xuất bản tại trung tâm thông tin Nông Nghiệp – CNTP, 2 Ngọc Hà, Hà Nội. 152 trang Dƣơng Công Kiên. 2003. Nuôi cấy mô thực vật. NXB Đại học quốc gia Tp.Hồ Chí Minh. Nguyễn Đức Lƣợng, Lê Thị Thuỷ Tiên. 2002. Công nghệ tế bào. NXB Đại học quốc gia Tp. Hồ Chí Minh. Trần Văn Minh. 2003. Công nghệ sinh học thực vật. Giáo trình cao học _ nghiên cứu sinh. Trƣờng Đại học Nông Lâm. Trƣơng Thị Lan Phƣơng. 2004. Bước đầu xây dựng mô hình thu nhận Rotenone trên cây thuốc lá bằng kỹ thuật thuỷ canh. Luận văn tốt nghiệp khoa nông học, Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh. Hoàng Thị Sản. 2003. Phân loại học thực vật. NXB Giáo Dục Vũ Văn Vụ, Vũ Thanh Tâm, Hoàng Minh Tấn. Sinh lý học thực vật. Nhà xuất bản giáo dục. 251 trang. Trần Khắc Thi, Trần Ngọc Hùng. 2002. Kỹ thuật trồng sạch. Nhà xuất bản nông nghiệp , Hà Nội. Trang 74 – 82 Nguyễn Văn Uyển. 1996. Những phương pháp Công nghệ sinh học thực vật. NXB Nông nghiệp Tp Hồ Chí Minh. Tài liệu tiếng Anh: D.K.Salunkhe, S.S.KaDam. Handbook of vegetable science and technology. Marcel dekker, Ine.p, 11- 51 Ho,B.L.2000. Hydroponics Simplifield. Universiti Malaysia Sabah. Kotakinabalu, Sabah, Malaysia. 95p. 74 Tài liệu từ Internet: =pubmed referrer=parent&backto=issue,22,24;journal,31,597:linkingpublicationresults,1:100326,1 p?referrer=parent&backto=issue,2,21;journal,81,145:linkingpublicationresults,1:100329,1 107.gif 75