Luận văn Khảo sát đặc điểm men giống sử dụng trong sản xuất bánh men thuốc bắc tại phong điền, Cần Thơ

hành so sánh, nếu không phù hợp ta phải tiến hành làm lại từ đầu. + Bước 2: Nếu có chủng nấm mốc của loài hoặc thứ vừa xác định trong bộ sưu tập các chủng nấm thì ta tiến hành so sánh các chủng này với chủng nấm mốc mẫu. Muốn vậy ta xác định các đặc điểm chính của khuẩn, các đặc điểm vi học chính của chủng nấm mẫu, và tiến hành so sánh với các chủng nấm cần định loại. Nếu các đặc điểm này trùng nhau ta khẳng định chắc chắn loài của chủng nấm mốc cần định loại. Thông thường trong trường hợp khi định loại nấm mốc bằng chuyên luận phân loại cho kết quả không chắc chắn ta mới tiến hành thêm với các chủng nấm mẫu. Có nhiều luận phân loại các chủng nấm mốc khác nhau được sử dụng rộng rãi trong các phòng thí nghiệm. Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ Ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 26 CHƯƠNG III. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU 3.1.1 Thời gian – địa điểm Thời gian thực hiện: 12 tuần (từ ngày 04/01/2008 đến 12/04/2008). Thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm của bộ môn Công Nghệ Thực Phẩm trường Đại Học Cần Thơ. 3.1.2 Nguyên liệu – hóa chất – thiết bị * Nguyên liệu: Giống bánh men được mua từ Phong Điền, Cần Thơ. * Hóa chất: + Cồn 70o, 95o. + Nước muối sinh lý. + Môi trường nuôi vi sinh vật: CDA, PCA, yeast extract. + Thuốc nhuộm: Methylen blue. + NaOH 0.1N. + Các hóa chất sử dụng để chuẩn aldehyd, acid, ester. * Dụng cụ, thiết bị: + Kính hiển vi có thước trắc vi. + Ống nghiệm đường kính 16mm. + Đĩa Petri bằng nhựa hoặc thủy tinh đã được thanh trùng. + Pipet bằng thủy tinh đã được thanh trùng. + Becher. + Buret chuẩn độ. + Lame, lamellae. + Que cấy móc. + Micropipet. + Bình tam giác. + Đèn cồn. + Tủ ủ. + Tủ sấy. + Thiết bị thanh trùng. + Hệ thống ống sinh hàn dùng chưng cất, thủy phân. + Bếp ga, bếp điện. Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ Ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 27 3.2 PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 3.2.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát qui trình chế biến bánh men thuốc bắc tại tổ hợp tác sản xuất rượu Phong Điền - Cần Thơ. + Mục đích Xác định lại qui trình sản xuất bánh men thuốc bắc trong tổ hợp tác sản xuất rượu địa phương hiện tại (Phong Điền) để tìm ra phương pháp cải tiến chất lượng . + Tiến hành thí nghiệm Thu thập một số loại men giống được sử dụng phổ biến tại huyện Phong Điền, Cần Thơ. Khảo sát và tìm hiểu qui trình chế biến bánh men thuốc bắc tại địa phương. + Ghi nhận kết quả Ghi lại các kết quả có được từ quá trình khảo sát qui trình sản xuất bánh men tại địa phương và các kết quả có được tra từ các nguồn tài liệu. Tình hình sản xuất bánh men thuốc bắc thực tế tại địa phương. Đánh giá lại qui trình sản xuất và so sánh với các qui trình sản xuất đã được nghiên cứu khác. Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ Ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 28 3.2.2 Thí nghiệm 2: Phân lập, định danh các loại nấm mốc có trong men giống sử dụng trong sản xuất bánh men thuốc bắc tại Phong Điền, Cần Thơ. + Mục đích Nhằm xác định được thành phần vi sinh vật tham gia vào qui trình chế biến bánh men. Để có hướng bổ sung hoặc cải tiến chất lượng men giống cho qui trình sản xuất bánh men thuốc bắc sau này. + Chuẩn bị thí nghiệm Chuẩn bị môi trường nuôi cấy: Môi trường PCA, CDA, yeast extract agar được chuẩn bị, thanh trùng đổ vào đĩa Petri để đặc tự nhiên trên mặt phẳng ngang. Chuẩn bị mẫu: Thí nghiệm được thực hiện trên mẫu men giống. + Tiến hành thí nghiệm: Phân lập nấm mốc ‚ Men giống được nghiền nhỏ, lấy một ít mẫu men đã được nghiền rắc trực tiếp lên mặt thạch của Petri (môi trường PCA). ‚ Nuôi ủ ở nhiệt độ phòng cho nấm mốc phát triển. ‚ Tiến hành quan sát sự phát triển của nấm mốc, nấm men hàng ngày. Sau khoảng thời gian nuôi cấy từ 7 ngày, dùng que cấy lấy một ít bào tử nấm mốc, (dựa trên hình thái quan sát) cấy lên môi trường Czapek dox agar trong đĩa petri. ‚ Tiến hành ủ ở điều kiện nhiệt độ phòng thí nghiệm (28 – 30oC) cho nấm mốc phát triển. ‚ Thao tác cấy truyền được thực hiện nhiều lần cho đến khi mẫu hoàn toàn thuần chủng, không có lẫn sợi nấm lạ. + Ghi nhận kết quả: Định danh theo phương pháp quan sát bằng kính hiển vi dựa vào khóa phân loại của Raper và Fennell, 1965 (Bùi Xuân Đồng, 2004). Tiến hành nhận xét đại thể và vi thể nấm - Đại thể: quan sát đặc điểm hình thái sợi nấm bằng mắt thường. - Vi thể: thực hiện tiêu bản nấm, quan sát ở vật kính 40X cấu tạo khuẩn ty và bào tử của nó. Dựa trên kết quả thu nhận được tra khóa phân loại, xác định tên loài nấm mốc tương ứng. Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ Ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 29 3.2.3 Thí nghiệm 3: So sánh khả năng đường hóa và lên men của bánh men giống với 2 loại men thuốc bắc khác trên thị trường. + Chuẩn bị thí nghiệm Tiến hành lên men rượu với 3 loại men khác nhau: men giống, men AT, men CT. + Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm 1 nhân tố (loại men) MG: Men giống AT: Men AT CT: Men CT Tổng số nghiệm thức: 3 nghiệm thức Thí nghiệm được tiến hành với 2 lần lặp lại. Tổng số đơn vị thí nghiệm là 6. Hình 6. Sơ đồ thí nghiệm khảo sát khả năng lên men của các loại bánh men thuốc bắc + Ghi nhận kết quả - Hàm lượng tinh bột sót. - Hàm lượng đường tạo thành - Hàm lượng rượu tạo thành. Gạo (tấm) Nấu chín Làm sạch Để nguội (30 – 35oC) Trộn Ủ mốc, 3 ngày Chưng cất Rượu thành phẩm M1 M2 M3 Chan nước Ủ yếm khí, 3 ngày Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ Ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 30 CHƯƠNG IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát qui trình sản xuất bánh men thuốc bắc tại tổ hợp tác sản xuất rượu Phong Điền – Cần Thơ. Qua quá trình khảo sát thực tế quá trình sản xuất bánh men tại tổ hợp tác sản xuất rượu Phong Điền, Cần Thơ ghi nhận được qui trình sản xuất như sau: Hình 7. Qui trình sản xuất bánh men thuốc bắc tại tổ hợp tác sản xuất rượu Phong Điền, Cần Thơ. Gạo Nghiền Phối trộn Tạo hình Bánh được bổ sung men Xếp vào các khay Ủ ở nhiệt độ thường Phơi khô Men thành phẩm Thuốc bắc Men giống Nước Ngâm nước Tách nước Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ Ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 31 Như kết quả hình 7 cho thấy quá trình sản xuất bánh men thuốc bắc sử dụng tinh bột chưa được hồ hoá. Tinh bột là khung cơ bản, là chất nền để phối trộn các hợp phần. Nhưng vai trò quan trọng của tinh bột là cung cấp thức ăn cho vi sinh vật. Tinh bột dùng trong sản xuất bánh men thuốc bắc tại địa phương có nguồn gốc từ gạo. Tinh bột gạo là môi trường chứa khá đầy đủ các dưỡng chất cần thiết cho hoạt động của vi sinh vật. Ngoài thành phần chính là glucid, nó còn chứa một lượng các thành phần như protein, lipid, chất tro, vitamin,... giúp cho vi sinh vật phát triển. Trong tính toán tỉ lệ nguyên liệu, người ta thường tính theo khối lượng tinh bột sử dụng, vì tinh bột chiếm phần chủ yếu trong khối lượng của bánh men thành phẩm. Nên dùng gạo tốt, không bị mốc, mọt,... để tránh nhiễm vi sinh vật lạ. Tuy nhiên, quá trình khảo sát thực tế cho thấy người dân chưa quan tâm đến chất lượng và khối lượng gạo dùng cho mỗi lần sản xuất, lượng gạo sử dụng cho mỗi lần sản xuất được đong bằng các dụng cụ địa phương, không có khối lượng chính xác. Gạo được đem ngâm nước (nước giếng) mục đích giúp quá trình xay nghiền được dễ dàng, đồng thời ngâm cũng giúp làm sạch nguyên liệu, thời gian ngâm cũng không xác định rõ ràng cụ thể mà chủ yếu dựa vào cảm tính. Gạo sau khi ngâm được xả lại bằng nước sông (điều này có thể nhiễm vi sinh vật từ nguồn nước) và đem nghiền mịn. Ở điều kiện sản xuất thủ công người ta thường dùng cối xay đá để nghiền ướt nguyên liệu nên hiệu suất thấp và rất tốn thời gian. Bột sau khi xay ở trạng thái dịch lỏng thì tiến hành tách nước, phương pháp tách nước được tiến hành thủ công và không được xác định thời gian cụ thể chủ yếu dựa vào kinh nghiệm. Dịch bột lỏng sau khi xay được cho vào một túi vải và dùng dây buột kín. Túi vải được đặt lên phần dưới của cối xay và được đè nặng bằng thân trên của cối xay. Thời gian tách nước không được quan tâm, thời gian tách nước dài ảnh hưởng đến chất lượng khối bột. Khối bột có thể bị chua do độ ẩm và thành phần của bột gạo là môi trường thuận lợi cho vi khuẩn xâm nhập làm giảm chất lượng bột. Bột sau khi được tách nước đem phối trộn với thuốc bắc và có thể bổ sung thêm nước mưa. Nước vừa cần cho sự sống của vi sinh vật, vừa tạo độ ẩm thích hợp để nhào bột thành bánh. Tùy theo kinh nghiệm mà người dân bổ sung lượng nước cho thích hợp, vì thế độ ẩm của khối bột lúc này không được quy định cụ thể. Thuốc bắc được cho vào ở công đoạn này và trộn đều, tỷ lệ thuốc bắc dùng cho mỗi mẻ sản xuất cũng không được quan tâm chủ yếu dựa vào kinh nghiệm. Thuốc bắc được bổ sung ở đây mỗi nơi có một toa thuốc với liều lượng và công thức phối chế riêng. Công thức phối chế thuốc bắc tùy thuộc vào từng đối tượng sản xuất. Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ Ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 32 Khi trộn đều thuốc bắc vào khối bột thì tiến hành nặn thành bánh. Độ ẩm của bánh men được khảo sát tại địa phương là 42,53%, thấp hơn so với độ ẩm mà các nghiên cứu đã cho thấy tốt nhất là khối bột nhào có độ ẩm từ 50 ÷ 55% (Nguyễn Văn Hiệu, 1992). Bánh men tại địa phương sản xuất có khối lượng lớn hơn so với các loại bánh men thuốc bắc được bán trên thị trường. Men giống sử dụng trong sản xuất bánh men thuốc bắc tại địa phương là các viên men trôi nỗi trên thị trường không rõ nguồn gốc và bao bì. Viên men được mua về và tiến hành nghiền nhỏ bằng cối gỗ. Việc sản xuất bánh men thuốc bắc tại tổ hợp tác có sự khác biệt với các qui trình sản xuất khác ở công đoạn bổ sung men giống. Các qui trình sản xuất bánh men truyền thống cho thấy bánh men được bổ sung men giống ở công đoạn phối trộn, nhưng ở đây bánh men sau khi được tạo hình mới được áo lớp men giống bên ngoài. Lượng men giống được bổ sung chỉ dựa vào kinh nghiệm của người dân, không có sự tính toán chính xác. Bánh men sau khi được bổ sung men giống được xếp lên các khay và đem ủ. Do quá trình sản xuất thủ công nên người sản xuất không thể điều chỉnh được nhiệt độ thích hợp cho vi sinh vật có trong bánh men phát triển tốt. Bánh men được đem ủ ở điều kiện nhiệt độ bình thường, vì thế chất lượng bánh men phụ thuộc rất lớn vào thời tiết. Nếu gặp phải những ngày mưa nhiệt độ môi trường thấp, bánh men rất dễ nhiễm mốc xanh ảnh hưởng nhiều đến chất lượng. Sau khi ủ tiến hành theo dõi đến khi thấy bánh men phồng đều, ngã màu vàng, có mùi thơm của mốc thì đem phơi khô. Thường thời gian ủ khoảng 2 ÷ 3 ngày, phụ thuộc vào thời tiết. Nhiệt độ tối ưu thích hợp ở công đoạn này từ 30 ÷ 31oC, nhiệt độ ủ không được quá 34oC. Giai đoạn này vi sinh vật sẽ phát triển sinh khối, tăng nhanh lượng tế bào (Lê Trần Công Huyến, 1991). Sấy khô bánh men bằng cách đem phơi nắng do điều kiện sản xuất thủ công. Phơi nắng giảm chi phí nhưng ta không thể điều chỉnh được nhiệt độ và tia cực tím trong nắng sẽ ảnh hưởng đến vi sinh vật có trong bánh men. Do vậy ta không nên phơi dưới trời nắng gắt, nhiệt độ phơi không quá 35oC. Điểm bất lợi của việc phơi nắng là phụ thuộc vào thời tiết nên chất lượng bánh men cho mỗi đợt sản xuất không đồng đều. Bánh men thành phẩm được bảo quản bằng cách để nơi khô ráo nhưng chỉ có giá trị trong thời gian ngắn. Nếu để trong thời gian dài (khoảng 1 tháng) rất dễ dàng bị mọt Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ Ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 33 gây hại. Vấn đề bao gói để bảo quản bánh men thành phẩm cũng chưa được người dân quan tâm đến. Kết luận: Qui trình sản xuất bánh men có rất nhiều giai đoạn cần lưu ý như ở công đoạn tạo độ ẩm cho khối bột nhào, nhiệt độ ủ, nhiệt độ phơi, độ ẩm cuối cùng của bánh men là bao nhiêu thì thích hợp cho quá trình bảo quản. Do điều kiện sản xuất thủ công nên không được người dân quan tâm nhiều, chất lượng bánh men cũng không đồng đều trong mỗi lần sản xuất. Men giống được bổ sung ở đây cũng không thuần chủng mà là các viên men được mua từ chợ Phong Điền. Nhìn chung việc sản xuất bánh men thuốc bắc tại tổ hợp tác sản xuất rượu Phong Điền, Cần Thơ hoàn toàn theo phương pháp thủ công, vì thế chất lượng bánh men phụ thuộc rất nhiều vào kinh nghiệm của từng người, từng gia đình. Tỉ lệ gạo, thuốc bắc, men giống dùng trong sản xuất bánh men thuốc bắc tại địa phương cũng chưa có những con số chính xác, chủ yếu dựa theo kinh nghiệm. Dựa theo các tài liệu đã nghiên cứu thì điều kiện thích hợp nhất để sản xuất bánh men thuốc bắc là độ ẩm khối bột nhào 50 ÷ 55%; tỉ lệ thuốc bắc 8 ÷ 10%; tỉ lệ men giống 4%; nhiệt đô ủ 30 ± 1oC, thời gian ủ 19 ÷ 20 giờ. Theo kết quả này, tỉ lệ thuốc bắc và men giống dùng quá cao nhưng phù hợp với yêu cầu sản xuất bánh men chất lượng cao (Nguyễn Văn Hiệu, 1992). Điểm đặc trưng của bánh men thuốc bắc là vị thuốc bắc, điều này phụ thuộc vào thành phần các vị thuốc bắc người dân dùng bổ sung vào bánh men. Nhìn chung vai trò của các vị thuốc bắc trong viên men chủ yếu là kháng khuẩn, tạo hương, tạo vị cay nồng cho rượu. Theo các nghiên cứu của các nhà khoa học Việt Nam và Trung Hoa, thì các vị thuốc bắc có tác dụng kích thích tuỳ đặc điểm của mỗi vị. Các vị Hoàng liên, Hoàng bá có tác dụng ức chế sự phát triển của nấm men. Các vị khác như Ngãi cứu, Nhục quế, Bạch truật, Khung cư, Tế Tân, Vất kim và Phục linh kích thích sự phát triễn của nấm men (Lê Trần Công Huyến, 1991). Một số ý kiến cho rằng các vị thuốc bắc này ít nhiều cũng có tác dụng hạn chế vi sinh vật lạ. Các vị như Quế, Đại hồi, Hồ tiêu có tác dụng hạn chế các vi khuẩn gây thối. Hoặc tinh dầu Bạc hà hay Gừng cũng có tác dụng diệt khuẩn (Nguyễn Văn Hiệu, 1992). Vấn đề cần quan tâm ở đây là cách thức vệ sinh dụng cụ, thiết bị không được chú trọng nên sản phẩm sẽ không đảm bảo được an toàn về mặt vệ sinh thực phẩm. Người Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ Ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 34 dân chỉ sử dụng chủ yếu là nước sông hoặc nước giếng không đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm. Nguồn nước sông, nước giếng sẽ không đảm bảo về mặt vi sinh cho nên khi sử dụng để vệ sinh dụng cụ, thiết bị sẽ không đảm bảo sạch. Cần có nguồn nước sạch sử dụng trong quá trình sản xuất để góp phần nâng cao chất lượng bánh men thành phẩm. Trang thiết bị cần cung cấp thêm như: tủ sấy, tủ ủ, máy nghiền búa, máy phối trộn, máy ép, để thay thế cho các dụng cụ hiện tại đang dùng nhằm năng cao hiệu suất và chất lượng bánh men thành phẩm. Bên cạnh đó còn có những điểm mấu chốt cần xem xét nên sử dụng bột gạo khô để chế biến bánh men, có thể loại bỏ được công đoạn tách nước và giai đoạn nào nên bổ sung men giống (phối trộn hay tạo hình) vì có sự khác biệt so với qui trình sản xuất từ các nguồn tài liệu và thực tế ở địa phương. Bánh men phải được đóng gói bảo quản để tránh nhiễm vi sinh vật hoặc bị hút ẩm từ môi trường bên ngoài và nên tiến hành đóng gói bánh men thành phẩm để làm tăng giá trị cảm quan của bánh men. Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ Ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 35 4.2 Thí nghiệm 2: Phân lập, định danh các loại nấm mốc có trong men giống sử dụng trong sản xuất bánh men thuốc bắc tại Phong Điền, Cần Thơ. Sau quá trình tiến hành phân lập và định danh các loại nấm mốc có trong men giống sử dụng trong sản xuất bánh men thuốc bắc tại Phong Điền, Cần Thơ. Chúng tôi quan sát thấy trên men giống xuất hiện thường xuyên một số loài nấm mốc (được phân biệt chủ yếu dựa trên màu sắc). Sau quá trình phân lập và định danh dựa trên các đặc điểm khả năng 2 loài nấm mốc tìm được là loài : - Mucor racemosus. - Aspergillus restrictus. Việc định danh các loài nấm mốc có trong bánh men được dựa trên phương pháp định danh của Raper và Fennell 1965 (Bùi Xuân Đồng, 2004). Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ Ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 36 4.2.1 Mucor racemosus Tên: Mucor racemosus Xuất xứ: Men giống mua từ Phong Điền, Cần Thơ Nhiệt độ: 28 – 30oC. Ánh sáng: trong bóng tối (hộc tủ). Môi trường: Czapek dox agar. Tuối nấm khi phân loại: 15 ngày. * Khuẩn lạc: Tốc độ mọc: Trung bình Kich thước: 7 – 8,5 cm Dạng khuẩn lạc: Xốp bông, cao dưới 1 cm. Giọt tiết: Không. Màu sắc: Mặt phải: Khuẩn lạc ban đầu có màu trắng sau chuyển sang xanh lợt (hình 8a). Mặt trái: Không màu (hình 8b). Sắc tố ra môi trường: Không. * Giai đoạn vô tính: Nang bào tử kín: Cách sắp xếp: mọc từ môi trường hoặc trên các nhánh. Hình dạng: Hình cầu, vỡ ra khi già (hình 9) Kích thước: Khoảng 30 – 60 µm. Cuống: Hình dạng: Bề mặt cuống nhẵn. Cuống có kích thước dài. Màu sắc: Cùng màu với nang bào tử kín. Trụ nang: Hình elip có phần phụ bao quanh gốc do vỏ nang khi vỡ tạo thành (hình10). Bào tử kín: Hình dạng: Phần lớn hình elip (hình 14). Kích thước: (6 – 9) x (4,5 – 7) µm. Bào tử áo: Hình dạng: Hình trứng (hình 13). Kích thước: 10 – 18 µm. Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ Ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 37 a) b) Hình 8. Mucor racemosus có sợi bông màu xanh nhạt trên môi trường CDA a) Mặt phải b) Mặt trái Hình 9. Nang bào tử kín của Mucor racemosus được chụp dưới vật kính 40X Hình10. Trụ nang có phần phụ bao quanh gốc do vỏ nang khi vỡ còn sót lại Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ Ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 38 Hình 11. Nang bào tử kín khi còn non Hình 12. Bào tử áo có nhiều trên sợi nấm Hình 13. Bào tử áo có hình cầu, hình trứng, cuống nang phân nhánh không đều Hình 14. Bào tử kín phần lớn có hình elip 10µm 40µm Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ Ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 39 4.2.2 Aspergillus restrictus Tên: Aspergillus restrictus Xuất xứ: Men giống mua từ Phong Điền, Cần Thơ Nhiệt độ: 28 – 30oC. Ánh sáng: trong bóng tối (hộc tủ). Môi trường: Czapek dox agar. Tuối nấm khi phân loại: 20 ngày. * Khuẩn lạc: Tốc độ mọc: Chậm Kich thước: 5 – 6 cm. Dạng khuẩn lạc: Dạng bột rời lấm tấm, ngoài có lớp bột màu trắng. Giọt tiết: Không. Màu sắc: Mặt phải: Khuẩn lạc ban đầu có màu xanh lục, sau chuyển sang nâu lục (hình 15a). Mặt trái: không màu (hình 15b). Sắc tố ra môi trường: Không. * Giai đoạn vô tính: Đầu: Cách sắp xếp, mọc từ môi trường. Hình dạng: Hình cầu, tỏa tia hình cột khi non và xé rách thành những bào tử rời rạc khi già chỉ còn thể bình. Kích thước: 60 – 85 µm. Cuống: Hình dạng: Bề mặt cuống nhẵn. Kích thước: (440– 550 ) x (6 – 10) µm. Màu sắc: Không màu. Bọng: Hình dạng: Hình cầu (hình 21). Kích thước: 15 – 22 µm. Vùng sinh sản: Khắp mặt bọng. Thể bình: Cách sắp xếp: Thể bình một tẩng (hình 16). Hình dạng: Hình trụ dài. Kích thước: (2 – 3,5) x (10 – 11,5) µm. Bào tử: Hình dạng: Hình cầu, hình trứng (hình 20). Kích thước: 3 – 4,5 µm. Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ Ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 40 a) b) Hình 15. Aspergillus restrictus trên môi trường CDA có màu xanh lục. a) Mặt phải b) Mặt trái Hình 16. Bọng đỉnh giá mang thể bình, đỉnh bọng hình cột Hình 17. Cấu tạo bông lớn với thể bình một tầng khi nhuộm xanh metylen. 11,5µm 65µm 80µm Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ Ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 41 Hình 18. Cấu tạo một bông Aspergillus restrictus trưởng thành ở vật kính 40X. Hình 19. Cấu tạo bông Aspergillus restrictus khi còn non trên môi trường thạch sống ở vật kính 40X Hình 20. Bào tử trần Hình 21. Cấu tạo bọng hình cầu 11,5µm 520µm8µm 4µm Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ Ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 42 Qua quá trình phân lập có được 2 loài Mucor racemosus và Aspergillus restrictus so với các loại bánh men thuốc bắc trên thị trường thường có sự hiện diện thêm loài Rhizopus (Nguyễn Thị Pha Liên, 2007). Điều này có thể ảnh hưởng đến hiệu suất đường hóa của bánh men sử dụng. Trong môi trường PCA cho thấy tốc độ mọc của loài Mucor racemosus khá nhanh hơn so với Aspergillus restrictus. Tuy nhiên, khả năng đường hóa của loài nấm mốc nào tốt hơn thì chưa thể khẳng định được. Theo các tài liệu cho thấy loài Mucor racemosus cũng được tìm thấy trong bánh men rượu cổ truyền và pho mát trắng. Ngoài khả năng sinh ra hệ enzyme amylase, nó còn có khả năng sinh ra hệ enzyme thủy phân protein và lipid. Loài mốc Aspergillus restrictus chưa được khảo sát về khả năng sinh enzyme thực hiện quá trình được hóa. Theo các nguồn tài liệu tìm được Aspergillus restrictus có khả năng sinh ra ‘restrictocin’ – là một protein ức chế tổng hợp ribosome trong tế bào sinh vật có nhân. Tuy nhiên theo các nguồn tài liệu cho thấy loài Aspergillus awamori có khả năng sinh tổng hợp glucoamylaza cao, được sử dụng bổ sung vào trong quá trình sản xuất rượu (Nguyễn Văn Hiệu, 1992). Ta có thể so sánh khả năng của 2 loài nấm mốc này, loài tốt hơn để bổ sung hoàn thiện và nâng cao chất lượng bánh men. Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ Ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 43 4.3 Thí nghiệm 3: So sánh khả năng đường hóa và lên men của bánh men giống với 2 loại men thuốc bắc khác trên thị trường. Để thấy được vai trò của nấm men và nấm mốc có trong men giống, chúng tôi tiến hành lên men để so sánh khả năng đường hóa và lên men của men giống với 2 loại men khác được sử dụng trong sản xuất rượu tại tổ hợp tác. Thí nghiệm được tiến hành với ba loại men: men giống (MG), bánh men thuốc bắc AT (AT) và bánh men thuốc bắc CT (CT). Nhiệt độ trong quá trình lên men là nhiệt độ phòng thí nghiệm (28 ÷ 30oC). Quá trình lên men được tiến hành trong vòng 6 ngày: 3 ngày đầu ủ hiếu khí, 3 ngày sau ủ yếm khí. Ở giai đoạn ủ hiếu khí chúng tôi tiến hành phân tích các chỉ tiêu tinh bột , đường tạo thành sau 3 ngày. Ở giai đoạn ủ yếm khí chúng tôi tiến hành chưng cất dịch lên men sau 6 ngày để xác định độ rượu tạo thành ở từng mẫu lên men. Kết quả khảo sát: Bảng 5. Kết quả so sánh tốc độ lên men của các loại men và men giống Loại men Hàm lượng đường (g/100ml) Hàm lượng tinh bột sót (g/100ml) Độ rượu (%v/v) Men giống (MG) Men AT (AT) Men CT (CT) 15,6b 10,4ab 8,1a 9,6b 2,5a 5,2b 7,3a 7a 12b Ghi chú: Các số liệu có cùng chữ cái đi kèm thể hiện sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở mức độ ý nghĩa 5%. Giá trị trong bảng là giá trị trung bình của 2 lần lặp lại. 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 MG AT CT loại men lư ợn g đư ờn g tạ o th àn h (g /1 00 m l) Hình 22. Đồ thị thể hiện hàm lượng đường tạo thành của các loại bánh men. Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ Ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 44 Theo kết quả phân tích thống kê (bảng 5) lượng đường tạo thành sau quá trình ủ mốc hiếu khí mẫu men MG và CT cho thấy sự khác biệt ý nghĩa ở mức độ ý nghĩa 5%. Mẫu men AT cho thấy rằng sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê đối với 2 mẫu MG và CT. Theo kết quả bảng 5 và hình 20 cho thấy loại men MG cho kết quả lượng đường tạo thành cao nhất.Điều này có thể cho nhận xét ban đầu là quá trình đường hóa của loại men giống là tốt nhất so với 2 nghiệm thức còn lại. Quá trình rượu hóa có thể xảy ra sau quá trình đường hóa nên lượng đường trong dịch lên men sẽ giảm. Ngoài ra lượng đường tạo thành ở thí nghiệm này được xác định là lượng đường tổng không phải là đường khử. Vì thế chưa đủ cơ sở để khẳng định rằng lượng đường tạo thành càng cao là hiệu quả đường hóa càng tốt. 0 2 4 6 8 10 12 MG AT CT loại men T in h bộ t c òn lạ i ( g/ 10 0m l) Hình 23. Đồ thị thể hiện hàm lượng tinh bột còn lại của các loại bánh men. Qua bảng 5 và hình 21 biểu diễn hàm hàm lượng tinh bột còn lại sau 3 ngày lên men từ các loại men cho thấy loại men AT có sự khác biệt ý nghĩa ở mức độ ý nghĩa 5% so với loại men MG và CT. Lượng tinh bột sót giữa men MG và CT khác biệt không có ý nghĩa thống kê. Hình 21 cho thấy hàm lượng tinh bột còn lại của loại men AT thấp hơn 2 loại men còn lại. Điều này có nghĩa là quá trình đường hóa của men AT cho kết quả tốt nhất trong 3 loại men khảo sát. Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ Ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 45 0 2 4 6 8 10 12 14 MG AT CT Loại men Đ ộ rư ợu (% v/ v) Hình 24. Đồ thị thể hiện thể tích rượu tạo thành của các loại men. Bảng 6. Kết quả so sánh hiệu suất lên men của các loại men sử dụng. Loại men Hiệu suất (%) MG AT CT 62,27 59,71 73,48 Ghi chú: Kết quả bảng trên được tính ở phần phụ lục D Dựa vào kết quả khảo sát quá trình sản xuất rượu trong tổ hợp tác tại Phong Điền (theo thí nghiệm khảo sát của Toàn và Phước, 2008). Cho thấy lượng men và lượng nước chan không thống nhất ở tất cả 3 loại men sử dụng nên ta có thể so sánh hiệu suất lên men của 3 loại men để tìm được loại men cho lượng rượu nhiều nhất. Từ kết quả bảng 6 ta thấy được hiệu suất lên men của loại men CT là cao nhất. Từ những kết quả phân tích trên ta thấy rằng quá trình rượu hóa ở men MG diễn ra chậm hơn so với 2 loại men còn lại. Điều này thể hiện ở hàm lượng đường tạo thành và lượng tinh bột sót của MG được đo sau 3 ngày ủ hiếu khí. Tuy nhiên hiệu suất thu hồi được tính toán trên độ rượu tạo thành cũng tương đương so với 2 loại men dùng so sánh, khả năng đường hóa của men giống chưa tốt thể hiện ở hàm lượng tinh bột còn lại sau 3 ngày ủ mốc cao nhất khi khảo sát cùng với 2 loại men khác (CT và AT). Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ Ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 46 CHƯƠNG V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Qua quá trình thực hiện các thí nghiệm, tổng hợp các kết quả thu nhận được chúng có một số kết luận sau: Sản phẩm bánh men chưa đảm bảo điều kiện an toàn vệ sinh thực phẩm, do chưa có những điều kiện tối ưu nên dễ nhiễm tạp khuẩn trong quá trình sản xuất làm giảm chất lượng bánh men. Quá trình sản xuất bánh men thuốc bắc của người dân ở hợp tác xã có một số chỉ tiêu khác với Nguyễn Văn Hiệu, 1992 như: độ ẩm khối bột nhào, nhiệt độ ủ, thời gian ủ. Sản xuất thủ công nên tốn nhiều thời gian và công sức, trang thiết bị đơn giản và theo truyền thống nên dẫn đến hiệu quả sản xuất chưa cao. Thí nghiệm đã phân lập được 2 loài nấm mốc Aspergillus restrictus và Mucor racemosus trên men giống. Khả năng lên men rượu của men giống (MG) so với 2 loại men đang sử dụng trong tổ hợp tác (CT và AT) ở mức độ trung bình do khả năng đường hóa của men giống thấp thể hiện ở hàm lượng tinh bột còn lại sau 3 ngày ủ mốc cao nhất khi khảo sát cùng với 2 loại men CT và AT. 5.2 Đề nghị Cần cải tiến lại qui trình sản xuất bánh men. Cần cung cấp thêm các trang thiết bị như máy nghiền búa, máy phối trộn, tủ ủ, tủ sấy và máy đóng gói. Có thể mở rộng sản xuất bánh men thuốc bắc ở qui mô xưởng thực nghiệm. Xác định bổ sung các loài nấm mốc có trong men giống bằng phương pháp hóa lý (máy quét định danh) để có kết quả chính xác hơn. Có thể sử dụng thêm một số giống vi sinh vật có hiệu suất đường hóa và lên men tốt đã được viện nghiên cứu công nghệ sinh học nghiên cứu tìm thấy và nhân giống. Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ Ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Bùi Xuân Đồng (2004), Nguyên lý phòng chống nấm mốc và mycotoxin, NXB Khoa Học & Kỹ Thuật. 2. Bùi Thị Huỳnh Hoa (2004), Công nghệ sản xuất rượu bia và nước giải khát, trường Đại Học Cần Thơ. 3. Lê Trần Công Huyến (1991), Sản xuất men thuốc bắc, trường Đại Học Cần Thơ. 4. Lê Thanh Mai (2006), Các phương pháp phân tích nghành công nghệ lên men, NXB Khoa Học và Kỹ Thuật. 5. Ngô Thị Phương Dung (2007), Nghiên cứu tính ổn định của hạt men giống thuần và khả năng ứng dụng trong sản xuất rượu nếp than, trường Đại Học Cần Thơ. 6. Nguyễn Lân Dũng (2001), Vi sinh vật học, NXB Giáo Dục. 7. Nguyễn Văn Kim (2000), Vi sinh học đại cương, trường Đại Học Cần Thơ. 8. Nguyễn Đức Lượng (2004), Công nghệ vi sinh vật – tập 1, 2, 3, trường Đại Học Kỹ Thuật TP. Hồ Chí Minh. 9. Nguyễn Đức Lượng, Thực tập vi sinh vật học thực phẩm, trường Đại Học Bách Khoa Tp. Hồ Chí Minh. 10. Nguyễn Thị Pha Liên (2007), So sánh khả năng của các loại bánh men thuốc bắc trên thị trường thành phố Cần Thơ, trường Đại Học Cần Thơ. 11. Nguyễn Thu Mai (2007), Phân lập và định danh một số loài Aspergillus trên hạt đậu phộng ở chợ Xuân Khánh, trường Đại Học Cần Thơ. 12. Vũ Thị Minh Đức (2001), Thực tập vi sịnh vật học, NXB Đại Học Quốc Gia Hà Nội. Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ Ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 48 PHỤ LỤC PHỤ LỤC A. MỘT SỐ HÌNH ẢNH DÙNG THAM KHẢO Hình 25. Mucor racemosus f.racemosus Fres: (= M. racemosus Fres.). a – nang bào tử kín; b – trụ nang; c – bào tử kín; d – bào tử áo. (Nguồn: Bùi Xuân Đồng, 2004). Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ Ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 49 Hình 26. Bào tử trần và bộ máy mang bào tử trần của loài Aspergillus flavus Link ex Fries (loại bộ máy mang bào tử trần có cuống thể bình): A – Các thành phần của bộ máy mang bào tử trần. 1. sợi nấm; 2. tế bào chân; 3. giá bào tử trần; 4. bọng đỉnh giá; 5. cuống thể bình; 6. thể bình; 7. bào tử trần. B – Bào tử trần. C – Bộ máy mang bào tử trần trưởng thành ở khối bào tử trần hình tia tỏa tròn (Hình vẽ của Nguyễn Huy Văn, 2000). (Nguồn: Bùi Xuân Đồng, 2004) Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ Ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 50 PHỤ LỤC B. CÁC PHƯƠNG PHÁP GIEO CẤY, PHÂN LẬP VSV 1. Kỹ thuật gieo cấy vi sinh vật Gieo cấy là quá trình đưa các vật liệu nghiên cứu hoặc canh trường vi sinh vật vào môi trường thức ăn mới. Gieo cấy thường nhằm một trong các mục đích sau: - Phát hiện sự có mặt của vi sinh vật trong các vật liệu nghiên cứu. - Để tạo ra những canh trường vi sinh vật thuần khiết rồi từ đó nghiên cứu sâu hơn. - Phát triển lượng vi sinh vật thuần khiết một cách nhanh chóng (nhân giống vi sinh vật). - Cấy truyền từ canh trường cũ sang canh trường mới để giữ giống. Yêu cầu cơ bản trong gieo cấy là phải đảm bảo hoàn toàn vô khuẩn để gieo cấy không bị nhiễm các vi sinh vật khác. Tốt nhất là tiến hành trong phòng vô khuẩn hoặc tủ chuyên dung để gieo cấy. Tuỳ yêu cầu và tuỳ loại môi trường mà cách gieo cấy khác nhau. Sau đây là những cách hay dùng: 1.1 Cấy truyền từ ống nghiệm này qua ống nghiệm khác Thường dùng que cấy vòng và trình tự như sau: - Đốt đền cồn lên. - Tay trái cầm 2 ống nghiệm: ống canh trường vi sinh vật ở ngoài, ống môi trường ở trong, giữ cả 2 ống hơi nghiêng (nhưng không để môi trường chạm vào nút bông) giữa ngón tay cái và trỏ tựa lên ngón tay giữa, lòng bàn tay hướng lên trên. - Dùng tay phải xoay lỏng các nút bông. - Tay phải cầm que cấy và vô khuẩn trên đèn cồn. Kẹp nút bông giữa các ngón tay rồi rút ra và giữ như vậy trên tay cho đến lúc đậy lại. - Đốt nóng miệng của 2 ống nghiệm trên đèn cồn. - Đưa que cấy vào ống canh trường và lấy một ít canh trường vi sinh vật rồi cấy vào ống môi trường. Chú ý không để đầu que cấy chạm vào thành ống nghiệm. - Rút que cấy ra, đốt miệng ống nghiệm và nút bông rồi đậy lại. Nếu nút bông bị cháy cũng cứ đậy vào nó sẽ tự tắt, còn phần ngoài thì dùng tay dập tắt. - Để các ống nghiệm vào giá, đốt que cấy trên đèn cồn rồi để vào chỗ cũ. - Dán nhãn lên ống môi trường mới được gieo cấy, để tên vi sinh vật và ngày gieo cấy. Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ Ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 51 Cách cấy chuyền nói trên có thể tiến hành từ canh trường đặc (hoặc lỏng) sang môi trường đặc (hoặc lỏng). Nếu gieo cấy vào môi trường lỏng thì khi cấy ta cho phần que cấy mang giọt canh trường vi sinh vật mài nhẹ lên thành ống nghiệm gần chỗ có môi trường, rồi nghiêng ống nghiệm cho môi trường cuốn đi. Khi gieo cấy canh trường lỏng, ngoài việc dùng que cấy còn có thể dùng pipet Pastơ, pipet thường hoặc chia độ. Các pipet này đã được chuẩn bị và làm vô khuẩn trước (rửa sạch, sấy khô, bọc giấy, tiệt khuẩn,) Khi dùng tháo giấy ra và dùng ngay. Dùng xong cắm pipet vào dung dịch khử khuẩn. 1.2 Gieo cấy trên thạch nghiêng Thường dùng que cấy vòng, trình tự tiến hành giống ở trên (mục 1.1.1) nhưng sau khi lấy được giọt canh trường vi sinh vào đầu que cấy rồi, ta tiếp tục như sau: - Đưa đầu que cấy vào tận đáy ống môi trường. - Nhẹ nhàng hoà giọt canh trường vi sinh vật vào giọt nước ngưng tụ ở đáy. - Nhẹ nhàng và từ từ kéo đầu que cấy lên trên mặt thạch từ đáy lên trên theo các kiểu sau: + Theo hình chữ chi (thường làm kiểu này). + Theo hình vòng xoắn. + Theo các vạch ngang song song. + Theo một đường thẳng. + Theo từng chấm, 1.3 Cấy trên thạch hộp (đĩa Petri) Có 2 trường hợp 1.3.1 Dùng que cấy vòng và cấy theo vết cạn dần Trình tự tiến hành như sau: - Để hộp thạch lên bàn - Dùng que cấy lấy canh trường vi sinh vật theo trình tự và yêu cầu vô khuẩn như đã trình bày ở các phần trên. - Tay trái hé mở nắp hộp vừa đủ để cho đầu que cấy vào. - Nhẹ nhàng và nhanh chóng đưa đầu que cấy (đã có giọt canh trường vi sinh vật) lướt nhẹ trên mặt thạch theo 1 trong các kiểu sau: + Theo 1 hình chữ chi lớn trên toàn bề mặt thạch trong hộp. + Theo 4 hình chữ chi nhỏ ở 4 góc. Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ Ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 52 + Theo những đường song song. Trong quá trình gieo cấy, vì lượng vi sinh vật sẽ bị giảm dần theo đường cấy nên khi vi sinh vật phát triển, càng gần cuối đường số khuẩn lạc càng thưa dần. 1.3.2 Dùng pipet Thường áp dụng khi định lượng hoặc phân lập vi sinh vật, cần gieo cấy một lượng tương đối nhiều (1 – 2 ml) vật gieo cấy lỏng. Có thể tiến hành theo một trong các cách sau: * Cách 1: Trộn vật gieo cấy lỏng vào thạch trước khi đổ ra hộp. Trình tự tiến hành như sau: - Dùng đĩa Petri đã vô khuẩn, chưa có thạch. - Đun chảy ống thạch, để nguội đến 50 – 55oC. - Dùng pipet vô khuẩn hút 1 lượng nhất định vật gieo cấy cho vào ống thạch, đậy nút bông lại. - Khẻ lắc ống thạch hoặc lăn nó giữa 2 bàn tay để trộn đều vật gieo cấy với thạch. - Hé mở nắp đĩa, nhanh tay đổ thạch vào đĩa, đậy nắp lại và xoay nhẹ để cho thạch dàn đều ra trên đáy đĩa. - Để yên cho thạch hoàn toàn đặc lại, lật ngược đĩa lại và cho vào tủ ấm để nuôi. * Cách 2: Trộn vật gieo cấy vào đĩa thạch. Trình tự tiến hành như sau: - Dùng đĩa Petri đã vô khuẩn, chưa có thạch. - Đun chảy ống thạch, để nguội đến 50 – 55oC. - Dùng pipet vô khuẩn hút một lượng nhất định vật gieo cấy lỏng, hé mở đĩa, cho vào đĩa, nghiêng qua nghiêng lại hoặc xoay nhẹ đĩa để chúng dàn đều trên đáy đĩa. - Hé mở nắp đĩa, nhanh tay đổ thạch vào, đậy nắp và xoay nhẹ vài vòng trên bàn cho thạch và vật gieo cấy trộn đều đồng thời dàn thành một lớp trên đáy hộp. - Để thạch đặc lại, lật ngược đĩa, cho vào tủ ấm. * Cách 3: Dàn đều vật gieo cấy trên mặt thạch. Trình tự tiến hành như sau: - Dùng đĩa thạch vô khuẩn. - Dùng pipet lấy 1 ít vật gieo cấy lỏng. - Hé mở đĩa và cho vật gieo cấy lên mặt thạch. Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ Ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 53 - Dùng que trang (bằng thủy tinh) dàn đều vật gieo cấy trên mặt thạch (que trang phải chuẩn bị trước: sạch, khô, bọc giấy, vô khuẩn) - Đậy nắp hộp, để yên một lúc cho mặt thạch ráo nước, quay ngược đĩa cho vào tủ ấm. 2. Phân lập các giống vi sinh vật thuần khiết Trong thiên nhiên và trong các vật phẩm dùng để nghiên cứu thường chứa hỗn hợp nhiều loài vi sinh vật khác nhau, ta chỉ có thể nghiên cứu về nhu cầu dinh dưỡng, về trao đổi chất, về di truyền học và các đặc tính khác khi ta có được những vi sinh vật thuần khiết. Vi sinh vật thuần khiết là giống vi sinh vật phát triển từ một tế bào ban đầu riêng biệt. Giống vi sinh vật thuần khiết thường được nhật từ canh trường vi sinh vật tập trung, canh trường này thường có được nhờ việc tạo ra các điều kiện chọn lọc. Vì thế muốn có giống thuần khiết ta phải tiến hành làm hai bước: - Phân lập canh trường vi sinh vật tập trung. - Sau đó phân lập vi sinh vật thuần khiết. 2.1 Phân lập canh trường vi sinh vật tập trung Canh trường vi sinh vật tập trung là canh trường trong đó một loài (hoặc có khi vào loài) vi sinh vật xác định chiếm tỷ lệ cao hơn hẳn các loài khác về số lượng. Phương pháp chủ yếu để nhận được canh trường vi sinh vật tập trung là dùng môi trường chọn lọc hay điều kiện chọn lọc. Tức là môi trường đó hay điều kiện nuôi cấy đó chỉ thuận lợi cho sự phát triển của vi sinh vật này mà không thuận lợi cho sự phát triển của vi sinh vật kia. Để có môi trường chọn lọc ta có thể thay đổi thành phần môi trường, pH môi trường hoặc một vài loại nguồn dinh dưỡng chính như nguồn cacbon và nguồn nitơ. Ví dụ: - Để tách vi sinh vật celluloza ta dùng môi trường có nguồn cacbon duy nhất là celluloza. - Để tách nấm mốc và nấm men ta dùng môi trường có hàm lượng đường cao và pH thấp. - Để tách vi sinh vật gây bệnh ta tiêm truyền qua súc vật thí nghiệm. Nói chung, tuỳ đặc tính của từng loài vi sinh vật mà ta có nhiều môi trường và điều kiện chọn lọc khác nhau. Muốn phân lập một loại nào cần tìm hiểu kỹ nhãng đặc tính sinh lý của loài đó trước. Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ Ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 54 2.2 Phân lập canh trường thuần khiết Canh trường thuần khiết là canh trường mà tất cả vi sinh vật trong đó đều được sinh ra từ một tế bào ban đầu. Việc phân lập canh trường thuần khiết là bước đầu tiên vô cùng quan trọng trong quá tình nghiên cứu vi sinh vật. Có thể phân lập canh trường thuần khiết từ vật phẩm nghiên cứu, nhưng tốt hơn cả là từ canh trường tập trung. Phương pháp cấy trên môi trường đặc Nguyên tắc của phương pháp này là tách từng khuẩn lạc riêng biệt trên môi trường đặc. Trình tự tiến hành như sau: - Đem vật phẩm (định để nghiên cứu) nghiền nhỏ: hoà lẫn và pha loãng dần đến mức độ nhất định bằng các ống nghiệm chứa nước cất hoặc nước muối sinh lý (0.85%) đã vô khuẩn. Tuỳ trường hợp mà pha loãng nhiều hay ít hoặc không pha loãng. Nói chung nên pha loãng trước để đảm bảo các tế bào tách ròi nhau và khi gieo cấy các khuẩn lạc dễ mọc tách biệt. - Gieo cấy trên môi trường đặc trong đĩa Petri đã chuẩn bị trước (thạch đĩa vô khuẩn) theo một trong các cách sau: + Dùng que cấy vòng cấy theo vết cạn dần Chú ý cấy thưa và đưa nhanh. + Dùng que trang, dàn đều vật gieo cấy trên mặt đĩa thạch. - Trộn vật gieo cấy vào ống thạch trước khi đổ vào đĩa (cách làm cụ thể đã trình bày ở phần gieo cấy. Trong 3 cách nêu trên thì 2 cách sau hay dùng vì nó thường cho các khuẩn lạc riêng biệt. - Gieo cấy xong, nuôi ở điều kiện thích hợp nhất cho loài vi sinh vật định phân lập. - Sau 1 đến 2 ngày đem quan sát và chọn những khuẩn lạc đứng tách biệt, dùng que cấy lấy 1 ít vi sinh vật ở khuẩn lạc riêng biệt cấy chuyển lên ống thạch, mỗi khuẩn lạc cấy lên một ống sau đó nuôi ở điều kiện thích hợp ta sẽ được canh trường thuần khiết. Chú ý: + Nếu sau 2 ngày, vi sinh vật chưa phát triển thì có thể để lâu hơn. + Phải chọn các khuẩn lạc thật riêng biệt. Phương pháp phân lập trên môi trường đặc là một phương pháp thông dụng, dễ làm và kết quả tương đối đảm bảo. Nhưng nó có thể gặp một số nhược điểm sau: Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ Ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 55 + Khuẩn lạc có thể không phải phát sinh từ 1 tể bào mà từ nhiều tế bào đã dính với nhau. + Các khuẩn lạc lúc mới mọc thì riêng biệt, nhưng qua một thời gian ngắn lại dính liền với nhau. Để khắc phục những nhược điểm đó và đảm bảo canh trường hoàn toàn thuần khiết ta có thể tiếp tục phân lập như trên vài lần, đồng thời làm tiêu bản quan sát để kiểm tra sự đồng nhất của khuẩn lạc đã tách. 3. Thực hiện tiêu bản quan sát nấm mốc dưới kính hiển vi 3.1 Tiêu bản nhuộm sống Cho một giọt cotton blue lên một lame sạch. Sử dụng kim mũi giáo hoặc que cấy móc lấy một ít hoặc một mảnh nhỏ thạch có khuẩn ty nấm. Rửa bớt bào tử nấm bằng cách đặt tơ nấm trong dung dịch nước xà phòng pha loãng, khuấy nhẹ. Đặt sinh khối khuẩn ty đã rửa vào giọt cotton blue trên lame< dùng hai que cấy móc hoặc một que cấy móc với một kim mũi giáo tách rời các sợi khuẩn ty trong dung dịch nhuộm. Đậy lại bằng một lamellae. Đặt tiêu bản lên bàn mang vật kính hiển vi và tiến hành quan sát ở vật kính 10X và 40X. 3.2 Tiêu bản thạch Cắt một mảnh thạch hình chữ nhật có kích thước bằng ¼ kích thước của lame, đặt lên một lame sạch. Dùng que cấy nhọn chạm nhẹ lên phần đầu sợi nấm để lấy bào tử, sau đó cấy nấm ở các cạnh của hình chữ nhật, đậy phần thạch lại bằng một lamellae sạch, đặt cả lame vào đĩa Petri và ủ ở nhiệt độ phòng. Sau khoảng thời gian 3 – 5 ngày, lấy lame ra tiến hành quan sát các đặc điểm vi học sợi nấm ở vật kính 10X. Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ Ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 56 PHỤ LỤC C. CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 1. Phương pháp xác định nồng độ rượu theo phương pháp chưng cất Chuẩn bị bình tam giác 500 ml, lấy dịch lọc lên men 300 ml cho vào bình tam giác, rồi đưa vào hệ thống chưng cất. Bình tam giác này được đặt trên bếp điện. Đầu còn lại của ống sinh hàn là côc thủy tinh dung để lấy rượu. Ta tiến hành chưng cất đến khi rượu ra được 100 ml thì ngừng. Trong quá trình chưng cất ta điều chỉnh nhiệt độ của bếp điện không quá cao và ổn định nhiệt độ để quá trình chưng cất đạt hiệu quả. Rượu sau khi chưng cất được đem làm lạnh đến 20oC, rồi đo độ rượu bằng cồn kế và ghi nhận kết quả. 2. Xác định tổng hàm lượng tinh bột và đường theo phương pháp thuỷ phân bằng axit Lấy 50 ml giấm chín cho vào bình tam giác 250 ml, thêm vào đó 50 ml nước cất và 6 ml HCl đậm đặc (hoặc 10 ml 25%), nối bình với ống sinh hàn khí dài ít nhất 50 ml. Mặt khác lấy 50 ml dịch lọc giấm chín rồi cho vào bình khác, cũng thêm nước và axit như mẫu giấm chưa lọc. Sau khi nối ống sinh hàn khí, đặt cả hai bình tam giác vào nồi cách thủy và đun sôi 2 giờ. Tiếp đó làm nguội tới nhiệt độ phòng rồi trung hoà bằng NaOH 10% tới khi màu của giấy quì chuyển sang màu xanh lơ. Chuyển toàn bộ dịch vào hai bình định mức 250 ml rồi thêm nước tới ngấn bình, đem lọc qua giấy vào hai bình khô khác nhau. Dịch lọc của hai bình dung để xác định đường theo các phường pháp khác nhau. Giả sử khi định phân 20 ml dung dịch K3Fe(CN)6 1% (20 ml dung dịch tương đương 25 mg glucoza) tốn hết a và a0 ml dịch đường. Hàm lượng đường cộng tinh bột sót trong giấm chín sẽ là: aa 5,12100 50 250025,0 =×× × (g/100 ml) Ví dụ: a = 10 như vậy tổng tinh bột và đường sót (chất khử) sẽ là: 10 5,12 = 1,25 g/100 ml Tương tự đối với giấm chín đã lọc khi định phân 20 ml ferixyanua kali 1% tiêu tốn a0 ml = 12,5. Như vậy lượng chất khử sót trong 100 ml giấm chín đã lọc tính theo glucoza sẽ là: 5,12 5,12 g/100 ml = 1 g/100ml Hàm lượng tinh bột sót: (1,25 – 1,0) x 0.9 = 0,225 g/100ml. Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ Ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 57 3. Xác định hiệu suất thu hồi rượu Nguồn gluxit Lượng cồn thu được từ 100kg Theo lít Theo kg Tinh bột 71,998 56,818 Hiệu suất thu hồi rượu được tính theo công thức sau: % 100 % 71,99 Tongdich doconH nguyenlieu tinhbot ×= ×× × Trong đó: Tổng dịch = lượng nước chan + cơm Nguyên liệu = khối lượng gạo đem nấu cơm. % tinh bột: lượng tinh bột có trong cơm, % tinh bột = 76%. Cơm = (nguyên liệu + lượng nước dùng để nấu) x hiệu suất nấu. Lượng nước dùng nấu = 1,5 x nguyên liệu. Hiệu suất nấu = 84%. Loại men Men giống Men AT Men CT Nước chan (g) 1540 1540 750 Nguyên liệu (g) 600 Hiệu suất nấu (%) 84 Cơm (g) 1260 Tổng dịch (g) 2800 2800 2010 Độ cồn (%v/v) 7,3 7,0 12 % tinh bột 76 H(%) 62,27 59,71 73,48 Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ Ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 58 PHỤ LỤC D. PHÂN TÍCH THỐNG KÊ Bảng 7. Kết quả số liệu phân tích khả năng đường khử và lên men của 3 loại men Lặp lại Bánh men Chỉ tiêu phân tích Men giống (MG) Men AT (AT) Men CT (CT) Lần 1 Lượng đường tạo thành (g/100ml) 14,.3 8,7 4,8 Tinh bột sót (g/100ml) 10,2 3,2 9 Độ rượu (%v/v) 7,2 6,9 11,7 Lần 2 Lượng đường tạo thành (g/100ml) 16,9 12,1 5,6 Tinh bột sót (g/100ml) 9,0 1,8 7,2 Độ rượu (%v/v) 7,4 7,1 12,3 Kết quả so sánh lượng đường tạo thành của các loại men. ANOVA Table for duong tao thanh by loai men Analysis of Variance ----------------------------------------------------------------------------- Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value ----------------------------------------------------------------------------- Between groups 108.16 2 54.08 17.11 0.0229 Within groups 9.48 3 3.16 ----------------------------------------------------------------------------- Total (Corr.) 117.64 5 Multiple Range Tests for duong tao thanh by loai men -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD loai men Count Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- CT 2 5.2 X AT 2 10.4 XX MG 2 15.6 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- AT - CT 5.2 5.65725 AT - MG -5.2 5.65725 CT - MG *-10.4 5.65725 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ Ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 59 Kết quả so sánh lượng tinh bột sót của các loại men. ANOVA Table for tinh bot sot by loai men Analysis of Variance ----------------------------------------------------------------------------- Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value ----------------------------------------------------------------------------- Between groups 56.0133 2 28.0067 25.31 0.0132 Within groups 3.32 3 1.10667 ----------------------------------------------------------------------------- Total (Corr.) 59.3333 5 Multiple Range Tests for tinh bot sot by loai men -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD loai men Count Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- AT 2 2.5 X CT 2 8.1 X MG 2 9.6 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- AT - CT *-5.6 3.34788 AT - MG *-7.1 3.34788 CT - MG -1.5 3.34788 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ Ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 60 Kết quả so sánh độ rượu tạo thành của các loại men. ANOVA Table for do ruou by loai men Analysis of Variance ----------------------------------------------------------------------------- Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value ----------------------------------------------------------------------------- Between groups 31.4533 2 15.7267 214.45 0.0006 Within groups 0.22 3 0.0733333 ----------------------------------------------------------------------------- Total (Corr.) 31.6733 5 Multiple Range Tests for do ruou by loai men -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD loai men Count Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- AT 2 7.0 X MG 2 7.3 X CT 2 12.0 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- AT - CT *-5.0 0.861811 AT - MG -0.3 0.861811 CT - MG *4.7 0.861811 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference.