Luận văn Khảo sát đặc điểm và vai trò của chủng xạ khuẩn streptomyces dicklowii

C xạ khuẩn hoàn toàn không phát triển được. 3.1.3.2. Khảo sát khả năng chịu muối: 66 Đây là đặc điểm phân loại đến loài của chi Streptomyces. Chủng xạ khuẩn được nuôi trên môi trường ISP-1(MT8) có bổ sung muối ở các nồng độ khác nhau, sau 5 ngày ghi nhận kết quả ở bảng 3.3: Bảng 3.3: Khả năng chịu muối của chủng xạ khuẩn Streptomyces dicklowii. Nồng độ NaCl Ñaëc ñieåm sinh tröôûng Maøu khuaån ty khí sinh Maøu saéc toá hoaø tan 1% 2% 3% 4% 5% 6% 7% 8% 9% 10% +++ +++ +++ ++ + - - - - - Xaùm traéng Xaùm traéng Traéng Traéng Traéng Traéng - - - - Khoâng Khoâng Khoâng Khoâng Khoâng Khoâng Khoâng Khoâng Khoâng Khoâng Chú thích: +++: sinh trưởng mạnh. ++: sinh trưởng trung bình +:sinh trưởng yếu. _: không sinh trưởng Từ kết quả trên cho thấy chủng Streptomyces dicklowii chỉ phát triển tốt ở nồng độ muối đến 4%, nồng độ muối trên 4% chủng xạ khuẩn phát triển rất kém và hầu như không phát triển ở nồng độ muối cao (trên 5%); điều này phù hợp với kết quả công bố của Zuckerman, 1996 về chủng xạ khuẩn Streptomyces dicklowii. 3.1.3.3. Khảo sát khả năng phân giải các hợp chất cao phân tử: 67 Môi trường sống tự nhiên của chủng Streptomyces dicklowii là môi trường đất với nhiều thành phần dưỡng chất khác nhau nhưng cơ bản vẫn là các thành phần Cellulose, Protein, ... là những hợp chất có phân tử lượng lớn. Để khảo sát khả năng sử dụng những hợp chất này của Streptomyces dicklowii chúng tôi tiến hành tìm hiểu khả năng sinh các enzym phân hủy các cao phân tử nói trên. Sau 7 ngày nuôi cấy trên môi trường MT5, MT6, MT7 để khảo sát khả năng sinh enzym phân giải các hợp chất cao phân tử như: hydratcacbon (tinh bột tan, CMC) protein (gelatin) của chủng Streptomyces dicklowii. Kết quả được ghi nhận ở bảng 3.4, hình 3.5. Bảng 3.4: Khả năng sinh enzym phân giải các hợp chất cao phân tử Vòng phân giải (mm) Cơ chất Vòng phân giải khuẩn lạc Hiệu suất phân giải(mm) Tinh bột tan 12,5 6 6,5 CMC 21,5 6,5 15 Gelatin 35 4,5 30,5 a b c Hình 3.5: Khả năng phân giải tinh bột (a), gelatin (b) và CMC (c) của chủng S. dicklowii. Qua bảng 4, hình 5 cho thấy: chủng xạ khuẩn Streptomyces dicklowii sinh nhiều loại enzym khác nhau để phân hủy các hợp chất cao phân tử khó tiêu cơ bản như các dạng hydratcacbon: tinh bột, cellulose (CMC), protein 68 (gelatin). Trong đó đáng lưu ý là khả năng phân giải gelatin của chủng này đạt hiệu suất phân giải rất cao (trên 30mm), với khả năng sinh enzym phong phú của chủng Streptomyces dicklowii cho thấy tính thích nghi cao với môi trường có các hợp chất cao phân tử khó phân hủy của chủng này. 3.1.3.4. Khảo sát khả năng sinh chất kích thích sinh trưởng thực vật: Auxin là nhóm chất kích thích sinh trưởng thực vật, trong đó acid indol acetic (IAA) là 1 loại auxin cơ bản được con người quan tâm nghiên cứu nhiều. Auxin không bền vững dưới tác dụng của ánh sáng và bị phân hủy trong môi trường acid hay dưới tác dụng của các chất oxy hóa. Có nhiều công trình nghiên cứu về khả năng sinh IAA của vi sinh vật nói chung và xạ khuẩn nói riêng cho thấy IAA là một kích thích sinh trưởng thực vật được nhiều xạ khuẩn sinh tổng hợp. Xuất phát từ thực tế này, chúng tôi tiến hành xác định khả năng sinh IAA của chủng Streptomyces dicklowii, trước tiên chúng tôi tiến hành xác định nhanh khả năng sinh IAA bằng phương pháp sử dụng thuốc thử Salkowski cải tiến: chủng xạ khuẩn Streptomyces dicklowii cấy vạch trên đĩa petri chứa môi trường MT19 (ISP4 có bổ sung tryptophan); sau 5 ngày nhận thấy vùng giấy lọc tương ứng với vết cấy xạ khuẩn xuất hiện màu hồng nhạt với thuốc thử Salkowski cải tiến, thuốc thử Salkowski cải tiến có phản ứng màu hồng đặc trưng khi tiếp xúc với IAA. Điều này chứng tỏ chủng xạ khuẩn Streptomyces dicklowii có sinh IAA. Để xác định rõ hơn khả năng sinh IAA của chủng Streptomyces dicklowii, chúng tôi tiến hành xác định hàm lượng IAA thô trong dịch nuôi cấy bằng phương pháp so màu với tia UV ở λ = 530 nm. ● Lập đồ thị chuẩn: Sử dụng 5 ống nghiệm có chứa dung dịch IAA với các độ pha loãng theo công thức ở sơ đồ sau: 69 Ống nghiệm số: 1 2 3 4 5 6 Nồng độ IAA 10µg/ml 2ml Nồng độ IAA 20µg/ml 2ml Nồng độ IAA 30µg/ml 2ml Nông độ IAA 40µg/ml 2ml Nồng độ IAA 50µg/ml 2ml Nước cất 2ml Thuốc thử Salkowki cải tiến 2ml 2ml 2ml 2ml 2ml 2ml Sau đó đem các dung dịch nói trên so màu bằng tia UV ở bước sóng λ = 530 nm; (Với ống nghiệm thứ 6 là ống đối chứng cho dung dịch nước cất) Đồ thị chuẩn được lập như sau: File Name: MINHHUY Created: 02:07 09/03/2005 Data: Original Wavelength: 530.0 Slit Width: 2.0 Multi-Point Working Curve Conc = k1 A + k0 k1 = 66.94 k0 = -0.162 Chi-Square: 0.01176 Number of Points: 6 Std Conc. Abs. 1 0.0000 0.000 2 10.000 0.178 3 20.000 0.299 4 30.000 0.420 5 40.000 0.575 6 50.000 0.784 ● Xác định hàm lượng IAA thô trong dịch nuôi cấy: 70 Xạ khuẩn được nuôi cấy trên môi trường dịch thể ISP4 có bổ sung tryptophan trên máy lắc 200 vòng /phút trong 5 ngày, sau đó ly tâm lấy 2ml dịch trong, cho 8ml thuốc thử Salkowki cải tiến vào ống nghiệm chứa 2ml dịch nuôi cấy nói trên đem so màu bằng tia UV ở bước sóng λ = 530 nm, từ đường chuẩn ta xác định được hàm lượng IAA thô của dịch nuôi cấy xạ khuẩn là: 9,223µg IAA/ml môi trường dịch nuôi cấy Từ kết quả trên cho thấy chủng xạ khuẩn Streptomyces dicklowii có khả năng sinh IAA với hàm lượng không cao lắm. Tuy vậy với hàm lượng IAA trong dịch nuôi cấy ở độ pha loãng nhất định cũng đã có tác dụng kích thích sự sinh trưởng phát triển của cây trồng. Kết quả này đã được chúng tôi kiểm chứng ở mục 3.5.3. 3.2. Nghiên cứu khả năng sinh kháng sinh của chủng xạ khuẩn S. dicklowii: Khả năng sinh tổng hợp chất kháng sinh là đặc tính của hơn 70% các loài xạ khuẩn, các chất kháng sinh có nguồn gốc từ xạ khuẩn có khả năng kháng nấm gây bệnh cho người, động vật, cây trồng, một số chất kháng sinh có khả năng kháng được các loại tuyến trùng sống ký sinh gây bệnh cho cây. Trong đó chi Streptomyces là chi xạ khuẩn sinh chất kháng sinh mạnh nhất và cũng là chi xạ khuẩn được tập trung nghiên cứu nhằm tìm những chất kháng sinh mới trong y học, nông nghiệp và ứng dụng chúng trong các chế phẩm vi sinh vật … 3.2.1. Thử họat tính kháng sinh: Để xác định hoạt tính kháng sinh của chủng Streptomyces dicklowii chúng tôi sử dụng phương pháp khuếch tán trên thạch (theo Nguyễn Đăng Đức, 1986) với Streptomyces dicklowii nuôi trong môi trường dịch thể MT3 (gồm nước chiết khoai tây và glucose), vi khuẩn kiểm định gram dương (Bacillus subtilic, Streptococcus sp.) và vi khuẩn gram âm (Echerichia coli) nuôi trên môi trường kiểm định MPA (MT11). Kết quả được ghi nhận ở bảng 3.5 và hình 3.6: 71 Bảng 3.5: Thử hoạt tính kháng sinh của chủng xạ khuẩn Streptomyces dicklowii lên vi khuẩn kiểm định. Ñöôøng kính voâ khuaån (mm) Vi khuaån kieåm ñònh D1 D2 D3 Hoaït tính khaùng sinh ( – d)mm Bacillus subtilis 29 27 28 28 20 Streptococcus sp. 21 20 20 20,5 12,5 Echerichia coli 0 0 0 0 0 Chú thích: D: đường kích vô khuẩn(mm). : đường kính vô khuẩn trung bình, d: đường kính lỗ đục (8mm) Hình 3.6: Thử hoạt tính kháng sinh lên vi khuẩn kiểm định. Qua kết quả ở bảng 3.5, hình 3.6 cho thấy chủng xạ khuẩn Streptomyces dicklowii có khả năng sinh kháng sinh. Kháng sinh của chủng này có khả năng ức chế chọn lọc, cụ thể ức chế mạnh vi khuẩn gram dương: Bacillus subtilic, Streptococcus sp. và không ức chế vi khuẩn thuộc gram âm Echerichia coli. 3.2.2. Lựa chọn môi trường thích hợp cho việc tạo kháng sinh của chủng xạ khuẩn Streptomyces dicklowii: Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh kháng sinh của xạ khuẩn là nguồn cacbon, nitơ và các yếu tố khoáng vi lượng. vì vậy để có một môi trường thích hợp cho các nghiên cứu về sau chúng tôi tiến hành lựa chọn trên các loại môi trường nuôi cấy với nguồn cacbon là glucose (môi trường A-4, A- 72 4H, Gauze-2, PGA), tinh bột (môi trường Gauze-1, A-12); nguồn nitơ là bột đậu tương (môi trường A-4, A-4H, A-12), cao thịt và peptone (môi trường Gauze-2) sau đó thử hoạt tính kháng sinh với vi khuẩn kiểm định là Bacillus subtilic. (các loại môi trường khảo sát trên là dịch thể không có agar) Kết quả được trình bày ở bảng 3.6, hình 3.7. Bảng 3.6: Lựa chọn môi trường lên men thích hợp cho chủng Streptomyces dicklowii. Voøng khaùng sinh (mm) Moâi tröôøng pH sau Sinh khoái (g/l) D1 D2 Hoaït löïc khaùng sinh ( - d)mm A - 4 6,5 17,2 25 25 25 17 A – 4H 6,8 20,1 21 22 21,5 13,5 A - 12 6,7 19 23 23,5 23,25 15,25 Gauze I 6,9 12,9 22 22 22 14 Gauze II 7,0 20,4 14 15 14,5 6,5 Nước chiết khoai tây 6,2 17 28 28 28 20 Chú thích: D: đường kích vô khuẩn(mm). : đường kính vô khuẩn trung bình, d: đường kính lỗ đục 73 0 5 10 15 20 25 A-4 A-4H A-12 Gauze 1 Gauze 2 MT17 MÔI TRƯỜNG LÊN MEN Si nh k hố i ( m g) 0 5 10 15 20 25 H oạ t l ự c kh án g si nh (m m ) Sinh khối Hoạt lực kháng sinh Biểu đồ 3.1: Sinh khối (mg) và hoạt tính kháng sinh (mm) của xạ khuẩn trên các loại môi trường. Môi trường A–4 Môi trường A-4H Môi trường A-12 Môi trường Gauze-1 Môi trường Gauze-2 Môi trường PGA Hình 3.7: Lựa chọn môi trường thích hợp tạo kháng sinh có hoạt tính cao. 74 Kết quả ghi ở bảng 3.6 cho thấy, trên môi trường Gauze – 2 (MT2) có thành phần môi trường rất giàu dinh dưỡng nên chủng xạ khuẩn Streptomyces dicklowii sinh trưởng mạnh cho sinh khối cao tuy nhiên hoạt tính kháng sinh thấp nhất trong các loại môi trường khảo sát. Trên môi trường nghèo dinh dưỡng hơn môi trường Gauze – 1 (MT1) chủng Streptomyces dicklowii sinh trưởng kém hơn nhưng hoạt tính kháng sinh mạnh hơn gấp đôi; đặc biệt trên môi trường nước chiết khoai tây với nguồn cacbon là glucose (MT3) chủng Streptomyces dicklowii có khả năng sinh trưởng tương đương như trên môi trường A 4 nhưng có hoạt tính kháng sinh cao nhất trong các loại môi trường khảo sát, môi trường MT3 có thành phần dinh dưỡng đơn giản dễ tìm ngoài thị trường cũng như giá thành không cao nên môi trường MT3 được chọn làm môi trường cho những nghiên cứu về sau. 3.3. Nghiên cứu các điều kiện ảnh hưởng đến sinh tổng hợp chất kháng sinh của chủng xạ khuẩn Streptomyces dicklowii. 3.3.1. Ảnh hưởng pH ban đầu: Chủng xạ khuẩn được nuôi cấy lắc 150 vòng/ phút trên môi trường MT3 ở nhiệt độ phòng với pH ban đầu khác nhau. Sau 120 giờ (5 ngày) đem xác định hoạt tính kháng sinh. kết quả được trình bày ở bảng 3.7 và hình 3.8: Bảng 3.7: Ảnh hưởng pH ban đầu lên khả năng sinh tổng hợp chất kháng sinh của chủng Streptomyces dicklowii Voøng khaùng khuaån (mm) pH Sinh khoái (g/l) pH sau D1 D2 Hoaït tính khaùng sinh ( – d) mm 5 12 5,6 17 16,5 16,75 8,75 6 19 6,0 20 19 19,5 11,5 7 20,5 6,2 29 28 27 20 8 12 6,11 25 25 25 17 9 11 6,21 24 24 24 16 75 10 11,5 6,0 17 16 16,5 8,5 Chú thích: D: đường kính vòng vô khuẩn. : đường kinh vòng vô khuẩn trung bình. d: đường kính lỗ đục (8mm) 0 5 10 15 20 25 pH 5 pH 6 pH 7 pH 8 pH 9 pH 10 pH ban đầu của môi trường nuôi cấy. S in h kh ối (g /l) 0 5 10 15 20 25 Ho ạt tí nh k há ng s in h (m m ) Sinh khối Hoạt tính kháng sinh Biểu đồ 3.2: Ảnh hưởng pH ban đầu lên khả năng sinh kháng sinh của chủng Streptomyces dicklowii 76 Hình 3.8: Ảnh hưởng của pH ban đầu đến hình thành kháng sinh của chủng xạ khuẩn Streptomyces dicklowii.. Kết quả cho thấy ở các pH ban đầu khác nhau cũng ảnh hưởng lên khả năng sinh kháng sinh cũng như khả năng sinh trưởng của xạ khuẩn; chủng xạ khuẩn Streptomyces dicklowii sinh trưởng tốt trong môi trường pH trung tính có hơi kiềm nên ở pH = 7 dịch nuôi cấy có sinh khối cao. Bên cạnh đó, thành phần khoáng cũng như các nguồn nitơ trong nước chiết khoai tây, nguồn cacbon là glucose đã giúp chủng Streptomyces dicklowii tăng sức cạnh tranh trong môi trường nuôi cấy thể hiện qua hoạt tính kháng sinh cao, các môi trường pH quá cao hay pH quá thấp chủng Streptomyces dicklowii phát triển yếu và khả năng sinh chất kháng sinh không cao. Vậy chủng Streptomyces dicklowii phải được nuôi cấy trong môi trường có pH trung tính (pH = 7) thì kết quả nuôi cấy sẽ có lượng sinh khối của xạ khuẩn cao và hoạt tính kháng sinh mạnh. 3.3.2. Ảnh hưởng chế độ thông khí: Xạ khuẩn là vi sinh vật hiếu khí nên sự có mặt của oxy cũng có ảnh hưởng lên khả năng sinh trưởng cũng như sinh kháng sinh.Qua khảo sát ở các độ thông khí khác nhau. Kết quả ghi nhận ở bảng 3.8, hình 3.9. Bảng 3.8: Ảnh hưởng chế độ thông khí lên khả năng sinh kháng sinh của chủng xạ khuẩn Streptomyces dicklowii. Voøng voâ khuaån (mm) Cheá ñoä thoâng khí D1 D2 D3 Hoaït tính khaùng sinh ( – d) mm 77 0 voøng 20 20 20 20 12 100 voøng 23 22 21 22 14 130 voøng 24 23,5 24,5 24 18 150 voøng 28 29 30 29 21 180 voøng 31 30 31 30,6 22,6 200 voøng 31 31 31 31 23 250 voøng 30,5 31,5 31 31 23 Chú thích: D: đường kinh vòng vô khuẩn : đường kính vòng vô khuẩn trung bình., d: đường kính lỗ đục (8mm). 78 Hình 3.9: Ảnh hưởng chế độ thông khí lên khả năng sinh kháng sinh của chủng xạ khuẩn Streptomyces dicklowii. 0 5 10 15 20 25 0 vòng 100 vòng 130 vòng 150 vòng 180 vòng 200 vòng 250 vòng độ thông khí (vòng /phút) H oạ t t ín h kh án g si nh (D -d )m m Hoạt tính kháng sinh Đồ thị 3.1: Ảnh hưởng độ thông khí lên khả năng sinh kháng sinh. Từ kết quả trên cho thấy chế độ thông khí càng cao - tăng số vòng lắc lên càng cao - thì chủng Streptomyces dicklowii sinh kháng sinh với hàm lượng càng cao, ở chế độ thông khí 200 vòng/phút hoạt tính kháng sinh cao nhất trong các lần thí nghiệm lặp lại, tuy nhiên nếu tăng 250 vòng/1 phút thì hoạt tính kháng sinh không tăng, vì vậy nuôi cấy chủng xạ khuẩn Streptomyces dicklowii tại chế độ thông khí 200 vòng/phút là thích hợp. 3.3.3. Xác định thời gian sinh kháng sinh tối ưu: Tùy theo từng loại chủng xạ khuẩn mà thời gian thích hợp để lên men thu sản phẩm trao đổi chất rất khác nhau, vì vậy để thu được lượng hoạt tính kháng sinh cao nhất cần khảo sát từng thời điểm nuôi cấy cách nhau 24 giờ. Kết quả được trình bày ở bảng 3.9, hình 3.10. 79 Bảng 3.9: Thời gian sinh kháng sinh tối ưu của chủng xạ khuẩn Streptomyces dicklowii khi nuôi cấy trong dịch thể. Voøng voâ khuaån (mm) Thôøi gian pH sau Sinh khoái (g/l) D1 D2 D3 Hoaït tính khaùng sinh ( – d) mm 1 5,3 8,7 15 16 14 15 7 2 4,9 11,7 17,5 18,5 18 18 10 3 5,32 14,2 24 24,5 23,5 24 16 4 5,7 16 26 26 26 26 18 5 5,82 17 31 32 31 31,3 23,3 6 6,3 17 30,5 31 31,5 31 23 Chú thích: D: đường kinh vòng vô khuẩn : đường kính vòng vô khuẩn trung bình. d: đường kính lỗ đục (8mm). 0 5 10 15 20 25 1 ngày 2 ngày 3 ngày 4 ngày 5 ngày 6 ngày THỜI GIAN NUÔI CẤY Si nh k hố i ( m g) v à độ p H -1.0 4.0 9.0 14.0 19.0 24.0 H oạ t t ín h kh án g si nh (m m ) Hoạt tính kháng sinh sinh khối pH sau Đồ thị 3.2: Xác định thời gian tối ưu sinh kháng sinh. 80 Hình 3.10: Thời gian nuôi cấy ảnh hưởng hoạt tính kháng sinh của chủng Streptomyces dicklowii. Qua bảng 3.9, đồ thị 3.2 cho thấy: khả năng sinh kháng sinh của chủng Streptomyces dicklowii có từ ngày thứ 1 nhưng rất yếu. Từ ngày thứ 2 trở đi dịch nuôi cấy hoạt tính kháng sinh tăng dần và đạt cực đại ở ngày thứ 5 (hoạt tính kháng sinh = 23,3 mm); Điều này liên quan chặt chẽ đến sự hình thành các acid hữu cơ trong môi trường và sự sinh trưởng của xạ khuẩn. Lượng sinh khối cũng tăng dần cùng với thời gian và hoạt tính kháng sinh đạt cực đại ở 120 giờ (5 ngày) sau đó sinh khối giảm (đồ thị 2) và hoạt tính kháng sinh không tăng. Từ kết quả đó có thể chọn 120 giờ (5 ngày) là thời gian thu kháng sinh từ môi trường nuôi cấy chủng Streptomyces dicklowii là thích hợp nhất. Trên cơ sở chất kháng sinh là sản phẩm trao đổi chất bậc 2 của chủng Streptomyces dicklowii; nên ở thời gian đầu sinh trưởng, chủng xạ khuẩn này chỉ sinh acid acetic và pyruvic là 2 acid tham gia chuyển hóa tiếp theo tạo kháng sinh; ở thời gian sau pha logarit của đường cong sinh trưởng chất kháng sinh mới tổng hợp mạnh mẽ (theo Đồng Thị Thanh Thu, 2000). 81 3.3.4. Ảnh hưởng nguồn hydratcacbon: Trong môi trường nuôi cấy vi sinh vật luôn có thành phần hydartcacbon, hydratcacbon được đưa vào môi trường nhằm cung cấp mạch cacbon cho quá trình tổng hợp và sự trao đổi hydartcacbon giúp cho vi sinh vật thu nhận năng lượng, tạo các liên kết trong quá trình tổng hợp, là thành phần của tế bào. Đối với xạ khuẩn nguồn hydratcacbon khác nhau cũng ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng, do khả năng sử dụng các nguồn đường, từ đó ảnh hưởng khả năng sinh kháng sinh của chủng này; nên chúng tôi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của nguồn cacbon khác nhau lên khả năng sinh kháng sinh của chủng xạ khuẩn Streptomyces dicklowii trên môi trường cơ bản là MT10 với nguồn nitơ (NH4)2SO4 1%. Kết quả được trình bày ở bảng 3.10, hình 3.11. Bảng 3.10: Ảnh hưởng nguồn hydratcacbon lên sinh tổng hợp chất kháng sinh của chủng xạ khuẩn Streptomyces dicklowii. Voøng khaùng sinh(mm) Nguoàn cacbon pH sau Sinh khoái (g/l) D1 D2 Hoaït löïc khaùng sinh( – d) mm Tinh boät tan 1,5% 7,0 5,2 21 22 21,5 13,5 Glucose 1,5% 6,8 5,3 23,5 24,5 25,5 17,5 Saccarose 1,5% 6,9 2,4 14 14 14 6 Dextrin 1,5% 6,7 5,26 24 24 24 16 Lactose 1,5% 7,0 4,2 20 20 20 12 Maltose 1,5% 7,2 3,8 25 24 24,5 16,5 Ræ ñöôøng 1,5% 7,3 11,6 27 25 26 18 Chú thích: D: đường kinh vòng vô khuẩn : đường kính vòng vô khuẩn trung bình, d: đường kính lỗ đục (8mm). 82 Hình 3.11: Ảnh hưởng nguồn hydratcacbon lên sinh kháng sinh của chủng xạ khuẩn Streptomyces dicklowii. Kết quả trên cho thấy, chủng Streptomyces dicklowii có khả năng sử dụng các loại đường khác nhau; trong đó nguồn cacbon là glucose, rỉ đường là 2 nguồn hydratcacbon thích hợp hơn cả, với nguồn cacbon này chủng xạ khuẩn vừa sinh kháng sinh cao vừa tích lũy sinh khối nhiều, nhất là nguồn cacbon là rỉ đường (biểu đồ 3.3) như vậy ngoài nguồn đường có trong rỉ đường các thành phần hữu cơ khác có trong rỉ đường cũng ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp chất kháng sinh của chủng này. 83 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 TBT1,5% Glu 1,5% Sac 1,5% Dex 1,5% Lac 1,5% Mal 1,5% Rỉ đường 1,5% NGUỒN CACBON S in h kh ối (g /l) 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Ho ạt lự c kh án g si nh (m m ) Sinh khối Hoạt lực kháng sinh Biểu đồ 3.3: Sinh khối và hoạt lực kháng sinh của xạ khuẩn Streptomyces dicklowii ở các loại môi trường có các nguồn hydartcacbon khác nhau 3.3.5. Ảnh hưởng nguồn nitơ: Trong môi trường nuôi cấy, nguồn nitơ đóng vai trò là thành phần nguyên liệu cho sự tổng hợp các sản phẩm của tế bào, ngoài ra các hợp chất chứa nitơ còn giúp tế bào thực hiện quá trình trao đổi chất và điều hòa quá trình chuyển hóa. Để khảo sát nguồn nitơ hữu cơ (cao nấm men và bột đậu tương) lên khả năng sinh tổng hợp chất kháng sinh của chủng Streptomyces dicklowii, chúng tôi cấy chủng này lên MT10 với nguồn cacbon là glucose 1,5%, cao nấm men và bột đậu tương được sử dụng ở các nồng độ ghi ở 3.11. kết quả thí nghiệm được trình bày ở bảng 3.11 và hình 3.12. Bảng 3.11: Ảnh hưởng nguồn nitơ lên khả năng sinh tổng hợp chất kháng sinh của chủng xạ khuẩn Streptomyces dicklowii. Voøng khaùng sinh (mm) Nguoàn nitô pH sau Sinh khoái (g/l) D1 D2 Hoaït tính khaùng sinh( – d)mm Cao naám men 1% 6,5 8 22 21 21,5 13,5 84 Boät ñaäu töông 1% 6,8 13,2 25 25 25 17 Boät ñaäu töông 2% 7,0 14 24 24 24 16 Chú thích: D: đường kinh vòng vô khuẩn : đường kính vòng vô khuẩn trung bình. d: đường kính lỗ đục (8mm). 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 Cao nấm men 1% Bột đậu tương 1% Bột đậu tương 2% NGUỒN NITƠ Si nh k hố i ( g/ l) 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 H oạ t l ự c kh án g si nh (m m ) Sinh khối Hoạt lực kháng sinh Biểu đồ 3.4: Ảnh hưởng nguồn nitơ lên sự tích lũy sinh khối và hoạt tính kháng sinh của xạ khuẩn Streptomyces dicklowii. Hình 3.12: Ảnh hưởng nguồn nitơ lên khả năng sinh kháng sinh của Streptomyces dicklowii Qua khảo sát trên cho thấy, với môi trường MT10 bổ sung nguồn nitơ là bột đậu tương tỉ lệ 1% thì xạ khuẩn sinh kháng sinh mạnh hơn môi trường bổ sung bột đậu tương tỉ lệ 2%; kết quả này phù hợp với nghiên cứu 85 của Lê Gia Hy , 1994. Kết quả trên theo chúng tôi có thể do trong môi trường nuôi cấy có quá nhiều nguồn nitơ thì sẽ gây ra hiện tượng ức chế quá trình sinh tổng hợp các enzym kể cả các enzym proteaza ngoại bào (theo Nguyễn Đức Lượng, 2001) từ đó ảnh hưởng lên khả năng sinh tổng hợp chất kháng sinh của chủng xạ khuẩn Streptomyces dicklowii. Từ kết quả thí nghiệm ở mục 3.3.4 và 3.3.5 cho thấy trên môi trường MT10 có thành phần rỉ đường 1,5%, (NH4)2SO4 1% thì xạ khuẩn Streptomyces dicklowii có khả năng tổng hợp chất kháng sinh trong dịch nuôi cấy cao và trên môi trường MT10 có thành phần glucose 1,5%, bột đậu tương 1% thì chủng xa khuẩn Streptomyces dicklowii có kháng sinh trong sinh khối nhiều. Điều này cho thấy nếu ta kết hợp nguồn hydratcacbon là rỉ đường 1,5%, nguồn nitơ là bột đậu tương 1%, và các thành phần khoáng đa vi lượng như môi trường MT10 thì chúng ta hy vọng thu được tổng lượng kháng sinh từ dịch nuôi cấy và trong sinh khối cao; để kiểm tra lại điều này chúng tôi tiếp tục thực hiện khảo sát kế tiếp. Cụ thể tiến hành 2 phương án thí nghiệm nuôi cấy chủng Streptomyces dicklowii trên các môi trường có 2 nguồn cacbon khác nhau là rỉ đường và glucose như sau: - Môi trường a (MTa): MT10 + bột đậu tương 1% + rỉ đường 1,5%. - Môi trường b (MTb): MT10 + bột đậu tương 1% + glucose 1,5%. Kết quả được trình bày ở bảng 3.12 Bảng 3.12: Khảo sát môi trường thích hợp cho nuôi cấy xạ khuẩn Streptomyces dicklowii để thu kháng sinh Môi trường Sinh khối (g/l) Hoạt tính kháng sinh từ sinh khối (D – d)mm Hoạt tính kháng sinh từ dịch thể (D – d)mm MTa 21 24 23 MTb 14 21,5 20 Chú thích: D: đường kinh vòng vô khuẩn, d: đường kính lỗ đục (8mm) 86 Qua kết quả trên chúng ta khẳng định được môi trường thích hợp cho việc nuôi cấy xạ khuẩn có hoạt tính kháng sinh cao là môi trường MTa (MT10 + rỉ đường 1,5% + bột đậu tương 1%). MTa (kháng sinh từ sinh khối) MTa (kháng sinh từ dịch lọc) 87 MTb (kháng sinh từ sinh khối) MTb (kháng sinh từ dịch thể) Hình 3.13: khảo sát môi trường thích hợp cho nuôi cấy Streptomyces dicklowii thu kháng sinh từ sinh khối và dịch lọc. 3.4. Tách chiết và tinh sạch chất kháng sinh của chủng xạ khuẩn S. dicklowii. 3.6.1. Lựa chọn dung môi thích hợp: Dịch nuôi cấy sau 5 ngày của chủng xạ khuẩn Streptomyces dicklowii được ly tâm và tách sinh khối và dịch lọc riêng. - Tiến hành chiết rút chất kháng sinh từ dịch lọc bằng các loại dung môi: n – butanol, n – probanol, toluen, clorofoc. - Tiến hành chiết rút chất kháng sinh từ sinh khối bằng các loại dung môi: aceton, etylacetat, etanol, metanol, n – butanol, n – probanol. Dịch kháng sinh chiết rút được sau đó đem đi xác định hoạt tính kháng sinh. Kết quả được trình bày ở bảng 3.13. Bảng 3.13: Khả năng tách chiết kháng sinh của chủng Streptomyces dicklowii bằng các loại dung môi 88 Nguồn chiết Dung môi Hoạt tính kháng sinh (D – d, mm) Sinh khối Aceton Etyl acetat Etanol Metanol n – butanol izoprobanol 24 11 24 24 18 23 Dịch lọc n – butanol n – probanol Toluen Clorofoc 21 20 14 không Kết quả ở bảng 3.13 cho thấy để tách chiết kháng sinh từ sinh khối đạt hiệu quả cao chỉ có 3 loại dung môi có độ phân cực là Aceton, Etanol và Metanol trong đó Aceton có độ phân cực thấp nhất tuy nhiên sử dụng Etanol dùng trong tách chiết kháng sinh từ sinh khối không độc đối với người sử dụng, dễ tìm kiếm trong thị trường và hiệu quả cũng tương tự như Aceton, Metanol nên chúng tôi chọn dung môi Etanol dùng tách chiết kháng sinh từ sinh khối. Khi sử dụng các dung môi Etyl acetat thuộc nhóm este thì khả năng trích ly kháng sinh từ sinh khối là thấp nhất hay các dung môi thuộc nhóm ancol (n – butanol, izoprobanol) khả năng trích ly kháng sinh từ sinh khối của xạ khuẩn đều không cao. Đối với dịch lọc của môi trường nuôi cấy xạ khuẩn, dung môi thuộc nhóm ancol là n – butanol tách chiết được kháng sinh đạt hiệu quả cao nên dung môi n – butanol được lựa chọn dùng tách chiết kháng sinh trong dịch nuôi cấy (sau khi tách sinh khối) của chủng Streptomyces dicklowii. Trong khi đó dung môi Clorofoc hoàn toàn không tách chiết được kháng sinh ở nhiệt độ phòng. 89 Hình 3.14: Lựa chọn dung môi để tách chiết kháng sinh từ sinh khối và từ dịch nuôi cấy chủng xạ khuẩn Streptomyces dicklowii. Cũng từ bảng 3.13 cho thấy lượng chất kháng sinh được tách từ sinh khối cao hơn chất kháng sinh được tách từ dịch lọc. Để phục vụ cho việc tách chiết, làm tinh sạch chất kháng sinh của chủng Streptomyces dicklowii chúng tôi tiến hành khảo sát độ hoà tan của chất kháng sinh này trong các hệ dung môi khác nhau, kết quả được trình bày ở bảng 3.14. 90 Bảng 3.14: Độ hoà tan của chất kháng sinh của chủng xạ khuẩn Streptomyces dicklowii trong các dung môi. Dung môi Độ hòa tan Metanol dễ tan Dimetylfocmamit dễ tan Butanol bảo hòa nước dễ tan Benzol dễ tan cồn 70% dễ tan nước Tan được cồn tuyệt đối Khó tan Ethel Không tan Clorofoc Không tan 3.6.2. Tách chiết và tinh sạch kháng sinh: Để tách chiết và tinh sạch chất kháng sinh chúng tôi sử dụng phương pháp dùng các loại dung môi. Trên cơ sở kết quả khảo sát ở phần 3.4.1 và 3.4.2 chúng tôi tiến hành chiết rút và làm tinh sạch chất kháng sinh theo sơ đồ 3.1 91 Giải thích các bước trong sơ đồ: - Dịch nuôi cấy sau khi kết thúc lên men được điều chỉnh hạ pH xuống pH = 3 nhằm ngăn chặn những chuyển hoá tiếp theo trong dịch nuôi cấy đồng thời loại đi những thành phần dinh dưỡng còn thừa trong dung dịch kể cả CaCO3 mà xạ khuẩn không dùng hết. Sau đó ly tâm dịch nuôi cấy, tách phần sinh khối và dịch thể. - Sinh khối được rữa sạch môi trường bằng nước cất (rữa 2 lần) chất kháng sinh trong sinh khối được rút chiết bằng etanol 70% (pH= 7->8) khuấy đảo liên tục ở nhiệt độ 45OC khoảng 30 phút nhằm tạo điều kiện để chất kháng sinh đi qua thành tế bào hòa vào trong dung môi. Tiếp theo dung môi (etanol) được đuổi đi bằng cô chân không ở nhiệt độ 60OC còn 1/3 thể tích dịch cô. Hạ 92 nhiệt độ xuống 4OC làm giảm sự hòa tan của kháng sinh đưa đến kháng sinh tủa. - Phần dịch lọc được tách chiết bằng dung môi n - butanol (pH=7) tỉ lệ 4 : 6 (4 phần là butanol : 6 phần là dịch lọc) ở bình lóng; sau khi bỏ lượng nước bên dưới bình lóng, phần trên đem cô chân không (60OC) còn 1/15 để đuổi hết dung môi. Cuối cùng cho aceton vào; ở nhiệt độ bình thường kháng sinh hòa trong dung môi, nhưng ở nhiệt độ lạnh (4OC) aceton giảm sự hoà tan, làm tủa chất kháng sinh. Kháng sinh kết tủa được tách bằng ly tâm 4500 vòng/ phút trong thời gian 15 phút, ta có được kháng sinh thô. Giai đoạn tiếp theo là làm tinh sạch kháng sinh thô thu kháng sinh tinh khiết: - Kháng sinh thô tiếp tục được pha với dung môi metanol (nhằm loại bỏ những tạp chất tương tự như kháng sinh có khả năng hoà tan trong aceton và butanol), đồng thời bổ sung 4% CaCl (nhằm tạo phức với kháng sinh làm kháng sinh không tan - theo Nguyễn Đức Lượng, 2001); lần rửa kháng sinh thô cuối cùng là bằng aceton và thu phần kháng sinh tủa – ta thu được kháng sinh tinh khiết có màu vàng sáng (hình 3.18). Hình 3.18: Chất kháng sinh được chiết tách từ chủng xạ khuẩn S. dicklowii 3.6.3. Tìm hiểu tính chất của chất kháng sinh từ chủng xạ khuẩn: 93 3.6.3.1. Khả năng bền vững nhiệt độ của chất kháng sinh: Mục đích để biết khả năng bền vững nhiệt độ của chất kháng sinh được tách chiết từ xạ khuẩn, chúng tôi tiến hành khảo sát nhiệt độ ảnh hưởng lên chất kháng sinh được tách từ Streptomyces dicklowii kết quả được trình bày ở bảng 3.14. Bảng 3.14: Khả năng bền nhiệt của chất kháng sinh chủng xạ khuẩn S. dicklowii. Hoaït tính khaùng sinh (D – d) mm Nhieät ñoä xöû lyù (OC) Xöû lyù10 phuùt Xöû lyù20 phuùt Xöû lyù40 phuùt Xöû lyù60 phuùt 30 23 23 23 23 40 23 23 23 23 60 23 22 22 22 80 22 21 20 19 100 19 19 17 16 Chú thích: D: đường kinh vòng vô khuẩn d: đường kính lỗ đục (8mm). Ở nhiệt độ 30OC – 40OC hoạt tính kháng sinh không đổi, ở nhiệt độ 60OC kéo dài hơn 10 phút thì hoạt tính kháng sinh có giảm ít nhưng ở nhiệt độ trên 60OC và kéo dài thời gian thì hoạt tính kháng sinh giảm đáng kể. Từ đó cho thấy việc tách chiết, sử dụng, bảo quản chất kháng sinh không nên ở nhiệt độ cao hơn 60OC mới bảo đảm hoạt lực kháng sinh. 3.6.3.2. Xác định các nhóm chức trong cấu trúc hoá học cùa chất kháng sinh bằng phản ứng màu: Mục đích thông qua các phản ứng chỉ thị đặc trưng cho từng nhóm chức hoá học mà từ đó bước đầu phân loại chất kháng sinh thuộc nhóm cấu trúc nào theo khóa phân loại của Masaji Sezaki,2001. Nhận biết sự hiện diện vòng lớn Lacton bằng phản ứng chỉ thị màu với H2SO4đđ: cho vài giọt chất kháng sinh tinh sạch vào ống nghiệm có 4ml 94 H2SO4đđ, lắc nhẹ quan sát sự thay đổi màu: nhận thấy có sự thay đổi từ không màu khi cho kháng sinh vào thì dung dịch chuyển sang màu đỏ thẩm điều đó xác định chất kháng có vòng lớn lacton và tan được trong H2SO4đđ. Trên cơ sở trên tiếp tục cho vài giọt chất kháng sinh vào dung dịch H3PO4đđ để nhận biết các nhóm hrydrastis trên vòng lớn Macrolide: nhận thấy có sự đổi màu từ không màu khi cho vài giọt kháng sinh vào thì dung dịch chuyển sang màu vàng đã chứng tỏ có nhóm OH trong cấu trúc. Với 2 yếu tố trên chất kháng sinh không thể thuộc nhóm 1,8, 9, 10, 11, 12 theo khoá phân loại của Masaji Sezaki. Xác định nhóm chức gốc amin (- NH2) bằng phản ứng với Ninhydrin: cho vài giọt kháng sinh vào ống nghiệm có Ninhydrin nhưng không có phản ứng màu hay chất kháng sinh không có nhóm chức amin, chất kháng sinh không thuộc nhóm phân loại 2, 6, 7. Xác định nhóm chức phenol bằng phản ứng đặc trưng với FeCl3: khi cho vài giọt chất kháng sinh vào ống nghiệm có sẳn FeCl3 nhận thấy không xảy ra phản ứng màu hay chất kháng sinh không có nhóm chức phenol , nên chất kháng sinh không thể thuộc nhóm 5, 8, 9. Xác định nối đôi –C=C- bằng phản ứng với KMnO4: cho vài giọt chất kháng sinh vào ống nghiệm có sẳn KMnO4 nhận xét thấy phản ứng xảy ra làm mất màu KMnO4 chứng tỏ trong cấu trúc của chất kháng sinh có nối đôi và điều này có thể cho biết chất kháng sinh thuộc nhóm 4. Các phản ứng trên được minh hoạ ở các hình 3.16, 3.17. 95 Hình 3.16: Phản ứng màu của chất kháng sinh chủng Streptomyces dicklowii với H2SO4đđ , H3PO4đđ , Nihydrin, Fehling (chú thích: CKS - chất kháng sinh; ĐC - đối chứng) Hình 3.17: Khảo sát các nhóm chức bằng các phản ứng màu với FeCl3, KMnO4 của chất kháng sinh chủng xạ khuẩn Streptomyces dicklowii. (chú thích: ĐC - đối chứng; CKS - chất kháng sinh) Từ các kết quả trên, đối chiếu với khóa phân loại kháng sinh của Masaji Sezaki & Shinji Miyadoh (2001) chất kháng sinh của chủng xạ khuẩn Streptomyces dicklowii có thể thuộc nhóm 4, nhóm polyene macrocyclic. 96 3.7. Khảo sát ảnh hưởng của dịch nuôi cấy chủng Streptomyces dicklowii lên các tác nhân gây hại cây trồng. 3.7.1. Khảo sát khả năng ức chế của chất kháng sinh lên bệnh hại cây trồng: Chúng tôi tiến hành thử dịch nuôi cấy xạ khuẩn ở 2 hình thức: nuôi cấy nấm gây bệnh trên môi trường dịch thể (nước chiết khoai tây và glucose) có bổ sung dịch nuôi cấy xạ khuẩn Streptomyces dicklowii 20% (đối chứng là môi trường dịch thể nước chiết khoai tây không bổ sung dịch nuôi cấy xạ khuẩn) và cấy chấm 2 điểm nấm bệnh trên môi trường thạch MT15 (thành phần gồm nước chiết khoai tây và glucose) đối xứng qua lỗ đục, rồi nhỏ dịch nuôi cấy xạ khuẩn vào lỗ đục. Kết quả cho thấy ở bảng 3.17, hình 3.19, 3.20, 3.21. Bảng 17: Khả năng ức chế của dịch nuôi cấy xạ khuẩn Streptomyces dicklowii lên bệnh hại cây trồng Khaû naêng sinh tröôûng Chuûng naám gaây beänh Trong dòch theå (20% dòch nuoâi caáy ) Treân moâi tröôøng thaïch Fusarium oxysporum - - Rhizoctonia solani - - Pythilium sp. - - Sclerotium sp. + + Colletotrichum sp. + + Chuù thích: +: khoâng bò öùc cheá; - : bò öùc cheá 97 Hình 3.19: Khả năng ức chế của dịch nuôi cấy xạ khuẩn lên nấm bệnh cây trồng bằng phương pháp dịch thể. Sau 3 – 5 ngày quan sát kết quả trên đĩa petri thấy: tại vị trí chất kháng sinh khuếch tán quanh lỗ thạch các loài nấm Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solani, Pythium sp không mọc được. Riêng nấm Colletotrichum sp và Sclerotium sp vẫn phát triển được trên vùng có chất kháng sinh khuếch tán. a. Rhizoctonia solani b. Pythium sp. 98 c. Fusarium oxysporum Hình 3.20: Khả năng ức chế của dịch nuôi cấy xạ khuẩn Streptomyces dicklowii lên nấm bệnh cây trồng a. Sclerotium sp. b. Colletotrichum sp. Hình 3.21: Sự không ức chế của dịch nuôi cấy xạ khuẩn Streptomyces dicklowii đối với nấm Sclerotium sp. và Colletotrichum sp. gây bệnh hại cây trồng Qua 2 phương pháp thử nghiệm sự ức chế nấm gây bệnh cho cây trồng đã cho những kết quả phù hợp, điều đó khẳng định chủng xạ khuẩn Streptomyces dicklowii có khả năng ức chế 3 loại nấm bệnh là: Fusarium oxysporum (gây bệnh héo vàng cho cà), Rhizoctonia solani (gây bệnh khô 99 vằn), Pythium sp (gây bệnh chết rạp thối rễ) và không có khả năng ức chế Collectotrichum sp , Sclerotium sp. 3.7.2. Khảo sát khả năng ức chế của chất kháng sinh từ Streptomyces dicklowii lên tuyến trùng hại cây trồng: Một đặc điểm đáng quí mà không phải chủng xạ khuẩn sinh kháng sinh nào cũng có là ở chủng Streptomyces dicklowii thể hiện hoạt tính diệt tuyến trùng hại cây trồng rất cao. Để khảo sát khả năng này của chủng xạ khuẩn Streptomyces dicklowii hiện chúng tôi đang có, chúng tôi tiến hành tìm hiểu đặc điểm hình thái và vòng đời của tuyến trùng nốt sưng ở một số cây trồng tại tp HCM và một số vùng khácđể trên cơ sở của những hiểu biết này có thể tách được tuyến trùng - đối tượng phục vụ cho các thí nghiệm thử hoạt tính diệt tuyến trùng của Streptomyces dicklowii – trong điều kiện phòng thí nghiệm. 3.7.2.1. Tìm hiểu đặc điểm hình thái và vòng đời của tuyến trùng nốt sưng: Từ việc khảo sát một số vùng trồng rau và cây thuốc có nhiễm tuyến trùng nốt sưng ở ngoại ô thành phố HCM và tỉnh An Giang đồng thời kết hợp tham khảo các tài liệu về tuyến trùng nốt sưng của Vũ Triệu Miên, 1998; luận án tiến sĩ nghiên cứu về đặc điểm sinh học và khả năng phòng chống tuyến trùng nốt sưng Meloidogyne incognita của Nguyễn Mạnh Hùng, 1999 chúng tôi đã có được những hiểu biết khá thú vị về tuyến trùng nốt sưng - một loại không xương sống gây hại cho cây trồng. Với các cây trồng bị nhiễm tuyến trùng nốt sưng như Xà lách, Mồng tơi, chuối, ngưu tất, …chúng tôi thu được bộ rễ bị nhiễm tuyến trùng nốt sưng (hình 3.22). từ những nốt sưng ở các bộ rễ chúng tôi đã tách được tuyến trùng ở một số giai đoạn biến thái của vòng đời (hình 3.23). Đầu tiên trứng (hình 3.23a) phát triển thành phôi và tuyến trùng tuổi một được hình thành ngay trong vỏ trứng (hình 3.23b). Tuyến trùng tuổi 1 chui ra ngoài vỏ trứng phát triển thành tuyến trùng tuổi 2 (hình 3.23c). Tuyến trùng tuổi 2 có thể từ u sưng 100 chui vào đất, gặp điều kiện thuận lợi chúng di chuyển, xâm nhập lây lan qua nhiều rễ cây khác. Tại các rễ mới xâm nhập này chúng không di chuyển sang các bộ phận khác của cây, chúng tiết ra các men và các chất kích thích sinh trưởng làm cho tế bào rễ sinh sản quá độ, rễ có chổ sẽ trở nên phình to, tạo nên các u sưng. Cũng tại các rễ mới xâm nhập này tuyến trùng tuổi 2 tiếp tục phát triển và phân hóa giới tính thành tuyến trùng cái và tuyến trùng đực tuổi 3 (hình 3.23d và 3.23e). Các giai đoạn phát triển từ tuyến trùng non phân hoá giới tính đều xảy ra trong u sưng, mỗi u sưng có từ 1 -> 10 tuyến trùng cái hình quả chanh (hình 3.23f). Tuyến trùng cái tuổi 3 tiếp tục phát triển chiều ngang thành tuyến trùng cái tuổi 4 và tuyến trùng cái trưởng thành có dạng hình quả lê hay giọt nước, tuyến trùng cái trưởng thành có mang túi trứng .Tuyến trùng đực tuổi 3 phát triển về chiều dài và trở thành con đực tuổi 4 và con đực trưởng thành chui vào đất. 101 Hình 3.22: Rễ của cây Cải xà lách và rễ của Mồng tơ bị tuyến trùng nốt sưng xâm nhập. 102 a b c d 103 e f Hình 3.23: Một số giai đoạn biến thái của vòng đời tuyến trùng: 3.23a/ trứng, 3.23b/ tuyến trùng tuổi 1, 3.23c/ tuyến trùng tuổi 2, 3.23d/ tuyến trùng tuổi 3♂, 3.23e/ tuyến trùng tuổi 3♀, 3.23f/ nốt sưng ở rễ cây xà lách có 1 tuyến trùng cái. Vòng đời của tuyến trùng nốt sưng Meloidogyne sp. được mô tả vắn tắt ở sơ đồ 3.24. 104 Hình 3.24: Sơ đồ vòng đời tuyến trùng nốt sưng Meloidogyne sp. (Vũ Triệu Mân, 1998) 3.24a/ trứng; 3.24b/ tuyến trùng tuổi 1, 3.24c và 3.24c1/tuyến trùng tuổi 3 3.24d và 3.24d1/tuyến trùng tuổi 4, 3.24e/ tuyến trùng cái trưởng thành 3.24e1/ tuyến trùng đực trưởng thành, 3.24g/con đực trưởng thành. 3.7.2.2. Tìm hiểu khả năng ức chế của dịch nuôi cấy: 105 Tuyến trùng tuổi 2 tách từ đất (số lượng 100 con tuyến trùng) đưa vào giữ trong nước muối sinh lý trong 5 đĩa petri trong đó có 1 đĩa petri đối chứng (không có bổ sung dịch nuôi cấy xạ khuẩn), 4 đĩa petri còn lại bổ sung dịch nuôi cấy xạ khuẩn theo các tỉ lệ 50%, 5%, 0,5%, 0,05% dịch nuôi cấy xạ khuẩn (dnc) sau mỗi 24 giờ đếm tuyến trùng dưới kinh hiển vi được kết quả bảng 3.18. Bảng 3.18: khả năng ức chế của dịch nuôi cấy chủng xạ khuẩn Streptomyces dicklowii lên tuyến trùng Meloidogyne sp. hại cây trồng Tỉ lệ tuyến trùng chết so với lúc ban đầu Số ngày theo dõi đối chứng 50% dnc 5% dnc 0,5%dnc 0,005%dnc 1 ngày 4% 100% 60% 46,2% 7,9% 2 ngày 10% - 84% 77% 19,7% 3 ngày 10% - 100% 86,5% 21,7% 4 ngày 10% - - 100% 21,7% Chú thích: dnc: dịch nuôi cấy. Qua kết quả trên, chủng xạ khuẩn Streptomyces dicklowii có khả năng ức chế được tuyến trùng ký sinh trong rễ hại cây trồng và với tỉ lệ dịch nuôi cấy xạ khuẩn từ 0,5% trở lên là ức chế được tuyến trùng nốt sưng. Dùng thuốc hoá học diệt tuyến trùng rất khó do: tuyến trùng sống sâu trong tầng đất canh tác, hơn nữa tuyến trùng là sinh vật trung gian gây cho cây trồng bị bệnh do chúng làm tổn thương rễ, do hoạt động sống ký sinh trong rễ cây đã tạo điều kiện cho các loài nấm bệnh, vi khuẩn, virus xâm nhiễm làm cho cây trồng bị bịnh; nên sử dụng các biện pháp sinh học là biện pháp vừa phòng bệnh vừa trị bệnh cho cây trồng, các vi sinh vật trong chế phẫm vi sinh ở mức độ nào đó sẽ phát tán trong đất tiêu diệt nấm bệnh và tuyến trùng, khả năng ức chế tuyến trùng và nấm bệnh của chủng xạ khuẩn S. dicklowii có ý nghĩa lớn trong công tác bảo vệ thực vật bằng biện pháp sinh học. 106 3.8. Khảo sát ảnh hưởng của dịch nuôi cấy chủng Streptomyces dicklowii đến hoạt động sinh lý của cây trồng: Bên cạnh khả năng kháng các tác nhân gây bệnh hại cây trồng của dịch nuôi cấy chủng Streptomyces dicklowii, điều chúng tôi quan tâm tìm hiểu là dịch nuôi cấy của chủng này có ảnh hưởng như thế nào đến hoạt động sinh lý của cây trồng: khả năng nảy mầm của hạt, quá trình sinh trưởng phát triển của cây. Để làm sáng tỏa điều băn khoăn trên, chúng tôi tiến hành một số thí nghiệm tiếp theo. 3.8.1. Ảnh hưởng dịch nuôi cấy lên khả năng nảy mầm của hạt: Kết quả thử nghiệm ảnh hưởng của dịch nuôi cấy chủng xạ khuẩn đến khả năng nẩy mầm của hạt sau 2 ngày được trình bày ở bảng 3.19 và hình 3.25 như sau: Bảng 3.19: ảnh hưởng nồng độ dịch nuôi cấy xạ khuẩn lên khả năng nảy mầm của hạt Tæ leä naõy maàm cuûa haït (%) Maãu thí nghieäm Dòch nuoâi (%) Ñaäu ñen Ñaäu traéng Ñoái chöùng nöôùc 0% 38% Xaï khuaån 100% 0% 30% 50% 14% 82% 10% 50% 92% 2% 72% 84% 1% 44% 76% Kết quả cho thấy: - Dịch nuôi cấy ở các độ pha loãng khác nhau ảnh hưởng khả năng nảy mầm của các loại hạt khác nhau. 107 - Nếu dịch nuôi cấy không pha loãng thì gây ức chế sự nảy mầm của hạt. - Nếu dịch nuôi cấy pha loãng thì kích thích sự nảy mầm của hạt: ở nồng độ pha loãng 50% dịch nuôi cấy chủng xạ khuẩn đã kích thích các loại hạt đậu đen, đậu trắng tăng tỉ lệ nảy mầm; tuy nhiên, nồng độ pha loãng dịch nuôi cấy ở 2% là nồng độ thích hợp làm tăng tỉ lệ nảy mầm của cả 2 loại hạt đậu. Hình 3.25: Dịch nuôi cấy ảnh hưởng lên sự nẩy mầm của hạt 3.8.2. Tìm hiểu ảnh hưởng dịch nuôi cấy lên sự phát triển của cây con: Tiếp tục đến giai đoạn cây mầm phát triển thành cây con, chúng tôi khảo sát dịch nuôi cấy xạ khuẩn ảnh hưởng lên sự phát triển thân mầmvà rễ mầm của cây lúavì sự phát triển của thân mầm và rễ mầm ảnh hưởng rất nhiều đến khả năng phát triển cũng như năng suất sau này của cây. Sau 4 ngày nuôi trong dịch cần khảo sát, chúng tôi tiến hành đo thân mầm và rễ mầm sau đó dùng phương pháp thống kê lấy giá trị trung bình, và lấy sự chênh lệch về kích thước. 108 Kết quả được trình bày như sau ở bảng số 3.20, hình 3.26. Bảng 3.20: Ảnh hưởng dịch nuôi cấy xạ khuẩn Streptomyces dicklowii lên sự phát triển cây con. Noàng ñoä dòch nuoâi XK Thaân maàm (mm) Reã maàm (mm) 0% (ñoái chöùng) 25,9 ± 2,0 52,6 ± 5,4 1% dnc 27,5 ± 2,6 67,3 ± 1,7 2% dnc 25,8 ± 4,5 60,3 ± 1,3 10% dnc 25 ± 5,5 15,2 ± 6,2 Chú thích: dnc: dịch nuôi cấy xạ khuẩn ±: sự chênh lệch sau 3 lần lặp lại. Qua kết quả bảng 3.20 cho thấy ở nồng độ thấp thích hợp: 1 – 2% dịch nuôi cấy chủng xạ khuẩn Streptomyces dicklowii không ảnh hưởng xấu đến sự phát triển thân mầm mà ngược lại chúng làm cho thân mầm phát triển dài hơn; cũng ở nồng độ này cũng giúp hệ rễ của cây phát triển mạnh có ý nghĩa trong hấp thụ chất dinh dưỡng nuôi cây. 109 Đối chứng (0% dịch nuôi cấy) 1% dịch nuôi cấy 2% dịch nuôi cấy 10% dịch nuôi cấy 110 Hình 3.25: Dịch nuôi cấy xạ khuẩn Streptomyces dicklowii ảnh hưởng sự sinh trưởng của cây con (lúa Jamin 85) 111 Chương 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1. Kết luận: 4.1.1. Đã tiến hành nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng xạ khuẩn Streptomyces dicklowii. • Đặc điểm hình thái đại thể và vi thể. • Đặc điểm sinh lý sinh hoá: + Streptomyces dicklowii là chủng xạ khuẩn có sức sinh trưởng rất mạnh: sau 24 giờ nuôi cấy đã xuất hiện khuẩn lạc, tạo sắc tố màu vàng trên môi trường nước chiết khoai tây (PGA) khuẩn lạc có mùi đất nồng rất rõ. + Sinh trưởng tốt ở nhiệt độ = 30 – 40OC; tốt nhất ở 30 – 35OC. + Chịu được nồng độ muối 4% trở lại , ở nồng độ 5% trở lên sẽ không sinh trưởng (đây là đặc điểm đặc trưng của loài Streptomyces dicklowii) + Có khả năng phân giải các hợp chất hữu cơ cao phân tử: tinh bột, cellulose (CMC), gelatin. Trong đó khả năng phân giải gelatin có hiệu suất cao nhất (30mm). + Có khả năng sinh chất kích thích sinh trưởng thực vật thuộc nhóm auxin: IAA. 4.1.2. Chủng Streptomyces dicklowii tạo chất kháng sinh trong hoạt động sống. chất kháng sinh này kháng với vi khuẩn gram (+): Bacillus subtilic, Streptococcus sp., không kháng vi khuẩn gram (-): Echerichia coli. Các yếu tố môi trường tối ưu cho chủng Streptomyces dicklowii sinh kháng sinh. • pH môi trường ban đầu: trung tính đến kiềm yếu. • Chế độ nuôi cấy lắc: 200 vòng/ phút. • Nguồn Nitơ trong môi trường: 1% bột đậu tương, nguồn Hydratcacbon: 1,5% rỉ đường. • Thời gian lên men tạo kháng sinh cao nhất: qua 5 ngày nuôi cấy. 112 4.1.3. Đã tiến hành tách chiết và tinh sạch chất kháng sinh từ sinh khối và dịch nuôi cấy của chủng Streptomyces dicklowii. Đồng thời đã tiến hành tìm hiểu tính chất của chất kháng sinh của chủng này và đã phân loại chất kháng sinh này theo cấu trúc hoá học. Qua đó đã sơ bộ xác định chất kháng sinh của chủng này thuộc nhóm 4: Polyene macrolide.(theo khoá phân loại kháng sinh của Masaji Sezaki & Shinji Miyadoh, 2001) 4.1.4. Dịch nuôi cấy của chủng Streptomyces dicklowii có khả năng ức chế 3 loại nấm gây bệnh cây trồng như: Fusarium oxysporum (gây bệnh thối rễ), Rhizoctonia solani (gây bệnh khô vằn, lở cổ rễ), Pythilium sp. (gây bệnh chết rạp thối rễ), đồng thời ở nồng độ từ 0,5% trở lên dịch nuôi cấy của chủng này cũng có khả năng diệt tuyến trùng nốt sưng Meloidogyne sp. với tỷ lệ: 84% sau 2 ngày và 100% sau 3 ngày trong điều kiện in vitro. 4.1.5. Dịch nuôi cấy chủng Streptomyces dicklowii không gây ảnh hưởng xấu đến hoạt động sinh lý của cây trồng; ở nồng độ thấp thích hợp: từ 1 – 2% dịch nuôi cấy kích thích sự nảy mầm của hạt đậu trắng, đậu đen và thúc đẩy thân mầm rễ mầm cây lúa phát triển tốt hơn. 4.2. Đề nghị: Do thời gian thực hiện đề tài có hạn, chúng tôi chưa thể giải quyết trọn vẹn các vấn đề đặt ra của đề tài. Để có cơ sở đầy đủ hơn nhằm sử dụng chủng xạ khuẩn Streptomyces dicklowii vào thực tế phòng chống bệnh hại cây trồng, chúng tôi nhận thấy cần tiếp tục nghiên cứu, giải quyết các vấn đề sau: - Sử dụng các phương pháp mới để định danh kiểm tra lại chủng này đến loài. - Thăm dò khả năng ức chế nấm và tuyến trùng gây bệnh của chủng xạ khuẩn này trên cây bệnh ngoài đồng ruộng. Đặc biệt nghiên cứu sâu hơn về khả năng diệt tuyến trùng nốt sưng gây hại cây trồng của chủng xạ khuẩn Streptomyces dicklowii. Đây là 113 vấn đề có ý nghĩa thực tiển, một yêu cầu rất bức bách của người trồng trọt, nhằm giải quyết vấn nạn tuyến trùng gây hại cây trồng. 114 TÀI LIỆU THAM KHẢO A. Tài liệu trong nước: 1. Nguyễn Trọng Cẩn, 1998 – Công nghệ enzym – NXB Nông nghiệp, Tp HCM. 2. Hoàng Minh Châu, 2002 – Cơ sở hóa học phân tích – NXB Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội. 3. Nguyễn Ngọc Châu, Nguyễn Vũ Thanh, 2000 - Động vật chí Việt Nam, tập 4 – NXB Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội. 4. Nguyễn Lân Dũng, 1978 - Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, tập 3 – NXB Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội. 5. Nguyễn Lân Dũng, 2000 – Vi sinh vật học – NXB Giáo dục. 6. Nguyễn Đăng Đức, 1986 – Xác định hoạt lực kháng sinh bằng vi sinh vật, tập 1 – NXB Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội. 7. Bùi Thị Việt Hà, 1998 – Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng sinh kháng nấm phân lập từ đất - luận án thạc sỉ, Hà Nội. 8. Lê Thị Hoa, 1998 – Nghiên cứu khả năng sinh chất kich thích sinh trưởng thực vật (IAA) của xạ khuẩn - luận án thạc sỉ, Hà Nội. 9. Bùi Xuân Hồng, Nguyễn Huy Văn, 2000 – Vi nấm dùng trong công nghệ sinh học – NXB Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội. 10. Nguyễn Mạnh Hùng, 1999 – Nghiên cứu đặc điểm sinh học và khả năng phòng chống tuyến trùng nốt sưng Meloidogyne incognita (Kofoid et White, 1919) Chitwood, 1949 trên một số cây trồng vùng Hà Nội và phụ cận.- luận án tiến sĩ, Hà Nội. 11. Lê Gia Hy, 1992 – Nghiên cứu khả năng sinh chất kháng sinh chống bệnh đạo ôn của một số chủng xạ khuẩn (Streptomyces) phân lập ở Việt Nam. - Tạp chí sinh học số 14. 115 12. Lê Gia Hy, 1994 - Ảnh hưởng môi trường lên men lên khả năng sinh tổng hợp kháng sinh chống nấm gây bệnh thực vật của chủng xạ khuẩn 5820 - Tạp chí sinh học số 16. 13. Lê Gia Hy, 1995 – Tách chiết, tinh chế và một số tính chất hoá lý của chất kháng sinh chống nấm từ chủng Streptomyces sp. 5820 - Tạp chí sinh học số 17. 14. Lê Gia Hy, 1996 – Nghiên cứu chủng Streptomyces sp.TH447 ưa nhiệt sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh thực vật phân lập ở Việt Nam. - tạp chí sinh học số 18. 15. Nguyễn Khang, 2005 – Kháng sinh học – NXB Y học, Hà Nội. 16. Trần Kim Loang, 1996 - Kết quả nghiên cứu bệnh hại café tại Daklak - Viện khoa học kỹ thuật nông lâm nghiệp Tây Nguyên. 17. Nguyễn Đức Lượng, 2003 – Thí nghiệm vi sinh vật, tập 2 – NXB Đại học quốc gia, tp HCM. 18. Nguyễn Đức Lượng, 2003 - Công nghệ sinh học – NXB Đại học quốc gia, tp HCM. 19. Vũ Triệu Mân, 1998 - Bệnh cây nông nghiệp – NXB Nông nghiệp – Hà Nội 20. Tôn Nữ Tuấn Nam, 2002 - Điều tra bệnh vàng lá chết chậm trên cây tiêu tại Tây Nguyên và đề xuất biện pháp phòng trừ - (kết quả nghiên cứu khoa học 2001 – 2002) Viện khoa học kỹ thuật nông lâm nghiệp Tây Nguyên. 21. Nguyễn Kim Phi Phụng, 2003 - Thực tập hóa hữu cơ 1 – NXB Đại học quốc gia, tp HCM. 22. Lê Xuân Phương, 2001 – Vi sinh vật công nghiệp – NXB Xây dựng. 23. Trần Minh Tâm, 2000 – Công nghệ vi sinh ứng dụng – NXB Nông nghiệp, tp HCM. 24. Trần Thị Thanh, 2000 – Công nghệ vi sinh – NXB Giáo dục. 116 25. Đồng Thị Thanh Thu, 2000 – Sinh hóa ứng dụng – NXB Đại học quốc gia. 26. Lê Ngọc Thạch, 2002 – Hoá học hữu cơ – NXB Đại học quốc gia, tp HCM. 27. Trần Thanh Thủy, 1998 - Hướng dẫn thực hành vi sinh vật học – NXB Giáo dục. 28. Tạp chí khoa học - số 23(2): 7 – 10 tháng 6 – 2001. B. Tài liệu nước ngoài: 29. Enefiok. J. Nkanga; Charles Hagedorn, 1978 – Antimicrobial agents and chemotherapy. 30. Joshua Lederberg, 1999 – Encyclopedia of microbiology, second edition, volume A – C – Academic press. 31. Larry McKane, 1980 – Microbiology essentials and applications, second edition. 32. Masaji Sezaki & Shinji Miyadoh, 2001 – Practically used Antibiotics and Their Related Substances – Pharmaceutial Research Center, Meiji Seika Kaisha, Ltd. 33. R. E. Buchanan & N. E. Gibbons – Bergey’s manual of determinative bacteriology, eighth edition – the Williams & Wilkins company/ Baltimore. 34. Zuckerman; Dicklow, 1996 – Nematocidal and Fungicidal Streptomyces dicklowii biopesticide – United States Patent 5549889. 35. William A. Remes, 1978 – The chemistry of antitumor antibiotics, volume 2. C. Tài liệu internet: 36. 37. 38. 39. 117 40. 41. 42. Abstracts%20Paszkowka2.htm 43. 44. 45. 46. 47. www.vusta.org.vn/vn/hoithao/hoithoash05.asp?topic=G1 48. www.uea.ac.uk/b137/images.gif 49. www.vertigo.uqam.ca/.../mathias_de_kouassi.html