Luận văn Khảo sát đậm độ và khả năng sinh độc tố của vi khuẩn Staphylococcus aureus trên môi trường nuôi cấy

. Màu được tạo xung quanh thành giếng, gõ nhẹ vỉ để màu đều trước khi đọc kết quả. Ủ ít nhất 30 phút trước khi đọc kết quả. Kết quả có thể được đọc bằng bảng so màu hoặc bằng máy đọc màu. Ở phương pháp này được đọc kết quả bằng máy đọc màu. Đọc kết quả tại thời điểm 30 phút khi chứng (+) đạt giá trị OD là 1. Chỉ kéo dài thời gian ủ sau 30 phút khi OD chứng (+) chưa đạt đến 1. o Bước 8: Đọc kết quả Sử dụng máy đọc màu, dùng bước sóng đơn: 414±10nm, bước sóng đôi: 490±10nm. Sau 30 phút, nếu chứng (+) đạt OD = 1,0 thì chuyển sang bước 9 và 10. Trường hợp chứng (+) chưa đạt đến OD = 1,0 thì tiếp tục ủ cho đến khi chứng (+) đạt OD = 1,0 và tiếp tục bước 9 và 10. Nếu như giá trị OD của chứng (+) vẫn chưa đạt đến 1,0 sau 45 phút thì không sử dụng kết quả này. Nên xem lại hướng dẫn trước khi làm lại thí nghiệm. o Bước 9: Thêm dung dịch dừng phản ứng Tùy lựa chọn có thể thêm hay không thêm chất dừng phản ứng nhưng chỉ nên thêm khi không đọc ngay kết quả được. Dung dịch dừng phản ứng sẽ làm chậm phản ứng lại, khi đó nên đọc kết quả trong vòng 30 phút sau khi thêm chất dừng phản ứng. Thêm 20 μl dung dịch dừng phản ứng vào mỗi giếng, gõ nhẹ để trộn đều, sau đó đọc kết quả trong vòng 30 phút. o Bước 10: Giải thích kết quả Thử nghiệm có giá trị khi: chứng (+) đạt ít nhất OD = 1,0 và chứng (-) có OD < 0,2. Nếu tiêu chuẩn trên không đạt thì kết quả này không được dùng, xem lại hướng dẫn trước khi làm lại thí nghiệm. Một mẫu được xem là âm tính (-) khi thử nghiệm có giá trị và giếng mẫu có OD < 0,2. Một mẫu được xem là dương tính (+) khi thử nghiệm có giá trị và giếng mẫu có OD ≥ 0,2. o Bước 11: Xác định loại độc tố (A, B, C ,D, E) Dùng bộ kit TECRA SET ID để xác định loại độc tố của các mẫu dương tính. Tiến trình được thực hiện tương tự các bước 1-8 đối với các mẫu tạo độc tố có kết quả dương tính đã được xác định ở trên, nhưng ở đây sử dụng bộ kit đơn giá, mỗi mẫu sử dụng 1 dãy gồm 5 giếng được gắn các kháng thể khác nhau (từ A đến E), mỗi giếng 200 μl độc tố. Trong đó: + SEA: giếng màu đen + SEB: giếng màu xanh + SEC: giếng màu vàng + SED: giếng màu đỏ + SEE: giếng màu trắng Đọc kết quả: Thử nghiệm có giá trị khi: chứng (+) đạt ít nhất OD = 1,0 và chứng (-) có OD < 0,2. Nếu tiêu chuẩn trên không đạt thì kết quả này không được dùng, xem lại hướng dẫn trước khi làm lại thí nghiệm. Kết quả đọc là dương tính (+) khi thử nghiệm có giá trị và giếng mẫu có OD ≥ 0,2. Kết quả đọc là âm tính (-) khi thử nghiệm có giá trị và giếng mẫu có OD < 0,2. Như vậy, một độc tố được xem là thuộc type A, B, C, D hay E khi kết quả đọc của giếng tương ứng là dương tính (khi thử nghiệm có giá trị và giếng tương ứng có OD ≥ 0,2). o Bước 12: Dọn dẹp sau thí nghiệm Khi đã hoàn thành thử nghiệm, loại bỏ tất cả các độc tố trong mẫu thí nghiệm, kể cả chứng dương vào dung dịch sodium hipochlorite 2%. Ngâm tất cả các giếng đã sử dụng trong dung dịch sodium hipochlorite 2%, sau đó hấp tiệt trùng ở 121oC trong ít nhất 30 phút.Những thành phần khác của bộ kit và các giếng có thể tái sử dụng tùy theo điều kiện, qui định của phòng thí nghiệm. Chú ý: + Lưu ý hạn dùng của bộ kit. Chuẩn bị chất thử cẩn thận và ghi lại ngày mở trên nhãn. Sử dụng bộ kit trong vòng 56 ngày. Giữ lạnh tất cả các thành phần (2-8oC) khi không sử dụng. Tuyệt đối không để trong tủ đông. + Không làm lẫn lộn giữa các thuốc thử khác nhau. + Sử dụng đầu tip mới cho mỗi mẫu. + Mỗi thí nghiệm phải có chứng (+), chứng (-). + Các giếng chưa sử dụng phải cho vào gói và bịt kín lại. Hình 3.2. Bộ kit Tecra xác định SE (SETVIA96) Hình 3.3. Bộ kit Tecra phân loại SE (SIDVIA72) PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Kiểm tra độ sống và độ thuần của các chủng S. aureus Các chủng S. aureus có nguồn gốc từ các mẫu thực phẩm và bệnh phẩm (Bảng 4.1) được kiểm tra độ sống và độ thuần bằng cách quan sát hình thái khuẩn lạc trên môi trường BP , môi trường MSA , nhuôṃ gram , thử phản ứng catalase và phản ứng coagulase. Bảng 4.1. Nguồn gốc các chủng S. aureus STT Mã số mẫu Nguồn gốc 1 M168 Phân 2 N88/05 Kẹo dừa đậu phộng 3 H110 Bánh ngọt 4 72/NĐ Cá ngừ kho 5 H117 Bánh bò 6 B9 Heo quay 7 N76/05 Bánh bông lan kem 8 M156 Phân 9 M69 Phân 10 V30 Thịt nguội 11 G147/05 Cơm dứa cuốn 12 D2/06 Socola 13 Na1 Sữa 14 V29 Bánh mì thịt 15 G168/05 Bột trộn bánh bao 16 M73 BVND05 Phân 17 V25 Bì tôm chả lụa chay 18 Na5 Sữa 19 D1/06 Cà phê hòa tan 20 B118/06 Bông lan kem 21 D6/06 Kem socola 22 D11/06 Sữa chua 23 K17/ĐT Ớt bằm 24 V13/ĐT Phèo heo 25 V14/ĐT Lòng gà 26 V15/ĐT Lòng gà 27 Tss/GS Chả lụa 28 Tpp/GS Chả lụa 29 Tkk/GS Chả lụa 30 V28/ĐT Lòng heo 31 V29/ĐT Lòng vịt 32 M64 BVND05 Phân 33 V34/ĐT Pate 34 V35/ĐT Chả lụa 35 V36/ĐT Chả lụa Cả 36 chủng được kiểm tra (100%) đều cho phản ứng catalase dương tính, phản ứng coagulase dương tính và tạo khuẩn lạc đặc trưng của S. aureus trên môi trường BP và MSA. o Trên môi trường BP, khuẩn lạc đặc trưng của S. aureus có màu đen nhánh, bóng, lồi, đường kính 1-1,5 mm, quanh khuẩn lạc có vòng sáng rộng 2–5 mm trên môi trường đục (Hình 4.1). 36 E2/NĐ06 Chất ói (mẫu ngộ độc) o Trên môi trường MSA, khuẩn lạc tròn, bờ đều và lồi, màu vàng nhạt đến vàng đậm, làm vàng môi trường xung quanh khuẩn lạc (Hình 4.2). Bảng 4.2. Tỉ lệ nguồn gốc các chủng S. aureus 36 chủng trên có nguồn gốc từ các mẫu thực phẩm và bệnh phẩm. Trong đó, các mẫu thực phẩm từ thịt, cá chiếm tỉ lệ cao nhất (41,6%) trong các mẫu thực phẩm bị nhiễm S. aureus (Bảng 4.2 và Hình 4.3). Kết quả này khá phù hợp với các cuộc khảo sát về vệ sinh an toàn thực phẩm thức ăn đường phố trước đây. Các mẫu phân (13,9%) và chất ói (2,8%) là các mẫu bệnh phẩm được lấy từ bệnh nhân có triệu chứng ngộ độc S. aureus. Như vậy với kết quả trên cho thấy các chủng này vẫn còn sống và vẫn đảm bảo độ thuần có thể sử dụng để tiến hành thí nghiệm. STT Nguồn gốc chủng Số lượng Tỉ lệ 1 Mẫu thực phẩm từ thịt, cá 15 41,7% 2 Mẫu thực phẩm từ bánh, kẹo 6 16,7% 3 Mẫu thực phẩm từ sữa 3 8,3% 4 Mẫu phân 5 13,9% 5 Mẫu từ chất ói 1 2,8% 6 Mẫu thực phẩm khác 6 16,7% Hình 4.1. Khuẩn lạc S. aureus trên môi trƣờng Baird Paker Hình 4.2. Khuẩn lạc S. aureus trên môi trƣờng MSA 15 6 6 5 3 1 0 2 4 6 8 10 12 14 16 Thịt, cá Bánh kẹo Thực phẩm khác Sữa Phân Chất ói Hình 4.3. Nguồn gốc các chủng S. aureus 4.2. Khảo sát đậm độ và khả năng sinh độc tố của các chủng S. aureus 4.2.1. Đậm độ 4.2.1.1. Trên môi trường TSGM Bảng 4.3. Đậm độ và khả năng sinh độc tố của S. aureus trên môitrƣờng TSGM Ghi chú: Mẫu (+) có giá trị OD 0,2. S T T Mã số chủng 0 giờ 16 giờ 24 giờ 48 giờ 72 giờ Kết quả Đậm độ (log10) Đậm độ (log10) Độc tố (OD) Đậm độ (log10) Độc tố (OD) Đậm độ (log10) Độc tố (OD) Đậm độ (log10) Độc tố (OD) 1 M168 5.97 7.68 1.861 7.91 2.430 8.18 2.672 7.88 2.676 + 2 N88/05 5.91 6.85 0.204 7.23 0.223 7.30 0.235 6.98 0.340 + 3 H110 6.45 7.15 0.033 7.48 0.047 7.18 0.068 6.60 0.077 - 4 72/NĐ 5.98 8.32 0.112 8.78 0.128 8.67 0.094 8.36 0.085 - 5 H117 6.08 8.11 0.091 8.26 0.125 8.45 0.143 7.90 0.152 - 6 B9 6.49 8.23 0.112 8.48 0.135 8.78 0.147 8.34 0.158 - 7 N76/05 6.26 7.79 0.096 7.65 1.118 8.23 0.131 7.97 0.146 - 8 M156 6.48 7.89 1.542 7.91 2.826 8.26 3.600 7.79 3.675 + 9 M69 6.38 7.15 2.504 7.66 3.310 8.32 3.323 8.15 3.320 + 10 V30 6.30 8.46 1.872 8.45 2.502 8.30 2.645 8.04 2.660 + 11 G147/05 5.86 8.28 0.512 8.45 0.621 8.04 0.729 7.81 0.850 + 12 D2/06 6.04 7.74 0.081 7.83 0.097 8.76 0.118 7.54 0.116 - 13 Na1 6.51 8.46 0.073 8.53 0.084 8.45 0.092 8.26 0.095 - 14 V29 6.26 6.95 1.520 8.15 1.986 7.40 2.206 6.78 2.371 + 15 G168/05 4.78 6.48 0.064 7.41 0.072 7.40 0.081 7.36 0.086 - 16 M73 BVND05 5.94 8.26 1.703 8.59 1.882 8.38 2.504 8.08 2.701 + 17 V25 5.84 8.32 0.135 7.98 0.179 7.76 0.185 6.85 0.189 - 18 Na5 6.28 8.80 0.064 8.84 0.081 8.41 0.092 8.36 0.099 - 19 D1/06 5.91 7.62 0.074 7.56 0.082 7.53 0.091 6.93 0.090 - 20 B118/06 6.18 7.26 0.071 7.79 0.080 7.28 0.089 6.84 0.092 - 21 D6/06 6.48 8.46 0.124 8.26 0.153 8.00 0.162 7.76 0.169 - 22 D11/06 6.66 8.00 0.112 8.15 0.146 7.92 0.158 7.68 0.161 - 23 K17/ĐT 5.73 7.20 0.125 7.40 0.139 7.28 0.145 6.83 0.152 - 24 V13/ĐT 5.74 7.75 0.119 7.61 0.128 7.20 0.136 6.89 0.141 - 25 V14/ĐT 6.18 7.71 0.153 8.34 0.165 7.94 0.171 7.18 0.172 - 26 V15/ĐT 6.48 8.74 0.102 8.66 0.119 8.53 0.125 8.18 0.130 - 27 Tss/GS 7.72 7.83 0.135 7.72 0.149 7.61 0.158 7.28 0.163 - 28 Tpp/GS 7.84 7.62 0.132 7.82 0.148 7.92 0.152 7.46 0.159 - 29 Tkk/GS 7.72 8.76 0.321 8.82 0.457 9.08 0.553 8.15 0.500 + 30 V28/ĐT 6.11 7.90 0.144 7.97 0.159 7.73 0.165 7.60 0.170 - 31 V29/ĐT 6.30 7.75 0.119 8.38 0.134 8.15 0.145 7.92 0.151 - 32 M64 BVND05 5.78 7.28 0.106 6.90 0.112 6.85 0.121 6.26 0.120 - 33 V34/ĐT 6.43 8.41 0.095 8.48 0.109 8.86 0.116 7.32 0.119 - 34 V35/ĐT 6.41 8.40 0.097 8.72 0.112 8.76 0.126 8.43 0.125 - 35 V36/ĐT 6.62 8.08 0.103 8.48 0.125 6.90 0.137 5.43 0.142 - 36 E2/NĐ06 6.18 8.30 2.604 8.53 2.990 8.32 3.560 8.08 3.670 + 0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 Lo g 10 (c fu /m l) Đậm độ 6.29 7.89 8.09 8.00 7.54 0 giờ 16 giờ 24 giờ 48 giờ 72 giờ Hình 4.4. Sự phát triển của S. aureus trên môi trƣờng TSGM Trên môi trường TSGM, đậm độ trung bình của S. aureus ở các thời điểm 0, 16, 24, 48 và 72 giờ lần lượt là 6,29; 7,89; 8,09; 8,00 và 7,54 log10 (cfu/ml). Đậm độ trung bình thấp nhất là 6,29 log 10(cfu/ml) ở 0 giờ và cao nhất là 8,09 log 10 (cfu/ml) ở 24 giờ. Theo hình 4.4, sự phát triển của S. aureus tuân theo đường cong tăng trưởng của vi khuẩn, gồm các phase: phase chậm, phase tăng trưởng cấp số, phase dừng và phase suy vong. Nhưng ở đây ta chỉ thấy được 3 phase: phase cấp số, phase dừng và phase suy vong, không thấy phase chậm và chỉ thấy được giai đoạn đầu của phase suy vong. Điều này là do trong thí nghiệm này, chúng tôi tiến hành khảo sát đậm độ S. aureus ở các thời điểm 0, 16, 24, 48 và 72 giờ, không khảo sát các thời điểm trong khoảng thời gian từ 0 - 16 giờ cũng như sau 72 giờ. 4.2.1.2. Trên môi trường BHI Tương tự như trên môi trườngTSGM, ở thí nghiệm trên môi trường BHI, đường cong tăng trưởng của S. aureus cũng theo đường cong tăng trưởng của vi khuẩn nhưng chỉ thấy được 3 phase: phase cấp số, phase dừng và phase suy vong; không thấy phase chậm (Hình 4.5). Đậm độ trung bình của S. aureus ở các thời điểm 0, 16, 24, 48 và 72 giờ lần lượt là 6,12; 8,04; 8,13; 7,81 và 7,73 log 10 (cfu/ml). Đậm độ trung bình thấp nhất là 6,12 log 10 (cfu/ml) ở 0 giờ và cao nhất là 8,13 log 10 (cfu/ml) ở 24 giờ. ST T Mã số chủng 0 giờ 16 giờ 24 giờ 48 giờ 72 giờ Kết quả Bảng 4.4. Đậm độ và khả năng sinh độc tố của các chủng S. aureus trên môi trƣờng BHI Ghi chú: Mẫu (+) có giá trị OD 0,2 Đậm độ (log10) Đậm độ (log10) Độc tố (OD) Đậm độ (log1 0) Độc tố (OD) Đậm độ (log10) Độc tố (OD) Đậm độ (log10) Độc tố (OD) 1 M168 5.93 7.53 2.313 7.64 2.378 7.81 2.393 7.71 2.623 + 2 N88/05 6.04 7.20 1.020 7.40 1.321 7.66 1.458 7.64 1.620 + 3 H110 6.52 7.08 0.029 7.08 0.041 6.85 0.063 6.00 0.072 - 4 72/NĐ 5.59 7.70 0.117 7.93 0.110 8.11 0.083 8.11 0.079 - 5 H117 5.87 8.04 0.095 8.00 0.131 7.72 0.149 8.62 0.154 - 6 B9 6.36 8.15 0.122 8.18 0.138 7.94 0.143 8.11 0.152 - 7 N76/05 6.11 7.59 0.103 7.91 1.112 7.63 0.124 7.80 0.132 - 8 M156 6.38 8.26 1.212 8.28 1.357 8.23 2.021 7.98 2.322 + 9 M69 6.15 8.23 1.856 8.20 2.560 8.15 2.968 7.70 2.970 + 10 V30 6.38 8.48 1.852 8.45 3.012 7.70 3.239 7.32 3.307 + 11 G147/05 5.76 8.26 0.526 8.26 1.010 7.72 1.202 7.70 1.376 + 12 D2/06 5.88 7.85 0.088 7.90 0.102 7.72 0.121 7.72 0.127 - 13 Na1 6.52 8.46 0.065 8.46 0.072 8.26 0.083 7.89 0.089 - 14 V29 6.15 8.00 1.500 7.97 2.021 8.04 2.156 7.79 2.370 + 15 G168/05 5.74 7.86 0.066 7.76 0.070 7.62 0.083 7.11 0.090 - 16 M73 BVND05 6.04 8.48 1.635 8.48 2.110 8.69 2.123 8.08 2.256 + 17 V25 5.83 7.23 0.139 7.59 0.156 7.60 0.175 7.56 0.183 - 18 Na5 6.18 8.34 0.056 8.78 0.075 7.91 0.094 8.00 0.098 - 19 D1/06 5.78 6.95 0.065 7.71 0.076 7.54 0.085 7.91 0.092 - 20 B118/06 6.08 8.20 0.063 8.91 0.071 7.91 0.082 7.74 0.087 - 21 D6/06 6.58 8.80 0.135 8.52 0.159 7.66 0.170 7.85 0.176 - 22 D11/06 6.76 7.87 0.103 7.87 0.125 7.67 0.144 7.86 0.154 - 23 K17/ĐT 5.75 7.79 0.127 7.88 0.138 8.04 0.147 7.96 0.150 - 24 V13/ĐT 5.85 7.61 0.113 7.68 0.125 7.36 0.132 8.15 0.139 - 25 V14/ĐT 6.18 8.69 0.149 8.70 0.162 7.86 0.170 8.08 0.173 - 26 V15/ĐT 6.38 8.64 0.122 8.72 0.131 7.80 0.140 8.20 0.146 - 27 Tss/GS 6.08 7.96 0.124 8.04 0.137 7.98 0.144 7.68 0.156 - 28 Tpp/GS 5.88 8.28 0.130 8.30 0.142 7.63 0.149 7.76 0.155 - 29 Tkk/GS 5.91 8.36 0.210 8.43 0.675 7.23 0.748 7.23 0750 + 30 V28/ĐT 6.18 7.97 0.136 8.23 0.142 8.20 0.151 8.11 0.159 - 31 V29/ĐT 6.23 8.20 0.128 8.20 0.139 8.04 0.151 8.04 0.153 - 32 M64 BVND05 5.59 7.89 0.123 7.90 0.138 7.38 0.145 7.26 0.151 - 33 V34/ĐT 6.36 8.58 0.126 8.66 0.139 8.40 0.150 8.08 0.157 - 34 V35/ĐT 6.34 8.48 0.114 8.62 0.127 8.41 0.133 8.53 0.139 - 35 V36/ĐT 6.62 7.98 0.109 7.62 0.118 6.60 0.131 5.15 0.139 - 36 E2/NĐ06 6.38 8.46 2.250 8.58 2.476 7.94 2.505 7.86 3.010 + 0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 Lo g 10 (c fu /m l) Đậm độ 6.12 8.04 8.13 7.81 7.73 0 giờ 16 giờ 24 giờ 48 giờ 72 giờ Hình 4.5. Sự phát triển của S. aureus trên môi trƣờng BHI Như vậy trên cả hai môi trường, sự phát triển của S. aureus theo đường cong phát triển của vi khuẩn, đậm độ đạt cao nhất ở 24 giờ. Tuy nhiên, không thấy được phase chậm do chưa khảo sát ở các thời điểm trong khoảng 0 - 16 giờ, có thể phase chậm xảy ra ở các thời điểm trong khoảng thời gian này. 4.2.2. Khả năng sinh độc tố Khả năng sinh độc tố của các chủng S. aureus được xác định bằng phương pháp ELISA. Thử nghiệm có giá trị khi: chứng (+) đạt ít nhất OD = 1,0 và chứng (-) có OD < 0,2. Qua 7 lần thực hiện phản ứng ELISA cho thấy bộ kit TECRA xác định độc tố SE có giá trị OD của đối chứng đều nằm trong giới hạn cho phép (Bảng 4.5). Bảng 4.5. Giá trị OD của đối chứng âm và đối chứng dƣơng Đối chứng âm (-): giá trị OD = 0,097 < 0,2). Đối chứng dương (+): giá trị OD =1,217 ≥ 1). Lần thực hiện Đối chứng âm Đối chứng dương Kết luận 1 0.083 1.187 Đạt 2 0.134 1.637 Đạt 3 0.063 1.393 Đạt 4 0.121 1.224 Đạt 5 0.114 1.029 Đạt 6 0.080 1.020 Đạt 7 0.087 1.030 Đạt Trung bình 0,097 ± 0,026 1,217 ± 0, 230 Đạt Như vậy, các đối chứng dương và đối chứng âm của bộ kit qua các lần thực hiện ELISA xác định độc tố SE đều đạt tiêu chuẩn. Chủng được xem là dương tính (+) khi giá trị OD ≥ 0,2; chủng âm tính khi giá trị OD < 0,2 (Hình 4.6). Hình 4.6. Phản ứng ELISA xác định độc tố ruột enterotoxin Giếng 1: đối chứng âm (-) Giếng 2: đối chứng dương (+) Giếng 3: M156/ Tecra/ 48 giờ (+) Giếng 4: V30/ Tecra/ 48 giờ (+) Giếng 5: N76/ Tecra / 48 giờ (-) Giếng 6: B9/ Tecra / 48 giờ (-) Giếng 7: H117/ Tecra / 48 giờ (-) Giếng 8: 72/NĐ/ Tecra / 48 giờ (-) Giếng 9: G147/ Tecra / 48 giờ (+) Giếng 10: M69/ Tecra / 48 giờ (+) Giếng 11: V30/ BHI / 48 giờ (+) Giếng 12: H117/ BHI / 48 giờ (-) Giếng 13: M69/ BHI (48 giờ) (+) Giếng 14: N88/ BHI (48 giờ) (+) Giếng 15: B9/ BHI (48 giờ) (-) Giếng 16: N76/ BHI (48 giờ) (-) Trong 36 chủng được khảo sát, có 10 chủng (27,8%) tạo độc tố cả trên môi trường TSGM và BHI (giá trị OD ≥ 0,2). Trong đó chiếm tỉ lệ cao nhất là các chủng từ các mẫu bệnh phẩm (50%) (Bảng 4.6). Đây là các chủng lấy từ phân và chất ói của người bị ngộ độc, có giá trị OD rất cao (OD > 1). Riêng chủng từ chất ói có giá trị OD cao nhất (OD = 3,670 ở 72 giờ). Như vậy, không phải tất cả các chủng S. aureus đều tạo độc tố enterotoxin, chỉ một số chủng có khả năng tạo độc tố. Trong đó các chủng có nguồn gốc từ bệnh phẩm tạo lượng độc tố rất cao so với các chủng có nguồn gốc từ thực phẩm. Bảng 4.6: Nguồn gốc các chủng cho độc tố dƣơng tính 4.3. Khảo sát các chủng có khả năng sinh độc tố 4.3.1. Tương quan giữa đậm độ và khả năng tạo độc tố Bảng 4.7. Các chủng S. aureus có khả năng tạo độc tố trên môi trƣờng TSGM Khi khảo sát đậm độ S. aureus, kết quả ở Phụ lục B.1 cho thấy có sự khác biệt về đậm độ S. aureus theo thời gian trên cả hai môi trường TSGM và BHI (P = 0 < 0,05), cụ thể là có sự khác biệt giữa các thời điểm 0-16 giờ, 0-24 giờ, 0-48 giờ, 0-72 giờ, 24-72 giờ, 48-72 giờ (Phụ lục B.2). Đó là do khi cho S. aureus vào môi trường nuôi cấy, đậm độ vi khuẩn sẽ tăng cao ở phase cấp số, cao nhất là ở 24 giờ (8,17 log10 cfu/ml) trên cả hai môi trường TSGM và BHI; và hầu như không đổi ở STT Mã số mẫu Nguồn gốc Độc tố (OD) ở 72 giờ 1 M168 Phân 2.676 2 N88/05 Kẹo dừa đậu phộng 0.340 3 M156 Phân 3.675 4 M69 Phân 3.320 5 V30 Thịt nguội 2.660 6 G147/05 Cơm dứa cuốn 0.850 7 V29 Bánh mì thịt 2.371 8 M73 BVND05 Phân 2.701 9 Tkk/GS Chả lụa 0.500 10 E2/NĐ06 Chất ói (mẫu ngộ độc) 3.670 STT Mã số chủng 0 giờ 16 giờ 24 giờ 48 giờ 72 giờ Đậm độ (log10) Đậm độ (log10) Độc tố (OD) Đậm độ (log10) Độc tố (OD) Đậm độ (log10) Độc tố (OD) Đậm độ (log10) Độc tố (OD) 1 M168 5.97 7.68 1.861 7.91 2.430 8.18 2.672 7.88 2.676 2 N88/05 5.91 6.85 0.204 7.23 0.223 7.30 0.235 6.98 0.340 3 M156 6.48 7.89 1.542 7.91 2.826 8.26 3.600 7.79 3.675 4 M69 6.38 7.15 2.504 7.66 3.310 8.32 3.323 8.15 3.320 5 V30 6.30 8.46 1.872 8.45 2.502 8.30 2.645 8.04 2.660 6 G147/05 5.86 8.28 0.512 8.45 0.621 8.04 0.729 7.81 0.850 7 V29 6.26 6.95 1.520 8.15 1.986 7.40 2.206 6.78 2.371 8 M73 BVND05 5.94 8.26 1.703 8.59 1.882 8.38 2.504 8.08 2.701 9 Tkk/GS 7.72 8.76 0.321 8.82 0.457 9.08 0.553 8.15 0.500 10 E2/NĐ06 6.18 8.30 2.604 8.53 2.990 8.32 3.560 8.08 3.670 Trung bình 6.30 7.86 1.464 8.17 1.923 8.16 2.203 7.77 2.276 phase dừng lúc 48 giờ, sau đó sẽ giảm ở phase suy vong lúc 72 giờ (7,77 log10 cfu/ml trên môi trường TSGM và 7,70 log10 cfu/ml trên môi trường BHI). Tuy nhiên do thời điểm 72 giờ thuộc giai đoạn đầu của phase suy vong nên vẫn có sự khác biệt về đậm độ so với lúc 0 giờ (trên môi trường TSGM là 6,30 log10 cfu/ml và trên môi trường BHI là 6,11 log10 cfu/ml). Bảng 4.8. Các chủng S. aureus có khả năng tạo độc tố trên môi trƣờng BHI Về độc tố SE, có sự khác biệt theo thời gian trên cả hai môi trường TSGM và BHI (P = 0,0387 < 0,05), thể hiện rõ giữa các thời điểm 16–48 giờ, 16–72 giờ (Phụ lục B.4 và Phụ lục B.5). Trên môi trường TSGM, giá trị OD ở 16 giờ là 1,464; ở 24 giờ là 1,923; khá cao ở 48 giờ (2,203), cao nhất ở 72 giờ (2,276). Tương tự, trên môi trường BHI, giá trị OD của độc tố ở 16 giờ đạt 1,437; ở 24 giờ đạt 1,892; ở 48 giờ đạt 2,081 và cao nhất là ở 72 giờ (2.260). Qua đó cho thấy độc tố SE tăng theo thời gian, ngay cả khi đậm độ không đổi ở phase dừng và đậm độ giảm ở phase suy vong (Hình 4.7, Hình 4.8). Đồng thời, từ Phụ lục B.7, B.8 cho thấy hệ số tương quan giữa đậm độ và độc tố rất thấp và sự tương quan là không có ý nghĩa, trên môi trường BHI là 0,015 (P = 0,928 > 0,05), trên môi trường TSGM là 0,111 (P = 0,495 > 0,05). Ở các nghiên cứu trước đây, khi thử nghiệm đậm độ và khả năng sinh độc tố của S. aureus trong sữa, Hiroshi Fujikawa và Satoshi Morozumi (2005) cũng thấy rằng khi đậm độ tế bào vi khuẩn đạt 106,5 cfu/ml, lượng độc tố SEA tăng tuyến tính theo STT Mã số chủng 0 giờ 16 giờ 24 giờ 48 giờ 72 giờ Đậm độ (log10) Đậm độ (log10) Độc tố (OD) Đậm độ (log10) Độc tố (OD) Đậm độ (log10) Độc tố (OD) Đậm độ (log10) Độc tố (OD) 1 M168 5.93 7.53 2.313 7.64 2.378 7.81 2.393 7.71 2.623 2 N88/05 6.04 7.20 1.020 7.40 1.321 7.66 1.458 7.64 1.620 3 M156 6.38 8.26 1.212 8.28 1.357 8.23 2.021 7.98 2.322 4 M69 6.15 8.23 1.856 8.20 2.560 8.15 2.968 7.70 2.970 5 V30 6.38 8.48 1.852 8.45 3.012 7.70 3.239 7.32 3.307 6 G147/05 5.76 8.26 0.526 8.26 1.010 7.72 1.202 7.70 1.376 7 V29 6.15 8.00 1.500 7.97 2.021 8.04 2.156 7.79 2.370 8 M73 BVND05 6.04 8.48 1.635 8.48 2.110 8.69 2.123 8.08 2.256 9 Tkk/GS 5.91 8.36 0.210 8.43 0.675 7.23 0.748 7.23 0.750 10 E2/NĐ06 6.38 8.46 2.250 8.58 2.476 7.94 2.505 7.86 3.010 Trung bình 6.11 8.13 1.437 8.17 1.892 7.92 2.081 7.70 2.260 thời gian, thậm chí vẫn tăng sau khi vi khuẩn đạt đến phase dừng. Như vậy, đậm độ và lượng độc tố S. aureus không tương quan nhau. 0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 Lo g 10 (c fu /m l) 0.000 0.500 1.000 1.500 2.000 2.500 O D Đậm độ 7.86 8.17 8.16 7.77 Độc tố 1.464 1.923 2.203 2.276 16 giờ 24 giờ 48 giờ 72 giờ Hình 4.7. Đậm độ và khả năng sinh độc tố của S. aureus trên môi trƣờng TSGM 0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 Lo g 10 (c fu /m l) 0.000 0.500 1.000 1.5 2. 0 2.500 O D Đậm độ 8.13 8.17 7.92 7.70 Độc tố 1.437 1.892 2.081 2.260 16 giờ 24 giờ 48 giờ 72 giờ Hình 4.8. Đậm độ và khả năng sinh độc tố của S. aureus trên môi trƣờng BHI Theo bảng 4.7, trên môi trường TSGM, ở thời điểm 16 giờ, đậm độ vi khuẩn S. aureus đạt 7,86 log10 cfu/ml (107 cfu/ml) thì khả năng sinh độc tố SE đạt giá trị OD là 1,923. Còn trên môi trường BHI, ở thời điểm 16 giờ, giá trị OD độc tố đạt 1,437 khi đậm độ vi khuẩn S. aureus đạt 8,13 log10 (cfu/ml) (Bảng 4.8). Trong khi đó, khả năng tạo độc tố của S. aureus được xem là dương tính khi giá trị OD ≥ 0,2. Như vậy, lượng độc tố mà S. aureus tạo ra lúc 16 giờ là rất cao. Điều đó cho thấy có thể S. aureus bắt đầu tạo độc tố SE vào trước thời điểm 16 giờ, lúc đậm độ vi khuẩn thấp hơn 107cfu/ml. Trong các báo cáo trước đây, L.Simeão do Carmo (2002); Yves Le Loir và ctv (2003) xác định rằng S. aureus có thể tạo SE khi đậm độ vi khuẩn đạt 106 cfu/ml. Còn trong nghiên cứu sự phát triển và tạo độc tố SE của S. aureus trong sữa, kết quả cho thấy khi đậm độ tế bào vi khuẩn đạt 106,5 cfu/ml, lượng độc tố SEA tăng tuyến tính theo thời gian (Hiroshi Fujikawa và Satoshi Morozumi, 2005). Tóm lại, trong 36 chủng S. aureus được khảo sát, chỉ có 10 chủng tạo độc tố SE (chiếm 27,8%). Như vậy, không phải tất cả các chủng S. aureus đều có khả năng tạo độc tố, việc tạo độc tố là tùy thuộc vào từng chủng. Ta cũng không thể dựa vào đậm độ vi khuẩn để suy ra lượng độc tố vì đậm độ và độc tố không tương quan với nhau. Đậm độ tuân theo đường cong tăng trưởng của vi khuẩn, tăng ở phase cấp số, không đổi ở phase dừng và giảm ở phase suy vong, còn độc tố thì tăng theo thời gian và đạt cao nhất ở 72 giờ. Đối với các chủng S. aureus có khả năng tạo độc tố thì ở thời điểm 16 giờ đã có thể tạo độc tố với giá trị OD khá cao (1,464 trên môi trường TSGM và 1,437 trên môi trường BHI). Tuy nhiên, do điều kiện thí nghiệm còn hạn chế, chúng tôi chưa khảo sát được đậm độ và khả năng tạo độc tố của S. aureus ở thời điểm trước 16 giờ cũng như sau 72 giờ. Do đó không thấy được phase chậm, chưa xác định được trên môi trường nuôi cấy ở thời điểm trước 16 giờ, S. aureus có hay không có tạo độc tố, với lượng bao nhiêu, có đủ gây ngộ độc không, cũng như chưa xác định được sau 72 giờ lượng độc tố có tiếp tục tăng hay không. Do đó, cần tiến hành những thí nghiệm khảo sát đậm độ và độc tố S. aureus trước 16 giờ và sau 72 giờ, cũng như xác định liều lượng độc tố tương ứng với giá trị OD có thể gây độc. 4.3.2. Đánh giá tác động của hai môi trường TSGM và BHI Từ Phụ lục B.1 và Phụ lục B.3 cho thấy sự khác biệt về đậm độ của S. aureus trên hai môi trường TSGM và BHI là không có ý nghĩa (P = 0,6146 > 0,05), đồng thời cũng không có sự khác biệt về khả năng tạo độc tố trên hai môi trường này (P = 0,7365 > 0,05) (Phụ lục B.4 và Phụ lục B.6). Như vậy hai môi trường TSGM và BHI có tác động như nhau đến sự phát triển cũng như khả năng tạo độc tố của các chủng S. aureus ở cùng điều kiện nuôi cấy. Do đó có thể sử dụng môi trường BHI thay thế cho môi trường TSGM để nuôi cấy S. aureus và kiểm tra độc tố của chúng. 4.4. Xác định các loại độc tố SE Các độc tố cần được xác định là A , B, C, D và E tương ứng với các giếng có màu đen, xanh, vàng, đỏ và trắng ; khi ở giếng nào có giá trị OD ≥ 0,2 thì được xác định là nhóm độc tố tương ứng với giếng đó (Hình 4.9). Kết quả thí nghiệm cho thấy các chủng S. aureus này tạo các loại độc tố SEA, SEB, SEC, không có chủng nào tạo độc tố SED và SEE (Bảng 4.9). Hình 4.9. Kết quả xác định loại độc tố bằng phƣơng pháp ELISA Giếng 1: đối chứng âm Giếng 2: đối chứng dương Giếng 3 – 7: Tkk/GS (serotype B - giếng 4) Giếng 10 - 14: G147/05 (serotype A – giếng 10) Giếng 17 - 21: E2/NĐ06 (serotype C - giếng 19) Giếng 24 - 28: V29 (serotype A – giếng 24) Giếng 8 , 9, 15, 16, 22, 23: các giếng trống Bảng 4.9. Các loại độc tố của S. aureus STT Mã số mẫu Giá trị OD Loại độc tố 1 M168 1.008 A 2 N88/05 0.375 A 3 M156 0.983 A 4 M69 1.020 A 5 V30 0.818 A 6 G147/05 0.425 A 7 V29 0.727 A 8 M73 BVND05 0.857 A 9 Tkk/GS 0.684 B 10 E2/NĐ06 0.674 C Trong đó, SEA chiếm tỉ lệ cao nhất (80%), trong khi SEB (10%) và SEC (10%) (Hình 4.10). Kết quả này phù hợp với các báo cáo trước đây, SEA là loại độc tố thường gây ra các vụ ngộ độc thực phẩm do tụ cầu ở nhiều nước (Lenz W và ctv, 1983; H.Y. Tsen, 1996; Naomi Balaban và Avraham Rasooly, 2000; Capucine Letetre và ctv, 2003). Các dòng S. aureus tạo độc tố SEA có tần số cao nhất trong các mẫu thực phẩm (61,5%) và trên những người khỏe mạnh (53,6%). Ngoài ra, C. Vernozy-Rozand và ctv (2004) cũng nhận thấy rằng SEA là nguyên nhân của 75% các vụ ngộ độc do tụ cầu, tiếp đến là SED, SEC và SEB, còn các vụ dịch do SEE thường rất ít gặp. 80% 10% 10% A B C Hình 4.10. Tỉ lệ các loại độc tố SE PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận Trong 36 chủng S. aureus khảo sát, có 10 chủng có khả năng tạo độc tố (27,8%), trong đó các chủng từ mẫu bệnh phẩm chiếm tỉ lệ cao nhất (50%). Như vậy khả năng tạo độc tố SE của S. aureus là tùy thuộc vào từng chủng. Đậm độ và độc tố S. aureus không tương quan với nhau, độc tố tăng theo thời gian. Sau 16 giờ nuôi cấy, trên môi trường TSGM, đậm độ vi khuẩn đạt 7,86 log10 cfu/ml thì độc tố đạt giá trị OD (ELISA) là 1,464. Trên môi trường BHI, đậm độ vi khuẩn đạt 8,13 log10 cfu/ml thì độc tố đạt giá trị OD (ELISA) là 1,437 (OD≥0,2 là dương tính). Hai môi trường TSGM và BHI là như nhau về ảnh hưởng đến đậm độ và khả năng tạo độc tố của S. aureus. Vì thế có thể sử dụng môi trường BHI thay thế môi trường TSGM trong công tác kiểm nghiệm phát hiện S. aureus cũng như độc tố SE của chúng. 10 chủng S. aureus này tạo các loại độc tố SEA, SEB, SEC; trong đó, SEA chiếm tỉ lệ cao nhất (80%), trong khi SEB (10%) và SEC (10%). 5.2. Đề nghị Do hạn chế về thời gian và điều kiện thí nghiệm, chúng tôi thu được một số kết quả nhất định. Nếu có điều kiện, cần tiến hành: o Tăng số lượng mẫu khảo sát. o Nghiên cứu sự phát triển, đậm độ và khả năng tạo độc tố của S. aureus ở các thời điểm trước 16 giờ cũng như ở các thời điểm sau 72 giờ. o Kiểm tra khả năng tạo độc tố của các chủng S. aureus trong thực phẩm bằng cách cho nhiễm các chủng có khả năng tạo độc tố vào thực phẩm và thử nghiệm độc tố. o Tính lượng độc tố SE từ giá trị OD, từ đó xác định lượng độc tố đó có đủ gây ngộ độc không. o Nghiên cứu, ứng dụng các kĩ thuật sinh học phân tử khác trong việc chẩn đoán SE. PHẦN 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt 1. Nguyễn Văn Hải và Lê Trung Hải. Nhận xét 173 trường hợp ngộ độc thực phẩm tại Khánh Hòa 2001-2004, Trung tâm y tế dự phòng tỉnh Khánh Hòa, Thông tin khoa học, Cục an toàn vệ sinh thực phẩm, 2005. 2. Bùi Thế Hiền, Tô Thị Thu và Cộng sự. Tình hình ô nhiễm thực phẩm do vi sinh vật tại hai xã huyện Kiến Xương tỉnh Thái Bình năm 2001, Trung tâm y tế dự phòng Thái Bình, Thông tin khoa học, Cục an toàn vệ sinh thực phẩm, 2005. 3. Nguyễn Lý Hương, Nguyễn thị Phấn và Bùi Thị Kim Dung. Khảo sát tình hình ô nhiễm vi sinh vật trên một số mặt hàng thực phẩm ăn liền bán tại các chợ ở Tp.Hồ Chí Minh trong 3 năm 2002-2004, Trung tâm y tế dự phòng Tp.Hồ Chí Minh, Thông tin khoa học, Cục an toàn vệ sinh thực phẩm, 2005. 4. Vương Thị Việt Hoa, 2002. Giáo trình thực tập Vi sinh thực phẩm. Trường Đại hoc Nông Lâm TP.HCM. 74 trang. 5. Đỗ Thị Hòa, 2006. Phòng chống tụ cầu trùng vàng. Khoa học phổ thông, số 30/06. 6. Cục an toàn vệ sinh thực phẩm, 2006. Cơ sở dữ liệu ngộ độc thực phẩm. 7. Nguyễn Đỗ Phúc, Hoàng Hoài Phương và Bùi Kiều Nương. Đánh giá mức độ ô nhiễm vi sinh vật thức ăn đường phố tại thành phố Hồ Chí Minh năm 2002, Viện Vệ Sinh Y tế Công Cộng Tp HCM, Thông tin khoa học, Cục an toàn vệ sinh thực phẩm, 2003. 8. Bộ môn vi sinh – khoa Y, 1996. Thực tập vi sinh học và miễn dịch học. Trường Đại học Y dược TP.HCM. 134 trang. 9. Trần Linh Thước, 2002. Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mỹ phẩm. Nxb Giáo dục. 230 trang. Tài liệu tiếng nước ngoài 10. Beatriz Pinto, Empar Chenoll và Rosa Azna, 2004. Identification and typing of food-borne Staphylococcus aureus by PCR-based techniques. Systematic and Applied Microbiology 28: 340-350. Elsivier Science. 11. Capucine Letetre, Sylvie Perelle, Francoise Dilasser và Patrick Fach, 2003. Detectio and genotyping by real-time PCR of the Staphylococcal enterotoxin genes sea to sej. Molecular and Cellular Probes 17: 139-147. Elsivier Science. 12. C H Collins, Patricia M Lyne và J M Grange, 1995. Staphylococcus and Micococcus. Collines and Lyne’s Microbiological Methods, (C H Collins, Patricia M Lyne và J M Grange). Butterworth-Heinemann Ltd. p.353-359. 13. C. Letertre, S. Perelle, F. Dilasser và P. Fach, 2003. Identification of a new putative enterotoxin SEU encoded by the egc cluster of Staphylococcus aureus. Journal of Food Microbiology 95: 38-43. The Society for Applied Microbiology. 14. C. Vernozy-Rozand, C. Mazuy-Cruchaudet, C. Bavai và Y. Richard, 2004. Comparison of three immunological methods for detecting staphylococcal enterotoxin from food. Letter in Applied Microbiology 39: 1390-394. The Society for Applied Microbiology. 15. D.L.K.Ng và L.Tay, 1992. Enterotoxigenic strains of coagulase-positive Staphylococcus aureus in drinks and ready-to-eat foods. Food Microbiology 10: 317- 320. Academic Press Limited. 16. Ernest Jawetz, Joseph L. Melnick, Edward A. Adelberg, George F. Brooks, Janet S. Butel và L. Nicholas Ornston, 1989. The Staphylococci, Medical Microbiology (Ernest Jawetz, Joseph L. Melnick, Edward A. Adelberg, George F. Brooks, Janet S. Butel và L. Nicholas Ornston). Pretice-Hall International Inc, USA. p.187-192. 17. G. Normanno, A. firinu, S. Virgilio, G. Mula, A. Dambrosio, A. Poggiu, L. Decastelli, R. Mioni, S. scuota, G. Bolzoni, E. Di Giannatale, A.P. Salinetti, G.La Salandra, M. bartoli, F. Zuccon, T. Pirino, S.Sias, A. Parisi, N.C. Quaglia và G.V. Celano, 2004. Coagulase-positive Staphylococci and Staphylococcus aureus in food products marketed in Italy. International Journal of Food Microbiology 98: 73-79. Elsivier Science. 18. Hiroshi Fujikawa và Satoshi Morozumi, 2005. Modeling Staphylococcus aureus growth and enterotoxin production in milk. Food Microbiology 23: 260-267. Elsivier Science. 19. H.J.Jogensen, T. Mork, H.R.Hogasen và L.M.Rorvik, 2004. Enterotoxigenic Staphylococcus aureus in bulk in Norway. Journal of Applied Microbiology 99: 158- 166. The Society for Applied Microbiology. 20. H.-L. Wei và C.-S. Chiou, 2001. Molecular subtyping of Staphylococcus aureus from an outbreak associated with a food handler. Epidemiol Infect 128: 15-20. Cambridge University Press. 21. H.Y. Tsen, G.K.Yu, K.C. Wang, S.J.Wang, M.Y. Chang và L.Y. Lin, 1996. Comparison of the enterotoxigenic types, toxic shock syndrom I (TSSS-1)strains and antibiotic susceptibility for enterotoxigenic Staphylococcus aureus isolated from food and clinical sample. Food Microbiology 15: 33-41.Academit Press Limited. 22. J.A. Boerema, R. Clemens và G. Bright Well, 2005. Evaluation of molecular methods to determine enterotoxigenic status and molecular genotype of bovine, ovine, human and food isolates of Staphylococcus aureus. International Journal of Food Microbiology 107: 192-201. Elsivier Science. 23. J.M. Fueyo, M.C. Martin, M.A. Gonzalez-Hevia và M.C.Mendoza, 2000. Enterotoxin production and DNA fingerprinting in Staphylococcus aureus isolated from human and food samples. Relations between genetic types and enterotoxins. International Journal of Food Microbiology 67: 139-145. Elsivier Science. 24. J.P. Rosec và O. Gigaud, 2002. Staphylococci enterotoxin genes of classical and new types detected by PCR in France. International Journal of Food Microbiology 77: 61-70. Elsivier Science. 25. Kenneth Todar. Todar’s Online Textbook of Bacteriology University of Wisconsin-Madison Department of Bacteriology (Staphylococcus). Kenneth Todar University of Wisconsin-Madison Department of Bacteriology, 2005. 26. L.C. Braga, J.W. Shupp, C. Cummings, M. Jett, J.A. Takahashi, L.S. Carmo, E. Chartone-Souza và M.A.Nascimento, 2004. Pomegranate extract inhibits Staphylococcus aureus grow than dsubse quententero toxin production. Journal of Ethnopharmacology 96: 335-339. Elsevier Ireland. 27. L. Simeão do Carmo, R. Souza Dias, V. Roberto Linardi, M. Jose de Sena, D. Aparecida dos Santos, M. Eduardo de Faria, E. Castro Pena, M. Jett và L.Guilherme Heneine, 2001. Food poisoning enterotoxigenic strains of Staphylococcus present in Minas cheese and raw milk in Brazil. Food Microbiology19: 9-14. Elsivier Science Ltd. 28. Mary K. Sandel và John L. McKillip, 2002. Virulence and recovery of Staphylococcus aureus to the food industry using improvement on traditional approaches. Food control 15: 5-10. Elsivier Science. 29. N.F. Lightfoot và E.A. Maier, 1998. Microbiological Analysis of Food and Water: Guideline for Quality Assurance. Elsevier. 266 trang. 30. Nighat P.Kokan và Merline S Bergdoll,1987. Detection of Low-Enterotoxin- Producing Staphylococcus aureus Strains. Applied and Environmental Microbiology Nov.1987: 2675-2676. American Society for Microbiology. 31. Naomi Balaban và Avraham Rasooly, 2000. Staphylococcal enterotoxins. International Journal of Food Microbiology 61: 1-10. Elsivier Science. 32. Norinaga Miwa, Asako Kawamura, Takashi Masuda và Masato Akiyama, 2000. An outbreak of food poisoning due to egg yolk reaction-negative Staphylococcus aureus. International Journal of Food Microbiology 64: 361-366. Elsivier Science. 33. Paul A. Gulig và David Brumbaugh. The Virtual Microbiology Lab (Key to Lap Images), University of Florida, June 2006. < ml> 34. P J Bremer, G C Fletcher và C Osbome. Staphylococcus aureus. Nee Zealand Institute for Crop and Food Research, April 2004. 35. Reginald W. Bennett và Gayle A. Lancette. Bacteriological Analytical Manual Online (Chapter12: Staphylococcus aureus). Center for Food Safety & Applied Nutrition, U.S.Food and Drug Administration, January 2001. 36. Rosamund M. Baird và W.H.Lee, 1995.Media used in the detection and enumeration of Staphylococcus aureus. International Journal of Food Microbiology 26: 15-24. Elsivier Science. 37. Scott E Martin, John J Iandolo, J Harvey, A Gilmour, Sita R Tatini, Reginald Bennett và Merlin S Bergdoll, 2000. Staphylococcus. Encyclopedia of Food Microbiology, (Richard K.Robinson, Carl A.Batt và Pradip D.Patel). Academic Press, San Diego - San Francisco - New Yolk – Boston – London – Sydney - Tokyo. p.2062-2083. 38. SOM 208 Microbiology Syllabus (The Staphylococci), UCSD School of Medicine, January 2006. < otes_Staphylococci.htm> 39. Stephen T. Abedon. Site Index (Supplemental Lecture). The Ohio State University, March 1998. < state.edu/~sabedon/biol2025.htm#stationary_phase> 40. Susana M. Portopcarrero, Melissa Newman và Benjy Mikel, 2001. Staphylococcus aureus survival, staphylococci enterotoxin production and shelf stability of country-cured hams manufactured under different processing procedures. Meat Science 62: 267-273. Elsivier Science. 41. Viktoria atanmassova, Alexandra Meindl và Christian Ring, 2001. Prevalence of Staphylococcus aureus and staphylococci enterotoxin in raw pork and uncooked smoked ham – a comparison of classical culturing detection and RFLP-PCR. International Journal of Food Microbiology 68: 105-113. Elsivier Science. 42. William G. Gilroy. Drug-resistant staph infections becoming an increasingly difficult health challenge. University of Notre Dame, April 2005. 43. Yves Le Loir, Florence Baron and Michel Gautier, 2003. Staphylococcus aureus and food poisoning. Genetic and Molecular Research 2: 63-76. FUNPEC. PHỤ LỤC Phụ lục A: Số liệu thô Phụ lục A.1. Đậm độ S. aureus trên môi trƣờng TSGM STT Mã số chủng 0 giờ (cfu/ml) 16 giờ (cfu/ml) 24 giờ (cfu/ml) 48 giờ (cfu/ml) 72 giờ (cfu/ml) 1 M168 9.3 x 10 5 4.8 x 10 7 8.1 x 10 7 1.5 x 10 8 7.6 x 10 7 2 N88/05 8.1 x 10 5 7.0 x 10 6 1.7 x 10 7 2.0 x 10 7 9.6 x 10 6 3 H110 2.8 x 10 6 1.4 x 10 7 3.0 x 10 7 1.5 x 10 7 4.0 x 10 6 4 72/NĐ 9.6 x 105 2.1 x 108 6.0 x 108 4.7 x 108 2.3 x 108 5 H117 1.2 x 10 6 1.3 x 10 8 1.8 x 10 8 2.8 x 10 8 7.9 x 10 7 6 B9 3.1 x 10 6 1.7 x 10 8 3.0 x 10 8 6.0 x 10 8 2.2 x 10 8 7 N76/05 1.8 x 10 6 6.1 x 10 7 4.5 x 10 7 1.7 x 10 8 9.4 x 10 7 8 M156 3.0 x 10 6 7.7 x 10 7 8.2 x 10 7 1.8 x 10 8 6.2 x 10 7 9 M69 2.4 x 10 6 1.4 x 10 7 4.6 x 10 7 2.1 x 10 8 1.4 x 10 8 10 V30 2.0 x 10 6 2.9 x 10 8 2.8 x 10 8 2.0 x 10 8 1.1 x 10 8 11 G147/05 7.2 x 10 5 1.9 x 10 8 2.8 x 10 8 1.1 x 10 8 6.5 x 10 7 12 D2/06 1.1 x 10 6 5.5 x 10 7 6.8 x 10 7 5.8 x 10 8 3.5 x 10 7 13 Na1 3.2 x 10 6 2.9x 10 8 3.4 x 10 8 2.8 x 10 8 1.8 x 10 8 14 V29 1.8 x 10 6 9.0 x 10 6 1.4 x 10 8 2.5 x 10 7 6.0 x 10 6 15 G168/05 6.0 x 10 4 3.0 x 10 6 2.6 x 10 7 2.5 x 10 7 2.3 x 10 7 16 M73 BVND05 8.8 x 10 5 1.8 x 10 8 3.9 x 10 8 2.4 x 10 8 1.2 x 10 8 17 V25 6.9 x 10 5 2.1 x 10 8 9.6 x 10 7 5.8 x 10 7 7.0 x 10 6 18 Na5 1.9 x 10 6 6.3 x 10 8 6.9 x 10 8 2.6 x 10 8 2.3 x 10 8 19 D1/06 8.2 x 10 5 4.2 x 10 7 3.6 x 10 7 3.4 x 10 7 8.5 x 10 6 20 B118/06 1.5 x 10 6 1.8 x 10 7 6.2 x 10 7 1.9 x 10 7 6.9 x 10 6 21 D6/06 3.0 x 10 6 2.9 x 10 8 1.8 x 10 8 1.0 x 10 8 5.7 x 10 7 22 D11/06 4.6 x 10 6 1.0 x 10 8 1.4 x 10 8 8.3 x 10 7 4.8 x 10 7 23 K17/ĐT 5.4 x 105 1.6 x 107 2.5 x 107 1.9 x 107 6.8 x 106 24 V13/ĐT 5.5 x 105 5.6 x 107 4.1 x 107 1.6 x 107 7.7 x 106 25 V14/ĐT 1.5 x 106 5.1 x 107 2.2 x 108 8.8 x 107 1.5 x 107 26 V15/ĐT 3.0 x 106 5.5 x 108 4.6 x 108 3.4 x 108 1.5 x 108 27 Tss/GS 5.2 x 10 7 6.7 x 10 7 5.2 x 10 7 4.1 x 10 7 1.9 x 10 7 28 Tpp/GS 6.9 x 10 7 4.2 x 10 7 6.6 x 10 7 8.4 x 10 7 2.9 x 10 7 29 Tkk/GS 5.2 x 10 7 5.7 x 10 8 6.6 x 10 8 1.2 x 10 9 1.4 x 10 8 30 V28/ĐT 1.3 x 106 8.0 x 107 9.4 x 107 5.4 x 107 4.0 x 107 31 V29/ĐT 2.0 x 106 5.6 x 107 2.4 x 108 1.4 x 108 8.4 x 107 32 M64 BVND05 6.0 x 10 5 1.9 x 10 7 8.0 x 10 6 7.0 x 10 6 1.8 x 10 6 33 V34/ĐT 2.7 x 106 2.6 x 108 3.0 x 108 7.3 x 108 2.1 x 107 34 V35/ĐT 2.6 x 106 2.5 x 108 5.3 x 108 5.7 x 108 2.7 x 108 35 V36/ĐT 4.2 x 106 1.2 x 108 3.0 x 108 8.0 x 106 2.7 x 105 36 E2/NĐ06 1.5 x 106 2.0 x 108 3.4 x 108 2.1 x 108 1.2 x 108 Phụ lục A.2. Đậm độ S. aureus trên môi trƣờng BHI STT Mã số chủng 0 giờ (cfu/ml) 16 giờ (cfu/ml) 24 giờ (cfu/ml) 48 giờ (cfu/ml) 72 giờ (cfu/ml) 1 M168 8.5 x 10 5 3.4 x 10 7 4.4 x 10 7 6.4 x 10 7 5.1 x 10 7 2 N88/05 1.1 x 10 6 1.6 x 10 7 2.5 x 10 7 4.6 x 10 7 4.4 x 10 7 3 H110 3.3 x 10 6 1.2 x 10 7 1.2 x 10 7 7.0 x 10 6 1 x 10 6 4 72/NĐ 3.9 x 105 5.0 x 107 8.6 x 107 1.3 x 108 1.3 x 108 5 H117 7.4 x 10 5 1.1 x 10 8 9.9 x 10 7 5.2 x 10 7 4.2 x 10 8 6 B9 2.3 x 10 6 1.4 x 10 8 1.5 x 10 8 8.7 x 10 7 1.3 x 10 8 7 N76/05 1.3 x 10 6 3.9 x 10 7 8.1 x 10 7 4.3 x 10 7 6.3 x 10 7 8 M156 2.4 x 10 6 1.8 x 10 8 1.9 x 10 8 1.7 x 10 8 9.5 x 10 7 9 M69 1.4 x 10 6 1.7 x 10 8 1.6 x 10 8 1.4 x 10 8 5.0 x 10 7 10 V30 2.4 x 10 6 3.0 x 10 8 2.8 x 10 8 5.0 x 10 7 2.1 x 10 7 11 G147/05 5.8 x 10 5 2.3 x 10 8 1.8 x 10 8 5.3 x 10 7 5.0 x 10 7 12 D2/06 7.6 x 10 5 7.0 x 10 7 8.0 x 10 7 5.3 x 10 7 5.2 x 10 7 13 Na1 3.3 x 10 6 2.9 x 10 8 2.9 x 10 8 1.8 x 10 8 7.8 x 10 7 14 V29 1.4 x 10 6 1.0 x 10 8 9.3 x 10 7 1.1 x 10 8 6.1 x 10 7 15 G168/05 5.5 x 10 5 7.2 x 10 7 5.8 x 10 7 4.2 x 10 7 1.3 x 10 7 16 M73 BVND05 1.1 x 10 6 3.0 x 10 8 3.0 x 10 8 4.9 x 10 8 1.2 x 10 8 17 V25 6.7 x 10 5 1.7 x 10 7 3.9 x 10 7 4.0 x 10 7 3.6 x 10 7 18 Na5 1.5 x 10 6 2.2 x 10 8 6.0 x 10 8 8.2 x 10 7 1.0 x 10 8 19 D1/06 6.0 x 10 5 9.0 x 10 6 5.1 x 10 7 3.5 x 10 7 8.2 x 10 7 20 B118/06 1.2 x 10 6 1.6 x 10 8 8.1 x 10 8 8.2 x 10 7 5.5 x 10 7 21 D6/06 3.8 x 10 6 6.3 x 10 8 3.3 x 10 8 4.6 x 10 7 7.1 x 10 7 22 D11/06 5.8 x 10 6 3.6 x 10 8 7.4 x 10 7 4.7 x 10 7 7.3 x 10 7 23 K17/ĐT 5.6 x 105 6.1 x 107 7.6 x 107 1.1 x 108 9.2 x 107 24 V13/ĐT 7.1 x 105 4.1 x 107 4.8 x 107 2.3 x 107 1.4 x 108 25 V14/ĐT 1.5 x 106 4.9 x 108 5.0 x 108 7.2 x 107 1.2 x 108 26 V15/ĐT 2.4 x 106 4.4 x 108 5.3 x 108 6.3 x 107 1.6 x 108 27 Tss/GS 1.2 x 10 6 9.1 x 10 7 1.1 x 10 8 9.5 x 10 7 4.8 x 10 7 28 Tpp/GS 7.5 x 10 5 1.9 x 10 8 2.0 x 10 8 4.3 x 10 7 5.7 x 10 7 29 Tkk/GS 8.1 x 10 5 2.3 x 10 8 2.7 x 10 8 1.7 x 10 7 1.7 x 10 7 30 V28/ĐT 1.5 x 106 9.3 x 107 1.7 x 108 1.6 x 108 1.3 x 108 31 V29/ĐT 1.7 x 106 2.9 x 108 1.6 x 108 1.1 x 108 1.1 x 108 32 M64 BVND05 3.9 x 10 5 7.7 x 10 7 7.9 x 10 7 2.4 x 10 7 1.8 x 10 7 33 V34/ĐT 2.3 x 106 3.8 x 108 4.6 x 108 2.5 x 108 1.2 x 108 34 V35/ĐT 2.2 x 106 3.0 x 108 4.2 x 108 2.6 x 108 3.4 x 108 35 V36/ĐT 4.2 x 106 9.6 x 107 4.2 x 107 4 x 106 1.4 x 105 36 E2/NĐ06 2.4 x 106 2.9 x 108 3.8 x 108 8.7 x 107 7.3 x 107 Phụ lục B: Kết quả phân tích thống kê Phụ lục B.1. Bảng phân tích ANOVA đậm độ S. aureus Analysis of Variance for DAMDO.DAMDO - Type III Sums of Squares -------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level -------------------------------------------------------------------------------- MAIN EFFECTS A:DAMDO.THOIGIAN 52.549630 4 13.137407 62.641 .0000 B:DAMDO.MOITRUONG .055225 1 .055225 .263 .6146 INTERACTIONS AB .7976700 4 .1994175 .951 .4386 RESIDUAL 18.875350 90 .2097261 -------------------------------------------------------------------------------- TOTAL (CORRECTED) 72.277875 99 -------------------------------------------------------------------------------- 0 missing values have been excluded. All F-ratios are based on the residual mean square error. Phụ lục B.2. Trắc nghiệm chi tiết về đậm độ - thời gian Multiple range analysis for DAMDO.DAMDO by DAMDO.THOIGIAN --------------------------------------------------------------------------- ----- Method: 95 Percent LSD Level Count LS Mean Homogeneous Groups --------------------------------------------------------------------------- ----- 0 20 6.2060000 X 72 20 7.7375000 X 16 20 7.9920000 XX 48 20 8.0375000 X 24 20 8.1695000 X --------------------------------------------------------------------------- ----- contrast difference limits 0 - 16 -1.78600 0.28777 * 0 - 24 -1.96350 0.28777 * 0 - 48 -1.83150 0.28777 * 0 - 72 -1.53150 0.28777 * 16 - 24 -0.17750 0.28777 16 - 48 -0.04550 0.28777 16 - 72 0.25450 0.28777 24 - 48 0.13200 0.28777 24 - 72 0.43200 0.28777 * 48 - 72 0.30000 0.28777 * --------------------------------------------------------------------------- ----- * denotes a statistically significant difference. Phụ lục B.3. Trắc nghiệm chi tiết về đậm độ - môi trƣờng Multiple range analysis for DAMDO.DAMDO by DAMDO.MOITRUONG --------------------------------------------------------------------------- ----- Method: 95 Percent LSD Level Count LS Mean Homogeneous Groups --------------------------------------------------------------------------- ----- B 50 7.6050000 X T 50 7.6520000 X --------------------------------------------------------------------------- ----- contrast difference limits T - B 0.04700 0.18200 --------------------------------------------------------------------------- ----- * denotes a statistically significant difference. Phụ lục B.4. Bảng phân tích ANOVA độc tố S. aureus Analysis of Variance for DOCTO.DOCTO - Type III Sums of Squares -------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level -------------------------------------------------------------------------------- MAIN EFFECTS A:DOCTO.THOIGIAN 8.4499463 3 2.8166488 2.943 .0387 B:DOCTO.MOITRUONG .1124250 1 .1124250 .117 .7365 INTERACTIONS AB .0429543 3 .0143181 .015 .9975 RESIDUAL 68.916709 72 .9571765 -------------------------------------------------------------------------------- TOTAL (CORRECTED) 77.522035 79 -------------------------------------------------------------------------------- 0 missing values have been excluded. All F-ratios are based on the residual mean square error. Phụ lục B.5. Trắc nghiệm chi tiết về độc tố - thời gian Multiple range analysis for DOCTO.DOCTO by DOCTO.THOIGIAN --------------------------------------------------------------------------- ----- Method: 95 Percent LSD Level Count LS Mean Homogeneous Groups --------------------------------------------------------------------------- ----- 16 20 1.4508500 X 24 20 1.9073500 XX 48 20 2.1395000 X 72 20 2.3183500 X --------------------------------------------------------------------------- ----- contrast difference limits 16 - 24 -0.45650 0.61688 16 - 48 -0.68865 0.61688 * 16 - 72 -0.86750 0.61688 * 24 - 48 -0.23215 0.61688 24 - 72 -0.41100 0.61688 48 - 72 -0.17885 0.61688 --------------------------------------------------------------------------- ----- * denotes a statistically significant difference. * denotes a statistically significant difference. Phụ lục B.6. Trắc nghiệm chi tiết về độc tố - môi trƣờng Multiple range analysis for DOCTO.DOCTO by DOCTO.MOITRUONG --------------------------------------------------------------------------- ----- Method: 95 Percent LSD Level Count LS Mean Homogeneous Groups --------------------------------------------------------------------------- ----- B 40 1.9165250 X T 40 1.9915000 X --------------------------------------------------------------------------- ----- contrast difference limits T - B 0.07498 0.43620 --------------------------------------------------------------------------- ----- * denotes a statistically significant difference. Phụ lục B.7. Tƣơng quan giữa đậm độ và độc tố trên môi trƣờng BHI Correlations DAMDOB DOCTOB DAMDOB Pearson Correlation 1 .015 Sig. (2-tailed) . .928 N 40 40 DOCTOB Pearson Correlation .015 1 Sig. (2-tailed) .928 . N 40 40 Phụ lục B.8. Tƣơng quan giữa đậm độ và độc tố trên môi trƣờng TSGM Correlations DAMDOT DOCTOT DAMDOT Pearson Correlation 1 .111 Sig. (2-tailed) . .495 N 40 40 DOCTOT Pearson Correlation .111 1 Sig. (2-tailed) .495 . N 40 40 Ghi chú: B: BHI T: TSGM Phụ lục C: Thành phần môi trƣờng C.1. Môi trƣờng Chapman (MSA - Manitol Salt phenol-red Agar) C.1.1. Thành phần g/l o Peptones 10 o Meat extract 1 o Sodium chloride 75 o D (-) Manitol 10 o Phenol red 0,025 o Agar 12 C.1.2. Cách pha: Hòa 108 g/1 lit nước cất, đun sôi, hấp ở 121oC/15 phút. Đỗ đĩa, pH cuối 7,4 ±2 ở 25oC. C.2. Môi trƣờng BP (Baird-Paker agar) C.2.1. Thành phần g/l o Dịch trích nấm men 1 o Ammonium dihydrogen phosphate 1 o Potassium chloride 0,2 o Magnium sulphate 0,2 o Agar 12 C.2.2. Cách pha: Hòa 58g/0,95 lit nước cất, đun sôi, hấp 121oC/15 phút. pH cuối là 6,8 ±0,2 ở 25oC. Thêm 5 ml huyền phù lòng đỏ trứng (ở nhiệt độ 45-50oC). C.3. Môi trƣờng TSGM (Tecra Staphyloccocus Growth Medium) C.3.1. Thành phần o Hydrolysed protein o Beef extract o Yeast extract o Manitol o Muối vô cơ và hữu cơ C.3.2. Cách pha: Hòa tan 70g vào 1lit nước cất, đun nóng để tan hoàn toàn. Hấp121oC/15 phút. pH cuối là 7,5 ±0,2 ở 25oC. C.4. Môi trƣờng BHI (Brain Heart Infusion broth) C.4.1. Thành phần g/l o Nutrient subtrate 27,5 o D (+) glucose 2 o Sodiumchloride 5 o Di-sodium hydrogen phosphate 2,5 C.4.2. Cách pha: Hòa tan 37g/l nước cất. Hấp 121oC/15 phút. pH cuối là 7,4 ±0,2 ở 25oC. C.5. Môi trƣờng TSB (Tryptic Soy Broth) C.5.1. Thành phần: g/l o Trypticase pepton 17g o Phytone peptone 3g o NaCl 5g o K2HPO4 2,5g o Glucose 2,5g C.5.2. Cách pha: Hòa tan tất cả vào 1lit nước cất. Hấp 121oC/15 phút. pH cuối là 7,4 ±0,2. C.6. Peptone đệm C.5.1. Thành phần: g/l o Peptone 10 o NaCl 10 C.5.2. Cách pha: Hòa tan vào 1lit nước cất, phân phối vào ống nghiệm. Hấp 121 oC/15 phút. pH cuối là 7,2.