Luận văn Khảo sát điều kiện nuôi cấy và sinh bào từ vi khuẩn Bacillus subtilis

cần thiết bảo đảm cho sức khoẻ vật chủ. Cũng có thể hai nhóm vi khuẩn khác nhau tranh chấp cùng một chất dinh dưỡng có khối lượng rất ít trong ống tiêu hoá. Vi khuẩn nào đồng hoá chất dinh dưỡng này tốt thì sẽ loại trừ vi khuẩn kia. Một số vi khuẩn có thể làm thay đổi một số đặc điểm lí hoá của hệ thống tiêu hoá như: độ pH, tiềm năng oxy hoá khử, nồng độ các chất chuyển hoá làm cho một số vi sinh vật khác phát triển hoặc không phát triển được (Nguyễn Kiều Uyên Vi, 2004). 2.3.2. Vai trò của hệ vi sinh vật đƣờng ruột Giúp cho quá trình tiêu hoá tốt hơn nhờ vào hệ enzyme. Đa số các vi khuẩn có lợi trong đường ruột tham gia vào quá trình tiêu hoá, phân giải tinh bột, đường, đạm và chất xơ thành những sản phẩm dễ hấp thu hơn. Nhóm này gồm những vi sinh vật sinh một số enzyme có khả năng phân huỷ các chất trên: amylase, protease, glucanase, cellulase… gồm các vi khuẩn Lactic, Bacillus subtilis, Isotrichs, Aspergillus oryzae, Aspergillus niger… Theo Nguyễn Thị Vân Hương (1990), bổ sung chế phẩm Saccharomyces boulardii vào khẩu phần gà thịt làm giảm được hệ số chuyển biến thức ăn trên 1 kg tăng trọng, làm tăng sức kháng bệnh của gà làm giảm tỉ lệ chết, từ đó góp phần làm tăng hiệu quả kinh tế trong chăn nuôi. Đối với thú trưởng thành tiêu hoá chủ yếu nhờ enzyme thì sự xuất hiện của vi sinh vật sản sinh enzyme cũng giúp thú tiêu hoá thức ăn tốt hơn. So với enzyme tổng 12 hợp, nguồn enzyme của các vi sinh vật tương đối lí tưởng, do có nhiều ưu điểm hơn so với các nguồn từ động vật và thực vật như:  Tốc độ sinh sản của vi sinh vật rất nhanh.  Nguồn nguyên liệu dễ nuôi cấy, dễ kiếm và rẻ tiền.  Các enzyme của vi sinh vật có hoạt tính cao. Ngoài ra, có thể điều khiển các điều kiện tối ưu trong quá trình nuôi cấy để đạt được hiệu quả cao trong sản xuất (Trần Thị Minh Chiến, 2002). 2.3.3. Sự loạn khuẩn Từ loạn khuẩn được Nissle đưa ra vào năm 1916. Ông cho rằng các vi khuẩn có trong ruột người và gia súc luôn ở thế quân bình để đảm bảo cho sự tiêu hoá bình thường của vật chủ. Thế quân bình này dựa vào 2 cơ chế: (1) Cùng tranh giành chất dinh dưỡng nào đó cần cho sự sinh trưởng của chúng. (2) Chúng có thể tiết ra chất có tính kháng đối với các vi khuẩn khác.  Các nguyên nhân gây loạn khuẩn: Theo Tô Minh Châu (2004) thì có 3 nguyên nhân:  Do kháng sinh có phổ rộng lâu ngày làm mất đi sự cân bằng của hệ vi sinh vật đường ruột.  Do yếu tố ngoại cảnh: thức ăn kém phẩm chất, thú bị stress, thay đổi thời tiết, vệ sinh kém…  Do yếu tố sinh lý của thú con: Sức đề kháng của cơ thể còn yếu…  Cơ chế của hiện tƣợng loạn khuẩn Theo Nguyễn Vĩnh Phước (1977), khi cơ thể khoẻ mạnh, hai nhóm vi sinh vật bắt buộc và tuỳ nghi luôn ở thế cân bằng có lợi nhờ cơ chế cạnh tranh sinh học. Khi một trong hai hệ này mất cân bằng thì dễ gây ra sự rối loạn hệ vi khuẩn đường ruột. Thông thường, hệ vi khuẩn tuỳ nghi lấn át hệ vi khuẩn bắt buộc. Dưới tác động của một vài điều kiện bất lợi nào đó, làm cho sức đề kháng của cơ thể giảm hoặc do dùng kháng sinh lâu ngày, trúng độc…làm cho hệ vi sinh vật đường ruột bị thay đổi về số lượng, về các dòng vi khuẩn cũng như vị trí cư trú của chúng. Từ đó, gây giảm độ tiêu hoá, tạo điều kiện cho vi khuẩn gây thối hoạt động, gây ra quá trình thối rửa, phân giải các chất trong ruột sinh ra khí CO2, H2S, CH4… Những 13 chất này sẽ phá huỷ các phản ứng bình thường trong dạ dày, ruột phá hoại quá trình tạo men của thức ăn, gây ra những phản ứng trên ống tiêu hoá như: biểu mô niêm mạc bị phồng lên, rộp ra và tróc đi tạo điều kiện cho thuận lợi cho sự xâm nhập của những vi khuẩn gây hại. Do đó để ổn định hệ vi sinh vật có lợi, đồng thời giúp cho vật nuôi sớm trở lại trạng thái ban đầu thì việc bổ sung chế phẩm vi sinh vật có lợi cho đường ruột là một vấn đề rất thiết thực cần được quan tâm. 2.4. Giới thiệu chung về probiotic 2.4.1. Định nghĩa Thuật ngữ probiotic được đưa ra lần đầu tiên bởi Lilly và Stillwel (1965) để mô tả những yếu tố kích thích sinh trưởng được sản sinh bởi vi sinh vật. Probiotic được bắt nguồn từ nguồn gốc Hy Lạp với nghĩa “ tiền sự sống” (prolife) Năm 1989, Fuller định nghĩa probiotic như là thức ăn bổ sung vi sinh vật sống có tác động có lợi đến động vật chủ thông qua cải tiến cân bằng vi sinh vật của nó. Năm 1992, Havenar và cộng sự chỉ ra rằng định nghĩa probiotic của Fuller bị hạn chế ở những thức ăn bổ sung cho động vật qua đường ruột. Ông mở rộng định nghĩa probiotic của Fuller như là một lứa cấy đơn hoặc hỗn hợp các vi sinh vật sống mà chúng có ảnh hưởng có lợi đối với vật chủ bằng cách cải thiện những tính chất của hệ vi sinh vật bản xứ. 2.4.2.Chức năng sinh học của probiotic  Trung hoà độc tố, khử độc và phân huỷ một số thuốc có độc tính cao.  Kích thích hệ thống miễn dịch.  Giúp ổn định hệ vi sinh vật đường ruột  Làm tăng thức ăn ăn vào và làm tăng khả năng tiêu hoá nhờ hệ thống enzyme  Tổng hợp vitamine nhóm B và K ở manh tràng. 2.5. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng chế phẩm chứa vi khuẩn Bacillus subtilis  Trong y học và chăn nuôi Trong kháng chiến chống Pháp Bacillus subtilis được các giáo sư Đặng Đức Trạch, Hoàng Thuỷ Nguyên (là các bác sĩ quân y) đã nghiên cứu sản xuất chế phẩm Bacillus subtilis để đưa ra chiến trường nhằm giải quyết dịch tiêu chảy. 14 Năm 1949, tại Pháp đã lưu hành thuốc uống dạng ống chứa vi khuẩn Bacillus subtilis chủng IB 5832, đến năm 1955 có thêm thuốc dạng bột đóng ống và viên nang. Năm 1962,Guy Albot phát hiện Bacillus subtilis có tác dụng trong điều trị tiêu chảy do lạm dụng kháng sinh và viêm đại tràng mãn, trộn thêm với các vi khuẩn lên men lactic khác chữa loạn khuẩn đường ruột rất hiệu quả. 1958 - 1960 bác sĩ Phạm Ngọc Thạch đã sản xuất đồng loạt chế phẩm Bacillus subtilis dùng trị bệnh đường ruột. Khoa vệ sinh y học bệnh viện Bạch Mai Hà Nội đã nghiên cứu và sản xuất chế phẩm Bacillus subtilis dùng điều trị bệnh tiêu chảy ở người. Viện bào chế Pharimex Tp.HCM, Viện Pasteur Nha Trang đã nghiên cứu sản xuất chế phẩm Bacillus subtilis. 1971, Trần Minh Hùng, Lê Thị Ba, Nguyên Văn Hùng đã nghiên cứu sản xuất chế phẩm Bacillus subtilis dạng viên nuôi cấy trên môi trường đậu tương, cua đồng…hấp thu bằng tinh bột tan. Chế phẩm này dùng cho heo uống từ 0,5 - 1g/kg thể trọng. Kết quả heo sau khi sử dụng chế phẩm Bacillus subtilis tăng trọng nhanh. 1982 Vũ Văn Ngữ và các cộng sự đã sản xuất thử nghiệm chế phẩm coli_subtly (Escherichia coli và Bacillus subtilis) làm giảm tái phát do bệnh tiêu chảy gây ra ở lợn so với phương pháp điều trị bằng kháng sinh, kết quả heo tăng trọng tốt. Nghiên cứu của Baker, Braude và Kon (1925), Hauser (1957) khi bổ sung kháng sinh liều lượng thấp vào thức ăn thú nhận thấy: acid folic, acid patothenic, vitamin A, vitamin B12 tích tụ trong gan cao. Ngoài ra Bacillus subtilis còn được phối trộn với một số chủng nấm mốc, nấm men và một số vi khuẩn khác dùng trong chế phẩm EM, probiotic…  Trong nông nghiệp Chế phẩm Bacillus subtilis được dùng phòng trừ vi sinh vật gây bệnh như nấm Rhizoetonia solani, Fusarium sp, Pyriculariaoryaze… và trong bảo vệ nông sản sau thu hoạch. Trung tâm sinh học thuộc liên hiệp sản xuất hoá chất thuộc bộ công nghiệp nặng Tp.HCM, đã nghiên cứu sản xuất chế phẩm Bactophyl từ Bacillus subtilis để phòng trừ các loại nấm gây bệnh trên rau cải. 15 Hồ Thị Mỹ Hồng, Nguyễn Thanh Bình Trung tâm ứng dụng sinh học Hà Nội sản xuất chế phẩm Bacillus subtilis để phòng trừ nấm gây bệnh ở bắp Ostrinia furnacalis. 1940 Norio Kimura Yokohamo đã sử dụng chế phẩm Bacillus subtilis để ngăn chặn sự phát triển và sinh độc tố của chủng nấm mốc Aspergilus flavus, Aspergillus paraciticus. Roman và các cộng sự đã nghiên cứu B. subtilis (ATCC_6633, ATCC_9372) làm giảm đi 40 - 50% aflatoxin trong dịch chứa aflatoxin trong vòng 20 ngày. 16 PHẦN 3. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1.Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài Đề tài được thực hiện tại Phòng Vi sinh – Khoa Chăn nuôi Thú Y - Trường đại học Nông Lâm Tp.HCM. Thời gian thực hiện: từ 3/2006 đến 7/2006. 3.2. Vật liệu thí nghiệm 3.2.1. Giống vi khuẩn Giống vi khuẩn Bacillus subtilis được cung cấp từ phòng vi sinh khoa Chăn nuôi Thú y trường đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh. 3.2.2. Môi trƣờng nuôi cấy  Môi trường giữ giống, đếm số lượng tế bào: TSA (Trypticase Soya Agar).  Môi trường khảo sát đặc điểm sinh học: TSB (Tripticase Soya Broth), Simmon Citrate, môi trường lên men các loại đường…  Các môi trường đều đươc vô trùng trước khi sử dụng. 3.2.3. Hoá chất  Hoá chất cơ bản: NaOH 1N, HCl 1%, NaCl,…  Hoá chất dùng khảo sát đặc tính sinh học của vi khuẩn: dầu soi, xylen,…  Thuốc thử Kowac’s, Methyl-Red, …  Thuốc nhuộm Gram:  Thuốc nhuộm bào tử. 3.2.4. Thiết bị và dụng cụ  Thiết bị Kính hiển vi, tủ ấm, tủ sấy, nồi hấp autoclave, tủ lạnh, cân điện tử, nồi cách thuỷ, microwave…  Dụng cụ Đĩa petri, ống nghiệm, bình tam giác, lame, đũa thuỷ tinh, pipette, ống Durham, đầu tip vô trùng… 17 3.3. Nội dung nghiên cứu  Khảo sát đặc điểm của Bacillus subtilis: hình thái khuẩn lạc, tế bào vi khuẩn, tính chất nuôi cấy trên một số môi trường, thử đặc tính sinh hoá.  So sánh phương pháp đếm số lượng vi khuẩn bằng phương pháp đỗ đĩa và phương pháp đếm trên kính hiển vi.  Ảnh hưởng của hình thức và thời gian nuôi cấy đến số lượng tế bào vi khuẩn.  Ảnh hưởng của môi trường và thời gian nuôi cấy đến số lượng tế bào vi khuẩn. 3.4. Phƣơng pháp thực hiện đề tài 3.4.1.Khảo sát đặc điểm sinh học của Bacillus subtilis  Quan sát đặc điểm hình thái của Bacillus subtilis Vi khuẩn Bacillus subtilis được nuôi trong môi trường thạch nghiêng TSA . Sau 24 giờ đem nhuộm Gram và xem dưới kính hiển vi ở độ phóng đại 1000 lần (Xem phương pháp nhuộm Gram ở phần phụ lục).  Quan sát đặc điểm nhóm của Bacillus subtilis Phân phối 15ml môi trường TSA đã được hấp tiệt trùng vào đĩa petri vô trùng rồi để nguội. Hoà vi khuẩn vào nước muối sinh lí đã được hấp tiệt trùng, lấy 10 dịch pha loãng trang lên môi trường để tạo khuẩn lạc đơn của vi khuẩn Bacillus subtilis. Sau đó, gói đĩa petri và ủ ỏ nhiệt độ 37oC trong 24 giờ. Quan sát đặc điểm nuôi cấy của Bacillus subtilis trong môi trƣờng canh Môi trường TSB được phân phối 4 - 5 ml vào ống nghiệm vô trùng, đem hấp tiệt trùng và làm nguội. Cấy giống vi khuẩn vào môi trường và ủ ở nhiệt độ 37oC trong 24 giờ. Sau đó quan sát và xem sự thay đổi của môi trường nuôi cấy. 3.4.2. Các thí nghiệm về Bacillus subtilis 3.4.2.1. Ảnh hƣởng của chế độ nuôi cấy (nuôi cấy tĩnh, nuôi cấy lắc) và thời gian nuôi cấy đến số lƣợng vi khuẩn  Nguyên tắc Khi nuôi cấy vi sinh vật trong cùng một loại môi trường nhưng khác nhau về thời gian và chế độ nuôi cấy (Nuôi cấy tĩnh và nuôi cấy lắc) thì cho lượng sinh khối khác nhau.  Mục đích Xác định số lượng vi khuẩn ở thời gian và chế độ nuôi cấy nào là phù hợp. 18 Bảng 3.1. Bố trí thí nghiệm 1 Thời gian Môi trường Nuôi cấy tĩnh Nuôi cấy lắc 24h 36h 48h  Cách làm Cấy vi khuẩn Bacillus subtilis từ ống giống vào ống nghiệm chứa 4 - 5 ml môi trường TSB đã được hấp tiệt trùng (121oC/15 phút), đem đi ủ ở 37oC trong 24 giờ. Sau đó, cấy vi khuẩn từ ống nghiệm vào bình tam giác chứa 50ml môi trường TSB với tỉ lệ 2%, nuôi cấy trong 2 chế độ khác nhau: nuôi cấy tĩnh và nuôi cấy lắc (lắc 15 phút, nghỉ 45 phút) ở điều kiện 37oC. Kiểm tra số lượng vi khuẩn sau thời gian 24, 36, 48 giờ bằng phương pháp đếm khuẩn lạc. Từ khảo sát trên chúng tôi chọn được chế độ nuôi cấy vi khuẩn Bacillus subtiis thích hợp để tiếp tục khảo sát thi nghiệm tiếp theo. 3.4.2.2. Khảo sát môi trƣờng và thời gian nuôi cấy thích hợp cho vi khuẩn Bacillus subtilis phát triển tạo sinh khối  Nguyên tắc Khi nuôi cấy vi khuẩn trong các loại môi trường khác nhau ở điều kiện nuôi cấy giống nhau (pH, nhiệt độ, thời gian nuôi cấy) thì số lượng vi khuẩn sẽ khác nhau.  Mục đích Xác định môi trường nuôi cấy nào là thích hợp.  Cách làm Cấy vi khuẩn từ ống giống vào ống nghiệm chứa 4 – 5 ml môi trường TSB, ủ ở 37 oC trong 24 giờ. 19 Sau đó, chuyển vi khuẩn từ ống nghiệm vào 4 loại môi trường khác nhau: TSB, TSB + 1% glucose, TSB + 1% cao nấm men, TSB + 1% glucose + 1% cao nấm men (với tỉ lệ 2%). Sau đó đem nuôi cấy ở chế độ đã được chọn ra từ thí nghiệm 1, đếm số lượng vi khuẩn sau 24, 36, 48 giờ nuôi cấy bằng phương pháp đếm khuẩn lạc. Từ khảo sát trên chúng tôi chọn được loại môi trường nuôi cấy thích hợp để tiếp tục khảo sát thí nghiệm tiếp theo. Bảng 3.2. Bố trí thí nghiệm 2 Thời gian (giờ) Môi trường TSB TSB+1%Glucose TSB + 1%Cao nấm men TSB + 1%Glucose + 1%Cao nấm men 24 36 48 3.4.2.3. Khảo sát pH, môi trƣờng thích hợp nuôi cấy vi khuẩn Bacillus subtilis  Nguyên tắc Mỗi loại vi khuẩn thích hợp với một độ pH khác nhau, vì vậy khi nuôi cấy vi khuẩn trong cùng một loại môi trường nhưng ở các độ pH khác nhau thì số lượng vi khuẩn phát triển sau cùng một khoảng thời gian là khác nhau. Bảng 3.3. Bố trí thí nghiệm 4 Thời gian (giờ) pH 7,0 7,5 Nhiệt độ phòng 37oC Nhiệt độ phòng 37oC 24 36 48 20  Mục đích Xác định pH môi trường nuôi cấy thích hợp.  Cách làm Cấy vi khuẩn từ ống giống vào ống nghiệm chứa 4 -5 ml môi trường TSB, ủ ở 37 oC trong 24 giờ. Sau đó, chuyển vi khuẩn từ ống nghiệm vào môi trường được chọn từ thí nghiệm 2 ở các pH khác nhau với tỉ lệ 2% và nuôi cấy ở chế độ nuôi cấy (1). Sau 48 giờ đếm số lượng vi khuẩn bằng phương pháp đếm khuẩn lạc. Từ thí nghiệm chúng tôi chọn ra pH môi trường nuôi cấy vi khuẩn Bacillus subtilis thích hợp. 3.4.3. Các thí nghiệm về bào tử Bacillus subtilis 3.4.3.1. Khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ đến sự tạo bào tử của vi khuẩn Bacillus subtilis  Cách làm Cấy vi khuẩn từ ông giống vào ống nghiệm chứa 4 – 5 ml môi trường TSB, ủ ở 37 oC trong 24 giờ. Sau đó, chuyển vi khuẩn vào môi trường đã được chọn từ các thí nghiệm trên. Sau thời gian nuôi cấy thích hợp chúng tôi xử lí nhiệt độ. Xử lí ở 50oC và 70oC, đếm số lượng bào tử hình thành sau 3, 5, 7 giờ xử bằng phương pháp đếm khuẩn lạc (xem phần phụ lục) Bảng 3.4. Bố trí thí nghiệm 4 Thời gian (giờ) Nhiệt độ 50 o C 70 o C 3 5 7 21 3.4.3.2 Khảo sát ảnh hƣởng của pH đến sự tạo bào tử của vi khuẩn Bacillus subtilis  Cách làm Cấy vi khuẩn từ ống giống vào ống nghiệm chứa 4 – 5 ml môi trường TSB, ủ ở 37 o C trong 24 giờ. Sau đó, chuyển vi khuẩn vào môi trường đã được chọn từ các thí nghiệm trên. Sau thời gian nuôi cấy thích hợp chúng tôi xử lí pH. Đếm số lượng bào tử hình thành sau 3, 5, 7 giờ xử lí bằng phương pháp đếm khuẩn lạc. Bảng 3.5: Bố trí thí nghiệm 5 Thời gian (giờ) pH 6 9 3 5 7 22 PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Khảo sát đặc điểm sinh học của Bacillus subtilis 4.1.1. Đặc điểm hình thái của Bacillus sutilis Sau khi tiêu bản vi khuẩn được nhuộm Gram và được quan sát trên kính hiển vi ở độ phóng đại 1000 lần, chúng tôi nhận thấy vi khuẩn Bacillus subtilis là :  Trực khuẩn bắt màu Gram dương, ngắn và nhỏ.  Kích thước từ 0,5 - 0,8 µm x 1,5 -3 µm, hai đầu tròn, đôi khi nối thành chuỗi dài, có tạo bào tử không làm phình tế bào. Hình 4.1. Tế bào vi khuẩn B. subtilis dƣới kính hiển vi ở độ phóng đại 1000 lần : www.answers.com/ topic/bacillus-1 4.1.2. Quan sát đặc điểm khuẩn lạc của Bacillus subtilis Vi khuẩn được cấy trên môi trường TSA, sau 24 giờ cho thấy hình dạng của khuẩn lạc: khuẩn lạc khô, có màu xám nhạt trắng, tạo ra lớp màng mịn, lan trên bề mặt thạch, có mép nhăn, mép lồi lõm, bám chặt vào môi trường thạch. Hình 4.2. Đặc điểm khuẩn lạc của Bacillus subtilis trên môi trƣờng TSA 23 4.1.3. Quan sát dăc điểm nuôi cấy Bacillus subtilis trên môi trƣờng canh Sau khi cấy vi khuẩn Bacillus subtilis vào môi trường canh TSB, đem ủ ở 37oC:  Sau 12 giờ thì vi khuẩn làm đục môi trường.  Nuôi cấy đến 24 giờ thì thấy vi khuẩn tạo váng trển bề mặt của môi trường và làm cho môi trường ở phía dưới trong hơn. 4.1.3. Tính chất sinh hoá Bảng 4.1. Các phản ứng sinh hoá khác của Bacillus subtilis Thử nghiệm Kết quả Hoạt tính catalase + Sinh Indol - MR + VP + Sử dụng citrate + Khử Nitrate + Saccharose + Mannitol + Glucose + Lactose - Maltose + Ghi chú: (-) là kết quả âm tính (+) là kết quả dương tính Qua bảng cho thấy kết quả khảo sát của chúng tôi phù hợp với tính chất sinh hoá của Bacillus subtilis (Nguyễn Vĩnh Phước, 1976). Ngoài ra chung tôi còn khảo sát thấy được rằng Bacillus subtilis có khả năng sử dụng các chất như: glucose, citrate, hợp chất chứa nitrogen và có khả năng di động. Tuy nhiên, Bacillus subtilis lại không có enzyme tryptophase để phân giải tryptophan tạo Indol. 24 Hình 4.4. Phản ứng lên men một số loại đƣờng của vi khuẩn Bacillus subtilis  Khả năng phân giải tinh bột Chúng tôi đã tiến hành khảo sát khả năng sử dụng tinh bột bằng cách đo đường kính vòng phân giải trên môi trường thạch tinh bột (Starch agar) và thu được kết quả đường kính vòng phân giải trung bình là 2,9 cm. Hình 4.3. Khuẩn lạc Bacillus subtilis trên môi trƣờng thạch tinh bột. 4.2. Các thí nghiệm về Bacillus subtilis 4.2.1. Khảo sát chế độ (nuôi cấy tĩnh, lắc) và thời gian nuôi cấy thích hợp Chúng tôi tiến hành:  Nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường TSB ở hai chế độ nuôi cấy khác nhau: nuôi cấy tĩnh và nuôi cấy lắc (15 phút lắc, 45 phút nghỉ).  Đếm số lượng vi khuẩn ở 3 thời điểm: 24giờ, 36giờ, 48 giờ bằng phương pháp đỗ đĩa (thí nghiệm được lặp lại 2 lần). Kết quả được trình bày ở bảng 4.1. 25 Bảng 4.1. Ảnh hƣởng của thời gian và chế độ nuôi cấy đến số lƣợng vi khuẩn Bacillus subtilis Thời gian (giờ) Chế độ nuôi cấy Nuôi cấy lắc Nuôi cấy tĩnh 12 10,15 8,79 18 11,07 9,92 24 11,16 9,95 X 10,79 9,55 (Số lượng vi khuẩn/ml tính theo logarit) 0 2 4 6 8 10 12 12 18 24 Thời gian (giờ) Số lƣợng vi khuẩn (tính theo logarit) Nuôi cấy lắc Nuôi cấy tĩnh Biểu đồ 4.1 Ảnh hƣởng của chế độ và thời gian nuôi cấy đến số lƣợng vi khuẩn B. subtilis Qua kết quả ở bảng 4.1 cho thấy số lượng vi khuẩn trung bình trong 1 ml canh khuẩn ở chế độ nuôi cấy lắc là 10,79 (giá trị logarit) (số thực tế là 6,17.1010) cao hơn so với số lượng vi khuẩn trung bình ở chế độ nuôi cấy tĩnh 9,55 (giá trị logarit) (số thực tế là 35,48.108). Kết quả xử lí thống kê cho thấy rằng có sự khác biệt về số lượng vi khuẩn giữa hai chế độ nuôi cấy tĩnh và lắc, sự khác biệt này có ý nghĩa về mặt thống kê (với P<0,05). Điều này có nghĩa là khi nuôi cấy lắc thì lượng oxy và chất dinh dưỡng sẽ phân bố đồng đều hơn trong môi trường giúp cho vi khuẩn phát triển nhanh hơn khi 26 nuôi cấy tĩnh (vì Bacillus subtilis là vi khuẩn hiếu khí nên khi cung cấp nhiều oxy hơn thì chúng sinh sản và phát triển mạnh hơn). Kết quả xử lí thống kê cũng cho thấy rằng có sự khác biệt về số lượng vi khuẩn giữa các khoảng thời gian nuôi cấy (12 giờ, 18 giờ và 24 giờ) (với P<0,05). Qua bảng kết quả, khi nuôi cấy vi khuẩn Bacillus subtilis sau 24 giờ ở chế độ nuôi cấy lắc thì cho số lượng tế bào vi khuẩn là 11,16 (giá trị logarit) cao hơn ở các mức thời gian 12 giờ, 18 giờ (10,15; 11,07). Vì vậy, chúng tôi quyết định chọn chế độ nuôi cấy lắc để khảo sát số lương vi khuẩn trong các loại môi trường nuôi cấy khác nhau ở thí nghiệm tiếp theo. 4.2.2. Khảo sát môi trƣờng và thời gian nuôi cấy thích hợp Từ kết quả của thí nghiệm 1, chúng tôi tiến hành nuôi cấy để xác định số lượng vi khuẩn trên 4 loại môi trường:  TSB.  TSB + 1% glucose.  TSB + 1% cao nấm men.  TSB + 1% glucose + 1% cao nấm men. Ở điều kiện 37oC, nuôi cấy lắc (15 phút lắc, 45 phút nghỉ) với tỉ lệ giống 2%. Đếm số lượng vi khuẩn bằng phương pháp đỗ đĩa vào các thời điểm: 24 giờ, 36 giờ và 48 giờ (thí nghiệm được lặp lại 2 lần). Kết quả thí nghiệm được trình bày qua Bảng 4.2 và Biểu đồ 4.2. Bảng 4.2. Ảnh hƣởng của môi trƣờng và thời gian nuôi cấy đến số lƣợng vi khuẩn Bacillus subtilis Thời gian (giờ) Môi trường TSB TSB + 1% glucose TSB+ 1% cao nấm men TSB+1% glucose+ 1% cao nấm men X 24 11,08 11,25 11,32 11,28 11,23 36 11,19 11,36 11,40 11,37 11,33 48 11,30 11,44 11,49 11,46 11,43 X 11,19 11,35 11,4 11,37 (Số lượng vi khuẩn /ml tính theo logarit) 27 0 2 4 6 8 10 12 14 24 36 48 Thời gian (giờ) Số lƣợng vi khuẩn (Tính theo logarit) TSB TSB+1%glucose TSB+1%cao nấm men TSB+1%glucose+1%cao nấm men Biểu đồ 4.2. Ảnh hƣởng của thời gian và môi trƣờng nuôi cấy đến số lƣợng vi khuẩn Bacillus subtilis Qua kết quả trình bày ở Bảng 4.2 cho thấy số lượng vi khuẩn trung bình trong 1ml canh khuẩn của môi trường TSB + 1% cao nấm men là 11,4 (giá trị logarit) (số thực tế là 25,19.1010) cao hơn số lượng vi khuẩn trung bình trong 1 ml canh khuẩn của các môi trường TSB, TSB + 1% glucose và TSB + 1% glucose + 1% cao nấm men. Và số lượng vi khuẩn trung bình ở thời gian nuôi cấy 48 giờ là 11,43 (giá trị logarit) (số thực tế 26,6.1010) cao hơn số lượng vi khuẩn trung bình trong 1ml canh khuẩn khi nuôi cấy ở các mức thời gian khác. Kết quả xử lí thống kê cho thấy không có sự khác biệt giữa 3 loại môi trường TSB, TSB + 1% glucose và TSB + 1% glucose + 1% cao nấm men. Nhưng có sự khác biệt giữa môi trường TSB với 3 loại môi trường trên. Kết quả xử lí thống kê cũng cho thấy có sự khác biệt về số lượng vi khuẩn giữa các khoảng thời gian nuôi cấy (24 giờ, 36 giờ và 48 giờ) với (P<0,05). Từ kết quả trên, chúng tôi chọn môi trường TSB + 1% cao nấm men và thời gian nuôi cấy 48 giờ để khảo sát các thí nghiệm tiếp theo. 4.2.3. Khảo sát pH, thời gian và nhiệt độ nuôi cấy vi khuẩn thích Từ kết quả của các thí nghiệm 1 và 2, chúng tôi tiến hành nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường TSB + 1% cao nấm men ở 2 mức pH (7 và 7,5) trong điều kiện 37oC, nuôi cấy lắc (15 phút lắc,45 phút nghỉ) với tỉ lệ cấy giống 2% (thí nghiệm lặp lại 2 lần). 28 Đếm số lượng vi khuẩn sau thời gian nuôi cấy bằng phương pháp đỗ đĩa. Kết quả được trình bày ở Bảng 4.3 . Bảng 4.3. Ảnh hƣởng của pH, nhiệt độ và thời gian nuôi cấy đến số lƣợng vi khuẩn Bacillus subtilis Thời gian (giờ) pH 7,0 7,5 Nhiệt độ phòng 37oC Nhiệt độ phòng 37oC 24 10,83 11,37 10,85 11,25 36 10,96 11,45 10,92 11,33 48 11,05 11,54 11,00 11,40 X 10,95 11,45 10,93 11,33 (Số lượng vi khuẩn/ml tính theo logarit) Qua kết quả Bảng 4.3 cho thấy số lượng vi khuẩn trung bình trong 1ml canh khuẩn ở pH = 7 và nhiệt độ 37oC là 11,45 (giá trị logarit) (giá trị thực tế 28,18.1010) cao hơn số lượng vi khuẩn trung bình ở các điều kiện khác (pH = 7 ở nhiệt độ phòng, pH = 7,5 ở nhiệt độ phòng và pH = 7,5 ở 37oC). Qua kết quả xử lý thống kê cho thấy có sự khác biệt giữa các điều kiện nuôi cấy trên, sự khác biệt này có ý nghĩa về mặt thống kê (P<0,05). 0 2 4 6 8 10 12 14 24 36 48 Thời gian (giờ) Số lƣợng vi khuẩn (tí theo logarit) pH 7, nhđộ phòng pH 7, 37 độ C pH 7.5, nhđộ phòng pH 7.5, 37 độ C Biểu đồ 4.3. Ảnh hƣởng của pH, nhiệt độ và thời gian nuôi cấy đến số lƣợng vi khuẩn Bacillus subtilis 29 Kết quả xử lý thống kê cũng cho thấy rằng có sự khác biệt về số lượng vi khuẩn giữa các khoảng thời gian nuôi cấy (24 giờ, 36 giờ và 48 giờ) (P<0,05). Vậy khi nuôi cấy vi khuẩn Bacillus subtilis trong môi trường có pH = 7, ở nhiệt độ 37oC trong 24 giờ cho số lượng tế bào vi khuẩn cao nhất. 4.2.4. Các thí nghiệm về bào tử Bacillus subtilis 4.2.4.1. Khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ đến sự hình thành bào tử của Bacillus subtilis Từ kết quả của các thí nghiệm 1, 2 và 3,chúng tôi tiến hành nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường TSB + 1% cao nấm men, pH = 7, ở trong điều kiện 37oC, nuôi cấy lắc (15 phút lắc, 45 phút nghỉ), thời gian nuôi cấy là 48 giờ. Sau 48 giờ nuôi cấy, chúng tôi tiến hành xử lí nhiệt độ (50oC và 70oC). Lần lượt đếm số lượng bào tử vi khuẩn hình thành sau 3 giờ, 5 giờ, 7 giờ xử lí bằng phương pháp đếm khuẩn lạc (thí nghiệm được lặp lại 2 lần). Kết quả được trình bày ở Bảng 4.4 và Biểu đồ 4.4. Bảng 4.4. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến sự hình thành bào tử vi khuẩn B. subtilis Thời gian (giờ) Nhiệt độ (oC) X 37 50 70 0 5,65 5,65 5,65 5,65 3 5,81 5,9 5,92 5,87 5 6,37 6,97 6,85 6,73 7 7,12 8,75 8,81 8,23 X 6,22 6,82 6,81 (Số lượng vi khuẩn/ml tính theo logarit) Qua kết quả của chúng tôi được trình bày ở Bảng 4.4, số lượng bào tử hình thành trung bình trong 1 ml canh khuẩn sau khi xử lí 50oC là 6,82 (giá trị logarit) (số thực tế là 6,6.106 bào tử/1ml) cao hơn số lượng bào tử hình thành trung bình trong 1 ml canh khuẩn sau khi xử lí 70oC và đối chứng (37oC). Qua kết quả xử lý thống kê cho thấy có sự khác biệt khi xử lý nhiệt độ (50oC, 70 o C) so với không xử lý (37oC) và sự khác biệt này có ý nghĩa về mặt thống kê (P< 0,05). Tuy nhiên, kết quả xử lý thống kê cũng cho thấy khi xử lý nhiệt độ 50oC và 70 o C thì sự khác biệt không có ý nghĩa (P>0,05). 30 0 2 4 6 8 10 0 3 5 7 Thời gian (giờ) Số lƣợng vi khuẩn (tính theo logarit) 37 độ C 50 độ C 70 độ C Biểu đồ 4.4. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến sự hình thành bào tử của vi khuẩn B. subtilis Qua Bảng 4.4 cũng thấy được số lượng bào tử hình thành tăng dần qua thời gian xử lí, số lượng bào tử trung bình sau 7 giờ xử lí là 8,81 (giá trị logarit) (số thực tế 64,5.10 7 ) cao hơn số lượng bào tử trung bình ở 3 giờ và 5 giờ xử lí nhiệt độ. Kết quả xử lí thống kê cho thấy có sự khác biệt giữa các khoảng thời gian xử lí nhiệt độ (3 giờ, 5 giờ và 7 giờ), sự khác biệt này có ý nghĩa về mặt thống kê (P<0.05) Từ kết quả của thí nghiệm, chúng tôi thấy rằng khi xử lý nhiệt độ (50oC, 70oC) có ảnh hưởng đến sự hình thành bào tử theo thời gian. Có thể, do thời gian xử lý nhiệt độ và theo dõi ngắn nên không thấy được sự tác động khác nhau của 2 mức nhiệt độ này. 4.2.4.2. Khảo sát ảnh hƣởng của pH đến sự hình thành bào tử của vi khuẩn Bacillus subtilis Chúng tôi tiến hành nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường TSB + 1% cao nấm men, pH = 7, ở trong điều kiện 37oC, nuôi cấy lắc (15 phút lắc, 45 phút nghỉ), nuôi cấy trong thời gian 48 giờ. Sau 48 giờ nuôi cấy, chúng tôi tiến hành xử lí pH (pH = 6 và pH = 9). Lần lượt đếm số lượng bào tử vi khuẩn hình thành sau 3 giờ, 5 giờ, 7 giờ xử lí bằng phương pháp đếm khuẩn lạc. 31 Bảng 4.5: Ảnh hƣởng của pH đến sự hình thành bào tử của vi khuẩn B. subtilis Thời gian (giờ) pH X 7 6 9 0 5,49 5,49 5,49 5,49 3 5,9 6,03 5,99 5,97 5 6,17 6,75 6,9 6,61 7 6,98 8,41 8,35 7,91 X 6,14 6,78 6,68 (Số lượng vi khuẩn/ml tính theo logarit) Qua kết quả Bảng 4.5, cho thấy số lượng bào tử hình thành trung bình trong 1ml canh khuẩn sau khi xử lí pH = 6 là 6,78 (giá trị logarit) (số thực tế là 6,03.106 bào tử/1ml) cao hơn sau khi xử lí pH = 9 và đối chứng (pH = 7). Kết quả xử lý thống kê cho thấy có sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê giữa việc xử lý pH và không xử lý pH đến sự hình thành bào tử. Nhưng khi xử lý pH = 6 và pH = 9 thì lại có sự khác biệt không có ý nghĩa về mặt thống kê (P> 0,05). Bảng kết quả cũng cho thấy số lượng bào tử vi khuẩn hình thành tăng dần theo thời gian, số lượng bào tử hình thành trung bình sau 7 giờ xử lí là 7,91 (giá trị logarit) (số thực tế là 8,13.107) cao hơn số lượng bào tử trung bình ở 3 và 5 giờ xử lí. Qua kết quả xử lí thống cũng cho thấy có sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê giữa các mức thời gian xủ lí pH (3 giờ, 5 giờ và 7 giờ). Từ kết quả trên, chúng tôi nhận thấy có sự tác động trong việc xử lí pH (pH6, pH9) đến sự hình thành bào tử theo thời gian , tuy nhiên lại không thể nhận thấy sự khác nhau trong tác động khác nhau giữa hai mức pH này. Có thể, do thời gian xử lí và theo dõi của chúng tôi ngắn nên không thể nhận thấy được sự tác động khác nhau của hai mức pH này. Qua hai bảng kết quả Bảng 4.4 và Bảng 4.5, chúng tôi so sánh thấy có sự khác biệt về số lượng bào tử trung bình khi xử lí bào tử bằng nhiệt độ so với xử lí bằng pH. Tuy nhiên kết quả xử lí thống kê cho thấy giữa hai cách xử lí bào tử có sự khác biệt không có ý nghĩa về mặt thống kê. 32 0 2 4 6 8 10 0 3 5 7 Thời gian (giờ) Số lƣợng vi khuẩn (tính theo logarit) pH 7 pH 6 pH 9 Biểu đồ 4.5. Ảnh hƣởng của pH đến sự hình thành bào tử của vi khuẩn B. subtilis 33 PHẦN V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận Sau thời gian thực hiện đề tài chúng tôi đã rút ra những kết luận sau: Đặc điểm sinh học, sinh hoá của vi khuẩn Bacillus subtilis do phòng thí nghiệm vi sinh khoa Chăn nuôi Thú y cung cấp cho thấy các đặc điểm về hình thái nuôi cấy và phản ứng sinh hoá phù hợp. Khảo sát ảnh hưởng của chế độ nuôi cấy tĩnh và nuôi cấy lắc (15 phút lắc, 45 phút nghỉ) thì chế độ nuôi cấy lắc cho số lượng vi khuẩn cao hơn. Khảo sát ảnh hưởng của 4 loại môi trường khác nhau (TSB, TSB + 1% glucose, TSB + 1% cao nấm men, TSB + 1% glucose + 1% cao nấm men) thì môi trường TSB cho số lượng vi khuẩn thấp nhất, 3 môi trường còn lại là những môi trường phù hợp cho Bacillus subtilis phát triển. Khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường (pH 7 và 7,5), thời gian (24,36 và 48 giờ) và nhiệt độ nuôi cấy (nhiệt độ phòng, 37oC) thì ở pH 7, thời gian 48 giờ và nhiệt độ nuôi cấy 37oC cho số lượng vi khuẩn lớn nhất. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ (50, 70), pH (6, 9) và thời gian xử lí (3, 5 và 7 giờ) đến sự hình thành bào tử thì khi xử lí ở các nhiệt độ và pH này có sự ảnh hưởng đến quá trình hình thành bào tử của vi khuẩn Bacillus subtilis. 5.2. Đề nghị Khảo sát thêm nhiều chủng vi khuẩn Bacillus subtilis để chọn chủng có khả năng phát triển mạnh. Khảo sát thêm nhiều loại môi trường, nhiệt độ, pH và thời gian nuôi cấy để xác định điều kiện thích hợp cho vi khuẩn Bacillus subtilis phát triển. Khảo sát thêm nhiều điều kiện xử lý bào tử để tìm được điều kiện thích hợp cho sự hình thành bào tử của vi khuẩn Bacillus subtilis. ` 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT 1. Nguyễn Đức Duy Anh, 2005. Phân lập và khảo sát một số đặc điểm của vi khuẩn Lactobacillus acidophilus và Bacillus subtilis. LVTN, bộ môn công nghệ sinh học, Trường Đại Học Nông Lâm Tp.HCM. 2. Tô Minh Châu, 2000. Giáo rình thực tập vi sinh vật học.. 3. Nguyễn Lân Dũng, 1983. Thực tập vi sinh vật. Nhà xuất bản đại học và trung học chuyên nghiệp Hà Nội. 4. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đăng Đức, Đặng Hồng Nguyên, Phạn Văn Ty, Nguyễn Vĩnh Phước, Nguyễn Phùng Tiến, 1976. Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học tập I, II, III. Nhà xuất bản Khoa học kỹ thuật. 5. Nguyễn Văn Đông, 1993. Khảo sát một số tính chất của vi khuẩn Bacillus subtilis dùng sản xuất chế phẩm Biosubtyl phòng và trị bệnh tiêu chảy cho heo con. Luận văn tốt nghiệp khó Chăn Nuôi Thú y, trường Đại Học Nông Lâm Tp.HCM. 6. Nguyễn Ngọc Hải, Tô Minh Châu, 2001. Giáo trình thực tập vi sinh. Tủ sách trường Đại Học Nông Lâm Tp.HCM. 7. Lý Kim Hữu, 2005. Khảo sát đặc điểm của Bacillus subtilis và tìm hiểu điều kiện nuôi cấy thích hợp sản xuất thử nghiệm chế phẩm probiotic LVTN, khoa Chăn nuôi Thú y, trường Đại Học Nông Lâm Tp.HCM. 8. Nguyễn Đức Lượng, 2001. Công nghệ sinh học. NXB ĐH Quốc gia Tp.HCM 9. Lê Minh Cẩm Ngọc, 2005. Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ chế phẩm probiotic, tìm hiểu môi trường nuôi cấy thích hợp và sản xuất thử nghiệm. LVTN, khoa Chăn nuôi Thú y , trường Đại Học Nông Lâm Tp>HCM. 10. Vũ Văn Ngữ, 1978. Loạn khuẩn đường ruột và tác dụng của Colisubtin. Nhà xuất bản y học Hà Nội . 11. Lương Đức Phẩm. 1998. Công nghệ vi sinh vật . NXB Nông nghiệp Hà Nội. 12. Lương Dức Phẩm, Hồ Xướng, 1978. Vi sinh tổng hợp. NXB KH tổng hợp. 35 TIẾNG NƢỚC NGOÀI 13. www.microscopyconsulting.com/ Gallery/pages/Ba... 14. www.techno-science.net/ ?onglet=glossaire&defi... 15. www.mbc.ntu.edu.tw/ faculty/teachers/LeeKT1.htm 16. www.biol.lu.se/cellorgbiol/ membprot/pop_sv.html 17. www.answers.com/ topic/bacillus-1 18. www.foodnews.ch/.../ Begriffsglossar_B.html 19. www.cat.cc.md.us/.../ labmanua/lab2/bscolony.html 20. micro.med.harvard.edu/ faculty/rudner.html 36 PHỤ LỤC 1. Thành phần môi trƣờng 1.1. Môi trƣờng Trypticase Soya Agar (TSA) Soya peptone 15g Tryptone peptone 5g Agar 18g Nước cất 1000ml pH 7,3 ± 0,2 Cân 30g môi trường TSB + 18g agar, hoà tan vào 1000ml nước cất, đun sôi cho hoà tan. Đem hấp tiệt trùng ở 121oC trong 20 phút. 1.2. Môi trƣờng Trypticase Soya Broth (TSB) Soya pepton 15g Tryptone pepton 5g Nacl 5g Nước cất 1000ml pH 7,3 ± 0,2 Cân 30g bột môi trường TSB hoà tan vào 1000ml nước cất, đun sôi cho hoà tan.Đem hấp khử trùng ở 121oC trong 20 phút. 1.3. Môi trƣờng lên men các loại đƣờng Cao thịt 5g Pepton bột 10g Đường 10g Phenol red 0,01g Nước cất 1000ml pH 7,4 ± 0,2 Hấp khử trùng 121oC trong 10 phút. 1.4. Môi trƣờng Simmons Citrate Agar Sodium citrate 2g K2PO4 1g MgSO4 0,2g Brothynol blue 0,08g NaCl 5g NH4H2PO4 1g Agar 18g pH 6,9 ± 0,2 1.5. Môi trƣờng Starch Agar (Tinh bột) Nutrien Agar 23g Tinh bột tan 10g Nước cất 1000ml pH 7,4 ± 0,2 1.6. Môi trƣờng Trypticase Soya Agar (TSB) + 1 % glucose Soya pepton 15g Tryptone pepton 5g Glucose 10g Nacl 5g Nước cất 1000ml pH 7,3 ± 0,2 Cân 30g bột môi trường TSB và 10g glucose hoà tan vào 1000ml nước cất, đun sôi cho hoà tan.Đem hấp khử trùng ở 121oC trong 10 phút 37 1.7. Môi trƣờng Trypticase Soya Broth (TSB) + 1% cao nấm men Soya pepton 15g Tryptone pepton 5g Cao nấm men 10g Nacl 5g Nước cất 1000ml pH 7,3 ± 0,2 Cân 30g bột môi trường TSB và 10g cao nấm men hoà tan vào 1000ml nước cất, đun sôi cho hoà tan.Đem hấp khử trùng ở 121oC trong 20 phút 1.8. Môi trƣờng Trypticase Soya Broth (TSB) + 1% glucose + 1% cao nấm men Soya pepton 15g Tryptone pepton 5g Glucose 10g Cao nấm men 10g Nacl 5g Nước cất 1000ml pH 7,3 ± 0,2 Cân 30g bột môi trường TSB hoà tan vào 1000ml nước cất, đun sôi cho hoà tan.Đem hấp khử trùng ở 121oC trong 10 phút 1.9. Môi trƣờng MR - VP Broth Môi trƣờng 1: Buffered peptone-water powder Difco hoặc BBL 7g Glucose 5g K2HPO4 5g Nước cất 1000ml Môi trƣờng 2 Casein Pancreatic Digesr 3.5g Peptic digest of animal tissue 3.5g Dextrose 5g Potassium phosphate 5g Nước cất 1000ml Hoà tan các thành phần trong nước, làm nóng nhẹ nêu cần.Phân phối vào các ống nghiệm và hấp vô trùng ở 121oC trong 15 phút. pH cuối là 6,9 + 0,2. Môi trƣờng 3 Peptone 5g Glucose 5g Phosphat buffer 5g Nước cất 1000ml Hoà tan các thành phần trong nước. Phân phối 10ml vào các ống nghiệm và hấp vô trùng ở 121oC trong 15 phút. pH cuối là 7,5 + 0,2. 2.Hoá chất 2.1.Nƣớc muối sinh lý 9 ‰ NaCl 9g Nước cất 1000ml 2.2.HCl 1% HCl đđ 10ml Nước cất 1000ml 2.3. NaOH 1% NaOH đđ 10ml Nước cất 1000ml 38 2.4. Dung dịch Iod 0,2N Cân 2g KI hoà tan trong 3ml nước, lắc đều cho tan, thêm nước cất vào cho đủ 100ml. 3.Thuốc thử và chất chỉ thị màu 3.1.Thuốc thử Catalase Dung dịch 3% H2O2 (Hydogen peroxide) 3.2.Thuốc thử Methyl Red Methyl Red 0,1g Ethanol 95% 300ml Nước cất (vừa đủ) 500ml Hòa tan đỏ methyl vào 300ml ethanol. Thêm nước cất vào cho đủ 500ml 4.Thuốc nhuộm 4.1.Crystal violet a. Crystal violet 0,4g Cồn 96 10ml b. Phenol 1g Nước cất 100ml Trộn hai dung dịch a và b lại với nhau, khuấy cho tan đều rồi đem lọc. Dung dịch thuốc nhuộm luôn được bảo quản trong chai màu để tránh ánh sáng. 4.2. Lugol KI 2g Iod tinh thể 1g Nước cất 300ml Hoà 2g KI vào 5ml nước , sau đó thêm 1g Iod,chờ cho Iod tan hết rồi mới thêm nước cất vừa đủ 300ml 4.3. Fuschine kiềm loãng a. Fuschine kiềm 0,3g Cồn 96o 10ml b Phenol 5g Nước cất 35ml Trộn dung dịch a với dung dịch baïn cho hoà tan. Đem bảo quản trong chai màu. 5.Thử các phản ứng sinh hoá 5.1. Kiểm tra khả năng lên men đƣờng Chuẩn bị Môi trường đường: glucose, maltose, saccharose, lactose. Giống vi khuẩn Bacilius subtili Ống nghiệm, ống durham. Tiến hành Cho vào mỗi ống nghiệm một ống durham, đem hấp khử trùng ở 121oC trong 10 phút. Sau đó cấy vi khuẩn vào môi trường môi trường, đem ủ ở 37oC/24 giờ. Quan sát sự đổi màu, sinh hơi. Nếu vi khuẩn có khả năng lên men đường thì đường sẽ bị lên men rượu, rượu hoá acid làm pH môi trường giảm làm chuyển màu môi trường. Kết quả Phản ứng (-): môi trường có màu hồng đỏ. Phản ứng (+): môi trường có màu vàng. 5.2.Thử phản ứng Catalase Chuẩn bị Dung dịch H2O2 30%. Lame. 39 Giống vi khuẩn Bacillus subtilis. Tiến hành Dùng pipete lấy một ít vi khuẩn phết lên giữa lame kính sạch và khô. Sau đó nhỏ giọt H2O2 30% lên vết vi khuẩn. Đọc kết quả sau khoảng 15 giây. Kết quả Phản ứng (-): không có hiện tượng sủi bọt. Phản ứng (+): Có hiện tượng sủi bọt. 5.3. Kiểm tra khả năng sinh Indol Chuẩn bị Môi trường TSB. Thuốc thử Kovacc Giống vi khuẩn Bacillus subtilis Tiến hành Cấy vi khuẩn vào môi trường TSB, nuôi cấy ở 37oC trong 24 giờ. Sau đó nhỏ vài giọt thuốc thử Kovacc vào môi truờng và đọc kết quả. Kết quả Phản ứng (-): Lớp mặt có màu vàng. Phản ứng (+): Lớp mặt có màu đỏ. 5.4. Phản ứng VP (Voges Proskauer) Chuẩn bị Giống vi khuẩn Bacillus subtilis. Môi trường Clark Lubs. Alpha-naphtol 10%, NaOH 40%. Tiến hành Dùng que cấy vòng lấy vi khuủân vào môi trường Clark Lubs, nuôi ở nhiệt độ 37oC trong 24 giờ. Sau đó nhỏ 3-5 giọt NaOH 40% và 3-5 giọt alpha-naphtol 10%. Sau 15 phút đọc kết quả. Kết quả Phản ứng VP (-): Môi trường có màu vàng. Phản ứng VP (+): Môi trường có màu đỏ. 5.5. Phản ứng Methyl-Red Chuẩn bị Môi trường Clark Lubs Thuốc thử Methyl-Red Giống vi khuẩn Bacillus subtilis Tiến hành Dùng que cấy vòng lấy vi khuẩn vào môi trường Clark Lubs, nuôi ở 37oC trong 24 giờ. Sau đó nhỏ 2-3 giọt thuốc thử Methyl-Red vào canh khuẩn va đọc kết quả. Kết quả Phản ứng (-): Môi trường có màu vàng. Phản ứng (+): Môi trường có mau đỏ. 5.6.Phản ứng khử Nitrate (NO3) Chuẩn bị Môi trường Nitrate. Dung dịch thuốc thử Giess A, Giess B. Giống vi khuẩn Bacillus subtilis. Tiến hành Dùng que cấy lấy vi khuẩn vào môi trường thạch Nitrate bán lỏng, nuôi ở 37oC. Sauu 24 giờ, nhỏ vào môi trường 2-3 giọt Giess A, sau đó nhỏ tiếp 2-3 giọt Giess B. Kết quả Phản ứng (-): Môi trường có màu vàng. 40 Phản ứng (+): Môi trường có màu đỏ. 5.7.Khả năng sử dụng Citrate. Chuẩn bị Giống vi khuẩn Bacillus subtilis. Môi trường Citrate. Tiến hành Cấy vi khuẩn vào môi trường citrate, nuôi ở 37oC trong 24 giờ. Kết quả Phản ứng (-): Môi trường có màu xanh lá mạ non. Phản ứng (+): Môi trường có nàu xanh dương. 6.Phƣơng pháp nhuộm Gram Cố định tiêu bản. Đặt giấy lọc lên vết bôi. Nhuộm Crystal violet trong 1 – 2 phút. Rửa nước. Cố định Lugol trong 1 phút. Rửa nước. Tẩy cồn 90o trong 15 giây. Rửa nước. Nhuộm Fuschine kiềm loãng trong 1 phút. Rửa nước. Châm khô, soi kính hiển vi. 7. Phƣơng pháp nhuộm bào tử Cố định tiêu bản. Nhỏ dung dịch HCl 1% lên vếta bôi trong 1– 2 phút. Rửa nước. Đặt giấy lọc lên vết bôi. Nhỏ Fuschine đậm đặc, hơ nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn trong 2– 4 phút. Bỏ giấy lọc, rửa nước. Nhúng vào cồn 96o cho đén khi có màu hồng không phai. Rửa nước. Nhỏ dung dịch Xanh Methylene trong 1- 2 phút. Rửa nước. Châm khô, đem soi kính. Công thức tính số lượng vi khuẩn bằng vết bôi: A = a x N x H x B Trong đó: A: Tổng số vi sinh vật có trong 1 ml dịch. a = n ai : Số vi sinh vật trung bình có trong 1 hiển vi trường. ai: Số vi sinh vật có trong mỗi hiển vi trường. n: Số hiển vi trường. H = 1/Độ pha loãng: Hệ số pha loãng. B = 1/V: Hệ số thể tích (1 ml). V: Thể tích làm vết bôi. 8. Phƣơng pháp đếm khuẩn lạc Chuẩn bị các đĩa môi trường TSA đã hấp tiệt trùng và để khô mặt thạch. Lấy 1 ml dịch vi khuẩn cần đếm pha loãng ở nhiều nồng độ liên tiếp nhau (theo phương pháp pha loãng thập phân) bằng dung dịch nước muối sinh lí. Cấy trang 0,1 ml dịch pha loãng lên môi trường TSA (mỗi nồng độ trang 2 đĩa), ủ ở 37oC trong 24 giờ. Đem đếm số lượng vi khuẩn. 41 Đếm số lƣợng bào tử bằng phƣơng pháp đếm khuẩn lạc: Lấy dịch nuôi cấy vi khuẩn pha loãng xử lí tế bào sinh dưỡng bằng cách đun ở 100oC trong 1 giờ, sau đó thực hiện các bước tiếp theo như trên. Tính kết quả *Số khuẩn lạc trong 1g mẫu hay 1 ml dịch mẫu ở mỗi độ pha loãng. Công thức: X = Vh A 11 Trong đó: X: Số lượng vi khuẩn trong 1g mẫu hay 1 ml dịch mẫu. A: Số khuẩn lạc trung bình có trong đĩa (trong tổng số 2 đĩa có cùng nồng độ pha loãng). h: Độ pha loãng tứ (10-7, 10-8, 10-9, …). V: Thể tích dịch mẫu cấy lên một đĩa. *Số khuẩn lạc trung bình trong 1g mẫu hay 1 ml dịch mẫu ở 3 độ pha loãng liên tiếp nhau: Công thức: Y = 3 321 XXX Trong đó: Y: Số khuẩn lạc trung bình ở các độ pha loãng. X1, X2, X3: Số khuẩn lạc trung bình có trong 1g mẫu hay 1 ml dịch mẫu ở mỗi nồng độ pha loãng. Ảnh hưởng của môi trường và thời gian nuôi cấy đến số lượng vi khuẩn Analysis of Variance for So luong - Type III Sums of Squares --------------------------------------------------------------------------- -- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level --------------------------------------------------------------------------- -- MAIN EFFECTS A:thoi gian .0814333 2 .0407167 11.258 .0018 B:moi truong .1736500 3 .0578833 16.005 .0002 INTERACTIONS AB .0023000 6 3.83333E-004 .106 .9941 RESIDUAL .0434000 12 .0036167 --------------------------------------------------------------------------- -- TOTAL (CORRECTED) .3007833 23 -------------------------------------------------------------------------- Multiple range analysis for So luong by moi truong --------------------------------------------------------------------------- -- Method: 95 Percent LSD Level Count LS Mean Homogeneous Groups --------------------------------------------------------------------------- -- 1 6 11.170000 X 2 6 11.320000 X 4 6 11.363333 X 3 6 11.390000 X --------------------------------------------------------------------------- -- contrast difference limits 1 - 2 -0.15000 0.07567 * 1 - 3 -0.22000 0.07567 * 1 - 4 -0.19333 0.07567 * 2 - 3 -0.07000 0.07567 2 - 4 -0.04333 0.07567 3 - 4 0.02667 0.07567 --------------------------------------------------------------------------- denotes a statistically significant difference. Multiple range analysis for so luong by thoi gian --------------------------------------------------------------------------- -- Method: 95 Percent LSD Level Count LS Mean Homogeneous Groups --------------------------------------------------------------------------- - 24 8 11.250000 X 36 8 11.318750 X 48 8 11.390000 X --------------------------------------------------------------------------- -- contrast difference limits 24 - 36 -0.06875 0.06087 * 24 - 48 -0.14000 0.06087 * 36 - 48 -0.07125 0.06087 * * denotes a statistically significant difference. Ảnh hưởng của chế độ và thời gian nuôi cấy đến số lượng vi khuẩn Analysis of Variance for so luong - Type III Sums of Squares --------------------------------------------------------------------------- ----- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level MAIN EFFECTS A: che do 6.5121333 1 6.5121333 89.617 .0001 B: thoi gian 2.8972667 2 1.4486333 19.935 .0022 INTERACTIONS AB .0480667 2 .0240333 .331 .7307 RESIDUAL .4360000 6 .0726667 TOTAL (CORRECTED) 9.8934667 11 -------------------------------------------------------------------------- Multiple range analysis for so luong by che do nuoi cay Method: 95 Percent LSD Level Count LS Mean Homogeneous Groups 2 6 9.386667 X 1 6 10.860000 X contrast difference limits 1 - 2 1.47333 0.38094 * --------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. Ảnh hưởng của pH, thời gian và nhiệt độ nuôi cấy đến số lượng vi khuẩn Analysis of Variance for so luong - Type III Sums of Squares Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level MAIN EFFECTS A:Thgian .0417000 2 .0208500 .750 .4931 B:pH .4160667 1 .4160667 14.975 .0022 C:Nhdo .5890667 1 .5890667 21.202 .0006 INTERACTIONS AB .2186333 2 .1093167 3.935 .0485 AC .4426333 2 .2213167 7.966 .0063 BC .1802667 1 .1802667 6.488 .0256 ABC .3606333 2 .1803167 6.490 .0123 RESIDUAL .3334000 12 .0277833 TOTAL (CORRECTED) 2.5824000 23 Multiple range analysis for so luong by pH Method: 95 Percent LSD Level Count LS Mean Homogeneous Groups 7.5 12 10.913333 X 7 12 11.176667 X contrast difference limits 7 - 7.5 0.26333 0.14830 * * denotes a statistically significant difference. Multiple range analysis for so luong by nhdo Method: 95 Percent LSD Level Count LS Mean Homogeneous Groups 32 12 10.888333 X 37 12 11.201667 X contrast difference limits 32 - 37 -0.31333 0.14830 * * denotes a statistically significant difference. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng hình thành bào tử của vi khuẩn Analysis of Variance for so luong - Type III Sums of Squares --------------------------------------------------------------------------- -- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level --------------------------------------------------------------------------- -- MAIN EFFECTS A:thgian 4.8966667 3 1.6322222 333.107 .0000 B:nhietdo 1.7563000 2 .8781500 179.214 .0000 INTERACTIONS AB 21.991433 6 3.6652389 748.008 .0000 RESIDUAL .0588000 12 .0049000 ----------------------- --------------------------------------------------- ------ TOTAL (CORRECTED) 28.703200 23 --------------------------------------------------------------------------- -- Multiple range analysis for so luong by thgian xu li --------------------------------------------------------------------------- -- Method: 95 Percent LSD Level Count LS Mean Homogeneous Groups --------------------------------------------------------------------------- -- 0 6 6.1333333 X 3 6 6.2266667 X 5 6 6.9233333 X 7 6 7.1966667 X --------------------------------------------------------------------------- -- contrast difference limits 0 - 3 -0.09333 0.08808 * 0 - 5 -0.79000 0.08808 * 0 - 7 -1.06333 0.08808 * 3 - 5 -0.69667 0.08808 * 3 - 7 -0.97000 0.08808 * 5 - 7 -0.27333 0.08808 * denotes a statistically significant difference. Table of Least Squares Means for XLNHDO1.sltb ------------------------------------------------------------------------------ -- 95% Confidence Level Count Average Stnd. Error for mean ------------------------------------------------------------------------------ -- GRAND MEAN 24 6.6200000 .0142887 6.5888596 6.6511404 A:thgian 0 6 6.1333333 .0285774 6.0710525 6.1956142 3 6 6.2266667 .0285774 6.1643858 6.2889475 5 6 6.9233333 .0285774 6.8610525 6.9856142 7 6 7.1966667 .0285774 7.1343858 7.2589475 B:nhietdo 37 8 6.2375000 .0247487 6.1835632 6.2914368 50 8 6.8175000 .0247487 6.7635632 6.8714368 70 8 6.8050000 .0247487 6.7510632 6.8589368 AB 0 37 2 5.6500000 .0494975 5.5421264 5.7578736 0 50 2 5.9000000 .0494975 5.7921264 6.0078736 0 70 2 6.8500000 .0494975 6.7421264 6.9578736 3 37 2 7.1200000 .0494975 7.0121264 7.2278736 ------------------------------------------------------------------------------ -- Ảnh hưởng của pH đến khả năng hình thành bào tử của vi khuẩn Analysis of Variance for so luong tbao - Type III Sums of Squares ------------------------------------------------------------------------------ -- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level ------------------------------------------------------------------------------ -- MAIN EFFECTS A:thgian 19.861200 3 6.6204000 185.272 .0000 B:pH 1.601200 2 .8006000 22.405 .0001 INTERACTIONS AB 1.6900000 6 .2816667 7.882 .0013 RESIDUAL .4288000 12 .0357333 ------------------------------------------------------------------------------ -- TOTAL (CORRECTED) 23.581200 23 ------------------------------------------------------------------------------ -- 0 missing values have been excluded. All F-ratios are based on the residual mean square error. Multiple range analysis for so luong by pH --------------------------------------------------------------------------- -- Method: 95 Percent LSD Level Count LS Mean Homogeneous Groups --------------------------------------------------------------------------- ----- 7 8 6.1350000 X 6 8 6.6700000 X 9 8 6.6950000 X --------------------------------------------------------------------------- -- contrast difference limits 6 - 7 0.53500 0.20599 * 6 - 9 -0.02500 0.20599 7 - 9 -0.56000 0.20599 * --------------------------------------------------------------------------- -- * denotes a statistically significant difference. Multiple range analysis for so luuong by thgian --------------------------------------------------------------------------- -- Method: 95 Percent LSD Level Count LS Mean Homogeneous Groups --------------------------------------------------------------------------- -- 0 6 5.4900000 X 3 6 5.9733333 X 5 6 6.6233333 X 7 6 7.9133333 X --------------------------------------------------------------------------- -- contrast difference limits 0 - 3 -0.48333 0.23785 * 0 - 5 -1.13333 0.23785 * 0 - 7 -2.42333 0.23785 * 3 - 5 -0.65000 0.23785 * 3 - 7 -1.94000 0.23785 * 5 - 7 -1.29000 0.23785 * --------------------------------------------------------------------------- -- * denotes a statistically significant difference.