Luận văn Khảo sát hệ vi khuẩn Methylobacterium sp. trên lúa (Oryza sativa L.) ở Tây Ninh

Từ các độ đục tiến hành pha loãng đến 10-5; 10-6; 10-7. Từ mỗi độ pha loãng cấy 0,1ml vào mỗi đĩa môi trường rắn CP. Ủ 300C trong 48 giờ đếm khuẩn lạc ở các đĩa có số khuẩn lạc trong khoảng 20 – 300. Tính số lượng tế bào trên ml mẫu bằng công thức: Ndi = A x 10 x di. Trong đó: - Ndi: số lượng tế bào ở độ pha loãng di - A: số khuẩn lạc đếm được trên đĩa. - d: số lần pha loãng i. Xây dựng đường tương quan tuyến tính giữa OD và log(N/ml) bằng phần mềm excel. + Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của vi khuẩn Mục đích: Nhằm xác định nhiệt độ thích hợp cho sử phát triển của các chủng đã phân lập phục vụ cho những nghiên cứu ứng dụng sau này. Vật liệu: Bốn chủng vi khuẩn đã phân nhóm ở những thí nghiệm trên được nuôi cấy trên môi trường cao-pep lỏng ở 20, 25, 30, 35, và 400C và đo OD ở bước sóng 610nm sau ba ngày. + Khảo sát ảnh hưởng của pH đến sự phát triển của vi khuẩn Mục đích: Nhằm xác định nhiệt độ và pH tối ưu cho sự phát triển của các chủng phân lập được để làm cơ sở cho những nghiên cứu ứng dụng sau này. Tiến hành: Cấy vi khuẩn vào các ống nghiệm chứa môi trường cao thịt-peptone lỏng với các khoảng pH từ 4,0 – 8,5 (cách nhau 0,5). Nuôi cấy lắc 100vòng/phút, sau ba ngày ghi nhận độ đục OD610nm. 3.2.6.7. Xác định đƣờng cong tăng trƣởng của vi khuẩn Nhằm xác định thời gian thích hợp để thu sinh khối và các hoạt chất do vi khuẩn tiết ra. Các chủng vi khuẩn được nuôi cấy lắc ở 250C trong môi trường CMS và tiến hành đo OD610nm 4 giờ/lần trong vòng 48 giờ. 3.3. Định danh vi khuẩn Mục tiêu này được thực hiện bằng các thí nghiệm sau: 3.3.1. Tính hệ số tƣơng đồng di truyền Hệ số tương đồng di truyền Jaccard (Sj) cho phép xác định mức độ giống nhau của hai loài vi khuẩn. Vì vậy, để xác định mối quan hệ họ hàng của các chủng 36 LM2, TS7, TN10 và TD15 với các loài Methylobacterium sp. đã được công bố thì việc tính toán hệ số di truyền Jaccard là cần thiết. Hệ số di truyền Jaccard được tình theo công thức sau: Sj = a/(a +b). Trong đó: a: tổng số các đặc điểm tương đồng của hai loài sinh vật b: tổng số các đặc điểm khác biệt giữa hai loài sinh vật. Hệ số Sj thay đổi trong khoảng từ 0 – 1 (0% - 100%). Nếu hai loài sinh vật có hệ số Sj lớn hơn 0,8 (80%) thì chúng có khả năng cùng một loài. 3.3.2. Ly trích DNA vi khuẩn Quy trình ly trích DNA bộ gen của các chủng Methylobacterium sp. theo quy trình của Rogers S.O. và ctv (1994), quy trình CTAB [78]. Bao gồm các bước sau:  Ly tâm thu sinh khối.  Bổ sung 600 l CATB nóng, vortex, ủ 650C trong 60 phút.  Ly tâm 13000 vòng/phút, trong 5 phút  thu dịch nổi.  Biến tính bằng 500 l dung dịch phenol – chloroform (1:1).  Ly tâm 13000 vòng/phút, 5 phút  thu dịch nổi.  Biến tính lần hai bằng 500 l dung dịch phenol – chloroform, lắc nhẹ.  Tủa DNA bằng 1ml cồn tuyệt đối lạnh, ly tâm 13000 vòng/phút ở 40C  thu tủa.  Ly tâm 13000 vòng/phút trong 30 phút ở 40C để thu tủa DNA.  Rửa tủa bằng 250 l cồn 700.  Phơi mẫu cho khô cồn.  Hòa tan tủa trong 20 l dung dịch TE 0,1X.  Bổ sung 20 l dung dịch RNase (1mg/ml), ủ 370 trong 60 phút.  Giữ ở 40C Sản phẩm DNA bộ gen đã ly trích được đánh giá tính nguyên vẹn khi điện di trên gel agarose 1% và độ tinh sạch được đánh giá thông qua tỷ số OD260nm/OD280nm. Sản phẩm DNA bộ gen ly trích bao gồm bốn chủng vi khuẩn Methylobacterium sp. đã phân nhóm và DNA chủng đối chứng là vi khuẩn E.coli. 37 3.3.3. Tiến hành phản ứng PCR. 3.3.3.1. Thành phần cho một phản ứng PCR.  Buffer 10X ................................................. 2,5 l  Mg++ 25mM ................................................ 1,5 l  dNTP 2mM ................................................. 2,5 l  Mồi xuôi (FPGS6 hay 2F) 10pmol/ l ........ 1 l  Mồi ngược (FPGS1509 hay 2R) 10pmol/ l 1 l  DNA khuôn ................................................. 0,5 l  Taq polymerase 1U/ l ................................ 0,5 l  Nước ............................................................ vừa đủ 25 l 3.3.3.2. Các primer sử dụng [9], [68] FPGS1509: 5` ... AAGGAGGGGATCCAGCCGCA...3`. FPGS6: 5`... GGAGAGTTAGATCTTGGCTCAG ...3` 2F: 5`... GATCGGCCCGCGTCTGATTAG ...3`. 2R: 5`... CCGTCATTATCGTCCCGGACA ...3`. Hình 3.1: Vị trí bắt cặp của các mồi trên vùng 16S rDNA. Để định danh các chủng vi khuẩn Methylobacterium sp. đã phân lập được chúng tôi tiến hành các phản ứng như sau: - Định tính vi khuẩn thuộc chi Methylobacterium bằng phản ứng PCR với cặp mồi 2R và 2F với sản phẩm tạo ra là đoạn DNA có kích thước khoảng 234bp. Với chu trình nhiệt như sau: 38 Hình 3.2: Chu trình nhiệt cho phản ứng với mồi 2F với 2R. - Khuếch đại trình tự rDNA 16S nguyên vẹn của vi khuẩn Methylobacterium phân lập được bằng cặp mồi FPGS6 và FPGS1509 và phối hợp sử dụng chung cặp mồi 2R và 2F. Với kích thước đoạn DNA tạo ra là khoảng 500base và 1200base. Với chu trình nhiệt như sau: Hình 3.3: Chu trình nhiệt cho phản ứng với cặp mồi FPGS6 với 2R và FPGS1509 với 2F 3.3.3.3. Điện di và xem kết quả. Sản phẩm sau khi khuếch đại bằng PCR được điện di trên gel agarose 2% ở điện thế 50V trong 40 phút. Sản phẩm điện di được ghi nhận bằng cách nhuộm ethidiumbromide và chiếu dưới đèn UV(ultra-violet). 3.3.4. Giải trình tự. Nhằm định danh chính xác và chi tiết hơn các chủng vi khuẩn Methylobacterium sp. đã phân lập được, nên chúng tôi tiến hành giải trình tự để so sánh với trình tự trên ngân hàng gen của NCBI (Mỹ). Trình tự DNA của sản phẩm PCR của vi khuẩn được đọc bằng phương pháp PCR trực tiếp tại Hàn Quốc. Trình tự DNA được đọc theo hai chiều xuôi và ngược. 39 Sản phẩm PCR của các chủng vi khuẩn có kích thước khoảng 500base và 1200 base được pha loãng với nước cất khử ion sau đó tiến hành phản ứng PCR cho mẫu pha loãng này nếu kết quả dương tính thì gởi mẫu pha loãng này để giải trình tự. 3.3.5. Xử lý kết quả giải trình tự. Kết quả giải trình tự được xử lý độ chính xác bằng phần mềm fastPCR, so sánh với trình tự trên ngân hàng gen bằng phần mềm BLAST, so sánh độ tương đồng của trình tự của các chủng so với các chủng đã công bố bằng phần mềm CluxtalX và dựng cây sinh loài bằng phần mềm Treeview. 3.4. Khảo sát khả năng tổng hợp các hợp chất thử cấp của vi khuẩn Theo các nghiên cứu của các tác giả trước cho rằng các loài Methylobacterium sp. có khả năng tổng hợp một số hợp chất có lợi nên chúng tôi tiến hành thử nghiệm khả năng sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp của vi khuẩn đã định danh. Mục tiêu này được tiến hành qua các thí nghiệm: 3.4.1. Định tính khả năng sinh tổng hợp auxin [16]. Mục tiêu: Sàn lọc các chủng có khả năng tổng hợp auxin để có thể ứng dụng chúng trong nuôi cấy in vitro và làm chế phẩm vi sinh dùng trong nông nghiệp và chế phẩm vi sinh cho cây lúa Phương pháp tiến hành: Khuẩn lạc nuôi trên môi trường MS có bổ sung 1% methanol cho giấy lọc vô trùng in trên bề mặt các khuẩn lạc vi khuẩn (sau 5 ngày nuôi cấy), ủ tiếp 2 ngày. Sau đó dùng những tấm giấy này áp lên tấm giấy lọc có thấm thuốc thử Salkowski (2,03g FeCl3.6H2O hoà tan trong 500ml nước và 300ml acid H2SO4 đậm đặc) hoặc Salkowski cải tiến (0,05 M FeCl3 trong dung dịch HClO4 35%) sấy 15 phút quan sát và ghi nhận sự xuất hiện màu tím xanh (với thuốc thử salkowski cải tiến). 3.4.2. Định tính khả năng sinh tổng hợp PHB [8]. Mục tiêu: Theo công trình nghiên cứu của J. U. Ackermann và ctv (1995), Trâm (2006), cho rằng một số chủng Methylobacterium sp. có khả năng sinh tổng hợp nhựa sinh học (PHB) nên chúng tôi tiến hành thí nghiệm định tính khả năng sinh tổng hợp PHB của các chủng đã phân lập nhằm sàng lọc sơ bộ các chủng có khả năng tổng hợp PHB. Vi khuẩn thí nghiệm: Bốn chủng vi khuẩn đã định danh trong thí nghiệm sinh hóa, sinh ly ở trên. 40 Phương pháp tiến hành: Lấy 1 – 2 giọt huyền phù sinh khối vi khuẩn (có OD600 khoảng 0,1) đặt lên tấm lam sạch. Hơ qua ngọn lửa đèn cồn nhiều lần để cố định tế bào trên lam. Nhuộm tế bào đã được cố định bằng một giọt phẩm nhuộm Nile Blue A trong 10 phút ở 550C. Sau khi nhuộm xong, phẩm thừa được rửa sạch bằng nước máy với bình xịt tia mạnh và sau đó rửa lại lần nữa với dung dịch acid acetic 8% trong 1 phút, dùng giấy thấm lau khô mẫu, cho một giọt nước lên lam đậy lamen lại. Mẫu sau khi xử lý được quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang ở bước sóng 460nm. Ở bước sóng ánh sáng này, các hạt PHB trong tế bào được nhuộm sẽ có màu cam sáng trên nền tế bào màu đen. 41 Phần IV: Kết quả và biện luận. 4.1. Kết quả phân lập và làm thuần Trong hai phương pháp phân lập vi khuẩn từ lá là Leaf print và tăng sinh chúng tôi nhận thấy rằng số khuẩn lạc thu được trong phương pháp tăng sinh nhiều hơn so với phương pháp Leaf print. Vì trong phương pháp Leaf print có sự nhiễm nấm cao. Theo Maliti (2000), cũng dùng phương pháp Leaf print để phân lập các chủng vi khuẩn Methylobacterium sp. trên lúa nhưng có bổ sung kháng sinh thì kết quả của phương pháp Leaf print cao hơn phương pháp tăng sinh. Từ đó, chúng tôi có thể khẳng định rằng để phân lập vi khuẩn Methylobacterium không bổ sung kháng sinh thì phương pháp phân lập qua quá trình tăng sinh là tốt nhất. Đối với các khuẩn lạc hình thành từ thí nghiệm Leaf print trên lá chúng tôi chọn tất cả các khuẩn lạc để làm thuần và các kuẩn lạc hình thành trên môi trường tăng sinh, môi trường nước và đất chúng tôi chỉ tiến hành chọn một số khuẩn lạc tiêu biểu để làm thuần. Trong tổng số ba loại mẫu: đất, nước và lá của ba vùng khác nhau đã phân lập và làm thuần được tổng số 26 dòng vi khuẩn và được tóm tắt trên bảng 4.1. Bảng 4.1: Danh sách các khuẩn lạc được phân lập và làm thuần. Số thứ tự Vùng phân lập Mẫu phân lập Ký hiệu 1 Trảng bàng (TB) Nước BN20 2 TB Nước BN21 3 TB Lá BS16 4 TB Lá BS17 5 TB Lá BS18 6 TB Đất BD11 7 TB Leaf print LB5 8 Truông mít (TM) Nước TN10 9 TM Nước TN12 10 TM Nước TN13 11 TM Lá TS6 12 TM Lá TS7 13 TM Lá TS8 14 TM Lá TS9 15 TM Leaf print (LP) LM1 42 16 TM LP LM2 17 TM LP LM3 18 TM LP LM4 19 TM Đất TD15 20 Gò dầu (GD) Nước GN19 21 GD Nước GN25 22 GD Lá GS22 23 GD Lá GS23 24 GD Lá GS24 25 GD Đất GD14 26 GD Đất GD26 Hình 4.1: Hình dạng tế bào quan sát dưới kính lúp. Tuy nhiên, các khuẩn lạc có nhiều đăc điểm giống nhau về màu sắc, hình dạng, kích thước. Vì vậy, chúng tôi tiến hành khảo sát các đặc điểm sinh lý, sinh hóa để phân nhóm sơ bộ các khuẩn lạc vi khuẩn này. 4.2. Kết quả khảo sát các đặc điểm sinh lý, sinh hóa 4.2.1. Kết quả thử nghiệm gram và đo kích thƣớc tế bào. Các chủng trong thí nghiệm có hai chủng bắt màu gram âm là TS7 và TD15 và phản ứng dương trong thử nghiệm String. Còn hai chủng LM2 và TN10 tùy vào thời gian thử nghiệm mà có thể bắt màu gram âm hay gram dương. Tuy nghiên, hai chủng này khi thử nghiệm gram bằng phương pháp String thì điều cho phản ứng dương. Từ đó chúng tôi cho rằng các hai chủng TS7 và TD15 là vi khuẩn gram âm còn hai chủng LM2 và TN10 là vi khuẩn gram âm biến đổi. Kết quả này phù hợp với những kết quả của các công trình nghiên cứu của Green (1992); Gallego (2005), đã công bố [34], [37] 43 Hình 4.2: Tế bào vi khuẩn trong thử nghiệm Gram vật kính 100X. 4.2.2. Mối quan hệ với oxy: Trong thí nghiệm khảo sát mối quan hệ với oxy của các chủng phân lập được. Trong tổng số 26 khuẩn lạc (chủng) vi khuẩn đều cho phản ứng catalase dương tính. Từ đó, có thể kết luận rằng các chủng vi khuẩn đã phân lập được là vi khuẩn hiếu khí. Ngoài ra, trong bốn chủng đại diện cho nhóm đều cho phản ứng oxydase dương tính cũng cho phép chúng tôi xác nhận một lần nữa các chủng này là vi khuẩn hiếu khí. Kết quả này phù hợp với các công trình nghiên cứu của Green (1992), trước đây [34]. 4.2.3. Khả năng đi động Kết quả thử nghiệm khả năng di động trong bốn chủng kiểm tra đều có khả năng di động (mọc lan ra khỏi đường cấy). Từ đó chúng tôi cũng có thể kết luận răng bốn chủng có roi (hay tiêm mao). 4.2.4. Kết quả khả năng sử dụng các chất cung cấp nguồn cacbon Kết quả thử nghiệm khả năng sử dụng các nguồn cung cấp carbon và năng lượng các khuẩn lạc thuần được tóm tắt trên bảng 4.2. Bảng 4.2: Kết quả thử nghiệm khả năng sử dụng nguồn cacbon của vi khuẩn. Arab in o se F ru cto se eth an o l m eth y lam in e trim eth y lam in e B etain e serb acate G lu tam ate A cetate n u trien t ag ar C atalase C itrate M an n ito l M alto se S u cro se LM1 – – + + – + – – + + + + + + + LM2 – – + + – + – – + + + + + + + 44 LM3 – – + + – + – – + + + + + + + BS16 – – + + – + – – + + + + + + + BS17 – – + + – + – – + + + + + + + BS18 – – + + – + – – + + + + + + + BN21 – – + + – + – – + + + + + + + TS9 + – – – – – – – – + + + + + + BD11 + – – – – – – – + + + + + + + TN12 + – – – – – – – + + + + + + + TN13 + – – – – – – – + + + + + + + TD15 + – – – – – – – + + + + + + + GN19 + – – – – – – – + + + + + + + GS22 + – – – – – – – + + + + + + + GS23 + – + + – – – – + + + + + + + GD26 + – + + – – – – + + + + + + + TN10 + + + – – – + + – + + + + + + GD14 + + + – – – + + – + + + + + + LM4 – + – – – + – + – + + – + + + LB5 – + – – – + – + – + + – + + + TS6 – + – – – + – + – + + – + + + TS7 – + – – – + – + – + + – + + + TS8 – + – – – + – + – + + – + + + GS24 – + – – – + – + – + + – + + + GN25 – + – – – + – + – + + – + + + BN20 – + – – – + – + – + + – + + + Từ các thử nghiệm sinh hóa này chúng tôi tiến hành phân nhóm các khuẩn lạc có đặc điểm sinh hóa giống nhau. Các khuẩn lạc có đặc điểm sinh hóa giống nhau được xếp vào cùng một nhóm và từ mỗi nhóm này chỉ dùng một đại diện để tiến hành tính hệ số tương đồng Jaccard so với đặc điểm sinh hóa của các chủng đã được công bố. Có tất cả 4 nhóm và bốn đại diện cho bốn nhóm được sử dụng trong tính toán hệ số tương đồng là: LM2, TS7, TN10, TD15. 45 Hình 4.3: Kết quả khảo sát khả năng sử dụng nguồn cacbon của vi khuẩn. Chú thích: 1: arabinose, 2: betaine, 3: citrate, 4: glucose, 5: ethanol, 6: fructose, 7: glutamate, 8: acetate, 9: methylamine, 10: serbacate, 11: trimethylamine, 12: lactose, DC: đối chứng âm. 4.2.5. Bộ thử nghiệm IDS 14GRN Từ các chủng vi khuẩn đại diện cho nhóm theo các đặc điểm sinh lý, sinh hóa để có thể khảo sát đầy đủ hơn một số đặc điểm sinh lý, sinh hóa của bốn chủng vi khuẩn chúng tôi tiến hành dùng bộ thử nghiệm sinh hóa định danh vi khuẩn gram âm để khảo sát một số đặc điểm sinh lý, sinh hóa khác. Kết quả bộ thử nghiệm định danh IDS 14GNR được tóm tắt trên bảng 4.4 Bảng 4.4: Kết quả bộ thử nghiệm sinh hóa IDS14GNR. LM2 DS7 DS15 DN10 Oxydase + + + + ONPG – – + – Nitrate – – – – Citrate + – + + Indole + + + + PAD – – – – Malonate – – – – LDC + + + + Di động + + + + Glucose – – – + 46 Esculin – – – – Urease + + – + H2S – – – – VP – – + – 4.2.6. Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ và pH đến sự phát triển của vi khuẩn Hình 4.4: Đường tương quan tuyến tính giữa OD và mật độ tế bào. Các chủng trong thí nghiệm đều có khả năng tăng trưởng tốt trên môi trường trong khoảng nhiệt độ biến thiên từ 20 – 300C. Trong đó, nhiệt độ tối ưu cho ba chủng LM2, TS7, TD15 là 250C và chủng TN10 là 300C. kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Green và ctv (1992), [34]. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự phát triển của các dòng vi khuẩn được biểu diễn trên hình Hình 4.5: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự phát triển của vi khuẩn. y = 1.2566x + 7.165 R 2 = 0.9814 7.2 7.3 7.4 7.5 7.6 7.7 7.8 7.9 8 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 OD lo g (N /m l) 47 Hình 4.6: Ảnh hưởng của pH lên sự phát triển của vi khuẩn. Trong khi đó, từ biểu đồ (hình 4.6) chúng tôi nhận thấy rằng các chủng đều có thể tăng trưởng tốt trong khoảng pH 5,0 – 7.5, tối ưu trong khoảng 6,5 – 7. Chủng TS7 có thể tăng trưởng trong khoảng pH từ aicd đến trung tính. Ngược lai, chủng TD15 lại có thể tăng trưởng trong khoảng pH từ acid đến pH hơi kiềm. 4.2.7. Đƣờng cong tăng trƣởng Dựa vào đường cong tăng trưởng (Hình 4.7)chúng tôi nhận thấy rằng các chủng tăng trưởng chậm trên môi trường nuôi cấy. Và theo Green và ctv (1992), thì vi khuẩn thuộc chi Methylobacterium tăng trưởng chậm. Thời gian để vi khuẩn tăng trưởng tới pha ổn định có thay đổi giữa các dòng vi khuẩn. Dòng LM2 là 32 giờ, dòng TS7 là 40 giờ, dòng TN10 là 44 giờ và dòng TD15 là 36 giờ. Từ những dữ liệu này chúng tôi cho rằng thời gian tốt nhất để thu hoạch tế bào là sau 24 giờ. 48 Hình 4.7: Đường cong tăng trưởng của các chủng vi khuẩn. Các đặc điểm sinh lý, sinh hóa của các chủng được tóm tắt trong bảng 4.4 Bảng 4.4: Tổng hợp các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn. LM2 TS7 TN10 TD15 Acetate + - - + Arabinose - - + + Betaine + + - - Catalase + + + + Citrate + - + + Di dộng + + + + Esculine - - - - Ethanol + - + - Fructose - + + - Glucose - - + - Glutamate - + + - H2S - - - - Indole + + + + Lactose - - - + 49 LDC + + + + Malonate + + + + Maltose + + + + Manitol + + + + Methylamine + - - - Nitrate - - - - Oxidase + + + + PAD - - - - Serbacate - - + - Sucrose + + + + Trimethylamine - - + - Urea + + - + Kích thước khuẩn lạc 1 – 3mm 1 – 3mm 1 - 3mm 2 – 5mm Kích thước tế bào 0,99-1,45µm 0,99-1,98µm 0,99-2,19µm 1,32-2,64µm Màu sắc khuẩn lạc Pl Pl Pr P Hình dạng khuẩn lạc Tròn, lồi Tròn, lồi Tròn, lồi Tròn, lồi Nhiệt độ tối ưu (t0C) 25 25 30 25 pH tối ưu 6,5 6,5 6,5 6,5 Gram biến đổi Âm biến đổi Âm Chú thích: +: có sử dụng hay dương tính, -: không sử dụng hoặc âm tính, Pl: hồng nhạt, P: hồng, Pr: hồng đỏ. 4.3. Định danh vi khuẩn 4.3.1. Hệ số tƣơng đồng di truyền-Jaccard. Bảng 4.5: Hệ số tương đồng Jaccard từ 0 – 1 của các loài. Thứ tự Loài LM2 TS7 TN10 TD15 01 M. aminovorans 0,600 0,600 0,400 0,400 02 M. aquaticum 0,333 0,667 0,667 0,167 03 M. chloromethanicum 0,889 0,556 0,222 0,667 04 M. dichloromethanicum 0,778 0,545 0,273 0,364 05 M. extorquens 0,750 0,583 0,167 0,500 50 06 M. fujisawaense 0,333 0,333 0,667 0,583 07 M. hispanicum 0,667 0,667 0,667 0,333 08 M. isbiliense 0,833 0,500 0,500 0,667 09 M. lusitanum 0,727 0,545 0,273 0,727 10 M. mesophilicum 0,333 0,333 0,667 0,417 11 M. nodulans 0,667 0,333 0,500 0,667 12 M. organophilum 0,455 0,545 0,455 0,455 13 M. populi 0,667 0,667 0,333 0,500 14 M. radiotolerans 0,500 0,333 0,583 0,500 15 M. rhodesianum 0,727 0,636 0,273 0,545 16 M. rhodinum 0,545 0,455 0,636 0,545 17 M. suomiense 0,727 0,545 0,273 0,545 18 M. thiocynatum 0,400 0,333 0,500 0,500 19 M. variabile 0,333 0,667 0,667 0,167 20 M. zatmanii 0,667 0,583 0,333 0,667 21 1019 0,462 0,385 0,769 0,385 22 LM2 1,000 0,615 0,615 0,615 23 TS7 0,615 1,000 0,462 0,462 24 TN10 0,615 0,642 1,000 0,385 25 TD15 0,615 0,642 0,385 1,000 Từ hệ số tương đồng Jaccard chúng tôi có thể kết luận rằng chủng TS7 có quan hệ gần với bốn loài: M. variabile, M. populi, M. hispanicum và M. aquaticum. Chủng TD15 có quan hệ gần với loài M. hispanicum. Chủng LM2 rất có thể thuộc loài M. chloromethanicum. Chủng TN10 có quan hệ gần với chủng 1019, loài M. variabile, M. fujisawaense, M. aquaticum, M. hispanicum. M. mesophilicum. Tuy nhiên, kết quả định danh dựa vào các đặc điểm sinh lý, sinh hóa chưa thể định danh chính xác các chủng có thuộc chi Methylobacterium hay không và phương pháp định danh bằng sinh lý, sinh hóa cũng không thể định danh các dòng vi khuẩn đã phân lập thuộc loài nào. Nên việc định danh vi khuẩn đã phân lập bằng các kỹ thuật sinh học phân tử là rất cần thiết. 51 300 base 234 base 4.3.2. Kết quả PCR 4.3.2.1. Kết quả định tính vi khuẩn chi Methylobacterium Khi khuếch đại DNA bộ gen bằng cặp mồi 2R và 2F các chủng điều tạo ra đoạn DNA đăc trưng khoảng 234base. Trong khi đó, theo nghiên cứu của Nishio và ctv (1997), [68] cho rằng cặp mồi 2F và 2R cho kết quả dương tính với 7 chủng vi khuẩn Methylobacterium sp. Ngoài ra, ở chủng E.coli đối chứng âm không có đoạn DNA đặc trưng. Từ đó, chúng tôi có thể kết luận rằng các chủng đã phân lập thuộc chi Methylobacterium. Hình 4.8: Kết quả điện di trên gel sản phẩm PCR với cặp mồi 2F và 2R Chú thích: 1: E.coli, 2: LM2, 3: TS7, 4: TN10, 5: TD15, M: thang chuẩn (Ladder). 4.3.2.2. Kết quả khuếch đại trình tự 16S rDNA nguyên vẹn Do kết quả đoạn DNA đặc trưng chỉ có thể định danh các dòng vi khuẩn có thuộc chi Methylobacterium hay không, mà không cho kết quả định danh đến mức độ loài. Vì vậy, chúng tôi tiếp tục khuếch đại trình tự 16S rDNA nguyên vẹn của vi khuẩn bằng cặp mồi FPGS6 và FPGS1509 [9]. Tuy nhiên, cặp mồi này tạo ra trình tự tương đối lớn gây khó khăn cho quá trình giải trình tự, nên chúng tôi sử dụng phối hợp với cặp mồi 2F và 2R sản phẩm tạo ra là hai đoạn khoảng 500base và 1200base (hình 4.9). 52 1200 base 500 base Chú thích: 1: LM2, 2: TS7, 3: TN10, 4: TD15, M: Ladder (Thang DNA chuẩn). Hình 4.9: Sản phẩm điện di trên gel với cặp mồi FPGS6 với 2R và FPGS1509 với 2F. 4.3.3. Kết quả giải trình tự và so sánh độ tƣơng đồng của các chủng với các loài Methylobacterium đã công bố. Kết quả giải trình tự được xác định độ chính xác bằng phần mềm fastPCR. Kết quả cho thấy rằng trong các mẫu giải trình tự chỉ có hai mẫu chính xác ở mức tinh cậy được là đoạn DNA 500base của mẫu LM2 và TN10, còn các mẫu còn lại có sự sai sót đáng kểtrong quá trình giải trình tự do mẫu chưa được tinh sạch. Do đó, chúng tôi chỉ tiến hành lấy hai trình tự đúng để so sánh với trình tự trên ngân hàng gen của BCBI. Kết quả so sánh trình tự với dữ lệu trên ngân hàng gene của NCBI (Mỹ). Bảng 4.6: Hệ số tương đòng Sj của chủng TN10 so với các chủng công bố Tên loài Độ tương đồng DNA (%) Độ tương đồng sinh hóa (Sj) M. aminovorans 96 0,400 M. chloromethanicum 96 0,222 M. dichlorometanicum 96 0,273 M. extorquens 96 0,167 M. jeotgali 96 N M. organophilum 96 0,455 M. podarium 96 N 53 M. rhodesianum 96 0,273 M. rhodinum 96 0,636 M. soumiense 96 0,273 M. thiocyanatum 96 0,500 M. zatmanii 96 0,333 1019 0,769 chú thích: Hệ số Sj được tính trong khoảng 0 – 1(0% - 100%), N: không xác định. Bảng 4.7: Hệ số tương đồng của chủng LM2 với các chủng đã công bố. Tên loài Mức độ tương đồng DNA (%) Độ tương đồng sinh hóa (Sj) M. aminovorans 99 0,600 M. chloromethanicum 99 0,889 M. dichlorometanicum 99 0,778 M. extorquens 99 0,750 M. fujisawaense 99 0,333 M. jeotgali 99 N M. lusitanum 99 0,727 M. organophilum 88 0,455 M. podarium 99 N M. populi 99 0,667 M. radiotolerans 88 0,500 M. rhodesianum 99 0,727 M. rhodinum 99 0,545 M. zatmanii 99 0,667 1019 0,462 Chú thích: hệ số Sj được tính trong khoảng 0 – 1(0% - 100%). 54 Mối quan hệ của trình tự hai chủng so với các chủng trên ngân hàng gen NCBI và của phòng thí nghiệm được biểu diển trên cây sinh loài được vẽ bằng phần mềm CluxtalX và Treeview. Hình 4.10: Cây sinh loài của các chủng trong chi Methylobacterium. Từ những số liệu so sánh này có thể thấy rằng mức độ tương đồng trình tự giữa chủng thí nghiệm với chủng đã công bố tương đối lớn. Nên chúng tôi có thể kết luận chính xác hơn là hai chủng đã giải trình tự đúng thuộc chi Methylobacterium. Chủng LM2 có quan hệ gần với chủng 1019 và TN10 cả ba chủng này cùng xếp trong cùng một nhánh lớn với M. thiocyanatum. Kết hợp với độ tương đồng sinh hóa thì chủng LM2 và chủng 1019 (0,462), chủng TN10 với chủng 1019 (0,769) là tương đối nhỏ. Nên chúng tôi cho rằng hai chủng LM2 và TN10 khác biệt lớn với chủng 1019 và các loài Methylobacterium sp. đã công bố nên chúng tôi cho rằng có thể hai chủng LM2 và TN10 là hai chủng mới Tuy nhiên, những kết luận này chưa chính xác 100% bởi vì trình tự 500 base chỉ có thể định danh vi khuẩn Methylobacterium tới mức độ chi và các đặc điểm sinh hóa cũng không thể định danh chính xác đến mức độ loài. 55 4.4. Kết quả khảo sát khả năng tổng hợp các hoạt chất thứ cấp 4.4.1. Kết quả định tính auxin Kết quả định tính auxin bằng thuốc thử Salkowski cải tiến. Trong bốn chủng thí nghiệm chỉ có hai chủng TS7 và TN10 có phản ứng dương tính với thuốc thử Salkowski cải tiến. Bên cạnh đó, trong nghiên cứu của Omer và ctv (2004), Ivanova và ctv (2001), một số chủng thuộc chi Methylobacterium có thể tổng hợp auxin. Từ đó có thể khẳng định rằng hai chủng này có khả năng tổng hợp auxin ở nồng độ đủ phát hiện, còn hai chủng LM2 và TD15 có thể chúng không thể tổng hợp auxin hoặc nồng độ auxin tạo ra của hai chủng này không đủ lớn để có thể phản ứng với thuốc thử Salkowski cải tiến. Chú thích: DC1: Đối chứng âm chủng E.coli DC2: Đối chứng dương IAA chuẩn Hình 4.11: Kết quả định tính auxin 56 4.4.2. Kết quả định tính PHB. Trong bốn chủng đã thử nghiệm đều cho kết quả dương tính với thuốc thử Nile Blue A. Trong khi đó, theo Trâm (2006) [8], thì các chủng thuộc chi Methylobacterium có khả năng tổng hợp PHB. Từ kết quả này chúng tôi có thể kết luận rằng, tất cả các chủng đã thử nghiệm có khả năng tổng hợp PHB. Với các hạt sáng khác nhau chúng tôi cũng có thể khẳng định rằng các chủng có thể tổng hợp PHB ở nồng độ khác nhau. Chú thích: DC: Mẫu đối chứng chủng E.coli. Hình 4.12: Sự phát sáng của các hạt PHB dưới kính hiển vi huỳnh quang. 57 Phần V: Kết luận và đề nghị Sau thời gian nghiên cứu mặc dù có nhiều cố gắng. Tuy nhiên, do thời gian tiến hành có giới hạn nên chúng tôi chỉ đạt được một số kết quả nhất định và những kết quả này chỉ là kết quả bước đầu. Các kết quả đạt được: - Phân lập và làm thuần và khảo sát được các đặc điểm sinh lý, sinh hóa tổng số 26 khuẩn lạc, trong đó chia thành bốn nhóm theo các đặc điểm sinh lý,sinh hoá. - Đã định danh được các chủng thuộc chi Methylobacterium bằng các phương pháp Sinh học Phân tử. Trong đó, có hai chủng TS7 và TD15 chỉ định danh được ở mức độ có đoạn DNA đặc trưng và hai chủng LM2 và TN10 định danh được tới mức độ so sánh trình tự đoạn DNA 500base trong vùng 16S rDNA. - Khảo sát được khả năng sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp của vi khuẩn. Trong đó, bốn chủng đều có khả năng tổng hợp PHB và có hai chủng LM2 và TN10 có khả năng tổng hợp auxin là TS7 và TN10. Từ những kết quả đó chúng tôi có những đề nghị sau: Cần tiến hành giải trình tự lại đoạn 1200 base của hai chủng trên cũng như các chủng đã giải sai để có thể định danh chính xác hơn đến mức độ loài. Định lượng lượng PHB tạo ra là bao nhiêu để có thể ứng dụng trong thực tế. Kiểm tra khả năng tổng hợp auxin, cytokinins, khả năng kích thích sự nẩy mầm của hạt, khả năng kích thích sinh trưởng của thực vật ở điều kiện in vivo cũng như trong điều kiện in vitro của các loài thuộc chi Methylobacterium trên để có thể ứng dụng tạo chế phẩm vi sinh dùng trong nông nghiệp, sử dụng làm nguyên liệu trong nuôi cấy mô tế bào và trong các lĩnh vực khác. 58 Phần V: Tài liệu tham khảo Tài liệu tiếng việt [1] Bùi Huy Đáp. Một số vấn đề về cây lúa, NXB Nông Nghiệp, 1999. [2] Trƣơng Đức. Kỹ thuật trồng các giống lúa mới, NXB Nông Nghiệp, 2000 [3] Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty. Vi sinh vật học, NXB giáo dục 1998 [4] Nguyễn Đức Hùng, Lê Đình Hùng, Huỳnh Lê Tâm. Sổ tay kiểm nghiệm vi sinh thực phẩm thủy sản, NXB nông nghiệp Hà Nội 2005. [5] Nguyễn Thị Lang, Bùi Chí Bửu. Sinh học phân tử giới thiệu phương pháp và ứng dụng. NXB Nông Nghiệp thành phố Hồ Chí Minh 2005. [6] Trần Linh Thƣớc, Nguyễn Đức Hoàng, Phan Thị Phƣợng Trang, Phạm Thị Hồng Tƣơi. Thực tập vi sinh vật học. NXB Đại Học Quốc Gia thành phố Hồ Chí Minh, 2001. [7] Lê Duy Linh, Trần Thị Hƣờng, Trịnh Thị Hồng, Lê Duy Thắng. Thực tập vi sinh cơ sở. NXB Đại Học Quốc Gia thành phố Hồ Chí Minh. 2001. [8] Lê Thị Thuỳ Trâm. 2006. Nghiên cứu thu nhận nhựa phân huỹ sinh học poly- -hydroxybutyrate (PHB) từ vi khuẩn Methylobacterium sp. phân lập tại Việt Nam luận văn thạc sĩ sinh hóa, Đại Học Khoa Hoc Tự Nhiên. Tài liệu tiếng nước ngoài. [9] Abdoulaye Sy, Giraud E., Jourand P., Garcia N., Willems A., De Lajudie P., Prin Y., Neyra M., Gillis M., Boivin-Masson C., Dreyfus B. (2001). “Methylotrophic Methylobacterium bacteria nodulate and fix nitrogen in symbiosis with legumes”, Journal of Bacteriology, Vol. 183, No. 1, pp. 214–220. [10] Ackermann J.-U., Müller S., Lösche A., Bley T., Babel W. (1995). “Methylobacterium rhodesianum cells tend to double the DNA content under growth limitations and accumulate PHB”, Journal of Biotechnology, Vol. 39, pp. 9-20. [11] Anesti V., McDonald I. R., Ramaswamy M., Wade W. G., Kelly D. P., Wood A. P. (2005). “Isolation and molecular detction of Methylotrophic 59 bacteria occurring in the human mouth”, Enviromental Microbiology, Vil. 7, No. 8, pp. 1227-1238. [12] Anesti V., Vohra J., Goonetilleka S., McDonald I. R., Str bler B., Stackebrandt E., Kelly D. P., Wood Ann P. (2004). “Molecular detection and isolation of facutatively methylotrophic bacteria, including Methylobacterium podarium sp. nov., from the human foot microflora”, Environmental Microbiology, Vol. 6, Iss. 8, pp. 820-830. [13] Arauujo W. L., Maccheroni W. Jr., Aguilar-Vildoso C. I., Barroso P. A. V., Saridakis H. O., Azevedo J. L. (2001). “Variability and interractions between endophytic bacteria and fungi isolated from leaf tissues of citrus rootstocks”, Cannada Journal Microbiol, Vol. 47, pp. 220-236. [14] Arauujo W. L., Marcon J., Maccheroni W. Jr., Van Elsas J. D., Van Vuurde J. W. L., Azevedo J. L. (2002), “Diversity of endophytic bacterial populations and their interaction with Xyllella fastidiosa in citrus plants”, Applied and Enviromental Microbiology, Vol. 68, No. 10, pp. 4906-4914. [15] Arthi K., Appalaraju B., Parvathi S. (2003). “Vancomycin sensitivity and KOH string test as an alternative to gram staining of bacteria”, India Journal of Medical Microbiology, Vol. 21, pp. 121-123. [16] Axel Ehmann (1977). “The van urk-salkowski reagent - a sensitive and specific chromogenic reagent for silica gel thin-layer chromatographic detection and identification of indole derivatives”, Journal of Chromatography, Vol. 132, pp. 267-276. [17] Aziz. N.H, El-Fouly. M.Z, El-Essawy. A.A, and Khalaf. M.A. Influence of bean seadling root exudates on the rhizophere colonization by Trichoderma lignorum for the control of Rhizoctonia solani. Bot. Bull. Acad. Sin. 1997, 38: 33 – 39. [18] Benchimol R., Chu E., Yuimuto R., Dias-Filho M. B. (2000). “Fusariosis control in black perper plants with bacterial endophytes survival and morphophylogical responses”, Pesq. Agropec. Bras., Brasília, Vol. 35, No. 7, pp. 1343-1348. 60 [19] Bloemberg, G. V., and Lugtenberg, B. J. J. 2001. Molecular basis of plant growth promotion and biocontrol by rhizobacteria. Plant Biol. 4:343-350. [20] Chistoserdova L., Chen S.-W., Lapidus A., Lidstrom M. E., (2003). “Methylotrophy in Methylobacterium extorquens AM1from a genomic point of view”, Journal of Bacteriology, Vol. 185, No. 10, pp. 2980-2987. [21] Chistoserdova L., Jenkins C., Kalyuzhnaya M. G., Marx C. J., Lapidus A., Vorholt J. A., Staley J. T., Lidstrom M. E. (2004). “The enigmatic planctomycetes may hold a key to the origins of Methanogenesis and Methylotrophy”, Molecular Biology ang Evolution, Vol. 21, No. 7, pp. 1234-1241. [22] De Marco P., Pacheco C. C., Figueiredo A. R., Moradas-Ferreira P. (2004). “Novel pollutant-resistant methylotrophic bacteria for use in bioremediation”, FEMS Microbiology Letters, Vol. 234, pp. 75-80. [23] Department of health and ageing office of the gene technology regulator. 2005. The biology and ecology of rice (Oryza sativa L.) in Australia. [24] Doronina N. V., Ivanova E. G., and Trotsenko Yu. A. (2002a). “New evidence for the ability of Methylobacteria and Methanotrophs to synthesize auxin”, Microbiology, Vol. 71, No. 1, pp. 116–118. Translated from Mikrobiologiya, Vol. 71, No. 1, pp. 130–132. [25] Doronina N. V., Trotsenko Y. A., Kuzentsov B. B., Tourova T. P., Salkinoja-Salonen M. S. (2002b). “Methylobacterium suomiense sp. nov. and Methylobacterium lusitanum sp. nov., aerobic, pink-pigmented, facultatively methylotrophic bacteria”, International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, Vol. 52, pp. 773-776. [26] Farah Ahmad, Iqbal Ahmad, Mohd Saghir Khan. Indole Acetic Acid Production by the Indigenous Isolates of Azotobacter and Fluorescent Pseudomonasin the Presence and Absence of TryptophanFarah. Department of Agricultural Microbiology, Faculty of Agricultural Sciences, Aligarh Muslim University, 2002. 61 [27] Figueira M. M., Larameùe L., Murrell J. C., Groleau D., Miguez C. B. (2000). “Production of green fluorescent protein by the methylotrophic bacterium Methylobacterium extorquens”, FEMS Microbiology Letters, Vol. 193, pp. 195-200. [28] Fournier D., Trott S., Hawari J. and Spain J. Metabolism of the Aliphatic Nitramine 4-Nitro-2,4-Diazabutanal by Methylobacterium sp. Strain JS179. Applied And Environmental Microbiology, Aug 2005, p. 4199 – 4202. [29] Gallego V., García M.T., Ventosa A. (2005c). “Methylobacterium isbiliense sp. nov., isolated from the drinking water system of Sevilla, Spain”, International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, Vol. 55, pp. 2333-2337. [30] Gallego V., García T. M.,Ventosa A. (2005a). “Methylobacterium hispanicum sp. nov. and Methylobacterium aquaticum sp. nov., isolated from drinking water”, International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, Vol.55, pp. 281-287. [31] Gallego V., García T. M.,Ventosa A. (2005b). “Methylobacterium variabile sp. nov., a methylotrophic bacterium isolated from an aquatic environment”, International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, Vol. 55, pp. 281-287. [32] Garcia de Salamone I. E., Hynes R. K., Nelson L. M. (2001). “Cytokinin production by plant growth promoting rhizobacteria and selected mutants” Canada Journal Microbiology, Vol 47, pp. 404-411. [33] Glick, B. R. 1995. The enhancement of plant growth by free-living bacteria. Can. J. Microbiol. 41:109-117. [34] Green P. N. (1992). “The Genus Methylobacterium”, pp. 2342-2345. In Balows A., Trüper H. G., Dworkin M., Harder V., Schleifer K. H. (ed.) The Prokaryote, 2nd ed., Springer-Verlag, Berlin. [35] Gromovykh. T, Tulpanova V, Shmarlovskaya. S, Gromovykh. V, Makhova H. Strains of Trichoderma Benefit for Biological Control Seedlings Pathogens. 62 [36] Hanson R. S., Hanson T. E. (1996). “Methanotrophic Bacteria”, Microbiological reviews, Vol. 60, No.2: pp: 439-471. [37] Hiraishi A., Furuhata K., Matsumoto A., Koike K. A., Fukuyama M. and Tabuchi K. (1995). “Phenotypic and genetic diversity of chrorine- resistant Methylobacterium strains isolated from various enviroment”, Applied and Enviromental Microbiobiology, Vol. 61, No. 6, pp. 2099- 2107. [38] Hirano. S.S., and C. D. Upper. 2000. Bacteria in the leaf cosystem with emphasis on Pseudomonas syringae: a pathogen, ice nucleus, and epiphyte. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 64:624–653. [39] Holland M. A. (1997) “Are cylokinin produced by plant?”, Plant Physiology, Vol. 115, pp. 865-868. [40] Holland M. A., Polacco J. C. (1994). “PPFMs and other covert contaminants: is there more to plant physiology than just plant?”, Plant Physiology, Vol. 45, pp. 197-209. [41] Holt J. G., Krieg N. R., Sneath P. H. A., Staley J. T., Williams S. T. (1994). Bergey’s manual of Determinative bacteriology, Ninth Edition, The Williams and Willins Company, pp. 88-145. [42] Hornschuh M., Grotha R., Kutschera U. (2002). “Epiphytic bacteria associated with the bryophyte Funaria hygrometrica: effects of Methylobacterium strains on protonema development”, Plant biol (Stuttg) Vol. 4, pp. 682-687. [43] Idris R., Trifonova R., Puschenreiter M., Wenzel W. W., Sessitsch A. (2004). “Bacterial communities associated with flowering plants of Ni hyperaccumulator Thlaspi goesingense”, Applied and Enviromental Microbiology , Vol. 70, No. 5, pp. 2667-2677. [44] Ilan Chet, Ada Viterbo, Yariv Brotman, Tamir Lousky. Enhancement of plant disease resistance by the biocontrol agent Trichoderma. [45] Jaftha J. B., Strijdom B. W., Steyn P. L. (2002). “Characterization of pigmented methylotrophic bacteria which nodulate Lotonosis bainesii”, Systematic and Applied Microbiology, Vol. 25, pp. 440-449. 63 [46] Jeon J.-S., Lee S.-S., Kim H.-Y., Ahn T.-S., Song H.-G. (2003). “Plant growth promotion in soil by some inoculated microorganisms”, The Journal of Microbiology, Vol. 41, No. 4, pp. 271-276. [47] Kalyaeva M. A., Ivanova E. G., Doronina N. V., Zakharchenko N. S., Trotsenko Yu. A., Buryanov Ya. I. (2003). “Stimulation of wheat morphogenesis in vitro by Methanotrophic bacteria” Doklady Biological Sciences, Vol. 388, pp. 76–78, Translated from Doklady Akademii Nauk, Vol. 388, No. 6, pp. 847–849. [48] Kalyaeva M. A., Zacharchenko N. S., Doronina N. V., Rukavtsova E. B., Ivanova E. G., Alekseeva V. V., Trotsenko Yu. A., Bur’yanov Ya. I. (2000). “Plant growth and morphogenesis in vitro is promoted by associative methylotrophic bacteria”, Russian Journal of Plant Physiology, Vol. 48, No. 4, pp. 514-517. Translated from Fiziologiya Rastenii, Vol. 48, No. 4, pp. 596-599. [49] Katircioglu H.,Aslim B.,Yüksekdao Z. N., Mercan N., Beyatli Y. (2003). “Production of poly-b-hydroxybutyrate (PHB) and differentiation of putative Bacillus mutant strains by SDS-PAGE of total cell protein”, African Journal of Biotechnology, Vol. 2, No. 6, pp. 147-149. [50] Kloepper. J. W., and Schroth. M.N. (1978). Plant growth-promoting rhizobacteria on radishes. Pages 879-882. Plant Pathogenic Bacter. Vol. 2, Station de Pathologie Vegetale et Phytobacteriologie, INRA, Angers, France. [51] Koenig R. L., Morris R. O., Polacco J. C. (2002). “tRNA is the source of low-level trans-zeatin production in Methylobacterium spp”, Journal of bacteriology, Vol. 184, No. 7, pp. 1832-1842. [52] Korotkova N., Lidstrom M. E. (2001) “Connection between Poly-β- Hydroxybutyrate biosynthesis and growth on C1 and C2 compounds in the methylotrop Methylobacterium extorquens AM1”, Journal of Bacteriology, Vol. 183, No. 3, pp. 1038-1046. [53] Kutchera U., Koopmann V., Grotha R. (2002). “Plant development in the absence of epiphytic microorganisms”, Naturwisschaften, Vol. 89, pp. 319-321. 64 [54] Lee J. K., Kim S. Y., Kim S. U., Kim J. H. (2002) “Synthesis of cationic polysaccharide derivatives and their hypocholesterolaemic capacity”, Biotechnology Applied Biochemistry, Vol. 35, pp. 181-189. [55] Lidstrom M. E., Chistoserdova L. (2002). “Plants in the pink: cytokinin production by Methylobacterium”, Journal of bacteriology, Vol. 184, No. 7, pp. 1818. [56] Liu Mei, Sun Zong-xiu, Zhu Jei, Xu Tong, Harman Gary E, Lorito Matteo. Enhancing rice resitance to fungal pathogens by transformation with cell wall degrading enzyme genes from Trichoderma atroviride. Journal oj Zhejiang University Science. 2004, 5: 133 – 136) [57] Long R. L. G. (2000). tRNA is the source of cytokinin secretion by plant- associated members of the genus Methylobacterium, Ph. D. thesis. University of Missouri, Columbia [58] Long R. L. G., Morris R. O., Polacco J. C. (2002). “tRNA is the source of low-level trans-zeatin production in Methylobacterium spp.”, Journal of Bacteriology, Vol. 184, No. 7, pp. 1832-1842. [59] Madhaiyan M., Ponguzhali S., Senthilkumar M., Seshdri S., Chung H., Yang J., Sundaram S, SA T. (2004). “Growth promotion and induction of systemic resistance in rice cultivar Co-47 (Oryza sativa L.) by Methylobacterium spp.” Bot. Bull. Acad. Sin., Vol. 45, pp. 315-324. [60] Madhaiyan M., Poonguzhali S., Sundaram S.P., Tongmin Sa. A new insight into foliar applied methanol influencing phylloplane methylotrophic dynamics ang growth promotion of cotton (Gossypium hirsutum L.) and sugarcane (Saccharum officinarum L.). Environmental and Experimental Botany. 2005. [61] Maliti C. M. (2000). Physiological and biochemical effects of Methylobacterium sp. strains and foliar-applied methanol on growth and development of rice Oryza sativa L, Ph. D. thesis, The city University of New York, USA. [62] Mantelin S., Touraine B. (2003). “Plant growth-promoting bacteria and nitrate availability: impacts on root development and nitrate uptake”, Journal of Experimental Botany, Vol. 55, No. 394, pp. 27-34. 65 [63] McDonald I. R., Doronina N. V., Trotsenko Y. A., McAnulla C. and Murrel J. C. (2001). “Hyphomicrobium chloromethanicum sp. nov. and Methylobacterium chloromethanicum sp. now, chloromethane-utilizing bacteria isolate from a polluted enviroment”, International Journal of Systemmatic and Evolutionary Microbiology, Vol. 51, pp. 119-122. [64] McDonald I. R., Warner K. L., McAnulla C., Woodall C. A., Oremland R. S., Murrell J. C. (2002). “A review of bacteria methyl hadide degradation: biochemistry, geneties and molecular ecology”, Enviromental Microbiology, Vol. 4, No. 4, pp. 193-203. [65] Mercan N., Aslime B., Yuksekdag Z.N., Beyatli Y., Production of Poly- -Hydroxybutyrate (PHB) by Some Rhizobium Bacteria. Turk J Biol. 26 (2002) 215-219. [66] Nelson. L.M. Plant Growth Promoting Rhizobacteria (PGPR): Prospects for New Inoculants. Okanagan University College. Published 1 March 2004. [67] Nester E. W., Anderson D. G., Roberts C. E., Pearsall N., Nester M. T. (2001). Microbiology a human perspecttine, third edition, Mc Graw Hill Publisher, 820p. [68] Nishio T., Yoshikura T., Itoh H. (1997). “Detection of Methylobacterium species by 16S rRNA gene- targeted PCR”, Applied and Environmental Microbiology, Vol. 63, No. 4, pp. 1594-1597 [69] Nogueira F., Botelho M. L,, Tenreiro R. (1998). “Radioresistance studies in Methylobacterium spp.”, Radiat. Phys. Chem..Vol. 52. No. 6, pp. 15-19. [70] Norbert C. A. de Ruijter, Ton Bisseling and Anne Mie C. Emons. Rhizobium Nod Factors Induce an Increasein Sub-apical Fine Bundles of Actin Filamentsin Vicia sativa Root Hairs within Minutes, MPMI Vol. 12, No. 9, 1999, pp. 829-832. [71] Omer Z. S., Tombolini R., Broberg A., Gerhardson B. (2004a). “Indole-3-acetic acid production by pink-pigmented facultative methylotrophic bacteria”, Plant Growth Regulation, Vol. 43, pp. 93-96. 66 [72] Omer Z. S., Tombolini R., Gerhardson B. (2004b). “Plant colonization by pink-pigmented facultative methylotrophic bacteria (PPFMs)”, FEMS Microbiology Ecology, Vol. 47, pp. 319-326. [73] Patten C. L., Glick B. R. (2002). “Role of Pseudomonas putida indoleacetic acid in development of the host plant root system”, Applied and Environmental Microbiology, Vol. 68, No. 8, pp. 3795-3801. [74] Persello-Cartieaux. F., Nussaume. L., and Robaglia, C. 2003. Tales from the underground: Molecular plant-rhizobacteria interactions. Plant Cell Environ. 26:189-199. 2004 [75] Picard C., Ponsonnet C., Paget E., Nesme X., Simonet P. (1992). “Detection and enumerration of bateria in siol by direct DNA extraction and polymerase chain reaction” Applied and Environmental Microbiology, Vol. 58, No. 9, pp. 2717-2722. [76] Pirttilä A. M., Laukkanen H., Pospiech H., Myllulä R., Hohtola A. (2000). “Detection of intracellular bacteria in the bud of Scotch pine (Pinus sylvestris L.) by in situ hybridization”, Applied and Environmental Microbiology, Vol. 66, No. 7, pp. 3073-3077. [77] Prescott L. M., Harley J. P., Klein D. A. (1996). Microbiology, third Edition, Wm. C. Brown Publisher, printted in the USA, pp. 380-395. [78] Rogers S. O., Bendich A. J. (1994). “Extraction of total cellular DNA from plants, algae and fungi”, Plant Molecular Biology Manual D1, pp. 1- 8. [79] Romanovskaia V.A., Stoliar S.M., Malashenko I.R., Dodatko T.N. (2001). “Processes of plant colonization by Methylobacterium strains and some bacterial properties”, Mikrobiologiia, Vol. 70, No. 2, Abstract. PMID: 1138606 [PubMed-indexed for MEDLINE] [80] Romanovskaya V. A. (1991). “Taxonomy of methylotrophic bateria”, Biotechnology, Vol. 18, pp. 3-23. [81] Romanovskaya V. A., Rokitko P. V., Shilin S. O., Chernaya N. A., Malashenko Yu. R. (2004). “Indentification of Methylobacterium strains using sequence analysis of 16S rRNA genes”. Microbiology, Vol. 73, No. 6, pp. 729-731. 67 [82] Roumagnac P., Gagnevin L., Garden L., Sutra L.,Manceau C., Dickstein E. R., Jones J. B., Rott P. and Pryvost O. (2004). “Polyphasic characterization of Xanthomomads isolated from onion, garlic and Welsh onion (Allium spp.) and their relatedness to different Xanthomonas species”, International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, Vol 54, pp. 14-24. [83] Sanders. J. W., Martin J. W., Hooke M., Hooke J. (2000). “Methylobacterrium mesophylicum injection: case report and literature review of an unusual opportunistic pathogen”, Clinical Infectious Diseases, Vol. 30, pp. 936-938. [84] Sato K., Ueda S., Shimizu S., (1977). “Form of vitamine B12 and its rolein a methanol utilizing bacterium, Protaminobacter ruber”, Applied and Enviromental Microbiology, Vol. 33, No. 3, pp. 515-521. [85] Song J., Lee S.-C., Kang J.-W., Beak H.-J., Suh J.-W. (2004). “Phylogenetic analysis of Streptomyces spp. isolated from potato scab lesions in Korea on basis of 16S rRNA gen and 16S-23S rRNA internally transceibed spacer sequences”, International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, Vol. 54, pp. 203-209. [86] Stocks P. K., McCleskey C. S. (1964). “Identity of the pink-pigmented methanol-oxidizingbacteria as Vibrio extorquens” Journal of Bacteriology, Vol. 88, No. 4, pp. 1065-1070. [87] Tejera1. N, Lluch. C, Martinez-Toledo. M.V and Gonzalez-Lopez. J. Isolation and characterization of Azotobacter and Azospirillum strains from the sugarcane rhizosphere, Plant and Soil (2005) 270: 223–232 ]. [88] Van Aken B., Peres C. M., Doty S. L., Yoon J. M., Schnoor J. L. (2004a). “Methylobacterium populi sp. nov., a novel aerobic, pink- pigmented, facultatively methylotrophic, methane-utilizing bacterium isolated from poplar trees (Populus deltoides x nigra DN34)”, Abstract. Journal of Clinial Microbiology Online [89] Van Aken B., Yoon J. M., and Schnoor J. L. (2004b). “Biodegradation of nitro-substituted explosives 2,4,6-trinitrotoluene, hexahydro-1,3,5- trinitro-1,3,5-triazine, and octahydro-1,3,5,7-tetranitro-1,3,5-tetrazocine 68 by a phytosymbiotic Methylobacterium sp. associated with poplar tissues (Populus deltoides_nigra DN34)”, Applied and Environmental Microbiology, Vol. 70, No. 1, pp. 508–517. [90] Van Dien S. J., Marx C. J., O’Brien B. N., Lidstrom M. E. (2003a). “Genetic characterization of the carotenoid biosynthetic pathway in Methylobacterium extorquens AM1 and isolation of colorless mutant”, Applied and Environmental Microbiology, Vol. 69, No. 12, pp. 7563- 7566. [91] Van Dien S. J., Okubo Y., Hough M. T., Korotkova N., Taitano T., Lidstrom M. E. (2003b). “Reconstruction of C3 and C4 metabolism in Methylobacterium extorquens AM1 using transposon mutagenesis”, Microbiology, Vol.149, pp. 601-609. [92] Verhoef R., De Waard P., Schols H. A., Siika-aho M., Voragen A. G. J. (2003). “Methylobacterium sp. isolated from a finnis paper machine produces highly pyruvated galactan exopolysaccharide”, Carbohydrate Research, Vol. 338, pp. 1851-1859. [93] Vessey J. K. (2003). “Plant growth promoting rhizobacteria as biofertilizers”, Plant and Soil, Vol. 255, pp. 571–586. [94] Wang P., Wang F., Xu M., Xiao X., (2003). “Molecular phylogenny of methylotrophs in a deep-sea sediment from a tropical west Pacific Warm Pool”, FEMS Microbiology Ecology, Vol. 47, pp. 77-84. [95] Wartiainen I., Hestnes A. G., Svenning M. M. (2003). “Methanotrophic diversity in high aretic weatlands on the islands of Salbard (Norway) - denaturing of radient gel electrophoresis of soil DNA and enrichment cultures”, Canada Journal Microbiol, Vol. 49, pp. 602-612. [96] Wendlandt K.D, Jechorek M., Helm J., Stottmeisster U. (2001). producing producing poly- -hydroxybutyrate with a high molecular mass from methan. Journal of Biotechnology, Vol. 86, p. 127 – 133. [97] Williams S. T., Sharpe M. E., Holt J. G., (1989). Bergey`s Manual of Systematic Bacteriology, vol.4. Williams and Wilkins. Baltimore, USA. [98] Wilson. M, Hirano. S. S, and Lindow. S. E. Location and Survival of Leaf-Associated Bacteria in Relation to Pathogenicity and Potential for 69 Growth within the Leaf. Applied And Environmental Microbiology, Apr. 1999, p. 1435–1443. [99] Wood A. P., Kelly D. P., McDonald I. R., Jordan S. L., Morgan T. D., Khan S., Murrell J. C., Borodina E. (1998). “A novel pink-pigmented facultative methylotroph Methylobacterium thiocyanatum sp. nov., capable of growth on thiocyanate or cyanate as sole nitrogen sources”, Arch Microbiol, Vol. 169, pp. 148-158. [100] Zabetakis I. (1997). “Enhancement of flavour biosynthesis from strawberry (Fragaria x ananassa) callus (mô sẹo) cultures by Methylobacterium species”, Plant Cell, Tissue and Organ Culture, Vol. 50, pp. 179–183. [101] Zabransky R. J., Ellis T., Canaday D. (1997). “Methylobacterium spp. from a patient with multiple sclerosis”, Clinical Microbiology Newsletter, Vol. 19, No, 19, pp. 150-152. [102] Zaharatos G. J., Dascal A., Miller M. A. (2001). “Discordant Carbapenem Susceptibility in Methylobacterium species and its application as a method for phenotypic identification”, Journal of Clinical Microbiology, Vol. 39, No. 5, pp. 2037-2038. Các địa chỉ internet: [103] [104] ch&term=methylobacterium