Luận văn Khảo sát hoạt tính và tinh sạch protease từ hai chủng nấm mốc aspergillus oryzae và aspergillus kawasaki trên môi trƣờng bán rắn

phƣơng pháp Bradford Bradford là một trong những phƣơng pháp để xác định hàm lƣợng protein. Phƣơng pháp này có một số ƣu điểm sau :  Dễ sử dụng (chỉ cần một loại thuốc thử).  Độ nhạy cao (có thể phát hiện protein ở 1 – 20 g)  Phức chất giữa thuốc nhuộm và protein tƣơng đối ổn định.  Phƣơng pháp này ít bị cản trở bởi các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu protein. 31  Nguyên tắc Phƣơng pháp này dựa trên sự thay đổi bƣớc sóng hấp thu cực đại và sự thay đổi màu xảy ra khi Coomasie Brilliant Blue liên kết với protein trong dung dịch acid. Trong dung dịch mang tính acid, khi không kết nối với protein thì thuốc nhuộm có bƣớc sóng hấp thu cực đại ở 465 nm. Khi kết hợp với protein thì thuốc nhuộm hấp thu cực đại ở bƣớc sóng 595 nm. Độ hấp thu ở bƣớc sóng 595 nm liên hệ trực tiếp với nồng độ protein. Dạng proton hóa của thuốc nhuộm Coomasie Brilliant Blue có màu da cam đỏ. Thuốc nhuộm liên kết chặt chẽ với các protein, tƣơng tác với cả nhóm kỵ nƣớc và các nhóm mang điện tích dƣơng trên phân tử protein. Trong môi trƣờng của các gốc mang điện tích dƣơng, sự proton hóa không xảy ra và màu xanh xuất hiện. Màu sẽ xuất hiện sau hai phút và ổn định trong gần một giờ.  Hóa chất và thiết bị  Hóa chất Dung dịch Albumin chuẩn. Thuốc thử Bradford.  Thiết bị Máy đo quang phổ UV - Vis Hình 3.1 : Máy quang phổ UV-Vis 32  Các bƣớc tiến hành  Xây dựng đƣờng chuẩn Albumin Pha dung dịch Albumin chuẩn 1mg/ml : Cân 100 mg Albumin dạng bột trên cân phân tích, định mức đến 100 ml bằng nƣớc cất. Pha thuốc thử Bradford : Coomasie Brilliant Blue (CBB) : 0,005 g Ethanol tuyệt đối : 23,5 g Acid phosphoric 85% : 42,5 g Phẩm màu CBB đƣợc làm tan trong ethanol, bổ sung acid phosphoric 85% và chỉnh tới 500 ml bằng nƣớc cất. Bảo quản trong chai tối. Chuẩn bị các ống nghiệm chứa dung dịch Albumin chuẩn ở các nồng độ xác định nhƣ bảng 3.1 Bảng 3.1 : Đƣờng chuẩn albumin Ống nghiệm Đối chứng 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Nồng độ ( g/ml) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Dung dịch albumin chuẩn ( l) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Nƣớc cất ( l) 1000 990 980 970 960 950 940 930 920 910 Thuốc thử Bradford (ml) 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 Tiến hành đo OD dung dịch trong các ống nghiệm ở bƣớc sóng 595 nm. Trị số mật độ quang của các ống từ 1 đến 9 sau khi trừ đi trị số của ống đối chứng sẽ xây dựng đƣợc đồ thị biểu diễn sự biến thiên của mật độ quang ( OD) theo nồng độ protein.  Xác định nồng độ protein của mẫu 33 Dịch chiết enzyme thô của hai chủng nấm mốc cũng đƣợc tiến hành tƣơng tự nhƣ trên. Mẫu đƣợc pha loãng sao cho trị số mật độ quang đo đƣợc trong khoảng của đƣờng chuẩn. Mật độ quang của mẫu cũng trừ đi trị số mật độ quang của ống đối chứng, rồi chiếu vào đƣờng chuẩn để suy ra lƣợng protein có trong dung dịch mẫu thí nghiệm ( g/ml). b) Xác định hoạt tính enzyme theo phƣơng pháp Amano  Nguyên tắc Dùng casein làm cơ chất, xác định hoạt tính phân giải protein của enzyme protease trên cơ sở định lƣợng sản phẩm tạo thành trong phản ứng bằng phản ứng màu với thuốc thử Folin. Dựa vào đồ thị chuẩn để tính lƣợng tyrosine tƣơng ứng với lƣợng sản phẩm thủy phân dƣới tác dụng của enzyme. Hoạt động của enzyme đƣợc biểu diễn bằng đơn vị hoạt tính thủy phân protein của enzyme.  Hóa chất và thiết bị  Hóa chất HCl 0,1M Na2CO3 0,4M Dung dịch TCA 0,4M Tyrosine tinh khiết Thuốc thử Folin Đệm phosphate pH7 0,1M Dung dịch casein 1% : Cân 1g casein từ sữa (Hãng Merck), thêm vào 100 ml dung dịch đệm phosphate 0,1M; pH = 7.  Dụng cụ và thiết bị Ống nghiệm, pipette, bình định mức, giấy lọc. Bể ổn nhiệt Máy đo quang phổ UV – Vis Máy đo pH  Các bƣớc tiến hành  Xây dựng đƣờng chuẩn tyrosine 34 Bảng 3.2 Đƣờng chuẩn tyrosine. Ống số Đối chứng 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Nồng độ ( g/ml) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Dung dịch tyrosine chuẩn ( l) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Dung dịch HCl ( l) 1000 990 980 970 960 950 940 930 920 910 Na2CO3 (ml) 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 Thuốc thử Folin (ml) 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 Pha dung dịch tyrosine ở các nồng độ khác nhau : 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 gtyrosine/mlHCl nhƣ bảng 3.2. Thêm 5 ml dung dịch Na2CO3 0,4M vào dung dịch tyrosine ở các nồng độ khác nhau ở trên và thêm 1 ml thuốc thử Folin vào dung dịch hỗn hợp. Sau khi trộn đều, để ổn định dung dịch ở 37 0,50C trong 20 phút. Đo độ hấp thụ của dung dịch này ở bƣớc sóng 660 nm. Ghi nhận kết quả As10, As20, As30, As40, As50, As60, As70, As80, As90. Đối với ống đối chứng dùng 1 ml acid HCl 0,1M thay cho tyrosine. Đo độ hấp thu của dung dịch này ở bƣớc sóng 660 nm và ghi nhận kết quả này là Aso. Trị số mật độ quang của các ống từ 1 đến 9 sau khi trừ đi trị số của ống đối chứng sẽ đƣợc giá trị OD1 đến OD9. Vẽ đồ thị dựa vào biến thiên của OD theo nồng độ protein. Đồ thị này gọi là đƣờng chuẩn tyrosine.  Xác định hoạt tính enzyme protease Hoạt tính enzyme đƣợc khảo sát ở nhiệt độ 370C và pH = 7. Cho 1 ml dung dịch cơ chất casein 1% vào ống nghiệm, ủ ở 37 0,50C trong 10 – 15 phút. Sau thời gian ủ, cho 1 ml dịch chiết enzyme thô vào và lắc đều. Đem ủ hỗn hợp này ở 37 0,50C trong một giờ. Cho vào 2 ml dung dịch TCA 0,4M để ngừng phản ứng enzyme. 35 Để ổn định dung dịch trong 25 phút, sau đó lọc dung dịch này qua giấy lọc để loại tủa. Cho 5 ml dung dịch Na2CO3 vào 1ml dịch lọc. Thêm 1 ml thuốc thử Folin. Trộn đều, để yên ở 37 0,50C trong 20 phút. Khi dung dịch xuất hiện màu xanh, đem đo độ hấp thu ở bƣớc sóng 660 nm (ghi nhận kết quả này là Am). Mẫu đối chứng : lấy 1 ml nƣớc cất thay cho 1 ml dung dịch enzyme và tiến hành các bƣớc tƣơng tự nhƣ mẫu thí nghiệm với cùng điều kiện. Ghi nhận kết quả độ hấp thụ là A0. Hàm lƣợng tyrosine đƣợc giải phóng do protease thủy phân đƣợc tính bằng cách lấy Am – A0 rồi lấy kết quả so với đƣờng chuẩn tyrosine để xác định hoạt độ protease theo tính toán sau : Một đơn vị hoạt tính (ĐVHT) enzyme protease đƣợc xác định là lƣợng enzyme để tạo ra lƣợng amino acid tƣơng đƣơng với 100 g tyrosine trong 1 ml dịch lọc dƣới điều kiện thí nghiệm. Hoạt tính enzyme protease (ĐVHT/ml) = (Am – A0).F.1/100.n Hoạt tính enzyme protease (ĐVHT/g) = F = [10/ As10 + 20/ As20 + 30/ As30 + 40/ As40 + 50/ As50 + 60/ As60 + 70/ As70 + 80/ As80 + 90/ As90]/9 Am : độ hấp thu của mẫu A0 : Độ hấp thu của ống đối chứng F : Hệ số tƣơng quan giữa hàm lƣợng tyrosine và độ hấp thu ở bƣớc sóng 660 nm trên đƣờng chuẩn. n : Hệ số pha loãng của enzyme 1/100 : Hệ số chuyển đổi V : Thể tích của dung dịch enzyme m : khối lƣợng chế phẩm enzyme thô.  Tính toán hoạt tính riêng (HTR) của enzyme protease Từ kết quả hàm lƣợng protein (mg/ml) và hoạt tính enzyme protease (UI/ml) tính hoạt tính riêng của enzyme. (Am – A0).F.1/100.n.V Số đơn vị hoạt tính m 36 HTR (UI/mg) = 3.3.1.2 Thí nghiệm 2 : Xác định nồng độ muối (NH4)2SO4 và tỷ lệ cồn tối ƣu để tủa enzyme protease. Chiết enzyme từ chế phẩm enzyme thô theo mô tả ở thí nghiệm 1, dịch chiết thu đƣợc đem đi tủa với các tác nhân tủa là muối (NH4)2SO4 và cồn 96 0 . a) Tủa protein bằng muối (NH4)2SO4 ở các nồng độ bão hòa khác nhau Bảng 3.3 : Khối lƣợng (NH4)2SO4 tƣơng ứng với mỗi nồng độ. Nồng độ (NH4)2SO4 (% độ bão hòa) 50 55 60 65 70 75 Dịch enzyme (ml) 50 50 50 50 50 50 (NH4)2SO4 (g) 15,7 17,55 19,5 21,5 23,6 25,3 Tiến hành tủa trong điều kiện nhiệt độ thấp để đảm bảo hoạt tính enzyme không bị ảnh hƣởng và quá trình tủa xảy ra tốt. Thể tích dịch enzyme và khối lƣợng muối (NH4)2SO4 tƣơng ứng với mỗi nồng độ đƣợc sử dụng nhƣ bảng 3.3 Dịch chiết enzyme thô đƣợc cho vào becher đặt trong chậu nhỏ chứa đá vụn xung quanh. Tất cả đƣợc đặt trên máy khuấy từ. Cho từ từ muối (NH4)2SO4 vào để muối có thời gian hòa tan trong dịch enzyme. Tiếp tục khuấy từ thêm 15 phút. Lấy dịch đi ly tâm 5000 vòng /phút trong 20 phút. Thu tủa, hòa lại trong 15 ml dung dịch đệm phosphate pH7. Cho dịch pha tủa vào lọ nhỏ, bảo quản 100C . b) Tủa enzyme bằng ethanol 960 ở các tỷ lệ khác nhau Bảng 3.4 : Thể tích cồn tƣơng ứng với các tỷ lệ Tỷ lệ dịch : ethanol 1:1 1:2 1:3 1:4 1:5 1:6 mg protein enzyme 37 Dịch enzyme (ml) 50 50 50 50 50 50 Ethanol (ml) 50 100 150 200 250 300 Để tránh làm biến tính protein, ethanol 960 phải đƣợc giữ lạnh trƣớc khi tiến hành tủa. Thể tích dịch enzyme và thể tích cồn tƣơng ứng với mỗi nồng độ đƣợc sử dụng nhƣ bảng 3.4 Lắc đều hỗn hợp, bảo quản lạnh trong một giờ. Ly tâm 5000 vòng/phút trong 20 phút. Bỏ dịch, thu tủa, hòa trong 15 ml dung dịch đệm phosphate pH7. Cho dịch hòa tan tủa vào lọ nhỏ, bảo quản 100C. c) Xác định nồng độ muối (NH4)2SO4 và tỷ lệ cồn tối ƣu để tủa enzyme protease. Dịch hòa tan tủa thu đƣợc từ việc tủa dịch chiết enzyme thô bằng (NH4)2SO4 và C2H5OH 96 0 ở các nồng độ và tỷ lệ khác nhau đƣợc xác định hàm lƣợng protein và hoạt tính protease (ở nhiệt độ 370C, pH = 7) nhƣ ở thí nghiệm 1. Nồng độ muối và tỷ lệ cồn tối ƣu cho việc tủa enzyme protease là giá trị mà ở đó hoạt tính protease thu đƣợc cao nhất. 3.3.1.3 Thí nghiệm 3 : Xác định nhiệt độ và pH tối ƣu cho hoạt động của protease. Dịch hòa tan tủa thu đƣợc khi tủa protease ở nồng độ muối và tỷ lệ cồn tối ƣu ở thí nghiệm 2 đƣợc xác định hoạt tính protease theo phƣơng pháp Amano ở các giá trị pH và nhiệt độ khác nhau. a) Xác định pH tối ƣu cho hoạt động của protease Khảo sát hoạt tính protease ở các giá trị pH : 4, 5, 6, 7, 8, 9 trong cùng điều kiện nhiệt độ (370C). Ở giá trị pH nào cho hoạt động của protease mạnh nhất (hoạt tính cao nhất) thì đó là pH tối ƣu cho hoạt động của enzyme. b) Xác định nhiệt độ tối ƣu Khảo sát hoạt tính enzyme ở các nhiệt độ (0C) : 37, 47, 57, 67, 77 trong cùng một điều kiện về pH (pH tối ƣu xác định đƣợc ở thí nghiệm trên). Ở nhiệt độ nào hoạt tính enzyme cao nhất thì đó là nhiệt độ tối ƣu cho hoạt động của enzyme. 38 3.3.1.4 Thí nghiệm 4 : Tinh sạch enzyme bằng sắc ký lọc gel a) Hóa chất và dụng cụ  Dụng cụ và thiết bị Hệ thống sắc ký cột áp suất thấp, hãng Bio-Rad, Mỹ. Phễu đổ gel Bình hút chân không. Flow Adapor 1,5 cm. Cột sắc ký Bio-Rad, kích thƣớc 30 x 1,5 cm; thể tích : 53 ml [thể tích = chiều cao cột x (đƣờng kính/2)2 x 3,14]. Bình đựng dung dịch đệm. Ống nghiệm: 50 cái. Vòi hút chân không để khử bọt khí cho các dung dịch Hình 3.2 Hệ thống sắc ký cột áp suất thấp, hãng Bio-Rad, Mỹ  Hóa chất  Gel Bio-Gel P-100, hãng Bio-Rad : là các hạt polyacrylamide tạo lỗ, đƣợc điều chế bằng quá trình đồng polymer hóa acrylamide và N, N’-methylene-bis- acrylamide. Các gel này rất ƣa nƣớc và không mang điện tích, giúp việc lọc các hợp chất nhạy cảm qua gel đạt hiệu quả. Đặc tính của Bio-Gel P-100 : dạng hạt mịn, kích thƣớc hạt 45 – 90 m, khả năng ngậm nƣớc : 12ml/1g gel khô, phạm vi phân tách : 5000-100000 daltons.  Đệm phosphate 0,1M; pH7 : khử bọt khí trƣớc khi dùng. b) Các bƣớc tiến hành 39  Chuẩn bị gel Cân 5 g gel Bio-gel P-100 khô. Cho bột gel từ từ vào dung dịch đệm phosphate 0,1M, pH = 7 đựng trong cốc. Dùng dung dịch đệm phosphate pH = 7 nhiều gấp hai lần so với thể tích lớp nền gel cần cho trong cột. Cụ thể dùng ít nhất 53 x 2 = 106 ml dung dịch đệm. Sau khi quá trình hydrate xảy ra hoàn toàn, gạn lớp nổi trên bề mặt. Chuyển dung dịch vào một bình hút chân không có gắn với vòi hút chân không Khử khí của dung dịch trong khoảng từ 5-10 phút, thỉnh thoảng lắc nhẹ bình, không dùng đũa khuấy vì nó có thể làm hƣ gel. Thêm dung dịch đệm để khử khí với thể tích gấp hai lần thể tích lớp nền và lắc nhẹ. Để gel ổn định cho đến khi 90 – 95% số hạt ổn định. Gạn hoặc loại lớp nổi trên bề mặt bằng cách hút để loại các hạt mịn. Gắn phễu đổ gel vào cột, đóng lỗ thoát của cột và cho dung dịch đệm làm đầy 20% thể tích cột. Rót đều dung dịch gel vào cột thành một dòng di chuyển nhẹ. Tránh làm bắn gel, đảm bảo việc nhồi cột đều và tránh bị bọt khí. Khi lớp nền đã hình thành trong cột từ 2 – 5 cm, mở khóa đầu ra của cột cho đến khi cột đƣợc nạp đầy gel. Khi cột đã đƣợc nạp đầy gel, mở khóa đầu ra của cột và gắn flow adaptor. Mở khóa đầu ra của cột, cho dung dịch đệm với thể tích gấp hai lần thể tích lớp nền chảy qua cột lúc điều khiển tốc độ chảy. Đóng đầu ra của cột, điều chỉnh flow adaptor xuống đến lớp nền gel. Nạp mẫu vào trên bề mặt lớp nền bằng cách bơm hoặc tiêm mẫu vào trên lớp nền gel qua flow adaptor.  Chuẩn bị mẫu Dịch hòa tan tủa sau khi tủa protein với nồng độ muối và tỷ lệ cồn tối ƣu ở thí nghiệm 2 đƣợc chạy qua sắc ký lọc gel. Mẫu chạy sắc ký phải sạch (không bị nhiễm bẩn và không có các hạt rắn), hòa tan hoàn toàn trong dung dịch đệm. Lọc mẫu qua milipore (màng lọc 0,45 micrometre) sẽ làm gia tăng độ bền và thời gian sử dụng của cột . Thu và xác định mẫu tách đƣợc. 40 Dịch ra khỏi cột đƣợc đo độ hấp thụ ở bƣớc sóng 280 nm bằng detector trong hệ sắc ký và đƣợc thể hiện độ hấp thu dƣới dạng sắc ký đồ bằng phần mềm LP Data View trên máy tính. Dịch đƣợc thu tự động bằng máy thu mẫu (collector), mỗi phân đoạn 2 ml.. Xác định hàm lƣợng protein và hoạt tính enzyme protease Dựa trên sắc ký đồ, tiến hành gom các phân đoạn thuộc cùng một peak. Các peak sẽ đuợc phân tích hàm lƣợng protein theo phƣơng pháp Bradford và hoạt tính protease theo phƣơng pháp Amano sau tinh sạch nhƣ thí nghiệm 2 c) Tính hiệu suất về hoạt tính enzyme protease và độ tinh sạch của enzyme sau tinh sạch bằng sắc ký lọc gel.  Hiệu suất về hoạt tính enzyme = Trong đó : HT enzyme 1 : Hoạt tính enzyme protease trƣớc tinh sạch (UI/ml dung dịch enzyme trƣớc tinh sạch. HT enzyme 2 : Hoạt tính enzyme protease sau tinh sạch (UI/ml dung dịch enzyme sau tinh sạch.)  HTR của enzyme protease sau tinh sạch =  Độ tinh sạch của enzyme = Trong đó : HTR enzyme 1 : Hoạt tính riêng enzyme trƣớc mỗi lần tinh sạch. HTR enzyme 2 : Hoạt tính riêng enzyme tƣơng ứng sau mỗi lần tinh sạch.  Độ tinh sạch của protease sau sắc ký = Trong đó : HTR enzyme 1 : Hoạt tính riêng của enzyme protease trƣớc tinh sạch HTR enzyme 2 : Hoạt tính riêng của enzyme protease sau tinh sạch. HT enzyme 2 HT enzym 1 HT enzyme 2 Hàm lƣợng protein sau tinh sạch HTR enzyme 2 HTR enzyme1 HTR enzyme 2 HTR enzyme 1 41 3.3.1.7 Thí nghiệm 5 : Xác định trọng lƣợng phân tử enzyme protease bằng phƣơng pháp điện di SDS - PAGE a) Thiết bị và dụng cụ Bộ điện di đứng Bộ nguồn chạy điện di Biorad. Pipetteman Đầu típ Eppendorf Dụng cụ làm gel (tấm kính, lƣợc, kẹp...) Hóa chất N,N,N’,N’-tetramethylennediamide(C6H16N2 – TEMED) Dung dịch Acrylamide/Bisacrylamide 40% (29:1)93,3%C) -Mercaptoethanol (HSCH2CH2OH) Thang protein chuẩn SDS-PAGE (Bio-rad), gồm các protein chuẩn có kích thƣớc xác định sau : Myosin : 200000 daltons. -galactosidase : 116250 daltons Phosphorylase b : 97400 daltons Bonvine serum albumin : 66200 daltons Ovalbumin : 45000 daltons Carbonic anhydrase : 31000 daltons Soybean trypsin inhibitor : 21500 daltons Lysozyme : 14400 daltons Aprotinin : 6500 dalons Sodium dodecyl sunfate (SDS) Ammoniumpersulfate [(NH4)2S2O8] Coomasie Brilliant Blue G-250 (Bio-rad) Cồn tuyệt đối (99,50) Methanol (CH3OH) 42 Tris (hydroxymethyl) aminomethane Acid acetic Bromophenol blue Glycerol (C3H8O3) Glycine (C2H5O2N) Acid Clohydric (HCl) Sodium dodecyl sunfate (SDS) 10% : cân 10g SDS, cho 100 ml nƣớc cất vào khuấy cho tới khi tan hết. Dung dịch đệm gel phân tách (separating gel buffer) Tris-Cl 1,5M; pH8,8- 0,4% SDS : cân 36,3g Tris pha trong 100 ml nƣớc cất, thêm dần HCl 6N và khuấy dung dịch trên cho tới khi pH kế chỉ 8,8. Hút 8 ml dung dịch SDS 10% cho vào. Thêm nƣớc cất cho đủ 200 ml, lắc đều giữ ở 40C Ammoniumpersulfate 10% (chỉ pha trƣớc khi dùng) : cân 0,1g cho vào một eppendorf 1000 l, thêm 1 ml nƣớc cất, lắc đều, để ở nhiệt độ phòng. Dung dịch đệm điện di Tris-glycine pH 8,3 : pha dung dịch mẹ 10X chứa 30 g Tris, 144g Glycine, 10g SDS hòa trong 1000 ml nƣớc cất. Dung dịch nạp mẫu 2X (2X treatment buffer) có thành phần nhƣ sau : 2,5 ml dung dịch đệm Tris-Cl 0,5M; pH 6,8; 4 ml 10%SDS; 2 ml Glycerol; 2 mg Bromophenol Blue; 0,2 ml mercaptoethanol; thêm nƣớc đủ 10 ml. Dung dịch nhuộm gel : chuẩn bị 250 ml dung dịch nhuộm gel chứa 0,625g Coomasie Blue G 250;112,5 ml ethanol tuyệt đối; 112,5 ml nƣớc cất và 25 ml acid acetic; lắc đều; giữ trong chai màu tối. Dung dịch giải nhuộm : 30 ml methanol, 10 ml acid acetic, 60 ml nƣớc cất. b) Phƣơng pháp  Đổ gel  Gel phân tách (separating gel) Cho các thành phần sau theo thứ tự, vào becher 50 ml sạch : 40% Acrylamide/Bis (29:1) : 2,5 ml Tris – HCl 1,5M pH8,8 – 4,4% SDS : 2,5 ml Nƣớc cất : 4,445 ml TEMED : 5 l 43 Ammoniumpersulfate 10% : 50 l Tổng thể tích : 10 ml Sau khi cho Ammoniumpersulfate 10% vào, lắc nhẹ ống Falcon vài lần (tránh tạo bọt khí), dùng pipetteman bơm dung dịch gel vào khuôn, đổ gel sao cho mức dung dịch gel cao hơn 7 cm (tránh tạo bọt khí trong khuôn gel). Sau đó nhẹ nhàng đặt một lớp nƣớc cất lên trên lớp gel để mặt gel đƣợc phẳng. Chờ gel đông (khoảng 20 – 30 phút).  Gel gom (Stacking gel): Cho các thành phần sau theo thứ tự vào becher 50 ml sạch khác : 40% Acrylamide/Bis (29:1) : 0,5 ml Tris – HCl 1,5M pH8,8 – 4,4% SDS : 1 ml Nƣớc cất : 2,476 ml TEMED : 4 l Ammoniumpersulfate 10% : 20 l Tổng thể tích : 4 ml Sau khi gel phân tách đã trùng ngƣng hoàn toàn, đổ hết nƣớc bên trên. Tiến hành đổ lớp gel gom bằng cách dùng pipetteman bơm dung dịch gel gom vào khuôn. Đồng thời đƣa lƣợc vào khuôn để tạo các giếng mẫu (tránh tạo bọt khí trong khuôn gel). Sau khi gel trùng ngƣng, tháo lƣợc, lắp đĩa gel vào bộ phận điện di cho dung dịch điện di vào buồng điện di.  Chuẩn bị mẫu và chạy điện di  Xử lý mẫu Tiến hành chạy điện di dịch chiết enzyme thô của Aspergillus oryzae và Aspergillus kawasaki đồng thời với peak đƣợc dự đoán là protease mà ta quan tâm của cả hai chủng khi tủa protein bằng cồn. Hút 30 l dung dịch nạp mẫu (2X treatment buffer) và 30 l dung dịch mẫu protein vào một eppendorf sạch, đậy nắp và búng nhẹ cho đều, đun sôi cách thủy 5 – 10 phút. Ly tâm 10000 vòng/phút trong 1-5 giây. Chú ý nồng độ protein trong mẫu vừa đủ sao cho hàm lƣợng protein trong một giếng không vƣợt quá 20 – 40 g và hàm lƣợng protein/band không vƣợt quá 0,1 g. 44 Đối với thang chuẩn protein (Biorad) hút 2 l vào eppendorf 1 ml chứa 8 l nƣớc cất và 10 l dung dịch nạp mẫu.  Tiến hành chạy điện di Dùng pipetteman 10 l nạp mẫu vào các giếng (20 l/giếng) Tiến hành chạy điện di ổn định dòng : 100V. Sau khi điện di, nhuộm gel với dung dịch nhuộm đã chuẩn bị trƣớc (2-4 giờ) trong một giờ. Sau đó tiến hành giải nhuộm bằng cách ngâm gel trong dung dịch giải nhuộm cho đến khi nền gel trở nên trong suốt không màu. Sau khi nhuộm xong, protein đƣợc phát hiện nhờ các vạch màu xanh lam trên nền gel trong suốt. Xác định trọng lƣợng phân tử của protein Đo khoảng cách di chuyển của các band protein từ gel phân tách tới các band protein và khoảng cách di chuyển từ gel phân tách tới vạch màu cuối cùng. Tính giá trị Rf : Rf = Vẽ biểu đồ lg của các giá trị trọng lƣợng phân tử của các protein chuẩn và các giá trị Rf của chúng. Trọng lƣợng phân tử của các vạch protein chƣa biết trọng lƣợng phân tử có thể xác định thông qua giá trị Rf của chúng. Trọng lƣợng phân tử của các protein chƣa biết trọng lƣợng phân tử có thể xác định thông qua giá trị Rf của chúng qua phƣơng pháp ngoại suy từ đồ thị. 3.4 Phƣơng pháp xử lý số liệu Số liệu đƣợc xử lý bằng phần mềm Excel. Khoảng cách di chuyển của protein Khoảng cách di chuyển của vạch màu bromophenol blue 45 PHẦN 4 : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Hàm lƣợng protein và hoạt tính protease của dịch chiết enzyme thô Chiết enzyme từ 100g chế phẩm enzyme thô bằng nƣớc cất. Dịch chiết thu đƣợc đem xác định hàm lƣợng protein và hoạt tính protease theo thí nghiệm 1 ở mục 3.3.1.1. Để dễ so sánh, chúng tôi quy đổi tổng hàm lƣợng protein và tổng hoạt tính protease trong 100g chế phẩm thành hàm lƣợng và hoạt tính trên một gam chế phẩm. Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 4.1 Bảng 4.1 : Hoạt tính enzyme protease và hàm lƣợng protein của dịch chiết enzyme thô của hai chủng Asp.oryzae và Asp.kawasaki Hoạt tính protease (UI/g CP) Hàm lƣợng protein (mg/g CP) HTR(UI/mg) Asp.oryzae 29,01 31,20 0,93 Asp. kawasaki 12,85 20,40 0,63 Đồ thị 4.1 Đồ thị so sánh hàm lƣợng protein và hoạt tính enzyme protease trong dịch chiết enzyme thô giữa hai chủng nấm mốc Asp.oryzae và Asp.kawasaki  Nhận xét : Từ đồ thị 4.1 cho thấy hàm lƣợng protein và hoạt tính protease của Asp.oryzae cao hơn Asp.kawasaki. 4.2 Nồng độ muối tối ƣu cho việc tủa protease 0 5 10 15 20 25 30 35 Asp.oryzae Asp.kawasaki Hàm lƣợng (mg/g CP) Hoạt tính (UI/g CP) 46 Chiết enzyme từ chế phẩm enzyme thô theo mô tả ở thí nghiệm 1, dịch chiết đƣợc tủa với muối (NH4)2SO4 ở các nồng độ 50, 55, 60, 65, 70, 75% độ bão hòa. Sử dụng 50 ml dịch chiết enzyme thô cho mỗi nồng độ. Ly tâm để thu tủa. Sau đó cặn tủa thu đƣợc hòa tan vào 15 ml dung dịch đệm phosphate pH = 7. Xác định tổng hàm lƣợng protein và tổng hoạt tính enzyme protease (ở nhiệt độ 370C, pH = 7) trong 15 ml dịch hòa tan tủa này. Ở nồng độ nào cho hoạt tính enzyme cao nhất thì đó là nồng độ tối ƣu cho việc tủa enzyme protease. 4.2.1 Kết quả đối với chủng Asp.oryzae Bảng 4.2 Tổng hàm lƣợng protein và tổng hoạt tính enzyme protease trong 15 ml dịch hòa tan tủa của Asp.oryzae khi tủa protease bằng muối. Nồng độ muối (NH4)2SO4 (% độ bão hòa) Tổng hoạt tính (UI) Tổng hàm lƣợng (mg) HTR (UI/mg) 50 271,67 106,12 2,56 55 385,98 129,96 2,97 60 495,85 159,95 3,1 65 805,91 204,56 3,94 70 702,29 208,4 3,37 75 625,2 216,09 2,89 Để dễ so sánh, chúng tôi quy đổi hoạt tính enzyme protease và hàm lƣợng protein có trong 15 ml dịch hòa tan tủa ở các nồng độ thành hàm lƣợng và hoạt tính trong 1g chế phẩm enzyme thô. Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 4.3. Bảng 4.3 : Hàm lƣợng protein và hoạt tính protease có trong 1g chế phẩm enzyme thô của Asp.oryzae khi tủa protease bằng muối Nồng độ (NH4)2SO4 (% độ bão hòa) Hoạt tính (UI/g CP) Hàm lƣợng (mg/g CP) HTR (UI/mg) 50 35,33 13,8 2,56 55 50,19 16,9 2,97 60 64,48 20,8 3,1 65 104,80 26,6 3,94 47 70 91,33 27,1 3,37 75 81,3 28,0 2,89 Đồ thị 4.2 : Hàm lƣợng protein và hoạt tính protease trong 1g chế phẩm enzyme thô của Asp.oryzae khi tủa protease bằng muối.  Nhận xét : Kết quả từ bảng 4.3 cho thấy :  Về hàm lƣợng : Sử dụng muối (NH4)2SO4 ở nồng độ 75% độ bão hòa thu đƣợc hàm lƣợng protein tủa là nhiều nhất. Nồng độ muối (NH4)2SO4 càng tăng thì hàm lƣợng protein tủa đƣợc càng nhiều. Điều này có đƣợc là do khi nồng độ muối càng cao, các phân tử muối phân ly thành các ion càng nhiều. Chính các ion này bắt lấy các phân tử nƣớc khỏi protein càng nhiều, do đó các protein có điều kiện tiếp xúc nhau và sa lắng.  Về hoạt tính : Sử dụng muối (NH4)2SO4 ở nồng độ 65% độ bão hòa cho hoạt tính enzyme protease cao nhất.  Hoạt tính riêng của enzyme ở nồng độ muối 65% độ bão hòa cao nhất. Nhƣ vậy, nồng độ muối tủa đƣợc nhiều protein nhất không phải là nồng độ tối ƣu để thu nhận enzyme protease. Bởi vì, ở các nồng độ muối khác nhau sẽ tủa đƣợc các protein khác nhau. Ở nồng độ muối 75% độ bão hòa, hàm lƣợng protein tủa đƣợc nhiều nhất nhƣng chứa nhiều protein tạp, không phải là enzyme protease. Ngƣợc lại, ở nồng độ muối 65% độ bão hòa, hàm lƣợng protein tủa đƣợc không cao nhất nhƣng hoạt tính protease mạnh nhất . Điều này chứng tỏ ở nồng độ muối 65% độ bão hòa tủa 0 5 10 15 20 25 30 50 55 60 65 70 75 Nồng độ muối amonium sunfat bão hòa (% độ bão hòa) Hà m lượ ng pr ote in (m g/g CP ) 0 20 40 60 80 100 120 Ho ạt tín h p rot ea se (U I/g CP ) Hàm lƣợng protein Hoạt tính protease 48 đƣợc nhiều protease nhất. Từ đây có thể kết luận, nồng độ muối (NH4)2SO4 65% độ bão hòa là tối ƣu để tủa enzyme protease vì vừa cho hoạt tính protease cao, vừa tiết kiệm lƣợng muối sử dụng. 4.2.2 Kết quả đối với chủng Asp.kawasaki Bảng 4.4 : Tổng hàm lƣợng protein và tổng hoạt tính enzyme protease trong 15 ml dịch hòa tan tủa của Asp.kawasaki khi tủa protease bằng muối Nồng độ (NH4)2SO4 (% độ bão hòa) Tổng hoạt tính (UI) Tổng hàm lƣợng (mg) HTR(UI/mg) 50 96,89 53,83 1,80 55 148,18 72,29 2,05 60 197,04 89,97 2,19 65 276,84 103,05 2,68 70 232,47 106,1 2,19 75 202,01 109,2 1,85 Để dễ so sánh, chúng tôi quy đổi hoạt tính enzyme protease và hàm lƣợng protein có trong 15 ml dịch hòa tan tủa ở các nồng độ thành hàm lƣợng và hoạt tính trong 1g chế phẩm enzyme thô. Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 4.5 Bảng 4.5 : Hàm lƣợng protein và hoạt tính protease có trong 1g chế phẩm enzyme thô của Asp.kawasaki khi tủa protease bằng muối Nồng độ muối (NH4)2SO4 (% độ bão hòa) Hoạt tính (UI/g CP) Hàm lƣợng (mg/g CP) HTR (UI/mg) 50 12,6 7 1,8 55 19,27 9,4 2,05 60 25,62 11,7 2,19 65 36 13,4 2,68 70 30,2 13,8 2,19 75 26,27 14,2 1,85 49 Đồ thị 4.3 Hàm lƣợng protein và hoạt tính protease trong 1g chế phẩm enzyme thô của Asp.kawasaki khi tủa protease bằng muối.  Nhận xét : Tƣơng tự với chủng Asp.oryzae, đối với chủng Asp.kawasaki :  Ở nồng độ muối 75% độ bão hòa, hàm lƣợng protein tủa đƣợc là nhiều nhất.  Nồng độ muối 65% độ bão hòa chính là nồng độ tối ƣu để tủa enzyme protease. 4.3 Tỷ lệ cồn tối ƣu cho việc tủa protease Chiết enzyme từ chế phẩm enzyme thô theo mô tả ở thí nghiệm 1, dịch chiết đƣợc tủa với cồn lạnh ở các tỷ lệ dịch enzyme : cồn là 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6. Sử dụng 50 ml dịch trích enzyme thô cho mỗi tỷ lệ. Ly tâm để thu tủa sau đó hòa tan tủa trong 15 ml dung dịch đệm phosphate pH = 7. Xác định hàm lƣợng và hoạt tính của dịch hòa tan tủa. Ở tỷ lệ nào hoạt tính enzyme cao nhất thì đó là tỷ lệ cồn tối ƣu cho việc tủa enzyme. 4.3.1 Kết quả đối với chủng Asp.oryzae 0 5 10 15 50 55 60 65 70 75 Nồng độ muối amonium sunfat bão hòa (% độ bão hòa) Hà m lư ợn g pr ot ei n (m g/ g CP ) 0 10 20 30 40 Ho ạt tí nh p ro te as e (U I/g C P) Hàm lƣợng protein Hoạt tính protease 50 Bảng 4.6 : Tổng hàm lƣợng protein và tổng hoạt tính enzyme protease trong 15 ml dịch hòa tan tủa của Asp.oryzae khi tủa protease bằng cồn. Tỷ lệ dịch enzyme : cồn Tổng hoạt tính (UI) Tổng hàm lƣợng (mg) HTR (UI/mg) 1:1 247,46 130,11 1,9 1:2 337,98 155,03 2,18 1:3 454,48 185,48 2,45 1:4 701,63 216,55 3,24 1:5 563,68 197,79 2,85 1:6 524,30 193,48 2,71 Để dễ so sánh, chúng tôi quy đổi hoạt tính enzyme protease và hàm lƣợng protein có trong 15 ml dịch hòa tan tủa ở các nồng độ thành hàm lƣợng và hoạt tính trong 1g chế phẩm enzyme thô. Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 4.7. Bảng 4.7 : Hàm lƣợng protein và hoạt tính protease có trong 1g chế phẩm enzyme thô của Asp.oryzae khi tủa protease bằng cồn Tỷ lệ dịch trích : cồn Hoạt tính (UI/g CP) Hàm lƣợng (mg/g CP) Hoạt tính riêng (UI/mg) 1:1 32,18 16,92 1,9 1:2 43,95 20,16 2,18 1:3 59,1 24,12 2,45 1:4 91,24 28,16 3,24 1:5 73,3 25,72 2,85 1:6 68,18 25,16 2,71 51 Đồ thị 4.4 : Hàm lƣợng protein và hoạt tính protease trong 1g chế phẩm enzyme thô của Asp.oryzae khi tủa protease bằng cồn.  Nhận xét : Ở tỷ lệ dịch trích enzyme : cồn = 1:4, hàm lƣợng protein và hoạt tính protease đều cao nhất. Nhƣ vậy có thể kết luận rằng, tỷ lệ dịch trích enzyme thô : cồn = 1:4 là tỷ lệ tối ƣu để tủa enzyme protease. 4.3.2 Kết quả đối với chủng Asp.kawasaki Bảng 4.8 : Tổng hàm lƣợng protein và tổng hoạt tính enzyme protease trong 15 ml dịch hòa tan tủa của Asp.kawasaki khi tủa protease bằng cồn. Tỷ lệ dịch trích : cồn Tổng hoạt tính (UI) Tổng hàm lƣợng (mg) HTR(UI/mg) 1:1 78,8 47,75 1,65 1:2 119,09 66,90 1,78 1:3 147,58 80,21 1,84 1:4 268,15 125,89 2,13 1:5 202,59 109,51 1,85 1:6 195,17 108,43 1,80 0 5 10 15 20 25 30 1:1 1:2 1:3 1:4 1:5 1:6 Tỷ lệ dung dịch enzyme và cồn lạnh Hà m lư ợn g p ro te in (m g/g C P) 0 20 40 60 80 100 Ho ạt tín h p ro te as e (U I/g C P) Hàm lƣợng protein Hoạt tính protease 52 Để dễ so sánh, chúng tôi quy đổi hoạt tính enzyme protease và hàm lƣợng protein có trong 15 ml dịch hòa tan tủa ở các nồng độ thành hàm lƣợng và hoạt tính trong 1g chế phẩm enzyme thô. Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 4.9. Bảng 4.9 : Hàm lƣợng protein và hoạt tính protease có trong 1g chế phẩm enzyme thô của Asp.kawasaki khi tủa protease bằng cồn Tỷ lệ dịch trích : cồn Hoạt tính (UI/g CP) Hàm lƣợng (mg/g CP) HTR (UI/mg) 1:1 10,25 6,21 1,65 1:2 15,49 8,70 1,78 1:3 19,19 10,43 1,84 1:4 34,86 16,37 2,13 1:5 26,34 14,24 1,85 1:6 25,38 14,10 1,80 Đồ thị 4.5 : Hàm lƣợng protein và hoạt tính protease trong 1g chế phẩm enzyme thô của Asp.kawasaki khi tủa protease bằng cồn.  Nhận xét : Từ kết quả ở bảng 4.9 cho thấy, khi tủa enzyme bằng cồn ở tỷ lệ 1:4, hàm lƣợng protein thu đƣợc nhiều nhất đồng thời hoạt tính protease cũng cao nhất. Nhƣ vậy tỷ lệ dịch trích enzyme thô : cồn ở tỷ lệ 1:4 là tối ƣu để kết tủa enzyme protease. 5 10 15 20 1:1 1:2 1:3 1:4 1:5 1:6 Tỷ lệ dung dịch enzyme và cồn lạnh Hà m lư ợn g pr ot ei n (m g/ g CP ) 0 5 10 15 20 25 30 35 40 Ho ạt tín h pr ot ea se (U I/g C P) Hàm lƣợng protein Hoạt tính protease 53 4.4 So sánh việc tủa enzyme trong cồn 960 và tủa bằng muối (NH4)2SO4. Bảng 4.10 So sánh việc tủa enzyme bằng tác nhân cồn và muối ở hai chủng Asp.oryzae và Asp.kawasaki. Chủng Tác nhân tủa HT cao nhất (UI/g CP) HL cao nhất (mg/g CP) HTR ở nồng độ muối và tỷ lệ cồn tối ƣu (UI/mg) A sp .o ry za e Cồn 960 91,24 28,16 3,24 Muối (NH4)2SO4 104,80 28 3,94 A sp .k a w a sa ki Cồn 960 34,86 16,37 2,13 Muối (NH4)2SO4 36 14,2 2,35 Từ kết quả của cả hai chủng cho thấy, hàm lƣợng protein thu đƣợc từ tác nhân tủa là cồn cao hơn tác nhân tủa là muối. Tuy nhiên, hoạt tính enzyme protease khi tủa bằng cồn lại thấp hơn khi tủa bằng muối. Điều này là do khi kết tủa bằng cồn, tạp chất trong chế phẩm lớn hơn khi kết tủa bằng muối. (Lê Ngọc Tú, 1982). Hơn nữa, có thể xảy ra hiện tƣợng biến tính không thuận nghịch khi kết tủa bằng dung môi hữu cơ. Khi hằng số điện môi giảm, phân tử protein có thể tự tháo gỡ và trở thành dạng không hoạt động. Trong khi đó muối (NH4)2SO4 là muối trung tính thƣờng đƣợc sử dụng vì tính hòa tan tốt và ít gây biến tính protein ở nhiệt độ thƣờng  Đối với tủa bằng cồn: Thu đƣợc hàm lƣợng protein cao, dễ dàng thực hiện trong điều kiện phòng thí nghiệm. Tuy nhiên, nhƣợc điểm của phƣơng pháp tủa bằng cồn là hoạt tính protease không cao so với tủa bằng muối, hoạt tính riêng thấp hơn so với muối, cần dụng cụ tủa có thể tích lớn nên không tiện áp dụng ở quy mô công nghiệp. 54  Đối với tủa bằng muối : Hoạt tính protease cao, hoạt tính riêng cao. Tuy nhiên, nhƣợc điểm của phƣơng pháp tủa bằng muối là hàm lƣợng protein không cao so với tủa bằng cồn. Việc sử dụng muối trong sản xuất quy mô lớn bị hạn chế do việc rất khó tách nó hoàn toàn ra khỏi tủa protein. Vì trong quá trình lắng tủa, tuy phần lớn muối tồn tại trong dung dịch trên cặn, nhƣng vẫn có một phần nhỏ có mặt trong tủa protein. 4.5 Ảnh hƣởng của nhiệt độ và pH đến hoạt động của enzyme protease. Nhƣ đã trình bày trong phần 4.3.2 việc tủa enzyme trong cồn lạnh dễ áp dụng ở quy mô phòng thí nghiệm. Do đó để xác định pH và nhiệt độ tối ƣu của enzyme protease, chúng tôi sử dụng dịch pha tủa ở tỷ lệ cồn tối ƣu (tỷ lệ dịch enzyme : cồn = 1:4). 4.5.1 pH tối ƣu Khảo sát hoạt tính enzyme ở các giá trị pH : 4, 5, 6, 7, 8, 9 trong cùng điều kiện về nhiệt độ (370C) để xác định pH tối ƣu cho hoạt động của enzyme protease. 4.5.1.1 Kết quả đối với chủng Asp.oryzae Bảng 4.11 Sự thay đổi hoạt tính enzyme protease của Asp.oryzae theo pH pH 4 5 6 7 8 9 Hoạt tính (UI/g CP) 84,98 87,57 89,56 91,73 88,12 85,21 Đồ thị 4.6 : Ảnh hƣởng của pH đối với hoạt tính enzyme protease từ Asp.oryzae.  Nhận xét : Enzyme rất nhạy với pH của môi trƣờng. pH môi trƣờng thƣờng ảnh hƣởng đến mức độ ion hóa cơ chất và đặc biệt ảnh hƣởng đến độ bền enzyme. Chính vì thế pH có ảnh hƣởng rất mạnh đến phản ứng enzyme. Mỗi enzyme thích hợp với một vùng pH nhất định. Từ đồ thị 4.6 cho thấy pH tối ƣu cho hoạt động của protease 82 84 86 88 90 92 94 4 5 6 7 8 9 pH H o ạt tí nh (U I/g CP ) 55 từ Asp.oryzae là pH = 7. Ở pH thấp hay cao hơn pH tối ƣu , hoạt tính enzyme đều giảm. 4.5.1.2 Kết quả đối với chủng Asp.kawasaki Bảng 4.12 Sự thay đổi hoạt tính enzyme protease của Asp.kawasaki theo pH pH 4 5 6 7 8 9 Hoạt tính (UI/g CP) 29,82 31,50 34,12 36,23 33,46 30,71 Đồ thị 4.7 : Ảnh hƣởng của pH đối với hoạt tính enzyme protease từ Asp.kawasaki  Nhận xét : Qua đồ thị 4.7 cho thấy pH = 7 là pH tối ƣu cho hoạt động của enzyme protease từ Asp.kawasaki. 4.5.2 Nhiệt độ tối ƣu Khảo sát hoạt tính enzyme theo dãy nhiệt độ (0C) : 30, 37, 47, 57, 67, 77 trong cùng điều kiện về pH (pH = 7). 4.5.2.1 Kết quả đối với chủng Asp.oryzae Bảng 4.13 : Sự thay đổi hoạt tính enzyme protease của Asp.oryzae theo nhiệt độ. Nhiệt độ (0C) 30 37 47 57 67 77 Hoạt tính (UI/g CP) 77,89 90,7 94,89 91,41 85,7 60,2 55 65 75 85 95 105 30 37 47 57 67 77 Nhiệt độ ( o C) Ho ạt t ính (U I/gC P) 29 31 33 35 37 4 5 6 7 8 9 pH Ho ạt tín h ( UI /g CP ) 56 Đồ thị 4.8 : Ảnh hƣởng của nhiệt độ đối với hoạt tính protease từ Asp.oryzae  Nhận xét : Nhiệt độ là một yếu tố vật lý có ảnh hƣởng rất lớn đến phản ứng enzyme, chúng liên quan đến khả năng kết hợp giữa enzyme và cơ chất. Thông thƣờng khi nhiệt độ tăng thì tốc độ phản ứng tăng. Tuy nhiên, tốc độ phản ứng chỉ tăng đến một giới hạn nhiệt độ nhất định. Vƣợt quá giới hạn đó, tốc độ phản ứng sẽ giảm. Từ đồ thị 4.8 cho thấy protease của chủng Asp.oryzae hoạt động mạnh nhất ở nhiệt độ 470C. Vƣợt quá nhiệt độ này, hoạt tính enzyme giảm và đặc biệt giảm mạnh ở 77 0C do sự biến tính của enzyme. 4.5.2.2 Kết quả đối với chủng Asp.kawasaki Bảng 4.14 Sự thay đổi hoạt tính enzyme protease của Asp.kawasaki theo nhiệt độ Nhiệt độ (0C) 30 37 47 57 67 77 Hoạt tính (UI/g CP) 24,84 36,73 39,16 30,12 15,2 10,14 Đồ thị 4.9 : Ảnh hƣởng của nhiệt độ đối với hoạt tính protease từ Asp.kawasaki.  Nhận xét : Tƣơng tự chủng Asp.oryzae, đối với Asp.kawasaki nhiệt độ tối ƣu cho hoạt động của protease cũng ở 470C. Sau nhiệt độ tối ƣu, hoạt tính protease giảm. 4.6 Kết quả tinh sạch qua lọc gel. Dịch hòa tan tủa sau khi tủa protein với muối 65% và cồn ở tỷ lệ dịch chiết enzyme thô : cồn là 1:4 đƣợc chạy qua hệ sắc ký lọc gel với các thông số sau : 5 15 25 35 45 30 37 47 57 67 77 Nhiệt độ ( 0 C) Ho ạt tín h ( UI /gC P) 57  Gel : Bio-Gel P-100 (Giới hạn phân tách 5000 – 100.000 daltons).  Cột : 30 x 1,5 cm  Flow adaptor : 1,5 cm.  Tốc độ dòng : 0,14 ml/phút.  Vmẫu : 1ml.  Phân đoạn : 2 ml/phân đoạn.  A280 : Độ hấp thụ protein ở bƣớc sóng 280 nm. 4.6.1 Kết quả đối với Asp.oryzae a) Kết quả tinh sạch qua lọc gel Biogel P-100 sau khi tủa protease bằng muối. Hình 4.1 : Sắc ký đồ kết quả tinh sạch qua lọc gel Biogel P-100 khi tủa protease bằng muối đối với nấm Aspergillus oryzae. Kết quả tinh sạch qua lọc gel khi tủa enzyme bằng muối (NH4)2SO4 thu đƣợc 3 peak với thứ tự nhƣ sau :  Peak1 : từ ống số 8 đến ống 11 : 8 ml  Peak2 : từ ống số 17 đến ống 19 : 6 ml.  Peak3 : từ ống số 25 đến 31 : 14 ml. Xác định hàm lƣợng protein và hoạt tính protease cho từng peak. Chúng tôi nhận thấy cả ba peak thu đƣợc đều có hoạt tính. Tuy nhiên hoạt tính protease và hàm lƣợng protein của peak 3 cao nhất nên có thể dự đoán peak 3 có chứa protease quan tâm. 58 b) Kết quả tinh sạch qua lọc gel Biogel P – 100 sau khi tủa protease bằng cồn. Hình 4.2 : Sắc ký đồ kết quả tinh sạch qua lọc gel Biogel P – 100 khi tủa bằng cồn đối với nấm Aspergillus oryzae. Kết quả tinh sạch qua lọc gel khi tủa enzyme bằng cồn thu đƣợc 3 peak với thứ tự nhƣ sau:  Peak 1 : từ ống số 7 đến ống 12 : 12 ml  Peak 2 : ống 13 và 14 : 4 ml  Peak 3 : ống 19 đến ống 27 : 18 ml. Xác định hàm lƣợng protein và hoạt tính protease cho từng peak. Chúng tôi nhận thấy cả ba peak thu đƣợc đều có hoạt tính. Tuy nhiên hoạt tính protease và hàm lƣợng protein của peak 3 cao nhất nên có thể dự đoán peak 3 có chứa protease quan tâm. 59 c) Kết quả tinh sạch protease của Aspergillus oryzae khi tủa protease bằng cồn và muối qua sắc ký lọc gel. Bảng 4.15 : Kết quả tinh sạch protease của Aspergillus oryzae qua sắc ký lọc gel. HT protease (UI/g CP) HL protein (mg/g CP) HTR (UI/mg) Độ tinh sạch Hiệu suất về HT (%) Chế phẩm enzyme thô 29,01 31,2 0,93 1 100 Dịch thu đƣợc sau khi chạy sắc ký qua Biogel P-100 khi tủa muối 19,293 3 6,43 6,91 66,49 Dịch thu đƣợc sau khi chạy sắc ký qua Biogel P-100 khi tủa cồn 10,059 1,7 5,9 6,34 34,67  Nhận xét kết quả lọc gel : Sau quá trình tinh sạch enzyme bằng sắc ký lọc gel, hoạt tính riêng của protease tăng lên đáng kể. Hoạt tính riêng của protease khi tủa bằng muối sau khi qua sắc ký cao hơn khi tủa bằng cồn. Độ tinh sạch của enzyme sau khi qua sắc ký nhƣ sau : + Khi tủa protease bằng muối : Độ tinh sạch gấp 6,91 lần so với chế phẩm enzyme thô ban đầu. + Khi tủa protease bằng cồn : Độ tinh sạch gấp 6,34 lần so với chế phẩm enzyme thô ban đầu. 60 4.6.2 Kết quả đối với Asp.kawasaki a) Kết quả tinh sạch qua lọc gel Biogel P-100 khi tủa protease bằng muối. Hình 4.3 : Sắc ký đồ kết quả tinh sạch qua lọc gel Bio-gel P – 100 khi tủa bằng muối đối với nấm Aspergillus kawasaki. Kết quả tinh sạch qua lọc gel khi tủa enzyme bằng muối thu đƣợc 2 peak với thứ tự nhƣ sau :  Peak1 : từ ống số 7 đến ống 12 : 12 ml  Peak2 : từ ống số 22 đến ống 29 : 16 ml. Xác định hàm lƣợng protein và hoạt tính protease cho từng peak. Chúng tôi nhận thấy cả hai peak thu đƣợc đều có hoạt tính. Tuy nhiên hoạt tính protease và hàm lƣợng protein của peak 2 cao nhất nên có thể dự đoán peak 2 có chứa protease quan tâm. b) Kết quả tinh sạch qua lọc gel Biogel P – 100 khi tủa protease bằng cồn. 61 Hình 4.4 : Sắc ký đồ kết quả tinh sạch qua lọc gel Biogel P-100 khi tủa bằng cồn đối với Aspergillus kawasaki. Kết quả tinh sạch qua lọc gel khi tủa enzyme bằng cồn thu đƣợc hai peak với thứ tự nhƣ sau :  Peak 1 : Từ ống số 7 đến ống 13 : 14 ml.  Peak 2 : từ ống số 14 đến ống 31 : 36 ml Xác định hàm lƣợng protein và hoạt tính protease cho từng peak. Chúng tôi nhận thấy cả hai peak thu đƣợc đều có hoạt tính. Tuy nhiên hoạt tính protease và hàm lƣợng protein của peak 2 cao nhất nên có thể dự đoán peak 2 có chứa protease quan tâm. c) Kết quả tinh sạch protease của Aspergillus kawasaki khi tủa protease bằng cồn và muối qua sắc ký lọc gel. Bảng 4.16 : Kết quả tinh sạch protease của Aspergillus kawasaki qua sắc ký lọc gel. HT protease (UI/g CP) HL protein (mg/g CP) HTR (UI/mg) Độ tinh sạch Hiệu suất về HT (%) Chế phẩm enzyme thô 12,852 20,40 0,63 1 100 Chạy sắc ký qua Biogel P-100 khi tủa muối 8,045 1,38 5,83 9,25 62,7 Chạy sắc ký qua Biogel P-100 khi tủa cồn. 5,534 1,05 5,27 8,37 43,1  Nhận xét kết quả lọc gel : Sau quá trình tinh sạch enzyme bằng sắc ký lọc gel, hoạt tính riêng của protease tăng. Độ tinh sạch của enzyme sau khi qua sắc ký nhƣ sau : 62 + Khi tủa protease bằng muối : Độ tinh sạch gấp 9,25 lần so với chế phẩm enzyme thô ban đầu. + Khi tủa protease bằng cồn : Độ tinh sạch gấp 8,37 lần so với chế phẩm enzyme thô ban đầu. 4.7 So sánh hoạt tính riêng protease qua các lần tinh sạch của hai chủng nấm mốc Aspergillus oryzae và Aspergillus kawasaki. 4.7.1 Tủa protease bằng muối Bảng 4.17 : So sánh hoạt tính riêng protease qua các quá trình tinh sạch khi tủa protease bằng muối. Asp.oryzae Asp.kawasaki Hoạt tính riêng (UI/mg) Dịch thô 0,93 0,63 Dịch tủa muối 3,94 2,68 Dịch sau sắc ký 6,43 5,83 4.7.2 Tủa protease bằng cồn Bảng 4.18 : So sánh hoạt tính riêng protease qua các quá trình tinh sạch khi tủa protease bằng cồn. Asp.oryzae Asp.kawasaki Hoạt tính riêng Dịch thô 0,93 0,63 Đồ thị 4.10 : Đồ thị so sánh hoạt tính riêng protease qua các bƣớc tinh sạch khi tủa protein bằng muối 0 1 2 3 4 5 6 7 Asp.oryzae Asp.kawasaki Dịch enzyme thô Dịch tủa muối Dịch sau sắc ký 63 (UI/mg) Dịch tủa cồn 3,24 2,13 Dịch sau sắc ký 5,9 5,27  Nhận xét :  Qua hai đồ thị 4.10 và 4.11 cho thấy, khi tủa protein bằng tác nhân cồn hay muối hoạt tính riêng của protease từ hai chủng nấm mốc qua các bƣớc tinh sạch đều tăng dần. Sau quá trình tủa, hoạt tính protease tăng lên do đã loại bớt đƣợc một số protein tạp. Tuy nhiên, enzyme vẫn hoàn toàn chƣa sạch do trong đó vẫn còn chứa một số protein lạ khác. Các protein lạ này sẽ bị loại bỏ qua quá trình sắc ký. Do đó, hoạt tính riêng của protease sau khi qua sắc ký cao nhất.  Từ hai đồ thị trên, chúng ta cũng thấy đƣợc hoạt tính protease của Aspergillus kawasaki không cao bằng hoạt tính protease từ Aspergillus oryzae. Nhƣ vậy, nếu đƣa vào sản xuất, chủng Asp.kawasaki vẫn không thể là nguồn vi sinh vật thay thế Asp.oryzae để thu nhận enzyme protease. 4.8 Kết quả phân tách hệ enzyme protease bằng phƣơng pháp điện di trên gel SDS – PAGE. Tiến hành chạy điện di dịch chiết enzyme thô của Aspergillus oryzae và Aspergillus kawasaki. Đồng thời, dịch enzyme thu đƣợc từ các peak sau khi chạy sắc Đồ thị 4.11 : Đồ thị so sánh hoạt tính riêng protease qua các bƣớc tinh sạch khi tủa protease bằng cồn. 0 2 4 6 8 Asp.oryzae Asp.kawasaki Dịch enzyme thô Dịch tủa cồn Dịch sau sắc ký 64 ký của mẫu tủa bằng cồn của cả hai chủng cũng đƣợc chạy điện di đồng thời với dịch chiết enzyme thô. Phƣơng pháp chuẩn bị mẫu nhƣ ở mục 2.2.3 Kết quả điện di nhƣ hình 4.5. Hình 4.5 : Kết quả chạy điện di của các dịch enzyme protease Thứ tự cho mẫu vào các giếng : Giếng 1 : Thang protein chuẩn Giếng 2 : Dịch chiết enzyme thô của Aspergillus oryzae Giếng 3 : Dịch enzyme thu đƣợc từ peak 1 của Aspergillus oryzae. Giếng 4 : Dịch enzyme thu đƣợc từ peak 2 của Aspergillus oryzae. Giếng 5 : Dịch enzyme thu đƣợc từ peak 3 của Aspergillus oryzae. Giếng 6 : Dịch chiết enzyme thô của Aspergillus kawasaki. Giếng 7 : Dịch enzyme thu đƣợc từ peak 1 của Aspergillus kawasaki. Kdal 200 116,25 1 2 97,4 66,2 45 31 21,5 14,4 3 4 5 6 7 8 65 Giếng 8 : Dịch enzyme thu đƣợc từ peak 2 của Aspergillus kawasaki. Từ kết quả điện di, tính giá trị Rf của từng protein trong thang chuẩn. Từ đó xây dựng phƣơng trình hồi quy tuyến tính giữa giá trị Rf và lg trọng lƣợng phân tử của các protein trong thang chuẩn bằng phần mềm Excel. Bảng 4.19 Giá trị Rf và trọng lƣợng phân tử của những protein trong thang. Rf Trọng lƣợng phân tử (daltons) Lg(trọng lƣợng phân tử) 0,0317 200.000 5,301 0,1111 116.250 5,065 0,2539 974.000 4,988 0,3174 662.000 4,820 0,5555 45.000 4,653 0,7460 31.000 4,491 0,9206 21.500 4,332 0,9682 14.400 4,158 Đồ thị 4.12 : Sự tƣơng quan giữa Lg của trọng lƣợng phân tử và giá trị Rf. Phƣơng trình hồi quy tuyến tính thu đƣợc từ đồ thị 4.12 nhƣ sau : Y = - 1,0576X + 5,2426 Trong đó : Y = lg(trọng lƣợng phân tử protein) X = Rf : Tỷ số giữa khoảng cách di chuyển của protein và khoảng cách di chuyển của vạch màu bromophenol blue cuối cùng tính từ gel phân tách. y = -1.0576x + 5.2426 4 4.2 .4 4.6 4.8 5 5.2 5.4 5.6 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 Rf Lg (tr ọn g lư ợn g ph ân tử ) 66 Từ phƣơng trình hồi quy tuyến tính, có thể suy ra công thức tính trọng lƣợng phân tử của protein : Trọng lƣợng phân tử protein = 10Y Từ hình 4.5 cho thấy :  Đối với Aspergillus oryzae:  Giếng 2 xuất hiện bốn vạch, là bốn loại protein có trong dịch chiết enzyme thô.  Giếng 3 và 4 không xuất hiện vạch protein, kết quả này là do hàm lƣợng protein trong peak 1 và 2 thấp nên không hiện vạch trên điện di đồ.  Giếng 5 xuất hiện 2 vạch. Vì hoạt tính của peak 3 cao nhất nên có thể dự đoán hai vạch này chính là hai loại protease do Asp.oryzae sinh ra. Giá trị Rf và trọng lƣợng phân tử của hai loại protease đƣợc tính toán dựa vào kết quả điện di và phƣơng trình hồi quy tuyến tính. Kết quả nhƣ bảng 4.20. Bảng 4.20 Giá trị Rf và trọng lƣợng phân tử protease ở peak 3 của Asp.oryzae Thứ tự vạch X = Rf Y Trọng lƣợng phân tử của protease (Daltons) Vạch 1 0,6031 4,6046 40.242 Vạch 2 0,7619 4,4368 27.340  Đối với Aspergillus kawasaki: Trong hai peak thu đƣợc của Asp.kawasaki sau khi chạy sắc ký, peak 2 có hoạt tính protease và hàm lƣợng protein cao nhất và cho hai vạch trên điện di đồ, peak 1 cho hoạt tính protease thấp và không xuất hiện vạch trên điện di đồ. Từ đó có thể dự đoán hai vạch của peak 2 chính là hai loại protease do Asp.kawasaki sinh ra. Giá trị Rf và trọng lƣợng phân tử của hai loại protease đƣợc tính toán dựa vào kết quả điện di và phƣơng trình hồi quy tuyến tính. Kết quả nhƣ bảng 4.21. Bảng 4.21 Giá trị Rf và trọng lƣợng phân tử protease ở peak 2 của Asp.kawasaki. Thứ tự vạch X = Rf Y Trọng lƣợng phân tử của protein (daltons) 67 Vạch 1 0,5873 4,3192 41.828 Vạch 2 0,873 4,3192 20.859 PHẦN 5 : KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết Luận Từ những kết quả thu đƣợc qua các thí nghiệm, chúng tôi rút ra những kết luận sau : 5.1.1 Chủng nấm mốc Aspergillus oryzae  Nồng độ muối (NH4)2SO4 65% độ bão hòa là nồng độ tối ƣu để tủa enzyme protease.  Tỷ lệ dịch trích enzyme : cồn = 1 : 4 là tỷ lệ tối ƣu để tủa enzyme protease.  Điều kiện tối ƣu cho hoạt động của protease : Protease hoạt động tốt nhất ở nhiệt độ 470C và pH = 7.  Sau khi tủa protease bằng muối (NH4)2SO4 và cồn 96 0, hoạt tính riêng của protease tăng lên : + Khi tủa muối : Hoạt tính riêng của dịch chiết enzyme thô từ 0,93 UI/mg tăng lên 6,43 UI/mg. + Khi tủa cồn : Hoạt tính riêng của dịch chiết enzyme thô từ 0,93 UI/mg tăng lên 5,9 UI/mg.  Sau khi qua sắc ký : + Khi tủa protease bằng muối : tỷ lệ % hoạt tính sau khi lọc gel so với chế phẩm thô ban đầu là 66,49% ; độ tinh sạch của enzyme sau khi qua lọc gel tăng 6,91 lần so với chế phẩm enzyme thô. + Khi tủa protease bằng cồn : Tỷ lệ % hoạt tính sau lọc gel so với chế phẩm thô ban đầu là 34,67% ; độ tinh sạch của enzyme sau khi qua lọc gel tăng 6,34 lần so với chế phẩm enzyme thô. 68  Trọng lƣợng phân tử của hai loại protease do Asp.oryzae sinh ra lần lƣợt là 40.242 và 27.340 daltons. 5.1.2 Chủng nấm mốc Aspergillus kawasaki  Nồng độ muối (NH4)2SO4 65% độ bão hòa là nồng độ tối ƣu để tủa enzyme protease.  Tỷ lệ dịch trích enzyme : cồn = 1 : 4 là tỷ lệ tối ƣu để tủa enzyme protease.  Điều kiện tối ƣu cho hoạt động của protease : Protease hoạt động tốt nhất ở nhiệt độ 470C và pH7.  Sau khi tủa protease bằng muối (NH4)2SO4 và cồn 96 0, hoạt tính riêng của protease tăng lên : + Khi tủa muối : Hoạt tính riêng của dịch chiết enzyme thô từ 0,63 UI/mg tăng lên 5,83 UI/mg. + Khi tủa cồn : Hoạt tính riêng của dịch chiết enzyme thô từ 0,63 UI/mg tăng lên 5,27 UI/mg.  Sau khi qua sắc ký : + Khi tủa protease bằng muối : tỷ lệ % hoạt tính sau khi lọc gel so với chế phẩm thô ban đầu là 62,7% ; độ tinh sạch của enzyme sau khi qua lọc gel tăng 9,25 lần so với chế phẩm enzyme thô. + Khi tủa protease bằng cồn : Tỷ lệ % hoạt tính sau lọc gel so với chế phẩm thô ban đầu là 43,1% ; độ tinh sạch của enzyme sau khi qua lọc gel tăng 8,37 lần so với chế phẩm enzyme thô.  Trọng lƣợng phân tử của hai loại protease do Asp.kawasaki sinh ra lần lƣợt là 41.828 và 20.859 daltons. 5.1.3 So sánh hai chủng Aspergillus oryzae và Aspergillus kawasaki  Protease của cả hai chủng đều hoạt động tốt nhất ở pH7 và nhiệt độ 470C.  Protease thu đƣợc từ Aspergillus oryzae có hoạt tính cao hơn protease từ Aspergillus kawasaki. 5.2 Đề nghị  Khảo sát thêm các phƣơng pháp tủa protein khác nhƣ lắng tủa đẳng điện, lắng tủa bằng các chất đa điện phân.  Tiến hành chạy sắc ký với các loại gel khác Biogel P-100 nhằm tìm ra loại gel tốt nhất để phân tách protease cho kết quả tinh sạch hơn. 69  Tinh sạch tiếp tục protease bằng sắc ký trao đổi ion sau khi qua sắc ký lọc gel.  Thực hiện western blot để kiểm tra vạch protease sau khi chạy điện di. Từ đó hoàn thiện quy trình tinh sạch protease. TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT 1. Nguyễn Hữu Chấn, 1984. Enzyme và xúc tác sinh học. Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ Thuật. 2. Phạm Thị Ánh Hồng, 2003. Kỹ thuật sinh hóa. Nhà xuất bản Đại học Qốc Gia TP.HCM. 3. Nguyễn Đức Lƣợng, 2002. Vi sinh vật học công nghiệp. Nhà xuất bản Đại học Quốc Gia TP.HCM. 4. Nguyễn Đức Lƣợng, 2002. Công nghệ enzyme. Nhà xuất bản Đại học Quốc gia TP.HCM. 5. Nguyễn Văn Mùi, 2001. Thực hành hóa sinh học. Nhà xuất bản Đại học Quốc Gia Hà Nội. 6. Lƣơng Đức Phẩm, 1998 . Công nghệ vi sinh vật. Nhà xuất bản Nông nghiệp 7. Lê Ngọc Tú, La Văn Chứ, Phạm Trân Châu, Nguyễn Lân Dũng, 1982. Enzyme vi sinh vật. Nhà xuất bản Khoa học Kĩ thuật. 8. Viện Sinh Học Nhiệt Đới, 1994 . Công nghệ sinh học và một số ứng dụng tại Việt Nam. Nhà xuất bản Nông nghiệp. 9. Nguyễn Tiến Thắng, 2004. Giáo trình Công nghệ enzyme.Tủ sách trƣờng Đại học Nông Lâm TP.HCM. 10. Nguyễn Tiến Thắng, 2003. Một số kỹ thuật phòng thí nghiệm sinh học. Tủ sách Viện Sinh Học Nhiệt Đới. TIẾNG NƢỚC NGOÀI 11. Amersham Biociences, 2004. Gel Filtration – Principle and Methods. Edition A1. 70 PHỤ LỤC 1) Đƣờng chuẩn Albumin 71 2) Đƣờng chuẩn Tyrosine 72