Luận văn Khảo sát khả năng sinh kháng sinh của các chủng nấm sợi phân lập từ rừng ngập mặn huyện Cần Giờ thành phố Hồ Chí Minh

h thái, phân loại. Các chủng nấm nghiên cứu được cấy trên các môi trường khác nhau MT1, MT 2, MT 4 thành một hoặc ba điểm, nuôi ủ ở nhiệt độ phòng trong thời gian 3  4 ngày. Quan sát sự phát triển của khuẩn lạc Để quan sát đại thể chúng tôi làm KL khổng lồ, quan sát vi thể chúng tôi làm phòng ẩm. Quan sát bào tử, cuống sinh bào tử, hệ sợi nấm dựa vào các tài liệu của Nguyễn Lân Dũng (2000) Ainsworth G.C (1973), Đặng Hồng Miên, Nguyễn Đức Lượng (2003), Bùi Xuân Đồng (2004), Saccardo P.A (cải tiến), Persoon ex Gray (1801) để định dạnh đến chi. Chúng tôi gửi chủng nghiên cứu sang Công ty cổ phần Giám định và Khử trùng FCC định danh đến loài theo phương pháp quan sát hình thái đại thể và vi thể. Dựa vào các khóa phân loại theo TK.A Revision of the genus trichoderma by MA .Rifai; Persoon ex Gray (1921),TK. The Genus Aspergillus – Kenneth B- Raper; TK. Manual of the penicillia by Kenneth B-Raper and Charles Thom để định danh tên giống (xem phụ lục) 3.5.1.a. Đặc điểm đại thể và vi thể của các chủng nấm sợi T1.2 Chủng T 1.2 có tốc độ sinh trưởng nhanh, kích thước khuẩn lạc đạt 10 cm trong 7 ngày, có màu sắc thay đổi tùy theo MT nuôi cấy. Khuẩn lạc lúc non có màu trắng đục, sau già chuyển màu xanh từ xanh lục nhạt đến xanh lục đậm, dạng bông xồm, kết cụm, mép khuẩn lạc hình tia, không xuất hiện giọt tiết. Mặt trái khuẩn lạc không tiết sắc tố. Hệ sợi có vách ngăn, trong suốt, không có tế bào màng dày.Cuống sinh bào tử thì phân nhánh nhiều, 2- 3 lần.. Các nhánh tạo thành các góc rộng với giá hoặc với các nhánh mang chúng. Các nhánh tận cùng ngắn mang ở đỉnh các thể bình. Thể bình hình chai, phình to ở giữa , sau đó thon nhỏ đến đỉnh. Bào tử hình oval, cầu, xuất phát từ đầu trên thể bình, không màu, tập hợp thành các khối tròn ở miệng thể bình, không nhày. Qua các đặc điểm về hình thái khuẩn lạc, khuẩn ty và cơ quan sinh sản trên và dựa vào mô tả của các tác giả chúng tôi có thể kết luận chủng T1.2 thuộc chi Trichoderma. Kết quả này hoàn toàn phù hợp với kết quả định danh của công ty Giám định và khử trùng FCC mà chúng tôi đã gửi chủng T1.2 đến, là loài Trichoderma viride Pers. ex. SF. Gray aggr (phụ lục). a b Hình 3.8. Hình thái đại thể (a) , vi thể ( b) của chủng T. viride T 1.2 (trên MT PDA) 3.5.1.b. Đặc điểm đại thể và vi thể của các chủng nấm sợi T’1[46] Khuẩn lạc của chủng T’1 có màu đen nâu ở giữa, có nhiều vòng đồng tâm dạng bột mịn, mép KL có màu trắng hơi xanh, tốc độ sinh trưởng trung bình, đạt kích thước 3-4 cm trong 7 ngày. Hệ sợi nấm gồm các sợi có vách ngăn, phân nhánh, hơi có màu nâu xẫm.Khối bào tử trên đỉnh bọng thường hình tia tỏa tròn. Bọng đỉnh giá hình cầu, vách dày, giá bào tử trần thắt lại ở phần dưới bọng, vách dày, vùng sinh sản khắp bọng. Thể bình xếp 2 tầng, lớp 1 có hình dạng tam giác ngược, lớp 2 dạng hình chai. BTT có hình dạng cầu, màu nâu đen, có gai thưa, chuỗi bào tử trần tách rời nhau, đôi khi hình cột. Qua các đặc điểm về hình thái khuẩn lạc, khuẩn ty và cơ quan sinh sản trên và dựa vào mô tả của các tác giả chúng tôi kết luận chủng T’1 thuộc chi Aspergillus. Kết quả này hoàn toàn phù hợp với kết quả định danh của công ty Giám định và khử trùng FCC mà chúng tôi đã gửi chủng T’1 đến, là loài Aspergillus foetidus var acidus Naka, Simo and Wat.(phụ lục). a b Hình 3.9. Hình thái đại thể (a)vi thể (b) của chủng A. foetidus T’1. 3.5.1.c. Đặc điểm đại thể và vi thể của các chủng nấm sợi T7.1[46] Hình dạng khuẩn lạc tròn, khi non bề mặt KL có màu trắng, sau 3 ngày chuyển sang màu đen nâu, dạng bột rời, ghồ lên ở giữa khuẩn lạc. Tốc độ sinh trưởng trung bình, kích thước 3,5- 4 cm trong 7 ngày. Hệ sợi nấm gồm các sợi có vách ngăn, phân nhánh, vách nhám, dầy. Bọng đỉnh giá hình cầu. Giá bào tử trần thắt lại ở phần dưới bọng, vách dày, vùng sinh sản khắp bọng Thể bình xếp 2 lớp, lớp 1 hình dạng tam giác ngược, lớp 2 hình dạng chai. BTT có hình dạng cầu, có gai rõ. Chuỗi BTT tách rời nhau, đôi khi hình cột, khối bào tử trên đỉnh bọng thường hình tia tỏa tròn. Sau 5 ngày nuôi cấy xuất hiện rõ các hạch nấm màu trắng kem, hình cầu, số lượng tập trung nhiều ở tâm khuẩn lạc, đường kính gần 1mm. a b Hình 3.10. Hình thái đại thể (a), vi thể (b) của chủng: A.tubingensis T 7.1 ( MT Czapek- Dox) T 7.1 Qua các đặc điểm về khuẩn lạc, khuẩn ty và cơ quan sinh sản trên và dựa vào mô tả của các tác giả chúng tôi kết luận chủng T 7.1 thuộc chi Aspergillus Kết quả này hoàn toàn phù hợp với kết quả định danh của công ty Giám định và khử trùng FCC mà chúng tôi đã gửi chủng T 7.1 đến, là loài Aspergillus tubingensis (Schober) Messeray. 3.5.1.d. Đặc điểm đại thể và vi thể của các chủng nấm sợi Đ 33.1[48] Khuẩn lạc có dạng tròn, mặt nhung mịn, bột rời. Khuẩn lạc có phân vùng rõ rệt, tâm khuẩn lạc có màu xanh đậm (Deep Green) kế đến có màu xanh nhạt hơn, rìa trắng. Mặt trái KL có màu vàng da cam có nhiều vòng đồng tâm xen kẽ rãnh phóng xạ, có hình mạng nhện. Tốc độ sinh trưởng chậm, kích thước 2,2-2,4 cm trong 7 ngày ở nhiệt độ 27 0 C Giá BTT nhẵn, phát triển từ hệ sợi nền, có hình dạng chổi, trên có thể bình hình chai. BTT có hình dạng cầu, không vách ngăn, tạo thành chuỗi dài , hơi tỏa. a b Hình 3.11. Hình thái đại thể (a), vi thể (b) của chủng P.citrinum Thom Đ33.1 Qua các đặc điểm về khuẩn lạc, khuẩn ty và cơ quan sinh sản trên và dựa vào mô tả của các tác giả chúng tôi kết luận chủng Đ 33.1 thuộc chi Penicillium. Kết quả này hoàn toàn phù hợp với kết quả của công ty Giám định và khử trùng FCC mà chúng tôi đã gửi chủng Đ 33.1 đến, là loài Penicillium citrinum Thom. Bảng 3.8. Đặc điểm phân loại 4 chủng nấm sợi nghiên cứu. Đặc điểm chủng nấm nghiên cứu Đặc điểm phân loại các taxon tương ứng theo Bùi Xuân Đồng (2004) T 1.2 - KL tròn, từ màu trắng đến xanh lục, phát triển nhanh. - Khuẩn ty trong suốt. - Cuống sinh bào tử ngắn, phân nhánh nhiều. - Thể bình hình chai -BTT tập trung thành khối ở miệng thể bình, hình oval Trichoderma -KL có màu trắng hoặc từ trắng đến lục, phát triển nhanh. - Khuẩn ty không màu - Cuống sinh bào tử phân nhánh nhiều. - Thể bình hình chai, phình to. - BTT liên kết thành chùm nhỏ, hình cầu, oval. T ‘1 - Khuẩn lạc có màu đen nâu. - Khuẩn ty hơi có màu nâu xẫm. - Bọng hình cầu, thắt lại ở phần dưới bọng. - Thể bình xếp 2 tầng. - BTTcó hình dạng cầu, màu nâu đen, có gai thưa, chuỗi BTT tách rời nhau thành hình tia. T 7.1 - KL tròn, màu đen nâu. - Khuẩn ty hơi có màu nâu xẫm, vách nhám, dầy - Bọng hình cầu, thắt lại ở phần dưới bọng. - Thể bình xếp 2 tầng - BTT có hình dạng cầu, có gai rõ, chuỗi BTT xếp hình tia tỏa tròn. - Hạch nấm có màu trắng kem, hình cầu, ở tâm khuẩn lạc. Aspergillus - Khuẩn lạc có màu đen nâu. - Khuẩn ty không màu hay nâu xẫm tùy vùng của KL. - Cuống sinh bào tử phồng to ở đầu thành bọng hình chùy hay hình cầu - Thể bình xếp 2 tầng. - BTT không vách ngăn, thay đổi về hình dạng, kích thước, màu sắc, bên ngoài có gai, xếp thành chuỗi dài hoặc ngắn tụ họp thành hình cột hoặc tia tỏa tròn. Đ 33.1 - Khuẩn lạc có màu lục xanh tươi, mặt nhung. Mặt trái KL có màu vàng da cam. - Giá BTT và thể bình dạng “chổi” - Giá BTT nhẵn, phát triển từ hệ sợi nền - Chổi có từ 1 đến 2 tầng không cân đối, hình dạng trụ dài, hơi tỏa. - Thể bình có từ 3- 5 thể bình trên cuống nhỏ,hình chai. -BTT có hình dạng cầu, tạo thành chuỗi dài. Penicillium -KL có màu xanh lục, có vết khía xuyên tâm. Mặt trái KL có màu do các sắc tố hòa tan. - Bộ máy mang BTT dạng “chổi” gồm giá BTT và thể bình. -Giá BTT phát triển từ các sợi nấm nằm sát cơ chất. - Thể bình xếp không đều trên phần ngọn giá, có phần đỉnh ngắn và thon nhỏ dần. - BTT hình cầu, dạng chuỗi dài trên miệng thể bình. 3.5.2. Một số đặc điểm sinh lý, sinh hóa của các chủng nấm sợi nghiên cứu. 3.5.2.1.Khảo sát khả năng sinh enzym ngoại bào của các chủng nấm sợi. Ngoài việc tìm hiểu khả năng sinh kháng sinh của các chủng phân lập được, chúng tôi tiến hành khảo sát khả năng sinh các enzym ngoại bào, khả năng phân giải cacbuahydro. Đây là các đặc tính được quan tâm nhiều của các chủng nấm sợi đang sinh sống ở RNM. Chúng tôi tiến hành nuôi các chủng nghiên cứu trên MT 1và thay đường glucose bằng các cơ chất tương ứng là CMC, casein, tinh bột để thử enzym ngoại bào theo phương pháp 2.2.3.1.Sau đó thử khả năng phân giải dầu theo phương pháp 2.2.3.5, nuôi trên MT 8 sau 15 ngày kiểm tra kết quả. Kết quả được ghi lại ở bảng 3.12, hình 3.11, 3.12. Bảng 3.9. Hoạt tính enzym của các chủng nghiên cứu Cellulaza Amylaza Proteaza STT Kí hiệu chủng Hiệu suất phân giải (D- d,mm) Hiệu suất phân giải (D- d, mm) Hiệu suất phân giải (D- d mm) Khả năng phân giải dầu 1 T 1.2 23,4 6,5 0,5 - 2 T’1 9,0 0,5 0,5 - 3 T7.1 5,0 1,5 0,5 ++ 4 Đ 33.1 11,0 0, 5 0, 5 +++ Ghi chú: khả năng phân giải dầu:+ yếu, ++ trung bình, +++ mạnh, - không phân giải. Qua bảng 3.9 cho thấy: - Hầu hết các chủng NC ngoài hoạt tính kháng sinh còn có khả năng sinh enzym ngoại bào như cellulaza, amylaza, proteaza - Chủng T.viride T 1.2 có hoạt tính cellulaza mạnh. - Còn các chủng còn lại khả năng sinh enzym ngoại bào tại vị trí nấm mọc. Đây là các enzym thủy phân có vai trò chủ đạo trong việc phân giải các biopolymers trong tự nhiên, khoáng hóa các đại phân tử này. Nhờ có hệ enzym phong phú này mà chúng dễ dàng tồn tại trong RNM. Hệ nấm sợi có ý nghĩa rất lớn trong hệ sinh thái RNM, nơi mà nguồn năng lượng chủ yếu là các chất lignoxenluloza (lá rụng, cành cây chết, hoa, quả, cỏ..v.v…). Chính chúng là các tác nhân tham gia tích cực phân giải các cơ chất lignoxenluloza, protêin, tinh bột trong rừng ngập mặn. - Chủng P.citrinum Đ 33.1, chủng A. tubingensis T 7.1 chúng có khả năng phân giải dầu với các mức độ khác nhau. Chúng có khả năng phân giải các thành phần cacbua hydro thơm trong dầu và các hợp chất mạch vòng benzen độc hại khác trong môi trường. Bởi vậy chúng là các VSV có triển vọng ứng dụng làm sạch môi trường, khép kín chu trình năng lượng trong hệ sinh thái này. Sự có mặt của chúng trong RNM là tác nhân tự vệ tự nhiên của hệ sinh thái này trước sự cố tràn dầu, ô nhiễm dầu xảy ra hằng ngày ở vùng RNM Cần Giờ. Đ 33.1 Hình 3.12. Họat tính enzym cellulaza Hình 3.13. Khả năng phân giải của chủng T.viride T 1.2 dầu của chủng P.citrinum Đ 33.1 3.5.2.2.Khảo sát ảnh hưởng của một số điều kiện môi trường lên sự sinh trưởng và phát triển của các chủng nấm sợi nghiên cứu. Để hiểu sâu hơn về các chủng T.viride T 1.2, A. foetidus T’1, A. tubingensis T7.1, P.citrinum Đ 33.1 chúng tôi tiến hành nghiên cứu một số đặc điểm sinh lý, sinh hóa như thử khả năng đồng hóa các nguồn hydrat cacbon, nitơ, độ pH, thời gian sinh trưởng. Cấy các chủng nghiên cứu trên các MT 1, MT2. Ủ 3 ngày, sau đó quan sát sự sinh trưởng của các chủng bằng cách đo đường kính khuẩn lạc. Kết quả thu được ghi ở bảng 3.10, đồ thị 3.1-3.5. Bảng 3.10. Một số đặc điểm sinh lý, sinh hóa của các chủng nấm sợi sinh kháng sinh. Mức độ phát triển- ĐKKL ( mm) Các đặc điểm T’1 T 7.1 T 1.2 Đ 33.1 Glucô 15 18 38 14 CMC 11 20 20 17 Tinh bột 13 20 46 9 Succrose 11 25 47 12 Galactose 10 21 40 11 Khả năng đồng hóa nguồn Cacbon Rỉ đường 45 30 55 21 NaNO3 15 19 38 15 Cao thịt 39 50 60 20 Bột đậu 37 49 58 18 NH4Cl 18 20 37 14 (NH4 )2SO4 11 14 37 10 NH4 NO3 16 17 34 11 Khả năng đồng hóa nguồn Nitơ NaNO2 10 12 10 8 0 % 29 25 40 17 3 % 15 18 38 15 5 % 16 16 20 11 7 % 15 15 15 9 10 % 13 13 11 8 Khả năng chịu mặn 20 % 6 7 8 3 3 0 0 2 0 4 10 12 25 5 5 15 18 38 14 6 15 18 39 15 7 13 14 20 8 8 0 0 0 0 pH 9 0 0 0 0 1 ngày 3 3,5 8 1 2 ngày 10 11 29 6 3 ngày 15 18 38 15 4 ngày 23 28 73 18 5 ngày 30 30 74 20 6 ngày 34 35 75 22 Thời gian 7 ngày 39 40 77 24 * Qua bảng 3.10 và đồ thị 3.1cho thấy tất cả các chủng nấm sợi tuyển chọn đều có khả năng đồng hóa nguồn cacbon khác nhau. Chúng phát triển tốt trên tất cả các nguồn cacbon đem thử. Trong đó nguồn cacbon là rỉ đường thì có ảnh hưởng tốt nhất đến sự phát triển của các chủng nấm sợi. Có thể là trong rỉ đường ngoài nguồn cacbon còn có một số chất hữu cơ khác như nitơ, một ít chất khoáng cần cho sự sinh trưởng của nấm sợi. Đây là đặc điểm thuận lợi vì rỉ đường là nguồn phế thải vừa rẻ tiền vừa dễ kiếm. Còn nguồn cacbon là CMC thì không thích hợp lắm cho sự phát triển của các chủng này nhưng nó vẫn phát triển được. Điều này cũng chứng tỏ các nấm sợi RNM có các enzym phân giải polisacarit rất tốt. Vậy trong thực tế thức ăn chủ yếu của nấm sợi là thảm thực vật thì chúng có khả năng sử dụng nguồn cacbon tự nhiên này để sinh sống. 0 10 20 30 40 50 60 Gluco CMC Tinh bột Succrose Galactose Rỉ đường T'1 T7.1 T1.2 Đ33.1 Đồ thị 3.1. Khả năng đồng hóa nguồn cacbon khác nhau của các chủng T.viride T 1.2, A. foetidus T’1, A. tubingensis T7.1, P.citrinum Đ 33.1 Succrose Galactos glucos Chủng A.foetidus T’1 Chủng A. tubingensis T 7.1 C chủng T.viride T1.2 Succrose Glucose Galactose CMC TB Rỉ đường CMC Succrose Glucose Tinh bột galactose Rỉ đường Tinh bột Rỉ đường glucose Chủng P.citrinum Đ 33.1 Hình 3.14. Khả năng đồng hóa nguồn cacbon khác nhau của các chủng NC 0 10 20 30 40 50 60ĐKKL (mm( Na NO3 C a o t h ịt Bột đậu NH4C l (NH4)2SO4 NH4NO3 Na NO2 Nguồn Nitơ T'1 T7.1 T1.2 Đ33.1 Đồ thị 3.2: Khả năng đồng hóa nguồn nitơ khác nhau của các chủng nấm sợi. (NH4 )2SO4 Bột đậu NH4 Cl NaNO3 Chủng A.foetidus T’1 Chủng A. tubingensis T 7.1 Chủng T.viride T 1.2 NH4 NO3 Cao thịt NaNO2 (NH4 )2SO4 Bột đậu NH4 Cl NaNO3 NaNO2 Cao thịt NH4 NO3 (NH4 )2SO4 Bột đậu NH4 Cl NaNO3 NH4 NO3 Cao thịt NaNO2 (NH4 )2SO4 Bột đậu NH4 Cl NaNO3 Chủng P.citrinum Đ 33.1 Hình 3.15. Khả năng đồng hóa nguồn nitơ khác nhau của các chủng nấm NC * Qua bảng 3.10, đồ thị 3.2 cho thấy các chủng nấm sợi tuyển chọn đều có khả năng đồng hóa nguồn nitơ khác nhau, ở các mức độ mạnh yếu khác nhau. Chúng đều đồng hóa tốt nguồn nitơ hữu cơ (như cao thịt, bột đậu) cũng như vô cơ là NO-3 nhưng khả năng đồng hóa NH+4, NO-2 lại ở mức trung bình. Như vậy NH+4, NO-2 đã ảnh hưởng không tốt tới sự phát triển của nấm sợi bởi việc khử đồng hóa NH+4, NO-2 đã gây ra sự thay đổi pH nội bào.Theo Nguyễn Đức Lượng, các nấm sợi phát triển yếu trên môi trường chứa NH4Cl, nguyên nhân chính không phải ở bản thân gốc NH+4 mà do độ chua sinh lý do các muối này tạo ra. Sau khi đồng hóa NH+4 môi trường sẽ tích lũy gốc Cl – sẽ làm giảm rất nhiều trị số pH của môi trường. Đây là một đặc tính có ý nghĩa sinh thái vì trong hệ sinh thái RNM cũng như trong bất kỳ hệ sinh thái nào, mỗi ngày chúng đều thải ra môi trường hàng loạt xác bã của động vật, thực vật. Những xác bã này được phân hủy, chuyển hóa thành các hợp chất nitơ vô cơ trong đó có nitơrit rất độc đối với tế bào thực vật. Người ta ứng dụng chúng để xử lý nitơrit trong môi trường sinh thái. * Qua bảng 3.10, đồ thị 3.3 cho thấy các chủng này đều có khả năng phát triển tốt ở môi trường nước biển có nồng độ muối là 3 % NaCl. Còn trên môi trường có các nồng độ muối cao hơn thì sự sinh trưởng và phát triển giảm.Vậy những nấm sợi phân lập được này là các vi nấm có khả năng chịu mặn cao. Chúng có thể có nguồn gốc từ đất liền (vì hầu hết các chủng nấm này là các chi điển hình thường gặp ở đất liền không ngập mặn) dần thích ứng với môi trường ngập mặn và cư trú lâu dài trong hệ sinh thái này. Vậy chúng là các vi sinh vật chịu mặn tùy tiện. Nồng độ muối ảnh hưởng không tốt tới sự phát triển của các chủng nấm sợi. Khi nồng độ muối của môi trường cao thì Na+ vận chuyển qua màng tế bào chất vào trong tế bào khi đó sẽ có dòng H+ chuyển động ngược chiều với nó, do đó làm thay đổi pH của môi trường nội bào làm biến đổi pH của môi trường nội bào từ trung tính trở nên kiềm hơn. Sự thay đổi pH của môi trường nội bào sẽ ảnh hưởng tới các phản ứng sinh lý, sinh hóa nội bào. Do đó ảnh hưởng tới khả năng sinh trưởng và phát triển. Khi nồng độ NaCl cao sẽ dẫn tới sự chênh lệch gradien nồng độ giữa môi trường nội bào và môi trường bên ngoài, nước từ tế bào chất sẽ đi ra ngoài gây co nguyên sinh làm tế bào dừng hoặc chậm phân chia. Chúng sinh trưởng yếu hơn khi nồng độ muối tăng lên tới 20 % . Điều này chứng tỏ chúng là những chủng chịu mặn (Halotolerance) chứ không phải là các chủng ưa mặn (Halophille). Sự tồn tại và họat động của các chủng nấm sợi này có ý nghĩa rất lớn đối với hệ sinh thái RNM. Chúng là những tác nhân làm sạch môi trường của RNM. Riêng các chủng P.citrinum Đ33.1; A.tubingensis T 7.1 ngoài hoạt tính đối kháng với các VSV gây bệnh, có hoạt tính phân giải phốt phat khó tan, lại thêm hoạt tính có khả năng chịu mặn. Còn chủng T.viride T1.2 chúng không những có ý nghĩa hết sức quan trọng trong chu trình photpho của RNM mà còn là các đối tượng hấp dẫn có thể sử dụng làm phân phốt phát vi sinh cho các vùng đất nhiễm mặn. 0 5 10 15 20 25 30 35 40 ĐKKL, mm 0% 3% 5% 7% 10% 20% Độ mặn T'1 T7.1 T1.2 Đ33.1 Đồ thị 3.3. Ảnh hưởng của độ mặn đến sự sinh trưởng của các chủng nấm sợi. 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 3 4 5 6 7 8 9 Độ pH ĐK K L, m m T'1 T7.1 T1.2 Đ33.1 Đồ thị 3.4. Ảnh hưởng của pH đến sự sinh trưởng của các chủng nấm sợi. Qua bảng 3.10 và đồ thị 3.4 cho thấy độ pH của môi trường ảnh hưởng rất lớn trong nuôi cấy VSV, như khả năng sinh trưởng của nấm sợi. Các chủng nấm sợi tuyển chọn từ RNM có khả năng phát triển tốt ở MT có độ pH từ 4,5  6. Chủng T.viride T1.2 có khả năng sinh trưởng và phát triển ở môi trường có phổ pH tương đối rộng (từ 3 đến 7), ngoài phạm vi trên nó không sinh trưởng và phát triển. Chủng A. foetidus T’1, A. tubingensis T7.1, T.viride T1.2 , P.citrinum Đ 33.1 đều sinh trưởng và phát triển thích hợp ở môi trường pH= 5÷ 6 * Qua bảng 3.10 và đồ thị 3.5 chúng tôi đánh giá mức độ tăng trưởng của nấm sợi bằng độ lớn của khuẩn lạc trong từng ngày. Chỉ có chủng T.viride T 1.2 sinh trưởng nhanh, khuẩn lạc lớn dần theo thời gian. Còn 3 chủng A. foetidus T’1, A. tubingensis T7.1, P.citrinum Đ 33.1 sinh trưởng ở mức trung bình và chậm. 0 20 40 60 80 100 1 2 3 4 5 6 7 Thời gian (ngày) ĐK K L, m m T'1 T 7.1 T 1.2 Đ 33.1 Đồ thị 3.5. Ảnh hưởng của thời gian đến sự sinh trưởng và phát triển của các chủng nấm sợi NC. 3.5.3. Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố môi trường đến hoạt tính kháng sinh của các chủng nấm sợi tuyển chọn. 3.5.3.1. Ảnh hưởng của nồng độ muối lên hoạt tính kháng sinh của các chủng nấm sợi tuyển chọn. Để khảo sát ảnh hưởng của độ mặn đến quá trình sinh tổng hợp chất kháng sinh, chúng tôi nuôi các các nấm sợi trên môi trường 2.1.4.2 với các nồng độ muối khác nhau 0, 3, 5, 7, 10, 20%. Sau 4 ngày nuôi cấy, xác định họat tính kháng sinh theo phương pháp 2.2.3.2. Kết quả được ghi nhận ở bảng 3.11 Bảng 3.11. Thử họat tính kháng sinh của các chủng nấm nghiên cứu được nuôi ở các môi trường với nồng độ muối (NaCl) khác nhau Họat tính kháng sinh ( D- d, mm) Nồng độ muối 0 % 3 % 5 % 7 % 10 % 20 % STT Chủng NC B. E. B. E. B. E. B. E. B. E. B. E. 1 T 1.2 24 23 20 - - - - - - - - - 2 T’1 28 27 20 21 21 22 21 20 18 15 - - 3 T 7.1 21 21 16 14 18 - 12 - 10 - - - 4 Đ 33.1 30 - 26 - 26 - 25 - 24 - - - Ghi chú: B. : Bacillus. subtillis; E. : E.coli. Qua bảng 3.11 cho thấy: Tính chịu mặn là đặc điểm đặc trưng của nấm sợi RNM. Tất cả các chủng đều có hoạt tính kháng sinh cao khi được nuôi trong môi trường không có muối (NaCl) nhưng cũng có thể sinh kháng sinh ở nồng độ muối 10 % như các chủng A. foetidus T’1; A. tubingensis T 7.1; P.citrinum Đ33.1. Hầu như các chủng nấm sợi nghiên cứu không có hoạt tính kháng sinh ở nồng độ muối 20 %. Điều này chứng tỏ đây là những chủng nấm du nhập từ đất liền vào và thích nghi với điều kiện ở RNM, nơi mà mỗi ngày đều có nước biển ra vào với nồng độ muối khá cao khoảng 40/0 . a b c d Hình 3.16. Hoạt tính đối kháng của chủng Đ 33.1(a)( ở nồng độ muối 7%) với E.coli (mặt trái đĩa pêtri) chủng T1.2 (b) (ở nồng độ muối 3 % ) với B.subtilis. chủng T’1 (c)(ở nồng độ muối 10 %) với E.coli chủng T7.1 (d)( ở nồng độ muối 5%) với B.subtili. 3.5.3.2. Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính kháng sinh. Nuôi cấy các chủng T.viride T 1.2, A. foetidus T’1, A. tubingensis T 7.1, P.citrinum Đ 33.1 trên MT 2, điều chỉnh pH trong môi trường ban đầu, sau 4 ngày cấy thử hoạt tính kháng sinh theo phương pháp 2.2.3.2. với VKKĐ là B.subtilis. Kết quả được ghi nhận ở bảng 3.12. Bảng 3.12. Ảnh hưởng của môi trường pH ban đầu lên họat tính kháng sinh Hoạt tính kháng sinh ( D- d, mm) Độ pH STT CHỦNG NC 3 4 5 6 7 8 9 1 T 1.2 5 25 27 26 20 0 0 2 T’1 0 18 30 30 15 0 0 3 T 7.1 0 22 24 25 14 0 0 4 Đ 33.1 0 15 26 25 0 0 0 0 5 10 15 20 25 30 (D-d, mm) 3 4 5 6 7 8 9 Độ pH ban đầu T1.2 T'1 T7.1 Đ33.1 Đồ thị 3.6. Ảnh hưởng của môi trường pH ban đầu lên hoạt tính kháng sinh Qua bảng 3.12 và đồ thị 3.6, cho thấy pH ảnh hưởng lớn đến khả năng sinh tổng hợp kháng sinh, pH quá cao hoặc quá thấp đều không có lợi cho khả năng sinh trưởng cũng như sinh tổng hợp kháng sinh. Tất cả các chủng nghiên cứu đều có khả năng sinh kháng sinh ở môi trường ban đầu có pH trung tính và hơi axít. Đối với chủng T.viride T1.2 có khả năng cho hoạt tính kháng sinh ở pH từ 3 đến 7. Các chủng A. foetidus T’1, A. tubingensis T 7.1 có khả năng sinh KS ở pH từ 4 đến 7. Còn chủng P.citrinum Đ 33.1 có khả năng sinh KS ở pH từ 4 đến 6. a (pH= 4 ) b (pH=4) Hình 3.17. Hoạt tính kháng sinh của chủng T.viride T1.2 (a), chủng A. tubingensis T7.1(b) 3.5.3.3. Xác định thời gian sinh tổng hợp chất kháng sinh. Để xác định trong khoảng thời gian nuôi cấy nào CKS được tổng hợp và có hoạt tính cao, chúng tôi tiến hành khảo sát thời gian sinh tổng hợp CKS của các chủng nấm nghiên cứu. Nuôi các chủng T.viride T 1.2, A.tubingensis T 7.1, A.foetidus T’1, P.citrinum Đ 33.1 trên MT 2 theo phương pháp 2.2.3.2 để thử hoạt tính KS qua từng ngày nuôi cấy, từ ngày thứ 2 đến ngày thứ 7 sau khi cấy, với VKKĐ là B. subtillus. Kết quả khảo sát được ghi nhận ở bảng 3.13. Bảng 3.13. Xác định thời gian sinh tổng hợp chất kháng sinh. Hoạt tính kháng sinh (D- d, mm) Thời gian (ngày). STT CHỦNG NC 2 3 4 5 6 7 1 T 1.2 0 8 25 26 17 2 2 T’1 0 7 32 30 20 11 3 T 7.1 0 5 27 24 10 5 4 Đ 33.1 0 3 26 22 15 8 0 5 10 15 20 25 30 35 2 3 4 5 6 7 Thời gian (ngày) (D -d , m m ) T1.2 T '1 T7.1 Đ33.1 Đồ thị 3.7. Xác định thời gian sinh tổng hợp chất kháng sinh. Qua bảng 3.13 và đồ thị 3.7 cho thấy: Các chủng sau 2 ngày nuôi cấy chưa thể hiện hoạt tính kháng sinh, chỉ thể hiện rõ từ ngày thứ 3 trở đi và hoạt tính giảm dần vào ngày thứ 6 đến thứ 7. Chủng A. foetidus T’1, A.tubingensis T7.1, P.citrinum Đ 33.1 cho hoạt tính mạnh nhất vào ngày thứ 4 và giảm vào ngày thứ 5 sau khi nuôi cấy nấm. Chủng T.viride T1.2 thì hoạt tính kháng sinh đạt cao vào ngày thứ 5 và giảm vào ngày thứ 6. Thời gian nuôi cấy càng lâu thì hoạt tính kháng sinh của các chủng càng yếu. Thời gian sinh kháng sinh nhiều nhất của các chủng nghiên cứu không giống nhau vì mỗi chúng nấm có tốc độ sinh trưởng và phát triển khác nhau mà CKS là sản phẩm trao đổi chất bậc hai nên thời gian sinh KS không trùng khớp với thời gian sinh trưởng của chúng. Kết quả trên tạo cơ sở cho việc tách chiết CKS ở đúng thời điểm các chủng nấm sợi sinh CKS nhiều nhất để thu được CKS có hoạt tính mạnh hơn. Có thể ở thời điểm sinh nhiều chất KS nhất thì hoạt tính kháng các VSVKĐ mạnh hơn. 3.5.3.4.Độ bền nhiệt. Chúng tôi tiến hành khảo sát khả năng chịu nhiệt của dịch chiết kháng sinh thô thu từ 4 chủng nấm nghiên cứu T.viride T 1.2, A.tubingensis T 7.1, A.foetidus T’1, P.citrinum Đ 33.1 khi nuôi cấy trên MT 2, không có agar. Dịch chiết kháng sinh thô đem giữ ở nhiệt độ 600C, 800C, 1000C, 1150C, 121 0C với thời gian nhất định rồi thử hoạt tính kháng sinh trên VK B.subtilis theo phương pháp 2.2.3.2. Kết quả được ghi nhận ở bảng 3.14. Bảng 3.14 : Độ bền nhiệt của KS trong dịch lên men của các chủng T.viride T 1.2, A.tubingensis T 7.1, A.foetidus T’1, P.citrinum Đ 33.1 Hoạt tính kháng sinh ( D – d , mm) Nhiệt độ Thời gian T’1 T 7.1 T 1.2 Đ 33.1 35 - 39 0C Đối chứng 20 18 30 28 60 0 C 10’ 20 18 29.5 28 30’ 20 18 29.5 28 60’ 20 18 29.5 28 80 0 C 10’ 19 17.5 29.5 28.5 30’ 20 17.5 30 28 60’ 19 18 30 28 100 0 C 10’ 20 18 30 27 30’ 19 18 30 27 60’ 19 18 30 28 115 0 C 10’ 20 18 29.5 28 30’ 20.5 18 30 28 60’ 20 18.5 29.5 28 121 0 C 10’ 19 18 29.5 28 30’ 19 18 30 28 60’ 19.5 18 29.5 28 Qua bảng 3.14 chúng tôi nhận thấy các dịch chiết kháng sinh thô này rất bền với nhiệt độ, hoạt tính kháng sinh không hề giảm khi ở nhiệt độ cao, kể cả 1210 C trong vòng 60 phút. Điều này thuận lợi trong khâu tách chiết, tinh chế, sử dụng trong công nghiệp, trong sản xuất phân bón và bảo quản. Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu của Nguyễn Thị Thu [41]. a b Hình 3.18. Khả năng bền nhiệt dịch chiết KS thô của chủng A. foetidus T’1 (a) ; A.tubingensis T 7.1(b) ở nhiệt độ 1210C (mặt trái đĩa pêtri) 3.6. Bước đầu tìm hiểu khả năng diệt côn trùng của các chủng nấm nghiên cứu: Các chủng nấm sợi RNM được tuyển chọn đều có khả năng sinh kháng sinh và để tìm ra hướng ứng dụng sâu hơn cho các chủng nấm nghiên cứu sau khi khảo sát khả năng đối kháng với VSV gây bệnh ở người đã lờn các loại kháng sinh và nấm gây bệnh cho cây trồng, chúng tôi tiến hành tìm hiểu khả năng diệt sâu tơ, tằm bằng dịch nuôi cấy và bào tử trần của chúng. Dùng bào tử trần, phun 3 ml dịch nuôi cấy lên mỗi đĩa pêtri chứa khoảng 40 cá thể sâu tơ (hay tằm), sau đó theo dõi sự phát triển của chúng trong vòng 15 ngày. Kết quả khảo sát trên tằm, sâu tơ được ghi nhận ở bảng 3.15- 3.22, đồ thị 3.8- 3.15. Bảng 3.15. Khả năng diệt tằm của các chủng T.viride T1.2 Tỉ lệ ( %) chềt của tằm theo thời gian ( ngày ) Tác nhân lây nhiễm 4 6 8 10 12 14 Đối chứng 0 0 2.5 7.5 12.5 12,5 DNC 10.0 15.5 17.5 25.5 70.0 72.5 BTT+HS 2.5 5.0 12.5 15.0 55.0 62.5 Chú thích: Dịch NC: dịch nuôi cấy, HS+ BTT: hệ sợi và bào tử trần 0 10 20 30 40 50 60 70 80 4 6 8 10 12 14 Thời gian (ngày) Tỉ lệ % tằ m c hết DNC BTT-HS ĐC Đồ thị 3.8. Khả năng diệt tằm của các chủng T.viride T 1.2. Qua bảng 3.15 và đồ thị 3.8 cho thấy: Khi không xử lý bằng dịch NC thì tỉ lệ tằm chết là 12,5 % Khi xử lý tằm bằng dịch nuôi cấy nấm sợi T.viride T 1.2 đã xác định được LD 50 ( thời gian gây chết 50 % ) ở tằm sau 12 ngày là 70 %. Còn khi xử lý bằng BTT- HS xác định được LD50 ở tằm cũng sau 12 ngày là 55 %. Vậy tỉ lệ tằm chết do DNC cao hơn do BTT- HS. Khả năng diệt tằm của các chủng T.viride T 1.2 mạnh. Bảng 3.16. Khả năng diệt sâu tơ của chủng T.viride T 1.2. Tỉ lệ ( %) chềt của sâu tơ theo thời gian (ngày) Tác nhân lây nhiễm 4 6 8 10 12 14 Đối chứng 2,5 10 10 10 10 10 Dịch NC 52.5 60,0 62,5 62,5 62,5 62,5 BTT + HS 0 45,0 50,0 50,0 50,0 50,0 0 10 20 30 40 50 60 70 4 6 8 10 12 14 Thời gian (ngày) Tỉ lệ % sâ u ch ết DNC BTT-HS ĐC Đồ thị 3.9 Khả năng diệt sâu tơ của chủng T.viride T 1.2 Qua bảng 3.16 và đồ thị 3.9 cho thấy: Ở mẫu đối chứng tỉ lệ sâu chết 10% Khi xử lý sâu tơ bằng dịch nuôi cấy nấm sợi T.viride T 1.2 đã xác định được LD 50 ở sâu tơ sau 4 ngày 52,5%. Còn khi xử lý bằng BTT- HS xác định được LD50 ở sâu tơ cũng sau 8 ngày 50 %, vậy tỉ lệ sâu tơ chết do DNC cao hơn và thời gian sâu chết cũng nhanh hơn. Khả năng diệt sâu tơ của chủng T.viride T 1.2 ở mức trung bình. Hình 3.19. Khả năng diệt tằm và sâu của chủng T.viride T 1.2. Hình 3. 20. Khả năng diệt tằm và sâu tơ của các chủng A.tubingensis T 7.1 Bảng 3.17. Khả năng diệt tằm của các chủng A.tubingensis T 7.1 Tỉ lệ (%) chềt của tằm theo thời gian ( ngày ) Tác nhân lây nhiễm 4 6 8 10 12 14 Đối chứng 0 0 2.5 7.5 12.5 12,5 ĐC DNC BTT + ĐC DNC HS+BT T ĐC DNC HS-BTT ĐC DNC HS + BTT ĐC DNC BTT+ HS Dịch NC 0 0 22,5 47,5 57,5 65,0 BTT + HS 0 0 0 0 27,5 50,0 0 10 20 30 40 50 60 70 4 6 8 10 12 14 Thời gian (ngày) Tỉ lệ % tằm c hết DNC BTT-HS ĐC Đồ thị 3.10. Khả năng diệt tằm của chủng A.tubingensis T 7.1. Qua bảng 3.17 và đồ thị 3.10 cho thấy: Khi xử lý tằm bằng dịch nuôi cấy chủng nấm sợi A.tubingensis T 7.1 đã xác định được LD 50 ( thời gian gây chết 50 % ) ở tằm sau 12 ngày 57,5 %. Còn khi xử lý bằng BTT- HS xác định được LD50 ở tằm sau 14 ngày là 50 %, vậy tỉ lệ tằm chết do DNC cao hơn . Khả năng diệt tằm của chủng A.tubingensis T 7.1 ở mức trung bình. Bảng 3.18. Khả năng diệt sâu tơ của các chủng T 7.1 Tỉ lệ ( %) chềt của sâu tơ theo thời gian ( ngày ) Tác nhân lây nhiễm 4 6 8 10 12 14 Đối chứng 2,5 10 10 10 10 10 Dịch NC 22.5 52,5 62,5 62,5 62,5 62,5 BTT + HS 0 37,5 52,5 52,5 52,5 52,5 0 10 20 30 40 50 60 70 4 6 8 10 12 14 Thời gian (ngày) Tỉ lệ % sâ u ch ết NC BTT-HS ĐC Đồ thị 3.11.Khả năng diệt sâu tơ của chủng A.tubingensis T 7.1 Qua bảng 3.18 và đồ thị 3.11 cho thấy: Khi xử lý sâu tơ bằng dịch nuôi cấy nấm sợi A.tubingensis T 7.1 đã xác định được LD 50 ở sâu tơ sau 6 ngày 52,5%. Còn khi xử lý bằng BTT- HS xác định được LD50 ở sâu tơ cũng sau 8 ngày 52,5 %, vậy tỉ lệ sâu tơ chết do DNC cao hơn và thời gian sâu chết cũng nhanh hơn. Khả năng diệt sâu tơ của chủng A.tubingensis T 7.1 mức trung bình. Bảng 3.19. Khả năng diệt tằm của các chủng A.foetidus T’1. Tỉ lệ ( %) chết của tằm theo thời gian (ngày ) Tác nhân lây nhiễm 4 6 8 10 12 14 Đối chứng 0 0 2.5 7.5 12.5 12,5 Dịch NC 0 0 0 0 60 67,5 BTT + HS 0 0 0 7,5 20,0 55,0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 4 6 8 10 12 14 Thời gian (ngày) Tỉ lệ % tằ m c hết DNC BTT-HS ĐC Đồ thị 3.12.Khả năng diệt tằm của chủng A.foetidus var acidus T’1. Qua bảng 3.19 và đồ thị 3.12 có thể thấy: Khi xử lý tằm bằng dịch nuôi cấy chủng nấm sợi A.foetidus T’1 đã xác định được LD 50 (thời gian gây chết 50 %) ở tằm sau 12 ngày 60%. Còn khi xử lý bằng BTT- HS xác định được LD50 ở tằm sau 14 ngày là 55 %, vậy tỉ lệ tằm chết do DNC cao hơn . Khả năng diệt tằm của các chủng A.foetidus var acidus T’1 ở mức khá mạnh. Bảng 3.20. Khả năng diệt sâu tơ của các chủng A.foetidus var acidus T’1 Tỉ lệ ( %) chềt của sâu tơ theo thời gian ( ngày ) Tác nhân lây nhiễm 4 6 8 10 12 14 Đối chứng 2,5 10 10 10 10 10 Dịch NC 22.5 50,5 57,5 57.5 57,5 57,5 BTT + HS 0 37,5 52,5 52,5 52,5 52,5 0 10 20 30 40 50 60 70 4 6 8 10 12 14 Thời gian (ngày) Tỉ lệ % sâ u ch ết DNC BTT-HS ĐC Đồ thị 3.13. Khả năng diệt sâu tơ của các chủng A.foetidus var acidus T’1. Qua bảng 3.20 và đồ thị 3.13 cho thấy khi xử lý sâu tơ bằng dịch nuôi cấy nấm sợi A.foetidus T’1 đã xác định được LD 50 ở sâu tơ sau 6 ngày 50,5%. Còn khi xử lý bằng BTT- HS xác định được LD50 ở sâu tơ sau 8 ngày 52,5 %, vậy tỉ lệ sâu tơ chết do DNC cao hơn và thời gian sâu chết cũng nhanh hơn. Khả năng diệt sâu tơ của các chủng A.foetidus var acidus T’1 ở mức trung bình. Hình 3.21 . Khả năng diệt tằm, sâu tơ của các chủng A.foetidus var acidus T’1 ĐC BTT+ HS DNC ĐC DNC HS+ BTT Hình 3.22. Khả năng diệt tằm và sâu tơ của chủng P.citrinum Đ 33.1 Bảng 3.21. Khả năng diệt tằm của các chủng P.citrinum Đ 33.1 Tỉ lệ ( %) chềt của tằm theo thời gian ( ngày ) Tác nhân lây nhiễm 4 6 8 10 12 14 Đối chứng 0 0 2.5 7.5 12.5 12,5 Dịch NC 0 0 2,5 10,0 15,0 32,5 BTT + HS 0 0 0 2,5 5,0 27,5 0 5 10 15 20 25 30 35 4 6 8 10 12 14 Thời gian (ngày) Tỉ lệ % tằ m c hế t DNC BTT-HS ĐC Đồ thị 3.14. Khả năng diệt tằm của các chủng P.citrinum Đ 33.1 ĐC DNC BTT-HS ĐC DNC BTT+ Qua bảng 3.21 và đồ thị 3.14 có thể thấy: khi xử lý tằm bằng dịch nuôi cấy chủng nấm sợi P.citrinum Đ 33.1 đã xác định được tỉ lệ tằm chết là 32,5 % sau 14 ngày nuôi cấy. Còn khi xử lý bằng BTT- HS tỉ lệ tằm chết sau 14 ngày 27,5 %, vậy tỉ lệ tằm chết do DNC cao hơn. Khả năng diệt tằm của chủng P.citrinum Đ 33.1 yếu Bảng 3.22. Khả năng diệt sâu tơ của chủng P.citrinum Đ 33.1 Tỉ lệ ( %) chết của sâu tơ theo thời gian (ngày ) Tác nhân lây nhiễm 4 6 8 10 12 14 Đối chứng 2,5 10 10 10 10 10 Dịch NC 0 0 30 30 30 30 BTT + HS 0 0 25 25 25 25 0 5 10 15 20 25 30 35 4 6 8 10 12 14 Thời gian (ngày) Tỉ lệ % sâ u ch ết DNC BTT-HS ĐC Đồ thị 3.15. Khả năng diệt sâu tơ của chủng P.citrinum Đ 33.1 Qua bảng 3.22 và đồ thị 3.15 khi xử lý sâu tơ bằng dịch nuôi cấy nấm sợi P.citrinum Đ 33.1 đã xác định tỉ lệ chết ở sâu tơ sau 8 ngày 30%. Còn khi xử lý bằng BTT- HS tỉ lệ chết ở sâu tơ sau 8 ngày 25%, vậy tỉ lệ sâu tơ chết do DNC cao hơn. Khả năng diệt sâu tơ của chủng P.citrinum Đ 33.1 yếu. * Các chủng nấm nghiên cứu đều có khả năng diệt tằm, sâu tơ ở các mức độ khác nhau. Dịch chiết kháng sinh thô (dịch nghiên cứu – DNC) có hoạt lực mạnh hơn so với BTT và hệ sợi. -DNC của chủng T.viride T 1.2 có khả năng diệt 70 % tằm sau 12 ngày, còn BTT có khả năng diệt 55% sau 12 ngày. -DNC của chủng A.tubingensis T 7.1 có khả năng diệt 57,5 % tằm sau 12 ngày, còn BTT có khả năng diệt 50% sau 14 ngày. -DNC của chủng A.foetidus T ‘1 có khả năng diệt 60 % tằm sau 12 ngày, còn BTT có khả năng diệt 55% sau 14 ngày. -DNC của chủng P.citrinum Đ 33.1 có khả năng diệt 32,5 % tằm sau 14 ngày, còn BTT có khả năng diệt 27,5 % sau 14 ngày, chủng này có khả năng diệt tằm yếu. - DNC T.viride T 1.2 có khả năng diệt 52,5% sâu tơ sau 4 ngày và 62,5% sau 8 ngày, còn BTT có khả năng diệt 45 % sâu tơ sau 6 ngày. - DNC A.tubingensis T 7.1 có khả năng diệt 52,5% sâu tơ sau 6 ngày, còn BTT có khả năng diệt 52,5% sâu tơ sau 8 ngày. - DNC A.foetidus T’1 có khả năng diệt 50,5% sâu tơ sau 6 ngày, còn BTT có khả năng diệt 52,5% sâu tơ sau 8 ngày. - DNC của chủng P.citrinum Đ 33.1 có khả năng diệt 30% sâu tơ sau 8 ngày, còn BTT có khả năng diệt 25% sâu tơ sau 8 ngày. Kết quả trên cho thấy, các chủng nấm nghiên cứu có khả năng diệt tằm mạnh hơn diệt sâu, kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu của tác giả Nguyễn Vĩnh Hà (2002). Có thể do sâu tơ sống trong điều kiện tự nhiên luôn phải chống chọi với các điều kiện bất lợi của môi trường nên sức đề kháng cao hơn so với tằm. Thời gian chết của sâu tơ nhanh hơn so với tằm, vì thời gian sinh trưởng của sâu tơ ngắn hơn thời gian sinh trưởng của tằm rất nhiều. Qua các lần thí nghiệm lặp lại thử khả năng diệt côn trùng chúng tôi thấy: khi côn trùng mới lột xác, nếu tiến hành thử nấm sợi ngay thì thời gian diệt côn trùng chết sẽ nhanh hơn do khi mới lột xác da của chúng còn mềm, lớp biểu bì bên ngoài chưa hình thành hoàn chỉnh dẫn tới dịch kháng sinh sẽ dễ dàng đi vào bên trong để phân giải các chất mà không bị lớp biểu bì da cản trở. Dịch chiết KS thô có hoạt độ diệt tằm, sâu tơ cao hơn hệ sợi và bào tử thể. Nấm sợi cũng như các VSV khác đều sử dụng nguồn dinh dưỡng khác nhau trong tự nhiên để sống là nhờ có hệ enzym nôi, ngoại bào của chúng. Các chủng có khả năng diệt côn trùng, thì các enzym thủy phân ngoại bào đóng vai trò quan trọng trong quá trình phân hủy da hay biểu bì của côn trùng. Nhờ có hệ enzym phong phú thì các chủng nấm sợi này dễ tồn tại trong tự nhiên. Trong thời gian gần đây, nhiều tác giả đã tách chiết được ngoại độc tố destruxin từ dịch nuôi cấy nấm sợi có khả năng diệt côn trùng Beauveria và Metarhizium. Theo Genthner và cộng tác viên, Sloman cũng xác định từ dịch nuôi cấy chủng Metarhizium sub sp. Anisopliae Ma.83 loại độc tố destruxin A. Có thể những chủng nấm sợi này không những diêt côn trùng bằng hệ enzym mà bằng cả độc tố của mình nữa.Vì thời gian có hạn nên chúng tôi chưa đi sâu vào vấn đề này. Cả 4 chủng nấm sợi nghiên cứu đều có khả năng diệt tằm, sâu tơ ở các mức độ khác nhau. Trong đó chủng T.viride T 1.2 có hoạt lực mạnh với sâu và tằm, chủng A.foetidus T’1 và A.tubingensis T 7.1 có hoạt lực trung bình, còn chủng P.citrinum Đ 33.1 có hoạt lực yếu. Các chủng này tiếp tục được lưu giữ, nghiên cứu và khai thác tiềm năng ứng dụng làm thuốc trừ sâu sinh học cho các cây vùng ngập mặn.Với hoạt tính đối kháng cao với các loài VSV có hại, những nấm sợi này chính là các tác nhân tự nhiên kiểm soát sinh học, giữ cân bằng sinh thái trong hệ sinh thái RNM. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ. 1.Kết luận. 1.1.Kết quả phân lập và tuyển chọn các chủng nấm sợi có khả năng sinh KS của các chủng nấm sợi phân lập từ RNM huyện Cần Giờ. - Từ 312 chủng nấm sợi phân lập từ RNM Cần Giờ, chúng tôi đã khảo sát hoạt tính kháng sinh, có 134 chủng có hoạt tính kháng sinh. - Có 39/312 chủng ( chiếm 12,5%) kháng cả VK G+ lẫn G- - Đã tuyển chọn được 4 chủng  Chủng T.viride T 1.2 có hoạt tính kháng sinh phổ rộng, vừa kháng nấm gây bệnh (C.albicans) ở người, vừa kháng VK G+, vừa kháng VK G-, vừa kháng 6/ 6 nấm gây bệnh ở cây trồng, kháng 3/ 5 chủng VK gây bệnh đã lờn các loại KS.  Chủng A.foetidus T’1, A.tubingensis T7.1 vừa kháng VK gram dương vừa kháng VK gram âm, vừa kháng nấm gây bệnh ở cây trồng, kháng 5/ 5 chủng VK gây bệnh đã lờn các loại KS.  Chủng P.citrinum Đ 33.vừa kháng VK gram dương vừa kháng VK gram âm, vừa kháng nấm gây bệnh ở cây trồng, kháng 3 / 5 chủng VK gây bệnh đã lờn các loại KS. 1.2. Đã nghiên cứu đặc điểm cơ bản của các chủng nấm sợi tuyển chọn (đặc điểm sinh học & phân loại) * Đã định danh - Chủng T 1.2 là giống Trichoderma viride Pers ex. SF Gray aggr . - Chủng T’1 là giống Aspergillus foetidus var acidus Naka, Simo and Wat. - Chủng T 7.1 là giống Aspergillus tubingensis (Schober) Messeray. - Chủng Đ 33.1 là giống Penicillium citrinum Thom. * Đã nghiên cứu một số các đặc điểm sinh học của 4 chủng tuyển chọn T.viride T 1.2, A.tubingensis T 7.1, A.foetidus T’1, P.citrinum Đ33.1. - Đều có khả năng sinh enzym ngoại bào như cellulaza, proteaza, amylaza ở mức độ thấp đến trung bình. - Có khả phân giải dầu mạnh như chủng P.citrinum Đ 33.1, trung bình như chủng A.tubingensis T 7.1. - Có khả năng sinh trưởng và phát triển ở MT có các nồng độ muối khác nhau thậm chí ở nồng độ 20% (NaCl). Tuy nhiên, nếu MT không có muối thì mức độ tăng trưởng mạnh hơn - Sử dụng tốt nguồn cacbon: glucose, succrose,CMC, tinh bột, galactose và phát triển mạnh trên MT rỉ đường. - Sử dụng tốt nguồn nitơ: NaNO3, cao thịt, bột đậu, sử dụng trung bình môi trường NH4 Cl, (NH4)2SO4, NH4NO3, sử dụng yếu NaNO2. - Đã xác định thời gian sinh trưởng và phát triển của: Chủng T. viride T 1.2 phát triển rất nhanh, sau 1 ngày cấy đã có đường kính khuẩn lạc 8mm. Chủng A. foetidus T’1 và chủng A. tubingensis T 7.1 phát triển ở mức trung bình, đường kính khuẩn lạc 30 – 40 mm sau 7 ngày cấy. Chủng P. citrinum Đ 33.1 thì phát triển chậm, đường kính khuẩn lạc 22 - 25 mm sau 7 ngày cấy. * Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến tính chất của chất kháng sinh. - Dịch chiết KS thô của 4 chủng nấm NC rất bền với nhiệt độ: ở 1210C, trong vòng 60 phút thì hoạt tính kháng sinh vẫn không thay đổi. - Đã thử hoạt tính kháng sinh khi nuôi cấy trên các môi trường với nồng độ muối khác nhau, các chủng A.tubingensis T 7.1, A.foetidus T’1, P.citrinum Đ 33.1 vẫn có họat tính kháng sinh với nồng độ NaCl 10%. Còn chủng T.viride T 1.2 chỉ có hoạt tính kháng sinh mạnh khi được nuôi cấy trên môi trường không có muối. * Đã thử hoạt tính kháng sinh khi nuôi cấy trên môi trường với độ pH ban đầu khác nhau. Hoạt tính kháng sinh mạnh khi môi trường ban đầu nuôi cấy ở pH trung tính và hơi axít từ 4,5  6. * Khi khảo sát sự sinh trưởng, phát triển theo thời gian chúng tôi thử hoạt tính kháng sinh: - Các chủng đều có hoạt tính kháng sinh từ ngày thứ 4 sau khi cấy. - Chủng T. rivide T1.2 hoạt tính kháng sinh mạnh nhất vào ngày thứ 5 sau khi cấy. - Các chủng A.tubingensis T 7.1, A.foetidus T’1, P.citrinum Đ 33.1 hoạt tính mạnh nhất vào ngày thứ 4 sau khi cấy. 1.3. Đã tìm hiểu khả năng ứng dụng của các chủng nấm sợi đã được tuyển chọn trong chống côn trùng hại cho cây trồng. - DNC có khả năng diệt tằm, sâu tơ với tỉ lệ cao hơn và thời gian chết nhanh hơn khi sử dụng BTT-HS. - Chủng T. rivide T1.2 hoạt lực mạnh với tằm, hoạt lực trung bình với sâu. - Chủng A.tubingensis T 7.1 hoạt lực trung bình với tằm và sâu tơ. - Chủng A.foetidus T’1 hoạt lực khá mạnh với tằm, hoạt lực trung bình với sâu tơ. - Chủng P.citrinum Đ 33.1 hoạt lực yếu với tằm, sâu tơ. 2. Kiến nghị. Vì thời gian thực hiện đề tài có hạn, các trang thiết bị ở phòng thí nghiệm chỉ ở mức cơ bản. Mong rằng các nghiên cứu sau sẽ tiếp tục khảo sát sâu hơn về các chủng nấm sợi RNM có khả năng sinh kháng sinh như:  Phân loại các chủng nấm sợi bằng kỷ thuật di truyền phân tử.  Xác định được bản chất chất kháng sinh do các chủng nấm sợi sinh ra.  Nghiên cứu ứng dụng dịch chiết kháng sinh trong bảo vệ động vật hoặc thực vật. TÀI LIỆU THAM KHẢO.    Tiếng Việt: 1. Lê Huy Bá (2004), Môi trường, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia TP HCM 2. Nguyễn Thị Thúy Bạch (2003), Nghiên cứu Streptomyces Rừng ngập mặn Thái Thụy- Thái Bình, Luận án Thạc sĩ Sinh học, Trường Đại học Sư Phạm Hà Nội, tr .14-69. 3. Phạm Văn Biên, Bùi Cách Tuyến (2003), Cẩm nang sâu bệnh hại cây trồng, tập 1, 2, Nhà xuất bản Nông nghiệp, TP Hồ Chí Minh. 4. Nguyễn Văn Cách (2004), Công nghệ lên men các chất kháng sinh, Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật, Hà Nội, tr. 20-28. 5. Nguyễn Hoàng Chiến (2000), Nghiên cứu chủng xạ khuẩn Streptomyces V6 sinh chất kháng sinh chống vi khuẩn gây bệnh héo xanh cà chua, Luận án Thạc sĩ Sinh học, trường Đại học Sư Phạm Hà Nội, tr. 8- 23. 6. Phạm Thị Quỳnh Châu (2001), Nghiên cứu hệ nấm mốc trên cà phê nhân ở một số tỉnh miền nam Việt Nam, sơ bộ định tính một vài độc tố và enzym của một số loài nấm mốc trên cà phê nhân, Khóa luận cử nhân khoa học, Đại học Khoa học Tự nhiên, TP HCM, tr. 10. 7. Lê Huy Chính, Nguyễn Vũ Trung (2005), Cẩm nang vi sinh vật y học, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội. 8. Nguyễn Thành Đạt (2005), Cơ sở sinh học vi sinh vật, Tập 1, 2, Nhà xuất bản ĐH Sư phạm, Hà Nội, (1) tr. 196-203, (2) tr. 270. 9. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2000), Vi sinh vât học (TậpI, II), Nhà xuất bản Đại học và Trung học Chuyên nghiệp , Hà Nội. 10. Nguyễn Lân Dũng, Phạm Thị Trân Châu, Nguyễn Thanh Hiền, Lê Đình Lương, Đoàn Xuân Mượu, Phạm Văn Ty (1978), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vât học (Tập III), Nhà xuất bản Khoa học & Kỹ thuật, Hà Nội, tr. 360 11. Trịnh Thị Mỹ Dung (2003), Phân lập, khảo sát đặc điểm các chủng xạ khuẩn phân lập từ đất, khóa luận cử nhân Sinh học, Trường Đại học Sư phạm TPHCM, tr. 4-10. 12. Bùi Xuân Đồng (2004), Nguyên lý phòng chống nấm mốc & mycotoxin, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, tr. 137. 13. Nguyễn Lân Dũng, Vi sinh vật tổng hợp, Nhà xuất bản Khoa học & Kỹ thuật, Hà Nội. 14. Hội nghị Khoa học sinh viên Eureka (2002), Khảo sát hoạt tính các hệ enzym thủy phân chiết tách từ môi trường nuôi cấy Trichoderma và thử ứng dụng chế biến phân hữu cơ vi sinh, Đoàn thanh niên cộng sản Hồ Chí Minh, Trường Đại học khoa học Tự nhiên 15. Nguyễn Thị Thu Hà (2001), Nghiên cứu đặc điểm chủng xạ khuẩn SD HT và ứng dụng trong việc diệt nấm và tuyến trùng hại cây trồng, khóa luận Cử nhân Sinh học, trường Đại học Sư phạm TPHCM, tr. 15. 16. Nguyễn Vĩnh Hà (2002), Khảo sát họat tính đối kháng của các chủng nấm sợi phân lập từ rừng ngập mặn khu vực Giao Thủy, Nam Định và Thái Thụy, Thái bình, Luận án Thạc sĩ Sinh học, Trường Đại học Sư Phạm Hà Nội, tr. 5- 30. 17. Bùi Thị Việt Hà, Kiều Hữu Ảnh (2002), Phân lập và tuyển chọn xạ khuẩn sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh thực vật, Đại học Khoa học Tự nhiên- Đại học Quốc gia Hà Nội. 18. Bùi Thị Việt Hà, Kiều Hữu Ảnh (2002), Nghiên cứu khả năng sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh thực vật của hai chủng xạ khuẩn T41 và D- 42, Đại học Khoa học Tự nhiên- Đại học Quốc gia Hà Nội, tr. 13. 19. Mai Thị Hằng, Phan Nguyên Hồng (2002), Đánh giá vai trò của vi sinh vật trong hệ sinh thái rừng ngập mặn, Trường Đại học Sư Phạm, Hà Nội, tr. 8- 24, 101-128. 20. Nguyễn Hiếu Hạnh, Vũ Thị Thanh Hoàn (2006), Nghiên cứu biện pháp xử lý hạt giống bằng thuốc hóa học để phòng trừ nấm Aspergillus spp gây bệnh mốc hạt sau khi gieo, Viện Khoa học Kĩ thuật Nông nghiệp Miền Nam, TPHCM 21. Đậu Ngọc Hào, Lê Thị Ngọc Diệp (2003), Nấm mốc và độc tố Aflatoxin trong thức ăn chăn nuôi, Nhà xuất bản Nông nghiệp Hà Nội. 22. Trương Phước Thiên Hoàng (2007), Khảo sát hoạt tính một số hệ enzym thủy phân amylase, cellulase, peectinase thu từ ba chủng Trichoderma phân lập từ Miền Đông Nam bộ, Luận án Thạc sĩ Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, TPHCM, tr. 5-11-16-95. 23. Phạm Thành Hổ (2005), Nhập môn công nghệ sinh học, Nhà xuất bản Giáo Dục. 24. Lê Văn Khoa (2005), Đất ngập nước, Nhà xuất bản Giáo Dục, tr. 24-108. 25. Lê Văn Khôi (2006), Khôi phục và phát triển bền vững hệ sinh thái rừng ngập mặn Cần Giờ thành phố Hồ Chí Minh (1978- 2000), Nhà xuất bản Nông nghiệp, tr. 13-56. 26. Nguyễn Đức Lượng (2002), Công nghệ vi sinh (T1,T2), Nhà xuất bản Đại học Quốc gia TPHCM, (2)tr 165. 27. Nguyễn Đức Lượng (2002), Thí nghiệm Công nghệ sinh học, (T1), Nhà xuất bản Đại học Quốc gia TPHCM GS N.X.ÊGÔRÔV, hiệu đính người dịch PGS Nguyễn Lân Dũng (1983), Thực tập vi sinh vât học, Nhà xuất bản “MIR” Maxcơva, Nhà xuất bản Đại học & Trung học chuyên nghiệp, Hà Nội, tr. 167. 28. Vũ Triệu Mân, Lê Lương Tề (2001), Giáo trình bệnh cây nông nghiệp, Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội. 29. Biền Văn Minh (2000), Nghiên cứu khả năng sinh chất kháng sinh của một số chủng xạ khuẩn phân lập từ đất Bình Trị Thiên, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Trường Đại học Sư Phạm Hà Nội. 30. Đặng vũ Hồng Miên (1999), Bảng phân loạii các loàii nấm mốc thường gặp, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội 31. Lê Hồng Ngọc (1998), Tìm hiểu thành phần và vai trò của nấm mốc trong chế phẩm vi sinh vật hữu hiệu EM, Luận án Thạc sĩ Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên. 32. Lê Xuân Phương (2001), Vi sinh vật công nghiệp, Nhà xuất bản Xây dựng, ĐH Đà Nẳng. 33. Löông Ñöùc Phaåm- Hoà Söôûng (1978), Vi sinh toång hôïp, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội. 34. Nguyễn Phong Phú (2004), Khảo sát khả năng thủy phân một số thành phần khó tiêu có trong nguyên liệu thực phẩm bởi nấm mốc Trichoderma, Luận văn tốt nghiệp, Trường Đại học Dân Lập Văn Lang, tr. 10-11. 35. Lê Lương Tề, Vũ Triệu Mân (1999), Bệnh vi khuẩn và virus hại cây trồng, Nhà xuất bản Giáo Dục. 36. Trần Thị Thanh (1997), Công nghệ vi sinh, Trường Đại học Sư Phạm TPHCM. 37. Nguyễn Xuân Thành (2005), Giáo trình Vi sinh vật học công nghiệp, Nhà xuất bản Giáo Dục. 38. Trần Thanh Thủy (1999), Hướng dẫn thực hành vi sinh vật học, Nhà xuất bản Giáo Dục, tr. 54-168. 39. Trần Linh Thước (2003), Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mỹ phẩm, Nhà xuất bản Giáo Dục. 40. Nguyễn Thị Thu (2005), Nghiên cứu đặc tính sinh học và khả năng sinh kháng sinh của các chủng Streptomyces phân lập từ rừng ngập mặn Việt Nam, Luận văn tốt nghiệp, trường Đại học Sư Phạm Hà Nội, tr. 11- 17. 41. Lê Đức Tuấn (2002), Khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần giờ, Nhà xuất bản Nông nghiệp- TPHCM, tr. 6- 17. 42. La Nam Vương (1999), Nghiên cứu xạ khuẩn sinh kháng sinh phân lập từ đất khu vực thị xã Lạng sơn, Luận án Thạc sĩ Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Hà Nội. 43. Viện sinh học nhiệt đới (1993- 1998), (1999- 200),Tuyển tập các công trình nghiên cứu Khoa học Công nghệ, Nhà xuất bản Nông nghiệp, TP HCM, tr. 57-98. Tiếng Anh: 44. Lowell L.Black (1971), Vegetable Diseases. A Practical Guide, Asian Vegetable Research & Development Center, Shanhua, Taiwan 45. A.d.Agate (1988), Mangrove Microbiology, UNDP / UNESCO Regional project research and its application to the management of the mangroves, pp 9.-32. 46. Kenneth B.Raper (1965), The genus Aspergillus, The Williams & Wilkins Company, Baltimore, pp. 310-315 47. Miguel Ulloa & Richard T Hanlin (2000), Illutrated Dictionery of mycology, Universidad National Autonoma de México. 48. Robert A. Samson, Ellen S. Hoekstra, jena C. Frisvad (2004), Introduction to Food and Airborne Fungi, An institude of the Royal Netherlands Academy of Arts and Sciences, pp.196-197. 49. Gary J. Samuels (2004), Trichoderma a guide to identification and biology, United States Department of Agriculture. Trang Web 50. nấm sợi. 51. Natural solution for human health 52. Antibiotic/ drug-discovery. 53. khang sinh 54. 55. 56. thuvienkhoahoc.com 57. 58. detail_vn.php.htm 59. 60. fungi/Trichoderma spiecies.html PHỤ LỤC Phụ lục 1. Các chủng vi khuẩn (kháng các loại KS) được phân lập từ các bệnh phẩm của các bệnh nhân khác nhau. E.coli Pseu. aeroginosa (1) Pseu. aeroginosa (2) Ent ( 1) Ent ( 2) Chất kháng sinh S R S R S R S R S R Cefuroxime      Ceftriaxone     Ceftazidim      Cefotaxime     Cefoperazone      Cepim     Amikacin     Tobramycine      Gentamycin      Ciprofloxacin      Piperacillin + Tazobactam     Ticarcillin+ A. clavulanic    Imipenem      Amoxicillin + A. clavulanic      Ertapenem     Ampi+sulbact     Ghi chú: R: resistance- kháng thuốc S: không kháng Pseu.aeroginosa: Pseudomonas aeroginosa; E.coli: Escherichia coli Ent: Enterobacter; (1), (2) các chủng này được phân lập từ 2 bệnh nhân khác nhau.