Luận văn Khảo sát khả năng tổng hợp amylase, protease của chủng vi khuẩn phân lập từ ao nuôi cá tra

Kết quả và biện luận -43- PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 3.1 Phân lập, làm thuần và chọn lọc 3.1.1 Phân lập và làm thuần các chủng vi khuẩn từ mẫu nước ao nuôi cá Tra 3.1.1.1 Phân lập và làm thuần Nước ao nuôi cá Tra được lấy mẫu, phân lập và giữ giống như ở mục 2.2.1.1, và mục 2.2.1.2. Kết quả phân lập thu được 24 chủng vi khuẩn. Các chủng được đánh số theo ngẫu nhiên. Với một khuẩn lạc ban đầu (do cấy trãi) chứa nhiều hơn một chủng, thì những chủng đó được đánh thêm một số ở phần đuôi. Tiến hành nuôi cấy các chủng vi khuẩn trên môi trường cao thịt-pepton ( như mục 2.1.2.1). Sau 72h tiến hành mô tả hình thái khuẩn lạc như mục 2.2.1.4. Kết quả mô tả được trình bày trong bảng 3.1, hình 3.1, và phụ lục 5.2 Bảng 3.1: Kết quả mô tả hình thái khuẩn lạc trên môi trường Cao thịt- Pepton Tên Đường kính (mm) Hình dạng khuẩn lạc Màu sắc khuẩn lạc Sắc tố ngoại bào Mặt cắt ngang Mép khuẩn lạc 1 1 – 24 Tròn Trắng đục Hồng nhạt Phẳng Răng cưa 2 1 – 11 Tròn Trắng cam Cam Phẳng Răng cưa 3 0.1 – 11 Phức tạp Trắng đục _ Gồ ghề Răng cưa 5 0.5 – 6 Không đều Tím nhạt _ Phẳng Lượn sóng 6.1 1 – 21 Tròn Vàng nhạt Vàng nâu Lồi nhọn Có vành 6.2 0.5 – 15 Gấp nếp Trắng xám Vàng nâu Gồ ghề Bằng phẳng 7 0.5 – 13 Không đều Tím nhạt Tím nhạt Gồ ghề Có múi 8 1 – 20 Gấp nếp Trắng _ Gồ ghề Không đều 9 1 – 14 Tròn Trắng đục _ Lồi cong Có vành 10 0.5 – 8 Không đều Vàng nâu _ Phẳng Lượn sóng 12 0.5 – 9 Không đều Trắng đục _ Gồ ghề Không đều Kết quả và biện luận -44- 13 1 – 17 Tròn Vàng nâu _ Phẳng Bằng phẳng 15.1 1 – 18 Gấp nếp Trắng _ Gố ghề Bằng phẳg 15.2 1 – 8.5 Tròn Vàng nhạt _ Phẳng Bằng phẳng 16 1 – 14 Tròn Vàng nâu Nâu đen Phẳng Bằng phẳng 20 3 – 22 Tròn Vàng _ Lồi cong Có vành 21 1 – 23 Tròn Trắng vàng _ Bằng Răng cưa 23.1 0.1 – 6 Tròn Tím nhạt _ Bằng Có vành 23.3 0.1– 6.5 Tròn Tím nhạt _ Gồ ghề Răng cưa 26.1 1 – 21 Gấp nếp Vàng nâu Nâu đen Gồ ghề Có vành 26.2 1 – 17 Tròn Trắng xám Nâu đen Gồ ghề Bằng phẳng 28.1 1 – 15 Gấp nếp Trắng Nâu đen Gồ ghề Có vành 28.3 1 – 13 Tròn Trắng _ Lồi cong Có vành 28.5 1 – 18 Tròn Trắng _ Lồi nhọn Bằng phẳng Chú thích: _ : Không cho sắc tố ngoại bào. Hình 3.1: Hình dạng khuẩn lạc chủng 3, chủng 8, chủng 12 3.1.1.2 Nhuộm Gram Tiến hành cấy các chủng phân lập được lên môi trường thạch nghiêng Cao thịt- pepton, sau 18 giờ nuôi cấy thì nhuộm Gram như mục 2.2.1.3. ¾ Kết quả nhuộm Gram gồm 16 chủng cho Gram dương, 8 chủng cho gram âm. Kết quả được mô tả cụ thể trong bảng 3.2, hình 3.2. Kết quả và biện luận -45- Bảng 3.2: Đặc điểm tế bào của khuẩn lạc sau 18h nuôi cấy trên môi trường cao thịt- Pepton Tên Gram Hình dạng tế bào Đặc điểm 1 + Que ngắn, Rời rạc, hoặc dạng chuỗi 2 - Cấu Rời rạc 3 + Que ngắn Rời rạc 5 - Cầu Rời rạc 6.1 + Que ngắn Chuỗi 6.2 - Cầu Rời rạc, hoặc chùm 7 + Que ngắn Rời rạc, hoặc chuỗi 8 + Que ngắn Rời rạc 9 + Que ngắn Rời rạc 10 - Que dài Chuỗi 12 + Que ngắn Rời rạc 13 + Que dài Rời rạc 15.1 + Que ngắn Rời rạc 15.2 - Cầu Rời rạc 16 - Que ngắn Rời rạc 20 - Que ngắn Rời rạc, hoặc chùm 21 + Que ngắn Rời rạc 23.1 - Cầu Rời rạc 23.2 + Que ngắn Rời rạc 26.1 + Que ngắn Rời rạc 26.2 + Que dài Rời rạc 28.1 + Que dài Chuỗi 28.3 + Que dài Rời rạc 28.5 + Que ngăn Chuỗi Chú thích: + : Gram dương ; - : Gram âm Kết quả và biện luận -46- Hình 3.2: Hình nhuộm Gram chủng 6.2, 13, 26.1 (que ngắn) + 15.2 (cầu) 3.1.2 Định lượng khả năng tổng hợp amylase và protease của các chủng vi khuẩn phân lập được trên môi trường thạch đĩa Do sự đa dạng của các chủng vi khuẩn và theo mục tiêu của đề tài là chọn lọc ra những chủng vi khuẩn có khả năng tổng hợp amylase và protease ngoại bào, nên trong chọn lọc bước một, chúng tôi sử dụng hai môi trường thạch đĩa (một dành cho sự tổng hợp amylase, một dành cho sự tổng hợp protease) nhằm khảo sát khả năng tổng hợp amylase và protease. Cụ thể như sau: 3.1.2.1 Trên môi trường tăng sinh amylase Tiến hành nuôi cấy các chủng vi khuẩn trên môi trường thạch đĩa tăng sinh amylase như phương pháp 2.2.4.1. Sau 48 giờ, đo đường kính vòng phân giải. Kết quả cụ thể trong bảng 3.3, trên biểu đồ 3.1, hình 3.3, phụ lục 5.3 Bảng 3.3: Kết quả đo đường kính khuẩn lạc trên môi trường thạch đĩa tăng sinh amylase sau 48h nuôi cấy Chủng 1 2 6.1 6.2 7 ĐK 0.269± 0.008 0.023± 0.004 0.344± 0.008 0.348± 0.01 2.005± 0.028 Chủng 8 9 10 12 13 ĐK 1.823± 0.067 0.031± 0.009 1.757± 0.009 2.063± 0.018 0.025 Chủng 15.1 15.2 16 21 26.1 ĐK 1.288± 0.053 0.025 0.769± 0.027 0.441± 0.049 0.588± 0.018 Chủng 26.2 28.1 28.3 28.5 ĐK 0.025 0.028± 0.004 0.025 0.119± 0.009 Kết quả và biện luận -47- Chú thích: ĐK: Đường kính vòng phân giải (cm) 0 0.5 1 1.5 2 2.5 1 2 6. 1 6. 2 7 8 9 10 12 13 15 .1 15 .2 16 21 26 .1 26 .2 28 .1 28 .3 28 .5 Chủng vi khuẩn Đ ườ ng k ín h vò ng p hâ n gi ải (c m ) Biểu đồ 3.1: Kết quả khảo sát khả năng tổng hợp amylase ngoại bào. Hình 3.3: Kết quả khảo sát khả năng tổng hợp amylase ngoại bào ¾ Nhận xét: Xử lý kết quả thu được (trong phụ lục 5.4), kết quả thu được 19 chủng sinh amylase ngoại bào, trong đó chọn ra được 5 chủng cho amylase cao (Chủng 7, 8, 10,12, 15.1). Kết quả và biện luận -48- 3.1.2.2 Trên môi trường tăng sinh protease Tiến hành nuôi cấy các chủng vi khuẩn trên môi trường thạch đĩa tăng sinh protease như phương pháp tại mục 2.2.4.2. Sau 48 giờ, đo đường kính vòng phân giải. Kết quả cụ thể trong bảng 3.4, biểu đồ 3.2, hình 3.4, phụ lục 5.5 Bảng 3.4: Kết quả đo đường kính khuẩn lạc trên môi trường tăng sinh protease sau 48h nuôi cấy trên môi trường thạch đĩa Chủng 1 2 3 5 6.1 ĐK 2.595± 0.092 2.305± 0.064 3.155± 0.042 2.595± 0.205 2.315± 0.092 Chủng 6.2 7 8 9 10 ĐK 2.4± 0.212 2.693± 0.028 3.378± 0.074 2.59± 0.057 2.722± 0.066 Chủng 12 13 15.1 16 21 ĐK 3.035± 0.099 2.285± 0.050 2.2± 0.071 2.828± 0.06 0.788± 0.032 Chủng 26.1 26.2 28.1 28.3 28.5 ĐK 2.541± 0.080 3.105± 0.078 1.418± 0.06 1.894± 0.038 1.838 ± 0.06 Chú thích: ĐK: Đường kính vòng phân giải (cm) 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 1 2 3 5 6.1 6.2 7 8 9 10 12 13 15.1 16 21 26.1 26.2 28.1 28.3 28.5 Chủng vi khuẩn Đ ư ờn g kí nh v òn g ph ân g iả i (c m ) Biểu đồ 3.2: Kết quả khảo sát khả năng tổng hợp protease ngoại bào Kết quả và biện luận -49- Hình 3.4: Kết quả khảo sát khả năng tổng hợp protease ngoại bào ¾ Nhận xét: Xử lý kết quả thu được (trong phụ lục 5.6), kết quả thu được 20 chủng sinh protease, trong đó chọn ra được 5 chủng cho protease cao (chủng 3, 8, 12, 16, 26.2). 3.1.3 Khảo sát khả năng tổng hợp amylase và protease của một số chủng cho hoạt tính cao trên môi trường lỏng Do các chủng vi khuẩn được phân lập từ môi trường nước. Chúng tôi quyết định khảo sát khả năng tổng hợp amylase và protease của một số chủng theo phương pháp nuôi cấy bề sâu trên hai loại môi trường lỏng riêng biệt (một dành cho sự tổng hợp amylase, một dành cho sự tổng hợp protease). Cụ thể như sau: 3.1.3.1 Khả năng tổng hợp amylase của các chủng 7, 8, 10, 12, 15.1 trên môi trường tăng sinh amylase Nuôi cấy các chủng 7, 8, 10, 12, 15.1 theo phương pháp nuôi cấy bề sâu (như mục 2.2.7.2) trên môi trường tăng sinh tổng hợp amylase (như mục 2.1.2.4) với mật độ giống đạt 107 tế bào/ml môi trường nuôi cấy. Khảo sát hoạt độ amylase theo các mốc 72h, 84h, 96h. (xác định hoạt độ amylase theo Heinkel- mục 2.2.6) Kết quả cụ thể được trình bày trong bảng 3.5, biểu đồ 3.3, phụ lục 5.7 Kết quả và biện luận -50- Bảng 3.5: Kết quả hoạt độ amylase của một số chủng vi khuẩn (7, 8, 10, 12, 15.1) nuôi cấy trên môi trường lỏng Thời gian Chủng 72h 84h 96h 7 0.353± 0.014 0.659± 0.012 0.467± 0.013 8 0.813± 0.027 1.718± 0.016 1.132± 0.032 10 0.319± 0.013 0.600± 0.005 0.423± 0.012 12 0.776± 0.023 1.445± 0.011 1.018± 0.029 15.1 0.110± 0.004 0.207± 0.002 0.146± 0.004 0.000 0.200 0.400 0.600 0.800 1.000 1.200 1.400 1.600 1.800 2.000 Chủng 7 Chủng 8 Chủng 10 Chủng 12 Chủng 15.1 Chủng vi khuẩn H oạ t đ ộ (U I/ m l) Biểu đồ 3.3: Kết quả khảo sát khả năng tổng hợp amylase của một số chủng vi khuẩn (7, 8, 10, 12, 15.1) nuôi cấy trên môi trường lỏng ¾ Nhận xét: Xử lý kết quả thu được (trong phụ lục 5.8) cho thấy chủng 8 cho hoạt độ amylase cao nhất. Chúng tôi quyết định chọn chủng 8 để định danh , và nghiên cứu sâu hơn về các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt độ amylase của chủng này. 3.1.3.2 Khả năng tổng hợp protease của các chủng 3, 8, 12, 16, 26.2 trên môi trường tăng sinh protease Nuôi cấy các chủng 3, 8, 12, 16, 26.2 theo phương pháp nuôi cấy bề sâu (như mục 2.2.7.2) trên môi trường tăng sinh tổng hợp protease (như mục 2.1.2.5), với mật độ giống đạt 107 tế bào/ml môi trường nuôi cấy. Khảo sát hoạt độ protease theo các mốc thời gian: 60h, 72h, 84h, 96h (xác định hoạt độ protease theo Anson – mục 2.2.5) Kết quả và biện luận -51- Kết quả cụ thể được trình bày trong bảng 3.6, biểu đồ 3.4, phụ lục 5.9 Bảng 3.6: Kết quả hoạt độ protease của một số chủng vi khuẩn ( 3, 8, 12, 16, 26.2) nuôi cấy trên môi trường lỏng Thời gian Chủng 60h 72h 84h 96h 3 0.177± 0.009 0.502± 0.012 0.362± 0.017 0.182± 0.018 8 0.370± 0.009 1.188± 0.013 1.014± 0.013 0.573± 0.020 12 0.386± 0.018 0.841± 0.007 0.897± 0.028 0.532± 0.007 16 0.145± 0.012 0.212± 0.009 0.156± 0.017 0.111± 0.014 26.2 0.263± 0.021 0.378± 0.011 0.257± 0.009 0.191± 0.014 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 Chủng 3 Chủng 8 Chủng 12 Chủng 16 Chủng 26.2 Chủng vi khuẩn H oạ t đ ộ (U I/ m l) Biểu đồ 3.4: Kết quả khảo sát khả năng tổng hợp protease của một số chủng ( 3, 8, 12, 16, 26.2) nuôi cấy trên môi trường lỏng ¾ Nhận xét: Xử lý thống kê số liệu (trong phụ lục 5.10) cho thấy chủng 8 cho hoạt độ protease cao nhất. Chúng tôi quyết định chọn chủng 8 để định danh , và nghiên cứu sâu hơn về các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt độ protease của chủng này. 3.2 Định danh vi khuẩn: Tiến hành cấy chuyền chủng 8, và gửi định danh (mục 2.2.10). ¾ Kết quả định danh chủng 8: Bacillus subtilis. (trong phụ lục 5.11) Kết quả và biện luận -52- 3.3 Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến hoạt độ amylase, protease của Chủng 8 (Bacillus subtilis) khi nuôi cấy trên môi trường lỏng: Do chủng 8 được phân lập từ nước, và nhằm mục đích tìm ra môi trường lỏng tăng sinh tối ưu cho chủng 8, thử nghiệm sơ bộ chủng 8 vào môi trường nước ao nuôi cá Tra. Chúng tôi quyết định khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến hoạt độ amylase và protease của chủng 8 (như pH môi trường, nồng độ cơ chất trong môi trường, và mật độ giống nuôi cấy) khi tiến hành nuôi cấy bề sâu trên hai môi trường nuôi cấy riêng biệt (một dành cho sự tăng sinh tổng hợp amylase, một dành cho sự tăng sinh tổng hợp protease). Xác định hoạt độ amylase theo Heinkel (mục 2.2.6), và xác định hoạt độ protease theo Anson (mục 2.2.5). Cụ thể như sau: 3.3.1 pH: 3.3.1.1 Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy đến hoạt độ amylase Nuôi cấy chủng 8 theo phương pháp nuôi cấy bề sâu (2.2.7.2) trên môi trường nuôi cấy dành cho sự tổng hợp amylase (tại mục 2.1.2.6), với mật độ giống nuôi cấy đạt 107 (tế bào/ml môi trường nuôi cấy), và có sự điều chỉnh độ pH môi trường nuôi cấy theo dãy pH : 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7. Khảo sát hoạt độ amylase tại các mốc thời gian: 72h, 84h, 96h. Kết quả được mô tả cụ thể tại bảng 3.7, phụ lục 5.12 Bảng 3.7 : Kết quả hoạt độ amylase của chủng 8 theo pH môi trường nuôi cấy Thời gian pH 72h 84h 96h 4.5 0.602± 0.016 1.118± 0.009 0.788± 0.022 5 0.612± 0.024 1.149± 0.009 0.809± 0.023 5.5 0.854± 0.033 1.603± 0.014 1.125± 0.025 6 0.996± 0.022 1.837± 0.015 1.285± 0.028 6.5 0.622± 0.013 1.166± 0.009 0.821± 0.023 7 0.402± 0.016 0.754± 0.008 0.531± 0.010 ¾ Nhận xét: Kết quả và biện luận -53- Xử lý kết quả thu được (tại phụ lục 5.13) cho thấy: Tại môi trường có pH 6, chủng 8 cho amylase với hoạt độ cao nhất (ở thời điểm 84h nuôi cấy). Chúng tôi quyết định chọn pH 6 làm pH môi trường tăng sinh amylase. 3.3.1.2 Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy đến hoạt độ protease Tiến hành nuôi cấy chủng 8 theo phương pháp nuôi cấy bề sâu (2.2.7.2) trên môi trường nuôi cấy dành cho sự tăng sinh tổng hợp protease (tại mục 2.1.2.7), với mật độ giống nuôi cấy đạt 107 (tế bào/ml môi trường nuôi cấy), và có sự điều chỉnh độ pH môi trường nuôi cấy theo dãy pH: 6, 6.5, 7, 7.5, 8. Khảo sát hoạt độ protease tại các mốc thời gian: 60h, 72h, 84h, 96h. Kết quả được mô tả cụ thể tại bảng 3.8, phụ lục 5.14 Bảng 3.8 : Kết quả hoạt độ protease của chủng 8 theo pH môi trường nuôi cấy Thời gian pH 60h 72h 84h 96h 6 0.514± 0.010 1.506± 0.019 1.312± 0.021 0.683± 0.023 6.5 0.631± 0.021 1.626± 0.008 1.386± 0.033 0.875± 0.008 7 0.367± 0.024 1.326± 0.064 1.172± 0.008 0.567± 0.007 7.5 0.253± 0.007 1.142± 0.024 0.844± 0.020 0.429± 0.017 8 0.174± 0.015 1.025± 0.008 0.669± 0.003 0.353± 0.035 ¾ Nhận xét: Xử lý kết quả thu được (tại phụ lục 5.15) cho thấy: Tại môi trường có pH 6.5, chủng 8 cho protease với hoạt độ cao nhất (ở thời điểm 72h nuôi cấy). Chúng tôi quyết định chọn pH 6.5 làm pH cho môi trường tăng sinh protease. 3.3.2 Cơ chất: 3.3.2.1 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất lên hoạt độ amylase Tiến hành nuôi cấy chủng 8 theo phương pháp nuôi cấy bề sâu (2.2.7.2) trên môi trường nuôi cấy dành cho sự tăng sinh tổng hợp amylase (tại mục 2.1.2.6), với mật độ giống nuôi cấy đạt 107 (tế bào/ml môi trường nuôi cấy), và có sự điều chỉnh độ pH môi trường nuôi cấy về pH 6. Và điều chỉnh nồng độ cơ chất (tinh bột) theo Kết quả và biện luận -54- dãy: 0.0001, 0.001, 0.002, 0.003, 0.004, 0.005 (g/ml môi trường nuôi cấy) hay 0.01%, 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5%. Khảo sát hoạt độ amylase tại các mốc thời gian: 72h, 84h, 96h. Kết quả được mô tả cụ thể trong bảng 3.9, phụ lục 5.16 Bảng3.9 : Kết quả hoạt độ amylase của chủng 8 theo nồng độ cơ chất trong môi trường nuôi cấy Thời gian NĐCC 72h 84h 96h 0.0001 1.002± 0.026 1.870± 0.012 1.316± 0.017 0.001 1.031± 0.017 1.906± 0.010 1.334± 0.029 0.002 0.982± 0.024 1.851± 0.016 1.304± 0.030 0.003 0.970± 0.028 1.815± 0.020 1.277± 0.046 0.004 0.933± 0.022 1.750± 0.023 1.240± 0.026 0.005 0.806± 0.025 1.516± 0.024 1.071± 0.021 Chú thích: NĐCC: Nồng độ cơ chất (g/ml) ¾ Nhận xét: Xử lý các kết quả thu được (tại phụ lục 5.17) cho thấy: Tại môi trường có nồng độ tinh bột 0.001g/ml hay 0.1%, chủng 8 cho amylase với hoạt độ cao nhất (ở thời điểm 84h nuôi cấy). Chúng tôi quyết định chọn nồng độ này làm nồng độ cho môi trường tăng sinh amylase. 3.3.2.2 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất lên hoạt độ protease Tiến hành nuôi cấy chủng 8 theo phương pháp nuôi cấy bề sâu (2.2.7.2) trên môi trường nuôi cấy dành cho sự tăng sinh tổng hợp protease (tại mục 2.1.2.7), với mật độ giống nuôi cấy đạt 107 (tế bào/ml môi trường nuôi cấy), và có sự điều chỉnh độ pH môi trường nuôi cấy về pH 6.5. Và điều chỉnh nồng độ cơ chất (casein) theo dãy: 0.005, 0.0075, 0.01, 0.0125, 0.015, 0.0175, 0.02 (g/ml môi trường nuôi cấy) hay 0.5%, 0.75%, 1%, 1.25%, 1.5%, 1.75%, 2%. Khảo sát hoạt độ protease tại các mốc thời gian là: 60h, 72h, 84h, 96h. Kết quả được mô tả cụ thể trong bảng 3.10, phụ lục 5.18 Kết quả và biện luận -55- Bảng 3.10: Kết quả hoạt độ protease của chủng 8 theo nồng độ cơ chất trong môi trường nuôi cấy Thời gian NĐCC 60h 72h 84h 96h 0.005 0.413± 0.019 1.459± 0.017 1.019± 0.019 0.570± 0.017 0.0075 0.406± 0.023 1.538± 0.010 1.023± 0.012 0.569± 0.015 0.01 0.390± 0.013 1.563± 0.012 1.442± 0.021 0.663± 0.018 0.0125 0.649± 0.017 1.677± 0.009 1.473± 0.016 0.855± 0.009 0.015 0.309± 0.033 1.510± 0.009 1.414± 0.012 0.885± 0.012 0.0175 0.381± 0.014 1.428± 0.012 1.289± 0.050 0.943± 0.011 0.02 0.325± 0.020 1.267± 0.012 1.119± 0.015 0.898± 0.012 Chú thích: NĐCC: Nồng độ cơ chất (g/ml) ¾ Nhận xét: Xử lý các kết quả thu được (tại phụ lục 5.19) cho thấy: Tại môi trường có nồng độ cơ chất là 0.0125g/ml hay 1.25% , chủng 8 cho protease với hoạt độ cao nhất (ở thời điểm 72h nuôi cấy). Chúng tôi quyết định chọn nồng độ này làm nồng độ cơ chất cho môi trường tăng sinh protease. 3.3.3. Mật độ vi khuẩn: 3.3.3.1. Ảnh hưởng của mật độ giống lên hoạt độ amylase: Tiến hành nuôi cấy chủng 8 theo phương pháp nuôi cấy bề sâu (2.2.7.2) trên môi trường nuôi cấy dành cho sự tăng sinh tổng hợp amylase (tại mục 2.1.2.6), và có sự điều chỉnh độ pH môi trường nuôi cấy về pH 6, nồng độ cơ chất trong môi trường là 0.001g/ml môi trường nuôi cấy . Và điều chỉnh đạt mật độ giống nuôi cấy theo dãy: 0.5*107 , 1*107 , 2*107 , 3*107 , 4*107 (tế bào/ml môi trường nuôi cấy). Khảo sát hoạt độ amylase tại các mốc thời gian: 72h, 84h, 96h. Kết quả được mô tả cụ thể trong bảng 3.11, phụ lục 5.20 Bảng 3.11: Kết quả hoạt độ amylase của chủng 8 theo mật độ giống nuôi cấy trên môi trường lỏng Kết quả và biện luận -56- Thời gian MĐG 72h 84h 96h 0.5*107 0.600± 0.025 1.146± 0.028 0.782± 0.031 1*107 1.063± 0.030 1.966± 0.041 1.329± 0.033 2*107 1.086± 0.049 2.096± 0.026 1.479± 0.034 3*107 0.549± 0.026 1.067± 0.038 0.731± 0.026 4*107 0.459± 0.016 0.885± 0.014 0.650± 0.029 Chú thích: MĐG: Mật độ giống (tế bào/ml) ¾ Nhận xét: Kết quả xử lý số liệu (tại phụ lục 5.21) cho thấy: Tại môi trường có mật độ giống nuôi cấy là 2*107 (tế bào/ml môi trường nuôi cấy), chủng 8 cho amylase với hoạt độ cao nhất (ở thời điểm 84h nuôi cấy). Chúng tôi quyết định chọn mật độ nuôi cấy này cho mật độ nuôi cấy trong môi trường tăng sinh amylase. 3.3.3.2. Ảnh hưởng của mật độ giống lên hoạt độ protease: Nuôi cấy chủng 8 theo phương pháp nuôi cấy bề sâu (2.2.7.2) trên môi trường nuôi cấy dành cho sự tăng sinh tổng hợp protease (tại mục 2.1.2.7), và có sự điều chỉnh độ pH môi trường nuôi cấy về pH 6.5, nồng độ cơ chất trong môi trường là 0.0125g/ml . Và điều chỉnh đạt mật độ giống nuôi cấy theo dãy: 0.5*107 , 1*107 , 2*107 , 3*107 , 4*107 (tế bào/ml môi trường nuôi cấy). Khảo sát hoạt độ protease tại các mốc thời gian là: 60h, 72h, 84h, 96h. Kết quả được mô tả cụ thể trong bảng 3.12, phụ lục 5.22 Bảng 3.12: Kết quả hoạt độ protease của chủng 8 theo mật độ giống nuôi cấy trên môi trường lỏng Thời gian MĐG 60h 72h 84h 0.5*107 0.511± 0.014 1.083± 0.011 0.982± 0.011 1*107 0.659± 0.024 1.362± 0.013 1.240± 0.014 2*107 0.865± 0.016 1.771± 0.014 1.606± 0.018 3*107 0.716± 0.012 1.468± 0.010 1.319± 0.015 4*107 0.620± 0.018 1.283± 0.012 1.141± 0.028 Kết quả và biện luận -57- Chú thích: MĐG: Mật độ giống (tế bào/ml) ¾ Nhận xét: Xử lý các kết quả thu được (tại phụ lục 5.23) cho thấy: Tại môi trường có mật độ giống nuôi cấy là 2*107 (tế bào/ml môi trường nuôi cấy), chủng 8 cho protease với hoạt độ cao nhất (ở thời điểm 84h nuôi cấy). Chúng tôi quyết định chọn mật độ này cho mật độ giống nuôi cấy trong môi trường tăng sinh protease. 3.3.4 Thời gian nuôi cấy: 3.3.4.1 Khảo sát hoạt độ amylase theo thời gian nuôi cấy trên môi trường lỏng Tiến hành nuôi cấy chủng 8 theo phương pháp nuôi cấy bề sâu (2.2.7.2) trên môi trường nuôi cấy dành cho sự tăng sinh tổng hợp amylase (tại mục 2.1.2.6), và có sự điều chỉnh độ pH môi trường nuôi cấy về pH 6, nồng độ cơ chất trong môi trường là 0.001g/ml . Và điều chỉnh mật độ giống nuôi cấy là 2*107 (tế bào/ml môi trường nuôi cấy). (Đặt tên môi trường tăng sinh amylase này là môi trường A) Tiến hành thu dịch enzyme thô và khảo sát hoạt độ bắt đầu từ 24 giờ cho đến 102 giờ, theo dãy các mốc thời gian cách nhau 6 giờ . Kết quả được mô tả cụ thể trong đồ thị 3.1, phụ lục 5.24 0 0.5 1 1.5 2 2.5 24 h 30 h 36 h 42 h 48 h 54 h 60 h 66 h 72 h 78 h 84 h 90 h 96 h 10 2h Thời gian (h) H oạ t đ ộ (U I/m l) Đồ thị 3.1: Kết quả khảo sát hoạt độ amylase theo thời gian nuôi cấy ¾ Nhận xét: Kết quả và biện luận -58- Xử lý kết quả thu được (tại phụ lục 5.25) cho thấy: Hoạt độ amylase thay đổi theo thời gian. Hoạt độ amylase tăng nhẹ trong thời điểm từ 24h đến 72h, và tại thời điểm 84h thì chủng 8 cho hoạt độ amylase cao nhất. Vì vậy, khi bổ sung chế phẩm của chủng 8 vào môi trường nước ao, chúng tôi quyết định chọn thời điểm 48h nuôi tăng sinh amylase. 3.3.4.2 Khảo sát hoạt độ protease theo thời gian nuôi cấy trên môi trường lỏng Tiến hành nuôi cấy chủng 8 theo phương pháp nuôi cấy bề sâu (2.2.7.2) trên môi trường nuôi cấy dành cho sự tăng sinh tổng hợp protease (tại mục 2.1.2.7), và có sự điều chỉnh độ pH môi trường nuôi cấy về pH 6.5, nồng độ cơ chất trong môi trường là 0.0125g/ml . Và điều chỉnh mật độ giống nuôi cấy là 2*107 (tế bào/ml môi trường nuôi cấy). (Đặt tên môi trường tăng sinh protease này là môi trường P ) Tiến hành thu dịch enzyme thô và khảo sát hoạt độ bắt đầu khảo sát ở 24 giờ cho đến 114h, theo các mốc thời gian cách nhau 6 giờ . Kết quả được mô tả cụ thể trong đồ thị 3.2, phụ lục 5.26 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 2 24 h 30 h 36 h 42 h 48 h 54 h 60 h 66 h 72 h 78 h 84 h 90 h 96 h 10 2h 10 8h 11 4h Thời gian (h) H oạ t đ ộ (U I/ m l) Đồ thị 3.2: Kết quả khảo sát hoạt độ protease theo thời gian nuôi cấy ¾ Nhận xét: Xử lý các kết quả thu được (tại phụ lục 5.27) cho thấy: Hoạt độ protease tăng nhẹ trong thời điểm từ 24h đến 66h, và tại thời điểm 72h thì chủng 8 cho hoạt độ protease cao nhất. Vì vậy, khi bổ sung chế phẩm của chủng 8 vào môi trường nước ao, chúng tôi quyết định chọn thời điểm 48h nuôi tăng sinh protease. Kết quả và biện luận -59- 3.4 Khảo sát sơ bộ khả năng tác dụng của chủng 8 lên môi trường nước ao nuôi cá Tra: Nhằm mục đích bước đầu tìm hiểu khả năng tác dụng của chủng 8 lên môi trường nước ao nuôi cá Tra. Chúng tôi quyết định đưa chủng 8 vào nước ao nuôi cá Tra (ở giai đoạn nuôi 4 tháng tuổi, được lấy mẫu theo mục 2.2.1.1 ) trên quy mô phòng thí nghiệm. Số lượng mẫu: 15 mẫu, thể tích mẫu: 3lít /1 mẫu. Tiến hành như sau: - Nuôi tăng sinh chủng 8 trên hai môi trường tăng sinh riêng biệt (một dành cho sự tổng hợp amylase, một dành cho sự tổng hợp protease) như đã khảo sát ở mục 3.3 - Tiến hành bổ sung chủng vi khuẩn đã tăng sinh vào môi trường nước ao nuôi cá Tra với mật độ cấy đạt 2.107 (tế bào/ml nước ao) thành các mẫu riêng biệt. Đặt tên mẫu như sau: Š Mẫu A: Là mẫu nước được cấy giống chủng 8 (chủng này đã được nuôi tăng sinh trên môi trường A). Š Mẫu P: Là mẫu nước được cấy giống chủng 8 (chủng này đã được nuôi tăng sinh trên môi trường P) Š Mẫu ĐC: Là mẫu nước đối chứng, để phát triển tự nhiên, không cấy vi khuẩn - Tại các mốc thời gian 0h, 24h, 48h, 72h, 96h, tiến hành thử nghiệm các chỉ số như: pH, carbon hữu cơ tổng số, NH3 tổng số, tổng chất rắn lơ lửng, tổng vi sinh vật hiếu khí. Kết quả cụ thể như sau: 3.4.1 Khả năng tác dụng lên pH môi trường Bổ sung chủng 8 đã được nuôi tăng sinh trong môi trường A và môi trường P vào nước ao nuôi cá Tra thành các mẫu riêng biệt. Tiến hành khảo sát pH các mẫu trên theo các mốc thời gian 0h, 24h, 48h, 72h, 96h (theo phương pháp tại mục 2.2.12). Kết quả được mô tả cụ thể trong bảng 3.13, đồ thị 3.3 Kết quả và biện luận -60- Bảng 3.13 : Kết quả khảo sát tác dụng của chủng vi khuẩn lên pH của môi trường nước ao nuôi cá Tra. Mẫu 0h 24h 48h 72h 96h Mẫu Đối chứng 6.85 7.51 7.80 7.52 7.41 Mẫu A 6.73 6.98 6.94 6.80 6.55 Mẫu P 6.76 7.02 7.11 7.15 7.26 5.80 6.00 6.20 6.40 6.60 6.80 7.00 7.20 7.40 7.60 7.80 8.00 0h 24h 48h 72h 96h pH Th ời g ia n (h ) Mẫu Đối chứng Mẫu A Mẫu P Đồ thị 3.3: Kết quả khảo sát tác dụng của chủng vi khuẩn lên pH môi trường nước ao nuôi cá Tra ¾ Nhận xét: Sau 96h thử nghiệm cho thấy: - pH của mẫu đối chứng tăng. Sự tăng pH là do hoạt động của tảo phù du chiếm ưu thế. - pH của mẫu A giảm . Sự giảm pH này là do hoạt động của chủng 8 chiếm ưu thế hạn chế hoạt động của tảo phù du. - pH của mẫu P có tăng nhưng vẫn thấp hơn mẫu đối chứng. Do chủng 8 trong mẫu này vẫn chiếm ưu thế (tuy không bằng mẫu A). Nhìn chung, mẫu A có độ ổn định về pH hơn hai mẫu còn lại. Khoảng pH của ba mẫu vẫn nằm trong khoảng pH thích hợp cho hoạt động sống của cá Tra [6.0 – 8.5]. 3.4.2 Khả năng tác dụng lên tổng Carbon hữu cơ (TOC) theo thời gian: Kết quả và biện luận -61- Bổ sung chủng 8 đã được nuôi trong hai môi trường tăng sinh vào nước ao nuôi cá Tra thành các mẫu riêng biệt. Tiến hành khảo sát lượng carbon hữu cơ tổng số của các mẫu trên theo các mốc thời gian 0h, 24h, 48h, 72h, 96h (theo phương pháp tại mục 2.2.13) Kết quả được mô tả cụ thể trong bảng 3.14, đồ thị 3.4. Bảng 3.14 : Kết quả khảo sát tác dụng của chủng vi khuẩn lên Carbon hữu cơ tổng số (TOC) môi trường nước ao nuôi cá Tra Mẫu 0h (g/l) 24h (g/l) 48h (g/l) 72h (g/l) 96h (g/l) Mẫu Đối chứng 1.42 1.64 1.76 1.64 1.45 Mẫu A 1.57 1.45 1.34 1.21 0.98 Mẫu P 1.47 1.41 1.43 1.32 1.15 0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 0 24h 48h 72 96h Thời gian (h) C ar bo n hữ u cơ tổ ng số (g /l) Mẫu Đối chứng Mẫu A Mẫu P Đồ thị 3.4 : Kết quả khảo sát tác dụng của chủng vi khuẩn lên carbon hữu cơ tổng số (TOC) môi trường nước ao nuôi cá Tra ¾ Nhận xét: Sau 96h thử nghiệm chủng 8 cho thấy: - Mẫu đối chứng có lượng TOC tăng lên 2.59% so với lượng TOC ban đầu. Sự tăng TOC là do tảo phù du có khả năng đồng hóa, sử dụng CO2 tạo nên hợp chất hữu cơ chứa carbon. - Mẫu A có lượng TOC giảm 37.5% so với lượng TOC ban đầu. Sự giảm TOC này là do chủng 8 chiếm ưu thế và sử dụng hợp chất hữu cơ chứa carbon làm nguồn Kết quả và biện luận -62- năng lượng, đồng thời giải phóng CO2. Lượng CO2 này sẽ bị đuổi ra khỏi mẫu khi tiến hành phân tích. - Mẫu P có lượng TOC giảm 21.54% so với lượng TOC ban đầu. Sự giảm này là do chủng 8 chiếm ưu thế, sử dụng các hợp chất hữu cơ chứa carbon làm nguồn năng lượng, và giải phóng CO2 (Ít hơn mẫu A). Nhìn chung, trong các mẫu thử nghiệm thì mẫu A có sự giảm lượng TOC sau 96h thử nghiệm nhất. 3.4.3 Khả năng tác dụng lên tổng NH3 Bổ sung chủng 8 đã được nuôi trong hai môi trường tăng sinh vào nước ao nuôi cá Tra thành các mẫu riêng biệt. Tiến hành khảo sát lượng NH3 tổng số của các mẫu này theo các mốc thời gian 0h, 24h, 48h, 72h, 96h (phương pháp tại mục 2.2.14). Kết quả được mô tả cụ thể trong bảng 3.15, đồ thị 3.5. Bảng 3.15 : Kết quả khảo sát tác dụng của chủng vi khuẩn lên tổng NH3 môi trường nước ao nuôi cá Tra Mẫu 0 (mg/l) 24h (mg/l) 48h (mg/l) 72h (mg/l) 96h (mg/l) Đối chứng 0.16 0.19 0.19 0.18 0.16 Mẫu A 0.17 0.15 0.13 0.11 0.11 Mẫu P 0.23 0.17 0.13 0.11 0.10 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0h 24h 48h 72h 96h Thời gian (h) T ổn g N H 3 (m g/ l) Mẫu Đối chứng Mẫu A Mẫu P Đồ thị 3.5: Kết quả khảo sát tác dụng của chủng vi khuẩn lên tổng NH3 môi trường nước ao nuôi cá Tra Kết quả và biện luận -63- ¾ Nhận xét: Sau 96h thử nghiệm chủng NH3 cho thấy: - Mẫu đối chứng có lượng tổng NH3 không thay đổi sau 96h. - Mẫu A có lượng tổng NH3 giảm 36.78% so với lượng tổng NH3 ban đầu. Sự giảm này là do chủng 8 chiếm ưu thế đã sử dụng các hợp chất hữu cơ có chứa nitơ thành dạng sinh khối của chủng 8. Hoạt động này làm hạn chế tạo NH3 ra môi trường. - Mẫu P có lượng tổng NH3 giảm 56.52% so với lượng tổng NH3 ban đầu. Sự giảm này là do chủng 8 chiếm ưu thế, sử dụng các hợp chất hữu cơ có chứa nitơ thành dạng sinh khối cho chủng 8 và hạn chế tạo NH3 ra môi trường (Hoạt động này diễn ra mạnh hơn mẫu A). Nhìn chung, mẫu P có sự giảm lượng tổng NH3 sau 96h thử nghiệm nhất. 3.4.4 Khả năng tác dụng lên tổng chất rắn lơ lửng(TSS) theo thời gian: Cấy chủng 8 đã được nuôi trong hai môi trường tăng sinh vào nước ao nuôi cá Tra thành các mẫu riêng biệt. Tiến hành khảo sát lượng tổng chất rắn lơ lửng (TSS) của các mẫu trên theo các mốc thời gian 0h, 24h, 48h, 72h, 96h (theo phương pháp tại mục 2.2.15)Tiến hành khảo sát như mục 2.2.15, sử dụng phương pháp như mục 2.2.21. Kết quả được mô tả cụ thể trong bảng 3.16, đồ thị 3.6. Bảng 3.16: Kết quả khảo sát tác dụng của chủng vi khuẩn lên tổng chất rắn lơ lửng môi trường nước ao nuôi cá Tra Mẫu 0h (mg/l) 24h (mg/l) 48h (mg/l) 72h (mg/l) 96h (mg/l) Mẫu Đối chứng 195 179 168 162 158 Mẫu A 207 187 147 120 105 Mẫu P 211 185 166 140 132 Kết quả và biện luận -64- 0 50 100 150 200 250 0h 24h 48h 72h 96h Thời gian (h) Tổ ng c hấ t r ắn lơ lử ng (m g/ l) Mẫu Đối chứng Mẫu A Mẫu P Đồ thị 3.6: Kết quả khảo sát tác dụng của chủng vi khuẩn lên tổng chất rắn lơ lửng môi trường nước ao nuôi cá Tra ¾ Nhận xét: Sau 96h thử nghiệm chủng 8 cho thấy: - Mẫu đối chứng có lượng TSS giảm 18.97% so với lượng TSS ban đầu. - Mẫu A có lượng TSS giảm 49,28% so với lượng TSS ban đầu. - Mẫu P có lượng TSS giảm 37.14% so với lượng TSS ban đầu. Nguyên nhân giảm này là do: chất hữu cơ trong mẫu giảm dần về khối lượng (do năng lượng của chúng được giải phóng, do tạo thành các chất khí thoát vào không khí) và chuyển thành sinh khối vi sinh vật và các sinh vật khác theo thời gian. Nhìn chung, mẫu A có sự giảm lượng TSS nhất. 3.4.5 khả năng tác dụng lên tổng lượng vi sinh vật hiếu khí: Cấy chủng 8 đã được nuôi trong hai môi trường tăng sinh vào nước ao nuôi cá Tra thành các mẫu riêng biệt. Tiến hành khảo sát lượng tổng vi sinh vật hiếu khí của các mẫu trên theo các mốc thời gian 0h, 24h, 48h, 72h, 96h (theo phương pháp tại mục 2.2.16) Kết quả được mô tả cụ thể trong bảng 3.17, đồ thị 3.7 Kết quả và biện luận -65- Bảng 3.17: Kết quả khảo sát tác dụng của chủng vi khuẩn lên tổng lượng Vi sinh vật hiếu khí Mẫu 0h CFU/ml 24h CFU/ml 48h CFU/ml 72h CFU/ml 96h CFU/ml Mẫu Đối chứng 1*104 2.5*105 1*105 3*104 1.6*104 Mẫu A 2*107 4.1*109 6.5*109 1.4*108 2.2*106 Mẫu P 2*107 5.6*109 4.3*109 1.6*108 2.8*106 -1000000000 0 1000000000 2000000000 3000000000 4000000000 5000000000 6000000000 7000000000 0h 24h 48h 72h 96h Thời gian (h) Lư ợn g tế b ào v i s in h vậ t (C FU /m l) Mẫu Đối chứng Mẫu A Mẫu P Đồ thị 3.7: Kết quả khảo sát tác dụng của chủng vi khuẩn lên tổng lượng Vi sinh vật hiếu khí ¾ Nhận xét: Sau 96h thử nghiệm chủng 8 cho thấy: Trong các mẫu thử nghiệm, tổng lượng vi sinh của mẫu A và mẫu P giảm xuống rõ rệt sau 96h thử nghiệm. Do đó, nếu chọn chủng vi khuẩn 8 để xử lý môi trường nước thì cần bổ sung chủng giống tại thời điểm sau khi bắt đầu thử nghiệm khoảng 96h. Kết quả và biện luận -66- Nhìn chung, mô hình xử lý ô nhiễm hữu cơ bằng Vi sinh có tiềm năng ứng dụng rất cao trong việc hạn chế thay nước cho các ao nuôi tôm, cá thương phẩm. Các vi khuẩn sử dụng carbon hữu cơ như là một nguồn năng lượng để kết hợp với nitơ sinh tổng hợp protein tạo ra tế bào mới. Trong đề tài này, chúng tôi thử nghiệm tác dụng của vi khuẩn (chủng 8 - có nguồn gốc phân lập như mục 3.1) lên môi trường nước ao nuôi cá Tra. Kết quả cho thấy: Chủng 8 phân hủy chất hữu cơ trong nước ao nuôi cá, chuyển hóa thành dạng sinh khối của chủng 8, và đồng thời làm giảm độc tố trong môi trường nước (như NH3 ), giúp ổn định pH của nước, giảm lượng chất rắn lơ lửng. Theo một số nguồn tài liệu cho thấy: Việc kết hợp sử dụng chủng 8 với hệ thống ao xử lý nước thải bên cạnh ao nuôi thương phẩm, định kỳ loại bỏ sinh khối của vi khuẩn ra khỏi môi trường nước của ao xử lý, và nước ao đã qua xử lý có thể được đưa lại vào ao nuôi thương phẩm. Trong nuôi trồng thủy sản, việc đảm bảo tính ổn định của môi trường nuôi được xem là yếu tố quan trọng hàng đầu. Thử nghiệm trong đề tài này cho thấy: Đây là một giải pháp xử lý nước ao nuôi thủy sản có tiềm năng ứng dụng rất cao, cần được nghiên cứu sâu hơn.