Luận văn Khảo sát khả năng tổng hợp amylase từ aspergillus oryzae khi bổ sung muối cảm ứng

enzyme. Kết quả là chúng làm thay đổi cấu trúc không gian của phân tử enzyme. Như vậy phức hợp EI này sẽ làm thay đổi hướng không có lợi cho hoạt động xúc tác của enzyme. Sau khi kết hợp với chất kìm hãm để tạo thành phức hợp EI, chúng vẫn có khả năng kết hợp với cơ chất để tạo thành một phức hợp EIS như phản ứng sau: Kìm hãm bởi sản phẩm của phản ứng Các sản phẩm được tạo thành do các phản ứng enzyme tham gia có thể trở thành chất kìm hãm tốc độ của chính phản ứng đó. Thí dụ: nếu có một phản ứng kiểu: S1 + S2 = P1 + P2 Do tính thuận nghịch của phản ứng trên, các enzyme có ái lực với P1 và P2 tương đương với S1 và S2. Trong trường hợp như thế P1 + P2 được coi như chất kìm hãm với S1 và S2. Kìm hãm do thừa cơ chất Trong một số trường hợp cơ chất bị thừa lại trở thành chất kìm hãm phản ứng. Giả sử ta có phản ứng: E + I EI E + S ES E + P E + S = ES E + P E + I = EI ES + I = EIS EI + S = EIS E + S = ES E + P Luận văn tốt nghiệp khoá 29 - 2008 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp &SHƯD 15 Nếu có cơ chất thứ hai tham gia vào, và nó có khả năng dính vào một vị trí nào đó trên phức hệ ES (ngoài vùng xúc tác) làm cho chúng không hoạt động, khi đó phức hệ này được coi là chất kìm hãm. ES + S = ESS 2.3.6 Các chất hoạt hóa Các chất hoạt hóa enzyme có thể là các anion, các ion kim loại ở ô thứ 11 đến ô thứ 55 trong bảng tuần hoàn Mendeleev, các chất hữu cơ có cấu trúc phức tạp làm nhiệm vụ chuyển hóa hydro, các chất có khả năng phá vỡ một số liên kết trong phân tử tiền enzyme, các chất có khả năng phục hồi nhóm chức trong trung tâm hoạt động của enzyme. Hình 11. Ảnh hưởng của chất hoạt hoá đến hoạt động enzyme 2.4 Các yếu tố của môi trường ảnh hưởng đến sự tổng hợp amylase 2.4.1 Ảnh hưởng của nguồn nitơ dinh dưỡng Nitơ tham gia vào quá trình tạo protein, axid nucleic và nhiều chất có đặc tính sinh học khác của tế bào sinh vật. Trong môi trường lên men nitơ thường được bổ sung dưới dạng muối nitrate, các hợp chất amon hoặc một số hợp chất có nguồn gốc vi sinh vật. Cho nguồn nitơ nhất định vào môi trường có thể kích thích tổng hợp amylase này và ức chế tổng hợp amylase khác. Theo mức độ tiêu thụ muối, môi trường bị axid hóa, quá trình dịch mạnh về phía tổng hợp tích cực glucoamylase và ức chế tổng hợp α-amylase. Fenikxova và cộng tác viên đã tiến hành thí nghiệm với NH4H2PO4 và thấy rằng sinh tổng hợp α-amylase giảm 10 lần mà sự tạo thành glucoamylase hầu như không bị ảnh hưởng. Kết quả được thể hiện ở bảng 3. Enzyme không hoạt động Chất cảm ứng Cơ chất Enzyme hoạt động Luận văn tốt nghiệp khoá 29 - 2008 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp &SHƯD 16 Bảng 3. Ảnh hưởng của nguồn nitơ tới sinh tổng hợp amylase Hoạt độ enzyme sau 6 ngày nuôi (đv/100ml) Nguồn nitơ Liều lượng muối (% theo N) α-amylase Glucoamylase NaNO3 0,30 145 8.000 NaNO3 0,15 26 3.300 NH4NO3 0,15 98 4.100 NH4NO3 0,30 45 4.900 NH4H2PO4 0.30 5,5 8.000 (Nguyễn Đức Lượng và ctv, 2004) Sự tạo thành glucoamylase cũng như amylase cực đại thường thấy ở các nồng độ nitơ cao từ (0,25-0,4%). Tỷ lệ khối lượng giữa carbon và nitơ trong môi trường, tính cân bằng của môi trường dinh dưỡng về carbon và nitơ có ý nghĩa lớn đối với sinh tổng hợp sinh khối vi sinh vật và sự tạo thành amylase. Chỉ khi nào trong môi trường có đủ lượng carbon và nitơ cần thiết mới có thể tích lũy được enzyme cực lớn. Sự thiếu hụt cấu tử này không được bù đắp bằng sự dư thừa cấu tử kia. Tỷ lượng tối ưu giữa carbon và nitơ (C:N) cho sự sinh tổng hơp amylase là 10:1- 40:1. Nói cách khác hàm lượng carbon trong môi trường phải 10- 40 lần hàm lượng nitơ. 2.4.2 Ảnh hưởng của axid amin Acid amin là những cấu tử hợp thành phân tử enzyme. Acid amin có ảnh hưởng tốt đến sinh lý của vi sinh vật cũng như sinh tổng hợp enzyme amylase do các nguyên nhân sau: Acid amin có thể đồng thời vừa là nguồn carbon, nguồn nitơ và là nguồn năng lượng. Nhiều vi sinh vật có thể đồng hóa trực tiếp acid amin (Konvalov, 1967). Một số aid amin riêng lẽ (acid glutamic, acid aspartic) đóng vai trò vô cùng quan trọng trong trao đổi axid amin cụ thể là sinh tổng hợp nhiều axid amin khác trong quá trình chuyển amin hóa (Araiet và ctv, 1968). Nhiều acid tham gia vào thành phần của các vitamin tan trong nước như acid pantotenic, biotin, acid folic, các vitamin này có ý nghĩa sinh học rất lớn. ngoài ra có những nhận xét cho rằng sự tổng hợp ARN trong tế bào một số vi sinh vật phụ thuộc vào sự có mặt của acid amin trong môi trường nuôi. Luận văn tốt nghiệp khoá 29 - 2008 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp &SHƯD 17 Acid amin có tính đặc hiệu của sự cảm ứng và kìm chế sinh tổng hợp enzyme. Một số acid amin kích thích và làm tăng cường sinh tổng hợp các amylase, một số thì ức chế quá trình này, một số thì không có ảnh hưởng gì cả. Chẳng hạn, sự tổng hợp amylase khi nuôi chủng Aspergillus awamori được kích thích bởi hai acid amin là acid glucomic và tyrosine. Sự tổng hợp glucoamylase được tăng cường bằng bốn acid amin: acid glutamic, tyrosine, aspartic và β-alanine. 2.4.3 Ảnh hưởng của nguồn khoáng dinh dưỡng Các nguyên tố đa vi lượng có ảnh hưởng lớn tới sinh trưởng và tổng hợp các enzyme amylase của vi sinh vật. Mg2+ có ảnh hưởng đến độ bền nhiệt của enzyme. MgSO4 sẽ có ảnh hưởng xấu đến sự tổng hợp mọi amylase bởi nấm sợi. Khi đó sự tổng hợp α-amylase bị ức chế hoàn toàn, còn lượng glucoamylase giảm xuống hàng chục lần (Fenikxova và Muxaeva, 1967). Nồng độ tối ưu của muối này cho sinh tổng hợp α-amylase và glucoamylase là 0,05%, thiếu muối này không ảnh hưởng đến sự tạo thành oligo- 1,6-glucosidase (Silov, 1967). Phosphor cần để tổng hợp các hợp phần quan trọng của sinh chất (nucleic acid phospholipide) và nhiều coenzyme (adenosine-phosphat, thiamine), đồng thời để phosphoryl hóa glucid trong quá trình oxy hóa sinh học. Phosphor ảnh hưởng trực tiếp đến sinh sản của nấm sợi và các vi sinh vật khác, do vậy mà tăng cường tổng hợp các enzyme amylase. Các muối phosphate thường được dùng với nồng độ cao tới 0,15M. Hoạt độ α- amylase và oligo-1,6-glucosidase tăng khi có 0,1% KH2PO4, còn hoạt độ glucoamylase tăng cực đại khi có 0,2% muối này. Calcium cần cho sự tổng hợp và ổn định α-amylase hoạt động vì nó là cấu tử không thể thiếu được của enzyme này. Nó còn có tác dụng bảo vệ amylase khỏi tác động của protease (Hsiu, 1964). Muốn tích lũy nhiều α-amylase cần có lượng calcium trong môi trường là 0,01-0,05%. Lưu huỳnh kích thích tạo amylase (lưu huỳnh có trong thành phần các axid amin quan trọng như: methionine, cystine, cystein). Lưu huỳnh với hàm lượng 0,07g/ml môi trường là thích hợp nhất cho Aspergillus oryzae tạo amylase (300- 350 đv/100ml). Giảm hàm lượng lưu huỳnh tới 0,004% thì hoạt lực amylase giảm xuống hai lần. Ngoài Ca2+, trong phân tử α-amylase của Bacillus subtilis còn có chứa ion Zn2+. Magan, đồng, thủy ngân kìm hãm sinh tổng hợp ở vi sinh vật. Luận văn tốt nghiệp khoá 29 - 2008 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp &SHƯD 18 2.4.4 Ảnh hưởng của pH nguyên liệu Khi nuôi cấy bằng phương pháp bề mặt pH môi trường ảnh hưởng ít, do môi trường có dung lượng đệm cao và hàm ẩm thấp, pH không thay đổi mấy trong quá trình nuôi. Tuy nhiên pH ban đầu của môi trường có ảnh hưởng không nhỏ tới sự phát triển của nấm mốc và sự tạo thành enzyme (bảng 4). Bảng 4. Ảnh hưởng của pH đến sinh tổng hợp amylase pH môi trường Hoạt độ enzyme trong mốc thành phẩm (đv/g) Các chất làm ẩm cám tới độ ẩm 60% Trước Thanh trùng Sau thanh trùng Mốc Thành phẩm α-amylase Oligo-1,6 glucoside Maltase Nước máy 6,0 6,1 6,4 25 1.008 130 HCl (0,1N) 5,0 6,7 6,7 27,3 1.230 134 HCl (0,2N) 4,5 6,8 6,8 24,7 1.172 127 HCl (0,25N) 4,0 6,1 6,1 10,4 1.100 134 HCl (0,3N) 3,6 6,0 6,0 8,7 1.130 133 (Nguyễn Đức Lượng và ctv, 2004) Đối với Aspegillus awamoori, pH ban đầu là 6,3 thì nấm mốc tạo α-amylase cực lớn. Nếu pH ban đầu là 3 thì nấm sợi sẽ tạo nhiều oligo-1,6-glucosidase và α-1,4- amyloglucosidase, còn pH là 7,4 thì sự tổng hợp cả Bacillus subtilis enzyme đều giảm (Grigorev, 1968). Đối với vi khuẩn pH tốt nhất để tạo enzyme là 6,6 -7,4. 2.4.5 Ảnh hưởng của độ ẩm môi trường nuôi cấy Trong điều kiện sản xuất, độ ẩm ban đầu tối thích của môi trường là 58 - 60% và phải giữ cho môi trường có độ ẩm đó trong quá trình nuôi. Độ ẩm tăng quá 55- 70% sẽ làm giảm độ thoáng khí, còn thấp hơn 50-55% thì kìm hãm sinh trưởng Luận văn tốt nghiệp khoá 29 - 2008 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp &SHƯD 19 và phát triển của vi sinh vật cũng như sự tạo amylase. Sự thay đổi độ ẩm của môi trường nuôi cấy đến hoạt đô của enzyme thể hiện trong bảng 5. Bảng 5. Ảnh hưởng độ ẩm của môi trường tới hoạt độ enzyme amylase 20 giờ 34 giờ 42 giờ Phương án thí nghiệm Độ ẩm (%) Hoạt độ amylase (đv/g) Độ ẩm (%) Hoạt độ amylase (đv/g) Độ ẩm (%) Hoạt độ amylase (đv/g) Khay để hở 27,8 15,0 23,8 18,0 22,0 20,5 Khay đậy nắp 46,4 20,4 42,4 32,9 42,4 36,7 (Nguyễn Đức Lượng và ctv, 2004) 2.5 Phương pháp nuôi Enzyme amylase là chất xúc tác sinh học, có bản chất là protein và chúng chỉ được tổng hợp bằng con đường sinh học mà chủ yếu là ở vi sinh vật. Nguồn enzyme amylase từ Aspergillus oryzae được sử dung nhiều nhất và có nhiều ưu điểm nổi bật: Hoạt tính amylase từ vi sinh vật rất cao, chỉ một lượng nhỏ có thể chuyển hóa một lượng cơ chất khá lớn, cường độ phản ứng xảy ra rất mạnh khi được xúc tác bởi các enzyme loại này. Aspergillus oryzae có cường độ sinh sản cực kỳ mạnh và tổng hợp amylase với tốc độ rất nhanh chóng. Trong một thời gian ngắn có thể thu được một lượng enzyme rất lớn. Môi trường nuôi cấy Aspergillus oryzae tạo enzyme amylase thì rất dễ kiếm và rẻ tiền, thường là những phụ liệu công nghiệp nên giá thành rẻ hơn và dễ áp dụng cho các cơ sở sản xuất. Aspergillus oryzae chịu ảnh hưởng rất lớn ở các thành phần dinh dưỡng môi trường, do dó người ta có thể tác động những biện pháp khác nhau hoặc thay đổi thành phần dinh dưỡng để tạo ra các enzyme có hoạt tính cao và khối lượng lớn. 2.5.1 Cách tiến hành Chuẩn bị 50g môi trường cơ bản trên mỗi bình tam giác có dung tích 250ml, hoặc 10g môi trường trên các đĩa Petri. Luận văn tốt nghiệp khoá 29 - 2008 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp &SHƯD 20 Dùng dung dịch đệm tạo ra độ ẩm môi trường từ 60 - 65%, đem triệt trùng ở 121oC trong 15 phút. Chuẩn bị 3 - 5 ống nghiệm nước vô khuẩn. Bằng thao thác vô trùng thực hiện trong tủ cấy vô trùng, đổ 10ml nước vô trùng này vào các ống nghiệm giống. Dùng đũa thủy tinh vô trùng khuấy nhẹ để bào tử nấm sợi Aspergillus oryzae hòa điều trong nước. Dùng pipet vô trùng hút lấy 2ml cho vào đĩa Petri có chứa môi trường vô khuẩn đã được làm nguội, hoặc đổ toàn bộ 10ml nước đã hòa tan đều bào tử vào bình tam giác có môi trường đã thanh trùng hoặc làm nguội. Lắc đều để môi trường trong bình tam giác trộn đều với bào tử hoặc xoay đều để môi trường trong đĩa Petri trộn đều với bào tử. Bao gói đĩa Petri hoặc đậy nắp bông bình tam giác và để vào tủ ấm có nhiệt độ ổn định 37oC. Nuôi trong thời gian 36 giờ. Nếu thí nghiệm được thực hiện với mục đích thu nhận lượng chế phẩm thô nhiều hơn ta có thể nuôi chúng trong bình tam giác 1000ml với lượng môi trường 200- 250g. hoặc có thể nuôi chúng trong các khay nhôm. Chiều dày của khối môi trường trên khay khoảng 3-5cm là tốt nhất. Khi nấm sợi bắt đầu chớm tạo ra bào tử là thời gian enzyme được tạo ra nhiều nhất. Ta nên thu nhận chế phẩm thô ngay giai đoạn này. Chế phẩm thô sau khi thu nhận được đem đi sấy ở nhiệt độ dưới 40oC có quạt thông gió để dễ dàng bảo quản và dùng lâu dài. 2.5.1Phương pháp nuôi cấy Nuôi cấy nấm mốc có rất nhiều phương pháp: Nuôi cấy trên bề mặt rắn, nuôi cấy trên bề mặt lỏng, nuôi cấy chìm trong đó phương pháp nuôi cấy trên bề mặt rắn được sử dụng phổ biến do có nhiều ưu điểm sau: • Nuôi cấy bề mặt dễ thực hiện. Qui trình công nghệ thường không phức tạp. • Lượng enzyme được tạo thành từ nuôi cấy bề mặt thường cao hơn nhiều so với nuôi cấy chìm. Đây là ưu điểm rất quan trọng giải thích tại sao phương pháp nuôi cấy bề mặt phát triển rất mạnh. • Chế phẩm amylase thô (bao gồm thành phần môi trường, sinh khối vi sinh vật, enzyme và nước) sau khi thu nhận rất dễ sấy khô và dễ bảo quản. Luận văn tốt nghiệp khoá 29 - 2008 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp &SHƯD 21 • Nuôi cấy bề mặt không cần sử dụng nhiều thiết bị phức tạp, do đó dễ vận hành công nghệ cũng như việc đầu tư vừa đơn giản vừa không tốn kém. • Trong trường hợp bị nhiễm các vi sinh vật lạ, ta rất dễ dàng xử lý. Môi trường đặc biệt là môi trường tĩnh, không có sự xáo trộn nên khu vực nào bị nhiễm ta chỉ cần loại bỏ khu vực đó ra khỏi toàn bộ khối môi trường nuôi cấy. Những khu vực khác sẽ được an toàn. Nguyên liệu dùng tạo ra môi trường bán rắn để nuôi cấy Aspergillus oryzae thường là cám gạo, cám mì, bột ngô, hạt kê, hoặc một số loại hạt, bột kém chất lượng kháccòn có bổ sung thêm một số dung dịch đặc trưng khác như: nitơ, phosphor, canxi, magiê, để giúp cho việc tổng hợp enzyme amylase cao hơn. Để làm tăng độ xốp của môi trường bán rắn từ các nguyên liệu trên người ta cho thêm phụ liệu có độ xốp cao. Trong các loại phụ liệu đó, người ta dùng trấu hoặc lõi ngô đã được làm nhỏ. Tuy nhiên các phụ liệu cho vào thường là vật liệu chứa ít chất dinh dưỡng, do đó lượng phụ liệu cho vào thường khoảng 15 - 20%. Mặc khác để tăng cường quá trình sinh tổng hợp các enzyme amylase cảm ứng, người ta thường cho thêm vào môi trường những chất có tính cảm ứng cho các enzyme này như: nitơ, phosphor, canxi, magiê, độ ẩm trong môi trường bán rắn thường được tạo ra là 58 - 60%. Nhiệt độ nuôi thường khoảng 28 - 30oC, thời gian nuôi từ 36 - 72 giờ. Chiều dày của lớp môi trường tốt nhất thường nằm trong khoảng 2 -3 cm. Trong quá trình phát triển của nấm mốc trong môi trường vi sinh vật thường trải qua ba giai đoạn: Giai đoạn đầu: Thời gian kéo dài từ 10-15 giờ đầu. Ở giai đoạn này bào tử bắt đầu trương nở và bắt đầu giai đoạn hô hấp, do đó nhiệt độ trong phòng nuôi cố duy trì ở 28 - 30oC. Giai đoạn thứ hai: Thời gian kéo dài từ 14 - 18 giờ kể từ khi kết thúc giai đoạn thứ nhất. Giai đoạn này hệ sợi nấm bắt đầu phát triển, quá trình hô hấp tăng mạnh, lượng nhiệt trong môi trường tăng nhanh. Tính chất vật lý và thành phần môi trường bắt đầu thay đổi. Để tránh ảnh hưởng của nhiệt (do quá trình hô hấp tạo ra) người ta thường phải thông gió trong giai đoạn này. Mặt khác, do quá trình tăng nhiệt trong khối môi trường nên độ ẩm của chúng cũng giảm rõ rệt. Để khắc phục tình trạng này phải tạo ra một hệ thống điều hòa độ ẩm không khí khoảng 80-90% là tốt nhất. Giai đoạn thứ ba: Đây là giai đoạn cuối cùng, giai đoạn này kéo dài khoảng 10- 12 giờ. Nhiệt độ khối môi trường bán rắn dần dần hạ xuống, cường độ hô hấp của Aspergillus oryzae giảm một cách rõ rệt, hệ sợi của nấm mốc Aspergillus oryzae Luận văn tốt nghiệp khoá 29 - 2008 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp &SHƯD 22 sẽ được chuyển mạch từ màu xám trắng của giai đoạn trước sang màu vàng hoa cao của khối bào tử. Ở thời kỳ bào tử đã già hoạt tính của enzyme amylase thường giảm rõ rệt. Toàn bộ khối môi trường đã nuôi nấm mốc đó được gọi là canh trường hay chế phẩm enzyme thô. Enzyme amylase được tiết ra môi trường và một phần khá lớn còn nằm lại trong tế bào nấm mốc. 2.5.2 Thu nhận enzyme chế phẩm Nguyên tắc trong quá trình phát triển của vi sinh vật, enzyme luôn được tổng hợp để tham gia vào quá trình đồng hóa và quá trình dị hóa. Trong thí nghiệm này, chủ yếu là thu nhận chế phẩm enzyme thủy phân là các loại amylase. Do hoạt tính enzyme không chỉ biểu hiện ở khả năng thủy phân của enzyme mà còn biểu hiện ở khả năng của vi sinh vật tổng hợp ra nó trong những điều kiện nuôi cấy nhất định. Trong quá trình phát triển, vi sinh vật sẽ tạo ra enzyme. Các enzyme được tạo ra trong tế bào vi sinh vật thoát ra khỏi tế bào để thực hiện các phản ứng thủy phân ngoài tế bào được gọi là enzyme ngoại bào. Khi tổng hợp ra enzyme, enzyme lẫn trong các thành phần môi trường, tan trong nước, có trong sinh khối của vi sinh vật. Toàn bộ khối vật chất thu nhận được trong quá trình nuôi cấy bao gồm: Sinh khối vi sinh vật, nước có trong đó, enzyme trong và ngoài tế bào và cả khối môi trường mà vi sinh vật không sử dụng hết được gọi là chế phẩm enzyme thô. 2.6 Ứng dụng của enzyme amylase Amylase là enzyme rất thông dụng được sử dụng nhiều trong công nghệ thực phẩm. Enzyme này làm nhiệm vụ thủy phân tinh bột thành các phân tử đường glucose. Trong sản xuất rượu: Người ta dùng enzyme amylase làm tác nhân đường hóa trong công nghiệp sản xuất rượu, cho phép tiết kiệm hàng vạn tấn nguyên liệu (đại mạch) loại tốt rút ngắn quá trình sản xuất, tiết kiệm được sản xuất bởi enzyme amylase thủy phân sâu sắc tinh bột thành đường lên men trong thời gian rút ngắn. Enzyme amylase không chỉ quan trọng trong thời gian đường hóa nà còn trong cả quá trình xử lý nhiệt nguyên liệu nữa. Việc sử dụng enzyme amylase để dịch hóa tinh bột khi nấu ở nhiệt độ 85 - 90oC cho phép có thể dùng hơi nước thứ cấp cho đun sơ bộ và làm dịu chế độ nấu. Điều này làm giảm chi Luận văn tốt nghiệp khoá 29 - 2008 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp &SHƯD 23 phí hơi trong gia nhiệt và tổn thất thiết bị. Vì vậy làm cho hiệu quả sản xuất tăng lên. Trong sản xuất bia: Trong công nghiệp sản xuất bia, enzyme amylase có trong mầm đại mạch được sử dụng để thủy phân tinh bột có trong đại mạch. Khác với rượu ở đây mức độ đường hóa tinh bột chứa trong nguyên liệu thấp hơn. Cần có các dextrin chưa đường hóa làm cho bia có hương vị. Việc chuyển hóa tinh bột và các nước chiết của nguyên liệu này do các enzyme amylase đảm nhận. Do đó, trong quá trình đường hóa và dịch hóa thì enzyme amylase có ý nghĩa và vai trò quan trọng bậc nhất. Việc bổ sung amylase từ các nguồn khác như vi sinh vật vào quá trình sản xuất bia để làm tăng hiệu suất cho từng giai đoạn. Do đó việc sử dụng enzyme amylase trong sản xuất bia có hiệu suất cao sẽ: • Giảm chi phí lao động cho sản xuất malt, do đó làm tăng hiệu suất lao động. • Giảm giá thành nguyên liệu hạt vì sử dụng nguyên liệu thay thế như: gạo, bắp, những nguyên liệu không nảy mầm. • Giảm tổn thất tinh bột và các chất hòa tan khi cho hạt nảy mầm, làm tăng hiệu suất chất hòa tan lên đáng kể. Trong công nghiêp sản xuất bánh mì: Trong sản xuất bánh mì enzyme amylase được xem như là một chất phụ gia cho quá trình làm bánh để tăng chất lượng bánh mì. Enzyme amylase được đưa vào để giải quyết các vấn đề sau: • Làm tăng nhanh thể tích bánh • Làm màu sắc của bánh đẹp hơn • Làm tăng mùi thơm cho bánh Trong sản xuất bánh mì người ta sử dụng cả α-amylase và β-amylase, các enzyme này thủy phân tinh bột để tạo thành đường. việc sử dụng amylase cho phép sử dụng bột mì kém phẩm chất để làm bánh hoặc có thể giảm bớt tới 50% đường cho thêm vào bánh trong thực đơn sản xuất bánh mì ngọt. Trong sản xuất bánh kẹo: Nếu chỉ tận dụng lượng enzyme có sẵn trong bột thì các phản ứng chuyển hóa tinh bột sẽ xảy ra không mạnh, nhất là khi sử dụng loại bột xấu để sản xuất bánh. Do đó, người ta phải cho thêm enzyme amylase và protease vào chế biến bột trong quá trình sản xuất bánh. Các enzyme này hoạt động làm tăng lượng đường khử và axid amin. Đường khử và axid amin có trong khối bột cùng tham gia vào các phản ứng oxy hóa khử, phản ứng maillard và kết quả là tạo cho bánh có mùi, vị và màu hấp dẫn. Trong sản xuất siro và các sản phẩm chứa đường: Sản xuất siro đường fructose từ tinh bột bắp bằng phương pháp enzyme phát triển rất mạnh. Theo Luận văn tốt nghiệp khoá 29 - 2008 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp &SHƯD 24 phương pháp này phôi bắp được xử lý bằng SO2 và vi khuẩn lactic để hạt tinh bột mềm ra và enzyme sẽ được sử dụng sau khi bột đã được hòa tan trong nước. Ở giai đoạn gia nhiệt người ta cũng cho một lượng nhỏ α-amylase vào để dịch tinh bột có độ nhớt thấp tránh hiện tượng cháy khét. Sau đó cho lượng còn lại vào giai đoạn đường hóa, các enzyme này giúp cho quá trình đường hóa rất dễ dàng. Tăng hiệu suất thu hồi sản phẩm. Trong xay xát: các bột nghèo enzyme α-amylase được cải thiện bằng cách bổ sung α-amylase vào trong khối bột. Công nghệ sản xuất đường: Enzyme amylase được bổ sung trong nước mía để cải thiện tốc độ lọc nước mía bằng cách thủy phân tinh bột trong nước ép mía giúp cho quá trình lọc nhanh hơn. Trong công nghiệp dệt và làm giấy: Chế phẩm amylase của vi khuẩn Bacillus subtilis, B.mensentericus có tính ưu việt và chịu nhiệt cao nên được dùng để tẩy lớp hồ bột trên vải. Trong vải mộc thường chứa 5% tinh bột và những tạp chất khác. Công nghiệp bột giặt: Tăng khả năng làm sạch của bột giặt đối với quần áo bị bẩn do tinh bột. Trong chăn nuôi: Người ta sử dụng amylase bằng hai cách: Trộn thẳng enzyme vào thức ăn khi cho gia súc ăn hoặc xử lý sơ bộ thức ăn trước bằng enzyme amylase. Chế phẩm amylase được sử dụng riêng lẽ hoặc phối hợp với protease, hemicellulase để sản xuất các loại thức ăn dễ tiêu hóa, dễ hấp thu cho gia súc. Trong y học: Enzyme amylase thường được phối hợp với các enzyme thủy phân khác để điều trị các biến chứng có liên quan đến đường tiêu hóa. Ngoài ra, enzyme amylase còn được dùng để tăng cường và cải thiện quá trình tiêu hóa thường được sử dụng ở dạng viên. Enzyme amylase còn được dùng để điều trị các chứng bệnh về tim, hệ thần kinh, enzyme amylase còn dùng để điều chế các môi trường dinh dưỡng chuẩn đoán và điều trị nhiều loại bệnh khác nhau, giúp cho công tác nghiên cứu vi sinh vật học trong các viện và phòng thí nghiệm. Luận văn tốt nghiệp khoá 29 - 2008 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp &SHƯD 25 CHƯƠNG III. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Dụng cụ và hóa chất Giống vi sinh vật được dùng trong thí nghiệm là nấm sợi Aspegillus oryzae. Nấm sợi này có thể sinh tổng hợp enzyme amylase, protease, pectinase và cả cellulase tùy theo cơ chất cảm ứng mà ta đưa vào. Môi trường bán rắn cơ bản gồm: Cám Trấu Các nguyên liệu chứa cơ chất cảm ứng (bột gạo và các muối nitrate) để tổng hợp ra enzyme tương ứng Độ ẩm môi trường là 60 - 65% Các dụng cụ thủy tinh dùng trong nuôi cấy gồm đĩa Petri, bình tam giác Khay Hình 12. Máy đông khô Hình 13. Máy phân tích ẩm Luận văn tốt nghiệp khoá 29 - 2008 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp &SHƯD 26 Hình 14. Máy đo pH Hình 15.Thiết bị đo mật độ quang Hình 16. Tủ ủ Dưới đây là phần thực nghiệm để thu nhận enzyme thô. Đánh giá chất lượng enzyme thô Chế phẩm enzyme thô được xác định hoạt tính chung và hoạt tính enzyme riêng theo những phương pháp tương tứng. Luận văn tốt nghiệp khoá 29 - 2008 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp &SHƯD 27 Qui trình thí nghiệm tham khảo Hình 17. Sơ đồ qui trình công nghệ tham khảo Thí nghiệm: Khảo sát khả năng tổng hợp amylase của nấm mốc Aspergillus oryzae khi bổ sung: NaNO3, NH4NO3, (NH4)2SO4, KNO3, NH4K2SO4, Mg(NO3)2. Mục đích: Xác định hàm lượng NaNO3, NH4NO3, (NH4)2SO4, KNO3, NH4K2SO4, Mg(NO3)2 mà ở đó hoạt tính của enzyme amylase được tổng hợp là cao nhất. Nguyên liệu: Cám, trấu, bột gạo và các muối (NaNO3 , NH4NO3 , (NH4)2SO4 KNO3, NH4K2SO4, Mg(NO3)2) Tiến hành thí nghiệm Chuẩn bị mỗi mẫu 50g bao gồm: 75% cám 20% trấu 5% bột gạo Thu nhận enzyme Khảo sát hoạt tính Nguyên liệu môi trường Xử lí nguyên liệu Hấp thanh trùng (121oC, 15 phút) Làm nguội Nuôi cấy vi sinh vật Thu nhận môi trường sau nuôi cấy Sấy lạnh Nghiền mịn Amylase thô Luận văn tốt nghiệp khoá 29 - 2008 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp &SHƯD 28 Nhân tố A: các loại muối bổ sung A1: NaNO3 A2: NH4K2PO4 A3: NH4NO3 A4: KNO3 A5: (NH4)2SO4 A6: Mg(NO3)2 Nhân tố B: nồng độ B1: 0,15% B2: 0,3% B3: 0,45% Số nghiệm thức là 18 Số lần lặp lại là 2 Thí nghiệm được tiến hành theo qui trình, nguyên liệu được xử lý và điều chỉnh ẩm đạt 55-60%, hấp thanh trùng ở 121oC trong thời gian 15 phút sau đó nuôi trong thời gian 50 giờ. Sau đó thu nhận enzyme và khảo sát hoạt tính. A6 A1 A2 B3 A3 B1 B2 A4 A5 B1 B2 B3 ............................ ... Luận văn tốt nghiệp khoá 29 - 2008 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp &SHƯD 29 CHƯƠNG IV. KẾT QUẢ THẢO LUẬN Quá trình nuôi cấy và tạo enzyme đối với nấm mốc phụ thuộc rất nhiều yếu tố như pH, nhiệt độ, thời gian, độ ẩm, thành phần môi trường, cơ chất cảm ứng Tuy nhiên, các chất cảm ứng này không làm tăng tuyệt đối tất cả enzyme mà nó thường tăng khả năng tổng hợp enzyme này và làm giảm hoạt tính của enzyme khác. Kết quả khảo sát các yếu tố này như sau: Bảng 6. Hoạt tính của amylase ở điều kiện đối chứng (đv/g) α-amylase riêng Glucoamylase riêng Khối lượng môi trường sau khi nuôi (g) α-amylase tổng Glucoamylase tổng 88,415 1782 86,07 7612,978 153376,740 Kết quả thể hiện ở bảng 6 thu được từ việc áp dụng những điều kiện tối ưu trong phần luận văn tốt nghiệp của Chiêm Thị Bích Vân ( 2007). Bảng 7. Kết quả thống kê ảnh hưởng của các loại muối bổ sung đến hoạt tính riêng của α- amylase Loại muối Hoạt tính riêng của α-amylase (đv/g) NH4NO3 137,916a NaNO3 122,350b (NH4)2SO4 119,237b KNO3 97,099c Mg(NO3)2 87,067d NH4K2PO4 62,854e Đối chứng 88,451d Ghi chú: các chữ cái khác nhau biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê trong cùng một cột, ở độ tin cậy 95%. Kết quả thống kê ở bảng 7 cho thấy các loại muối bổ sung ảnh hướng lớn đến hoạt tính riêng của α- amylase, hoạt tính riêng của α- amylase ở các loại muối khác nhau đều khác nhau về ý nghĩa thống kê. Tuy nhiên, hoạt tính riêng của α- amylaseở 2 loại muối NaNO3 và (NH4)2SO4 là không có sự khác biệt ý nghĩa. Luận văn tốt nghiệp khoá 29 - 2008 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp &SHƯD 30 Nồng độ (%) 0 20 40 60 80 100 120 140 160 A1 A2 A3 A4 A5 A6 Đối chứngChất cảm ứng H o ạt tín h (đ v /g ) 0.15 0.30 0.45 Hình 18. Hoạt tính riêng của α-amylase khi bổ sung các loại muối Đồ thị biểu diễn ở hình 18 cho thấy hoạt tính riêng của α-amylase thu được từ việc bổ sung những muối cảm ứng ở những nồng độ khác nhau. Qua kết quả ta nhận thấy ở nồng độ 0,15% NH4NO3 (A3) thì hoạt tính riêng của enzyme α- amylase là cao nhất, bên cạnh đó ở những nồng độ của các muối NaNO3 (A1), (NH4)2SO4 (A5) hoạt tính riêng của α-amylase cũng cao hơn so với mẫu đối chứng. Trong khi đó với việc bổ sung các muối (NH4)2SO4 (A5), NH4K2PO4 (A2), Mg(NO3)2 (A6) thì khả năng tổng hợp α-amylase riêng có phần suy giảm. Bảng 8. Kết quả thống kê hoạt tính riêng của glucoamylase khi bổ sung các loại muối Loại muối Hoạt tính riêng của glucoamylase (đv/g) NH4K2PO4 2013c NaNO3 4290ab (NH4)2SO4 3234b NH4NO3 4455a KNO3 1980c Mg(NO3)2 1485c Đối chứng 1848d Ghi chú: các chữ cái khác nhau biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê trong cùng một cột, ở độ tin cậy 95%. Hoạt tính riêng của glucoamylase khi bổ sung các loại muối NaNO3và NH4NO3 là rất lớn so với các muối còn lại và hoạt tính riêng của glucoamylase khi bổ sung Luận văn tốt nghiệp khoá 29 - 2008 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp &SHƯD 31 các loại muối này không có sự khác biệt ý nghĩa về mặt thống kê. Tuy nhiên, nếu bổ sung các muối NH4K2PO4, KNO3, và Mg(NO3)2 thì hoạt tính riêng của glucoamylase nhỏ hơn rất nhiều và rất khác biệt ý nghĩa so với các muối trên (bảng 8). Nồng độ (%) 0 1000 2000 3000 4000 5000 A1 A2 A3 A4 A5 A6 Đối chứngChất cảm ứng H o ạt tín h (đ v /g ) 0.150 0.300 0.450 Hình 19. Hoạt tính riêng glucoamylase khi bổ sung các loại muối Tương tự như hoạt tính riêng của α-amylase riêng thì hoạt tính riêng của glucoamylase được tổng hợp cao hơn nhiều khi bổ sung các muối NaNO3 (A1), (NH4)2SO4 (A5), NH4NO3 (A3) so với mẫu đối chứng. Ở nồng độ 0,3% NaNO3 thì cao hơn so với hai nồng độ còn lại trong khi đó các muối (NH4)2SO4, NH4NO3 ở nồng độ 0,45% thì khả năng tổng hợp glucoamylase riêng cao hơn so với hai nồng độ còn lại. Trong hình 19 ta nhận thấy khả năng tổng hợp glucoamylase riêng của NH4NO3 (A3) ở nồng độ 0,45% là cao nhất. Bảng 9. Hoạt tính của α-amylase tổng khi bổ sung các loại muối Loại muối Hoạt tính của α-amylase tổng (đv) NH4NO3 10841,50a (NH4)2SO4 9546,07b NaNO3 9438,04b KNO3 8208,71c Mg(NO3)2 7672,34c NH4K2PO4 5101,19d Đối chứng 7612,98c Ghi chú: các chữ cái khác nhau biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê trong cùng một cột, ở độ tin cậy 95%. Luận văn tốt nghiệp khoá 29 - 2008 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp &SHƯD 32 Hoạt tính của α-amylase tổng khi bổ sung muối NH4K2PO4 là cao nhất và đều khác biệt ý nghĩa so với các muối còn lại. Khi bổ sung các loại muối khác nhau hoạt tính của α-amylase cũng rất khác biệt nhau (bảng 9). 0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 Hoạt tính (đv/g) A1 A2 A3 A4 A5 A6 Đố Chất cảm ứng Nồng độ (%) 0.150 0.300 0.450 Hình 20. Hoạt tính của α-amylase tổng khi bổ sung các loại muối Đồ thị biểu diễn ở hình 20 cho thấy khả năng tổng hợp nên α-amylase tổng ở nồng độ 0,3% muối NaNO3 (A1), 0,15% muối NH4NO3 (A3), 0,45% muối (NH4)2SO4 (A5) thì cao hơn so với hai nồng độ còn lại của mỗi muối. Trong đó khả năng tổng hợp α-amylase tổng của muối NH4NO3 (A3) 0,15% là cao nhất Bảng10. Hoạt tính của glucoamylase tổng khi bổ sung các loại muối Loại muối Hoạt tính của glucoamylase tổng (đv/g) NH4NO3 377918a NaNO3 330931ab (NH4)2SO4 258914bc KNO3 167389cd NH4K2PO4 157578d Mg(NO3)2 130858d Đối chứng 153376d Ghi chú: các chữ cái khác nhau biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê trong cùng một cột, ở độ tin cậy 95%. i chứng Luận văn tốt nghiệp khoá 29 - 2008 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp &SHƯD 33 Hoạt tính của glucoamylase tổng cũng cho kết quả tương tự hoạt tính α-amylase tổng. Kết quả thể hiện ở bảng 10 cho thấy, khi bổ sung muối NH4K2PO4 hoạt tính của glucoamylase tổng có giá trị cao nhất . 0 50000 100000 150000 200000 250000 300000 350000 400000 Hoạt tính (đv/g) A1 A2 A3 A4 A5 A6 Chất cảm ứng Nồng độ (%) 0.150 0.300 0.450 Hình 21. Hoạt tính của glucoamylase tổng khi bổ sung các loại muối Khả năng vượt trội về tổng hợp glucoamylase tổng của muối NH4NO3 (A3) so với những muối còn lại cụ thể là ở nồng độ 0,45% NH4NO3 (hình 21). Qua các kết quả khảo sát được cho thấy khả năng tổng hợp nên α-amylase riêng, α-amylase tổng cũng như glucoamylase riêng và glucoamylase tổng của muối NH4NO3 (A3) ở nồng độ 0,45% là cao nhất sau đó là muối NaNO3 (A1) ở nồng độ 0,3% kế tiếp là muối (NH4)2SO4 (A5) 0,45%. Ở hai muối (NH4)2SO4 (A5), Mg(NO3)2 (A6) khả năng tổng hợp không có sự khác biệt so với mẫu đối chứng, ngược lại khi bổ sung NH4K2PO4 (A2) khả năng tổng hợp nên các amylase của nấm Aspergillus oryzae suy giảm đáng kể. Đối chứng Luận văn tốt nghiệp khoá 29 - 2008 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp &SHƯD 34 CHƯƠNG V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Qua kết quả khảo sát thì ta nhận thấy hoạt tính của enzyme được tổng hợp từ việc nuôi cấy nấm mốc Aspergillus oryzae có thể tăng thêm khi bổ sung một lượng chất cảm ứng với vai trò kích thích quá trình tổng hợp enzyme : Thành phần môi trường nuôi cấy gồm 75% cám gạo, 20% trấu, 5% bột gạo, 0,45% muối NH4NO3 bổ sung làm chất cảm ứng, sau khi thanh trùng tiến hành cấy giống Aspergillus oryzae trong thời gian 50 giờ. Điều kiện độ ẩm là 55%, pH bằng 5,0, nhiệt độ nuôi cấy 30oC. Quy trình sản xuất đề nghị: Môi trường (75% cám gạo, 20% trấu, 5% bột gạo, 0,45% muối NH4NO3) Thanh trùng (121oC, 15 phút) Cấy Ủ (nhiệt độ 30oC, 50 giờ) Thu môi trường Đông khô Nghiền Đóng gói Bảo quản Luận văn tốt nghiệp khoá 29 - 2008 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp &SHƯD 35 5.2 Đề nghị Do thời gian nghiên cứu ngắn nên chế phẩm enzyme thu được chưa có điều kiện thử nghiệm vào thực tế nên tôi xin đề nghị thêm: - Sử dụng chế phẩm amylase vào chế biến thực phẩm: rượu, nước giải khát - Nghiên cứu sản xuất amylase từ vi khuẩn hay loại nấm mốc khác - Nghiên cứu sự tổng hợp amylase trên các nguyên liệu khác: cám ngô, rỉ mật Luận văn tốt nghiệp khoá 29 - 2008 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp &SHƯD 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO Đặng Thị Thu và các cộng sự (2004), Công nghệ enzyme, Nhà xuất bản Đại học quốc gia thành phố Hồ Chí Minh. Lương Đức Phẩm (1998), Công nghệ vi sinh vật, Nhà xuất bản Nông nghiệp. Nguyễn Đức Lượng- Nguyễn Hữu Phúc (1996), Công nghệ vi sinh vật (tập 2: Vi sinh vật công nghiệp), Trường đại học quốc gia thành phố Hồ Chí Minh. Nguyễn Đức Lượng và các cộng sự (2003), Thí nghiệm công nghệ sinh học (tập 2: Thí nghiệm vi sinh vật học), Nhà xuất bản Đại học quốc gia thành phố H ồ Chí Minh. Nguyễn Đức Lượng (2001), Công nghệ vi sinh vật (tập 1: Cơ sở vi sinh vật công nghiệp), Nhà xuất bản Đại học quốc gia thành phố Hồ Chí Minh. Nguyễn Đức Lượng và các cộng sự (2004), Công nghệ enzyme, Nhà xuất bản Đại học quốc gia thành phố Hồ Chí Minh. Nguyễn Đức Lượng (2004), Công nghệ sinh học, Nhà xuất bản Đại học quốc gia thành phố Hồ Chí Minh Nguyễn Xuân Tành và các cộng sự (2004), Công nghệ enzyme, Nhà xuất bản Đại học quốc gia thành phố Hồ Chí Minh. Phạm Thị Trân Châu- Phạm Tuấn Nghĩa (2007), Công nghệ sinh học (tập 3: Enzyme và ứng d ụng), Nhà xuất bản Giáo dục. Trần Minh Tâm (2000), Công nghệ vi sinh ứng dụng, Nhà xuất bản Nông nghiệp. Chiêm Thị Bích Vân (2007), Nghiên cứu sản xuất chế phẩm Amylase từ Aspergillus oryzae, Luận văn tốt nghiệp Khoa Nông nghiệp&Sinh Học Ứng Dụng Trường Đại Học Cần Thơ. org Luận văn tốt nghiệp khoá 29 - 2008 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp &SHƯD vii PHỤ LỤC A Các phương pháp phân tích hoạt tính amylase Khảo sát hoạt tính của α-amylase theo Rukhliadeva Nguyên tắc Phương pháp dựa trên cơ sở thủy phân tinh bột bởi enzyme có trong dịch chế phẩm nghiên cứu tới các dextrin có phân tử lượng khác nhau. Do đó cường độ màu tạo thành giữa tinh bột và các sản phẩm thủy phân của nó với iod bằng máy so màu quang điện sẽ tính được hoạt độ enzyme. Đơn vị hoạt độ amylase là lượng enzyme chuyển hóa được 1g tinh bột tan thành các dextrin có phân tử lượng khác nhau ở 30oC trong thời gian một giờ (pH là 4,7). Hóa chất và dịch chiết enzyme Dung dịch đệm acetate pH bằng 4,7: Phối trộn một thể tích CH3COOH 1N với một thể tích CH3COONa 1N. Kiểm tra lại bằng pH kế. Dung dịch HCl 0,1N Dung dịch iod gốc: Hòa tan 0,5g iod và 5g KI với một lượng nhỏ nước cất trong chén có nút mài. Lắc nhẹ hỗn hợp để hòa tan hoàn toàn, sau đó chuyển sang bình định mức 200ml, bổ sung nước cất đến vạch mức. Dung dịch iod phân tích: Pha loãng 2ml dung dịch iod gốc với dung dịch HCl 0,1N trong bình tam giác 100ml. Trước khi sử dụng cần kiểm tra mật độ quang của nó trên máy so màu quang điện ở bước sóng là 453nm với chiều dày cuvet 1cm. Mật độ quang của dung dịch phải có giá trị 0,16 (± 0,01). Nếu có sự sai lệch mật độ quang phải hiệu chỉnh bằng cách thêm vài giọt HCl hoặc dung dịch iod gốc. Dung dịch tinh bột 1%: Hòa tan 1g tinh bột (theo chất khô tuyệt đối) với 50ml nước cất trong bình định mức 100ml, lắc đều. Đặt vào bếp cách thủy đun sôi, lắc liên tục cho đến khi hòa tan hoàn toàn. Sau đó làm nguội và bổ sung 10ml dung dịch đệm axetate có pH bằng 4,7 bổ sung nước cất tới vạch mức, lắc đều. Dung dịch tinh bột được chuẩn bị cho ngày sử dụng. Dịch chiết enzyme phân tích: Pha loãng 3g enzyme thu được có chứa một lượng enzyme đủ để thủy phân tinh bột từ 20% - 70% trong điều kiện xác định. Do đó tùy thuộc vào hoạt độ chế phẩm enzyme gốc mà tiến hành pha loãng theo tỷ lệ thích hợp. Luận văn tốt nghiệp khoá 29 - 2008 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp &SHƯD viii Tiến hành thí nghiệm Cho vào 2 ống nghiệm (đường kính 20mm, chiều cao 100mm), mỗi ống 10ml dung dịch tinh bột 1%, đặt máy vào máy điều nhiệt có nhiệt độ 30oC (± 0,2oC) trong thời gian 10 phút để đưa nhiệt độ tới 30oC. Bổ sung vào ống nghiệm thứ nhất 5ml nước cất (ống kiểm chứng), vào ống thứ hai 5ml enzyme phân tích (ống thí nghiệm), khuấy đều nhanh hỗn hợp và giữ nguyên nhiệt độ này trong thời gian 10 phút. Lấy từ hai ống nghiệm trên mỗi ống 0,5ml hỗn hợp phản ứng cho vào hai ống nghiệm khác đã có sẵn 50ml dung dịch iod phân tích, lắc đều hỗn hợp trong bình. Các dung dịch nhận được có màu như sau: • Dung dịch kiểm chứng có màu xanh • Dung dịch thí nghiệm có màu tím với cường độ màu khác nhau tuỳ thuộc lượng tinh bột chưa bị thuỷ phân. Đo cường độ màu các dung dịch ở bước sóng λ = 656 nm so với nước cất. kết quả lượng tinh bột thuỷ phân (C) tính theo công thức: 1,0 1 21 × − = D DDC Trong đó: D1: Mật độ quang đo được của dung dịch kiểm chứng; D2: Mật độ quang đo được của dung dịch thí nghiệm; 0,1: Lượng tinh bột được phân tích, gam. Hoạt độ amylase của chế phẩm enzyme nguồn gốc nấm mốc tính theo đv/g: 100003766,0264,7 ×−×= m CHdA (Rukhliadeva, 1968) Trong đó: m: Lượng chế phẩm nghiên cứu, mg; C: Lượng tinh bột bị thuỷ phân, gam; 1000: Hệ số chuyển mg thành gam; 7,264 và 0,03766: Là các hệ số của phương trình tính hoạt độ, thu được bằng phương pháp xử lý toán học số liệu thực nghiệm về sự phụ thuộc của Luận văn tốt nghiệp khoá 29 - 2008 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp &SHƯD ix lượng tinh bột bị thuỷ phân vào lượng enzyme lấy để thí nghiệm. Trong các hệ số này đã có đưa vào thừa số tính chuyển ra một giờ tác dụng của enzyme. Hoạt độ của glucoamylase (γ-amylase) theo phương pháp vi lượng của V.Y.Rodzevich, O.P.Karenbiakina Nguyên tắc Khảo sát hoạt tính của glucoamylase dựa trên cơ sở thuỷ phân tinh bột bởi enzyme glucoamylase có trong chế phẩm nghiên cứu. Xác định lượng glucose tạo thành sẽ tính được hoạt độ enzyme. Đơn vị hoạt độ Glucoamylase là lượng enzyme tác dụng lên dung dịch tinh bột tan ở pH = 4,7, nhiệt độ 30oC, trong thời gian một giờ giải phóng được 1mg glucose. Hoá chất và dung dịch enzyme Dung dịch Fehling A: Hoà tan 34,64g CuSO4.5H2O trong 500 ml nước cất. Dung dịch Fehling B: Hoà tan 173g kali natri tartrat kép và 50g NaOH trong 500ml nước cất. Dung dịch H2SO4 25% Dung dịch KI 30% Dung dịch tinh bột 1% Na2S2O3 0,1N Chiết rút enzyme: Cân 3g chế phẩm nghiền nhỏ chuyển toàn bộ vào bình tam giác 250ml, bổ sung 90ml nước cất và 10ml dung dịch đệm axetat pH bằng 4,7. Giữ hỗn hợp ở nhiệt độ 30oC trong thời gian 1 giờ có khuấy đão định kỳ. Lọc và thu hồi dịch chiết enzyme. Bảo quản dung dịch chế phẩm gốc ở nhiệt độ 2 - 4oC trong thời gian 1 ngày. Tiến hành Mẫu thí ngiệm: Hút 1ml dung dịch tinh bột 1% cho vào bình tam giác 50ml, bổ sung 1,5ml nước cất và 0,5ml dịch chiết enzyme (các dung dịch này đã đưa về nhiệt độ 30oC), lắc đều và đặt lại vào máy điều nhiệt và giữ chính xác 10 phút. Đình chỉ phản ứng bằng 1ml Fehling A và 1ml Fehling B. Đun sôi 2 phút (kể từ lúc xuất hiện bọt sôi đầu tiên), làm nguội và bổ sung 1ml H2SO4 25% để hoà tan Cu2O, sau đó bổ sung 2ml KI 30% rồi chuẩn bằng dung dịch Na2S2O3 0,1N. Lưu ý hoạt độ dịch chiết enzyme quá thấp (không có lớp Cu2O màu đỏ ở đáy bình phải tăng lượng enzyme, ngược lại nếu chỉ có Cu2O mà không có màu xanh của dung dịch Fehling ở trên phải pha loãng dịch chiết enzyme). Luận văn tốt nghiệp khoá 29 - 2008 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp &SHƯD x Mẫu kkiểm chứng: Tiến hành như đối với mẫu thí nghiệm, nhưng thay thế 0,5 ml dịch chiết enzyme bằng 0,5 ml dịch chiết enzyme đã bị vô hoạt bằng cách đun sôi. Kết quả Hoạt độ Glucoamylase (HdG) tính bằng đv/g được xác định theo công thức: 10 603,3 × ××× = m faHdG Trong đó: a: Hiệu số ml Na2S2O3 0,1N của mẫu kiểm chứng và mẫu thí nghiệm; f: hệ số hiệu chỉnh nồng độ Na2S2O3 0,1N; 3,3: Hệ số chuyển đổi thành glucose; 10: Thời gian thủy phân cơ chất, phút; m: lượng enzyme sử dụng, gam; 60: Hệ số chuyển thành giờ; Các đơn vị hoạt độ enzyme Đơn vị hoạt độ của enzyme được coi là lượng enzyme có khả năng xúc tác làm chuyển hóa một lượng cơ chất nhất định trong thời gian xác định ở điều kiện tiêu chuẩn. Theo qui ước quốc tế có một số đơn vị hoạt độ sau: Đơn vị IU (đơn vị quốc tế) Là lượng enzyme có khả năng xúc tác chuyển hóa được một lượng micromol cơ chất sau thời gian một phút ở điều kiện tiêu chuẩn. 1IU = 1µM cơ chất (10-6M/phút) Đơn vị katal (kat) Là lượng enzyme có khả năng xúc tác chuyển hóa một mol cơ chất sau thời gian một giây ở điều kiện tiêu chuẩn. 1kat = 1Mol cơ chất/giây 1IU = 1/60 x 10-6kat = 16,67 nkat Hoạt lực enzyme hoặc hoạt lực xúc tác được biểu diễn bằng một số đơn vị hoạt độ enzyme trên đơn vị khối lượng protein. 1IU hoặc kat / 1mg (ml) protein Luận văn tốt nghiệp khoá 29 - 2008 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp &SHƯD xi Hoạt độ phân tử (hoặc hoạt độ riêng phân tử) Được biểu diễn bằng số phân tử cơ chất được chuyển hóa bởi một phân tử enzyme sau một thời gian (thường một phút) Hoạt lực tâm xúc tác Là số phân tử cơ chất được chuyển hóa bởi một trung tâm hoạt động sau một phút. Luận văn tốt nghiệp khoá 29 - 2008 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp &SHƯD xii PHỤ LỤC B ANOVA Table for HdA rieng by Dieu kien Analysis of Variance ----------------------------------------------------------------------------- Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value ----------------------------------------------------------------------------- Between groups 7928.06 6 1321.34 111.39 0.0000 Within groups 83.0379 7 11.8626 ----------------------------------------------------------------------------- Total (Corr.) 8011.1 13 Multiple Range Tests for HdA rieng by LOAI MUOI -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD Dieu kien Count Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- A2 2 62.8535 X A6 2 87.067 X Doi chung 2 88.451 X A4 2 97.0985 X A5 2 119.237 X A1 2 122.35 X A3 2 137.916 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- Doi chung– A1 *-33.8985 8.14428 Doi chung– A2 *25.5975 8.14428 Doi chung– A3 *-49.4645 8.14428 Doi chung– A4 *-8.6475 8.14428 Doi chung– A5 *-30.7855 8.14428 Doi chung– A6 1.384 8.14428 A1 – A2 *59.496 8.14428 A1 – A3 *-15.566 8.14428 A1 – A4 *25.251 8.14428 A1 – A5 3.113 8.14428 A1 – A6 *35.2825 8.14428 A2 – A3 *-75.062 8.14428 A2 – A4 *-34.245 8.14428 A2 – A5 *-56.383 8.14428 A2 – A6 *-24.2135 8.14428 Luận văn tốt nghiệp khoá 29 - 2008 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp &SHƯD xiii A3 – A4 *40.817 8.14428 A3 – A5 *18.679 8.14428 A3 – A6 *50.8485 8.14428 A4 – A5 *-22.138 8.14428 A4 – A5 *10.0315 8.14428 A5 – A6 *32.1695 8.14428 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. ANOVA Table for HdG rieng by Dieu kien Analysis of Variance ----------------------------------------------------------------------------- Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value ----------------------------------------------------------------------------- Between groups 1.81247E7 6 3.02078E6 12.40 0.0020 Within groups 1.70537E6 7 243625.0 ----------------------------------------------------------------------------- Total (Corr.) 1.98301E7 13 Multiple Range Tests for HdG rieng by LOAI MUOI -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD Dieu kien Count Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- A6 2 1485.0 X Doi chung 2 1848.0 X A4 2 1980.0 X A2 2 2013.0 X A5 2 3234.0 X A1 2 4290.0 XX A3 2 4455.0 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- Doi chung – A1 *-2442.0 1167.14 Doi chung– A2 -165.0 1167.14 Doi chung– A3 *-2607.0 1167.14 Doi chung– A4 -132.0 1167.14 Doi chung– A5 *-1386.0 1167.14 Doi chung– A6 363.0 1167.14 A1 – A2 *2277.0 1167.14 A1 – A3 -165.0 1167.14 A1 – A4 *2310.0 1167.14 A1 – A5 1056.0 1167.14 A1 – A6 *2805.0 1167.14 Luận văn tốt nghiệp khoá 29 - 2008 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp &SHƯD xiv A2 – A3 *-2442.0 1167.14 A2 – A4 33.0 1167.14 A2 – A5 *-1221.0 1167.14 A2 – A6 528.0 1167.14 A3 – A4 *2475.0 1167.14 A3 – A5 *1221.0 1167.14 A3 – A6 *2970.0 1167.14 A4 – A5 *-1254.0 1167.14 A4 – A6 495.0 1167.14 A5 – A6 *1749.0 1167.14 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. ANOVA Table for HdA tong by Dieu kien Analysis of Variance ----------------------------------------------------------------------------- Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value ----------------------------------------------------------------------------- Between groups 4.07984E7 6 6.79974E6 102.86 0.0000 Within groups 462740.0 7 66105.7 ----------------------------------------------------------------------------- Total (Corr.) 4.12612E7 13 Multiple Range Tests for HdA tong by Dieu kien -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD Dieu kien Count Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- A4 2 5101.19 X Doi chung 2 7612.98 X A6 2 7672.34 X A3 2 8208.71 X A1 2 9438.04 X A5 2 9546.07 X A2 2 10841.5 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- A1 - A2 *-1403.5 607.971 A1 - A3 *1229.33 607.971 A1 - A4 *4336.85 607.971 A1 - A5 -108.034 607.971 A1 - A6 *1765.7 607.971 A1 - Doi chung *1825.06 607.971 Luận văn tốt nghiệp khoá 29 - 2008 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp &SHƯD xv A2 - A3 *2632.83 607.971 A2 - A4 *5740.35 607.971 A2 - A5 *1295.46 607.971 A2 - A6 *3169.19 607.971 A2 - Doi chung *3228.56 607.971 A3 - A4 *3107.52 607.971 A3 - A5 *-1337.37 607.971 A3 - A6 536.363 607.971 A3 - Doi chung 595.729 607.971 A4 - A5 *-4444.88 607.971 A4 - A6 *-2571.15 607.971 A4 - Doi chung *-2511.79 607.971 A5 - A6 *1873.73 607.971 A5 - Doi chung *1933.1 607.971 A6 - Doi chung 59.366 607.971 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. ANOVA Table for HdG tong by Dieu kien Analysis of Variance ----------------------------------------------------------------------------- Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value ----------------------------------------------------------------------------- Between groups 2.983E12 6 4.97167E11 297.23 0.0000 Within groups 1.17085E10 7 1.67264E9 ----------------------------------------------------------------------------- Total (Corr.) 2.99471E12 13 Multiple Range Tests for HdG tong by Dieu kien -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD Dieu kien Count Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- Doi chung 2 153376.0 X A6 2 130858.0 X A4 2 157578.0 X A3 2 167389.0 XX A5 2 258914.0 XX A1 2 330931.0 XX A2 2 377918.0 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- A1 - A2 -46987.1 96708.5 Luận văn tốt nghiệp khoá 29 - 2008 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp &SHƯD xvi A1 - A3 *163541.0 96708.5 A1 - A4 *173353.0 96708.5 A1 - A5 72016.6 96708.5 A1 - A6 *200072.0 96708.5 A1 - Doi chung *177555 96708.5 A2 - A3 *210528.0 96708.5 A2 - A4 *220340.0 96708.5 A2 - A5 *119004.0 96708.5 A2 - A6 *247059.0 96708.5 A2 - Doi chung *224542 96708.5 A3 - A4 9811.56 96708.5 A3 - A5 -91524.8 96708.5 A3 - A6 36531.0 96708.5 A3 - Doi chung 14013 96708.5 A4 - A5 *-101336.0 96708.5 A4 - A6 26719.4 96708.5 A4 - Doi chung 4202 96708.5 A5 - A6 *128056.0 96708.5 A5 - Doi chung *105538 96708.5 A6 - Doi chung *-22518 96708.5 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference.