Luận văn Khảo sát sự ảnh hưởng của chất gây rối loạn nội tiết lên Dapnnia magna

iến đổi vật chất và năng lượng của hệ sinh thái hồ. Nếu vượt quá khả năng hấp thụ của hệ sinh thái thì nguồn dinh dưỡng thừa này sẽ là nguyên nhân gây nên tình trạng phì dinh dưỡng hay ô nhiễm hữu cơ thủy vực. Hậu quả là xảy ra các hiện tượng yếm khí môi trường nước với các sản phẩm kèm theo là NH3, NO3, PO4, H2S, vi khuẩn coliforms,… Lượng dinh dưỡng vô cơ N, P kể trên, nếu phát triển quá mạnh thường gây hiện tượng nở hoa thực vật nổi, đồng thời làm giảm sự đa dạng sinh học và hạn chế phát triển các đối tượng thủy sinh vật có ích khác trong thủy vực. 2.2.2.2. Ảnh hưởng của ô nhiễm đến thủy sinh vật Giữa môi trường và cơ thể sống có mối tương tác chặt chẽ với nhau. Trong thủy vực, môi trường nước tác động đến thủy sinh vật, ngược lại, cơ thể sống có những đặc tính phản ứng một cách tự nhiên để phù hợp với điều kiện sống hoặc những biến đổi về điều kiện môi trường. Chất lượng môi trường nước, kiểu ô nhiễm hay mức độ ô nhiễm của môi trường nước sẽ tác động tới thủy sinh vật theo các chiều hướng như sau: Làm giảm sự đa dạng (thành phần loài) đồng thời làm giảm mật độ, sinh khối. Làm thay đổi cấu trúc khu hệ thủy sinh vật. Làm bùng nổ mật độ sinh khối, sinh vật nổi (nở hoa thực vật nổi), sinh vật đáy. Làm biến dạng cấu tạo cơ thể (cấu trúc nội quan, màu sắc, gene…), sự tích lũy các chất gây độc quá mức bình thường. Một số các thủy vực tiếp nhận nước thải ở các tỉnh phía Bắc Việt Nam bị ô nhiễm dinh dưỡng hoặc nặng hơn, bị ô nhiễm hữu cơ, thành phần loài thủy sinh vật kém phong phú thể hiện ở thành phần loài ít, mật độ cũng như sinh khối thấp. Tại các thủy vực bị ô nhiễm hữu cơ nặng dường như không thấy các nhóm thủy sinh vật phổ biến (sinh vật nổi, tôm cua, trai ốc, cá), thậm chí nhóm ấu trùng côn trùng Chironomidae là nhóm có thể thích ứng với điều kiện môi trường giàu dinh dưỡng hoặc ô nhiễm hữu cơ cũng đã ít gặp mà chỉ còn các nhóm vi sinh vật hoại sinh trong điều kiện yếm khí và nấm. Cũng tương tự, các thủy vực tự nhiên như ao, mương dùng để ngâm đay ở Hưng Yên, các thủy vực tiếp nhận nước thải xưởng làm giấy chỉ có các loại sinh vật kỵ khí Closterium và ấu trùng Diptera, không thấy các nhóm thủy sinh vật phổ biến khác. Ô nhiễm bên cạnh gây ra sự suy giảm đa dạng sinh học còn gây nên sự suy giảm mật độ cũng như sinh khối các nhóm thủy sinh vật. Hầu hết các thủy vực bị ô nhiễm hữu cơ đều có mật độ và sinh khối thủy sinh vật thấp hơn so với các thủy vực không bị ô nhiễm hoặc mới bị ô nhiễm dinh dưỡng với mức độ thấp. Tại các thủy vực phì dưỡng, trong thời kỳ nở rộ thực vật nổi, một số loài tảo, đặc biệt sự nở hoa thực vật nổi, một số loài tảo, đặc biệt tảo lam lấm Microcystic trong quá trình phát triển có sản sinh ra những độc tố gây hại trực tiếp ngay cho các loài sinh vật khác. Một số các đầm nuôi ven biển bị tác động của thủy triều đỏ (sự nở rộ của loài tảo giáp có tính độc), thủy triều xanh (nở rộ tảo silic) đã gây bệnh hoặc làm chết hàng loạt các đối tượng nuôi như tôm he, cua, cá. Các nhóm sinh vật tự nhiên khác ở vùng cửa sông, ven biển cũng bị ảnh hưởng tiêu cực của thủy triều đỏ. Sau thời kỳ nở rộ thực vật nổi, lượng lớn tảo bị chết hàng loạt gây mùi khó chịu. Tảo chết chìm xuống đáy hồ với một khối lượng lớn sau sự nở rộ, tạo thành một lượng chất dinh dưỡng tích lũy trong trầm tích đáy. Một số chất dinh dưỡng vô cơ dễ bị phân hủy được khoáng hóa trong chu trình trao đổi vật chất đã làm suy giảm lượng oxy tầng đáy, gây nên điều kiện yếm khí tầng đáy và những sản phẩm độc hại (khí H2S, khí methane,… các loại vi sinh vật kỵ khí Clostridium, nấm…) gây chết một số loài thủy sinh vật khác. Những hiện tượng ô nhiễm hữu cơ như trên một mặt gây chết hàng loạt các nhóm động vật bậc cao, mặt khác cũng góp phần làm giảm mức độ đa dạng sinh học, làm thay đổi cấu trúc thành phần cũng như tỉ lệ số lượng các nhóm thủy sinh vật. Sự ô nhiễm môi trường bên cạnh ảnh hưởng đến cấu trúc thành phần, mức độ đa dạng, mật độ và sinh khối các nhóm thủy sinh vật mà còn gây tác động tiêu cực tiềm tàng khác là biến đổi chất lượng của những cá thể trên cơ sở tích tụ các chất gây độc như một số kim loại nặng, các hóa chất bảo vệ thực vật trong các cơ quan nội tạng của một số loài cá, thân mềm, giáp xác. Các tia phóng xạ ngoài tác hại gây chết, chúng còn ảnh hưởng đến sự phát triển của sinh vật ở giai đoạn đầu như đẻ sớm, không phát triển hết các giai đoạn của thai,… 2.3. Daphnia magna [1],[10],[13],[30] 2.3.1. Đặc điểm hình thái, sinh lý Daphnia magna là loài giáp xác nước ngọt thuộc họ Cladocera. Nó phân bố ở khắp các nơi với rất nhiều loài. Có khoảng 150 loài được tìm thấy ở Bắc Mỹ, và ở Châu Âu Daphnia cũng tồn tại với số lượng tương tự. Bên cạnh đó, ở Châu Á và Châu Phi cũng có rất nhiều loài Daphnia, ví dụ như: Daphnia lumholtzi được tìm thấy rất nhiều ở Châu Phi. Trong các loại Daphnia thì Daphnia magna tuy không phân bố rộng rãi nhưng được biết đến nhiều nhất, do nó là nguồn thức ăn lý tưởng cho các loài ấu trùng cá, và được sử dụng rất nhiều trong các nghiên cứu về độc học và xử lý nước thải hữu cơ. 2.3.1.1. Hình thái Hình 2.1 – Daphnia magna D.magna có cơ thể hình bầu dục, có vỏ giáp bọc ngoài, phân đốt cơ thể không rõ ở bề ngoài. Nó có hai râu gấp đôi gồm hai nhánh phát triển lớn, có kích thước dài gần bằng một nửa cơ thể. Con đực có kích thước nhỏ hơn con cái, râu lớn hơn, đuôi bụng dài hơn và hình dạng của chân trước như cái càng dùng để gắp thức ăn. D.magna cái trưởng thành có kích thước bề rộng khoảng 3 – 5mm, D.magna đực là 2mm. Cơ thể của D.magna có thể chia thành 3 phần: đầu, ngực và bụng, cả ba phần đều không phân đốt rõ rệt. Toàn cơ thể được bọc trong vỏ giáp trơn và trong suốt, gồm hai mảnh trái, phải dính nhau về phía lưng và về phía bụng. Phần đầu vỏ giáp kéo dài về phía trước thành chùy nhọn, phần sau của vỏ giáp đầu, phía lưng thường có các lỗ đầu, gồm lỗ chính và lỗ bên. Ở gốc râu, hai bên đầu có nếp gấp của vỏ giáp tạo thành gở bên đầu. Phần thân vỏ giáp có thể phân biệt: cạnh lưng, cạnh bụng, cạnh sau. Cạnh bụng vỏ giáp có viền gai hay tơ. Cạnh sau vỏ giáp liên tục với cạnh bụng, đuôi vỏ giáp thường kéo dài thành núm. Phần ngực nằm trong vỏ giáp, không phân đốt rõ, có 4 – 6 đôi chân ngực. Phần bụng kéo dài thành đuôi bụng, không có phần phụ, lỗ hậu môn đổ ra cạnh trên ở gốc đuôi bụng. Ở phần gốc đuôi bụng trước hậu môn, thường có núm lồi nhỏ, có hai tơ dài, ngay phía trên có các phần lồi đuôi bụng hình dải lớn. Ngay trước hậu môn còn có núm trước hậu môn. Cạnh trên đuôi bụng (thường dễ lầm là cạnh dưới khi đặt con vật theo tư thế thẳng đứng) thường có hang gai đuôi bụng. Mặt bên đuôi bụng có khi có hàng gai hay tơ bên mọc thành từng đám hay thành dãy song song với cạnh trên. Đầu ngọn đuôi bụng có vuốt ngọn. Phần đầu có râu I, đôi râu II, đôi hàm trên đôi hàm dưới I và II. Râu I thường nhỏ, hình que không phân đốt, mọc ở gần ngọn chùy, đầu ngọn có túm tơ cảm giác. Râu II lớn, gồm phần gốc và 2 nhánh ngọn phân đốt, nhánh lưng hay nhánh trên và nhánh bụng hay nhánh dưới. Hình 2.2 – Cấu tạo của Daphnia magna 1. Râu 8. Postabdominal claw 2. Mắt 9. Hậu môn 3. Miệng 10. Postabdomen 4. Râu nhỏ 11. Túi ấp trứng 5. Môi trên 12. Vỏ giáp 6. Shell gland 13. Tim 7. Thoracic appendage 14. Thực quản Hình 2.3 – Phần đầu và đuôi của D.magna 2.3.1.2. Đặc điểm sinh lý D.magna có thể sống ở dãy nhiệt độ 18 – 250C, nhưng nó phát triển nhất ở nhiệt độ tối thích là 21 ± 10C và pH = 7.2 – 8.5 với hàm lượng oxy trong nước 7 – 8 mg/l. Chúng chỉ có thể sống trong môi trường nước ngọt với hàm lượng muối không được phép vượt quá 4.0 ppt, và nồng độ muối trong khoảng 1.5 – 3.0 ppt là thích hợp nhất. D.magna rất nhạy cảm với môi trường nước nghèo dinh dưỡng hoặc bị nhiễm độc. Khi môi trường có sự thay đổi bất thường thì có sự xuất hiện của trứng đen trong túi ấp, những trứng này nở ra con đực hay con cái sẽ chuyển thành con đực, và các con đực này sẽ chết. Môi trường chứa halogen như clo hay flo rất độc đối với D.magna, thậm chí nó bị ảnh hưởng nhiều hơn rất nhiều so với loài cá. Chúng cũng rất nhạy cảm trong môi trường có chứa các ion kim loại như natri, kali, magie, canxi, đồng và chì, nếu hàm lượng các chất này trong nước quá cao có thể làm cho chúng tê liệt và chết. Do vậy chúng thường được nuôi trong môi trường nước đã được kiểm tra và đạt tiêu chuẩn an toàn. D.magna có thể ăn rất nhiều các loại thức ăn khác nhau nhưng nguồn thức ăn chính của nó là các loại tảo đơn bào tươi, vi khuẩn, nấm men,… Nguồn thức ăn của D.magna ảnh hưởng rất nhiều đến màu sắc của nó. Nếu thức ăn của nó là tảo nó sẽ có màu xanh trong suốt, nếu nó ăn vi khuẩn thì sẽ có màu hồng cam… Bên cạnh đó màu sắc của cơ thể nó cũng phụ thuộc rất nhiều vào môi trường. Trong môi trường có hàm lượng oxy thấp, D.magna có xu hướng tạo ra nhiều hemoglobulin để nâng cao sự hấp thụ oxy trong nước và làm cho cơ thể nó có màu đỏ, trong môi trường có hàm lượng oxy cao nó có xu hướng có màu vàng. D.magna chủ yếu sinh sản theo kiểu trinh sản (con mẹ chỉ đẻ ra con cái) hơn là sinh sản hữu tính. Điều này đảm bảo cho việc đồng nhất giới tính. Tuy nhiên, D.magna chỉ có thể sinh sản theo kiểu này khi trong môi trường đạt những điều kiện thuận lợi về nguồn thức ăn, nhiệt độ,… Những con D.magna con trưởng thành sau 7 – 8 ngày. Sau khoảng 2 tuần thì D.magna con có thể sinh sản, trung bình mỗi con đẻ khoảng 10 con con, sự phát triển của trứng có thể quan sát trực tiếp qua cơ thể mẹ. Con cái tiếp tục sinh sản thường trong khoảng 3 ngày và chậm nhất là sau 4 ngày, nó sinh sản khoảng 20 lần trong suốt cuộc đời của nó (thông thường con cái thường đẻ ít hơn 100 con trong suốt cuộc đời của nó), con cái có thể sinh sản trong 2 tháng. Khi lượng thức ăn hiếm hay có độc tố thì trong túi ấp sẽ xuất hiện các trứng đen. Những trứng này sẽ phát triển thành con con đực với kích thước nhỏ, và chia ra các mảnh giáp xác nhỏ có hình dạng khớp lưng màu nâu tối hoặc màu đen. Khi đó, con cái sẽ không còn hình thức sinh sản vô tính nữa mà sẽ chuyển sang hình thức sinh sản hữu tính, nghĩa là có sự giao phối giữa con đực và con cái, và sự đồng nhất giới tính sẽ mất đi. Nếu điều kiện quá khắc nghiệt, con cái sẽ không đẻ ra con con và sẽ đẻ ra các trứng đen này, những trứng này có thể tồn tại trong điều kiện khắc nghiệt và khả năng chống chịu với ảnh hưởng môi trường khá tốt nếu các ao nước nuôi chúng bị khô cạn và thậm chí chúng vẫn có thể tồn tại trong băng. Khi điều kiện sống được cải thiện, các trứng bắt đầu nở ra con con (tất cả đều là cái) và các con đực chết hoàn toàn. Hình 2.4 – Vòng sinh sản của D.magna 2.3.2. Ứng dụng Thức ăn cho ấu trùng cá và một vài loài thủy sinh D.magna được biết đến nhiều từ khi thú chơi cá cảnh bắt đầu phát triển ở các nước châu Âu, do D.magna là một loại thức ăn cho cá rất có giá trị dinh dưỡng. D.magna có hàm lượng protein chiếm 50% tổng chất khô của cơ thể, ở con trưởng thành lượng chất béo chiếm 20 – 27%, ở con non 4 – 6% do vậy nó cung cấp cho cá và các loài thủy sinh khá đầy đủ các chất dinh dưỡng cần thiết. Hơn nữa, ở các nước ôn đới, điều kiện nuôi chúng khá dễ dàng và khả năng sinh sản, phát triển của nó tương đối nhanh. Hiện nay, tại một số nước ở châu Âu và Singapore, D.magna đang được kinh doanh rất nhiều để làm thức ăn cho cá cảnh, chúng được bán dưới dạng sống, dạng đông lạnh và cả loại đã sấy khô thành viên. Thử nghiệm độc tính Do đặc điểm sinh sản của nó là sinh sản vô tính, khi gặp điều kiện bất lợi thì sẽ xuất hiện trứng đen trong túi ấp và sẽ nở ra thành con đực, D.magna cũng có những thay đổi rõ rệt để phản ứng lại với độc tố của môi trường nên D.magna được sử dụng rất nhiều để đánh giá thử nghiệm độc tính của môi trường nước. Bên cạnh đó, nó có cấu tạo khá đơn giản, thời gian phát triển tương đối nhanh chỉ từ 7 – 8 ngày, sau khoảng 2 tuần thì nó có thể sinh sản với một số lượng lớn khoảng 10 – 30 con trong một lần sinh sản nên có thể đáp ứng được các yêu cầu về số lượng sinh vật để bố trí thí nghiệm. Các ứng dụng khác D.magna được sử dụng để lau sạch các loài tảo đơn bào trong các bể cá lớn, nó cũng có khả năng ăn vi khuẩn và nấm men nên làm cho nước của bể được trong hơn và sạch hơn. Nó cũng có khả năng lọc một số chất thải hữu cơ, chính vì vậy hiện nay nó cũng đang được nghiên cứu để sử dụng trong các ao hồ sinh học của các hệ thống xử lý nước thải của các nhà máy nhằm tăng khả năng xử lý nước thải và giảm bớt chi phí cho nhà máy. Chương 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 3.1. Thiết bị và dụng cụ 3.1.1. Thiết bị Thiết bị do pH, nồi hấp, tử sấy, cân phân tích Máy khuấy từ, máy cất nước, máy sục khí, kính hiển vi, kính soi nổi Đèn ống philip TLD-80 nối với đồng hồ hẹn giờ… 3.1.2. Dụng cụ Cốc thủy tinh, ống đong, bình định mức Erlen, beaker thủy tinh 2L, 4L, chai sạch 250ml, 500ml Đĩa thủy tinh đường kính 150mm Lưới lọc có kích thước lỗ lọc là 1300µm, 850µm, 375µm Lọ thủy tinh 100ml dùng để bảo quản dung dịch mẹ Micropipette và pipette Pasteur… 3.2. Vật liệu Daphnia magna được nuôi tại phòng Công nghệ biến đổi sinh học, Viện sinh học Nhiệt đới trong môi trường COMBO. Chất gây rối loạn nội tiết (Endocrine Disruptors) : 17α-Ethynylestradiol ;17β-Estradiol. 3.3. Phương pháp nghiên cứu 3.3.1. Kỹ thuật nuôi cấy Daphnia magna trên môi trường COMBO 3.3.1.1. Môi trường nuôi cấy Môi trường nuôi cấy là môi trường COMBO [xem phụ lục 2] Dung dịch mẹ được bảo quản ở nhiệt độ 40C tối đa là 3 tháng phải thay mới. Chú ý dung dịch số 5 (Fe), 6 (EDTA) và 10 (Vitamin) nên thay mới mỗi tháng. Dung dịch mẹ được chứa trong lọ nâu 100ml đã được rửa sạch và vô trùng trước khi sử dụng. Số lượng các chất được hướng dẫn chính xác trong bảng thành phần môi trường với nước cất thành 4L môi trường nuôi cấy. Chú ý trộn dung dịch số 5 (Fe) với dung dịch số 6 (EDTA) trước khi cho vào nước cất, vì đây là một phức của Fe Môi trường được sục khí trong 4 giờ để bão hòa O2 Bảo quản môi trường M4 ở nhiệt độ 200C không được hơn 1 tuần để tránh sự phát triển của vi sinh vật. Các thông số lý hóa của môi trường M4 pH: 8.2 ± 0.2 O2: 7 – 8 mg/l Độ dẫn điện: 610 µS/cm Độ kiềm: 0.9 mmol/l Tổng cứng: 2.5 mmol/l 3.3.1.2. Nuôi cấy 3.3.1.2.1. Điều kiện môi trường bên ngoài Nhiệt độ phòng thí nghiệm : 21 ± 10C Ánh sáng : Ánh sáng trắng mát dịu Độ chiếu sáng khoảng 500 ÷ 800 Lux Không được vượt quá 1000 lux để tránh sự phát triển của tảo Chu kỳ chiếu sáng: 16 giờ sáng/ 8 giờ tối 3.3.1.2.2. Quần thể sinh vật Loài Daphnia chủ yếu sinh sản theo kiểu trinh sản (con mẹ chỉ đẻ con cái) hơn là sinh sản hữu tính, điều này đảm bảo cho việc đồng nhất giới tính, thuận lợi cho việc thí nghiệm độc học. Sự xuất hiện của trứng đen trong túi ấp trứng (những trứng này nở ra con đực), là có sự thay đổi bất thường trong điều kiện sống. Và việc xuất hiện con đực sẽ hình thành kiểu sinh sản hữu tính, làm cho thí nghiệm độc học không còn chính xác. Do vậy, nếu có sự xuất hiện con đực nên loại bỏ beaker nuôi cấy này. Daphnia magna con trưởng thành sau 7 – 8 ngày. Sau khoảng 2 tuần thì Daphnia magna con có thể đẻ trứng, trứng nở được khoảng 10 – 30 con sau 2 – 3 ngày (thậm chí nở được 50 – 60 con), và con cái có thể sinh sản trong 2 tháng. 3.3.1.2.3. Dinh dưỡng Tảo đơn bào (Pseudokirchneriella subcapitata, Selenastrum capricornutum, Chlorella vulgaris). Thời gian bảo quản tảo tối đa là 1.5 – 2 tháng. Tảo được nuôi cấy trong môi trường EPA (EPA, 1978) trong beaker 2 lít, sau một tuần ly tâm ở tốc độ 4000 vòng/phút, trong 20 phút, thu sinh khối thêm vào 50ml môi trường M4, bảo quản trong lọ vô trùng ở 40C không hơn 4 tuần. Tảo này dùng cho Daphnia magna ăn theo định kỳ 2 lần một tuần với khoảng 2ml/4l môi trường nuôi cấy. Số lượng tế bào tảo được tính dựa trên thành phần Carbon. Đối với Daphnia magna, thành phần carbon khoảng 48%, số lượng tảo cho mỗi Daphnia magna ăn là 2.28 x 107 tế bào/ Daphnia magna/ ngày (tương đương 0.2 mgC/ Daphnia/ ngày). Sinh khối tảo thường lắng xuống đáy của beaker nuôi cấy, cần phải khuấy lên lớp tảo lắng này mỗi ngày bằng một pipette gắn với chóp nhựa, để tránh va chạm vào Daphnia magna làm ảnh hưởng đến chúng. Đặt beaker nuôi cấy lên một nền đen, Daphnia sẽ di chuyển lên trên nên chúng ta sẽ dễ dàng làm sạch đáy beaker. 3.3.1.2.4. Thay môi trường nuôi cấy Bắt đầu nuôi cấy với khoảng 150 con Daphnia con cùng lứa (ít hơn 24 giờ tuổi) trong 1.5 lít môi trường M4 Beaker được đậy bằng một dĩa thủy tinh, ghi ngày theo ngày tháng sinh của Daphnia con Ngày Daphnia sinh sản lần đầu được ghi lại. Mỗi khi Daphnia bắt đầu sinh sản (thông thường sau 1 tuần). Chúng tôi lọc 2 – 3 lần/tuần với lưới lọc có kích cỡ lỗ 850µm để tránh có nhiều lứa trong một beaker. Hơn nữa trong suốt thời gian này Daphnia lớn lên, nên kích thước cơ thể tăng lên, do đó cần thay lưới lọc có kích thước lỗ phù hợp (1200, 1400, 1600 µm). Trong thời gian thí nghiệm việc thay mới môi trường bắt đầu mỗi tuần. 3.3.1.2.5. Duy trì nuôi cấy Duy trì thường xuyên 2 beaker là đủ Daphnia được lọc 2 lần/tuần bằng lưới lọc 850µm và 3750µm. Daphnia trưởng thành thu được ở lưới lọc phía trên và Daphnia con thu được ở lưới lọc phía dưới. Lưới lọc được làm ẩm lưới lọc trước khi lọc Daphnia Môi trường M4 được thay mới hàng tuần để tránh nhiễm bẩn cho Daphnia. Beaker được rửa sạch và tráng cồn trước khi sử dụng và nên vô trùng beaker bằng nồi hấp vô trùng 1 lần/1 tuần. Những con Daphnia trên lưới lọc được rửa sạch bằng môi trường M4, sau đó cho chúng vào beaker đựng môi trường mới. Lưu ý: Daphnia phải được rửa một cách nhẹ nhàng để tránh tổn thương chúng. Quá trình lọc phải được thực hiện một cách cẩn thận, nhẹ nhàng, nhanh chóng. Phải dành riêng thiết bị dụng cụ cho việc nuôi cấy Daphnia Daphnia con được sử dụng để làm thí nghiệm . . . . . . . . . . . . * * * * * * * Hình 3.1 – Lọc Daphnia 3.3.1.2.6. Duy trì sinh vật trong thời gian thí nghiệm Số lượng beaker nuôi sinh vật có thể tăng. Thí nghiệm được thực hiện trên sinh vật ít hơn 24 giờ tuổi. Do vậy, phải lọc sinh vật trước khi thí nghiệm 24 giờ. Sinh vật thí nghiệm được đặt vào đĩa petri vô trùng chứa môi trường M4 trước khi chuyển vào bình làm thí nghiệm. Daphnia phải được thay mới sau 4 tuần nuôi cấy. 3.3.1.2.7. Điều kiện bất lợi Trong trường hợp có sự bất lợi của môi trường nuôi cấy đối với Daphnia magna như tỷ lệ tử vong cao, không có hoặc khả năng sinh sản của Daphnia magna kém cần chú ý những điểm sau: Chu kỳ chiếu sáng (xem xét tình trạng làm việc của đồng hồ hẹn giờ) Ánh sáng (đèn chiếu sáng bị cũ hay bị hư hỏng) Nồng độ của dung dịch mẹ (đo lại pH) Chất lượng tảo (tảo bị kém chất lượng khi có màu khác thường). Cần chuẩn bị tảo với số lượng vừa đủ và thường xuyên. Mật độ dày đặc của Daphnia magna (không được hơn 150 sinh vật trưởng thành/1 lít môi trường). Môi trường nuôi. Dụng cụ cần được rửa sạch và khử trùng trước khi dùng để ngăn chặn sự phát triển của vi khuẩn. 3.3.2. Kỹ thuật nuôi cấy tảo 3.3.2.1. Môi trường nuôi cấy Môi trường nuôi cấy tảo là môi trường EPA (EPA, 1978) THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG EPA Mã số dd mẹ Hóa chất Số lượng (mg) Thể tích (ml) Thể tích (ml) của dd mẹ/1L Nồng độ (mg/l) 1 NaNO3 12.75 500 H2O 1 25.5 2 MgCl2.6H2O CaCl2.2H2O H3BO3 MnCl2.4H2O ZnCl2 CoCl2.6H2O CuCl2.2H2O Na2MoO4.2H2O 5000 2210 92.76 207.81 Trong dd. a Trong dd. b Trong dd. c Trong dd. d 496 H2O + 1ml dd. a 1ml dd. b 1ml dd. c 1ml dd. d 1 10 4.42 0.185 0.415 0.003 0.001 0.012 0.007 3 FeCl3.6H2O Na2EDTA.2H2O 80 150 500 H2O 1 0.16 0.3 4 MgSO4.7H2O 7350 500 H2O 1 14.7 5 K2HPO4 522 500 H2O 1 1.04 6 NaHCO3 7500 500 H2O 1 15 DUNG DỊCH MẸ Mã số dd Hóa chất Số lượng (mg) Thể tích (ml) a ZnCl2 164 100 b CoCl2.6H2O 71.4 100 c’ CuCl2.6H2O 60 1000 c Dùng dd c’ 1ml dd. c’ trong 10ml d Na2MoO4.2H2O 36.6 100 3.3.2.2. Chuẩn bị môi trường nuôi cấy 3.3.2.2.1. Nuôi tảo với mục đích làm thức ăn cho sinh vật thử nghiệm a) Cách pha dung dịch mẹ và bảo quản Dung dịch stock được pha và bảo quản trong lọ thủy tinh 100ml. Các lọ này phải được rửa sạch và khử trùng trước mỗi lần sử dụng. Dán nhãn tên dung dịch và phương thức pha vào từng lọ. Bảo quản dung dịch mẹ trong tủ lạnh ở 40C. Các dung dịch này kể cả dung dịch phụ phải được bỏ đi nếu quá 6 tháng kể từ lúc pha. b) Môi trường EPA Chuẩn bị 1 beaker 3L chứa 2500ml nước cất. Lần lượt cho dd mẹ từ dd có mã số từ 1 đến 6 vào beaker trên và cho thêm nước cất để vừa đủ 3000ml. Cho 0.2ml tảo giống vào trong bình môi trường đã được pha sẵn. Ghi ngày bắt đầu nuôi. Khuấy trộn bình bằng con cá từ với tốc độ khuấy 100rpm trên máy khuấy từ. 3.3.2.2.2. Nuôi cấy tảo mới mục đích giữ giống Để giữ giống tảo, tảo phải được nuôi trên môi trường thạch a) Chuẩn bị môi trường thạch EPA Chuẩn bị lọ thủy tinh đã khử trùng thể tích 1000ml chứa 800ml nước cất Lần lượt cho dung dịch mẹ có mã số từ 1 đến 6 vào beaker 1L có thể vô trùng được. Chuẩn độ pH: 7.5 – 8 Thêm 1% thạch tinh khiết. Hấp vô trùng ở 1210C trong 30 phút. Rót môi trường còn nóng (khoảng 450C) vào đĩa petri đã được vô trùng với độ dày khoảng 0.2 – 0.3 cm. Để các đĩa petri trên mặt phẳng bằng cho đến khi nguội hoàn toàn. Gói kín các đĩa petri bằng giấy và bảo quản. b) Nuôi cấy tảo Dùng que cấy khử trùng lấy tảo và cấy vào trong đĩa petri có môi trường thạch nuôi tảo đã được chuẩn bị sẵn. Cách cấy zic zac được mô tả như trong hình vẽ. Dán kín petri bằng parafin. Ghi ngày bắt đầu cấy. Lưu trữ tảo trong tủ lạnh ở 40C và dung để nhân giống sau này. 3.3.2.3. Nuôi cấy 3.3.2.3.1. Điều kiện nuôi cấy Nhiệt độ nuôi cấy: 22 ± 20C Ánh sáng: ánh sáng trắng mát dịu. Cường độ chiếu sáng tối ưu là 4000 lux. Sục khí môi trường nuôi cấy liên tục. 3.3.2.3.2. Thay mới môi trường nuôi cấy Rót vào bình tam giác đã vô trùng 150ml môi trường nuôi cấy. Chuyển 1 – 2µl tế bào tảo trên mặt đĩa petri bằng một ống tiêm vào một ống tiêm vào bình tam giác trên và lắc đều. Đặt hỗn hợp dung dịch tảo vào tủ ủ. Khuấy hỗn hợp dung dịch tảo mỗi trước mỗi ngày 2 lần. Sau 7 ngày, tảo sẽ phát triển ở pha log. 3.3.2.3.3. Duy trì nuôi cấy Mật độ tảo được chọn để bắt đầu quá trình nuôi cấy trong quy trình này là 10000 tế bào/ml. Mỗi đợt nuôi cấy khoảng 7 ngày. Trong đó 3 ngày đầu là pha phương trình tuyến tính và pha log kéo dài tối đa là 3 ngày sau. Mật độ tảo có thể tăng nhanh và như vậy thời gian đạt đến pha log sẽ ngắn hơn. Để nuôi cấy liên tiếp chúng ta cần xác định thể tích giống như sau: Xác định mật độ tế bào tảo trong quá trình nuôi cấy (x – 1) Thể tích giống vix được tính như sau: vix = Dix : mật độ tảo giống đem nuôi cấy x (ở đây là 10000 tb/ml) V : thể tích môi trường nuôi cấy (ở đây là 150ml) Dx-1 : mật độ tế bào nuôi cấy (x – 1) Sau khi cho giống vào môi trường mới rồi nuôi chúng trong điều kiện nuôi cấy tảo. Quá trình nuôi được kết thúc sau 7 ngày. Bình tam giác được rửa bằng xà phòng, tráng lại bằng nước máy, sau đó bằng nước cất, rồi đem chúng đi vô trùng. 3.3.2.3.4. Duy trì quá trình nuôi cấy để giữ giống Quá trình nuôi cấy để giữ giống được thực hiện trên môi trường thạch. Chúng tôi thường xuyên chuyển tảo lên môi trường thạch để chọn ra những đĩa giống tảo thuần và sạch. Nếu có đĩa giống nào bị nhiễm khuẩn chúng tôi loại bỏ ngay. Tảo được nuôi trên đĩa petri. Tảo từ đĩa petri được cấy nhanh vào mỗi đĩa petri khoảng 10µl tảo ở pha log. Cấy tảo theo đường zic zac. Bảo quản đĩa ở 40C. 3.3.2.3.5. Những sự cố trong quá trình nuôi cấy Nhiệt độ nuôi cấy: nhiệt độ tằn giảm ngoài ngưỡng sẽ làm ảnh hưởng đến sự phát triển của tảo. Ánh sáng: nếu đèn neon quá cũ cũng có thể làm thay đổi cường độ ánh sáng. Nồng độ các chất trong môi trường nuôi cấy (kiểm tra bằng cách đo pH) Chất lượng tảo giống được kiểm tra bằng cách soi kính hiển vi, tránh sự xuất hiện của các loại vi khuẩn. Các dụng cụ nuôi cấy cần được khử trùng và rửa sạch sẽ ngăn chặn sự phát triển của vi khuẩn. 3.3.3. Bố trí thí nghiệm Pha môi trường COMBO Pha loãng nồng độ của 17α-Ethynylestradiol và 17β-Estradiol trong môi trường Combo với các nồng độ sau : Bảng 3.1: Nồng độ bố trí thí nghiệm của 17α-Ethynylestradiol Ký hiệu α1 α2 α3 α4 α5 Nồng độ 1µg/l 10µg/l 50µg/l 100µg/l 200µg/l Bảng 3.2: Nồng độ bố trí thí nghiệm của 17β-Estradiol Ký hiệu β1 β2 β3 β4 β5 Nồng độ 1µg/l 10µg/l 50µg/l 100µg/l 200µg/l Bố trí mỗi nồng độ lặp lại 3 lần, với thể tích là 300ml Mẫu đối chứng cũng lặp lại 3 lần chỉ với môi trường COMBO Mỗi nồng độ bố trí 20 con Daphnia magna 1 ngày tuổi Thí nghiệm được bố trí ở nhiệt độ phòng là 220C. Chương 4: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN Những Daphnia magna con 24 giờ tuổi được nuôi đồng nhất từ D. magna mẹ, được để nghỉ ít nhất 1 giờ trước khi bắt đầu thí nghiệm. Những D.magna này được chia vào cốc thủy tinh chứa 300ml môi trường COMBO với các nồng độ 17α-Ethynylestradiol và 17β-Estradiol với các nồng độ như sau: Bảng 4.1: Nồng độ bố trí thí nghiệm của 17α-Ethynylestradiol Ký hiệu α1 α2 α3 α4 α5 Nồng độ 1µg/l 10µg/l 50µg/l 100µg/l 200µg/l Bảng 4.2: Nồng độ bố trí thí nghiệm của 17β-Estradiol Ký hiệu β1 β2 β3 β4 β5 Nồng độ 1µg/l 10µg/l 50µg/l 100µg/l 200µg/l D. magna con được cho ăn hàng ngày, cho ăn gấp đôi vào những ngày thứ sáu. Không thay môi trường trong suốt quá trình làm thí nghiệm, chỉ thêm môi trường khi thấy môi trường vơi đi, duy trì chính xác điều kiện nuôi D. magna. Theo sự hướng dẫn của ISO và OECD cho thí nghiệm sự sinh sản của D. magna, yêu cầu điểm dừng chính là tổng số D. magna con được tạo ra trên D. magna mẹ (24h tuổi bắt đầu thí nghiệm) đến sau 21 ngày tiếp xúc với chất thử nghiệm (ISO 2000, OECD 1998). Ghi lại những điểm tiêu biểu về dòng đời (chu kỳ sống) của sinh vật như sự sống sót, tuổi trưởng thành (lần đầu tiên có trứng), tuổi bắt đầu sinh sản và những bất bình thường về hành vi trong quá trình phát triển (theo hướng dẫn của ISO, OECD). Vì khó để xác định mối liên hệ đầy đủ giữa nồng độ và sự đáp ứng cho tỷ lệ sinh sản những D. magna con được tạo ra từ một D. magna mẹ mà sống đến lúc kết thúc thí nghiệm. Vì có những nồng độ gây chết cao cho D. magna trưởng thành trong bố trí thí nghiệm, chúng tôi quyết định gom những D. magna con của tất cả những con D. magna mẹ mà đã đạt đến trưởng thành (tạo ra được ít nhất 1 D. magna con). Dưới đây là những kết quả ghi nhận được trong bố trí thí nghiệm. 4.1. Ảnh hưởng của chất gây rối loạn nội tiết lên Daphnia magna 4.1.1. Tỷ lệ % D. magna sống sót sau 21 ngày bố trí thí nghiệm Bảng 4.3: Tỷ lệ % D. magna sống sót sau 21 ngày bố trí 17α-Ethynylestradiol 17β-Estradiol Nồng độ COMBO α1 α2 α3 α4 α5 COMBO β1 β2 β3 β4 β5 % D. magna sống sót 63,3 58,3 38,3 16,6 18,3 0 90 83,3 80 10 6,6 10 Vì sau 24 h bố trí thí nghiệm ở nồng độ thứ 5 (200µg/l) của 17α-Ethynylestradiol gây chết toàn bộ sinh vật thí nghiệm nên trong các phần sau chúng tôi không đề cập đến nồng độ này. Sau 21 ngày bố trí chúng tôi thu được kết quả ở bảng 4.3, nhận thấy tỷ lệ D. magna mẹ sống sót trong môi trường COMBO là cao nhất 63,3% đối với đợt bố trí thí nghiệm 17α-Ethynylestradiol và 90% đối với đợt bố trí thí nghiệm 17β-Estradiol. Như vậy, 2 chất dùng làm thí nghiệm trên có ảnh hưởng đến sự tồn tại của D. magna. Đối với đợt bố trí thí nghiệm 17α-Ethynylestradiol tôi nhận thấy ở nồng độ thứ 3 (50µg/l) và thứ 4 (100 µg/l) có tỷ lệ D. magna sống sót thấp nhất là 16,6% và 18,3%. Ở nồng độ thứ 1 (1µg/l) có tỷ lệ D. magna sống sót cao nhất là 58,3%. Như vậy chứng tỏ ở nồng độ 17α-Ethynylestradiol càng thấp lượng D. magna tồn tại tương đương với mẫu đối chứng. Đối với đợt bố trí thí nghiệm 17β-Estradiol tôi nhận thấy ở nồng độ thứ 3 (50µg/l), thứ 4 (100 µg/l) và thứ 5 (200µg/l) có tỷ lệ D. magna sống sót thấp nhất là 10%, 6,6% và 10%. Ở nồng độ 1 (1µg/l) và 2 (10µg/l) có tỷ lệ D. magna sống sót cao nhất là 83,3% và 80%. Như vậy, chứng tỏ ở nồng độ 17β-Estradiol càng thấp lượng D. magna tồn tại tương đương với mẫu đối chứng. 4.1.2. Số lượng D. magna được sinh ra trên 1 D. magna mẹ sau 21 ngày bố trí thí nghiệm Bảng 4.4: Số lượng D. magna con được sinh ra trên 1 D. magna mẹ trong 21 ngày bố trí 17α-Ethynylestradiol 17β-Estradiol Nồng độ COMBO α1 α2 α3 α4 COMBO β1 β2 β3 β4 β5 Số lượng D.magna con 25,4 31 49,6 17,6 54,4 32,7 28,3 27,9 64,7 60,8 31,3 Kết quả thử nghiệm ở bảng 4.4 cho thấy: Số lượng trung bình của D. magna con trên D. magna mẹ trong 21 ngày bố trí thí nghiệm với 17α-Ethynylestradiol có sự khác biệt rất lớn từ 54,4 – 17,6 D. magna con trên D. magna mẹ so với môi trường COMBO là 25,4 D. magna con trên D. magna mẹ. Với nồng độ thứ 1 (1µg/l), thứ 2 (10µg/l), thứ 4 (100µg/l) có sự kích thích sinh sản, số lượng D. magna con cao hơn mẫu đối chứng và ở nồng độ thứ 3 (50µg/l) có sự ức chế sinh sản, số lượng D. magna con thấp hơn mẫu đối chứng. Số lượng trung bình của D. magna con trên D. magna mẹ trong 21 ngày bố trí thí nghiệm với 17β-Estradiol có sự khác biệt rất lớn từ 27,9 – 64,7 D. magna con trên D. magna mẹ so với môi trường COMBO là 32,7 D. magna con trên D. magna mẹ. Với nồng độ từ 50µg/l – 100 µg/l có sự kích thích sinh sản cho số lượng D. magna con cao 64,7 – 60,8 và ở các nồng độ còn lại có sự ức chế sinh sản D. magna con được sinh ra thấp hơn so với mẫu đối chứng. Tuy nhiên trong môi trường tự nhiên, thông thường D. magna con trưởng thành sau 7 – 8 ngày. Sau khoảng 2 tuần thì D. magna con có thể sinh sản, trong mỗi lứa sinh sản trung bình mỗi con đẻ khoảng 10 con con, sự phát triển của trứng có thể quan sát trực tiếp qua cơ thể mẹ. Con cái tiếp tục sinh sản thường trong khoảng 3 ngày và chậm nhất là sau 4 ngày, thông thường con cái đẻ ít hơn 100 con trong suốt cuộc đời của nó. Vì thời gian làm đề tài có hạn nên số lần lặp lại thí nghiệm không đủ để làm thống kê cho nên không cho ra được kết quả khác biệt cụ thể với thí nghiệm này. Tuy nhiên chúng tôi nhận thấy dù số lượng D. magna mẹ giảm trong thời gian thí nghiệm, nhưng sau khi thích ứng chúng cho tỷ lệ sinh sản cao cụ thể là ở nồng độ 100µg/l của 17α-Ethynylestradiol là 54,4 D. magna con trên D. magna mẹ và ở nồng độ 50µg/l của 17β-Estradiol là 64,7 D. magna con trên D. magna mẹ. 4.1.3. Sự phát triển bất thường của D. magna Trong suốt thời gian bố trí thí nghiệm chúng tôi nhận thấy có sự xuất hiện của trứng cyst, những trứng này xuất hiện khi gặp điều kiện không thuận lợi (thiếu thức ăn hay điều kiện khắc nghiệt). Sự tạo trứng cyst này trong môi trường đối chứng có thể do trong thời gian bố trí thí nghiệm vào mùa nắng nóng nên chúng tôi bố trí trong phòng thí nghiệm có máy điều hòa nhiệt độ, và trong mùa này thường xuyên cúp điện nên nhiệt độ phòng thí nghiệm có thay đổi. Bảng 4.5: Tổng số trứng cyst của D. magna mẹ tạo ra 17α-Ethynylestradiol 17β-Estradiol Nồng độ COMBO α1 α2 α3 α4 COMBO β1 β2 β3 β4 β5 Số trứng cyst 8 13 5 18 0 13 15 24 13 11 4 Sau khi thực hiện thí nghiệm chúng tôi nhận thấy: Đối với chất 17α-Ethynylestradiol ở nồng độ thứ 4 (100µg/l ) không có sự xuất hiện của trứng cyst, ở nồng độ thứ 3 (50µg/l ) sự xuất hiện trứng cyst là cao nhất 40,9% và ở nồng độ thứ 2 (10 µg/l) trứng cyst là thấp nhất 11,3%. Tương ứng với sự tạo trứng cyst chúng tôi cũng nhận thấy số lượng của D. magna con ở nồng độ thứ 3 (50µg/l ) thấp. Đối với chất 17β-Estradiol ở tất cả các nồng độ đều có xuất hiện trứng cyst, trứng cyst xuất hiện nhiều nhất ở nồng độ thứ 2 (10µg/l) chiếm 30% và ở nồng độ thứ 5 (200µg/l) trứng cyst là thấp nhất 5%. Tương ứng với sự tạo trứng cyst chúng tôi cũng nhận thấy số lượng của D. magna con ở nồng độ thứ 2 (10µg/l ) thấp. 4.1.4. Ảnh hưởng gây chết Với hai chất là 17α-Ethynylestradiol và 17β-Estradiol, chúng tôi nhận thấy với các nồng độ trên chúng bất động sau 48h, sau 6 ngày và sau 21 ngày là: 4.1.4.1. Sau 48 giờ Bảng 4.6: Tỷ lệ % D. magna bất động sau 48 giờ 17α-Ethynylestradiol 17β-Estradiol Nồng độ COMBO α1 α2 α3 α4 COMBO β1 β2 β3 β4 β5 % D. magna bất động 26,7 33,3 53,3 78,3 81,7 6,7 1,7 5 50 90 80 Sau khi bố trí thí nghiệm 48h chúng tôi ghi được kết quả thí nghiệm ở bảng 4.6 và nhận thấy: Đối với chất 17α-Ethynylestradiol sau 48h tỷ lệ D. magna bất động trong môi trường COMBO là thấp nhất 26,7% và tỷ lệ này tăng theo nồng độ của 17α-Ethynylestradiol, và ở nồng độ thứ 4 (100µg/l) thì tỷ lệ D. magna bất động là cao nhất 81,7%. Đối với chất 17β-Estradiol sau 48h tỷ lệ D. magna bất động trong môi trường COMBO là 6,7%, ở nồng độ thứ 1 (1µg/l) thì tỷ lệ D. magna bất động là thấp nhất 1,7% và tỷ lệ này cao nhất ở nồng độ thứ 4 (100µg/l) là 90%. 4.1.4.2. Sau 6 ngày Bảng 4.7: Tỷ lệ % D. magna bất động sau 6 ngày 17α-Ethynylestradiol 17β-Estradiol Nồng độ COMBO α1 α2 α3 α4 COMBO β1 β2 β3 β4 β5 % D. magna bất động 26,7 33,3 53,3 78,3 81,7 6,7 1,7 5 50 90 80 Dựa vào 2 bảng 4.6 và 4.7 trên ta thấy tỷ lệ % D. magna bất động sau 48h và 6 ngày của 2 chất 17α-Ethynylestradiol, 17β-Estradiol không có sự khác biệt. 4.1.4.3. Sau 21 ngày Bảng 4.8: Tỷ lệ % D. magna bất động sau 21 ngày 17α-Ethynylestradiol 17β-Estradiol Nồng độ COMBO α1 α2 α3 α4 COMBO β1 β2 β3 β4 β5 % D. magna bất động 36,7 41,7 61,7 83,4 81,7 16,7 16,7 26,6 85 92,5 85 Đối với chất 17α-Ethynylestradiol sau 21 ngày tỷ lệ D. magna bất động trong môi trường COMBO là thấp nhất 36,7% và tỷ lệ này tăng theo nồng độ, ở nồng độ thứ 3 (50µg/l) thì tỷ lệ D. magna bất động là cao nhất 83,4%. Đối với chất 17β-Estradiol sau 21 ngày tỷ lệ D. magna bất động trong môi trường COMBO và ở nồng độ thứ 1 (1µg/l) là thấp nhất 16,7%, tỷ lệ này cao nhất ở nồng độ thứ 4 (100µg/l) là 92,5%. 4.1.5. Ảnh hưởng của chất gây rối loạn nội tiết lên thời gian phát triển của D. magna Trong môi trường tự nhiên D. magna bắt đầu sinh sản sau 2 tuần, trong thí nghiệm này D. magna được nuôi trong môi trường COMBO nên thời gian sinh sản sẽ rút ngắn xuống còn khoảng 8 ngày và tùy theo nồng độ của chất gây rối loạn nội tiết khác nhau thì thời gian sinh sản cũng khác nhau. 4.1.5.1. 17α-Ethynylestradiol Bảng 4.9: Thời gian D. magna bắt đầu sinh sản trong môi trường 17α-Ethynylestradiol COMBO α1 α2 α3 α4 Lần lặp lại 0.1 0.2 0.3 1.1 1.2 1.3 2.1 2.2 2.3 3.1 3.2 3.3 4.1 4.2 4.3 Ngày sinh sản 8 11 11 7 10 17 7 7 11 15 15 12 11 11 12 Dựa vào bảng 4.9 ta thấy trong môi trường COMBO D. magna bắt đầu sinh sản từ ngày thứ 8 – 11.Ở nồng độ thứ 2 (10µg/l) có sự kích thích sinh sản, D. magna sinh sản sau 7 ngày và ở nồng độ thứ 3 (50µg/l) có sự ức chế sinh sản, D. magna sinh sản từ ngày 12 đến ngày 15 vì vậy số lượng D. magna con được sinh ra ở nồng độ này thấp. 4.1.5.2. 17β-Estradiol Bảng 4.10: Thời gian D. magna bắt đầu sinh sản trong môi trường 17β-Estradiol COMBO β1 β2 β3 β4 β5 Lần lặp lại 0.1 0.2 0.3 1.1 1.2 1.3 2.1 2.2 2.3 3.2 3.3 4.1 4.2 5.1 5.2 Ngày sinh sản 8 8 8 8 8 8 8 8 8 11 9 15 11 11 11 Dựa vào bảng 4.10 ta thấy trong môi trường COMBO D. magna bắt đầu sinh sản từ ngày thứ 8 và ở nồng độ thứ 1 (1µg/l) thứ 2 (10µg/l) cũng không có sự ảnh hưởng đến thời gian sinh sản của D. magna (bắt đầu sinh sản từ ngày thứ 8). Sự ức chế sinh sản chỉ xảy ra ở nồng độ thứ 4 (100µg/l) và thứ 5 (200µg/l), D. magna bắt đầu sinh sản từ ngày 11 – 15. 4.1.6. Sự đáp ứng về dòng đời của D. magna với chất gây rối loạn nội tiết 4.1.6.1. Chất 17α-Ethynylestradiol Bảng 4.11: Thời gian D. magna tồn tại trong môi trường 17α-Ethynylestradiol COMBO α1 α2 α3 α4 Lần lặp lại 0.1 0.2 0.3 1.1 1.2 1.3 2.1 2.2 2.3 3.1 3.2 3.3 4.1 4.2 4.3 Ngày chết 43 61 49 47 54 39 46 48 18 34 40 46 46 41 40 Dựa vào bảng 4.11 ta thấy trong môi trường COMBO thời gian sống sót của D. magna là cao nhất 51 ngày (trung bình của 3 lần bố trí), thời gian sống sót D. magna tỷ lệ nghịch với nồng độ của 17α-Ethynylestradiol, nồng độ càng tăng thì thời gian sống sót càng giảm. Dòng đời trung bình của D. magna khoảng 2 tháng, với các nồng độ bố trí như trên chúng tôi nhận thấy không có sự khác biệt rõ ràng ở các nồng độ, tuy nhiên nồng độ càng cao thì số ngày tuổi của D. magna càng giảm. 4.1.6.2. Chất 17β-Estradiol Bảng 4.12: Thời gian D. magna tồn tại trong môi trường 17β-Estradiol COMBO β1 β2 β3 β4 β5 Lần lặp lại 0.1 0.2 0.3 1.1 1.2 1.3 2.1 2.2 2.3 3.2 3.3 4.1 4.2 5.1 5.2 Ngày chết 65 68 67 68 65 64 59 61 59 45 47 29 43 43 44 Dựa vào bảng 4.12 ta thấy trong môi trường COMBO thời gian sống sót của D. magna là cao nhất 66,7 ngày (trung bình của 3 lần bố trí) và thời gian này giảm theo nồng độ tăng dần của 17β-Estradiol. Dòng đời trung bình của D. magna khoảng 2 tháng với kết quả trên chúng tôi nhận thấy ở nồng độ thứ 4 (100µg/l) của 17β-Estradiol làm cho dòng đời của D. magna giảm còn 36 ngày. 4.2. Ảnh hưởng của chất gây rối loạn nội tiết lên Daphnia magna đời F1 Những D. magna con 24h tuổi của bố trí thí nghiệm trên được chúng tôi chọn để bố trí thí nghiệm tiếp theo với các chất gây rối loạn nội tiết và các nồng độ như trên bảng 4.1 và 4.2 4.2.1. Tỷ lệ % D. magna sống sót sau 21 ngày bố trí thí nghiệm Bảng 4.13: Bảng tỷ lệ % D. magna sống sót sau 21 ngày bố trí 17α-Ethynylestradiol 17β-Estradiol COMBO α1 α2 α3 α4 COMBO β1 β2 β3 β4 β5 % D. magna sống sót 83,6 73,3 87,5 20 30 85 85 80 20 15 7,5 Sau 21 ngày bố trí chúng tôi nhận thấy tỷ lệ D. magna mẹ sống sót trong môi trường COMBO là cao nhất 83,6% đối với đợt bố trí thí nghiệm 17α-Ethynylestradiol và 85% đối với đợt bố trí thí nghiệm 17β-Estradiol. Đối với đợt bố trí thí nghiệm 17α-Ethynylestradiol tôi nhận thấy ở nồng độ thứ 3 (50µg/l) và thứ 4 (100 µg/l) có tỷ lệ D. magna sống sót thấp nhất là 20% và 30%.Ở nồng độ thứ 2 (10µg/l) có tỷ lệ D. magna sống sót cao nhất là 87,5%. Như vậy chứng tỏ ở nồng độ 17α-Ethynylestradiol càng thấp lượng D. magna tồn tại tương đương với mẫu đối chứng. Đối với đợt bố trí thí nghiệm 17β-Estradiol tôi nhận thấy ở nồng độ thứ 5 (200µg/l) có tỷ lệ D. magna sống sót thấp nhất là 7,5%. Ở nồng độ 1 (1µg/l) và 2 (10µg/l) có tỷ lệ D. magna sống sót cao nhất là 85% và 80%. Như vậy chứng tỏ ở nồng độ 17β-Estradiol thấp thì lượng D. magna tồn tại tương đương với mẫu đối chứng. 4.2.2. Số lượng D. magna được sinh ra trên 1 D. magna mẹ sau 21 ngày bố trí thí nghiệm Bảng 4.14: Số lượng D. magna con được sinh ra trên 1 D. magna mẹ trong 21 ngày bố trí 17α-Ethynylestradiol 17β-Estradiol COMBO α1 α2 α3 α4 COMBO β1 β2 β3 β4 β5 Số lượng D.magna con 44 43,9 33,9 23,2 36,3 38 37 37,8 53,5 27,9 50,3 Kết quả thử nghiệm ở bảng 4.14 cho thấy: Số lượng trung bình của D. magna con trên D. magna mẹ trong 21 ngày bố trí thí nghiệm với 17α-Ethynylestradiol ở nồng độ thứ 1 (1µg/l) tương đương với môi trường COMBO. Sự ức chế sinh sản xảy ra từ nồng độ thứ 2 (10µg/l) đến nồng độ thứ 4 (100µg/l). Số lượng trung bình của D. magna con trên D. magna mẹ trong 21 ngày bố trí thí nghiệm với 17β-Estradiol ở các nồng độ thứ 1 (1µg/l) và thứ 2 (10µg/l) tương đương với môi trường COMBO.Ở nồng độ thứ 4 (100µg/l) số lượng D. magna con trên D. magna mẹ là thấp nhất 27,9, ở hai nồng độ thứ 3 (50µg/l) và thứ 5 (200µg/l) thì số lượng D. magna con trên D. magna mẹ là cao nhất. Với kết quả trên chúng tôi nhận thấy 17β-Estradiol có thể có khả năng kích thích sinh sản ở nồng độ thứ 3 (50µg/l). Tuy nhiên do thời gian thực hiện đề tài có hạn nên chúng tôi chưa kịp kiểm chứng lại. 4.2.3. Sự phát triển bất thường của D. magna Bảng 4.15: Tổng số trứng cyst của D. magna mẹ tạo ra 17α-Ethynylestradiol 17β-Estradiol COMBO α1 α2 α3 α4 COMBO β1 β2 β3 β4 β5 Số trứng cyst 13 7 5 23 2 11 3 9 0 17 5 Sau khi thực hiện thí nghiệm chúng tôi nhận thấy: Đối với chất 17α-Ethynylestradiol ở tất cả các nồng độ đều có xuất hiện trứng cyst, riêng ở nồng độ thứ 3 (50µg/l ) sự xuất hiện trứng cyst là cao nhất 46% và ở nồng độ 4 (100 µg/l) sự xuất hiện trứng cyst là thấp nhất 4%.Tương ứng với sự tạo trứng cyst chúng tôi cũng nhận thấy số lượng của D. magna con ở nồng độ thứ 3 (50µg/l ) thấp. Đối với chất 17β-Estradiol ở nồng độ thứ 3 (50µg/l ) không có sự xuất hiện của trứng cyst, trứng cyst xuất hiện nhiều nhất ở nồng độ thứ 4 (100µg/l) chiếm 37,7% và ở nồng độ thứ 1 (1µg/l) trứng cyst là thấp nhất 6,6%. Tương ứng với sự tạo trứng cyst chúng tôi cũng nhận thấy số lượng của D. magna con ở nồng độ thứ 4 (100µg/l ) thấp. Với kết quả trên chúng tôi nhận thấy ở môi trường dùng làm đối chứng COMBO cho trứng cyst cao nhất có thể là do điều kiện nhiệt độ bị thay đổi, tuy nhiên khi ở nồng độ 1µg/l của 17α-Ethynylestradiol và của 17β-Estradiol đã hạn chế được sự tạo thành trứng cyst khi điều kiện nhiệt độ bất lợi. 4.2.4. Ảnh hưởng gây chết Với hai chất là 17α-Ethynylestradiol và 17β-Estradiol, chúng tôi nhận thấy với các nồng độ trên chúng bất động sau 48h, sau 6 ngày và sau 21 ngày là: 4.2.4.1. Sau 48 giờ Bảng 4.16: Bảng tỷ lệ % D. magna bất động sau 48h 17α-Ethynylestradiol 17β-Estradiol Nồng độ COMBO α1 α2 α3 α4 COMBO β1 β2 β3 β4 β5 % D. magna bất động 6,6 11,6 10 80 58,3 1,6 8,3 5 20 82,5 80 Đối với chất 17α-Ethynylestradiol sau 48h tỷ lệ D. magna bất động trong môi trường COMBO là thấp nhất 6,6% và tỷ lệ này tăng dần theo nồng độ, ở nồng độ thứ 3 (50µg/l) thì tỷ lệ D. magna bất động là cao nhất 80%. Đối với chất 17β-Estradiol sau 48h tỷ lệ D. magna bất động trong môi trường COMBO là thấp nhất 1,6%, và tỷ lệ này tăng dần theo nồng độ, ở hai nồng độ thứ 4 (100µg/l) và thứ 5 (200µg/l) ta thấy tỷ lệ D. magna bất động là cao nhất 82,5% và 80%. 4.2.4.2. Sau 6 ngày Bảng 4.17: Bảng tỷ lệ % D. magna bất động sau 6 ngày 17α-Ethynylestradiol 17β-Estradiol Nồng độ COMBO α1 α2 α3 α4 COMBO β1 β2 β3 β4 β5 % D. magna bất động 6,6 16 10 80 66,6 6,6 11,6 8,3 45 82,5 85 Đối với chất 17α-Ethynylestradiol sau 6 ngày tỷ lệ D. magna bất động trong môi trường COMBO là thấp nhất 6,6% và tỷ lệ này tăng dần theo nồng độ, ở nồng độ thứ 3 (50µg/l) thì tỷ lệ D. magna bất động là cao nhất 80%. Đối với chất 17β-Estradiol sau 6 ngày tỷ lệ D. magna bất động trong môi trường COMBO là thấp nhất 6,6%, và tỷ lệ này tăng dần theo nồng độ, ở hai nồng độ thứ 4 (100µg/l) và thứ 5 (200µg/l) ta thấy tỷ lệ D. magna bất động là cao nhất 82,5% và 85% 4.2.4.3. Sau 21 ngày Bảng 4.18: Bảng tỷ lệ % D. magna bất động sau 21 ngày 17α-Ethynylestradiol 17β-Estradiol Nồng độ COMBO α1 α2 α3 α4 COMBO β1 β2 β3 β4 β5 % D. magna bất động 16,6 28,3 12,5 80 70 15 15 20 80 85 92,5 Đối với chất 17α-Ethynylestradiol sau 21 ngày tỷ lệ D. magna bất động trong môi trường COMBO là 16,6% và tỷ lệ này thấp nhất ở nồng độ thứ 2 (10µg/l), ở nồng độ thứ 3 (50µg/l) thì tỷ lệ D. magna bất động là cao nhất 80%. Đối với chất 17β-Estradiol sau 21 ngày tỷ lệ D. magna bất động trong môi trường COMBO và nồng độ thứ 1 (1µg/l) đều bằng nhau bằng15%, và tỷ lệ này tăng dần theo nồng độ, ở nồng độ thứ 5 (200µg/l) ta thấy tỷ lệ D. magna bất động là cao nhất 92,5% . 4.2.5. Ảnh hưởng của chất gây rối loạn nội tiết lên thời gian phát triển của D. magna 4.2.5.1. Chất 17α-Ethynylestradiol Bảng 4.19: Thời gian D. magna bắt đầu sinh sản trong môi trường 17α-Ethynylestradiol COMBO α1 α2 α3 α4 0.1 0.2 0.3 1.1 1.2 1.3 2.1 2.2 3.1 3.2 3.3 4.1 4.2 4.3 Ngày sinh sản 8 8 8 8 8 7 8 8 14 17 17 11 15 15 Dựa vào bảng 4.19 ta thấy trong môi trường COMBO và nồng độ thứ 1 (1µg/l), thứ 2 (10µg/l) D. magna bắt đầu sinh sản từ ngày thứ 8. Ở nồng độ thứ 3 (50µg/l) thứ 4 (100µg/l) có sự ức chế sinh sản, sự ức chế này cao nhất ở nồng độ thứ 3 (50µg/l) bắt đầu sinh sản từ ngày 14 đến ngày 17 vì vậy số lượng D. magna con được sinh ra ở nồng độ này thấp. 4.2.5.2. Chất 17β-Estradiol Bảng 4.20: Thời gian D. magna bắt đầu sinh sản trong môi trường 17β-Estradiol COMBO β1 β2 β3 β4 β5 0.1 0.2 0.3 1.1 1.2 1.3 2.1 2.2 2.3 3.2 3.3 4.1 4.2 5.1 5.2 Ngày sinh sản 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 8 12 11 12 10 Dựa vào bảng 4.20 ta thấy từ môi trường COMBO đến nồng độ thứ 3 (50µg/l) không có sự ức chế sinh sản D. magna bắt đầu sinh sản từ ngày thứ 7-8, ở hai nồng độ còn lại có sự ức chế sinh sản D. magna bắt đầu sinh sản từ ngày thứ 10-12. 4.2.6. Sự đáp ứng về dòng đời của D. magna với chất gây rối loạn nội tiết 4.2.6.1. Chất 17α-Ethynylestradiol Bảng 4.21: Thời gian D. magna tồn tại trong môi trường 17α-Ethynylestradiol COMBO α1 α2 α3 α4 0.1 0.2 0.3 1.1 1.2 1.3 2.1 2.2 3.1 3.2 3.3 4.1 4.2 4.3 Ngày chết 58 60 60 59 60 56 58 66 41 42 34 53 49 45 Dựa vào bảng 4.21 ta thấy từ môi trường COMBO đến nồng độ thứ 2 (10µg/l) thời gian sống sót của D. magna không có sự khác biệt đáng kể từ 56-66 ngày. Thời gian sống sót của D. magna giảm dần ở nồng độ thứ 3 (50µg/l) và thứ 4 (100µg/l) nên có sự ảnh hưởng đến số lượng D. magna con được sinh ra. 4.2.6.2. Chất 17β-Estradiol Bảng 4.22: Thời gian D. magna tồn tại trong môi trường 17β-Estradiol COMBO β1 β2 β3 β4 β5 0.1 0.2 0.3 1.1 1.2 1.3 2.1 2.2 2.3 3.2 3.3 4.1 4.2 5.1 5.2 Ngày chết 64 65 64 65 63 65 62 60 61 44 55 42 29 28 25 Dựa vào bảng 4.22 ta thấy từ môi trường COMBO đến nồng độ thứ 2 (10µg/l) thời gian sống sót của D. magna không có sự khác biệt đáng kể từ 60-65 ngày.Thời gian sống sót giảm dần từ nồng độ thứ 3 (50µg/l) đến thứ 5 (200µg/l) và đạt thấp nhất ở nồng độ thứ 5 (200µg/l), vì vậy số lượng D. magna con được sinh ra ở các nồng độ này thấp. 4.3. Khảo sát hàm lượng chất gây rối loạn nội tiết trên kênh rạch Thành Phố Hồ Chí Minh Tại phòng CNBĐSH chúng tôi đã lấy mẫu ở một số vị trí trên kênh rạch Tp. Hồ Chí Minh và phân tích hàm lượng chất gây rối loạn nội tiết. 4.3.1. Xác định vị trí lấy mẫu Mẫu được thu tại 7 vị trí trên các kênh rạch ở Tp Hồ Chí Minh, chúng tôi bố trí sơ đồ lấy mẫu sao cho trong 7 vị trí lấy mẫu phải có những vị trí nước bị ô nhiễm nặng như các vị trí tại cầu Tham Lương, cầu tạm Chữ Y, cầu Thị Nghè…và một số vị trí nước khá sạch như cầu Sài Gòn, cầu Đồng Nai…Vị trí lấy mẫu được xác định bằng GPS (máy định vị toàn cầu).Thu mẫu vào lúc nước đạt mức thủy triều cao nhất trong ngày theo lịch thủy triều. Bảng 4.23: vị trí thu mẫu STT Địa điểm Ký hiệu mẫu Vị trí Kinh độ Vĩ độ 01 02 03 04 05 06 07 Cầu Tham Lương Cầu tạm Chữ Y Cầu Chữ Y Cầu Kênh Tẻ Cầu Thị Nghè Cầu Sài Gòn Cầu Đồng Nai KR1 KR2 KR3 KR4 KR5 KR6 KR7 10049’41.9”N 10045’02.2”N 10044’47.7”N 10045’41.9”N 10047’28.5”N 10047’53.1”N 10054’21.4”N 106046’09.6”E 106041’00.3”E 106040’35.8”E 106042’06.7”E 106054’22.7”E 106043’44.1”E 106050’28.8”E 4.3.2. Kết quả phân tích nồng độ chất gây rối loạn nội tiết Các mẫu nước sau khi được thu và vận chuyển về phòng thí nghiệm đã được phân tích xác định hàm lượng chất gây rối loạn nội tiết (EDs) bằng phương pháp YES(ThS.Lê Thị Ánh Hồng, [phụ lục 1]) với nấm men đã được chuyển gen Estrogen Receptor. Chất chuẩn là 17β-Estradiol do đó số liệu thu được là nồng độ chất gây rối loạn nội tiết tương đương nồng độ 17β-Estradiol (ng/l). Bảng 4.24: Kết quả phân tích nồng độ (ng/l) chất gây rối loạn nội tiết Địa điểm lấy mẫu Số lần lấy mẫu 01 02 03 KR1 6.207 1.169 0.895 KR2 2.878 0.635 0.800 KR3 2.718 0.550 0.610 KR4 1.031 0.515 0.929 KR5 2.678 0.442 0.29 KR6 2.991 0.332 0.167 KR7 1.573 0.113 0.068 Do ảnh hưởng của thủy triều và lượng nước mưa nên các lần phân tích EDs trong mẫu khác nhau rất lớn như ở vị trí KR1 lần 1 là 6,207 ng/l và lần 3 là 0,895 ng/l Mẫu ở vị trí cầu Tham Lương là có hàm lượng EDs cao nhất 6,207ng/l trong tất cả các mẫu phân tích Xếp theo thứ tự nồng độ EDs từ cao tới thấp thì chúng tôi nhận thấy như sau: KR1 > KR6 > KR2 > KR3 > KR5 > KR7 > KR4 Theo như báo cáo của Univeritat Bremen [14 ] thì: Đối với 17β-Estradiol : 8.0µM_21 ngày không ảnh hưởng đến đời sống, không ảnh hưởng đến quá trình sinh sản, không ảnh hưởng đến sự phát triển của F1 270µg/l không ảnh hưởng đến giới tính, sinh sản LC50 2,97mg/l 48h_giảm sinh sản 1_100µg/l 6 ngày không ảnh hưởng đến giới tính, sinh sản Đối với 17α-Ethynylestradiol : 100ppb – 5ppm giảm sinh sản, không ảnh hưởng đến râu và giới tính Vậy với nồng độ EDs phân tích được ở các mẫu nước phân tích từ 6,207 – 1,573 ng/l trên kênh rạch Tp Hồ Chí Minh không gây ảnh hưởng đến Daphnia sp.Tuy nhiên có thể ảnh hưởng đến những loài có kích thước nhỏ hơn như Ceriodaphnia sp. hay Brachionus sp. Chương 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1. Kết luận Sau 3 tháng thực hiện đề tài “ khảo sát sự ảnh hưởng của chất gây rối loạn nội tiết lên Daphnia magna ’’ chúng tôi thu được kết quả : Ảnh hưởng của 17α-Ethynylestradiol Tỷ lệ sống sót của Daphnia magna bố trí thí nghiệm thấp hơn so với đối chứng. Ở nồng độ 100µg/l 17α-Ethynylestradiol sau 48h số lượng Daphnia magna chết đến 81,7%. Thời gian sinh sản là 7 ngày với nồng độ 17α-Ethynylestradiol 1µg/l và 15 ngày với nồng độ 17α-Ethynylestradiol 50µg/l. Vòng đời của Daphnia magna bị rút ngắn xuống còn 40 ngày so với đối chứng là 61 ngày. Tỷ lệ sinh sản cao ở nồng độ 100µg/l là 54,4 D. magna con trên D. magna mẹ so với đối chứng là 25,4 D. magna con trên D. magna mẹ. Ảnh hưởng của17β-Estradiol Tỷ lệ sống sót của Daphnia magna bố trí thí nghiệm thấp hơn so với đối chứng. Ở nồng độ 100µg/l 17β-Estradiol sau 48h số lượng Daphnia magna chết đến 90%. Thời gian sinh sản là 8 ngày với nồng độ 17β-Estradiol 1µg/l, 10µg/l và 15 ngày với nồng độ 17β-Estradiol 100µg/l. Vòng đời của Daphnia magna bị rút ngắn xuống còn 43 ngày so với đối chứng là 67 ngày. Tỷ lệ sinh sản cao ở nồng độ 50µg/l là 64,7 D. magna con trên D. magna mẹ so với đối chứng là 32,7 D. magna con trên D. magna mẹ. Khi bố trí tiếp theo của Daphnia magna đời F1 cũng cho kết quả tương tự như ở Daphnia magna mẹ 5.2. Kiến nghị Do thời gian thực hiện đề tài có hạn nên chúng tôi chưa thực hiện hết các yêu cầu của đề tài. Do vậy chúng tôi có những kiến nghị như sau: Bố trí thêm 3 hoặc 4 lần thí nghiệm để đưa được vào phần mềm thống kê, xếp hạng để được kết quả chính xác (do bố trí trên sinh vật nên có sai số rất lớn). Thử nghiệm trực tiếp Daphnia magna đối với các nguồn nước ô nhiễm để đánh giá nguy cơ ảnh hưởng của nguồn nước đó đến động vật thủy sinh. Khảo sát ảnh hưởng của chất gây rối loạn nội tiết lên các loài thủy sinh hiện diện nhiều ở Việt Nam như: Ceriodaphnia cornuta, Brachionus calyciflorus,…