Luận văn Khảo sát thành phần hóa học cây giảo cổ lam gynostemma pentaphyllum, họ bầu bí (cucurbitaceae)

Khảo sát thành phần hóa học cây giảo cổ lam Gynostemma pentaphyllum HVCH: Đào Thị Ngọc Minh -2- CBHD: TS. Trần Lê Quan 2. TỔNG QUAN 2.1 Mô tả thực vật 2.1.1 Vài nét về họ Cucurbitaceae [1] Họ Bầu bí (Cucurbitaceae) là họ thực vật chứa một số loài được biết đến nhiều như bầu (Lagenaria siceraria), bí ngô (chi Cucurbita), mướp (chi Luffa), dưa hấu (Citrullus vulgaris), dưa vàng (Cucumis melo) và dưa chuột (Cucumis sativus). Họ Bầu bí là một trong những họ quan trọng nhất trong việc cung cấp thực phẩm trên thế giới, có 125 chi với khoảng 960 loài phân bổ rộng khắp, chủ yếu tại khu vực nhiệt đới và ôn đới (ở Việt Nam có khoảng 50 loài). Phần lớn các loài trong họ này là các loại dây leo sống một năm với hoa khá lớn và sặc sỡ. 2.1.2 Chi Gynostemma [2] Chi Gynostemma cũng được gọi chung là giảo cổ lam. Hiện nay trên thế giới có khoảng 21 loài thuộc chi này với năm loài đã được tìm thấy ở Việt Nam trong đó có G. laxum (giảo cổ lam ba lá, cổ yếm lá bóng), G. pubescens (giảo cổ lam bảy lá, thất diệp đởm), G. pentaphyllum (giảo cổ lam năm lá, ngũ diệp sâm) 2.1.3 Giới thiệu về cây giảo cổ lam 2.1.3.1 Tên gọi [2], [3], [4] Giảo cổ lam có tên khoa học là G. pentaphyllum (Thunb.) Makino thuộc họ Bầu bí (Cucurbitaceae), còn gọi là cam trà vạn, cây trường sinh, cây cỏ thần kỳ, cây bổ đắng, sâm phương nam, dây lõa hùng, trường sinh thảo, ngũ diệp sâm, phúc âm thảo, 绞股蓝 (jiaogulan, Trung Quốc), 甘茶蔓 (amachazuru, Nhật Bản), dungkulcha (Hàn Quốc), cha-satun (Thái Lan). 2.1.3.2 Mô tả cây [2] Giảo cổ lam là một loài cây thảo có thân mảnh, leo nhờ tua cuốn đơn ở nách lá. Cây đực và cây cái riêng biệt. Lá kép hình chân vịt. Khảo sát thành phần hóa học cây giảo cổ lam Gynostemma pentaphyllum HVCH: Đào Thị Ngọc Minh -3- CBHD: TS. Trần Lê Quan Hình 1: Lá cây giảo cổ lam Hình 2: Quả cây giảo cổ lam Cụm hoa hình chùy mang nhiều hoa nhỏ màu trắng, các cánh hoa rời nhau xòe hình sao, bao phấn dính thành đĩa, bầu có ba vòi nhụy. Cây ra hoa vào tháng 7-8, có quả chín từ tháng 9 đến tháng 10. Hình 3: Hoa cây giảo cổ lam Quả khô hình cầu, đường kính 5 - 9 mm, khi chín màu đen. 2.1.3.3 Môi trường sống và thu hái [4] Giảo cổ lam mọc tự nhiên ở độ cao 300–3200 m tại các cánh rừng hoặc thung lũng trên núi, những nơi ẩm thấp như bên bờ suối, trong các bụi cây, phân bố rộng rãi ở các quốc gia như Nhật Bản, Hàn Quốc, Trung Quốc, Ấn Độ, Nepal, Bangladesh, Sri Lanka, Lào, Myanmar, Việt Nam. Giảo cổ lam được lần đầu tiên phát hiện vào năm 1976 tại Nhật Bản. Tuy nhiên, giảo cổ lam đã được các bộ lạc sống trên núi cao sử dụng từ hơn Khảo sát thành phần hóa học cây giảo cổ lam Gynostemma pentaphyllum HVCH: Đào Thị Ngọc Minh -4- CBHD: TS. Trần Lê Quan 500 năm trước đó với mục đích kéo dài tuổi thọ. Tuổi thọ bình quân của họ đạt được rất cao đến gần trăm tuổi. Ở Việt Nam, GS.TS. NGND Phạm Thanh Kỳ (nguyên Hiệu trưởng trường đại học Dược Hà Nội, Chủ nhiệm Bộ môn Dược liệu) lần đầu tiên phát hiện thấy cây này trên núi Phanxipang (Lào Cai) vào năm 1997, sau đó được GS.TS. NGND. Vũ Văn Chuyên xác định tên khoa học chính xác. Hiện nay, giảo cổ lam cũng đã được tìm thấy trên những vùng núi cao ở các tỉnh phía Bắc như Cao Bằng, Thái Nguyên, Yên Bái, Hà Giang, Hòa Bình. 2.1.3.4 Tính vị và công năng [4], [5], [6] Theo y học cổ truyền Trung Quốc, giảo cổ lam có vị đắng, tính bình, cường dương, bổ âm với rất nhiều tác dụng như: ü Tăng sức đề kháng cho cơ thể, chống viêm và nhiễm trùng ü Tác dụng làm hạ mỡ máu, nhất là giảm cholesterol toàn phần, ngăn ngừa xơ vữa mạch máu, chống huyết khối và bình ổn huyết áp, phòng ngừa các biến chứng tim mạch, não. ü Chống lão hoá, giảm căng thẳng mệt mỏi, giúp tăng lực, tăng khả năng làm việc. Tăng cường hệ miễn dịch, ngăn ngừa sự hình thành và phát triển của khối u. ü Giúp dễ ngủ và ngủ sâu giấc, tăng cường máu lên não, ngăn ngừa chứng lú lẫn ở người già. ü Rất tốt cho tế bào gan, tăng cường chức năng giải độc của gan ü Điều chỉnh rối loạn chuyển hoá mỡ nên làm giảm béo tốt, nhất là béo bụng, đùi. Hiện nay ở Việt Nam, giảo cổ lam đã được sử dụng như một loại thực phẩm chức năng bào chế dưới các dạng trà túi lọc, viên nang, chai nước giải khát rất thuận tiện cho người tiêu dùng. Khảo sát thành phần hóa học cây giảo cổ lam Gynostemma pentaphyllum HVCH: Đào Thị Ngọc Minh -5- CBHD: TS. Trần Lê Quan 2.2 Thành phần hóa học Chi Gynostemma nổi tiếng với thành phần saponin trong đó nhiều loại saponin rất giống với thành phần saponin có trong nhân sâm, có tác dụng rất tốt cho sức khỏe về phòng ngừa và chữa bệnh. Khi so sánh hàm lượng saponin giữa một số loài cùng chi, loài G. pentaphyllum được biết đến với hàm lượng saponin cao nhất trong chi này, kế đến là G. pubescens và thấp nhất là G. longipes [7] Thành phần hóa học chủ yếu của giảo cổ lam là saponin và flavonoid. Các saponin trong cây giảo cổ lam (còn gọi là gypenosid hay gynosaponin) có cấu trúc triterpen khung dammaran, trong đó có nhiều hợp chất đã được xác định có trong thành phần saponin trong nhân sâm và tam thất. Ngoài ra, giảo cổ lam còn chứa các carotenoid, polysaccharid, sterol, các acid amin tan trong nước, nhiều vitamin và các nguyên tố vi lượng như Zn, Fe, Se. [6] 2.2.1 Các carotenoid [8], [9] Vai trò của các carotenoid đã được chứng minh có tác dụng ngăn ngừa các căn bệnh mãn tính. Ví dụ như lutein làm giảm nguy cơ thoái hóa điểm vàng và nguy cơ mắc các bệnh về tim mạch, lycopen và β-caroten ức chế sự tổng hợp các cholesterol, do đó có khả năng làm tăng sự thoái biến các lipoprotein có phân tử lượng thấp. Năm 2004, H. L. Liu và các cộng sự đã xác định một số carotenoid có trong cây giảo cổ lam bằng phương pháp HPLC, trong đó nhiều nhất là trans-lutein, kế đến là cis-lutein, các carotenoid như neochrom, neoxanthin, trans-α-caroten, auroxanthin, violaxanthin, luteoxanthin, β-cryptoxanthin, các đồng phân cis- và trans-β-caroten. OH HO H 1 trans-Lutein Khảo sát thành phần hóa học cây giảo cổ lam Gynostemma pentaphyllum HVCH: Đào Thị Ngọc Minh -6- CBHD: TS. Trần Lê Quan 2.2.2 Các polysaccharid [10] Năm 2008, tác giả Xingbin Yang và các cộng sự đã xác định được rằng glucose là monosaccharid chiếm nhiều nhất trong tổng lượng đường hiện diện trong cây giảo cổ lam với 23.2 %, kế đến là galactose chiếm 18.9 %, arabinose 10.5 %, rhamnose 7.7%, acid galacturonic 4.7 %, xylose 3.9 %, mannose 3.1 %, và acid glucuronic 1.2 %, ngoài ra còn có một lượng nhỏ ribose và fucose. 2.2.3 Các sterol [6], [11], [12] Năm 1989, tác giả Marino và các cộng sự đã xác định trong cây giảo cổ lam có sự hiện diện của các sterol thường gặp như ergostanol, sitosterol và stigmasterol với hàm lượng rất thấp (khoảng 0.0001%). Các dẫn xuất thế 24,24- dimetylcholestanol cũng được Akihisa tìm thấy vào năm 1988-1989 trong các loại cây thuộc họ Cucurbitaceae. Chondrillasterol (2) và spinasterol (3), hai xuyên lập thể phân tại C-24, là hai sterol chính có trong cây này. Ngoài ra, các acetylen sterol đầu tiên (4, 5, 6, 7) cũng được cô lập từ cây giảo cổ lam vào năm 1989. Khảo sát thành phần hóa học cây giảo cổ lam Gynostemma pentaphyllum HVCH: Đào Thị Ngọc Minh -7- CBHD: TS. Trần Lê Quan 2.2.4 Các flavonoid [6], [13] Sự hiện diện của nhiều flavonoid trong cây giúp cho giảo cổ lam có hoạt tính sinh học cao, có khả năng chống lão hóa, rất tốt cho sức khỏe. Năm 1989, Fang và Zeng đã cô lập được rutin và ombuosid (8a). Quercetin và ombuin (8b) cũng được xác nhận. Bên cạnh đó, vitexin (9) lần đầu tiên được cô lập từ cây giảo cổ lam bởi Yin và các cộng sự. 2.2.5 Các saponin [7], [14] Tổng hàm lượng saponin trong cây giảo cổ lam khô vào khoảng 2.4%. Hàm lượng này cao nhất trước khi cây ra hoa. Ngoài ra, khi thu hái cây vào những thời điểm khác nhau hay tại những vùng đất khác nhau thì tổng hàm lượng saponin cũng sẽ khác nhau. Từ năm 1976 đến nay các nhà khoa học trên thế giới, chủ yếu từ Nhật Bản và Trung Quốc, đã cô lập được trên 100 triterpen saponin từ cây giảo cổ lam. Các saponin này được gọi là gypenosid (gypenosid I – LXXIX) hay gynosaponin. Cấu trúc của các gypenosid chủ yếu có khung sườn dammaran cũng là khung sườn chính của các saponin hiện diện trong nhân sâm. Có tám ginsenosid của nhân sâm cũng được cô lập từ giảo cổ lam. Đó là các triterpen saponin có khung protopanaxadiol ginsenosid Rb1, Rb3, Rd, F2, Rg3, malonyl-Rb1, malonyl-Rd và một ginsenosid có khung protopanaxatriol là ginsenosid Rf. Gypenosid XVII, IX (cũng là notoginsenosid Fd) và XV cũng được tìm thấy trong cây tam thất P. notoginseng, trong khi gypenoside XVII và IX được tìm thấy trong cây sâm Mỹ P. quinquefolium. Các ginsenosid này chiếm khoảng 25% tổng saponin có trong cây giảo cổ lam. Khảo sát thành phần hóa học cây giảo cổ lam Gynostemma pentaphyllum HVCH: Đào Thị Ngọc Minh -8- CBHD: TS. Trần Lê Quan Khung triterpen dammaran của các aglycon saponin có trong cây giảo cổ lam có thể có mạch nhánh hở (hình 4) hay mạch nhánh vòng (hình 5). Nhóm chức thường gặp nhất là nhóm hydroxyl, thường thấy xuất hiện ở C-3, C-20, C-21 và C-25, ít gặp hơn là ở C-2, C-12, C-19 và C-24. Các nhóm chức khác như nối đôi (ở C-23, C-24 và C-25), aldehid (ở C-19) và keton (ở C-12) cũng thấy xuất hiện trong một vài hợp chất. Các đơn vị đường có trong các saponin này chủ yếu là b-D- glucopyranose, b-D-xylopyranose, a-L-arabinopyranose và a-L-rhamnopyranose, thường thấy ở vị trí C-3 (có cấu hình b), ở C-20 và C-21. Hình 4: Cấu trúc khung dammaran với mạch nhánh hở Trong đó R1-R7 có thể là: R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 H H CH3 H CH3 CH3 a Glycosid* OH CH2OH OH CH2OH OH b CHO =O OH CH2OH c O-glycosid* CH2-O-glycosid* d e f g h i * Các đơn vị đường như glucopyranose, arabinopyranose, xylopyranose, rhamnopyranose Khảo sát thành phần hóa học cây giảo cổ lam Gynostemma pentaphyllum HVCH: Đào Thị Ngọc Minh -9- CBHD: TS. Trần Lê Quan R3 R1 O R2 R4 R5 2829 1 9 18 17 30 O OH O HO OH O O O R6R6 OHHO O R6 20 20 R5 j l n k m Hình 5: Cấu trúc khung dammaran với mạch nhánh vòng Trong đó R1-R6 có thể là: R1 R2 R3 R4 R5 R6 H H CH3 H j H Glycosid * OH k OH l OAc m n * Các đơn vị đường như glucopyranose, arabinopyranose, xylopyranose, rhamnopyranose Năm 1996, từ dịch trích metanol của phần thân cây giảo cổ lam, tác giả Lihong Hu và các cộng sự đã cô lập được ba triterpen saponin mới (10-12) cùng với một saponin đã được biết trước đó (13). Cấu trúc của các hợp chất này được chứng minh bằng phương pháp hóa học và các phương pháp phổ nghiệm. Aglycon của hợp chất 10 và 11 có khung 12-oxo-2α,3β,20(S)-trihydroxydammar-24-en. [15] Khảo sát thành phần hóa học cây giảo cổ lam Gynostemma pentaphyllum HVCH: Đào Thị Ngọc Minh -10- CBHD: TS. Trần Lê Quan O OHO HO OH O O HO OH HO OH HO O O HO HO OH O OHO HO R OH O R O OHO HO OH O O HO OH HO OH O O HO HO OH OH O 10 R = CH3 11 R = H 12 R = CH2OH 13 R = CHO Vào năm 2003, từ phần thân cây giảo cổ lam, tác giả Xin Liu và các cộng sự đã cô lập được năm saponin mới có mạch nhánh kiểu ocotillon đặt tên là gynosid A-E (14-18) và mười saponin khung dammaran khác. Cấu trúc của các hợp chất mới được xác định bằng phương pháp phân tích phổ NMR và thủy giải acid. Riêng cấu trúc và lập thể của gynosid A (14) được xác nhận bằng phương pháp nhiễu xạ tia X. [16], [17] Năm 2004, tác giả Åke Norberg và các cộng sự, trong đó có các nhà khoa học Việt Nam đã cô lập được một gypenosid mới, đặt tên là phanosid (19). Phanosid với liều 500 µM kích thích tạo ra insulin (in vitro) ở mức gấp 10 lần khi lượng glucose là 3.3 mM và có khả năng kích tạo insulin ở mức gấp 4 lần khi mức glucose là 16.7 mM. Ở mức đường huyết trên, 2 µM hoạt chất glibenclamid, một Khảo sát thành phần hóa học cây giảo cổ lam Gynostemma pentaphyllum HVCH: Đào Thị Ngọc Minh -11- CBHD: TS. Trần Lê Quan thuốc tân dược được sử dụng trong điều trị tiểu đường, chỉ có khả năng kích tạo insulin gấp hai lần. Khi cho chuột uống phanosid (40 và 80 mg/ml), khả năng hấp thụ glucose được cải thiện đáng kể và mức insulin huyết thanh cũng được tăng cường. [18] O HO O O HO OH20 2122 23 O HO HO OH O HO O HO OH O HO 19 Cũng trong năm 2004, tác giả Feng Yin và các cộng sự đã cô lập được ba gypenosid mới (20-22) cùng với ba hợp chất khác đã được công bố trước đó (23- 25). Cấu trúc của các hợp chất này được xác định bằng các phương pháp phổ nghiệm. [13] Khảo sát thành phần hóa học cây giảo cổ lam Gynostemma pentaphyllum HVCH: Đào Thị Ngọc Minh -12- CBHD: TS. Trần Lê Quan Năm 2005, tác giả Feng Yin và các cộng sự đã cô lập được sáu hợp chất triterpen saponin mới (26-31) có khung 21,23-lacton từ dịch trích metanol của phần thân cây giảo cổ lam. Cấu trúc các hợp chất này được xác định bằng phương pháp thoái biến hóa học và các phương pháp phân tích phổ NMR. [19] Khảo sát thành phần hóa học cây giảo cổ lam Gynostemma pentaphyllum HVCH: Đào Thị Ngọc Minh -13- CBHD: TS. Trần Lê Quan 3 26 R1 = Rha R2 = Xyl R3 = Ac 27 R1 = Rha R2 = Xyl R3 = H 28 R1 = Rha R2 = Glc R3 = H O HO O 20 21 24 22 25 18 17 O R2O O HO R1O O HO HO OR3 O OR2O OR1 HO OR3 3 O HO O 20 21 24 22 25 18 17 O 29 R1 = H 30 R1 = H 31 R1 = Ac R3 = Ac R3 = H R3 = Ac R2 = Xyl R2 = Xyl R2 = Xyl Cùng năm 2005, tác giả Tom Hsun-Wei Huang và các cộng sự đã tìm ra được gynosaponin TR1 (32) trích từ giảo cổ lam có khả năng hoạt hóa receptor X của gan (LXR), một receptor đóng vai trò quan trọng trong việc điều hòa nồng độ cholesterol, mở ra triển vọng điều trị bệnh xơ vữa động mạch. [20] HO OH O HO HO R2O O HO OH HO 32 Năm 2006, tác giả Feng Yin và các cộng sự đã cô lập được chín hợp chất saponin mới (33-41) có khung dammanran từ dịch trích metanol của phần thân cây giảo cổ lam mọc hoang ở Trung Quốc. Cấu trúc của các hợp chất này được xác định bằng phương pháp phân tích phổ NMR và phương pháp thoái biến hóa học. Đặc biệt, các hợp chất 38-41 là những ví dụ đầu tiên của khung 21,24- cyclopentyldammaran, trong đó có liên kết C-C giữa C-21 và C-24 thay vì liên kết Khảo sát thành phần hóa học cây giảo cổ lam Gynostemma pentaphyllum HVCH: Đào Thị Ngọc Minh -14- CBHD: TS. Trần Lê Quan eter giữa hai carbon này như 33-37. Các hợp chất 33, 36, và 40 có hoạt tính kháng các tế bào ung thư dạ dày SGC-7901 và tế bào ung thư gan BEL-7402. [21] Năm 2006, tác giả Tom Hsun-Wei Huang và các cộng sự đã chứng minh được rằng dịch trích của G. pentaphyllum và thành phần chính của nó, gypenosid XLIX (42), có tác dụng kháng viêm bằng cách ức chế sự hoạt hóa NF- kB do lipopolysaccarid (LPS) trong đại thực bào của chuột. [22] Khảo sát thành phần hóa học cây giảo cổ lam Gynostemma pentaphyllum HVCH: Đào Thị Ngọc Minh -15- CBHD: TS. Trần Lê Quan 2.3 Hoạt tính sinh học của cây giảo cổ lam [6], [23], [24] Hoạt tính sinh học của cây giảo cổ lam chủ yếu là do thành phần saponin, vì vậy, saponin đã trở thành đối tượng của rất nhiều những nghiên cứu về giảo cổ lam trên thế giới. Và cũng vì những tác dụng đa dạng mà cây giảo cổ lam còn được gọi là cây trường sinh. Nhiều nghiên cứu đã cho thấy dịch trích nước của giảo cổ lam có tác dụng làm giảm nồng độ lipid và cholesterol trong máu của chuột. Gynosaponin với liều 200 mg/kg làm giảm nồng độ cholesterol toàn phần, cũng như nồng độ LDL và VLDL trên chuột, đồng thời làm tăng tỷ lệ HDL/LDL. Những nghiên cứu lâm sàng cho thấy G. pentaphyllum có hiệu quả trong chữa trị lão hóa, chứng đau nửa đầu, hen suyễn mãn tính, viêm gan B, đau dạ dày mãn tính. Từ đó, cho thấy giảo cổ lam có khả năng cải thiện và điều hòa quá trình chuyển hóa lipid. Giảo cổ lam cũng có tác dụng trên hệ tim mạch. Gypenosid tổng tiêm nội phúc mạc trên thỏ với liều 100 mg/kg làm giảm nhồi máu cơ tim gây ra do thắt động mạch vành và ức chế sự tăng nồng độ acid béo tự do sau nhồi máu cơ tim. Gypenosid ở nồng độ 50, 100 và 200 mg/mL thể hiện hoạt tính bảo vệ đối với tế bào cơ tim bằng cách ức chế tổn thương gây bởi glucose và sự thiếu hụt oxygen cũng như ức chế sự giải phóng creatin phosphokinase và lactat dehydrogenase. Tiêm tĩnh mạch gypenosid (5 và 10 mg/kg) vào chó cũng làm tăng lưu lượng máu qua động mạch vành. Gần đây, nghiên cứu cũng cho thấy gypenosid ức chế sự tổng hợp nitrit của đại thực bào RAW 264.7 kích thích bởi LPS. Nghiên cứu sâu hơn cho thấy gypenosid ức chế hoạt tính và sự sao chép gen iNOS bằng cách giảm hoạt tính của NF-kB. Sự ức chế sinh tổng hợp NO bằng cách ức chế sự thể hiện gen của iNOS hoặc hoạt tính của nó là một mục tiêu quan trọng trong việc điều khiển một số bệnh lý như viêm và xơ cứng động mạch. Những kết quả này cho thấy tầm quan trọng của các gypenosid trong việc điều khiển sinh tổng hợp NO. Khảo sát thành phần hóa học cây giảo cổ lam Gynostemma pentaphyllum HVCH: Đào Thị Ngọc Minh -16- CBHD: TS. Trần Lê Quan Saponin toàn phần trích từ G. pentaphyllum ở liều 100 mg/kg bằng đường miệng trong hai tuần làm giảm đáng kể đường huyết trên chuột tiểu đường gây ra do streptozotocin. Phanosid (19) từ giảo cổ lam có khả năng tăng tiết insulin từ tuyến tụy của chuột. Phanosid với liều uống 40 và 80 mg/kg cải thiện dung nạp glucose và làm tăng nồng độ insulin trong máu trên chuột. Giảo cổ lam còn có tác dụng tăng cường miễn dịch. Gypenosid 200 và 400 mg/kg có tác dụng ngăn chặn sự làm teo các cơ quan miễn dịch do cyclophosphamid. Gypenosid còn có hoạt tính bảo vệ gan do CCl4 với liều 50 mg/kg s.c. Dịch trích từ G. pentaphyllum còn cho thấy có tác dụng chống mệt mỏi, làm tăng tuổi thọ trên động vật thử nghiệm. Nhiều nghiên cứu cho thấy gypenosid toàn phần của cây giảo cổ lam an toàn, không có độc tính và phản ứng phụ. LD50 trên chuột cống là 1.85 g/kg gypenosid tổng được tiêm nội phúc mạc. 8 g/kg gypenosid bằng đường miệng trên chuột cống trong một tháng cũng không có độc tính và phản ứng phụ. Những kết quả này cho thấy giảo cổ lam là một loại cây thuốc với nhiều tác dụng quý báu, an toàn.