Luận văn Khảo sát tình hình nhiễm E.coli và Coliforms trong nước uống, nước có gas, nước có cồn trên địa bàn quận Thủ Đức

heo TCVN 6096 – 1995, TCVN 5042 – 1994 quy định về vi sinh vật của các dạng nƣớc này nhƣ sau [3]: Nƣớc uống đóng chai Nƣớc giải khát không cồn Chỉ tiêu Mức tối đa cho phép Không đóng chai Đóng chai Tổng vi sinh vật hiếu khí (CFU/ml) E. coli (CFU/100ml) Clostridium perfringens(CFU/100ml) Leuconostoc Nấm men – nấm mốc, (CFU/ml) Staphylococcus aureus 5 x 10 4 3 0 0 10 3 0 10 2 0 0 0 0 0 Chỉ tiêu Mức tối đa cho phép Coliform (MPN/100ml) Coliform phân (MPN/100ml) E. coli (CFU/100ml) Clostridium khử sulphate (CFU/100ml) Streptococci phân (CFU/100ml) 0 0 0 0 0 6 Nƣớc giải khát có cồn Chỉ tiêu Mức tối đa cho phép Không đóng chai Đóng chai Tổng vi sinh vật hiếu khí (CFU/ml) E. coli (CFU/100ml) Clostridium perfringens (CFU/100ml) Vi khuẩn gây đục (quan sát bằng mắt ) Nấm men – nấm mốc, (CFU/ml) S. aureus / vi khuẩn gây bệnh đƣờng ruột 10 3 0 0 0 10 2 0 10 2 0 0 0 0 0 Ngoài ra, theo TCVN 5943 – 1995 quy định nƣớc biển ven bờ dùng cho bãi tắm, nuôi thuỷ sản có Coliform không quá 1000MPN/100ml [3]. 2.3. Sơ lƣợc về Coliforms Coliforms đƣợc xem là những vi sinh vật chỉ thị an toàn vệ sinh, bởi vì số lƣợng của chúng hiện diện trong mẫu chỉ thị khả năng có sự hiện diện của các vi sinh vật gây bệnh khác trong thực phẩm. Các nhà nghiên cứu cho rằng số lƣợng Coliforms trong thực phẩm càng cao thì khả năng hiện diện các vi sinh vật gây bệnh khác cũng rất lớn. Tuy vậy mối liên hệ giữa số lƣợng vi sinh vật chỉ thị và vi sinh vật gây bệnh còn đang đƣợc tranh cải về cơ sở khoa học, cho đến nay mối liên hệ này vẫn không đƣợc sự thống nhất trong các hội đồng khoa học [2]. Coliforms là nhóm những trực khuẩn đƣờng ruột gram âm không sinh bào tử, hiếu khí hoặc kỵ khí tuỳ nghi, có khả năng sinh acid, sinh hơi do lên men lactose ở 37 0C trong vòng 24 giờ [6, 7]. Coliforms chịu nhiệt là những Coliforms có khả năng lên men lactose sinh hơi trong khoảng 24 giờ khi đƣợc ủ ở 44oC trong môi trƣờng canh EC. Coliforms phân 7 (Faecal Coliforms hay E. coli giả định) là Coliforms chịu nhiệt có khả năng sinh indole khi đƣợc ủ khoảng 24 giờ ở 44,5oC trong canh Trypton. Coliforms phân là một thành phần của hệ vi sinh vật đƣờng ruột ở ngƣời và các động vật máu nóng khác và đƣợc sử dụng để chỉ thị mức độ vệ sinh trong quá trình chế biến, bảo quản, vận chuyển, thực phẩm, nƣớc uống cũng nhƣ để chỉ thị sự ô nhiễm phân trong mẫu môi trƣờng. Trên thực tế kiểm nghiệm Coliforms phân đƣợc quan tâm nhiều hơn, đặc biệt là E. coli là loài đƣợc quan tâm nhiều nhất về vệ sinh an toàn thực phẩm. Nhóm Coliforms gồm 4 giống đó là Escherichia với một loài duy nhất là E .coli, Citrobacter, Klebsiella, Enterobacte (gồm 2 loài E. aerobacter và E. cloacae). Tính chất sinh hoá đặc trƣng của nhóm này đƣợc thể hiện qua các thử nghiệm IMViC [6, 7]. Bảng 2.1 Biểu hiện sinh hoá các giống của Coliforms Phản ứng Indol Methyl Red Voges Proskauer Citrat Escherichia +(-) + - - Citrobacter -(+) + - + Klebsiella -(+) - + + Enterobacter -(+) - + + Ghi chú: + phản ứng dương tính, - phản ứng âm tính, +(-): đa số là phản ứng dương tính và -(+): đa số là phản ứng âm tính. Coliforms phát triển tốt trên nhiều loại môi trƣờng, nhiều loại thực phẩm. Có những nghiên cứu cho thấy chúng có thể phát triển ở nhiệt độ thấp đến – 20C và cao đến 500C. Trong thực phẩm chúng phát triển yếu và rất chậm ở 50C tuy cũng có tài liệu ghi nhận sự phát triển của chúng ở 3 – 60C [7]. Ngƣỡng pH để Coliforms có thể phát triển là 4,4 – 9 E. coli có thể phát triển trên môi trƣờng tối thiểu chỉ chứa một nguồn carbon hữu cơ duy nhất (chẳng hạn glucose) và một nguồn nitơ duy nhất nhƣ (NH4)2SO4 cùng vài loại khoáng khác. Chúng phát triển tốt trên môi trƣờng thạch thƣờng, cho những khuẩn lạc thấy đƣợc sau 12 – 16 giờ ở 370C, phát triển tốt ở rất nhiều loại thực phẩm trong điều kiện thích hợp. Coliforms gồm 2 nhóm: - Coliforms có nguồn gốc từ phân phát triển nhanh, khoảng 16 giờ, trong 8 môi trƣờng dinh dƣỡng ở 440C, không mọc ở 40C trong 30 ngày. Là loại vi khuẩn ƣa nhiệt, nhiệt độ thích hợp nhất là 410C. - Coliforms không có nguồn gốc từ phân, chúng có nguồn gốc thuỷ sinh hay từ đất, mọc nhanh ở 4oC trong 3 – 4 ngày và 10oC trong 1 ngày. Không mọc ở 41 oC, ở 44oC ức chế hoàn toàn sự phát triển của tất cả các Coliforms không có nguồn gốc từ phân. 2.4. Sơ lƣợc về E. coli 2.4.1. Đại cƣơng Vi khuẩn Escherichia coli (E. coli) thuộc [11]: Lớp: Schgzomycetes Bộ: Eubacteriales Họ: Enterobacteriaceae Tộc 1: Escherichiae Giống: Escherichia Loài: Escherichia coli Escherichia coli còn có tên là Bacteriam coli Commue đƣợc ông Escherich phát hiện năm 1885 trong trƣờng hợp tiêu chảy ở trẻ em [16]. Hình 2.1 Vi khuẩn Escherichia coli [19] 9 Theo P. J. Quinn và cs (1994), E. coli có nhiều trong ruột của động vật ăn thịt, ăn tạp hơn là động vật ăn cỏ, sống vài tuần đến vài tháng trong bụi, phân, nƣớc, ngoài tự nhiên. Hầu hết chúng không gây hại cho ngƣời và động vật, giúp ổn định sinh lý đƣờng ruột. Tuy nhiên cho đến nay đã phát hiện đƣợc 5 dòng có khả năng gây hại cho ngƣời và động vật là [8]: - EAEC (Enteroaggregative E. coli), E. coli kết tập ở ruột. - EHEC (Enterohemorrhagic E. coli), E. coli gây xuất huyết ở ruột. - EPEC (Enteropathogenic E. coli), E. coli gây bệnh đƣờng ruột. - ETEC (Enterotoxigenic E. coli), E. coli sinh độc tố ruột. - EIEC (Enteroinvasive E. coli), E. coli xâm lấn niêm mạc ruột. 2.4.2. Tính chất vi sinh học E. coli là trực khuẩn hình gậy ngắn, gram âm bắt màu hồng, kích thƣớc dài hay ngắn tuỳ thuộc vào môi trƣờng nuôi cấy trung bình 2 – 3µm x 0,5µm, hai đầu tròn, có lông quanh tế bào, đứng riêng lẻ, đôi khi xếp thành chuỗi ngắn, di động không hình thành nha bào. Trong bệnh phẩm có khi bắt màu lƣỡng cực hai đầu. 2.4.3. Đặc điểm nuôi cấy E. coli là vi khuẩn hiếu khí hay kỵ khí tuỳ nghi, nhiệt độ phát triển thích hợp là 37oC, pH = 7,4. Mọc tốt trên môi trƣờng dinh dƣỡng thông thƣờng chịu đƣợc nhiệt độ biến thiên từ 4 – 450C. - Môi trƣờng thạch dinh dƣỡng tạo khuẩn lạc tròn ƣớt, màu trắng đục hơi lồi để lâu có dạng khô rìa hơi nhăn. - Trên thạch máu có chủng dung huyết α hoặc β. - Trên thạch gelatin không tan chảy. - Môi trƣờng canh dinh dƣỡng: làm đục đều môi trƣờng, sau lắng xuống đáy, có màu tro nhạt đôi khi có màu xám, có mùi trứng thối. - Trên môi trƣờng chuyên biệt. - Môi trƣòng Eosin mythylen blue (EMB) tạo khuẩn lạc tím ánh kim. - Môi trƣờng MacConkey (MCK) tạo khóm đỏ hồng. - Môi trƣờng Kligler iron agar (KIA) lên men đƣờng glucose và lactose (vàng / vàng), sinh gas, không sinh H2S. - Môi trƣờng Brilliant green agar (BGA) tạo khuẩn lạc xanh lá mạ [11,13]. 10 2.4.4. Đặc tính sinh hoá E. coli lên men sinh hơi đƣờng glucose, manitol, lactose, galactose nhƣng không sinh hơi đƣờng maltose, arabinose. E. coli không lên men dextrin, glycogen, inositol, salisin, ít khi lên men inulin, pectin. E. coli không sinh H2S, không tan chảy gellatin, không phân hủy đạm, hoàn nguyên Nitrate thành Nitrite [17]. Để phân biệt E. coli với vi khuẩn đƣờng ruột khác, ngƣời ta thƣờng sử dụng thử nghiệm IMViC. E. coli cho kết quả IMViC là: + + - - hay - + - - [14]. 2.4.5. Sức đề kháng E. coli bị diệt ở 55oC trong 1 giờ, 60oC trong 15 - 30 phút, các chất sát trùng nhƣ acid phenic, formol có thể bị diệt trong 5 phút. Đề kháng với sự sấy khô, 95% E. coli bị diệt ở nhiệt độ đông lạnh trong 2 giờ. 2.4.6. Kháng nguyên Vi khuẩn đƣờng ruột E. coli có cấu trúc kháng nguyên phức tạp. Dựa vào tính chất kháng nguyên, ngƣời ta phân chia các vi khuẩn cùng loại thành các tuýp huyết thanh (serotype) khác nhau [1]. Kháng nguyên O (somatic antigen) là kháng nguyên chịu nhiệt, không bị hủy khi đun nóng 100oC trong 2 giờ, kháng cồn không bị hủy khi tiếp xúc với cồn 50%, bị hủy bởi formol 5%, rất độc chỉ cần 0,05mg đủ để giết chuột nhắt sau 24 giờ. Đƣợc phân bố trong vách tế bào, bao gồm hỗn hợp lipid–polysaccharid–protein. Lipid xác định độc tính colitoxin, polysaccharid xác định tính đặc thù của huyết thanh và protein mang tính kháng nguyên. Kháng nguyên O đƣợc chia làm 4 nhóm chính: OI, OII, OIII, OIV, với trên 150 loại khác nhau, nó bám vào nhung mao ruột làm giảm sự hấp thụ. Kháng nguyên K (capsalar antigen) có bản chất là polysaccharid hay protein, chịu nhiệt kém (dễ bị phá huỷ ở 1000C trong 1 giờ). Có hơn 100 loại khác nhau và nằm ngoài kháng nguyên O. Nếu kháng nguyên K che phủ hoàn toàn thân vi khuẩn thì sẽ ngăn cản phản ứng ngƣng kết O. Kháng nguyên giáp mô K (capsular antigen) giúp E. coli bám vào tế bào biểu mô trƣớc khi xâm lấn đƣờng tiêu hóa hay đƣờng tiết niệu. Kháng nguyên H (flagellar antigen) có trên 50 loại khác nhau, cấu tạo bởi protein và có tính chất không chịu nhiệt, bị hủy bởi cồn 50% và các proteinase, không bị hủy bởi formol 5%. Khi kháng nguyên H gặp kháng thể tƣơng ứng sẽ xảy ra hiện tƣợng ngƣng kết H. 11 Kháng nguyên F (fimbrial antigen) có dạng hình sợi, dài khoảng 4 m, thẳng hay xoắn, đƣờng kính 2,1 – 7nm, giúp vi khuẩn bám vào tế bào niêm mạc ruột nên rất quan trọng trong khả năng gây bệnh của vi khuẩn . Hiện nay có hơn 700 tuýp huyết thanh của E. coli từ sự tổ hợp các nhóm kháng nguyên O, H, K, F. Dựa vào đó, ngƣời ta có thể định danh vi khuẩn. Hình 2.2 Vị trí các loại kháng nguyên trên E. coli [21] 2.4.7. Độc tố E. coli sinh ra các độc tố sau Nội độc tố: gồm 2 loại Enterotoxin LT: không bền với nhiệt độ, trọng lƣợng phân tử 91,5 KDa, chia làm 2 phần LTa và LTb, mang tính kháng nguyên. LT gây hoạt hoá adennylcylase trong tế bào biểu mô ruột, làm tăng lƣợng AMP vòng do đó kích thích bài tiết CT và Bicarbonate, ức chế tái hấp thụ Na+, hậu quả cuối cùng là tiêu chảy mất nƣớc. Enterotoxin ST: bền với nhiệt gồm STa và STb không có tính kháng nguyên. ST hoạt hoá fuanylcylase làm tăng GMP vòng dẫn đến kích thích bài tiết nƣớc muối gây tiêu chảy. Ngoại độc tố: trọng lƣợng phân tử 70 KDa, mang tính kháng nguyên. 2.4.8. Tình hình nhiễm Các ổ dịch trên gia súc và ngƣời gây ra bởi các kiểu huyết thanh O157:H7, đã đƣợc phát hiện lần đầu tiên ở Mỹ vào năm 1982. Sau đó đƣợc ghi nhận ở một số nơi nhƣ: Bắc Mỹ, Châu Âu, Nam Phi, Nam Mỹ, Nhật, Úc…Đặc biệt là ở Nhật vào năm 12 1996 làm 10 ca tử vong và hơn 8000 ca bệnh. Ở các nƣớc phát triển, có thể do sự hạn chế về trang thiết bị kỹ thuật trong chẩn đoán nên ngƣời ta chƣa điều tra xác định đƣợc tầm quan trọng của bệnh. Các vụ dịch lớn làm một số ngƣời chết do ăn bánh mì kẹp thịt nấu chƣa chín, do uống sữa chƣa đƣợc khử trùng, có khi do uống rƣợu táo đƣợc chế biến từ táo bị nhiễm phân bò. Ở Châu Âu và Bắc Mỹ dịch thƣờng xảy ra vào mùa hè, có thể do nhiều yếu tố nhƣ sự gia tăng tiêu thụ nƣớc, sự nhiễm khuẩn cao hơn trong thịt bò. 2.4.8.1. Đặc điểm gây bệnh Chúng tiết ra các độc tố tế bào (cytotoxin), các dòng vi khuẩn này có một plasmid có thể giúp chúng bám dính vào màng nhày của ruột, gây tiêu chảy không có máu hoặc có máu và các hội chứng khác ở ngƣời [10]. 2.4.8.2. Cơ chế gây bệnh Cơ chế gây bệnh đƣờng ruột của vi khuẩn E. coli cũng có một số điểm giống vi khuẩn Salmonella và họ vi khuẩn đƣờng ruột (Enterobacteriaceae). Để gây bệnh trƣớc hết vi khuẩn phải bám dính vào tế bào nhung mao ruột bằng các nhân tố xâm nhập, vi khuẩn bám dính vào lớp tế bào biểu mô của thành ruột. Ở đây, chúng phát triển và nhân lên làm phá huỷ các lớp tế bào biểu mô gây viêm ruột. Đồng thời sản sinh độc tố đƣờng ruột enterotoxin gồm yếu tố chịu nhiệt (ST) làm tăng tính thẩm xuất của tế bào thành ruột và phá huỷ tế bào, yếu tố không chịu nhiệt (LT) sẽ tác động vào quá trình trao đổi muối, nƣớc làm rối loạn chu trình này. Nƣớc từ cơ thể chảy vào ống ruột làm căng ruột, cùng với khí do lên men ở ruột gây nên một tác động cơ học làm nhu động ruột đẩy nƣớc và thức ăn gây nên hiện tƣợng tiêu chảy. Sau khi đã phát triển ở thành ruột, chúng vào hệ bạch huyết, đến hệ tuần hoàn gây nhiễm trùng máu, chúng chống lại hiện tƣợng thực bào, gây dung huyết làm cho cơ thể thiếu máu. Từ hệ thống tuần hoàn chúng theo các vi quản đến các tổ chức, cơ quan, ở đây chúng lại phát triển nhân lên lần thứ hai. Chúng phá huỷ tế bào tổ chức gây viêm và sản sinh ra độc tố toxogenic và verotoxin phá huỷ tế bào tổ chức gây tụ huyết và xuất huyết [9]. 2.4.8.3. Triệu chứng trúng độc E. coli là vi khuẩn gây bệnh tiêu chảy phổ biến nhất, đặc biệt là ở trẻ em. Đƣờng lây nhiễm chủ yếu là qua đƣờng tiêu hoá do sử dụng nguồn nƣớc và ăn phải thức ăn bị ô nhiễm có chứa lƣợng lớn vi khuẩn E. coli. 13 Sau khi sử dụng thực phẩm bị nhiễm E. coli thì trong vòng 4 – 48 giờ sẽ có các triệu chứng nhƣ đau bụng, đi ngoài phân lỏng từ 5 – 15 lần/ngày có lẫn máu trong phân, đôi khi có buồn nôn. Nếu không đƣợc cấp cứu, xử trí kịp thời sẽ bị mất nƣớc, điện giải, rối loạn thân nhiệt, hạ huyết áp và có thể tử vong.[9] 2.4.8.4. Phòng ngừa E. coli gây bệnh theo phân ra ngoài và phát tán trong đất, nƣớc, không khí. Ngoài ra, bệnh có thể lây truyền từ ngƣời sang ngƣời do tay bẩn, thực phẩm và nƣớc uống bị nhiễm. Do đó, bệnh có thể gây thành dịch, đặc biệt ở nhà trẻ, khoa nhi của bệnh viện và ngƣời già. Vì vậy phòng bệnh chủ yếu là tuân thủ nghiêm ngặt qui chế vệ sinh, chú ý xử lý phân và dụng cụ của bệnh nhân. Không nên ăn những loại thực phẩm không đảm bảo chất lƣợng, đặc biệt là sản phẩm từ thịt chƣa nấu chín. Có thể xác định mật độ E. coli trong nƣớc để xem nƣớc có nhiễm bẩn hay không. 2.5. Phƣơng pháp định lƣợng vi sinh vật MPN (Most probable number) 2.5.1. Khái niệm MPN là phƣơng pháp dùng để đánh giá mật độ vi sinh vật theo số có xác suất lớn nhất của lƣợng vi sinh vật có trong một đơn vị thể tích mẫu, với độ chính xác tƣơng đối cao. Phƣơng pháp này còn đƣợc gọi là phƣơng pháp pha loãng tới hạn hay phƣơng pháp chuẩn độ, chúng dựa trên kỹ thuật nuôi cấy vi sinh vật cần định lƣợng trong một môi trƣờng lỏng thích hợp với một số lần lặp lại nhất định. Pha loãng một số lần mẫu có chứa vi sinh vật, sau đó kiểm tra xem tới độ pha loãng nào còn phát hiện thấy sự có mặt của loại vi sinh vật cần kiểm tra. Dùng phƣơng pháp thống kê toán học để tính ra số lƣợng gần đúng của từng nhóm vi sinh vật nhất định trong mẫu phân tích [3, 6, 7]. Phƣơng pháp MPN có thể thực hiện theo 2 cách - Với một nồng độ pha loãng - Với vài nồng độ pha loãng 2.5.2. Cách tiến hành Tuỳ theo tình trạng của mẫu mà ta sử dụng các độ pha loãng khác nhau, từ nồng độ nguyên, 10-1, 10-2, 10-3, 10-4 hay từ nồng độ 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7. Phải chọn giới hạn thế nào để ở nồng độ thấp nhất luôn có mặt vi sinh vật, còn nồng độ cao nhất thì hoàn toàn không phát hiện thấy vi sinh vật. 14 Cho vào một số ống nghiệm xác định (có chứa sẵn loại môi trƣờng thích hợp cho sự phát triển của dạng vi sinh vật cần định lƣợng) một thể tích chính xác dung dịch mẫu với các nồng độ pha loãng khác nhau (1/10, 1/100, 1/1000). Mỗi nồng độ pha loãng đƣợc lặp lại nhiều lần, thông thƣờng phải cấy lặp lại từ 3 – 10 lần tại mỗi nồng độ pha loãng. Các độ pha loãng đƣợc tiến hành sao cho trong các lần lặp lại có một số lần cho dấu hiệu dƣơng tính và một số lần cho dấu hiệu âm tính. Sau khi ủ trong những điều kiện nhiệt độ và thời gian thích hợp, dựa trên những tính chất biểu kiến nhƣ sinh hơi, đổi màu, chuyển đục…, xác định số ống nghiệm có vi sinh vật phát triển (ống dƣơng tính) ở từng nồng độ pha loãng. Lặp một chỉ số gồm các ống nghiệm dƣơng tính ở mỗi loại nồng độ pha loãng (theo thứ tự giảm dần của nồng độ). Tra chỉ số trên theo bảng MPN của MacCrady để xác định số có xác suất lớn nhất của lƣợng vi sinh vật trong một đơn vị thể tích. 2.5.3. Cách lập chỉ số MPN - Trƣờng hợp 1: Có ít nhất ba ống dƣơng tính cho một độ pha loãng. Chọn độ pha loãng cao nhất (tức là dịch pha loãng có nồng độ mẫu nhỏ nhất) cho ba ống dƣơng tính, cùng với hai độ pha loãng cao hơn kế tiếp (tức là độ pha loãng này có nồng độ mẫu là 1/10 và 1/100 của độ pha loãng thứ nhất đã đƣợc chọn) (xem Bảng 2.2, thí dụ 1). Nếu các dịch pha loãng tiếp theo ngoài dịch pha loãng cao nhất cũng cho ba ống dƣơng tính thì chọn tiếp ba độ pha loãng cao nhất trong cả dãy (tức là những độ pha loãng có nồng độ mẫu nhỏ nhất) (xem Bảng 2.2, thí dụ 2). - Trƣờng hợp 2: Không có độ pha loãng nào cho ba ống dƣơng tính. Chọn ba độ pha loãng cao nhất trong dãy pha loãng (tức là những độ pha loãng có nồng đỗ mẫu nhỏ nhất), trong số đó ít nhất thu đƣợc một kết quả dƣơng tính (xem Bảng 2.2, thí dụ 3). - Các trƣờng hợp đặc biệt: Trong tất cả các trƣờng hợp khi có nhiều hơn một trong ba độ pha loãng đƣợc chọn theo trƣờng hợp 1 và 2 không cho ống dƣơng tính, thì hãy chọn từ các độ pha loãng này độ pha loãng thấp nhất không cho các ống dƣơng tính (tức là độ pha loãng có nồng độ mẫu cao nhất) và hai độ pha loãng thấp hơn kế tiếp trong dãy pha loãng (tức là có nồng độ mẫu gấp 10 lần và 100 lần độ pha loãng thứ nhất đã chọn) (xem Bảng 2.2, thí dụ 4, 5), trừ khi các ống dƣơng tính chỉ tìm thấy ở mức pha loãng đầu tiên đƣợc chuẩn bị từ mẫu thử trong trƣờng hợp cuối cùng này 15 cần chọn ra ba độ pha loãng đầu tiên để tính MPN thậm chí loạt ống này bao gồm hai độ pha loãng không cho các ống dƣơng tính nào [5, 12]. 2.5.4. Cách tính kết quả Số vi sinh vật trên mililit hoặc trên gam của sản phẩm đƣợc tính bằng cách nhân chỉ số MPN với số đảo của độ pha loãng thấp nhất đƣợc chọn (tức là dịch pha loãng có nồng độ mẫu cao nhất). Khi độ pha loãng thấp nhất đƣợc chọn tƣơng ứng với các ống đƣợc chuẩn bị với môi trƣờng nồng độ kép (tức là cấy với 10ml), thì trƣớc hết hãy chia chỉ số MPN cho 10. Bảng 2.2 Thí dụ lựa chọn các kết quả dƣơng tính đối với việc tính toán MPN Mẫu 1 2 3 4 5 Số ống dƣơng tính nhận đƣợc từ 3 ống đƣợc ủ ấm đối với số mẫu đƣợc nuối cấy trên ống (1) Sản phẩm lỏng 10ml 1ml 10-1ml 10-2ml 10-3ml Các sản phẩm 1g 10-1g 10-2g 10-3g 10-4g ở dạng khác 3 3 2 1 0 3 3 3 0 2 2 1 1 0 3 3 0 0 0 2 2 0 1 0 Tổ hợp tô đen là tổ hợp đƣợc chọn. 16 Phần 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 3.1. Thời gian và địa điểm 3.1.1. Thời gian Thời gian thực hiện đề tài từ 20/02/2006 đến 30/07/2006 3.1.2. Địa điểm Nơi lấy mẫu: Mẫu đƣợc lấy tại các quán nƣớc giải khát trên địa bàn Quận Thủ Đức. Nơi tiến hành phân tích thí nghiệm: Phòng thí nghiệm Công Nghệ Sinh Học Môi Trƣờng Tại Trung tâm phân tích Hoá Sinh – Trƣờng Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh. 3.2. Vật liệu 3.2.1. Dụng cụ và thiết bị 3.2.1.1. Dụng cụ - Bình tam giác 250ml, 1000ml - Cốc đựng nƣớc - Pipetman - Ống nghiệm, ống Durham - Địa petri - Que cấy vòng, que trang - Đèn cồn - Bao PE vô trùng 3.2.1.2. Thiết bị - Cân phân tích - Nồi hấp autoclave - Tủ sấy - Tủ cấy an toàn sinh học - Tủ ấm 37oC - Bể điều nhiệt - Tủ lạnh 17 3.2.2. Hoá chất và môi trƣờng 3.2.2.1. Hoá chất - Thuốc thử Kovac’s gồm: p – Dimethylaminobenzaldehyde (p–DMABA) 10g/l, isoamyl alcohol 150ml/l, HCl đậm đặc 50ml/l. Hòa tan p–DMABA trong dung môi, bổ sung và khuấy từng phần nhỏ HCl cho đến khi đủ lƣợng. Thuốc thử đƣợc chứa trong chai màu tối tránh ánh sang ở 40C. Có thể thay thế isoamyl alcohol bằng amyl alcohol hoặc butanol. - Thuốc thử Methyl red gồm: Methyl red 0,1g, ethanol 95% 300ml, nƣớc cất (đủ) 500ml. Hòa tan đỏ methyl vào 300ml ethanol. Thêm nƣớc cất vào cho đủ thể tích 500ml. - Dung dịch – naphthol gồm: – naphthol 1g/l, 5N acetic acid 200ml/l. Chuẩn bị acid acetic 5N bằng cách cho 28,75ml acid glacial acetic vào 71,25ml nƣớc cất vô trùng. Trữ dung dịch này trong chai thủy tinh màu tối. - KOH 40% - Cồn 700, 960 và nƣớc cất 3.2.2.2. Môi trƣờng - Môi trƣờng lỏng Brilliant Green Lactose Bile Salt (canh BGBL) đƣợc chuẩn bị trong các ống nghiệm chứa ống Durham úp ngƣợc. Thành phần môi trƣờng gồm: peptone 10g/l, lactose 10g/l, mật bò 20g/l, brilliant green 0,0133g/l. Trộn đều và hấp khử trùng ở 1210C trong 15 phút. Sau khi khử trùng pH cuối là 7,2 ± 0,2 và chỉ sử dụng các ống nghiệm không có bọt khí bên trong ống Durham. - Dung dịch Saline Peptone Water (SPW): là dịch pha loãng, chuẩn bị trong ống nghiệm, mỗi ống 9ml. Thành phần môi trƣờng là peptone 1g/l, NaCl 8,5g/l, hấp khử trùng ở 1210C trong 15 phút, pH sau khi khử trùng là 7,0 0,2. - Môi trƣờng Eosin Methylene Blue Lactose agar (EMB): là môi trƣờng dùng để phân lập E. coli. Thành phần EMB gồm: pepton 10g/l, lactose 5g/l, sucrose 5g/l, K2HPO4 2g/l, Eosin 0,4g/l, methylen blue 0,065g/l, Agar 13,5g/l. Đun sôi để hòa tan agar trong bình chứa, hấp khử trùng ở 1210C trong 15 phút, phân phối vào các đĩa petri khoảng 10ml, pH sau khi khử trùng là 7,2. - Môi trƣờng Tryptic Soy Agar (TSA): đƣợc sử dụng để bảo quản và phục hồi giống vi sinh vật trong quá trình thí nghiệm. Thành phần TSA gồm: trypticase 18 peptone 15g/l, phytone peptone 5g/l, NCl 5g, agar 15g/l. Đun nóng để hòa tan agar trong cốc bercher, phân phối vào các ống nghiệm khoảng 5 – 7ml. Hấp khử trùng ở 121 0C trong 15 phút, pH sau khi khử trùng là 7,3. Sau đó để nguội khoảng 50 – 600C rồi để thạch nghiêng. - Môi trƣờng canh Trypton: là môi trƣờng đƣợc sử dụng để thử nghiệm phản ứng indol. Thành phần môi trƣờng gồm: peptone 10g/l, NaCl 5g/l, hấp khử trùng ở 1210C trong 15 phút. - Môi trƣờng MR–VP Broth: đƣợc sử dụng để thử nghiệm phản ứng Methyl red và Voges proskauer, có thể sử dụng một trong hai loại môi trƣờng sau: Môi trƣờng 1 gồm các thành phần sau: Buffered peptone water (Difco hoặc BBL) 7g, glucose 5g, K2HPO4 5g, 1lít nƣớc cất. Môi trƣờng 2 gồm các thành phần sau: Casein Pancreatic Digest 3,5g, peptic digest of animal tissue 3,5g, dextrose 5g, potassium phosphate 5g, 1lít nƣớc cất. Hòa tan các thành phần trong nƣớc, làm nóng nhẹ nếu cần. Phân phối 10ml vào các ống nghiệm 16 x 150mm và hấp vô trùng ở 118 – 1210C trong 15 phút. pH sau khi khử trùng là 6,9 0,2. - Môi trƣờng Simmons Citrate Agar đƣợc sử dụng để thử nghiệm phản ứng citrate. Thành phần gồm: sodium citrate 2g, NaCl 5g, K2HPO4 1g, NH4H2PO4 1g, MgSO4 0,2g, bromothymol blue 0,08g, agar 15g, 1lít nƣớc cất. Đun nóng nhẹ và thỉnh thoảng lắc. Đun sôi 1 – 2 phút cho đến khi hòa tan. Phân phối vào 1/3 ống nghiệm có nắp 13 x 100ml hoặc 16 x 150mm. Hấp ở 1210C trong 15 phút. Đặt nghiêng ống nghiệm, pH sau khi khử trùng 6,8 0,2. 3.2.3. Vật liệu thí nghiệm - Chủng E. coli đƣợc lấy từ Trung tâm chất lƣợng, An toàn vệ sinh và Thú y Thuỷ sản Vùng 4 Thành Phố Hồ Chí Minh - Các loại nƣớc đóng chai và không đóng chai: gồm 24 mẫu nƣớc đóng chai và 18 mẫu nƣớc không đóng chai. 3.3. Phƣơng pháp thực hiện 3.3.1. Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu khối đầy đủ ngẫu nhiên. Các mẫu nƣớc đƣợc lấy ở cùng một nơi và lặp lại ở những nơi khác nhau trên địa bàn Quận Thủ Đức. 19 3.3.2. Cách lấy mẫu Thời gian lấy mẫu vào buổi sáng tại các quán nƣớc trên địa bàn Quận Thủ Đức. Các loại nƣớc đóng chai và không đóng chai đƣợc cho vào các bao nylon vô trùng, sau đó đem về phòng thí tiến hành phân tích. 3.3.3. Chọn mẫu âm và tìm giới hạn phát hiện Lấy 3 ống môi trƣờng BGBL nồng độ kép, dùng pipet vô trùng chuyển 10ml mẫu thử vào từng ống trên. Tiếp theo lấy 3 ống môi trƣờng BGBL nồng độ đơn, dùng pipet vô trùng chuyển 1ml mẫu thử vào từng ống trên. Thực hiện tƣơng tự với 3 ống tiếp theo, mỗi ống cấy vào 0,1ml mẫu. Ủ các ống đã cấy ở 370C trong 24 – 48 giờ, chọn các mẫu không có ống dƣơng tính làm mẫu âm (xem Hình 3.1). Từ chủng E. coli trong ống nghiệm thạch nghiêng cấy sang môi trƣờng canh Tryptone. Sau đó ủ ở 370C trong 24 giờ, định lƣợng mật độ E. coli trong môi trƣờng canh Trypton bằng phƣơng pháp đếm khuẩn lạc. Pha loãng canh khuẩn trong môi trƣờng SPW thành các dịch có mật độ E. coli khác. Gây nhiễm vào 100ml mẫu âm đã chọn để thành mẫu gây nhiễm E. coli với mật độ trong các khoảng: <10, 10 – 100, >100 khuẩn lạc/100ml mẫu. Lấy 3 ống môi trƣờng BGBL nồng độ kép, dùng pipet vô trùng chuyển 10ml dịch gây nhiễm vào từng ống. Tiếp theo lấy 3 ống môi trƣờng BGBL nồng độ đơn, dùng pipet vô trùng chuyển 1ml dịch gây nhiễm vào từng ống. Thực hiện tƣơng tự với dãy 3 ống cấy 0,1ml. Ủ các ống đã cấy ở 370C trong 24 – 48 giờ, đếm số dƣơng tính ở mỗi dãy cấy, tra bảng chỉ số MPN/100ml với 3 ống 10ml, 3 ống 1ml, 3 ống 0,1ml để xác định mật độ Coliforms trong mẫu gây nhiễm. Tiếp theo từ các ống dƣơng tính ta cấy ria sang môi trƣờng EMB đây là môi trƣờng chọn lọc của E. coli giúp ta dễ dàng nhận diện tế bào E. coli và ủ ở 370C. Chọn các khuẩn lạc đặc trƣng cấy sang môi trƣờng TSA để thử nghiệm IMViC. Căn cứ vào số ống có khuẩn lạc cho thử nghiệm IMViC dƣơng tính ở mỗi dãy để tra bảng MPN/100ml để có mật độ của E. coli và tính độ thu hồi. 3.3.4. Định lƣợng Coliforms và E. coli trong nƣớc Lấy 3 ống môi trƣờng BGBL nồng độ kép, dùng pipet vô trùng chuyển 10ml dịch gây nhiễm vào từng ống. Tiếp theo lấy 3 ống môi trƣờng BGBL nồng độ đơn, 20 dùng pipet vô trùng chuyển 1ml mẫu vào từng ống đây là môi trƣờng tăng sinh của Coliforms. Thực hiện tƣơng tự với dãy 3 ống cấy 0,1ml mẫu. Ủ ở 37oC trong 24 – 48 giờ, đếm số ống dƣơng tính ở mỗi dãy cấy, tra bảng kết quả MPN/100ml với 3 ống 10ml, 3 ống 1ml, 3 ống 0,1ml để xác định trị số Coliforms trong mẫu. Từ các ống dƣơng tính, cấy ria sang môi trƣờng thạch đĩa EMB ủ ở 37oC trong 24 giờ. Chọn các khuẩn lạc đặc trƣng có dạng tròn, dẹt hình đĩa, có ánh kim tím (Hình 3.2) để cấy sang các môi trƣờng canh Tryptone, canh MR-VP, môi trƣờng thạch Simmon Citrate. Ủ các môi trƣờng đã cấy ở 370C trong 2 giờ, thử phản ứng Indol, Methyl Red, Voges Prokauer, Citrate. Từ các kết quả thử nghiệm IMViC để xác định số ống cho kết quả E. coli dƣơng tính trong mỗi dãy. Tra bảng kết quả MPN/100ml với 3 ống 10ml, 3 ống 1ml, 3 ống 0,1ml để xác định trị số E. coli trong mẫu. Thử nghiệm Indol: nhỏ vài giọt thuốc thử Kovac’s vào canh khuẩn trong môi trƣờng canh Tryptone. Phản ứng dƣơng tính khi có vòng đỏ xuất hiện trên bề mặt, phản ứng âm tính khi không có vòng đỏ này. Thử nghiệm Methyl Red: nhỏ vài giọt thuốc thử Methyl red vào canh khuẩn trong môi trƣờng MR-VP, lắc đều. Phản ứng dƣơng tính khi canh khuẩn chuyển sang màu đỏ, phản ứng âm tính khi canh khuẩn không chuyển màu. Thử nghiệm Voges prokauer: cho 0,2 – 0,3ml KOH 40% vào canh khuẩn MR-VP, lắc mạnh. Sau đó cho 0,2ml thuốc thử α – naphthol 5%, lắc mạnh. Quan sát trong 1 giờ, phản ứng dƣơng tính khi canh chuyển sang màu đỏ, phản ứng âm tính khi canh khuẩn không chuyển màu. Thử nghiệm Citrate: Quan sát trên môi trƣờng Simmon citrate, phản ứng dƣơng tính khi môi trƣờng có xuất hiện sinh khối và chuyển sang màu xanh da trời. Phản ứng âm tính khi môi trƣờng không có sinh khối và không có chuyển màu (Hình 3.3). Bảng 3.1 Biểu hiện sinh hoá của E. coli Môi trƣờng Phản ứng Biểu hiện của môi trƣờng Canh Tryptone + Có vòng đỏ xuất hiện trên bề mặt Thử nghiệm Methyl Red + Môi trƣờng chuyển sang màu đỏ Thử nghiệm Voges prokauer - Môi trƣờng không chuyển màu 21 Simmon Citrate - Không có sinh khối và không chuyển màu 3.3.5. Phƣơng pháp định lƣợng E. coli trong dịch pha loãng bằng phƣơng pháp đếm khuẩn lạc Sau khi ủ các môi trƣờng canh tryptone đã cấy E. coli trong 24 giờ, ta pha loãng canh khuẩn trong môi SPW ở các độ pha loãng từ 10-1 đến 10-7. Bằng cách dùng pipet vô trùng hút 1ml canh khuẩn cho vào ống nghiệm vô trùng chứa 9ml môi trƣờng SPW, dùng pipet trộn đều ta đƣợc dịch pha loãng ở nồng độ 10-1. Sau đó hút 1ml dịch pha loãng này cho vào 9ml môi trƣờng SPW ta đƣợc dịch pha loãng 10-2. Thực hiện tƣơng tự đến nồng độ 10-7, tất cả quá trình trên đều thực hiện trong điều kiện vô trùng. Tiếp theo dùng pipet hút 0,1ml dịch pha loãng ở các nồng độ 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10 -7 cho vào đĩa peptri chứa môi trƣờng thạch EMB, dùng que trang trải đều cho đến khi khô mặt thạch. Lật ngƣợc đĩa và đem đi ủ ở 370C trong 24 giờ. Các dịch pha loãng đƣợc bảo quản lạnh ở 40C, sau khi khuẩn lạc mọc đều ta đếm các khuẩn lạc đặc trƣng của E. coli trên các đĩa và chọn 3 – 5 khuẩn lạc để khẳng định IMViC. Chọn các dịch pha loãng có mật dộ thích hợp để gây nhiễm vào các mẫu âm. 3.3.6. Xử lý số liệu Số liệu đƣợc xử lý bằng phần mềm thống kê Statgraphics 7.0 22 Chuẩn bị mẫu và pha loãng để có độ pha loãng 10 -1 , 10 -2 , 10 -3… Chuyển 10ml mẫu vào 10ml BGBL nồng độ kép. Chuyển 1ml và 0,1ml mẫu vào ống 10ml BGBL nồng độ đơn. Các độ pha loãng khác cũng tiến hành tƣơng tự. Mỗi nồng độ lặp lại 3 lần. Ủ ở 37oC trong 24 – 48 giờ. Số ống (+) ở mỗi nồng độ. Tra bảng MPN Cấy lên thạch EMB, Mật độ Coliforms ủ ở 370C trong 24 giờ Chọn khuẩn lạc đặc trƣng cấy vào Tryptone, MR-VP, Citrate. Ủ ở 370C trong 24 giờ. Thử nghiệm IMViC Đếm số ống IMViC ++--, tra bảng MPN Mật độ E. coli Sơ đồ 3.1 Quy trình định lƣợng Coliforms và E. coli 23 Hình 3.1 Biểu hiện của E. coli trên môi trƣờng canh BGBL 1: Đối chứng dƣơng, 2: Mẫu dƣơng, 3: Đối chứng âm Hình 3.2 Khuẩn lạc E. coli trên môi trƣờng EMB 24 Hình 3.3 Biểu hiện sinh hóa của E. coli 1: Indol (+), 2: Methyl Red (+), 3: Voges Prokauer (-), 4: Citrate (-) 25 Phần 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Khảo sát giới hạn định lƣợng Coliforms và E. coli trong các loại nƣớc bằng phƣơng pháp MPN Thí nghiệm đƣợc tiến hành trên các mẫu âm, là mẫu không nhiễm Coliforms. Các mẫu đƣợc sử dụng trong thí nghiệm này thuộc các nhóm: nƣớc uống tinh khiết đóng chai Lavie, nƣớc ngọt có gas đóng chai Pepsi, nƣớc giải khác có cồn bia Sai Gòn đỏ. Mẫu đã chọn đƣợc gây nhiễm E. coli với các mật độ: 0, 1-10, 10 – 100, > 100 CFU/100ml. Kết quả khảo sát đƣợc thể hiện trên Bảng 4.1. Bảng 4.1 Kết quả khảo sát giới hạn định lƣợng Coliforms và E. coli trong các nhóm nƣớc Mẫu Mật độ gây nhiễm (CFU/100ml) Mật độ phát hiện (MPN/100ml) Độ thu hồi(%) trung bình Nƣớc uống Lavie 0 6 21 56 105 296 0 3 9 39 64 240 60,86 b Nƣớc ngọt có gas Pepsi 0 6 21 56 105 296 0 0 0 28 64 240 38,40 a Nƣớc có cồn bia Sài Gòn 0 6 21 56 105 296 0 0 0 23 48 150 27,49 a 26 Ghi chú *: Các số trung bình có các chữ cái khác nhau theo cột dọc thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa về mật thống kê ở mức P<0,05. Kết quả trình bày trên Bảng 4.1 cho thấy hầu hết mật độ phát hiện của các mẫu nƣớc nói trên đều giảm so với mật độ gây nhiễm. Nhƣ ở mẫu nƣớc uống Lavie khi gây nhiễm là 6 CFU/100ml thì phát hiện chỉ đƣợc 3 MPN/100ml, mật độ này giảm đi một nữa so với mật độ gây nhiễm. Nhƣng khi gây nhiễm ở mật độ cao hơn nhƣ 56, 105, 296 CFU/100ml thì mật độ phát hiện càng tăng cụ thể lần lƣợt là 39, 64, 240 MPN/100ml. Từ kết quả này cho thấy khi gây nhiễm ở mật độ càng cao thì khả năng phát hiện càng lớn. Còn ở mẫu nƣớc ngọt có gas Pepsi thì sự chênh lệch giữa mật độ gây nhiễm và mật độ thu hồi cũng tƣơng tự nhƣ ở mẫu nƣớc uống Lavie cụ thể là khi gây nhiễm ở mật độ là 56, 105, 296 CFU/100ml thì mật độ phát hiện là 28, 64, 240 MPN/100ml giảm gần một nữa so với mật độ ban đầu. Nhƣng khi gây nhiễm ở mật độ thấp thì mật độ phát hiện có thể là 0 MPN/100ml cụ thể là ở mật độ 6 hay 21 CFU/100ml. Nguyên do có thể là khi gây nhiễm ở mật độ cao thì sự phân bố vi khuẩn trong 100ml mẫu âm tƣơng đối đồng đều hơn, còn khi gây nhiễm ở mật độ thấp thì sự phân bố có thể không đồng đều có nơi có có nơi không nên khi hút cũng sẽ có khi có có khi không. Ở mẫu nƣớc có cồn bia Sài Gòn thì mật độ phát hiện cũng tƣơng tự nhƣ mẫu nƣớc ngọt có gas khi gây nhiễm ở mật độ thấp. Nhƣng khi gây nhiễm ở mật độ cao hơn nhƣ 56, 105, 296 CFU/100ml thì mật độ phát hiện giảm đi hơn một nữa cụ thề chỉ thu lại lần lƣợt là 23, 48, 150 MPN/100ml. 0 10 20 30 40 50 60 70 Đ ộ th u hồ i ( % ) Nước uống Nước ngọt có gas Nước có cồn Mẫu 27 Biểu đồ 4.1: Biểu đồ so sánh độ thu hồi của 3 nhóm nƣớc Biểu đồ 4.1 và Bảng 4.1 cho thấy độ thu hồi giữa ba nhóm nƣớc có sự khác biệt (p<0,05)(xem Bảng 1B phụ lục). Ở nhóm nƣớc uống là 60,86% cao gấp 1,5 lần so với nhóm nƣớc ngọt có gas là 38,4%, còn so với nhóm nƣớc có cồn thì tỷ lệ này còn cao hơn khoảng gấp 2,5 lần. Còn giữa nhóm nƣớc có gas và nƣớc có cồn thì không có sự khác biệt (P<0,05) (xem Bảng 1B phụ lục), không có sự chênh lệch về giá trị. Nguyên nhân có thể là do các chất có trong mẫu nƣớc làm ức chế phần nào sự tăng trƣởng của các vi khuẩn. Kết quả cho thấy trong thực tế khi mẫu nƣớc bị nhiễm ở mật độ thấp thì khả năng phát hiện cũng thấp. Do vậy song song với việc sử dụng các phƣơng pháp truyền thống trong xét nghiệm cũng cần dùng các phƣơng pháp hiện đại để thu đƣợc kết quả chính sát hơn. 4.2. Khảo sát mật độ Coliforms và E. coli trong các loại nƣớc giải khát Bảng 4.2. Kết quả khảo sát mật độ Coliforms và E. coli trong các loại nƣớc giải khát Mẫu Số mẫu Mật độ Coliforms (MPN/100ml) Mật độ E. coli (MPN/100ml) Nhóm không đóng chai Nƣớc mía 3 1100 c 673,33 b Nƣớc rau má 3 1100 c 616,66 b Nƣớc đá 3 1100 c 886,66 b Sữa đậu nành 3 886,66 bc 673,33 b Nƣớc sâm 3 673, 33 b 590 b Bia hơi 3 886,66 bc 616,66 b Nhóm đóng chai Bia Sài Gòn 3 0 a 0 a Lavie 3 0 a 0 a Aquafina 3 0 a 0 a South’s 3 0 a 0 a Pepsi 3 0 a 0 a Xá xị 3 0 a 0 a Mirinda 3 0 a 0 a Cocacola 3 0 a 0 a Tiêu chuẩn cho phép 0 0 28 Khảo sát đƣợc thực hiện trên 42 mẫu nƣớc giải khát, trong đó có 9 mẫu nƣớc suối và nƣớc khoáng, 12 mẫu nƣớc ngọt, 3 mẫu bia hơi, 3 mẫu bia đóng chai và thanh trùng, 3 mẫu nƣớc đá, 12 mẫu nƣớc giải khát từ các xe đẩy bán dọc đƣờng. Tất cả các mẫu trên đƣợc phân tích đồng thời hai chỉ tiêu Coliforms và E. coli bằng phƣơng pháp MPN/100ml. Kết quả khảo sát sau khi đƣợc xử lý thống kê bằng phần mềm Statgraphics đƣợc trình bày trên Bảng 4.2 và Biểu đồ 4.2. 0 200 400 600 800 1000 1200 Mậ t đ ộ ( 10 0c fu/ 10 0m l) Nước mía Rau má Nước đá Sữa đậu Nước sâm Bia hơi Mẫu E.coli Coliforms Biểu đồ 4.2. Biểu đồ so sánh Coliforms và E. coli trong các mẫu nƣớc giải khát Kết quả trình bày trên Bảng 4.2 cho thấy giữa các mẫu nƣớc giải khát trong nhóm nƣớc giải khát không đóng chai không có sự khác biệt về mật độ nhiễm Coliforms và E. coli trong mẫu nƣớc. Nhƣng có sự khác biệt rất lớn với các mẫu nƣớc đóng chai và tiêu chuẩn cho phép về phƣơng diện thống kê (P<0,05) (xem Bảng 3B và 5B phụ lục). Ta thấy hầu hết các mẫu nƣớc đóng chai hay đóng lon đƣợc sản xuất bởi các công ty có tên tuổi trên thị trƣờng đều đạt tiêu chuẩn cho phép của nƣớc uống. Ngƣợc lại 100% các loại nƣớc uống giải khát không qua quá trình đóng chai, đƣợc bày bán dọc đƣờng, thậm chí các loại bia hơi đều không đạt tiêu chuẩn cho phép về hai chỉ tiêu E. coli và Coliforms. Kết quả trên cho thấy các loại nƣớc uống đƣợc bày bán dọc đƣờng tại khu vực Thủ Đức nhƣ nƣớc mía, nƣớc rau má, sữa đậu nành, nƣớc sâm … có mật độ Coliforms và E. coli cao hơn mức cho phép từ 500 đến 1000 lần so với tiêu chuẩn cho phép. 29 Trên Biểu đồ 4.2 cũng cho thấy các loại nƣớc giải khát có qua quá trình gia nhiệt nhƣ sữa đậu nành, nƣớc sâm … có mật độ E. coli và Coliforms thấp hơn so với trong trong các loại nƣớc uống không qua gia nhiệt nhƣ nƣớc mía, bia hơi, rau má, nhƣng tỉ lệ chênh lệch này là không đáng kể và vƣợt quá cao so với mức cho phép. Kết quả này nói lên rằng sự nhiễm bẩn các vi sinh vật này vào trong nƣớc uống có thể xảy ra trong quá trình vận chuyển, bảo quản hay từ các thiết bị chứa, phân phối. Đặc biệt nguy hiểm hơn khi tiến hành phân tích trên 3 mẫu nƣớc đá đƣợc lấy từ các quán giải khác thuộc khu vực quận Thủ Đức cũng cho kết quả Coliforms cao hơn 1100 lần, E. coli cao hơn khoảng 900 lần so với mức cho phép. Nƣớc đá thƣờng xuyên đƣợc sử dụng trong các hàng quán, cửa hàng nƣớc giải khát và đƣợc sử dụng chung với các loại nƣớc uống khát, một số lƣợng lớn ngƣời thƣờng xuyên sử dụng loại nƣớc này. Vì vật khi nƣớc đá nhiễm bẩn nặng nề nhƣ vậy sẽ làm nhiễm bẩn luôn các loại nƣớc uống hợp vệ sinh khác, đồng thời gây mất vệ sinh cho một số lƣợng lớn ngƣời sử dụng. Kết quả khảo sát của chúng tôi nhƣ trên có cao hơn kết quả khảo sát của Cục Thú y về tình hình ô nhiễm vi sinh vật trên một số loại nƣớc giải khát bán lẻ (sữa đậu nành, nƣớc rau má, sữa tƣơi, nƣớc mía …) tại các chợ trên địa bàn TP. Hồ Chí Minh từ 2002-2004 là 89% số mẫu không đạt yêu cầu về vi khuẩn chỉ điểm vệ sinh và vi khuẩn gây bệnh. Ngoài ra theo thống kê của Bộ Y tế thì nƣớc đá sử dụng cho dịch vụ thức ăn đƣờng phố có nhiễm E. coli là 35,6% ở các cơ sở nội thành và 64,7% ở các cơ sở ngoại thành. Qua đây ta thấy khả năng nhiễm vào các loại nƣớc giải khát không đóng chai của Coliforms và E. coli là rất lớn nhƣ Biểu đồ 4.2. Coliforms và E. coli là những chỉ tiêu vi sinh vật chỉ thị mức độ an toàn vệ sinh thực phẩm. Khi mật độ các vi sinh vật này cao, chứng tỏ trong các loại nƣớc uống trên bị ô nhiễm hữu cơ rất nặng. Đồng thời song hành với những vi sinh vật này là những vi sinh vật đƣờng ruột gây bệnh nguy hiểm nhƣ Salmonella, Shigella, Listeria … Khi mật độ E. coli, Coliforms cao thì khả năng hiện diện của các vi sinh vật gây bệnh trên trong các loại nƣớc uống này cũng rất cao. Đây là một mối nguy hiểm cho sức khỏe cộng đồng của thành phố. Các cơ quan chức năng cần phải có có những biện pháp cần thiết để hạn chế những loại nƣớc giải khát không đạt tiêu chuẩn vệ sinh lƣu hành trên thị trƣờng để bảo vệ sức khỏe của mọi ngƣời dân. 30 4.3. Đánh giá tình hình nhiễm Coliforms và E. coli trong nƣớc giải khát Với kết quả thu đƣợc trong thí nghiệm trên ta thấy mức độ nhiễm E. coli và Coliforms trong các mẫu nƣớc giải khát không đóng chai đƣợc bán lẻ trên địa bàn Thủ Đức rất cao so với tiêu chuẩn cho phép của Bộ Y tế. Sở dĩ có đƣợc kết quả này là do nhiều nguyên nhân nhƣng theo thống kê của Bộ Y tế có khoảng 49,1 – 91,6% các cơ sở không bảo đảm vệ sinh an toàn thực phẩm trong quá trình chế biến, 85,9 – 99,2% cơ sở vận chuyển, bảo quản không bảo đảm an toàn vệ sinh thực phẩm, 37 – 88% nơi bán hàng, trang thiết bị và dụng cụ chế biến không bảo đảm vệ sinh; 43,8 – 88% ngƣời kinh doanh, chế biến thực phẩm không chấp hành các quy định vệ sinh an toàn thực phẩm. Đó là lý do khiến cho các loại nƣớc giải khát bán tại các chợ bị ô nhiễm. Hệ quả nhãn tiền là mỗi năm lại có hàng trăm ngƣời phải vào viện cấp cứu vì ngộ độc. Theo thống kê giai đoạn 2001 – 2005 cho thấy đã có 988 vụ ngộ độc với 23190 ngƣời mắc và 263 ngƣời chết. Tất nhiên trên thực tế, những con số ngoài báo cáo sẽ còn cao hơn nhiều. Ngƣợc lại, so với các loại nƣớc giải khát không đóng chai thì các loại nƣớc giải khát đóng chai thì ƣu việt hơn nhiều, không có sự xâm nhiễm của E. coli và Coliforms trong nƣớc đạt tiêu chuẩn của Bộ Y tế. Nguyên nhân là do các Công ty này rất chú tâm đến vấn đề vệ sinh an toàn thực phẩm trong sản phẩm của mình, đây là yếu tố cạnh tranh nên đã đầu tƣ các thiết bị hiện đại để kiểm tra và xử lý sản phẩm của mình. 31 Phần 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận Những kết quả khảo sát nhƣ trên là bƣớc đầu phản ánh tình hình ô nhiễm vi sinh vật trong các loại nƣớc giải khát trên địa bàn TP. Hồ Chí Minh đã đến mức báo động. Từ kết quả đã nhận đƣợc cho phép chúng tôi rút ra kết luận nhƣ sau: - Có sự khác biệt giữa giới hạn định lƣợng của Coliforms và E. coli trong các nhóm nƣớc uống, nƣớc ngọt có gas và nƣớc có cồn. Đồng thời cũng xác định đƣợc giới hạn định lƣợng trong từng loại nƣớc. Độ thu hồi của Coliforms và E. coli trong nƣớc uống là 60,86%, trong nƣớc ngọt là 38,40%, trong nƣớc uống có cồn là 27,49%. - Có sự khác biệt rất lớn về mật độ ô nhiễm Coliforms và E. coli trong các loại nƣớc giải khát đóng chai và không đóng chai.Ngoài ra cũng cho thấy không có sự khác biệt giữa các loại nƣớc trong cùng một nhóm. - 100% các mẫu nƣớc giải khát không đóng chai và nƣớc đá lƣu hành trên địa bàn quận Thủ Đức đều không đạt tiêu chuẩn an toàn vệ sinh. Mật độ Coliforms và E. coli trong các mẫu này đều cao hơn mức cho phép từ 500 đến 1100 lần. - Kết quả này cho thấy tình hình mất an toàn vệ sinh trong các loại loại nƣớc uống lƣu hành tự do trên thị trƣờng đang ở mức báo động cao. 5.2. Đề nghị Nếu quá trình khảo sát này tiếp tục đƣợc thực hiện, chúng tôi đề nghị đƣợc tiến hành với các nội dung sau: - Khảo sát trên phạm vi rộng lớn không chỉ các loại nƣớc giải khát mà còn là nƣớc sinh hoạt. - Nghiên cứu xem các vi khuẩn xâm nhiễm vào nƣớc có nguồn gốc từ đâu để kịp đƣa ra các biện pháp khắc phục. - Khảo sát sự nhiễm bẩn các loại vi sinh vật gây bệnh trong các loại nƣớc giải khát 32 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHẦN TIẾNG VIỆT 1. Bộ môn vi sinh – khoa Y – Đại học Y Dƣợc TP. HCM, 1996. Vi khuẩn học. 2. Bộ thuỷ sản và Danida, dự án cải thiện chất lƣợng và xuất khuẩu thuỷ sản (Seaqip), 2004. Sổ tay kiểm nghiệm vi sinh thực phẩm thuỷ sản. Nhà xuất bản Nông Nghiệp – Hà Nội. 3. Mai Chí Cần, 2002. Khảo sát sự hiện diện của vi khuẩn E .coli và Salmonella và Nấm phổi trên gà 1 ngày tuổi. Luận văn tốt nghiệp khoa Chăn nuôi Thú y, Trƣờng Đại học Nông Lâm TP. HCM. 4. Nguyễn Tiến Dũng, 2004. Bài giảng” Kiểm nghiệm chất lượng thực phẩm “. 5. Vƣơng Thị Việt Hoa, 2003. Giáo trình thực tập vi sinh thực phẩm. Tủ sách Đại học Nông Lâm TP. HCM. 6. Lê Đình Hùng,1998. Đại cương về phương pháp kiểm tra vi sinh vật thực phẩm. Trung tâm Tiêu Chuẩn Đo Lƣờng Chất Lƣợng khu vực III, TP. HCM. 7. Bùi Quý Huy, 2002. Hướng dẫn phòng chống các bệnh do Vi khuẩn CHLaMyDa và RicKettSin từ động vật lây sang người. Nhà xuất bản Nông Nghiệp – Hà Nội. 8. Phạm Sỹ Lăng, Trƣơng Văn Dung, 2002. Một số bệnh mới do Vi khuẩn và Mycoplasma ở gia súc – gia cầm nhập nội và biện pháp phòng trị. Nhà xuất bản Nông Nghiệp – Hà Nội. 9. Lƣơng Đức Phẩm, 2002. Vi sinh vật học và an toàn vệ sinh thực phẩm.Nhà xuất bản Nông Nghiệp – Hà Nội. 10. Trần Linh Thƣớc, 2002. Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mỹ phẩm. Nhà xuất bản Giáo Dục. 11. Cao Thanh Chính Trung, 2000. Khảo sát sự hiện diện của E. coli, Staphylococcus aureus, Salmonella trong môi trường chăn nuôi Gà công nghiệp. Luận văn tốt nghiệp khoa Chăn nuôi Thú y, Trƣờng Đại học Nông Lâm TP. HCM. 12. Nguyễn Ngọc Tuân, 2002. Vệ sinh thịt. Nhà xuất bản Nông Nghiệp – TP. HCM. 13. Tiêu chuẩn Việt Nam 4882 – 2001. Vi sinh vật học - Hƣớng dẫn chung về định lƣợng Coliforms - Kỹ thuật đếm số có xác suất lớn hơn. 33 PHẦN TIẾNG NƢỚC NGOÀI 14. Clinical Verterinary Microbiologin. 15. FAO,1992. Microbiological analysis in the food centrol laboratory 16. P. J. Quinn và cs, 1994. Clirical Verteriaary Microbiology. 17. Sussman, 1985. The Virulence of E. coli. PHẦN TRANG WEB 18. coli.com. 19. http:// res2.agr.ca/lethbridge/emia/SEMproj/Ecoli_f.htm 20. http:// vm.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-4a.html 21. 34 PHỤ LỤC PHỤ LỤC A Bảng 1A Kết quả khảo sát giới hạn định lƣợng Coliforms và E. coli trong các nhóm nƣớc Mẫu Mật độ gây nhiễm (CFU/100ml) Mật độ phát hiện (MPN/100ml) Độ thu hồi(%) Nƣớc uống Lavie 0 6 21 56 105 296 0 3 9 39 64 240 0 50 42,857 69,642 60,952 81,081 Nƣớc ngọt có gas Pepsi 0 6 21 56 105 296 0 0 0 28 64 240 0 0 0 50 60,952 81,081 Nƣớc có cồn bia Sài Gòn 0 6 21 56 105 296 0 0 0 23 48 150 0 0 0 41,071 45,714 50,675 35 Bảng 2A Kết quả khảo sát mật độ Coliforms và E.coli trong các loại nƣớc giải khát Mật độ (CFU/100ml) Lần Mẫu Lần 1 Lần 2 Lần3 E. coli Coliforms E. coli Coliforms E. coli Coliforms Nƣớc mía 460 1100 460 1100 1100 1100 Nƣớc rau má 290 1100 460 1100 1100 1100 Nƣớc đá 1100 1100 1100 1100 460 1100 Sữa đậu nành 460 460 1100 1100 460 1100 Nƣớc sâm 1100 1100 460 460 210 460 Bia hơi 460 1100 1100 1100 290 460 Bia Sai Gòn 0 0 0 0 0 0 Lavie 0 0 0 0 0 0 Aquafina 0 0 0 0 0 0 South 0 0 0 0 0 0 Pepsi 0 0 0 0 0 0 Xáxị 0 0 0 0 0 0 Mirinda 0 0 0 0 0 0 Cocacola 0 0 0 0 0 0 36 PHỤ LỤC B Bảng 1B Bảng phân tích ANOVA độ thu hồi cùa các loại nƣớc Analysis of Variance for DOTHUHOI.thuhoi - Type III Sums of Squares -------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level -------------------------------------------------------------------------------- MAIN EFFECTS A:DOTHUHOI.dot 7716.2524 4 1929.0631 12.995 .0014 B:DOTHUHOI.mau 2895.1817 2 1447.5909 9.752 .0072 RESIDUAL 1187.5455 8 148.44318 -------------------------------------------------------------------------------- TOTAL (CORRECTED) 11798.980 14 -------------------------------------------------------------------------------- 3 missing values have been excluded. All F-ratios are based on the residual mean square error. Bảng 2B Trắc nghiệm LSD về độ thu hồi của loại nƣớc Multiple range analysis for DOTHUHOI.thuhoi by DOTHUHOI.mau -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count LS Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- m2 5 27.492000 X m3 5 38.406600 X m1 5 60.863600 X -------------------------------------------------------------------------------- contrast difference +/- limits m1 - m2 33.3716 17.7743 * m1 - m3 22.4570 17.7743 * m2 - m3 -10.9146 17.7743 -------------------------------------------------------------------------------- denotes a statistically significant difference. Bảng 3B Bảng phân tích ANOVA chỉ số Coliforms trong các mẫu nƣớc Analysis of Variance for SOSANH1.Coliforms - Type III Sums of Squares -------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level -------------------------------------------------------------------------------- MAIN EFFECTS A:SOSANH1.dot 78019.0 2 39009.52 1.368 .2722 B:SOSANH1.mau 9890590.5 13 760814.65 26.689 .0000 RESIDUAL 741180.95 26 28506.960 -------------------------------------------------------------------------------- TOTAL (CORRECTED) 10709790 41 -------------------------------------------------------------------------------- 0 missing values have been excluded. All F-ratios are based on the residual mean square error. 37 Bảng 4B Trắc nghiệm LSD giữa các mẫu nƣớc về chỉ số Coliforms Multiple range analysis for SOSANH1.Coliforms by SOSANH1.mau -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count LS Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- m7 3 .0000 X m8 3 .0000 X m9 3 .0000 X m10 3 .0000 X m11 3 .0000 X m12 3 .0000 X m13 3 .0000 X m14 3 .0000 X m5 3 673.3333 X m4 3 886.6667 XX m6 3 886.6667 XX m1 3 1100.0000 X m2 3 1100.0000 X m3 3 1100.0000 X -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. Bảng 5B Bảng ANOVA phân tích chỉ số E. coli trong các mẫu nƣớc Analysis of Variance for SOSANH1.E__coli - Type III Sums of Squares -------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level -------------------------------------------------------------------------------- MAIN EFFECTS A:SOSANH1.dot 139276.2 2 69638.10 .989 .3856 B:SOSANH1.mau 4878364.3 13 375258.79 5.328 .0001 RESIDUAL 1831057.1 26 70425.275 -------------------------------------------------------------------------------- TOTAL (CORRECTED) 6848697.6 41 -------------------------------------------------------------------------------- 0 missing values have been excluded. All F-ratios are based on the residual mean square error. Bảng 6B Trắc nghiệm LSD giữa các mẫu nƣớc về chỉ số E. coli Multiple range analysis for SOSANH1.E__coli by SOSANH1.mau -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count LS Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- m7 3 .00000 X m8 3 .00000 X m9 3 .00000 X m10 3 .00000 X m11 3 .00000 X m12 3 .00000 X m13 3 .00000 X m14 3 .00000 X m5 3 590.00000 X m2 3 616.66667 X m6 3 616.66667 X m1 3 673.33333 X m4 3 673.33333 X m3 3 886.66667 X -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. 38 Bảng 7B Bảng MPN Table 1. For 3 tubes each at 0.1, 0.01, and 0.001 g inocula, the MPNs per gram and 95 percent confidence intervals. Pos. tubes MPN/g Conf. lim. Pos. tubes MPN/g Conf. lim. 0.10 0.01 0.001 Low High 0.10 0.01 0.001 Low High 0 0 0 <3.0 -- 9.5 2 2 0 21 4.5 42 0 0 1 3.0 0.15 9.6 2 2 1 28 8.7 94 0 1 0 3.0 0.15 11 2 2 2 35 8.7 94 0 1 1 6.1 1.2 18 2 3 0 29 8.7 94 0 2 0 6.2 1.2 18 2 3 1 36 8.7 94 0 3 0 9.4 3.6 38 3 0 0 23 4.6 94 1 0 0 3.6 0.17 18 3 0 1 38 8.7 110 1 0 1 7.2 1.3 18 3 0 2 64 17 180 1 0 2 11 3.6 38 3 1 0 43 9 180 1 1 0 7.4 1.3 20 3 1 1 75 17 200 1 1 1 11 3.6 38 3 1 2 120 37 420 1 2 0 11 3.6 42 3 1 3 160 40 420 1 2 1 15 4.5 42 3 2 0 93 18 420 1 3 0 16 4.5 42 3 2 1 150 37 420 2 0 0 9.2 1.4 38 3 2 2 210 40 430 2 0 1 14 3.6 42 3 2 3 290 90 1,000 2 0 2 20 4.5 42 3 3 0 240 42 1,000 2 1 0 15 3.7 42 3 3 1 460 90 2,000 2 1 1 20 4.5 42 3 3 2 1100 180 4,100 2 1 2 27 8.7 94 3 3 3 >1100 420 --