Luận văn Một số yếu tố ảnh hưởng kết quả nuôi cấy tế bào biểu mô ống dẩn trứng và phản ứng hoạt hóa tinh trùng chó

(hoặc protein từ dịch hoàn phụ và đƣợc gắn vào màng) bị giảm khối lƣợng phân tử (Esbenshade và Clegg, 1980); các protein có thể di chuyển và phân bố lại một cách cục bộ, hình thành nên những diện tích nhỏ thiếu vắng các protein, là giai đoạn cần thiết cho sự phối hợp áp vào nhau của màng sinh chất và màng ngoài acrosome; cuối cùng là sự thất thoát cholesterol của màng sinh chất và màng ngoài acrosome. Sự phân bố lại các protein của màng sinh chất quanh acrosome và những thay đổi trong thành phần các lipid này có khả năng làm rách acrosome. 2.10. Môi trƣờng pha loãng – bảo quản tinh trùng chó 2.10.1. Các yếu tố ảnh hƣởng sự tồn tại của tinh trùng - Vai trò của nƣớc cất: trong môi trƣờng pha loãng tinh dịch, các chỉ tiêu của nƣớc cất nhƣ khả năng tích ion, tổng vật chất khô, tổng lƣợng vi khuẩn… sẽ ảnh hƣởng rất lớn đến sức sống của tinh trùng (trích dẫn từ Thái Thị Mỹ Hạnh, 2005). Theo Nguyễn Tấn Anh và Nguyễn Quốc Đạt (1997), tinh dịch heo đƣợc pha loãng trong môi trƣờng bảo quản với nƣớc cất khử ion, thẩm thấu ngƣợc và tiệt trùng bằng tia cực tím, đã cho kết quả bảo tồn trên 5 ngày; ngoài ra, hoạt lực và sức sống tinh trùng tốt hơn so với dùng nƣớc cất thƣờng và nƣớc cất khử ion. - Chất điện giải và không điện giải trong môi trƣờng: theo Nguyễn Tấn Anh và Nguyễn Quốc Đạt (1997), chất không điện giải (nhƣ các loại đƣờng) có tác dụng làm giảm độ dẫn điện của môi trƣờng, “bảo vệ” cho tinh trùng tránh đƣợc hiện tƣợng mất điện tích trên bề mặt tinh trùng. Nhờ đó, ngăn ngừa đƣợc hiện tƣợng tụ dính của tinh trùng, giúp cho tinh trùng duy trì sức sống thuận lợi hơn. Ngoài ra, chất không điện giải còn giữ vai trò chất khử, ngăn ngừa đƣợc sự oxy hóa của oxygen. Khi pha loãng 17 bằng những dung dịch đƣờng thì hạn chế sự sinh sản của các vi khuẩn gây mủ và tăng độ nhớt của môi trƣờng. Chất điện giải là các cation hóa trị 2 (Ca, Mg, St, Ba) làm cho tinh trùng tụ dính lại và cation hóa trị 3, 4 ( Al, Fe, Ta) làm cho tinh dịch đông lại, tinh trùng chết nhanh chóng. Ngƣợc lại, các anion có mối tƣơng quan thuận: anion hóa trị 2 tác động lên tinh trùng tốt hơn so với anion hoá trị 1, còn anion hoá trị 3 lại càng tốt hơn. - Tác động của pH (trích dẫn từ Thái Thị Mỹ Hạnh, 2005): tinh dịch chó có pH hơi toan tính biến động từ 6,5 – 6,8. Ở pH này, sức hoạt động của tinh trùng bị ức chế nên thời gian sống lâu hơn. Nếu môi trƣờng hơi kiềm pH từ 7,0 – 7,5 (theo Nguyễn Tấn Anh và Nguyễn Quốc Đạt, 1997) thì sức hoạt động của tinh trùng đƣợc tăng cƣờng nên thời gian sống ít hơn. Để môi trƣờng có khả năng duy trì một cách ổn định pH ở mức thích hợp, ngƣời ta thƣờng đƣa vào môi trƣờng những chất có năng lực đệm nhƣ: bicarbonate, citrate, phosphate… - Áp suất thẩm thấu (trích dẫn từ Thái Thị Mỹ Hạnh, 2005): phụ thuộc vào nồng độ hòa tan của các phân tử và các ion trong môi trƣờng. Theo Iguer và Verstegen (2001) áp suất thẩm thấu của tinh dịch chó dao động từ 290 – 460 mOsm. - Theo Nguyễn Tấn Anh và Nguyễn Quốc Đạt (1997), vai trò của chất kháng sinh trong môi trƣờng pha loãng tinh trùng là hạn chế tác hại của vi khuẩn. Theo Hoàng Tích Huyền và ctv (2001), kháng sinh penicillin thuộc nhóm β-lactam tạo phức “nhầm” với transpeptidase (phức bền và không phục hồi). Sự tạo phức này làm vi khuẩn không tạo đƣợc vách. Vì vách vi khuẩn Gr + (và một phần của vi khuẩn Gr -) là mạng lƣới dày đặc các peptidoglycan nối với nhau, mà xúc tác cho sự nối peptidoglycan là các enzyme transpeptidase và carboxypeptidase. Nhƣ vậy, penicillin có tác dụng tốt đối với vi khuẩn Gr+. Streptomycin và gentamycin thuộc nhóm amynoglycosid, diệt vi khuẩn bằng cách ức chế tổng hợp vi khuẩn ở mức ribosome. Streptomycin gắn vào tiểu phần 30S của ribosome và một số aminoglycosid khác có thể tác động lên cả tiểu phần 50S. Aminoglycosid có phổ tác dụng rộng, chủ yếu trên vi khuẩn Gr- và có tác dụng vừa phải đối với tụ cầu. Theo Nguyễn Tấn Anh và Nguyễn Quốc Đạt (1997), streptomycin có độc tính cao hơn penicillin nên streptomycin có một phần nào đó gây tác hại đến sức sống của tinh trùng. Trong việc bảo quản tinh dịch chó hiện nay các tác giả vẫn thƣờng sử dụng kết hợp 2 kháng sinh là penicillin và streptomycin (trích dẫn từ Thái Thị Mỹ Hạnh, 2005). Vì penicillin cản 18 trở tạo vách vi khuẩn, tạo điều kiện để streptomycin dễ thấm qua màng và vào tác động lên ribosome của vi khuẩn (Hoàng Tích Huyền và ctv, 2001). - Vai trò của lòng đỏ trứng: theo Milônanôp (1962), lòng đỏ trứng có lƣợng anion nhiều nên lòng đỏ trứng thƣờng có pH toan tính từ 6 – 6,7. Ông còn nhận định, khi cho citrate natri vào môi trƣờng có lòng đỏ trứng gà sẽ làm tăng độ nhớt của môi trƣờng giúp cho tinh trùng ít bị dao động trong quá trình vận chuyển và tránh sốc khi hạ nhiệt độ. Ngoài ra, lòng đỏ trứng còn có năng lực đệm tốt vì hàm lƣợng PO4 3- rất cao. Lòng đỏ trứng chứa 32% lipid, 16,6% protein, 1% glucid có tác dụng cung cấp dƣỡng chất cho tinh trùng, ngăn ngừa tinh trùng tiêu thụ lipid của bản thân vì trong quá trình sống tiềm sinh tinh trùng vẫn sử dụng lipid trong nguyên sinh chất (trích dẫn từ Thái Thị Mỹ Hạnh, 2005). Iguer và Verstegen (2001) đã làm thí nghiệm chứng minh vai trò của lòng đỏ trứng trong việc bảo quản tinh dịch chó. Tinh dịch chó đƣợc bảo quản đến thời điểm hoạt lực còn 50% trong 3 môi trƣờng: Biladyl, Green extender, Fresh – phos với thời gian tƣơng ứng: 3,2±1; 2,9±2,5; 2,3±0,5 ngày và bổ sung 20% lòng đỏ trứng vào 3 môi trƣờng: Biladyl, Green extender, Fresh – phos với thời gian tƣơng ứng: 8,5±0,2; 4,5±1,1; 5,2±0,4 ngày. 2.10.2. Một số môi trƣờng bảo quản tinh trùng chó - Iguer và Verstegen (2001) khảo sát khả năng bảo quản của 4 môi trƣờng: Tris – glucose, Tris – fructose, EDTA và Tris – BES (bảng 2.3). Kết quả về thời gian sống và còn khả năng thụ tinh giảm dần theo thứ tự nhƣ sau: Tris – glucose, Tris – Fructose, EDTA, Tris – BES tƣơng ứng: 13±1; 9,7±0,6; 4±0,6; 3,6±1,1 ngày. Trong môi trƣờng Tris – glucose, ông vẫn thấy tinh trùng sống tới ngày thứ 16 sau khi bảo quản. 19 Bảng 2.3. Công thức môi trƣờng bảo quản tinh chó (nguồn: Iguer và Verstegen, 2001) Thành phần môi trƣờng Tris – glucose Tris – fructose EDTA Tris – BES Nhiệt độ bảo quản (OC) 0 – 4 0 – 4 0 – 4 0 – 4 EDTA (g) 0,37 Tris (g) 3,025 3,025 0,43 Glucose (g) 1,25 6 0,59 Fructose (g) 1,25 Bicarbonate Na (g) 0,12 Citrate Na (g) 1,7 1,7 Nƣớc cất (ml) 100 100 100 100 BES (g) 1,49 Lactose (g) 3,4 Penicillin (mg/100ml) 100 100 100 100 Streptomycin (mg/100ml) 100 100 100 100 Lòng đỏ trứng (ml) 20 20 20 20 pH 6,82 6,84 6,81 6,84 Áp suất thẩm thấu (mOsm) 381 364 464 310 - Thái Thị Mỹ Hạnh (2005) khảo sát khả năng bảo quản của 4 loại môi trƣờng tris – glucose, glycine, tris – BES và EDTA (bảng 2.4). Kết quả về thời gian sống còn khả năng thụ tinh (t5) giảm dần theo thứ tự nhƣ sau: Tris – glucose, Glycine, Tris – BES, EDTA tƣơng ứng với thời gian 65,24; 61,97; 25,46; 19,96 giờ. 20 Bảng 2.4. Công thức pha chế 4 môi trƣờng bảo quản tinh chó (nguồn: Thái Thị Mỹ Hạnh, 2005) Thành phần môi trƣờng Tris – Glucose Glycine Tris – BES EDTA Glycine (g) 0,93 EDTA (g) 0,37 Tris (g) 3,025 0,43 Glucose (g) 1,25 1,25 0,59 6 Bicarbonate Na (g) 0,12 Citrate Na.1H2O (g) 1,7 1,45 Nƣớc cất 2 lần (ml) 100 100 100 100 BES (g) 1,49 Lactose (g) 3,4 Penicillin (mg) 100 100 100 100 Streptomycin (mg) 100 100 100 100 Lòng đỏ trứng (ml) 20 20 20 20 pH 6,82 6,8 6,81 6,81 Áp suất thẩm thấu (mOsm) 381 - 310 464 2.11. Hoạt hóa tinh trùng Hoạt hóa tinh trùng (sperm capacitation): là quá trình biến đổi đầu tiên của tinh trùng trong quá trình vận chuyển từ tử cung đến ống dẫn trứng. Quá trình này làm cho tinh trùng có khả năng phóng thích enzyme hyaluronidase, một enzyme làm phân hủy sự liên kết của các tế bào hạt (cumulus cell) bao quanh tế bào trứng, để tinh trùng có thể tiếp cận và kết hợp với màng trong suốt của trứng (zona pellucida). Vì vậy trong kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm (IVF) tinh trùng phải đƣợc hoạt hóa (capacitation) trƣớc khi cho kết hợp với trứng đã chín (matured oocyte) (trích dẫn từ Nguyễn Văn Thuận, 2005). Theo Farstad (2000), môi trƣờng Tyrode cải tiến (Sperm - TALP) thƣờng đƣợc sử dụng trong quá trình hoạt hóa in vitro của tinh trùng bò, chó và cáo. 21 Các yêu cầu của quá trình hoạt hóa tinh trùng trong ống nghiệm (trích dẫn từ Huỳnh Thị Lệ Duyên, 2003): do tinh thanh ngăn cản phản ứng hoạt hoá và có chứa một số chất ức chế hoạt động của tinh trùng nên cần đƣợc loại bỏ. Trong môi trƣờng hoạt hóa, cần có sự hiện diện các thụ quan của cholesterol, có thể là huyết thanh hoặc albumin huyết thanh bò hoặc ngƣời (BSA hoặc HSA), sẽ thực hiện chức năng làm mất ổn định màng tinh trùng. Huyết thanh có hiệu quả hơn vì có các lipoprotein có khả năng thu hồi cholesterol tốt hơn albumin. Dịch nang trứng cũng là một thụ quan có hiệu quả cho việc thu nhận cholesterol. Sirivaidyapong và ctv (1999) cho rằng nồng độ Ca2+ cao trong môi trƣờng Sperm- TALP-1 sẽ làm tăng tỷ lệ tinh trùng chó có phản ứng acrosome (AR) còn sống và di chuyển trong suốt quá trình hoạt hóa ở 37OC. Bởi vì nồng độ Ca2+ trong môi trƣờng cao sẽ xâm nhập nhanh chóng vào bên trong tế bào (tinh trùng) làm nồng độ Ca 2+ bên trong tế bào tăng đến mức có thể hoạt hóa phản ứng acrosome. Ông chứng minh bằng cách thêm EDTA vào môi trƣờng thì phản ứng acrosome của tinh trùng chó không xảy ra. Ngƣợc lại nồng độ Mg2+ có thể ức chế phản ứng acrosome của tinh trùng. Phản ứng hoạt hoá tinh trùng có tính chất thuận nghịch. Các tinh trùng hoạt hoá có thể trở nên bất hoạt khi cho tinh dịch vào. Hai phƣơng pháp thông dụng nhất dùng trong thụ tinh trong ống nghiệm (IVF) để hoạt hoá tinh trùng là phƣơng pháp “bơi lên” (swim-up) và phƣơng pháp Percoll. Tỉ lệ thụ tinh của các tinh trùng phân tách từ hai phƣơng pháp này là nhƣ nhau, khi các tinh trùng lấy ra theo 2 phƣơng pháp này đều bình thƣờng nhƣ nhau. Một điều quan trọng khi xử lí mẫu tinh dịch trƣớc khi đƣa vào thụ tinh trong ống nghiệm là tinh dịch cần phải đƣợc rửa sạch hoàn toàn để cho các yếu tố ức chế tinh trùng không thể hoạt động đƣợc (trích dẫn từ Phan Trƣờng Duyệt và Phan Khanh Vy, 2001). Phƣơng pháp “bơi lên” là phƣơng pháp phổ biến để tách tinh trùng ra khỏi tinh dịch, đƣợc sử dụng từ những năm 1970 đến nay. Nguyên tắc của phƣơng pháp này dựa vào sự di động của tinh trùng trong môi trƣờng. Phƣơng pháp này thích hợp cho mẫu tinh trùng có mật độ cao và di động tốt nhƣng không phù hợp cho mẫu tinh có khả năng di chuyển kém (trích dẫn từ Huỳnh Thị Lệ Duyên, 2003). Farstad và ctv (1993) đã thành công trong việc tạo phôi in vitro trên loài cáo xanh (Alopex lagopus), trong quá trình hoạt hóa tinh trùng, Farstad đã sử dụng phƣơng pháp “bơi lên” này. 22 Năm 2001, Younglai và ctv đã so sánh tác động làm hƣ hại DNA tinh trùng ngƣời của phƣơng pháp “bơi lên” thông thƣờng và phƣơng pháp “bơi lên” trực tiếp. Phƣơng pháp “bơi lên” thông thƣờng là phƣơng pháp “bơi lên” mà mẫu tinh dịch ban đầu đƣợc rửa bằng cách ly tâm. Phƣơng pháp “bơi lên” trực tiếp là phƣơng pháp “bơi lên” mà mẫu tinh dịch ban đầu đƣợc đƣa trực tiếp vào quá trình “bơi lên” hay không trải qua bƣớc ly tâm để rửa. Tỉ lệ tinh trùng có DNA bị hƣ hại sau khi hoạt hoá bằng 2 phƣơng pháp “bơi lên” này đƣợc so sánh với mẫu tinh dịch ban đầu. Kết quả: sự hƣ hại DNA đều bé hơn 5% trong hầu hết các mẫu và không có sự thay đổi ý nghĩa nào trong mẫu DNA đƣợc quan sát giữa 2 phƣơng pháp “bơi lên” này. 23 PHẦN III. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Nội dung nghiên cứu - Nuôi cấy tế bào biểu mô ống dẫn trứng: + Thu thập tế bào biểu mô ống dẫn trứng bằng phƣơng pháp vuốt và phƣơng pháp cạo. + So sánh 2 phƣơng pháp nuôi cấy tế bào biểu mô ống dẫn trứng, bao gồm phƣơng pháp sử dụng lá kính (lamell) và phƣơng pháp không sử dụng lá kính. + Nhuộm xác định tỉ lệ tế bào sống và chết sau khi nuôi cấy. - Xác định ảnh hƣởng của thời gian bảo quản và phản ứng hoạt hóa đến chất lƣợng tinh trùng: + Bảo quản các mẫu tinh dịch trong môi trƣờng Tris-glucose. + Hoạt hóa tinh trùng bằng phƣơng pháp bơi lên. + Khảo sát các chỉ tiêu đánh giá tinh trùng trƣớc và sau hoạt hóa ở các thời điểm bảo quản. 3.2. Thời gian và địa điểm thực hiện Đề tài đƣợc thực hiện từ ngày 06-02-2006 đến ngày 06-07-2006 tại trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. 3.3. Vật liệu 3.3.1. Nguồn mẫu Ống dẫn trứng chó đƣợc thu thập tại lò mổ anh Phƣớc, quận Thủ Đức, Tp. Hồ Chí Minh. Mẫu tinh chó đƣợc thu tại nhà bác Sáu và nhà chị Hạnh. 3.3.2. Dụng cụ và thiết bị Eppendorf Ống nhựa (falcon) 15 ml Dao Kéo Găng tay Khay Lọ cồn Đầu lọc 0,2 µm 24 Dây đồng mảnh Kẹp Ống tiêm 1 ml và kim 26 G Đĩa nuôi cấy 35mm Nhiệt kế Bình cách nhiệt Pipette Pasteur Micropipette Buồng đếm hồng cầu Que thuỷ tinh Phiến kính, lá kính Các loại ống đông có chia độ Kính hiển vi Máy li tâm Cân (độ chính xác 0,001) pH kế (độ chính xác 0,01) Tủ sấy dụng cụ Nồi hấp Tủ cấy Tủ ấm CO2 Tủ bảo ôn ở nhiệt độ 0-10 0 C Kính hiển vi soi ngƣợc 3.3.3. Hoá chất NaCl NaOH HCl Nigrosin-eosin Dầu xem kính Thuốc nhuộm Kovács (1992) Môi trƣờng Tris-glucose Môi trƣờng Sperm-TALP-1 theo Sirivaiddyapong và ctv (1999) Môi trƣờng TCM 199 25 Môi trƣờng PBS Môi trƣờng Hepes – 199 Dầu khoáng Huyết thanh Lòng đỏ trứng Penicillin Streptomycin Gentamycin Kanamycin 3.4. Phƣơng pháp tiến hành 3.4.1. Nuôi cấy mô tế bào biểu mô ống dẫn trứng 3.4.1.1. Thu thập ống dẫn trứng tại lò mổ (Xu và ctv, 1992) - Chọn những chó cái đang giai đoạn lên giống. Hiên tƣợng lên giống đƣợc chuẩn đoán lâm sàng với những đặc điểm nhƣ: âm hộ sƣng lên và có dịch tiết; không có sự xuất hiện của thể vàng trên bề mặt buồng trứng. - Gây chết nhƣng không trụng nƣớc sôi và thui nóng chó. - Dùng dao mổ từ rốn trở xuống 5 cm. - Dùng 2 ngón tay kéo thận ra. - Dùng kéo cắt màng treo của bao buồng trứng gắn vào thận và cắt sừng tử cung. - Thu nhận phức hợp gồm bao buồng trứng và 1 phần sừng tử cung. - Trữ 250 C trong môi trƣờng PBS đƣợc bổ sung FCS 2%, penicilin 100 IU/ml và streptomycin 100 µg/ml. - Vận chuyển nhanh về phòng thí nghiệm. 3.4.1.2. Xử lý ống dẫn trứng tại phòng thí nghiệm (Xu và ctv, 1992) - Dùng kéo tách ống dẫn trứng từ phức hợp gồm bao buồng trứng và một phần sừng tử cung. - Tách mô liên kết, tua viền của ống dẫn trứng. - Rửa ống dẫn trứng trong môi trƣờng Hepes-199 đƣợc bổ sung ECS 10%, penicilin 100 IU/ml và streptomycin 100 µg/ml. 26 3.4.1.3. Thu thập tế bào biểu mô ống dẫn trứng Thí nghiệm 1: so sánh 2 phƣơng pháp thu thập tế bào biểu mô ống dẫn trứng. Chỉ tiêu quan sát là thời gian thu thập tế bào và khả năng gây nhiễm vi sinh vật của mỗi phƣơng pháp. Sự nhiễm vi sinh vật đƣợc đánh giá thông qua sự đổi màu của môi trƣờng nuôi cấy. a/ Thu thập tế bào biểu mô bằng phƣơng pháp vuốt (squeeze) (Xu và ctv, 1992) Dùng dây đồng mảnh luồn vào trong ống dẫn trứng Ống dẫn trứng đã đƣợc rửa trong môi trƣờng Hespes – 199 Lộn ngƣợc bề mặt trong của ống dẫn trứng Dùng 2 kẹp vuốt để tách những mảnh biểu mô Cho những mảnh biểu mô này vào đĩa petri loại 35 mm chứa 3 ml môi trƣờng Hepes - 199 Dùng ống tiêm 1 ml gắn kim 26 G hút và đẩy vài lần Tạo huyễn dịch với những mảnh tế bào nhỏ hơn Li tâm huyễn dịch (240 vòng/phút, 2 phút) Giữ cặn Thêm 4 ml môi trƣờng Hepes – 199, trộn đều Li tâm lần 2 (240 vòng/phút, 2 phút) Thu nhận tế bào biểu mô ở dạng mảnh nhỏ Loại bỏ dịch nổi Loại bỏ dịch nổi 27 b/ Phân lập tế bào biểu mô bằng phƣơng pháp cạo (scrape) (Bogliolo và ctv, 2002) Giữ cặn Thêm 4 ml môi trƣờng Hepes-199, trộn đều Li tâm lần 2 (240 vòng/phút, 2 phút) Thu nhận tế bào biểu mô (ở dạng mảnh nhỏ) Loại bỏ dịch nổi Loại bỏ dịch nổi Cố định ống dẫn trứng lên các đầu ngón tay Ống dẫn trứng đã đƣợc rửa trong môi trƣờng Hespes – 199 Dùng kéo cắt dọc ống dẫn trứng Mở bề mặt trong của ống dẫn trứng Cho những mảnh biểu mô này vào đĩa petri loại 35 mm chứa 3 ml môi trƣờng Hepes – 199 Dùng ống tiêm 1 ml gắn kim 26 G hút và đẩy vài lần Tạo huyễn dịch với những mảnh tế bào nhỏ hơn Li tâm huyễn dịch (240 vòng/phút, 2 phút) Dùng dao cạo nhẹ nhàng để tách những mảnh biểu mô 28 3.4.1.4. Nuôi cấy tế bào biểu mô ống dẫn trứng Thí nghiệm 2: so sánh 2 phƣơng pháp nuôi cấy tế bào biểu mô ống dẫn trứng. Tế bào biểu mô ống dẫn trứng đƣợc nuôi cấy ở dạng mảnh (Xu và ctv, 1992). Do đó những tế bào này khó bám vào đáy đĩa nuôi cấy để đƣợc cố định. Để giải quyết nhƣợc điểm này, phƣơng pháp sử dụng lá kính cố định những tế bào này đƣợc đặt ra và đƣợc so sánh với phƣơng pháp không sử dụng là kính. Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên một yếu tố. Chỉ tiêu khảo sát là sự xuất hiện cấu trúc “bóng nƣớc” (vesicle – like). a/ Nuôi cấy tế bào bằng phƣơng pháp sử dụng lá kính - Hút 5 µl huyễn dịch tế bào biểu mô ống dẫn trứng cho vào đĩa petri loại 35 mm, đƣợc phủ gelatin 1%. - Đánh dấu vị trí bơm tế bào vào đĩa. - Đặt đĩa này vào tủ CO2 (5% CO2, 37 o C, ẩm độ cao) trong 5 phút. - Dùng lá kính đƣợc cắt 1/4 đậy lên vị trí vừa đánh dấu. - Bơm nhẹ nhàng 3 ml môi trƣờng TCM – 199 đƣợc bổ sung ECS 10% lên bề mặt lá kính. - Ghi kí hiệu trên đĩa. - Đặt đĩa này vào tủ CO2 (5% CO2, 37 o C, ẩm độ cao). - Quan sát tế bào biểu mô dƣới kính hiển vi soi ngƣợc mỗi ngày 1 lần. b/ Nuôi cấy tế bào bằng phƣơng pháp không sử dụng lá kính - Hút 5 µl huyễn dịch tế bào biểu mô ống dẫn trứng cho vào đĩa petri (loại 35 mm, đƣợc phủ gelatin 1%) chứa 3 ml môi trƣờng TCM-199 đƣợc bổ sung ECS 10%. - Ghi kí hiệu trên đĩa. - Đặt đĩa này vào tủ CO2 (5% CO2, 37 o C, ẩm độ cao). - Quan sát tế bào biểu mô dƣới kính hiển vi soi ngƣợc mỗi ngày 1 lần. 29 3.4.1.5. Nhuộm xác định tế bào chết và tế bào sống bằng trypan blue (Nigel Jenkins, 1999; Nhan Ngọc Hiền, 2005) Ghi chú: Quy trình này dùng để nhuộm những tế bào biểu mô ống dẫn trứng đƣợc nuôi cấy bằng phƣơng pháp “sử dụng lá kính”. Công thức tính tỉ lệ tế bào nuôi cấy còn sống tại thời điểm nhuộm: % tế bào sống = (số tế bào sống đếm đƣợc / tổng số tế bào đếm đƣợc)*100% Li tâm 2 lần (240 vòng/phút, 2 phút) (bằng môi trƣờng PBS) Giữ cặn và tạo huyền phù Loại bỏ dịch nổi Loại bỏ dịch nổi Hòa tan dung dịch trypan blue 2% với tỉ lệ 1:1 (2 phút, nhiệt độ phòng) Cho hỗn hợp này vào buồng đếm hồng cầu Quan sát, đếm tế bào sống (màu trắng) và tế bào chết (màu xanh) Hút bỏ 2 ml môi trƣờng bề mặt và dùng kẹp gấp lá kính ra Đĩa tế bào sau một thời gian nuôi cấy Hút 0,5 ml huyễn dịch tế bào vào 0,5 ml môi trƣờng PBS, trộn đều Li tâm 2 lần (240 vòng/phút, 2 phút) Quan sát và lắc nhẹ đĩa đến khi tế bào vừa đƣợc tách (3-4 phút) Trung hoà trypsin bằng 1 ml môi trƣờng TCM-199 đƣợc bổ sung ECS 10% Giữ cặn, thêm 1 ml trypsin, trộn đều 30 3.4.2. Hoạt hóa tinh trùng Thí nghiệm 3: xác định ảnh hƣởng của thời gian bảo quản và phản ứng hoạt hóa tinh trùng đến chất lƣợng tinh trùng. Thí nghiệm gồm 2 yếu tố (thời gian bảo quản và phản ứng hoạt hóa tinh trùng). Chỉ tiêu quan sát bao gồm các chỉ tiêu đánh giá tình trạng tinh trùng nhƣ: hoạt lực, nồng độ, độ kỳ hình, tình trạng sống còn acrosome và cƣờng độ hoạt động của tinh trùng. 3.4.2.1. Thu nhận và vận chuyển mẫu tinh trùng về phòng thí nghiệm (Thái Thị Mỹ Hạnh, 2005) - Thu nhận tinh dịch pha 2 vì pha này có nồng độ tinh trùng cao, ít tinh thanh. - Dùng pipette (1000 µl) hút mẫu tinh vào ống falcon (15 ml, đƣợc gói giấy bạc). - Thêm môi trƣờng tris – glucose vào ống falcon này với tỉ lệ 1:1, trộn đều một cách nhẹ nhàng. - Chia nhỏ mẫu tinh đã pha loãng vào đầy từng ống eppendorf (1,5 ml), nhằm tránh sóng lắc trong quá trình vận chuyển. - Trữ những eppendorf này vào bình đá (0 – 40C). - vận chuyển nhanh về phòng thí nghiệm. 3.4.2.2. Hoạt hóa tinh trùng Với mẫu tinh đã đƣợc pha loãng trong môi trƣờng tris – glucose, chia 3 nhóm và đƣợc khảo sát ở 3 thời điểm tƣơng ứng là 0 giờ, 24 giờ và 48 giờ. Mỗi nhóm đƣợc chia làm 2 phần: phần A có thể tích là 0,5 ml và phần B có thể tích là 1 ml. Phần A đƣợc dùng đánh giá các chỉ tiêu của tinh trùng trƣớc khi hoạt hóa. Phần B đƣợc đƣa vào quy trình hoạt hóa tinh trùng và đƣợc đánh giá ngay sau khi hoạt hoá. 31 Tinh trùng đƣợc hoạt hóa theo quy trình sau (Younglai và ctv, 2001; Phan Trƣờng Duyệt và Phan Khanh Vy, 2001): Các chỉ tiêu đánh giá chất lƣợng tinh trùng đƣợc thực hiện theo phƣơng pháp sau (Thái Thi Mỹ Hạnh, 2005) a/ Đánh giá hoạt lực (A) Tiến hành: dùng đũa thủy tinh lấy một giọt tinh đặt lên phiến kính sạch khô, đậy lá kính lên mẫu tinh này và xem ở vật kính 10 và 40. Dùng pipette hút 1 ml dịch nổi ở phần trên cùng vào eppendorf 1,5 ml Đánh giá các chỉ tiêu của tinh trùng Sau 1 giờ, dựng thẳng ống falcon (nhẹ nhàng, chậm rải) Giữ yên ống falcon 5 phút Li tâm 2 lần (240 vòng/phút, 5 phút) (dùng môi trƣờng Sperm – TALP – 1) Mẫu tinh dịch pha loãng trong môi trƣờng Tris – glucose (1 ml) Thu phần đáy Thêm 1 ml môi trƣờng Sperm – TALP – 1 Bơm nhẹ nhàng 1 ml hỗn hợp này vào đáy của ống falcon chứa 4 ml môi trƣờng Sperm – TALP – 1 Đặt ống falcon vào tủ CO2 (5% CO2, 37 o C, ẩm độ cao) theo một gốc xiên 300 so với mặt phẳng ngang. Trộn đều (nhẹ nhàng) loại bỏ dịch nổi 32 Nhằm phản ánh hoạt động tối ƣu của tinh trùng, đặt tinh trùng ở 37OC khi kiểm tra hoạt lực. Có 3 loại vận động đƣợc quan sát: vận động tiến thẳng, vận động vòng quanh và vận động lắc lƣ. Đánh giá hoạt lực của tinh trùng dựa trên tỉ lệ tinh trùng tiến thẳng và cho điểm từ 0 - 1. b/ Đánh giá nồng độ tinh trùng (C) Tiến hành: + Dùng lá kính đặt lên buồng đếm hồng cầu. + Pha loãng tinh bằng ống pha loãng hồng cầu, trong dung dịch NaCl 3%, với độ pha loãng 200 lần. + Lắc nhẹ ống pha loãng theo vòng số 8 khoảng 4 – 5 lần. + Loại bỏ 4 – 5 giọt tinh pha loãng ở đầu ống mao dẫn của ống pha loãng. + Nhỏ 0,5 – 1 giọt tinh pha loãng vào buồng đếm hồng cầu. + Đếm đầu tinh trùng ở vật kính 40 trong 80 ô nhỏ, đƣợc đại diện bởi 5 ô lớn (4 ô ở 4 góc và 1 ô ở chính giữa). Số lƣợng tinh trùng trong 1 ml tinh dịch pha loãng với môi trƣờng Tris – glucose đƣợc tính theo công thức: C = n * b * 50.000 Trong đó: C : Nồng độ tinh trùng trong 1 ml tinh dịch pha loãng với môi trƣờng tris – glucose n : Số lƣợng tinh trùng đếm đƣợc trong 5 ô lớn b : Hệ số pha loãng c/ Đánh giá kỳ hình (K) Tiến hành: + Dùng đũa thủy tinh lấy một giọt tinh đặt lên phiến kính sạch khô. + Thêm 1 giọt dung dịch NaCl 1%, trộn đều. + Thêm 1 giọt dung dịch nigrosin – eosin, trộn đều. + Dùng cạnh một phiến kính khác phết nhẹ hỗn hợp này để dàn mỏng tinh trùng trên mặt phiến kính. + Đếm tổng số 200 tinh trùng ở vật kính 40 và tính tỉ lệ kỳ hình. 33 Tinh trùng kỳ hình là những tinh trùng có hình dạng khác thƣờng: đầu có bƣớu, đầu to, đầu nhỏ, 2 – 3 đầu, thân phình to ra, đuôi cong hình móc câu, búi tóc… Tỉ lệ tinh trùng kỳ hình đƣợc tính theo công thức: %K = (Tổng số tinh trùng kỳ hình / Tổng số đếm đƣợc) * 100% d/ Đánh giá tỉ lệ tinh trùng sống và còn nguyên acrosome (SC) Sử dụng kỹ thuật nhuộm của Kovács (1992): + Dùng đũa thủy tinh lấy một giọt tinh đặt lên phiến kính sạch khô. + Thêm 1 giọt dung dịch NaCl 1%, trộn đều. + Thêm 1 giọt dung dịch trypan blue, trộn đều. + Dùng cạnh một phiến kính khác phết nhẹ hỗn hợp này để dàn mỏng tinh trùng trên mặt phiến kính. + Để khô tự nhiên (2 – 5 phút). + Đặt phiến kính đã khô này vào dung dịch hãm màu, 2 phút. + Rửa sạch dƣới vòi nƣớc máy, rửa lại bằng nƣớc cất 2 lần. + Nhúng ngập phiến kính đã khô vào dung dịch nhuộm, 4 giờ, 370C. + Rửa sạch dƣới vòi nƣớc máy, ngâm trong nƣớc cất 2 phút. + Để khô tự nhiên (2 – 5 phút). + Đậy lá kính, nhỏ một giọt dầu xem kính, đếm tổng số 200 tinh trùng ở vật kính 100 và tính tỉ lệ tinh trùng sống, còn nguyên acrosome. Khi quan sát tinh trùng chó, thấy phần đầu tinh trùng bắt màu hồng mịn đều là tinh trùng còn acrosome và phần sau đầu tinh trùng có màu trắng là tinh trùng còn sống. Tỉ lệ tinh trùng sống và còn nguyên acrosome đƣợc tính theo công thức: % SC = (Tổng số tinh trùng sống còn acrosome / Tổng số đếm đƣợc) * 100% e/ Đánh giá cƣờng độ hoạt động của tinh trùng (CĐ) Chỉ tiêu này đƣợc ghi nhận thêm để phản ánh đầy đủ hơn hoạt động của tinh trùng. Tiến hành: dùng đũa thủy tinh lấy một giọt tinh đặt lên phiến kính sạch khô, đậy lá kính lên mẫu tinh này và xem ở vật kính 10 và 40. Đánh giá cƣờng độ hoạt động của tinh trùng dựa trên tốc độ vận động của tinh trùng đƣợc quan sát, ƣớc lƣợng trên kính hiển vi ở vật kính 10 và 40. Cƣờng độ hoạt động của tinh trùng tại thời điểm 0 giờ đƣợc ghi nhận là 1 (cƣờng độ gốc). Tùy vào sự tăng hay giảm cƣờng độ hoạt động của tinh trùng ở thời điểm bảo quản 0, 24, 34 48 giờ hay trƣớc và sau phản ứng hoạt hóa, cƣờng độ hoạt động của tinh trùng đƣợc tính bằng công thức: CD = số lần tăng hoặc giảm cƣờng độ hoạt động so với cƣờng độ gốc 3.5. Xử lí số liệu Số liệu đƣợc xử lý bằng trắc nghiệm F và chi – square trên phần mềm Statgraphics 7.0. 35 PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Thí nghiệm 1: so sánh hai phƣơng pháp thu thập tế bào biểu mô ống dẫn trứng Tế bào biểu mô ống dẫn trứng của chó đƣợc thu thập 7 lần với tổng số là 14 đĩa (2 – 3 ống dẫn trứng/đĩa): 7 đĩa đƣợc thu thập bằng phƣơng pháp vuốt và 7 đĩa đƣợc thu thập bằng phƣơng pháp cạo. Cả hai phƣơng pháp này đều thu thập đƣợc tế bào biểu mô ống dẫn trứng dƣới dạng mảnh mô nhƣ Xu và ctv (1992) đã mô tả. Số đĩa bị nhiễm vi sinh vật đƣợc thu nhận từ phƣơng pháp vuốt ít hơn phƣơng pháp cạo, tƣơng ứng là 0% và 14,3% (một đĩa có môi trƣờng chuyển sang màu vàng). Do kích thƣớc ống dẫn trứng của chó rất nhỏ (đƣờng kính 0,5 – 0,8 mm), gây trở ngại thao tác trong phƣơng pháp cạo nhƣ dễ cạo phạm vào lớp đệm của tầng niêm mạc và lớp cơ trơn của tầng cơ nên khi thao tác cạo đòi hỏi phải đặt mẫu lên các đầu ngón tay để làm điểm tựa và phải đặt cận mắt (sát cửa tủ cấy) làm tăng khả năng nhiễm vi sinh vật. Ngoài ra, trong phƣơng pháp vuốt, tiến hành vuốt theo chiều dọc của ống dẫn trứng, còn phƣơng pháp cạo chỉ cạo cục bộ từng phần của ống dẫn trứng nên thời gian thực hiện của thao tác vuốt nhanh hơn thao tác cạo, tƣơng ứng là 30 giây và 60 giây. Tế bào biểu mô ống dẫn trứng ở ngoài môi trƣờng dinh dƣỡng càng lâu thì càng bất lợi cho khả năng tồn tại của tế bào. Vì vậy phƣơng pháp vuốt cho khả năng thu thập tế bào biểu mô ống dẫn trứng tốt hơn phƣơng pháp cạo. 4.2. Thí nghiệm 2: so sánh 2 phƣơng pháp nuôi cấy tế bào ống dẫn trứng Sau khi thu nhận tế bào biểu mô ống dẫn trứng, nuôi cấy theo 2 phƣơng pháp: sử dụng lá kính (lamelle) và không sử dụng lá kính. Kết quả xuất hiện cấu trúc “bóng nƣớc” (vesicle - like) đƣợc trình bày ở bảng 4.1. Bảng 4.1. Sự xuất hiện cấu trúc “bóng nƣớc” của 2 phƣơng pháp nuôi cấy Phƣơng pháp Số đĩa có xuất hiện “bóng nƣớc” Số đĩa không có xuất hiện “bóng nƣớc” Tỉ lệ % đĩa có xuất hiện “bóng nƣớc” p Sử dụng lá kính 2 5 28,6 0,0021 Không sử dụng lá kính 0 7 0 36 Bảng 4.1 cho thấy phƣơng pháp nuôi cấy tế bào biểu mô ống dẫn trứng sử dụng lá kính và phƣơng pháp không sử dụng lá kính có sự khác biệt rất ý nghĩa (p < 0,01) khi xét chỉ tiêu có hay không có sự xuất hiện của cấu trúc “bóng nƣớc” mà Xu và ctv (1992) đã mô tả. Cấu trúc “bóng nƣớc” bắt đầu xuất hiện vào ngày thứ 3 nuôi cấy (hình 4.1) giống nhƣ kết quả mà Xu và ctv (1992) đã ghi nhận. Nhƣ vậy, tỉ lệ đĩa nuôi cấy đạt chỉ tiêu đánh giá của phƣơng pháp có sử dụng lá kính (28,6%) cao hơn phƣơng pháp không sử dụng lá kính (0%). Những mảnh tế bào biểu mô đƣợc lá kính cố định sẽ giảm dao động trong quá trình di chuyển và quan sát đĩa dƣới kính hiển vi, do đó lá kính có thể đóng vai trò nhƣ một giá đỡ tế bào. Hơn nữa, trọng lực lá kính sẽ tạo áp lực bề mặt giúp một số tế bào tiếp xúc với đĩa có khả năng bám tốt hơn. Để chứng minh cho sự tồn tại của tế bào ống dẫn trứng chó gắn liền với sự xuất hiện cấu trúc “bóng nƣớc”, đĩa có xuất hiện cấu trúc “bóng nƣớc” đƣợc nhuộm trypan blue vào ngày thứ 14 nuôi cấy. Kết quả nhuộm cho thấy: bên cạnh những tế bào chết trong đĩa vẫn còn những tế bào có khả năng tồn tại (hình 4.2) và tỉ lệ tế bào sống trung bình là 44%. Hình 4.2 Tế bào sống (mũi tên) và tế bào chết (trong vòng tròn) (x 200) Hình 4.1 Cấu trúc “bóng nƣớc” (mũi tên) sau 3 ngày nuôi cấy (x 400) 37 4.3. Thí nghiệm 3: ảnh hƣởng của thời gian bảo quản và phản ứng hoạt hóa lên chất lƣợng tinh trùng 4.3.1. Hoạt lực của tinh trùng Hoạt lực của tinh trùng dƣới tác động bởi 2 yếu tố: thời gian bảo quản và phản ứng hoạt hoá đƣợc trình bày ở bảng 4.2. Bảng 4.2 Thay đổi hoạt lực của tinh trùng Thời gian bảo quản 0 giờ 24 giờ 48 giờ Phản ứng hoạt hóa Trƣớc hoạt hóa Sau hoạt hóa Trƣớc hoạt hóa Sau hoạt hóa Trƣớc hoạt hóa Sau hoạt hóa Hoạt lực 0,72 ± 0,08 0,78 ± 0,08 0,65 ± 0,06 0,75 ± 0,06 0,53 ± 0,05 0,77 ± 0,05 n 6 PTG 0,0017 PPƢ 0,0000 PTG - PƢ 0,0057 Ghi chú: n: số lần lập lại PTG: xác suất sai lầm của yếu tố thời gian bảo quản PPƢ: xác suất sai lầm của yếu tố phản ứng hoạt hóa PTG – PƢ: xác suất sai lầm của sự tƣơng tác giữa 2 yếu tố thời gian bảo quản và phản ứng hoạt hóa tinh trùng 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 0 giờ 24 giờ 48 giờ Thời gian bảo quản Ho ạt Lự c Trước hoạt hoá Sau hoạt hoá Biểu đồ 4.1 So sánh hoạt lực của tinh trùng Kết quả bảng 4.2 cho thấy hoạt lực của tinh trùng ở các mốc thời gian bảo quản (0 giờ, 24 giờ và 48 giờ) có khác biệt rất ý nghĩa (PTG < 0,01). Hoạt lực của tinh trùng 38 giảm dần theo thời gian bảo quản, kết quả này phù hợp với ghi nhận của Thái Thị Mỹ Hạnh (2005). Hoạt lực của tinh trùng trƣớc và sau phản ứng hoạt hóa cũng có sự khác biệt rất cao (PPƢ < 0,001). Hoạt lực của tinh trùng sau phản ứng hoạt hóa cao hơn trƣớc khi hoạt hóa, kết quả này phù hợp với báo cáo của Younglai và ctv (2001). Tinh trùng thu đƣợc sau quá trình hoạt hóa là những tinh trùng có khả năng bơi lội tốt (Phan Trƣờng Duyệt và Phan Khanh Vy, 2001). Sự tƣơng tác giữa 2 yếu tố thời gian bảo quản và phản ứng hoạt hóa rất có ý nghĩa (PTG – PƢ < 0,01). Nhƣ vậy, yếu tố thời gian bảo quản có ảnh hƣởng đến hoạt lực của tinh trùng thu đƣợc sau phản ứng hoạt hóa. 4.3.2. Nồng độ của tinh trùng Nồng độ tinh trùng cũng đƣợc khảo sát trƣớc tác động của thời gian bảo quản và phản ứng hoạt hóa. Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 4.3. Bảng 4.3 Thay đổi nồng độ tinh trùng Thời gian bảo quản 0 giờ 24 giờ 48 giờ Phản ứng hoạt hóa Trƣớc hoạt hóa Sau hoạt hóa Trƣớc hoạt hóa Sau hoạt hóa Trƣớc hoạt hóa Sau hoạt hóa Nồng độ (x 10 6 /ml) 130 ± 36,68 9,83 ± 2,91 130 ± 36,68 2,77 ± 1,30 130 ± 36,88 1,58 ± 0,87 n 6 PTG 0,2323 PPƢ 0,0000 PTG – PƢ 0,2323 0 20 40 60 80 100 120 140 0 giờ 24 giờ 48 giờ Thời gian bảo quản Nồ ng độ (x 10 00 00 0/m l) Trước hoạt hóa Sau hoạt hóa Biểu đồ 4.2 So sánh nồng độ của tinh trùng 39 Kết quả bảng 4.3 cho thấy nồng độ của tinh trùng thay đổi không có ý nghĩa (PTG > 0,05) giữa các mốc thời gian bảo quản (0 giờ, 24 giờ và 48 giờ). Ngƣợc lại, nồng độ của tinh trùng trƣớc và sau phản ứng hoạt hóa có khác biệt rất cao (PPƢ < 0,001). Nồng độ của tinh trùng sau phản ứng hoạt hóa thấp hơn trƣớc phản ứng, kết quả này phù hợp với kết quả của Younglai và ctv (2001). Sự tƣơng tác giữa 2 yếu tố thời gian bảo quản và phản ứng hoạt hóa không có ý nghĩa (PTG – PƢ > 0,05). Nhƣ vậy, bảo quản trong 48 giờ không ảnh hƣởng đến nồng độ của tinh trùng thu đƣợc sau phản ứng hoạt hóa. 4.3.3. Tỉ lệ tinh trùng kỳ hình Tỉ lệ tinh trùng kỳ hình cũng đƣợc khảo sát trƣớc tác động của thời gian bảo quản và phản ứng hoạt hóa, kết quả đƣợc trình bày ở bảng 4.4. Bảng 4.4 Sự biến thiên của tỉ lệ tinh trùng kỳ hình Thời gian bảo quản 0 giờ 24 giờ 48 giờ Phản ứng hoạt hóa Trƣớc hoạt hóa Sau hoạt hóa Trƣớc hoạt hóa Sau hoạt hóa Trƣớc hoạt hóa Sau hoạt hóa Kỳ hình (%) 16,08 ± 3,11 6,18 ± 0,78 16,08 ± 3,11 6,93 ± 2,07 16,08 ± 3,11 6,18 ± 1,63 n 6 PTG 0,9118 PPƢ 0,0000 PTG – PƢ 0,9118 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 0 giờ 24 giờ 48 giờ Thời gian bảo quản Kỳ h ìn h (% ) Trước hoạt hóa Sau hoạt hóa Biểu đồ 4.3 So sánh tỉ lệ tinh trùng kỳ hình Bảng 4.4 cho thấy tỉ lệ tinh trùng kỳ hình thay đổi không ý nghĩa (PTG > 0,05) giữa các mốc thời gian bảo quản (0 giờ, 24 giờ và 48 giờ). Ngƣợc lại, tỉ lệ tinh trùng 40 kỳ hình sau phản ứng hoạt hóa đã giảm rất ý nghĩa (PPƢ < 0,001) so với trƣớc phản ứng, kết quả này phù hợp với báo cáo của Younglai và ctv (2001). Tinh trùng kỳ hình thƣờng có khả năng bơi lội kém hoặc không có khả năng bơi lội nên phần tinh trùng thu đƣợc sau quá trình hoạt hóa ít có tinh trùng kỳ hình. Tƣơng tự trƣờng hợp thụ tinh in vivo, trong tử cung và dịch ống dẫn trứng tỉ lệ tinh trùng kỳ hình thấp hơn so với trong tinh dịch nguyên (Nguyễn Tấn Anh và Nguyễn Quốc Đạt, 1997). Sự tƣơng tác giữa 2 yếu tố thời gian bảo quản và phản ứng hoạt hóa không có ý nghĩa (PTG – PƢ > 0,05). Nhƣ vậy, thời gian bảo quản không ảnh hƣởng đến tỉ lệ kỳ hình của tinh trùng thu đƣợc sau phản ứng hoạt hóa. 4.3.4. Tỉ lệ tinh trùng sống, còn nguyên vẹn acrosome Tỉ lệ tinh trùng sống còn nguyên acrosome cũng đƣợc khảo sát trƣớc tác động của thời gian bảo quản và phản ứng hoạt hóa, đƣợc trình bày ở bảng 4.5. Bảng 4.5 Sự biến thiên của tỉ lệ tinh trùng sống, còn nguyên vẹn acrosome Thời gian bảo quản 0 giờ 24 giờ 48 giờ Phản ứng hoạt hóa Trƣớc hoạt hóa Sau hoạt hóa Trƣớc hoạt hóa Sau hoạt hóa Trƣớc hoạt hóa Sau hoạt hóa Sống còn acrosome (%) 80,75 ± 3,82 36,38 ± 8,48 74,33 ± 4,89 26,38 ± 3,80 67,42 ± 5,02 27,8 ± 5,28 n 6 PTG 0,0001 PPƢ 0,0000 PTG - PƢ 0,1879 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 0 giờ 24 giờ 48 giờ Thời gian bảo quản Số ng cò n ac ro so m e ( % ) Trước hoạt hóa Sau hoạt hóa Biểu đồ 4.4 So sánh tỉ lệ tinh trùng sống và còn nguyên acrosome 41 Bảng 4.5 cho thấy tỉ lệ tinh trùng sống và còn nguyên vẹn acrosome giảm dần theo thời gian bảo quản (PTG < 0,001). Kết quả này phù hợp với kết luận của Thái Thị Mỹ Hạnh (2005). Ngoài ra, tỉ lệ tinh trùng sống và còn nguyên vẹn acrosome sau phản ứng hoạt hóa thấp hơn trƣớc phản ứng (PPƢ < 0,001)(hình 4.3 và hình 4.4). Nồng độ Ca 2+ cao trong môi trƣờng Sperm – TALP – 1 sẽ làm tăng phản ứng acrosome của tinh trùng (Sirivaidyapong và ctv, 1999). Thêm vào đó, sự hiện diện của thụ quan cholesterol (BSA) làm mất sự ổn định màng tinh trùng (trích dẫn từ Huỳnh Thị Lệ Duyên, 2003). Hai nguyên nhân này có lẽ liên quan đến dẫn liệu của Nguyễn Tấn Anh và Nguyễn Quốc Đạt (1997); theo tác giả sự phân bố lại các protein của màng sinh chất quanh acrosome và những thay đổi trong thành phần các lipid của màng sinh chất và màng ngoài acrosome có khả năng làm rách màng acrosome. Do đó sau khi hoạt hóa, tinh trùng có thể bị rách màng acrosome (hình 4.4). Điều này có lẽ trở thành cở sở cho việc phóng thích enzyme hyaluronidase để phân hủy sự liên kết của các tế bào hạt (cumulus cell) bao quanh tế bào trứng trong quá trình thụ tinh. Sự tƣơng tác giữa 2 yếu tố thời gian bảo quản và phản ứng hoạt hóa không có ý nghĩa (PTG – PƢ > 0,05). Nhƣ vậy, bảo quản trong 48 giờ không ảnh hƣởng đến tỉ lệ sống và còn nguyên vẹn acrosome của tinh trùng sau phản ứng hoạt hóa. Hình 4.3 Tinh trùng đƣợc nhuộm Hình 4.4 Tinh trùng nhuộm (x 1000) trƣớc phản ứng hoạt hóa (x 1000) sau phản ứng hoạt hóa có màng acrosome không đồng nhất (mũi tên) 4.3.5. Cƣờng độ hoạt động của tinh trùng Cƣờng độ hoạt động của tinh trùng cũng đƣợc khảo sát trƣớc tác động của thời gian bảo quản và phản ứng hoạt hóa. Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 4.6. 42 Bảng 4.6 Sự thay đổi cƣờng độ hoạt động của tinh trùng Thời gian bảo quản 0 giờ 24 giờ 48 giờ Phản ứng hoạt hóa Trƣớc hoạt hóa Sau hoạt hóa Trƣớc hoạt hóa Sau hoạt hóa Trƣớc hoạt hóa Sau hoạt hóa Cƣờng độ hoạt động 1 ± 0,00 6,33 ± 1,03 0,94 ± 0,02 4,4 ± 0,81 0,88 ± 0,03 2,95 ± 0,51 n 6 PTG 0,0000 PPƢ 0,0000 PTG - PƢ 0,0000 0 1 2 4 5 6 7 0 giờ 24 giờ 48 giờ Thời gian bảo quản Cư ờn g độ Trước hoạt hóa Sau hoạt hóa Biểu đồ 4.5 So sánh cƣờng độ hoạt động của tinh trùng Kết quả bảng 4.6 cho thấy cƣờng độ hoạt động của tinh trùng thay đổi rất ý nghĩa (PTG < 0,001)giữa các mốc thời gian bảo quản (0 giờ, 24 giờ và 48 giờ) . Cƣờng độ hoạt động của tinh trùng cao nhất ở mốc thời gian là 0 giờ và giảm dần theo thời gian bảo quản. Có lẽ tinh trùng đã tiêu tốn năng lƣợng khá nhiều cho việc di chuyển trong môi trƣờng bảo quản. Tinh trùng có đặc tính luôn chuyển động về phía trƣớc (Trần Tiến Dũng, 2002). Cƣờng độ hoạt động của tinh trùng trƣớc và sau phản ứng hoạt hóa cũng thay đổi rất ý nghĩa(PPƢ < 0,001). Sau phản ứng hoạt hóa cƣờng độ hoạt động của tinh trùng đƣợc cải thiện. Trong môi trƣờng Tris – glucose, sự hiện diện của lòng đỏ trứng và citrate natri làm tăng độ nhớt của môi trƣờng nên làm hạn chế hoạt động của tinh trùng (trích dẫn từ Thái Thị Mỹ Hạnh, 2005). Do đó cƣờng độ hoạt động của tinh trùng trong môi trƣờng Tris – glucose thấp hơn trong tinh nguyên và trong môi trƣờng 43 Sperm – TALP – 1. Ngoài ra pH của môi trƣờng Tris – glucose hơi toan tính (6,82) nên sức hoạt động của tinh trùng bị ức chế (trích dẫn từ Thái Thị Mỹ Hạnh, 2005). Ngƣợc lại pH của môi trƣờng Sperm – TALP – 1 hơi kiềm tính (7,21) thì sức hoạt động của tinh trùng đƣợc tăng cƣờng (Nguyễn Tấn Anh và Nguyễn Quốc Đạt, 1997). Sự tƣơng tác giữa thời gian bảo quản và phản ứng hoạt hóa rất ý nghĩa (PTG – PƢ < 0,001). Nhƣ vậy, thời gian bảo quản có ảnh hƣởng đến cƣờng độ hoạt động của tinh trùng thu đƣợc sau phản ứng hoạt hóa. Tóm lại, thí nghiệm 3 cho thấy chất lƣợng tinh trùng thu đƣợc sau phản ứng hoạt hóa ở mốc thời gian khảo sát 0 giờ là tốt nhất. Tinh trùng đƣợc hoạt hóa ngay sau khi pha loãng có hoạt lực trung bình cao nhất (0,78 ± 0,08) và cƣờng độ hoạt động trung bình cũng cao nhất (6,33 ± 1,03). Do đó, khi thụ tinh in vitro nên chọn tinh trùng đƣợc hoạt hóa ngay sau khi pha loãng. Tuy nhiên, để kết luận đƣợc chính xác hơn, cần chọn cả 3 mẫu tinh trùng đƣợc hoạt hóa ở các mốc thời gian bảo quản 0 giờ, 24 giờ và 48 giờ tiến hành thụ tinh in vitro. Tỉ lệ phôi 2 tế bào đƣợc tạo ra từ quá trình thụ tinh này là chỉ tiêu quyết định trong việc đánh giá chất lƣợng tinh trùng sau khi hoạt hóa ở các mốc thời gian bảo quản khác nhau (0 giờ, 24 giờ và 48 giờ). Trong quá trình khảo sát 5 chỉ tiêu nêu trên, một đặc điểm khác của tinh trùng cũng đƣợc quan sát. Tinh trùng có đặc tính tiếp xúc với vật lạ (Trần Tiến Dũng, 2002). Do đó trƣớc khi hoạt hóa, tinh trùng chỉ tiếp xúc với vật lạ (nếu có) mà không tiếp xúc với nhau. Tuy nhiên, sau khi hoạt hóa thì tinh trùng thƣờng hay tiếp xúc lẫn nhau (hình 4.5). Các cation hóa trị 2 trong môi trƣờng Sperm – TALP – 1 (Ca2+ với nồng độ cao, Mg 2+) làm mất điện tích bề mặt tinh trùng nên tinh trùng tụ dính lại (Nguyễn Tấn Anh và Nguyễn Quốc Đạt, 1997). Những tinh trùng trƣớc phản ứng hoạt hóa không tụ dính với nhau, có lẽ do bề mặt của chúng có cùng điện tích. Hình 4.5 Hiện tƣợng tụ dính tinh trùng (x 400) 44 PHẦN V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận - Thu thập tế bào biểu mô ống dẫn trứng bằng phƣơng pháp vuốt xảy ra ngắn hơn và nuôi cấy ít bị nhiễm hơn phƣơng pháp cạo. - Nuôi cấy tế bào biểu mô ống dẫn trứng bằng phƣơng pháp sử dụng lá kính (lamelle) cho tỉ lệ thành công là 28,6%, cao hơn so với phƣơng pháp không sử dụng lá kính (0%). - Thời gian bảo quản và phản ứng hoạt hóa có ảnh hƣởng đến chất lƣợng tinh trùng. Chất lƣợng của tinh trùng hoạt hóa ngay sau khi pha loãng là tốt nhất. 5.2. Đề nghị - Tiến hành thêm nhiều thí nghiệm để nâng cao tỉ lệ thành công khi nuôi cấy tế bào biểu mô ống dẫn trứng. - Thụ tinh in vitro đối với tinh trùng vừa đƣợc bảo quản và hoạt hóa. - Đồng nuôi cấy tế bào biểu mô ống dẫn trứng với noãn và phôi, nhằm nâng cao tỉ lệ trứng chín và làm tăng chất lƣợng của phôi đƣợc nuôi cấy trong điều kiện in vitro. 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT 1. Nguyễn Tấn Anh và Nguyễn Quốc Đạt, 1997. Thụ tinh nhân tạo gia súc gia cầm. Nxb Nông Nghiệp Tp. Hồ Chí Minh. 2. Nguyễn Tƣờng Anh, 2002. Sự đa dạng, sự sinh sản và phát triển của động vật. Nxb Đại Học Quốc Gia Tp. Hồ Chí Minh. 3. Trịnh Bình, Phạm Phan Dịch, Đỗ Kính, 2004. Mô học. Nxb Y Học, Hà Nội. 4. Trần Tiến Dũng, Dƣơng Đình Long, Nguyễn Văn Thanh, 2002. Sinh sản gia súc. Nxb Nông Nghiệp, Hà Nội. 5. Huỳnh Thị Lệ Duyên, 2003. Ứng dụng kĩ thuật thụ tinh in vitro và PCR xác định giới tính trên heo. Luận văn thạc sĩ, Đại học Khoa Học Tự Nhiên Tp. Hồ Chí Minh. 6. Phan Trƣờng Duyệt, Phan Khanh Vy, 2001. Thụ tinh trong ống nghiệm. Nxb Y Học, Hà Nội. 7. Thái Thị Mỹ Hạnh, 2005. Khảo sát khả năng khai thác tinh trên chó và khả năng bảo quản của một số môi trường pha chế tinh. Luận văn thạc sĩ, Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. 8. Hoàng Kim Giao, 2003. Công nghệ cấy truyền phôi ở gia súc. Nxb Khoa Học và Kĩ Thuật, Hà Nội. 9. Trịnh Hữu Hằng, Đỗ Công Huỳnh, 2001. Sinh lí học người và động vật. Nxb Khoa Học và Kỹ Thuật, Hà Nội. 10. Nhan Ngọc Hiền, 2005. Xây dựng quy trình nuôi cấy nguyên bào sợi phù hợp điều kiện Việt Nam. Đề tài nghiên cứu khoa học, trung tâm đào tạo bồi dƣỡng cán bộ y tế Tp. Hồ Chí Minh. 11. Nguyễn Nhƣ Hiền, 2005. Sinh học phân tử và tế bào – cơ sở khoa học của công nghệ sinh học. Nxb Giáo Dục. 12. Hoàng Tích Huyền, Đào Văn Phan, Nguyễn Trọng Thông, 2001. Dược lí học. Nxb Y Học Hà Nội. 13. Phan Kim Ngọc, 2002. Giáo trình thực tập cơ sở công nghệ sinh học động vật. Nxb Đại Học Quốc Gia Tp. Hồ Chí Minh. 14. Nguyễn Văn Thuận, 2005. Tài liệu giảng dạy môn công nghệ sinh học trong chăn nuôi. Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. 46 TIẾNG ANH 15. Bogliolo L., Zedda T. M., Ledda S., Leoni G., Naitana S., Pau S., 2002. Influence of co-culture with oviductal epithelial cells on in vitro maturation of canine oocytes. Preprod. Nutr. Dev 42: 265-273. 16. Farstad W., 2000. Current state in biotechnology in canine and feline reproduction. Animal Reproduction Science 60: 375-387. 17. Farstad W., 2000. Assisted reproductive technology in canid species. Therigenology 53: 175-186. 18. Fartad W., Hyttel P., Grondahl C., Krongenes A., Mondain-Monval M. and Hafne A.L., 1993. Fertilization in vitro of oocytes matured in vivo in the blue fox (Alopex lagopus). Journals of Reproductive & Fertility 47: 219-226. 19. Freshney I. R., 1987. Culture of animal cells – a manual of basic technique. Alan R. Liss, Inc., New York. 20. Iguer-ouada M. and Verstegen J.P., 2001. Long-term preservation of chilled canine semen: effect of commercial and laboratory prepared extenders. Theriogenology 55: 671-684. 21. Jenkins N., 1999. Animal cell Biotechnology methods and protocols. Humana Press, Inc. Totowa, New Jersey. 22. Sirivaidyapong S., Cheng F. P., Marks A., Voorhout W. F., Bevers M. M. and Colenbrander B., 2000. Effect of sperm on the acrosome reaction in canine sperm. Theriogenology 53: 789-802. 23. Xu K. P., Yadav B. R., Rorie R. W., Plante, Betteridge K. J. và King W. A., 1992. Development and viability of bovine embryos derived oocytes matured and fertilized in vitro and co-cultured with bovine oviducal epithelial cells. J. Reprod. Fert 94: 33-43. 24. Younglai E.V., Holt D., Brown P., Jurisicova A. and Casper R.F., 2001. Sperm swim-up techniques and DNA fragmentation. Human Reproduction 16 (9): 1950-1953. 47 PHỤ LỤC 1. So sánh 2 phƣơng pháp nuôi cấy tế bào biểu mô ông dẫn trứng Summary Statistics for Contingency Tables (Page 1) -------------------------------------------------------------------------------- Chi-square D.F. Significance --------------------------------------------------------------------- 11.6667 1 6.36300E-4 9.45000 1 2.11149E-3 with Yates correction With rows With columns Statistic Symmetric dependent dependent --------------------------------------------------------------------- Lambda 0.22222 0.00000 0.28571 Uncertainty Coeff. 0.20119 0.27061 0.16011 Somer's D 0.38356 0.28571 0.58333 2. Khảo sát hoạt lực tinh trùng Analysis of Variance for XULITK.HL - Type III Sums of Squares -------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level -------------------------------------------------------------------------------- MAIN EFFECTS A:XULITK.THOI_GIAN .0600000 2 .0300000 7.941 .0017 B:XULITK.HOAT_HOA .1600000 1 .1600000 42.353 .0000 INTERACTIONS AB .0466667 2 .0233333 6.176 .0057 RESIDUAL .1133333 30 .0037778 -------------------------------------------------------------------------------- TOTAL (CORRECTED) .3800000 35 -------------------------------------------------------------------------------- 0 missing values have been excluded. All F-ratios are based on the residual mean square error. 3. Khảo sát nồng độ tinh trùng Trắc nghiệm về sự đồng nhất của các biến lƣợng: Chi-Square Goodness-of-Fit Test ---------------------------------------- Observed Expected Frequency Frequency Chi-Square ---------------------------------------- 1345 677 660 8 677 660 1345 677 660 2 677 674 1360 677 689 1 677 675 ---------------------------------------- Chi-square = 4018.62 with 5 d.f. Sig. level = 0 Chuyển đổi số liệu sang căn bậc hai của số liệu và trắc nghiệm về sự đồng nhất các biến lƣợng của số liệu mới: Chi-Square Goodness-of-Fit Test ---------------------------------------- Observed Expected Frequency Frequency Chi-Square ---------------------------------------- 7 5.3 .501 4 5.3 .501 ---------------------------------------- Chi-square = 1.00194 with 1 d.f. Sig. level = 0.316841 48 Kết quả phân tích biến lƣợng cho số liệu đã chuyển đổi: Analysis of Variance for XULITK.ND4 - Type III Sums of Squares -------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level -------------------------------------------------------------------------------- MAIN EFFECTS A:XULITK.TG 5.60527 2 2.80264 1.536 .2323 B:XULITK.HH 751.94102 1 751.94102 412.056 .0000 INTERACTIONS AB 5.6052716 2 2.8026358 1.536 .2323 RESIDUAL 52.920717 29 1.8248523 -------------------------------------------------------------------------------- TOTAL (CORRECTED) 811.66562 34 -------------------------------------------------------------------------------- 1 missing values have been excluded. All F-ratios are based on the residual mean square error 4. Khảo sát tỉ lệ tinh trùng kỳ hình Analysis of Variance for XULITK.KH - Type III Sums of Squares -------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level -------------------------------------------------------------------------------- MAIN EFFECTS A:XULITK.THOI_GIAN 1.12500 2 .56250 .093 .9118 B:XULITK.HOAT_HOA 838.10250 1 838.10250 138.001 .0000 INTERACTIONS AB 1.1250000 2 .5625000 .093 .9118 RESIDUAL 182.19500 30 6.0731667 -------------------------------------------------------------------------------- TOTAL (CORRECTED) 1022.5475 35 -------------------------------------------------------------------------------- 0 missing values have been excluded. All F-ratios are based on the residual mean square error. 5. Khảo sát tỉ lệ tinh trùng sống và còn nguyên acrrosome Analysis of Variance for XULITK.SC - Type III Sums of Squares -------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level -------------------------------------------------------------------------------- MAIN EFFECTS A:XULITK.THOI_GIAN 780.097 2 390.049 13.158 .0001 B:XULITK.HOAT_HOA 17406.404 1 17406.404 587.199 .0000 INTERACTIONS AB 104.84722 2 52.423611 1.768 .1879 RESIDUAL 889.29333 30 29.643111 -------------------------------------------------------------------------------- TOTAL (CORRECTED) 19180.642 35 -------------------------------------------------------------------------------- 0 missing values have been excluded. All F-ratios are based on the residual mean square error. 6. Khảo sát cƣờng độ hoạt động của tinh trùng Analysis of Variance for XULITK.CD - Type III Sums of Squares -------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level -------------------------------------------------------------------------------- MAIN EFFECTS A:XULITK.THOI_GIAN 18.49181 2 9.24590 27.951 .0000 B:XULITK.HOAT_HOA 117.90340 1 117.90340 356.428 .0000 INTERACTIONS AB 16.123472 2 8.0617361 24.371 .0000 RESIDUAL 9.9237500 30 .3307917 -------------------------------------------------------------------------------- TOTAL (CORRECTED) 162.44243 35 -------------------------------------------------------------------------------- 0 missing values have been excluded. All F-ratios are based on the residual mean square error.