Luận văn Nghiên cứu ảnh hưởng của resveratrol lên sự bám dính của các dòng tế bào ung thư DLD-1 và HL-60

Chương 3. Kết quả - Thảo luận 31 Chương 3 Kết quả - Thảo luận Trong nghiên cứu này, chúng tôi tìm hiểu ảnh hưởng của RV lên: - Sự bám dính của hai dòng tế bào ung thư HL-60 và DLD-1. - Sự biểu hiện và phosphoryl hóa của FAK, một protein chủ chốt điều hòa quá trình bám dính. HL-60, dòng tế bào ung thư bạch cầu có hình thái lơ lửng, không bám, được chọn làm mô hình nghiên cứu dựa trên giả thiết RV tăng cường khả năng bám dính của tế bào ung thư. DLD-1 là dòng tế bào ung thư ruột kết có hình thái bám và hơn nữa, kết quả ban đầu của nhóm cho thấy RV làm tăng tính bám của dòng tế bào này trên bề mặt nuôi cấy. Chúng tôi nghiên cứu ảnh hưởng của RV lên sự bám dính của tế bào HL-60 và DLD-1 trên fibronectin trong môi trường không huyết thanh và trên bề mặt nuôi cấy thông thường trong môi trường 10% huyết thanh. Khi tế bào được nuôi cấy trong môi trường có huyết thanh, một số protein của chất nền ngoại bào có trong huyết thanh như fibronectin, vitronectin tạo thành giá thể trên bề mặt nuôi cấy, giúp tế bào bám và tăng trưởng [10]. Tương tác bám này được hình thành bởi sự gắn của một số thụ thể trên màng tế bào lên các protein chất nền. Mỗi protein chất nền lại tương tác chuyên biệt với một số thụ thể [10]. Do đó, người ta thường nghiên cứu sự bám dính của tế bào trên từng protein chất nền riêng rẽ trong môi trường thiếu huyết Chương 3. Kết quả - Thảo luận 32 thanh để có thể khưu trú những thụ thể chuyên biệt tham gia vào quá trình bám dính. Ngoài ra, nghiên cứu của Rodrigue và cs (2005) cho thấy RV đã cảm ứng sự gia tăng một cách rõ rệt tính bám dính của dòng tế bào ung thư máu K562 và ung thư vú MCF-7 trên giá thể fibronectin [41]. 3.1. Dòng tế bào HL-60 3.1.1. Ảnh hưởng của RV lên sự tăng sinh và sức sống của tế bào HL-60 Việc xác định tác động của các nồng độ khác nhau của RV lên sự tăng sinh và sức sống của tế bào HL-60 là cần thiết để lựa chọn nồng độ RV thích hợp cho nghiên cứu bám dính sau này. Nồng độ RV được chọn phải không ảnh hưởng nhiều đến sức sống và có khả năng ức chế sự tăng sinh của tế bào. Tế bào HL-60 được nuôi cấy trong môi trường chứa các nồng độ tăng dần của RV (7,5; 15; 30; 60; và 120 µM) hoặc DMSO ở nồng độ 0,1% (mẫu không xử lý) trong 24 và 48 giờ. Chúng tôi sử dụng phương pháp đếm tế bào với máy đếm tự động và thử nghiệm trypan blue để xác định ảnh hưởng của RV lên sự tăng sinh và sức sống của dòng tế bào HL-60. Kết quả cho thấy tác động ức chế tăng sinh và giảm sức sống của RV trên dòng tế bào HL-60 tăng theo nồng độ và thời gian xử lý (hình 3.1 và 3.2). Ở nồng độ thấp 15 µM, RV ức chế vừa phải sự tăng sinh của tế bào HL-60 mà không ảnh hưởng đến sức sống trong suốt quá trình ủ. Trong khi ở những nồng độ cao hơn, 30 và 60 µM, RV gần như làm dừng hoàn toàn sự tăng sinh của tế bào 48 giờ ủ. Ở nồng độ thử nghiệm cao nhất, 120 µM, RV dường như trở nên độc với tế bào HL-60 và làm giảm số lượng tế bào sau cả 24 và 48 giờ xử lý so với trước khi xử lý. Điều này còn được chứng minh qua sự giảm đáng kể tỉ lệ sống của tế bào HL-60, RV ở nồng độ 120 µM gây vỡ màng tế bào và làm chết tế bào HL-60. Chương 3. Kết quả - Thảo luận 33 200000 300000 400000 500000 600000 700000 800000 0 12 24 36 48 Thời gian ủ với RV (giờ) S ố tế b ào Không xử lý RV 7,5 µM RV 15 µM RV 30 µM RV 60 µM RV 120 µM Hình 3.1. Ảnh hưởng của RV lên sự tăng sinh của dòng tế bào HL-60. Kết quả được trình bày dưới dạng giá trị trung bình và độ lệch chuẩn của ba thí nghiệm độc lập. 0 20 40 60 80 100 120 Thời gian ủ với RV T ỉ lệ ( % ) tế b ào s ố n g Không xử lý RV 7,5 µM RV 15 µM RV 30 µM RV 60 µM RV 120 µM * * * * * Hình 3.2. Ảnh hưởng của RV lên sức sống của dòng tế bào HL-60. Kết quả được trình bày dưới dạng giá trị trung bình và độ lệch chuẩn của ba thí nghiệm độc lập. Dấu (*) thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức tin cậy 99% giữa từng mẫu được xử lý với RV với mẫu không xử lý trong cùng thời gian ủ. Chương 3. Kết quả - Thảo luận 34 Kết quả này của chúng tôi phù hợp với kết quả của các công trình trước đây nghiên cứu ảnh hưởng của RV lên sự tăng trưởng và sức sống của dòng tế bào HL- 60. Nghiên cứu của Clement và cs (1998) sử dụng thử nghiệm MTT [12] cho thấy khi ủ tế bào HL-60 với RV ở nồng độ từ 4 – 32 µM thì tỉ lệ chết của tế bào tăng theo nồng độ với hơn 80% tế bào chết sau 48 giờ xử lý. Trong một nghiên cứu khác của Ragione và cs (1998) RV ở nồng độ 30 µM ức chế hoàn toàn sự tăng trưởng của tế bào HL-60 và những RV ở nồng độ cao hơn (50 và 100 µM) làm giảm số lượng tế bào so với trước khi xử lý [39]. Vậy với kết quả thu nhận được, chúng tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của RV lên khả năng bám dính của tế bào HL-60 ở nồng độ 15 và 30 µM. RV ở nồng độ 15 µM ức chế vừa phải sự tăng sinh của tế bào HL-60 mà không ảnh hưởng đến sức sống trong suốt quá trình ủ. Trong khi đó, RV ở nồng độ 30 µM ức chế hoàn toàn sự tăng sinh của tế bào HL-60 và làm giảm sức sống tế bào ít hơn so với nồng độ 60 µM. 3.1.2. Ảnh hưởng của RV lên khả năng bám của tế bào HL-60 Thử nghiệm bám trải tế bào được sử dụng trong thí nghiệm này. Chúng tôi ủ tế bào HL-60 với RV ở nồng độ 15 và 30 µM hoặc với DMSO ở nồng độ 0,1% (mẫu không xử lý) trong môi trường không huyết thanh trên giá thể fibronectin và trong môi trường bổ sung 10% huyết thanh trên bề mặt nuôi cấy thông thường trong 3 và 24 giờ. Kết quả thử nghiệm bám trải tế bào cho thấy RV không làm tế bào HL- 60 trải ra trên bề mặt giá thể. Tế bào HL-60 vẫn giữ nguyên hình thái tròn, lơ lửng trong cả hai môi trường nuôi cấy (có và không có huyết thanh) trên cả hai bề mặt bám (không phủ và phủ fibronectin) sau 24 giờ ủ với RV ở cả hai nồng độ khảo sát (hình 3.3). Chương 3. Kết quả - Thảo luận 35 Ngoài ra, chúng tôi còn thực hiện thêm thử nghiệm bám dính tế bào và kết quả cũng tương tự (dữ liệu không trình bày). Tín hiệu huỳnh quang ở tất cả các giếng xử lý và không xử lý với RV trong 3 và 24 giờ bằng với tín hiệu nền cho thấy RV 30 µM Không xử lý RV 15 µM Fibronectin – 0% huyết thanh 10% huyết thanh Hình 3.3. Ảnh hưởng của RV lên sự bám trải của dòng tế bào HL-60 sau 24 giờ xử lý. Ảnh được chụp ở độ phóng đại 100X, thanh tỉ lệ tương đương 500 µm. Chương 3. Kết quả - Thảo luận 36 RV cũng không làm tế bào HL-60 trở nên bám dính trên bề mặt nuôi cấy. Như vậy, RV hoàn toàn không có ảnh hưởng lên khả năng bám dính của dòng tế bào ung thư máu HL-60. Kết quả trên dòng tế bào HL-60 của chúng tôi dường như mâu thuẫn với kết quả nghiên cứu của Rodrigue và cs (2005) trên dòng tế bào ung thư máu K562. Nghiên cứu này đã chứng minh dưới tác động của RV ở nồng độ 100 µM trong 48 giờ, tế bào K562 thay đổi hình thái, trở nên bám và mọc trải ra trên chất nền fibronectin. Dòng tế bào K562 có nguồn gốc từ một bệnh nhân mắc bệnh bạch cầu dòng tủy mãn tính giai đoạn cuối [16]. Bệnh liên quan đến sự mất khả năng bám vào các tế bào đệm tủy xương trong quá trình trưởng thành của các tiền tủy bào do đột biến gene, dẫn đến sự đi vào máu của các tế bào chưa trưởng thành này [20], [42]. Trong khi đó, HL-60 là dòng tế bào ung thư bạch cầu dòng tủy cấp tính mang những sai hỏng trong gene mã hóa cho thụ thể  của acid retinoic điều hòa quá trình biệt hóa tế bào máu dòng tủy và gene mã hóa cho một nhân tố phiên mã ức chế tăng trưởng, dẫn đến sự ngừng biệt hóa và tăng sinh không ngừng của các tiền tủy bào trong bệnh nhân mắc bệnh [9]. Sự khác nhau về đặc tính sai hỏng di truyền có thể giải thích cho sự khác nhau trong đáp ứng với RV của hai dòng tế bào ung thư máu HL-60 và K562 về khả năng bám dính. Một số nghiên cứu cho thấy RV ức chế sự tăng sinh của dòng tế bào HL-60 bởi sự cảm ứng quá trình biệt hóa [3], [22], [39]. Ngoài ra, một số tác nhân như phorbol ester có thể biệt hóa tế bào HL-60 thành bạch cầu đơn nhân và tế bào HL- 60 trở nên bám vào bề mặt nuôi cấy; trong khi DMSO hay acid retinoic lại biệt hóa tế bào HL-60 theo con đường trở thành bạch cầu hạt và không bám [43]. Trong nghiên cứu của chúng tôi, RV ức chế sự tăng sinh của dòng tế bào HL-60 nhưng không cảm ứng sự bám cho thấy RV có thể đã cảm ứng sự biệt hóa tế bào HL-60 thành bạch cầu hạt. Những thí nghiệm sâu hơn cần được thực hiện để làm rõ suy đoán này. Chương 3. Kết quả - Thảo luận 37 3.2. Dòng tế bào DLD-1 3.2.1. Ảnh hưởng của RV lên khả năng bám của tế bào DLD-1 Theo các kết quả ban đầu của nhóm, xử lý tế bào DLD-1 đã bám và đang tăng trưởng trên bề mặt nuôi cấy với RV ở nồng độ 60 µM làm cho các tế bào này gia tăng kích thước, trở nên bám chặt hơn và cần thời gian ủ với trypsin dài hơn để tách các tế bào này khỏi bề mặt nuôi cấy. Điều này cho thấy RV đã có những ảnh hưởng nhất định lên khả năng bám dính của dòng tế bào DLD-1. Ngoài ra, theo nghiên cứu của Rodrigue và cs (2005), RV đã làm tăng sự bám trải của các tế bào ung thư vú MCF-7 (một dòng tế bào bám) trên fibronectin; cũng như sự biểu hiện của tensin, một protein liên quan đến bộ xương tế bào. Do đó, chúng tôi muốn tìm hiểu sâu hơn ảnh hưởng của RV lên khả năng bám của tế bào DLD-1. Các dòng tế bào bám khi được nuôi cấy in vitro phải trải qua giai đoạn bám và mọc trải ra hoàn toàn trên bề mặt nuôi cấy trước khi bước vào giai đoạn tăng trưởng. Câu hỏi đặt ra là: “RV làm tăng tính bám của dòng tế bào DLD-1 đang ở giai đoạn tăng trưởng, vậy nếu tế bào DLD-1 được tiếp xúc với RV trong giai đoạn bám và mọc trải thì RV có ảnh hưởng như thế nào lên tính bám của tế bào DLD-1?” Để trả lời câu hỏi này, chúng tôi tiến hành thử nghiệm bám trải trên tế bào DLD-1 được xử lý với RV ở nồng độ 20 và 60 µM trong 3 giờ ngay khi bắt đầu giai đoạn bám trong môi trường chứa 10% huyết thanh trên bề mặt nuôi cấy thông thường và trong môi trường không huyết thanh trên giá thể fibronectin. Trên dòng tế bào DLD-1, 20 µM là nồng độ ức chế 50% sự tăng sinh. Tế bào DLD-1 nuôi trong môi trường có DMSO ở nồng độ 0,1% là mẫu không xử lý trong tất cả các thí nghiệm. Biểu đồ trên hình 3.4 cho thấy trên giá thể fibronectin, khoảng 36% tế bào DLD-1 bám trải được sau 3 giờ nuôi cấy trong môi trường không huyết thanh. Tỉ lệ bám trải của tế bào DLD-1 được xử lý với RV ở nồng độ 20 và 60 µM lần lượt là 21 và 10%. Trên bề mặt nuôi cấy thông thường, tác động của RV cũng tương tự. Tỉ lệ Chương 3. Kết quả - Thảo luận 38 tế bào DLD-1 mọc trải ra khoảng 26%, và RV ở nồng độ 20 và 60 µM làm giảm tỉ lệ bám trải của tế bào DLD-1 xuống còn 18 và 10%. Các kết quả này chứng tỏ RV ức chế quá trình bám trải của tế bào DLD-1 trên giá đỡ, và nồng độ RV càng cao sự ức chế càng mạnh. Hơn nữa, so sánh tỉ lệ tế bào bám trải của các cặp xử lý tương ứng giữa hai điều kiện thí nghiệm cho thấy không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức tin cậy 99%. Như vậy, tác động ức chế của RV lên sự bám trải của dòng tế bào DLD-1 không chuyên biệt trên giá thể fibronectin (hình 3.4). Hình 3.5 cho thấy các tế bào DLD-1 không xử lý có nền đen, biểu hiện hình thái trải dài (mũi tên nét liền) sau 3 giờ nuôi cấy trong khi có rất ít tế bào DLD-1 được xử lý với RV biến đổi hình thái so với trước khi xử lý. 0.0 10.0 20.0 30.0 40.0 FN - 0% FBS 10% FBS Tỉ lệ (% ) t ế bà o bá m tr ải Không xử lý RV 20 µM RV 60 µM* * * Hình 3.4. Ảnh hưởng của RV lên sự bám trải của dòng tế bào DLD-1 sau 3 giờ xử lý. Kết quả được trình bày dưới dạng giá trị trung bình và độ lệch chuẩn của ba thí nghiệm độc lập. Dấu (*) thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức tin cậy 99% giữa từng mẫu được xử lý với RV với mẫu không xử lý trong cùng điều kiện thí nghiệm. FN, fibronectin; FBS, huyết thanh. Chương 3. Kết quả - Thảo luận 39 FN– 0% FBS 10% FBS Không xử lý RV 60 µM RV 20 µM Hình 3.5. Hình thái bám trải của dòng tế bào DLD-1 sau 3 giờ xử lý với RV. Ảnh được chụp ở độ phóng đại 100X, thanh tỉ lệ tương đương 500 µm. FN, fibronectin; FBS, huyết thanh. Chương 3. Kết quả - Thảo luận 40 Quá trình bám dính của tế bào lên một giá thể bao gồm giai đoạn gắn của các thụ thể hay các phân tử bám dính trên màng tế bào lên các phân tử của giá thể, ví dụ như các protein của chất nền ngoại bào. Sau đó là giai đoạn mọc trải ra, sự mở rộng diện tích bám của tế bào trên giá thể. Kết quả thử nghiệm bám trải chứng minh tác động ức chế của RV trên giai đoạn này, vậy RV có ảnh hưởng đến giai đoạn bám trước đó hay không. Để trả lời câu hỏi này, chúng tôi tiến hành thử nghiệm bám dính trên tế bào DLD-1 được xử lý với RV ở nồng độ 60 µM trong 1 và 3 giờ với các điều kiện thí nghiệm tương tự như thử nghiệm bám trải. Kết quả trình bày trong hình 3.6 cho thấy sau 1 giờ ủ với RV, tỉ lệ bám dính của tế bào DLD-1 trên giá thể fibronectin và bề mặt nuôi cấy thông thường lần lượt là 28,1 và 26,9%, tỉ lệ này ở tế bào DLD-1 không xử lý lần lượt là 41,3 và 36,7% (hình 3.6A). Sau 3 giờ ủ với RV, tỉ lệ tế bào DLD-1 bám dính vào giá thể fibronectin và bề mặt nuôi cấy thông thường lần lượt là 40,6 và 44,5%, tỉ lệ này ở tế bào DLD-1 không xử lý lần lượt là 64,7 và 59,0% (hình 3.6B). Vậy RV làm giảm tỉ 0 20 40 60 80 FN - 0% FBS 10% FBS Tỉ lệ (% ) t ế b ào b ám d ín h Không xử lý RV 60 µM A B 0 20 40 60 80 FN - 0% FBS 10% FBS Tỉ lệ (% ) t ế b ào b ám d ín h * * * * Hình 3.6. Ảnh hưởng của RV lên sự bám dính của dòng tế bào DLD-1 sau 1 giờ (A) và 3 giờ (B) xử lý. Kết quả được trình bày dưới dạng giá trị trung bình và độ lệch chuẩn của ba thí nghiệm độc lập. Dấu (*) thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức tin cậy 99% giữa mẫu được xử lý với RV ở nồng độ 60 µM với mẫu không xử lý trong cùng điều kiện thí nghiệm. FN, fibronectin; FBS, huyết thanh. Chương 3. Kết quả - Thảo luận 41 lệ tế bào DLD-1 bám dính lên giá thể nuôi cấy trong các điều kiện thí nghiệm, hay nói cách khác RV ức chế quá trình thiết lập sự bám dính của tế bào DLD-1. So sánh tỉ lệ tế bào bám dính của các cặp xử lý tương ứng giữa hai điều kiện thí nghiệm cho thấy không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức tin cậy 99%. Như vậy, tác động ức chế của RV lên sự bám dính của dòng tế bào DLD-1 không chuyên biệt trên giá thể fibronectin. Chúng tôi nhận thấy RV ở nồng độ 60 µM đã ức chế sự bám dính của dòng tế bào DLD-1 ở thời điểm khá sớm, chỉ sau 1 giờ xử lý. Do đó, sự ức chế quá trình bám trải của dòng tế bào DLD-1 sau 3 giờ xử lý với RV chúng tôi ghi nhận được có phải là hệ quả của tác động ức chế sự bám của tế bào hay không. Chúng tôi tiến hành xác định tỉ lệ giữa tỉ lệ tế bào DLD-1 bám trải và tỉ lệ tế bào DLD-1 bám dính ở các mẫu thí nghiệm sau 3 giờ xử lý. Kết quả được trình bày qua hình 3.7. Trong mẫu không xử lý, tỉ lệ tế bào DLD-1 mọc trải ra sau khi đã bám lên giá thể fibronectin và bề mặt nuôi cấy thông thường là khoảng 55,5 và 44,6% . Tỉ lệ này của mẫu xử lý với RV ở nồng độ 60 µM lần lượt là 24,9 và 23,2%, thấp hơn khoảng hai lần so với khi không xử lý. Kết quả này cho thấy RV thật sự ức chế sự trải ra trên giá thể nuôi cấy của tế bào DLD-1. Tổng hợp kết quả của hai thử nghiệm bám 0 20 40 60 FN - 0% FBS 10% FBST ỉ l ệ (% ) tế b ào t rả i/t ế b ào d ín h Không xử lý RV 60 µM Hình 3.7. Ảnh hưởng của RV lên sự trải ra trên giá thể nuôi cấy của dòng tế bào DLD-1 sau 3 giờ xử lý. FN, fibronectin; FBS, huyết thanh. Chương 3. Kết quả - Thảo luận 42 trải và bám dính, có thể kết luận RV ở nồng độ 60 µM ức chế quá trình bám dính của dòng tế bào DLD-1 ở cả hai giai đoạn bám và trải ra sau 3 giờ xử lý. Kéo dài thời gian xử lý với RV và quan sát sự thay đổi hình thái của tế bào DLD-1, chúng tôi ghi nhận được một số kết quả thú vị và đáng chú ý. Sau 24 giờ xử lý với RV, trong cả hai điều kiện thí nghiệm, hầu như tất cả tế bào DLD-1 đều bám và trải ra (hình 3.8). Kết quả này cho thấy dòng tế bào DLD-1 đã vượt qua được sự ức chế quá trình bám dính của RV sau 24 giờ nuôi cấy. Nói cách khác, RV chỉ làm chậm quá trình bám dính của dòng tế bào DLD-1 ở nồng độ thử nghiệm. Ngoài ra, khi được nuôi cấy trong môi trường có huyết thanh, tế bào DLD-1 có khuynh hướng liên kết chặt chẽ với nhau hơn và xử lý với RV dường như làm tế bào lớn hơn so với không xử lý. 10% FBS FN – 0% FBS Không xử lý RV 20 µM RV 60 µM Hình 3.8. Ảnh hưởng của RV lên hình thái của dòng tế bào DLD-1 sau 24 giờ xử lý. Ảnh được chụp ở độ phóng đại 100X, thanh tỉ lệ tương đương 500 µm. FN, fibronectin; FBS, huyết thanh. Chương 3. Kết quả - Thảo luận 43 Chúng tôi tiếp tục quan sát hình thái tế bào DLD-1 sau 48 giờ ủ với RV, kết quả cho thấy tế bào DLD-1 trở nên tròn, sáng, mất tính bám trên giá thể fibronectin trong môi trường không huyết thanh. Ngược lại, trong môi trường có huyết thanh chứa nồng độ 60 µM RV, rất ít tế bào tròn, sáng xuất hiện; thay vào đó là các tế bào có diện tích tăng theo nồng độ xử lý, trải dẹp trên bề mặt nuôi cấy (hình 3.9A và B). Vậy huyết thanh hay fibronectin là nhân tố làm gia tăng kích thước tế bào. Để trả lời câu hỏi này, chúng tôi tiến hành thêm thí nghiệm xử lý tế bào DLD-1 với RV ở nồng độ 20 và 60 µM ngay khi bắt đầu giai đoạn bám trong môi trường chứa 10% huyết thanh trên giá thể fibronectin. Hình 3.9. Ảnh hưởng của RV lên hình thái của dòng tế bào DLD-1 sau 48 giờ xử lý. Ảnh được chụp ở độ phóng đại 100X, thanh tỉ lệ tương đương 500 µm. FN, fibronectin; FBS, huyết thanh. FN – 0% FBS 10% FBS Không xử lý RV 20 µM RV 60 µM FN-10% FBS A B C Chương 3. Kết quả - Thảo luận 44 Kết quả quan sát sau 48 giờ cho thấy sự thay đổi hình thái tế bào tương tự như trong điều kiện thí nghiệm 10% huyết thanh – bề mặt nuôi cấy thông thường (hình 3.9C). Như vậy, huyết thanh đóng vai trò quan trọng trong việc làm gia tăng diện tích bám của tế bào DLD-1 được xử lý với RV trong 48 giờ. Kết quả này tương tự với kết quả ban đầu của nhóm khi xử lý tế bào DLD-1 đã bám và đang tăng trưởng với RV ở nồng độ 60 µM trong môi trường 10% huyết thanh trong 48 giờ [26]. Điều thú vị là RV được biết như là một tác nhân ức chế con đường PI3K/Akt [19]. Protein Akt được chứng minh làm tăng kích thước tế bào thông qua các con đường tín hiệu phụ thuộc và không phụ thuộc mTOR [18]. Theo đó, xử lý với RV sẽ làm giảm kích thước tế bào thay vì làm tăng như quan sát của chúng tôi. Do đó, các thí nghiệm nhằm làm rõ hơn tác động này đang được tiến hành trong một nghiên cứu khác của nhóm. Tương tác giữa tế bào ung thư và chất nền ngoại bào điều hòa nhiều quá trình như tăng trưởng, sống sót, biệt hóa và đặc biệt là di căn. Do đó, tác động lên sự bám dính của tế bào lên chất nền ngoại bào sẽ làm biến đổi các quá trình này. Như trong công trình của Rodrigue và cs (2005), các tác giả chứng minh rằng ảnh hưởng làm tăng sự bám dính và trải trên fibronectin cũng như làm thay đổi bộ xương tế bào của RV đã ngăn chặn quá trình xâm lấn trên mô hình dòng tế bào ung thư vú MCF-7 [41]. Nghiên cứu của chúng tôi lần đầu tiên chứng minh RV làm chậm quá trình bám dính của các tế bào DLD-1 trên fibronectin, một protein của chất nền ngoại bào thông qua sự ức chế quá trình bám và mọc trải ra của tế bào ngay sau 1 giờ ủ. Điều này dường như mâu thuẫn với kết quả ban đầu của nhóm và công trình của Rodrigue và cs trên dòng tế bào MCF-7. Tuy nhiên, sự mâu thuẫn này có thể được lý giải qua thời điểm bổ sung RV vào môi trường nuôi cấy. Tế bào DLD-1 được xử lý với RV ngay khi bắt đầu quá trình thiết lập sự bám dính, trong khi RV được thêm vào môi trường nuôi cấy tế bào MCF-7 sau khi tế bào đã bám ổn định. Các dữ liệu này cho thấy RV có những ảnh hưởng khác nhau lên sự bám dính của tế bào đang trong các giai đoạn khác nhau của quá trình bám dính.. Đối với các tế bào “chuẩn Chương 3. Kết quả - Thảo luận 45 bị bám”, RV ức chế cả hai giai đoạn bám và trải. Trong khi đó, RV sẽ thúc đẩy sự bám và trải thông qua sự gia tăng kích thước đối với những tế bào đã bám dính và bắt đầu tăng sinh. Kết quả này sẽ góp phần vào việc xác định cơ chế kháng ung thư ở giai đoạn di căn của RV, trong đó RV có thể ngăn tế bào ung thư mất khả năng bám vào chất nền ngoại bào và ức chế quá trình thiết lập sự bám dính của tế bào ung thư tại một cơ quan mới trong cơ thể. 3.2.2. Ảnh hưởng của RV lên bộ khung actin của tế bào DLD-1 Quá trình bám dính của tế bào lên giá thể luôn đi cùng với sự tái tổ chức bộ khung actin của tế bào chất, cụ thể là sự hình thành các lamellipodia và filopodia [32]. Dựa trên kết quả RV ở nồng độ 60 µM làm chậm quá trình bám dính của dòng tế bào DLD-1 sau 3 giờ xử lý, chúng tôi tiến hành nhuộm huỳnh quang tế bào DLD- 1 với phalloidin và DAPI để đánh giá tác động của RV lên hệ thống sợi actin của tế bào trên giá thể fibronectin trong môi trường nuôi cấy không huyết thanh. Phalloidin tương tác chuyên biệt với sợi actin của bộ xương tế bào, còn DAPI là một chất nhuộm huỳnh quang có thể gắn xen vào DNA. Kết quả cho thấy: sau 3 giờ bám, trên màng tế bào DLD-1 không xử lý tỏa ra nhiều sợi filopodia từ lamellipodia, trong khi ở tế bào DLD-1 được xử lý với RV ở nồng độ 60 µM chỉ có sự hình thành các lamellipodia nhưng không thấy xuất hiện các sợi filopodia (hình 3.10). Ngoài ra, chúng tôi nhận thấy không có sự khác biệt giữa nhân của tế bào DLD-1 không xử lý và xử lý với RV (hình 3.10). Kết quả này đã khẳng định lần nữa ảnh hưởng của RV lên sự bám dính của dòng tế bào ung thư DLD-1 thông qua sự biến đổi hệ thống sợi actin. Chương 3. Kết quả - Thảo luận 46 3.2.3. Ảnh hưởng của RV lên sự biểu hiện và phosphoryl hóa của protein FAK trên dòng tế bào DLD-1 FAK, phân tử trung tâm của phức hợp bám dính đóng vai trò quan trọng trong sự điều hòa quá trình bám dính của tế bào vào giá thể nuôi cấy [47]. Với các tác động lên quá trình bám dính và hệ thống sợi actin của tế bào DLD-1 chúng tôi quan sát được, RV có thể ảnh hưởng đến sự biểu hiện và sự phosphoryl hóa ở vị trí Tyr-397 của FAK. Để kiểm tra giả thiết này, chúng tôi tiến hành thí nghiệm Western Blot so sánh sự biểu hiện của hai protein FAK và FAK[pY397] trong tế bào DLD-1 giữa mẫu xử lý với RV ở nồng độ 60 µM và mẫu không xử lý (DMSO ở nồng độ 0,1%) trong môi trường chứa 10% huyết thanh. B A Hình 3.10. Ảnh hưởng của RV lên bộ khung actin của tế bào DLD-1 sau 3 giờ xử lý. A, tế bào DLD-1 không xử lý; B, tế bào DLD-1 được xử lý với RV ở nồng độ 60 µM.  chỉ filopodia, . , chỉ lamellipodia. Ảnh được chụp ở độ phóng đại 1000X, thanh tỉ lệ tương đương 25 µm. Chương 3. Kết quả - Thảo luận 47 Kết quả trên hình 3.11 cho thấy: sau 3 giờ đầu xử lý, sự biểu hiện của FAK không chịu ảnh hưởng của RV thể hiện qua tỉ lệ biểu hiện của FAK giữa mẫu xử lý và không xử lý xấp xỉ bằng 1 tại các thời điểm thu mẫu. Ngược lại, tỉ lệ biểu hiện của FAK[pY397] giữa mẫu xử lý và không xử lý giảm dần theo thời gian. Điều này chứng tỏ RV ức chế sự phosphoryl hóa của FAK ở vị trí Tyr-397. Sau 3 giờ xử lý, Actin  FAK  FAK [pY397] A KXL RV KXL RV KXL RV KXL RV 30 phút 60 phút 3 giờ 24 giờ 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 30 ph út 60 ph út Thời gian xử lý với RV T ỉ lệ b iể u h iệ n g iữ a m ẫu x ử l ý và m ẫu k h ô n g x ử l ý FAK FAK[pY397] B Hình 3.11. Ảnh hưởng của RV lên sự biểu hiện và phosphoryl hóa ở vị trí tyrosine 397 của protein FAK trên dòng tế bào DLD-1. A, Kết quả lai Western Blot với các kháng thể kháng protein -actin, FAK, và FAK[pY397] của các mẫu không xử lý và xử lý với RV ở nồng độ 60 µM trong 30 và 60 phút, 3 giờ và 24 giờ. B, Biểu đồ biểu diễn tỉ lệ biểu hiện của protein FAK và FAK[pY397] giữa mẫu xử lý với RV ở nồng độ 60 µM và mẫu không xử lý trong 30 và 60 phút, 3 giờ và 24 giờ. KXL, không xử lý; RV, xử lý với RV ở nồng độ 60 µM. Chương 3. Kết quả - Thảo luận 48 RV gây giảm một nửa số phân tử FAK được phosphoryl hóa. Tuy nhiên, sau 24 giờ xử lý, tác động của RV lên FAK lại theo một cách khác. Tỉ lệ biểu hiện của FAK giữa mẫu xử lý và không xử lý giảm còn 0,65, chứng tỏ RV đã ức chế sự biểu hiện của FAK. Tỉ lệ biểu hiện của FAK[Y397] giảm còn 0,4 cho thấy RV tiếp tục ức chế sự phosphoryl hóa FAK và sự ức chế này một phần có thể là hệ quả của sự ức chế biểu hiện. Tóm lại, tương tự như kết quả của thử nghiệm bám dính, ảnh hưởng của RV lên sự biểu hiện và phosphoryl hóa của FAK trên dòng tế bào DLD-1 cũng chia thành 2 giai đoạn. Giai đoạn đầu là tác động ức chế riêng rẽ sự phosphoryl hóa và liên quan đến quá trình thiết lập sự bám dính của tế bào lên giá thể. Giai đoạn sau trong ảnh hưởng của RV là tác động ức chế kết hợp sự biểu hiện và sự phosphoryl hóa, và dường như liên quan đến tác động gia tăng kích thước và diện tích bám của tế bào lên bề mặt nuôi cấy. Những thí nghiệm để tìm hiểu rõ hơn về tác động này đang được thực hiện trong các nghiên cứu khác của nhóm. Tyr-397 là vị trí tự phosphoryl hóa nằm ở vùng thượng nguồn của vùng kinase trung tâm, vùng thiết yếu cho các chức năng sinh học của FAK. Sự hoạt hóa chức năng của FAK liên quan đến sự tự phosphoryl hóa ở vị trí Tyr-397 trong đáp ứng với sự tập trung của các integrin trên màng tế bào được cảm ứng bởi quá trình bám của tế bào vào giá thể. FAK khi đã được hoạt hóa sẽ tương tác với một loạt các phân tử trung gian khác trong phức hợp bám dính trung tâm để điều hòa các quá trình sinh học, trong đó có sự tái tổ chức bộ xương tế bào giúp tế bào bám dính vào bề mặt nuôi cấy. RV ức chế sự tự phosphoryl hóa của FAK ở vị trí Tyr-397 dẫn đến sự ức chế hoạt động của kinase này trong giai đoạn hình thành sự bám dính của tế bào. Kết quả là bộ xương tế bào, đặc biệt là các sợi actin không được tái cấu trúc và tế bào không thể bám và trải hoàn toàn trên bề mặt nuôi cấy. Điều này đã được chúng tôi chứng minh qua các thử nghiệm bám dính, bám trải và nhuộm huỳnh quang bộ khung actin của tế bào. Bên cạnh đó, một giả thiết khác cũng có thể được đặt ra là: RV ức chế sự bám của tế bào DLD-1 vào giá thể nuôi cấy, ví dụ như ức chế sự tập trung các integrin Chương 3. Kết quả - Thảo luận 49 trên màng tế bào. Điều này dẫn đến FAK không thể định vị tại phức hợp bám dính trung tâm và tự phosphoryl hóa ở vị trí Tyr-397, và hệ quả là không hoạt hóa được FAK.