Luận văn Nghiên cứu đa dạng di truyền cây tiêu (Piper nigrum L.) tai thi xã Bà Rìa- Vũng Tàu bằng kỹ thuật RAPD

] Năm 2001, nhóm tác giả ngƣời Ấn Độ đã khảo sát sự đa dạng di truyền giữa 22 giống tiêu thuộc dòng Piper nigrum thu thập đƣợc từ miền Nam Ấn Độ và 2 dòng hoang dại là P.longum và P.colubrinum bằng kỹ thuật RAPD. Trong số 34 mồi ngẫu nhiên đƣợc dùng thì có 24 mồi cho kết quả tốt. 5 mồi ngẫu nhiên trong số 24 mồi này cho các băng đồng hình, số còn lại cho các băng đa hình (từ 3 đến 21 băng). Tổng số băng thu đƣợc ở 22 giống thuộc dòng Piper nigrum là 327, trong số đó 11 băng là đồng hình. Dựa trên sự hiện diện của các băng DNA để tính hệ số đo Jaccard’s cho mỗi băng, sử dụng phƣơng pháp Neighbour – Joining và kết quả đƣợc thể hiện bằng cây phát sinh loài sử dụng chƣơng trình UPGMA. Kết quả phân tích RAPD cho thấy mức tƣơng đồng về kiểu gen giữa các giống tiêu này là từ 0,11 đến 0,66. 2.8.2. Việt Nam Các viện và trƣờng đại học ở nƣớc ta đã có sự nổ lực nghiên cứu về cây tiêu trong nhiều năm qua, cụ thể là Viện Khoa Học Kỹ Thuật Nông Nghiệp Miền Nam, Viện Sinh Học Nhiệt Đới, Viện Nghiên Cứu Cây Ăn Quả Miền Nam, Viện Nghiên Cứu Nông Lâm Nghiệp Tây Nguyên, Trƣờng Đại Học Nông Lâm, Đại Học Tây Nguyên… Ngoài ra, các trung tâm khuyến nông của các tỉnh cũng hỗ trợ đắc lực trong việc chuyển giao các kết quả nghiên cứu cho ngƣời dân. Năm 1989, đề tài cấp nhà nƣớc về cây tiêu 18A – 01 – 06 nghiên cứu toàn diện về cây tiêu ở nƣớc ta đã đƣợc tổng kết với một số nội dung về giống, kỹ thuật canh tác và cả các biện pháp phát triển. Năm 2001, đề tài cấp nhà nƣớc KC 06 – 11 – NN “Nghiên cứu các giải pháp khoa học công nghệ và thị trƣờng để phát triển vùng hồ tiêu nguyên liệu phục vụ chế biến và xuất khẩu” do Bộ Khoa Học và Công Nghệ chủ trì,Viện Khoa Học Kỹ Thuật Nông Nghiệp Miền Nam thực hiện. 24 Đƣợc sự hỗ trợ kinh phí từ đề tài cấp nhà nƣớc mã số KC 06 – 11 – NN, nhóm tác giả thuộc Bộ Môn Bảo Vệ Thực Vật và Trung Tâm Phân Tích Thí Nghệm Hóa Sinh của trƣờng Đại Học Nông Lâm đã thực hiện đề tài “Xác định triệu chứng và mức độ nhiễm bệnh virus trên cây hồ tiêu tại vùng Bình Long, Bình Phƣớc và Châu Đức, Bà Rịa – Vũng Tàu”. Kết quả điều tra đã cho thấy tỉ lệ cây tiêu bị nhiễm TMV trung bình là 40%. Gần đây, năm 2005, đề tài cấp tỉnh “Tuyển chọn các giống tiêu tốt tại tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu” do Sở Khoa Học Công Nghệ Tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu chủ trì, Trung Tâm Khuyến Nông Và Giống Nông Nghiệp Tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu thực hiện cũng đã thu đƣợc một số kết quả ban đầu. 25 PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Nội dung Đề tài đƣợc thực hiện với hai nội dung sau: - Nội dung 1: Điều tra về các giống tiêu hiện đƣợc trồng tại thị xã Bà Rịa. - Nội dung 2: Thực hiện phản ứng RAPD để đánh giá mức độ đa dạng di truyền của quần thể tiêu tại thị xã Bà Rịa. 3.2. Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài Đề tài đƣợc thực hiện từ ngày 6 tháng 3 năm 2006 đến ngày 6 tháng 8 năm 2006 tại thị xã Bà Rịa và phòng thí nghiệm Công Nghệ Sinh Học Thực Vật – Trung tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh – Trƣờng Đại học Nông Lâm TP.HCM. 3.3. Vật liệu 3.3.1. Giống tiêu Bảng 3.1 Danh sách các giống tiêu sử dụng trong nghiên cứu Thứ tự Tên giống Nguồn gốc 1 Ấn Độ lá bầu Ấn Độ 2 Ấn Độ đọt tím Ấn Độ 3 Paniyur – 1 Ấn Độ 4 Ấn Độ lá dài Ấn Độ 5 Ấn Độ đọt trắng Ấn Độ 6 Karimunda Ấn Độ 7 Kuchin Mã Lai 8 Vĩnh Linh Indonesia 9 Phú Quốc Campuchia 10 Sẻ lá nhỏ Giống địa phƣơng 11 Sẻ lá lớn Giống địa phƣơng 26 3.3.2. Hóa chất cần thiết  Hóa chất dùng trong tách chiết và kiểm tra DNA lá tiêu - Dung dịch nitơ lỏng - Dung dịch EB (extraction buffer) cho quy trình ly trích 1 và 2 :  2% w/v CTAB  1,4M NaCl  100 mM Tris – HCl pH 8.0  20mM EDTA  2% PVP  0,1% v/v β – mercaptoethanol - Dung dịch EB (extraction buffer) dùng cho quy trình ly trích 3:  1,4M NaCl  100 mM Tris – HCl pH 8.0  20mM EDTA - Dung dịch phenol/chloroform (1:1) - Dung dịch chloroform /isoamylalcohol (24:1) - Dung dịch phenol /chloroform /isoamylalcohol (25:24:1) - Dung dịch isopropanol lạnh - Ethanol 700, 1000 - RNase - Dung dịch TE  10mM Tris – HCl pH 8,0  1mM EDTA  Hóa chất dùng cho kỹ thuật PCR – RAPD - Taq polymerase - Taq buffer - MgCl2 - dNTPs - DNA mẫu - Nƣớc cất 2 lần, hấp khử trùng và chiếu UV - Primer 27 Bảng 3.2 Danh sách các primer sử dụng trong nghiên cứu Số thứ tự Primer Trình tự 1 OPA – 05 AGGGGTCTTG 2 OPF – 09 CCAAGCTTCC 3 OPS – 03 CAGAGGTCCC 4 OPT – 06 CAAGGGCAGA 5 OPW – 11 CTGATGCGTG 6 OPZ – 20 ACTTTGGCGG 7 A – 11 CAATCGCCGT 8 AL – 08 GTCGCCCTCA 9 RAPD1 GGTGCGGGAA 10 RAPD3 GTAGACCCGT 11 RAPD5 AACGCGCAAC 12 RAPD6 CCCGTCAGCA 13 OPD03 GGGGGTCTTT 14 OPD05 TGAGCGGACA 15 OPD13 GGGGTGACGA 16 OPA10 GTGATCGCAG 17 OPC11 AAAGCTGCGG 18 OPD02 GGACCCAACC 19 RAPD4 AAGAGCCCGT  Hóa chất dùng cho điện di - Agarose - Dung dịch TAE 0,5X - Ladder - Loading dye - Dung dịch ethidium bromide  Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm Thiết bị và dụng cụ dùng trong thí nghiệm tách chiết DNA - Chày cối nghiền mẫu - Cân điện tử 28 - Ống eppendorf 1,5 ml - Pipette 10 μl – 100 μl và 100 μl – 1000 μl - Đầu túyp 10 μl – 100 μl và 100 μl – 1000 μl - Bao tay - Máy ly tâm - Tủ sấy - Tủ ủ mẫu - Tủ – 20oC , 40C - Autoclave - Tủ hút Thiết bị và dụng cụ dùng trong điện di - Buồng điện di - Máy chụp hình DNA Geldoc - Pipette 0,5 μl – 10 μl - Đầu túyp 0,5 μl – 10 μl Thiết bị và dụng cụ dùng trong phản ứng PCR - Máy PCR PTC Thermocycle 100 - Tủ cấy vô trùng - Ống eppendorf 1,5 ml - Pipette 0,5 μl – 10 μl và 10 μl – 100 μl - Đầu túyp 0,5 μl – 10 μl và 10 μl – 100 μl 3.4. Phƣơng pháp 3.4.1. Nội dung 1: Điều tra về các giống tiêu hiện đƣợc trồng tại thị xã Bà Rịa  Phƣơng pháp tiến hành Tiến hành điều tra, thu thập thông tin theo phiếu soạn sẵn qua phỏng vấn trực tiếp tại vƣờn tiêu trên 5 tuổi và có trên 200 trụ tiêu của 50 hộ dân trên địa bàn thị xã Bà Rịa. Các nội dung điều tra gồm: - Các giống tiêu hiện đƣợc trồng tại thị xã Bà Rịa và mức độ phổ biến của giống. - Đặc điểm của các giống tiêu 29  Chỉ tiêu theo dõi - Tỷ lệ trồng của từng giống (%) = (Số hộ trồng : 50) × 100 - Các đặc trƣng về lá: o Dài lá o Rộng lá o Gân lá o Mép lá o Màu sắc lá o Dạng lá - Các yếu tố cấu thành năng suất và năng suất của các giống tiêu: o Số gié bông trung bình trên 1 m2 o Số hạt trung bình có trên gié o Phẩm chất hạt: trọng lƣợng 1000 hạt, đƣờng kính hạt o Năng suất hạt tiêu (kg/trụ) 3.4.2. Nội dung 2: Thực hiện phản ứng RAPD để đánh giá mức độ đa dạng di truyền của quần thể tiêu tại thị xã Bà Rịa  Thí nghiệm 1: Khảo sát 3 quy trình ly trích DNA - Thiết kế thí nghiệm Thí nghiệm đƣợc bố trí gồm 3 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức đƣợc lặp lại 3 lần. Mỗi nghiệm thức gồm 5 mẫu. Quy trình 1 (nghiệm thức 1)  Nghiền 0,3 g lá trong nitơ lỏng, cho vào eppendorf 1,5 ml.  Thêm 1 ml dung dic̣h EB đa ̃đƣơc̣ đun nóng ở 650C.  Mâũ đƣơc̣ ủ trong 1 giờ ở 650C. Ly tâm, chuyển phần dịch qua eppendorf mới.  Sau đó thêm vào 500 μl phenol/chloroform (1:1), lắc nhẹ và đều.  Ly tâm trong 15 phút ở 11.000 vòng/phút  Hút dịch nổi và tủa DNA bằng cách thêm vào isopropanol , để ở 40C trong 15 – 30 phút  Rửa lại DNA bằng ethanol 700  Ly tâm và để khô. Sau đó hòa trong dung dịch TE 1X.  Bảo quản mẫu ở -200C Quy trình 2 (nghiệm thức 2) 30  Cắt nhỏ lá và đặt lá vào cối. Thêm 400 l EB, nghiền các mô lá với chày.  Thêm tiếp 400 l EB và tiếp tục nghiền đến khi dung dịch có màu xanh đó là dấu hiệu tế bào bị phá vỡ và phóng thích diệp lục.  Trộn và chuyển 400 l dịch nghiền vào một eppendorf 1,5ml. Ủ ở 650C trong 15 phút.  Thêm 400 l chloroform/isoamyl alcohol (24:1). Trộn cẩn thận và khéo léo. Đặt eppendorf này vào ly tâm 13000 vòng khoảng 30 giây. Chuyển dung dịch bên trên vào eppendorf mới và ghi nhãn. Giai đoạn này cần sự cẩn thận để tránh trộn lẫn dung dịch.  Thêm vào 800 l ethanol 1000 và trộn cho tốt. Ly tâm trong thời gian từ 3 đến 5 phút. Đỗ bỏ phần dịch.  Rửa tủa với ethanol 700 và phơi khô DNA.  Hòa tan DNA vào 50 l TE 1X. Giữ ở nhiệt độ - 200C. Quy trình 3 (nghiệm thức 3)  Cân 0,5 g mẫu cho vào cối  Thêm vào 3 ml dịch trích DNA (gồm 2,7 ml EB và 0,3 ml sakosyl 10%). Nghiền mô lá với dịch trích.  Lấy phần dịch nghiền cho vào eppendorf 1,5 ml và đem ủ ở 550C trong 1 giờ.  Sau đó ly tâm ở 6000 vòng trong 10 phút ở nhiệt độ 100C  Tiếp theo hút khoảng 800 l dịch lỏng phía trên cho vào eppendorf mới rồi cho 100 l NaCl 5M và 100 l CTAB/NaCl (CTAB 10% với 0,7 M NaCl). Đem ủ ở 650C trong 10 phút.  Cho tiếp 600 l chloroform/isoamyl alcohol (24:1), trộn đều và ly tâm 12000 vòng trong 10 phút ở 100C.  Sau khi ly tâm, hút khoảng 800 l dịch nổi phía trên sang eppendorf mới và tiếp tục cho 600 l phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1), trộn đều và ly tâm ở 12000 vòng trong 10 phút ở 100C.  Hút 600 l sang eppendorf mới, cho vào 360 l isopropanol, trộn đều và ủ ở nhiệt độ -200C trong 30 phút (giai đoạn này gọi là giai đoạn ngƣng kết DNA). Ly tâm ở tốc độ 15000 vòng trong thời gian 15 phút ở nhiệt độ 100C. 31  Ly tâm xong, đổ nhẹ phần nƣớc phía trên và giữ lại phần cặn phía dƣới, để cho khô và rửa lại bằng ethanol 700. Sau khi rửa xong, cho 100 l TE 1X vào để hòa tan DNA.  Sau đó giữ lạnh ở -200C. Bảng 3.3 So sánh sự khác nhau của ba quy trình tách chiết khảo sát Quy trình Quá trình nghiền Đệm tách chiết Tác nhân biến tính protein Tác nhân tủa DNA 1 Nghiền trong N2 lỏng CTAB Phenol/chloroform (1:1) Isopropanol 2 Nghiền trong dung dịch EB CTAB Chloroform/isoamyl alcohol (24:1) Ethanol 100 0 3 Nghiền trong dung dịch EB CTAB/NaCl Sakosyl 10% Chloroform/isoamyl alcohol (24:1) Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1) Isopropanol - Phƣơng pháp tiến hành Các mẫu lá đƣợc lấy ngẫu nhiên tại các vƣờn đƣợc chọn. Ở mỗi giống, chọn từ 2 – 3 vƣờn, lấy khoảng 5 – 10 lá (1 mẫu) đã trƣởng thành, không lấy lá đã già, chọn những lá tốt, không bị rách hay bị sâu hại, lau sạch rồi cho vào bọc nylon đã ghi đầy đủ thông tin về mẫu. Mẫu đƣợc trữ trong thùng đá lạnh, sau đó đem về trữ trong tủ lạnh –20oC tại Trung tâm Phân tích Thí nghiệm Hoá Sinh – Trƣờng Đại học Nông Lâm TP. HCM. Tiến hành chọn ngẫu nhiên 5 mẫu lá của 5 giống tiêu để khảo sát 3 quy trình ly trích DNA. DNA tổng số sau khi ly trích sẽ đƣợc kiểm tra định tính và định lƣợng bằng phƣơng pháp điện di và đo OD. Từ các kết quả thu đƣợc, chọn ra quy trình ly trích cho kết quả ly trích tốt nhất để ly trích hết các mẫu còn lại. 32 o Định tính DNA bằng phƣơng pháp điện di DNA sau khi đƣợc ly trích sẽ đƣợc định tính bằng phƣơng pháp điện di trên gel agarose 1 %. Dƣới tác dụng của điện trƣờng, do tích điện âm (do tính chất của nhóm phosphate) nên DNA di chuyển từ cực âm sang cực dƣơng. Khi DNA di chuyển qua các lỗ của agarose, sự cọ sát giữa hạt agarose và phân tử DNA tạo ra lực kháng làm ngăn cản sự chuyển dịch của DNA. DNA có phân tử càng lớn thì lực cản càng mạnh, do đó DNA có phân tử càng nhỏ di chuyển càng nhanh. Nhờ vậy ta có thể phân loại đƣợc các đoạn DNA trên gel agarose. Sau khi điện di trên gel, các đoạn DNA đƣợc phân ra tùy theo trọng lƣợng phân tử. Có thể quan sát chúng bằng mắt nhờ kỹ thuật nhuộm màu với ethidium bromide và chụp gel bằng tia UV. Cách tiến hành:  Pha gel agarose với nồng độ 1 %: Cân 0,125 g agarose cho vào 12,5 ml dung dịch TAE 0,5X. Đun sôi bằng lò Viba ở bƣớc sóng 650 W cho đến khi agarose tan hoàn toàn. Để nguội đến khoảng 600C.  Đổ gel, chờ agarose đông  Load mẫu vào các giếng với tỷ lệ 2 l loading dye và 4 l DNA mẫu.  Chạy điện di ở điều kiện 100 V, 250 mA, thời gian khoảng 20 phút.  Nhuộm gel bằng dung dịch ethidium bromide 10mg/ml khoảng 15 phút, sau đó đƣa vào máy Geldoc đọc kết quả. o Định lƣợng DNA bằng phƣơng pháp đo OD Cách tiến hành: 1. Xây dựng đƣờng chuẩn: Dùng dung dịch TE 1X để tạo đƣờng chuẩn. 2. Pha loãng dung dịch DNA đến nồng độ thích hợp để đo với dung dịch TE 1X. Cho vào cuvette. Tiến hành đo OD. - Chỉ tiêu theo dõi o Chất lƣợng DNA: độ sáng của băng DNA, độ smear (gãy) của DNA trên gel điện di. o Độ tinh sạch của DNA: tỷ lệ OD260/OD280 o Hàm lƣợng DNA: từ kết quả OD260 và OD280, có thể ƣớc lƣợng hàm lƣợng DNA theo công thức: 33 Hàm lƣợng DNA (ng/ l) = [(62,9 * OD260nm) – (36 * OD280nm)]* Độ pha loãng  Thí nghiệm 2: Tối ƣu hóa phản ứng RAPD - Thí nghiệm 2a: Khảo sát ảnh hƣởng của số chu kỳ khuếch đại đến sản phẩm RAPD. o Thiết kế thí nghiệm: Thí nghiệm đƣợc bố trí gồm 2 nghiệm thức. Mỗi nghiệm thức đƣợc lặp lại 3 lần. Mỗi nghiệm thức gồm 6 mẫu DNA. Bảng 3.4 Thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng của số chu kỳ đến sản phẩm RAPD Nghiệm thức 1 Nghiệm thức 2 Số chu kỳ Nhiệt độ (0C) Thời gian (phút) Số chu kỳ Nhiệt độ (0C) Thời gian (phút) 1 94 4 1 94 4 40 94 1 37 94 1 37 1 37 1 72 2 72 2 1 72 5 1 72 5 Giữ ở 40C Giữ ở 40C o Phƣơng pháp tiến hành: chọn ngẫu nhiên 6 mẫu DNA có chất lƣợng tốt, thực hiện phản ứng RAPD với nồng độ các thành phần phản ứng nhƣ bảng 3.5 Bảng 3.5 Thành phần phản ứng RAPD dùng trong thí nghiệm 2.1 Hóa chất Nồng độ sử dụng PCR buffer MgCl2 dNTP Primer Taq polymerase DNA mẫu H2O 1X 2 mM 0,2 mM 1 M 0,75 U 25 ng Thêm vừa đủ 25 l o Chỉ tiêu theo dõi: Độ sáng, rõ của các băng khuếch đại trên gel điện di. 34 - Thí nghiệm 2b: Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ primer đến sản phẩm RAPD o Thiết kế thí nghiệm: Thí nghiệm đƣợc bố trí gồm 4 nghiệm thức. Mỗi nghiệm thức đƣợc lặp lại 3 lần. Mỗi nghiệm thức gồm 1 mẫu DNA. Bảng 3.6 Thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ primer đến sản phẩm RAPD Nghiệm thức 1 Nghiệm thức 2 Nghiệm thức 3 Nghiệm thức 4 Nồng độ primer 0,5 M 1 M 1,5 M 2 M o Phƣơng pháp tiến hành: Tiến hành chọn 1 mẫu DNA có chất lƣợng tốt và primer RAPD 6 để khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ primer đến sản phẩm RAPD. o Chỉ tiêu theo dõi: Độ sáng, rõ của băng khuếch đại trên gel điện di. - Thí nghiệm 2c: Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ Mg2+ đến sản phẩm RAPD o Thiết kế thí nghiệm: Thí nghiệm đƣợc bố trí gồm 4 nghiệm thức. Mỗi nghiệm thức đƣợc lặp lại 3 lần. Mỗi nghiệm thức gồm 1 mẫu DNA. Bảng 3.7 Thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ Mg2+ đến sản phẩm RAPD Nghiệm thức 1 Nghiệm thức 2 Nghiệm thức 3 Nghiệm thức 4 Nồng độ Mg2+ 2 mM 2,5 mM 3 mM 3,5 mM o Phƣơng pháp tiến hành: Tiến hành chọn 1 mẫu DNA có chất lƣợng tốt và primer RAPD 6 để khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ Mg2+ đến sản phẩm RAPD. o Chỉ tiêu theo dõi: Độ sáng, rõ của băng khuếch đại trên gel điện di. - Thí nghiệm 2d: Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ Taq polymerase đến sản phẩm RAPD o Thiết kế thí nghiệm: Thí nghiệm đƣợc bố trí gồm 4 nghiệm thức. Mỗi nghiệm thức đƣợc lặp lại 3 lần. Mỗi nghiệm thức gồm 1 mẫu DNA. Bảng 3.8 Thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ Taq đến sản phẩm RAPD Nghiệm thức 1 Nghiệm thức 2 Nghiệm thức 3 Nghiệm thức 4 Nồng độ Taq 0,5 U 0,75 U 1 U 1,5 U 35 o Phƣơng pháp tiến hành: Tiến hành chọn 1 mẫu DNA có chất lƣợng tốt và primer RAPD 6 để khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ Taq polymerase đến sản phẩm RAPD. o Chỉ tiêu theo dõi: Độ sáng, rõ của băng khuếch đại trên gel điện di. - Thí nghiệm 2e: Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ DNA mẫu đến sản phẩm RAPD o Thiết kế thí nghiệm: Thí nghiệm đƣợc bố trí gồm 3 nghiệm thức. Mỗi nghiệm thức đƣợc lặp lại 3 lần. Mỗi nghiệm thức gồm 1 mẫu DNA. Bảng 3.9 Thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ DNA mẫu đến sản phẩm RAPD Nghiệm thức 1 Nghiệm thức 2 Nghiệm thức 3 Nồng độ DNA 100 ng 50 ng 20 ng o Phƣơng pháp tiến hành: Tiến hành chọn 1 mẫu DNA có chất lƣợng tốt và primer RAPD 6 để khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ DNA mẫu đến sản phẩm RAPD. o Chỉ tiêu theo dõi: Độ sáng, rõ của băng khuếch đại trên gel điện di.  Thí nghiệm 3: Đánh giá độ đa dạng di truyền của các giống tiêu tại thị xã Bà Rịa Phản ứng RAPD sau khi tối ƣu các thành phần phản ứng sẽ đƣợc ứng dụng để đánh giá độ đa dạng di truyền của các giống tiêu tại thị xã Bà Rịa. Sản phẩm RAPD đƣợc kiểm tra kích thƣớc bằng điện di trên gel agarose 2%, trong dung dịch đệm TAE 0,5X, dƣới hiệu điện thế 50 V trong 50 phút. Sau đó, gel đƣợc ngâm trong dung dịch ethidium bromide 10 mg/ml và các vạch DNA sẽ đƣợc quan sát dƣới tia UV. Sự hiện diện (mã hóa là 1) hay vắng mặt (mã hóa là 0) của các băng vạch trên bảng gel sẽ đƣợc ghi nhận ở mỗi cá thể, đƣợc dùng để phân tích bằng phần mềm NTSYS. Số liệu này sẽ đƣợc sử dụng để xây ma trận tƣơng đồng (Similarity matrix) hoặc ma trận khoảng cách (Distance matrix). Các ma trận này biểu hiện cho mối quan hệ xa gần về mặt di truyền giữa các mẫu phân tích và đƣợc xây dựng trên công thức toán học của Nei và Li (1979). 36 yx xy S xy 2 xy: Số băng giữa hai mẫu. x: Số băng của mẫu x. y: Số băng của mẫu y. Sxy: Hệ số tƣơng đồng giữa 2 mẫu x và y. Từ Sxy ta tính đƣợc khoảng cách di truyền giữa x và y Dxy = 1 – Sxy Trên cơ sở toán học này, các nhà toán học đã xây dựng các phần mềm WINDIST và NTSYS cho máy tính. Chƣơng trình WINDIST tạo ra ma trận tƣơng đồng từ bộ dữ liệu nhập sẵn. Chƣơng trình NTSYS version 2.1 tạo ra sơ đồ hình cây phản ánh mối quan hệ di truyền giữa các cá thể nghiên cứu (Kangle Zheng và ctv, 1995). Hiện nay 2 chƣơng trình WINDIST và NTSYS đƣợc gộp lại thành chƣơng trình package – NTSYS để tiện dụng hơn. Cách nhập số liệu: Dữ liệu thu đƣợc từ sản phẩm PCR sẽ nhập vào excell theo những quy định chung. Nếu nhƣ sản phẩm có băng hiện diện thì ta sẽ nhập là 1 và 0 nếu không hiện diện băng. Sau khi nhập số liệu, ở hàng đầu tiên chúng ta ký hiệu là 1 (đối với ma trận hình chữ nhật), cột thứ hai ghi số hàng, cột thứ ba ghi số cột, và cột thứ tƣ ghi số 0 nếu không có số liệu thiếu. Sau đó, bản số liệu trong excell sẽ đƣợc dùng để xây dựng ma trận tƣơng đồng trong phần mềm NTSYSpc version 2.1 Sơ đồ cây phát sinh loài sẽ đƣợc tạo ra khi sử dụng phƣơng pháp UPGMA trong phần mềm NTSYS. 37 PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Kết quả điều tra về giống tiêu ở thị xã Bà Rịa 4.1.1. Các giống tiêu và mức độ phổ biến của chúng ở thị xã Bà Rịa Kết quả điều tra cho thấy hiện có 11 giống tiêu đƣợc trồng tại thị xã Bà Rịa. Một số giống tỏ ra thích nghi và cho năng suất cao nhƣ : Ấn Độ đọt tím, Ấn Độ đọt trắng, Vĩnh Linh. Do vậy mà các giống tiêu này đƣợc trồng khá phổ biến. Một số giống tiêu khác nhƣ tiêu Phú Quốc, Karimunda, Ấn Độ lá bầu, Ấn Độ lá dài chỉ xuất hiện lẻ tẻ ở một vài hộ với số lƣợng rất ít. Riêng giống tiêu thuộc nhóm tiêu sẻ tuy có năng suất thấp và khả năng kháng bệnh kém nhƣng vẫn đƣợc trồng phổ biến. Nguyên nhân có thể là do đây là giống tiêu địa phƣơng, có thời gian bắt đầu cho thu hoạch sớm, thích nghi tốt với điều kiện tự nhiên của Bà Rịa – Vũng Tàu và đặc biệt là đa số các hộ nông dân không có thói quen cập nhật các giống cây trồng mới. Bảng 4.1 Các giống tiêu hiện đƣợc trồng tại thị xã Bà Rịa STT Tên giống Số hộ trồng Tỷ lệ (%) 1 Ấn Độ lá bầu 2 4 2 Ấn Độ đọt tím 30 60 3 Paniyur – 1 3 6 4 Ấn Độ lá dài 1 2 5 Ấn Độ đọt trắng 30 60 6 Karimunda 1 2 7 Kuchin 3 6 8 Vĩnh Linh 31 62 9 Phú Quốc 2 4 10 Sẻ lá nhỏ 27 54 11 Sẻ lá lớn 13 26 38 4.1.2. Đặc điểm các giống tiêu tại thị xã Bà Rịa Bảng 4.2 So sánh các đặc trƣng về lá của các giống tiêu STT Tên giống Dài lá (cm) Rộng lá (cm) Gân lá Mép lá Màu sắc lá Dạng lá 1 Ấn Độ lá bầu 13,5 7,8 Rõ GS Hơi nhạt Bầu 2 Ấn Độ đọt tím 10,8 6,2 Rõ GS Đậm Hơi bầu 3 Paniyur – 1 10,7 6,5 Rõ GS Đậm Bầu 4 Ấn Độ lá dài 11,2 5,0 Không rõ GS Đậm Thuôn dài 5 Ấn Độ đọt trắng 12,8 6,8 Rõ GS Đậm Hơi bầu 6 Karimunda 10,2 6,1 Rõ KGS Đậm Thuôn dài 7 Kuchin 9,8 5,2 Rõ GS Đậm Thuôn nhỏ 8 Vĩnh Linh 11,5 6,3 Rõ KGS Đậm Hơi bầu 9 Phú Quốc 11,3 6,2 Không rõ Ít GS Hơi nhạt Thuôn dài 10 Sẻ lá nhỏ 9,4 5,0 Rõ Ít GS Nhạt Thuôn nhỏ 11 Sẻ lá lớn 11,2 6,8 Vừa KGS Vừa Thuôn- TB 39 Bảng 4.3 So sánh một số chỉ tiêu cấu thành năng suất và năng suất của các giống tiêu STT Tên giống Chiều dài gié (cm) Đƣờng kính quả (mm) P 1000 hạt (g) Số hạt/gié Số gié/m2 Năng suất (kg/nọc) 1 Ấn Độ lá bầu 10,76 4,9 56,5 25 128 2,49 2 Ấn Độ đọt tím 12,5 4,8 56,8 26 175 2,6 3 Paniyur – 1 9,0 4,6 54,4 25 106 2,43 4 Ấn Độ lá dài 10,2 4,6 56,4 20 141 2,5 5 Ấn Độ đọt trắng 12,2 4,5 55,5 18 146 2,3 6 Karimunda 8,8 4,7 51,1 28 107 2,25 7 Kuchin 9,8 4,9 57,9 26 103 2,6 8 Vĩnh Linh 10,4 4,8 57,0 23 182 2,47 9 Phú Quốc 11,1 4,7 56,3 22 164 1,9 10 Sẻ lá nhỏ 9,3 4,3a 56,2 25 154 1,85 11 Sẻ lá lớn 9,5 4,7 56 27 118 1,8 40  Giống tiêu Ấn Độ lá bầu - Nguồn gốc xuất xứ: Ấn Độ - Hình thái lá: Dạng lá bầu, dài × rộng trung bình 13,5 × 7,8 cm, gân lá nổi rõ, mép lá gợn sóng, màu xanh hơi nhạt. - Đặc điểm hoa, quả: trọng lƣợng 1000 hạt trung bình là 56,5 kg, số hạt/gié trung bình 25 hạt. Mật độ gié/m2 trung bình 128 gié/m2, chiều dài gié 10,76 cm, đƣờng kính quả tƣơi 4,9 cm. - Tính chống chịu bệnh thông qua ý kiến của nông dân: Mạnh - Mức sinh trƣởng thông qua ý kiến của nông dân: Mạnh. Năng suất bình quân: 2,49 kg/nọc.  Giống tiêu Ấn Độ đọt tím - Nguồn gốc xuất xứ: Ấn Độ - Hình thái lá: Dạng lá hơi bầu, dài × rộng trung bình 10,8 × 6,2 cm, gân lá nổi rõ, mép lá gợn sóng, màu xanh đậm - Đặc điểm hoa, quả: trọng lƣợng 1000 hạt trung bình là 56,8 kg, số hạt/gié trung bình là 26 hạt. Mật độ gié/m2 trung bình 175 gié/m2, chiều dài gié 12,5 cm, đƣờng kính quả tƣơi 4,8 cm. - Tính chống chịu bệnh thông qua ý kiến của nông dân: Khá - Mức sinh trƣởng thông qua ý kiến của nông dân: Mạnh. Năng suất bình quân 2,6 kg/nọc.  Giống tiêu Paniyur – 1 - Nguồn gốc xuất xứ: Ấn Độ - Hình thái lá: Dạng lá bầu, dài × rộng trung bình 10,7 × 6,5 cm, gân lá nổi rõ, mép lá gợn sóng, màu xanh đậm. - Đặc điểm hoa, quả: trọng lƣợng 1000 hạt trung bình là 54,4 kg, số hạt/gié trung bình 25 hạt. Mật độ gié/m2 trung bình 106 gié/m2, chiều dài gié 9,0 cm, đƣờng kính quả tƣơi 4,6 cm. - Tính chống chịu bệnh thông qua ý kiến của nông dân: Trung bình - Mức sinh trƣởng thông qua ý kiến của nông dân: mạnh. Năng suất bình quân 2,43 kg/nọc. 41  Giống tiêu Ấn Độ lá dài - Nguồn gốc xuất xứ: Ấn Độ - Hình thái lá: Dạng lá thuôn dài, dài × rộng trung bình 11,2 × 5,0 cm, gân lá không rõ, mép lá gợn sóng, màu xanh đậm - Đặc điểm hoa, quả: trọng lƣợng 1000 hạt trung bình 56,4 kg, số hạt/gié trung bình 20 hạt. Mật độ gié/m2 trung bình 141 gié/m2, chiều dài gié 10,2 cm, đƣờng kính quả tƣơi 4,6 cm. - Tính chống chịu bệnh thông qua ý kiến của nông dân: Mạnh - Mức sinh trƣởng thông qua ý kiến của nông dân: Mạnh. Năng suất bình quân 2,5 kg/nọc.  Giống tiêu Ấn Độ đọt trắng - Nguồn gốc xuất xứ: Ấn Độ - Hình thái lá: Dạng lá hơi bầu, dài × rộng trung bình 12,8 × 6,8 cm, gân lá nổi rõ, mép lá gợn sóng, màu xanh đậm. - Đặc điểm hoa, quả: trọng lƣợng 1000 hạt trung bình 55,5 kg, số hạt/gié trung bình 18 hạt. Mật độ gié/m2 trung bình 146 gié/m2, chiều dài gié 12,2 cm, đƣờng kính quả tƣơi 4,5 cm - Tính chống chịu bệnh thông qua ý kiến của nông dân: Mạnh - Mức sinh trƣởng thông qua ý kiến của nông dân: Mạnh. Năng suất bình quân 2,3 kg/nọc.  Giống tiêu Karimunda - Nguồn gốc xuất xứ: Ấn Độ - Hình thái lá: Dạng lá thuôn dái, dài × rộng trung bình 10,2 × 6,1 cm, gân lá nổi rõ, mép lá không gợn sóng, màu xanh đậm. - Đặc điểm hoa, quả: trọng lƣợng 1000 hạt trung bình 51,1 kg, số hạt/gié trung bình 28 hạt. Mật độ gié/m2 trung bình 107 gié/m2, chiều dài gié 8,8 cm, đƣờng kính quả tƣơi 4,7 cm. - Tính chống chịu bệnh thông qua ý kiến của nông dân: Khá - Mức sinh trƣởng thông qua ý kiến của nông dân: Mạnh. Năng suất bình quân 2,25 kg/nọc. 42  Giống tiêu Kuchin - Nguồn gốc xuất xứ: Mã Lai - Hình thái lá: Dạng lá thuôn nhỏ, dài × rộng trung bình 9,8 × 5,2 cm, gân lá nổi rõ, mép lá gợn sóng, màu xanh đậm. - Đặc điểm hoa, quả: trọng lƣợng 1000 hạt trung bình 57,9 kg, số hạt/gié trung bình 26 hạt. Mật độ gié/m2 trung bình 103 gié/m2, chiều dài gié 9,8 cm, đƣờng kính quả tƣơi 4,9 cm. - Tính chống chịu bệnh thông qua ý kiến của nông dân: Mạnh - Mức sinh trƣởng thông qua ý kiến của nông dân:Mạnh. Năng suất bình quân 2,6 kg/nọc.  Giống tiêu Vĩnh Linh - Nguồn gốc xuất xứ: Indonesia - Hình thái lá: Dạng lá hơi bầu, dài × rộng trung bình 11,5 × 6,3 cm, gân lá nổi rõ, mép lá không gợn sóng, màu xanh đậm. - Đặc điểm hoa, quả: trọng lƣợng 1000 hạt trung bình 57,0 kg, số hạt/gié trung bình 23 hạt. Mật độ gié/m2 trung bình 182 gié/m2, chiều dài gié 10,4 cm, đƣờng kính quả tƣơi 4,8 cm. - Tính chống chịu bệnh thông qua ý kiến của nông dân: Khá - Mức sinh trƣởng thông qua ý kiến của nông dân: Trung bình. Năng suất bình quân 2,47 kg/nọc.  Giống tiêu Phú Quốc - Nguồn gốc xuất xứ: Campuchia - Hình thái lá: Dạng lá thuôn dài, dài × rộng trung bình 11,3 × 6,2 cm, gân lá nổi không rõ, mép lá ít gợn sóng, màu xanh hơi nhạt. - Đặc điểm hoa, quả: trọng lƣợng 1000 hạt trung bình 56,3 kg, số hạt/gié trung bình 22 hạt. Mật độ gié/m2 trung bình 164 gié/m2, chiều dài gié 11,1 cm, đƣờng kính quả tƣơi 4,7 cm. - Tính chống chịu bệnh thông qua ý kiến của nông dân: Trung bình - Mức sinh trƣởng thông qua ý kiến của nông dân: Mạnh. Năng suất bình quân 1,9 kg/nọc. 43  Giống tiêu sẻ lá nhỏ - Nguồn gốc xuất xứ: giống đại phƣơng - Hình thái lá: Dạng lá thuôn nhỏ, dài × rộng trung bình 9,4 × 5,0 cm, gân lá nổi rõ, mép lá ít gợn sóng, màu xanh nhạt. - Đặc điểm hoa, quả: trọng lƣợng 1000 hạt trung bình 56,2 kg, số hạt/gié trung bình 25 hạt. Mật độ gié/m2 trung bình 154 gié/m2, chiều dài gié 9,3 cm, đƣờng kính quả tƣơi 4,3 cm. - Tính chống chịu bệnh thông qua ý kiến của nông dân: Trung bình - Mức sinh trƣởng thông qua ý kiến của nông dân: Trung bình. Năng suất bình quân 1,85 kg/nọc.  Giống tiêu sẻ lá lớn - Nguồn gốc xuất xứ: giống địa phƣơng - Hình thái lá: Dạng lá thuôn trung bình, dài × rộng trung bình 11,2 × 6,8 cm, gân lá nổi vừa, mép lá không gợn sóng, màu xanh vừa. - Đặc điểm hoa, quả: trọng lƣợng 1000 hạt trung bình 56 kg, số hạt/gié trung bình 27 hạt. Mật độ gié/m2 trung bình 118 gié/m2, chiều dài gié 9,5 cm, đƣờng kính quả tƣơi 4,7 cm. - Tính chống chịu bệnh thông qua ý kiến của nông dân: Kém - Mức sinh trƣởng thông qua ý kiến của nông dân: Kém. Năng suất bình quân 1,8 kg/nọc. 4.2. Kết quả phản ứng RAPD 4.2.1. Kết quả khảo sát 3 quy trình tách chiết DNA DNA là thông tin di truyền, là vật liệu quan trọng dùng trong các thao tác nghiên cứu về phân tử. Vì vậy, việc tìm ra quy trình ly trích DNA nhằm thu đƣợc DNA tinh sạch, có chất lƣợng cao là bƣớc đầu tiên, không thể thiếu trong các nghiên cứu sinh học phân tử. Sau khi tiến hành ly trích DNA tổng số từ lá tiêu theo ba quy trình, chúng tôi tiến hành kiểm tra chất lƣợng DNA tổng số ly trích đƣợc bằng phƣơng pháp điện di và đo mật độ quang. 44 Hình 4.1 DNA ly trích theo quy trình 1 Giếng 1: Mẫu DNA của giống Ấn Độ đọt trắng Giếng 2: Mẫu DNA của giống Ấn Độ đọt tím Giếng 3: Mẫu DNA của giống Vĩnh Linh Giếng 4: Mẫu DNA của giống Karimunda Giếng 5: Mẫu DNA của giống Phú Quốc Hình 4.2 DNA ly trích theo quy trình 2 Giếng 1: Mẫu DNA của giống Ấn Độ đọt trắng Giếng 2: Mẫu DNA của giống Ấn Độ đọt tím Giếng 3: Mẫu DNA của giống Vĩnh Linh Giếng 4: Mẫu DNA của giống Karimunda Giếng 5: Mẫu DNA của giống Phú Quốc Hình 4.3 DNA ly trích theo quy trình 3 Giếng 1: Mẫu DNA của giống Ấn Độ đọt trắng Giếng 2: Mẫu DNA của giống Ấn Độ đọt tím Giếng 3: Mẫu DNA của giống Vĩnh Linh Giếng 4: Mẫu DNA của giống Karimunda Giếng 5: Mẫu DNA của giống Phú Quốc Bảng 4.4 Tỷ lệ mẫu DNA tổng số tinh sạch ly trích theo các quy trình khảo sát Quy trình Số mẫu thực hiện Số mẫu không tinh sạch Tỷ lệ mẫu tinh sạch 1 15 4 73,3 % 2 15 8 46,6 % 3 15 3 80% 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 45 26.70% 73.30% 53.40% 46.60% 20.00% 80% 0.00% 20.00% 40.00% 60.00% 80.00% 100.00% 1 2 3 Quy trình Tỷ lệ mẫu DNA tinh sạch của ba quy trình ly trích % mẫu tinh sạch % mẫu không tinh sạch Biểu đồ 4.1 Tỷ lệ mẫu DNA tổng số tinh sạch của ba quy trình ly trích khảo sát Bảng 4.5 Hàm lƣợng DNA tổng số ly trích theo ba quy trình khảo sát Quy trình Hàm lƣợng DNA thu đƣợc (ng/ l) 1 373,63 2 190,58 3 137,57 Biểu đồ 4.2 So sánh hàm lƣợng DNA tổng số ly trích theo ba quy trình 393.87 190.58 137.57 0 100 200 300 400 ng/ul 1 2 3 Hàm lượng DNA tổng số ly trích theo ba quy trình khảo sát 46 Qua khảo sát ba quy trình ly trích, chúng tôi rút ra đƣợc những nhận xét: - Quy trình ly trích 1: Trong tổng số 15 mẫu đƣợc ly trích thì chỉ có 4 mẫu không tinh sạch, đồng thời, DNA ly trích đƣợc không bị gãy do trong quá trình nghiền có sử dụng nitơ lỏng. - Quy trình 2 : Do sử dụng tác nhân biến tính protein là chloroform/isoamyl alcohol (24:1) là tác nhân biến tính protein yếu nên không đủ để loại bỏ protein tạp trong quá trình ly trích DNA. Đồng thời, quá trình phá vỡ màng tế bào bằng cách nghiền với dung dịch EB rất dễ dẫn đến hiện tƣợng DNA bị gãy nhiều. - Quy trình 3: Quá trình phá vỡ màng tế bào bằng cách nghiền trong dung dịch EB nên rất dễ dẫn đến việc DNA bị gãy. Tuy tỷ lệ mẫu DNA tinh sạch thu đƣợc cao hơn hai quy trình trên nhƣng lƣợng DNA thu đƣợc ít do thực hiện quá trình biến tính protein nhiều lần, qua nhiều lần thao tác làm mất đi một lƣợng DNA. Dựa vào các kết quả thu đƣợc, chúng tôi quyết định chọn quy trình 1 để tiến hành ly trích DNA tổng số từ lá của các giống tiêu. 4.2.2. Kết quả tối ƣu hóa thành phần RAPD  Ảnh hƣởng của số chu kỳ khuếch đại đến sản phẩm RAPD Sản phẩm RAPD thu đƣợc ở cả hai nghiệm thức đều rất mờ cho thấy số chu kỳ khuếch đại trong trƣờng hợp này không ảnh hƣởng đến sản phẩm RAPD. Nguyên nhân làm cho sản phẩm khuếch đại ít là do thành phần phản ứng RAPD không phù hợp. Vì vậy, chúng tôi giữ nguyên số chu kỳ khuếch đại là 40 chu kỳ và tiến hành tối ƣu các thành phần phản ứng RAPD. Hình 4.4 Sản phẩm RAPD khi chạy 40 chu kỳ Thứ tự các giếng 1 – 6: Sản phẩm RAPD trên primer RAPD 6 của các giống tiêu Ấn Độ đọt trắng, Ấn Độ lá dài, Paniyur – 1, Kuchin, Phú Quốc, Ấn Độ lá bầu 1 2 3 4 5 6 47 Hình 4.5 Sản phẩm RAPD khi chạy 37 chu kỳ Thứ tự các giếng 1 – 6: Sản phẩm RAPD trên primer RAPD 6 của các giống tiêu Ấn Độ đọt trắng, Ấn Độ lá dài, Paniyur – 1, Kuchin, Phú Quốc, Ấn Độ lá bầu  Ảnh hƣởng của nồng độ primer đến sản phẩm RAPD Kết quả khảo sát cho thấy nồng độ primer cũng ảnh hƣởng nhiều đến kết quả phản ứng RAPD. Nồng độ primer quá thấp sẽ dẫn đến kết quả RAPD mờ trong khi nồng độ primer quá cao sẽ ức chế phản ứng. Theo nhƣ kết quả khảo sát, chúng tôi nhận thấy nồng độ primer tối ƣu cho phản ứng RAPD là 1 M. Hình 4.6 Khảo sát nồng độ primer Giếng 1: Nồng độ primer là 0,5 M Giếng 2: Nồng độ primer là 1 M Giếng 3: Nồng độ primer là 1,5 M Giếng 4: Nồng độ primer là 2 M  Ảnh hƣởng của nồng độ Mg2+ đến sản phẩm RAPD Nồng độ Mg2+ thấp hoặc cao đều ảnh hƣởng đến phản ứng RAPD. Nồng độ Mg 2+ thấp sẽ làm hạn chế quá trình kéo dài. Ngƣợc lại nồng độ Mg2+ cao sẽ giúp ổn định dây đôi DNA và ngăn ngừa sự biến tính hoàn toàn của sản phẩm trong mỗi chu kỳ, làm cho sản phẩm PCR ít đi. Kết quả khảo sát cho thấy nồng độ Mg2+ tối ƣu cho phản ứng RAPD là 3 mM. Hình 4.7 Khảo sát nồng độ Mg 2+ Giếng 1: Nồng độ Mg2+ là 2 mM Giếng 2: Nồng độ Mg2+ là 2.5 mM Giếng 3: Nồng độ Mg2+ là 3 mM Giếng 4: Nồng độ Mg2+ là 3,5 mM 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 1 2 3 4 48 1 2 3 4  Ảnh hƣởng của nồng độ Taq polymerase đến sản phẩm RAPD Nồng độ Taq quá thấp sẽ không đủ lƣợng enzyme để xúc tác tạo sản phẩm nhƣ mong muốn. Ngƣợc lại, nồng độ Taq quá cao sẽ tạo ra những sản phẩm không chuyên tính, gây sai lệch kết quả. Qua kết quả khảo sát, chúng tôi thấy nồng độ Taq tối ƣu cho phản ứng RAPD là 0,75 U. Hình 4.8 Khảo sát nồng độ Taq polymerase Giếng 1: Nồng độ Taq là 0,5 U Giếng 2: Nồng độ Taq là 0,75 U Giếng 3: Nồng độ Taq là 1 U Giếng 4: Nồng độ Taq là 1,5 U  Ảnh hƣởng của nồng độ DNA mẫu đến sản phẩm RAPD Kết quả khảo sát cho thấy nồng độ DNA mẫu không ảnh hƣởng nhiều đến phản ứng RAPD. Chúng tôi nhận thấy nồng dộ DNA mẫu 50 ng là tối ƣu cho phản ứng RAPD. Hình 4.9 Khảo sát nồng độ DNA mẫu Giếng 1: Nồng độ DNA mẫu là 100 ng Giếng 2: Nồng độ DNA mẫu là 50 ng Giếng 3: Nồng độ DNA mẫu là 25 ng 1 2 3 49 Sau khi khảo sát các thành phần của phản ứng RAPD, chúng tôi đƣa ra thành phần phản ứng tối ƣu Bảng 4.6 Nồng độ tối ƣu của các thành phần phản ứng RAPD Thành phần Nồng độ PCR buffer dNTPs Primer Mg 2+ Taq polymerase DNA mẫu Nƣớc cất 1X 0,2 mM 1 M 3 mM 0,75 U 50 ng thêm vào cho đủ 25 l 4.2.3. Đánh giá độ đa dạng di truyền của các giống tiêu ở thị xã Bà Rịa Sau khi tiến hành tối ƣu các thành phần phản ứng RAPD, chúng tôi thực hiện phản ứng RAPD trên các mẫu DNA của các giống tiêu thu thập đƣợc tại thị xã Bà Rịa. Chúng tôi nhận thấy, trong tổng số 19 primer sử dụng thì chỉ có 4 primer cho sản phẩm RAPD, các primer còn lại hoặc không cho sản phẩm ở tất cả các giống hoặc chỉ cho sản phẩm ở một hoặc hai giống. Bảng 4.7 Số băng khuếch đại và băng đa hình trên một số primer Primer Số băng khuếch đại Số băng đa hình RAPD 6 10 3 OPA 10 10 9 AL 08 6 3 OPD 05 3 1  Primer RAPD 6 Trong số 4 primer cho sản phẩm RAPD thì primer RAPD 6 là primer cho sản phẩm trên tất cả 11 giống tiêu khảo sát. Số băng đa hình ghi nhận đƣợc ở primer này là 3. Băng đa hình có kích thƣớc khoảng 700bp chỉ thấy xuất hiện ở các giống tiêu Ấn Độ đọt trắng, Ấn Độ lá dài, Paniyur – 1 và Ấn Độ lá bầu. 50 Hình 4.10 Sản phẩm khuếch đại RAPD với primer RAPD 6. L: thang chuẩn ; thứ tự các giếng (1 – 11): Ấn Độ đọt trắng, Ấn Độ lá dài, Paniyur – 1, Kuchin, Phú Quốc, Ấn Độ lá bầu, Karimunda, Ấn Độ đọt tím, Vĩnh Linh, sẻ lá nhỏ, sẻ lá lớn  Primer OPA 10 Kết quả khảo sát trên primer OPA 10 cho thấy có 10 băng khuếch đại, trong số đó, có 9 băng đa hình. Tuy nhiên, primer OPA 10 này không cho sản phẩm trên giống tiêu Ấn Độ đọt trắng, Ấn Độ lá dài, Kuchin và Ấn Độ đọt tím. Ở hai giống tiêu sẻ lá lớn và sẻ lá nhỏ đồng thời xuất hiện băng đa hình (hình 4.12). Có thể băng đa hình này là chỉ thị đặc trƣng cho hai giống tiêu sẻ này. Tuy nhiên, do giới hạn của đề tài, chúng tôi chƣa xác định đƣợc kích thƣớc của băng này. Ngoài ra, ở giống Paniyur – 1 có xuất hiện một băng đa hình kích thƣớc khoảng 350bp. Đây có thể là chỉ thị đặc trƣng cho giống tiêu này. Hình 4.11 Sản phẩm khuếch đại RAPD với primer OPA 10 L : thang chuẩn ; giếng 1 – 8: Ấn Độ đọt trắng, Paniyur – 1, Ấn Độ lá bầu, Phú Quốc, Karimunda, Vĩnh Linh, sẻ lá nhỏ, sẻ lá lớn (L 1 2 3 4 5 6 7 8 ( L 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 51  Primer AL 08 Kết quả khảo sát trên primer AL 08 cho thấy primer này chỉ cho sản phẩm khuếch đại ở 5 giống tiêu : Ấn Độ đọt trắng, Phú Quốc, Ấn Độ lá bầu, Karimunda và sẻ lá lớn với tổng số băng khuếch đại là 6, trong đó số băng đa hình là 3. Duy nhất ở giống tiêu Ấn Độ đọt trắng có xuất hiện băng đa hình kích thƣớc khoảng 1500bp. Vì vậy, có thể xem băng này là chỉ thị để nhận biết giống tiêu Ấn Độ đọt trắng.  Primer OPD 05 Kết quả khảo sát trên primer OPD 05 cho thấy primer này chỉ cho sản phẩm khuếch đại ở 4 giống tiêu: Paniyur – 1, Kuchin, Phú Quốc và Karimunda. Số băng thu đƣợc trên primer này ít (chỉ có 3 băng) và số băng đa hình chỉ có 1. Băng đa hình duy nhất này có kích thƣớc khoảng 1100bp và xuất hiện duy nhất ở giống tiêu Karimunda. Hình 4.12 Sản phẩm RAPD trên primer OPD 05 (a) và AL 08 (b) L: thang chuẩn, giếng 1 – 11: Ấn Độ đọt trắng, Ấn Độ lá dài, Paniyur – 1, Kuchin, Phú Quốc, Ấn Độ lá bầu, Karimunda, Ấn Độ đọt tím, Vĩnh Linh, sẻ lá nhỏ, sẻ lá lớn.  Phân tích số liệu bằng phần mềm NTSYS Từ kết quả RAPD thu đƣợc trên gel điện di, chúng tôi mã hóa thành dạng nhị phân và đƣa vào phân tích bằng phần mềm NTSYS. ( (a)L 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 (b)L 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 52 Coefficient 0.42 0.56 0.70 0.84 0.97 Kuchin Adtr LD tim VL P1 ADB PQ SN SL Kuchin Kari Bảng 4.8 Hệ số đồng dạng di truyền của 11 giống tiêu Adtr LD P1 ADB Kuchin PQ Kari tim VL SN SL Adtr 1.00 LD 0.76 1.00 P1 0.55 0.74 1.00 ADB 0.55 0.79 0.79 1.00 Kuchin 0.53 0.50 0.66 0.66 1.00 PQ 0.76 0.63 0.47 0.47 0.50 1.00 Kari 0.42 0.34 0.45 0.45 0.42 0.50 1.00 tim 0.74 0.97 0.71 0.82 0.47 0.66 0.37 1.00 VL 0.74 0.87 0.71 0.71 0.47 0.71 0.47 0.89 1.00 SN 0.58 0.71 0.61 0.61 0.37 0.82 0.42 0.74 0.79 1.00 SL 0.50 0.53 0.53 0.58 0.66 0.74 0.39 0.55 0.50 0.71 1.00 Kết quả cho thấy mức tƣơng đồng gen cao nhất giữa hai giống Ấn Độ đọt tím và Ấn Độ lá dài (0,97) chứng tỏ hai giống này có cùng nguồn gốc và đứng rất gần nhau trong cây phát sinh loài. Mức tƣơng đồng gen thấp nhất giữa hai giống Karimunda và Ấn Độ lá dài chứng tỏ hai giống này sẽ đứng rất xa nhau trong cây phát sinh loài. Hình 4.13 Cây phân nhóm di truyền dựa vào kết quả RAPD Sơ đồ cây phát sinh loài cho thấy, các giống tiêu khảo sát chia thành 2 nhóm với mức tƣơng đồng gen biến thiên từ 0,34 đến 0,97. Điều này cho thấy các giống tiêu khảo sát có sự đa dạng cao về mặt di truyền. 53 Nhóm 1 gồm giống Karimunda, nhóm 2 bao gồm các giống còn lại. Trong đó, mức tƣơng đồng gen giữa nhóm 1 và nhóm 2 là 0,42. Kết quả này cho thấy giống Karimunda có sự khác biệt xa về mặt di truyền so với các giống khác. Điều này có lẽ do giống Karimunda tuy có nguồn gốc là Ấn Độ (cùng nguồn gốc với một số giống tiêu ở nhóm 2) nhƣng theo nhƣ thông tin chúng tôi thu thập đƣợc thì đây lại là giống tiêu thuần (các giống Ấn Độ ở nhóm 2 đều là các giống tiêu lai) và mới đƣợc du nhập vào Việt Nam những năm gần đây. Nhóm 2 phân thành 2 nhóm nhỏ: nhánh 2A là giống tiêu Kuchin và nhánh 2B gồm những giống tiêu còn lại. Mức tƣơng đồng gen giữa nhóm 2A và 2B là khoảng 0,52. Mức tƣơng đồng này khá thấp chứng tỏ giống tiêu Kuchin và các giống tiêu ở nhánh 2B có nguồn gốc khác nhau. Điều này đúng với thực tế điều tra, Kuchin là giống tiêu đƣợc du nhập từ Mã Lai. Nhánh 2B đƣợc phân thành 2 nhánh: nhánh 2B1 bao gồm các giống sẻ lá nhỏ, sẻ lá lớn, Phú Quốc và nhánh 2B2 bao gồm các giống Ấn Độ đọt trắng, Ấn Độ lá dài, Ấn Độ đọt tím, Vĩnh Linh, Paniyur – 1, Ấn Độ lá bầu. Trong đó, mức tƣơng đồng gen giữa nhánh 2B1 và 2B2 là khoảng 0,61. Ở nhánh 2B1 chúng tôi nhận thấy mức tƣơng đồng di truyền khá cao giữa giống tiêu sẻ lá nhỏ với tiêu Phú Quốc (0,8) mặc dù theo thông tin thu thập đƣợc thì hai giống này có nguồn gốc khác nhau. Giống tiêu Phú Quốc có nguồn gốc từ Campuchia còn giống tiêu sẻ lá lớn và sẻ lá nhỏ có nguồn gốc địa phƣơng. Sự bất hợp lý này có thể là do sai sót trong quá trình thu mẫu hoặc do sai lầm của nông dân trong việc gọi tên giống. Nhánh 2B2 bao gồm phần lớn các giống tiêu Ấn Độ. Nhánh này đƣợc phân thành 2 nhánh nhỏ: nhánh 2B2a gồm giống tiêu Ấn Độ đọt trắng và nhánh 2B2b gồm các giống tiêu Ấn Độ lá dài, Ấn Độ đọt tím, Vĩnh Linh, Paniyur – 1, Ấn Độ lá bầu. Vì bao gồm hầu hết là các giống tiêu có cùng nguồn gốc Ấn Độ nên mức tƣơng đồng gen giữa 2 nhánh nhỏ 2B2a và 2B2b khá cao (0,68). Nhánh 2B2b lại đƣợc phân ra thành 2 nhánh: nhánh thứ nhất bao gồm giống tiêu Paniyur – 1 và Ấn Độ lá bầu, nhánh thứ hai bao gồm giống tiêu Ấn Độ lá dài, Ấn Độ tím và Vĩnh Linh. Theo nhƣ thông tin thu thập đƣợc thì giống Vĩnh Linh có nguồn gốc từ Indonesia nhƣng lại đứng rất gần với các giống tiêu Ấn Độ trong cây phát sinh loài với mức tƣơng đồng gen rất cao (0,9) . Khi so về hình thái bên ngoài thì giống tiêu 54 Vĩnh Linh này có hình thái rất giống với giống tiêu Ấn Độ đọt tím, điều này có thể đã dẫn đến sai sót trong quá trình thu mẫu. Tóm lại, qua kết quả cây phát sinh loài ở hình 4. cho thấy các giống tiêu hiện đƣợc trồng tại thị xã Bà Rịa có mức độ đa dạng cao về mặt di truyền. Qua các số liệu điều tra và kết quả cây phát sinh loài, bƣớc đầu có thể đề xuất vật liệu lai cho công tác chọn tạo giống mới ví dụ nhƣ hai giống tiêu Ấn Độ đọt tím và giống Kuchin là hai giống có năng suất cao nhƣng lại rất khác biệt về mặt di truyền, đây sẽ là vật liệu tốt cho việc lai tạo giống mới có chất lƣợng tốt hơn. 55 PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận Từ những kết quả thu đƣợc, có thể đƣa ra một số kết luận sau:  Về kết quả điều tra giống tiêu Hiện có 11 giống tiêu đang đƣợc trồng tại thị xã Bà Rịa. Các giống tiêu Ấn Độ đọt tím, Kuchin, Ấn Độ lá dài, Vĩnh Linh là các giống cho năng suất cao, trong khi giống tiêu thuộc nhóm tiêu sẻ, Phú Quốc là những giống cho năng suất thấp. Nhìn chung, các giống tiêu có sự khác biệt về hình thái lá, các yếu tố cấu thành năng suất. Tuy nhiên, giữa giống tiêu Vĩnh Linh và giống Ấn Độ đọt tím, giống Phú Quốc và giống sẻ lá nhỏ có nhiều đặc điểm hình thái giống nhau.  Về quy trình ly trích DNA Quy trình 1 cho kết quả tốt khi ly trích DNA tổng số từ lá tiêu. DNA thu đƣợc ít bị gãy và hàm lƣợng khá cao do chỉ qua một lần biến tính protein bằng phenol/chloroform (1:1).  Về phản ứng RAPD Chỉ có 4 primer RAPD 6, OPA 10, AL 08, OPD 05 trong tổng số 19 primer cho sản phẩm khuếch đại trên hầu hết các giống tiêu. Kết quả bƣớc đầu cho thấy trên primer OPA 10, AL 08, OPD 05 có các băng đa hình có thể là chỉ thị giúp nhận diện các giống tiêu sẻ, Ấn Độ đọt trắng, Paniyur – 1 và Karimunda.  Về phân nhóm di truyền Các giống tiêu khảo sát có sự đa dạng cao về mặt di truyền với mức tƣơng đồng gen biến thiên từ 0,34 đến 0,97. Trong đó, mức tƣơng đồng gen cao nhất giữa hai giống Ấn Độ đọt tím và Ấn Độ lá dài (0,97) và thấp nhất là giữa hai giống Karimunda và Ấn Độ lá dài. 5.2. Đề nghị o Tiếp tục khảo sát thêm nhiều primer và nhiều mẫu hơn để có kết quả chính xác hơn. Từ đó, tìm ra những chỉ thị liên kết với các tính trạng tốt của các giống. o Kết hợp phân nhóm di truyền dựa vào kết quả RAPD với việc phân nhóm di truyền dựa vào dữ liệu kiểu hình để có những nhận định chính xác và độ tin cậy cao hơn trong công tác tuyển chọn và lai tạo giống mới. 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT 1. Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn, 2004. Báo cáo ngành hàng quý I/04 : Mặt hàng hạt tiêu. Hà Nội, 6 trang. 2. Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang, 2004. Di truyền phân tử. Nhà xuất bản Nông Nghiệp Tp. Hồ Chí Minh. 3. Hồ Bích Liên, 2002. Xây dựng phƣơng pháp chẩn đoán bắp chuyển gen và nghiên cứu hiện trạng các sản phẩm bắp chuyển gen nhập khẩu vào Việt Nam. Khóa luận tốt nghiệp kỹ sƣ nông học, Đại học Nông Lâm, TP. Hồ Chí Minh. 4. Hoàng Thị Bích Thủy, 2004. Khảo sát đa hình giống dứa Cayenne dựa trên kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymophic DNA). Khóa luận tốt nghiệp Cử Nhân Công Nghệ Sinh Học, Đại học Khoa học Tự Nhiên TP. Hồ Chí Minh. 5. Lê Thị Thanh Tuyền, 2005. Nghiên cứu đa dạng nguồn gen dứa Cayenne bằng marker phân tử. Khóa luận tốt nghiệp Kỹ sƣ Công Nghệ Sinh Học, Đại học Nông Lâm, TP. Hồ Chí Minh, Việt Nam. 6. Mai Xuân Liễu, 2003. Điều tra giống và kỹ thuật canh tác cây tiêu (Piper nigrum L.) tại huyện Tân Thành tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu. Khóa luận tốt nghiệp Kỹ sƣ Nông học, Đại học Nông Lâm, TP. Hồ Chí Minh, Việt Nam. 7. Nguyễn Nghĩa Thìn, 2005. Đa dạng sinh học và tài nguyên di truyền thực vật. Nhà xuất bản ĐHQG Hà Nội. 8. Nguyễn Thị Lang, 1999. Những phương pháp cơ bản trong nghiên cứu Công Nghệ Sinh Học. Nhà xuất bản Nông Nghiệp, Tp. Hồ Chí Minh. 9. Nguyễn Thị Ngọc Thắm, 2005. Khảo sát năng suất cây hồ tiêu bị bệnh virus tại huyện Châu Đức tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu. Khóa luận tốt nghiệp Kỹ sƣ Nông học, Đại học Nông Lâm, TP. Hồ Chí Minh, Việt Nam. 10. Nhiều tác giả, 2004. Cây gia vị, đặc điểm và kỹ thuật gieo trồng. Nhà xuất bản Thanh Hóa. 11. Phạm Thị Chín, Nguyễn Xuân Vinh, 2005. Tuyển chọn các giống tiêu tốt tại tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu. 12. Phạm Văn Bình, 2005. Đánh giá sơ bộ mức độ đa dạng di truyền của quần thể điều (Acanardium occidentale L.) hiện đƣợc trồng tại tỉnh Ninh Thuận bằng kỹ thuật 57 RAPD và AFLP. Khóa luận tốt nghiệp Kỹ sƣ Công Nghệ Sinh Học, Đại học Nông Lâm, TP. Hồ Chí Minh, Việt Nam. 13. Phan Gia Tân, 2001. Kỹ thuật thâm canh cây tiêu. Tài liệu tập huấn, Đại học Nông Lâm, TP. Hồ Chí Minh, Việt Nam. 14. Phan Hữu Trinh, Trần Thị Mai, Vũ Đình Thắng và Bùi Đắc Tuấn, 1987. Kỹ thuật trồng tiêu. Nhà xuất bản nông nghiệp. 15. Tôn Nữ Tuấn Nam, Trần Kim Loang, 2001. Kỹ thuật trồng và chăm sóc hồ tiêu. Tài liệu tập huấn, Viện Khoa Học Kỹ Thuật Nông Lâm Nghiệp Tây Nguyên, Dak Lak. 16. Trần Văn Hòa, 2001. 101 câu hỏi thường gặp trong sản xuất nông nghiệp – Tập 9. Nhà xuất bản Trẻ. TIẾNG NƢỚC NGOÀI 17. John M. S. Bartlett, David Stirling, 2002. Methods in Molecular Biology Vol. 226: PCR protocols, 2nd edition. Humana press Inc., Totowa, NJ. 18. K. Johnson George, G. Ganga, R. Sandeep Varma, B. Sasikumar, K. V. Saji, 2004. Identification of hydrids in black pepper (Piper nigrum L.) using male parent – specific RAPD markers. Current science, Vol. 88, No. 2. 19. Kurt Weising, Hilde nybom, Kirsten Woff, Wieland Meyer, 1995. DNA fingerprinting in plants and fingi. CRC press, Inc. 20. M. J. McPherson, S. G. Moller, 2000. PCR. The Cromwell press, UK. 21. Singth RK, SN Kakar, 1977. Control on individual trait means during index selection. Proc. Thrid Congr. SABRAO (Canberra), 3 d): 22 – 25. 22. T. Pradeepkumar, J.L. Karihaloo, Sunil Archak and Ambika Baldev, 2003. Analysis of genetic diversity in Piper nigrum L. using RAPD markers. Genetic Resources And Crop Evolution 50: 469 – 475. Kluwer Academic Publishers, Netherlands. 58 TRANG WEB 23. %20English%20chuan%20_13-4-04_.pdf 24. 25. 26. ống%20tiêu&m=99&opt=all&dk=and &datefrom=&dateto=&lr=&kieu=0&num=10&layID=106116 27. 28. 59 PHỤ LỤC Sự khác biệt về hình thái lá của các giống tiêu 60 Quy trình Mẫu Tỷ lệ OD260/OD280 OD260 OD280 Lƣợng DNA Quy trình 1 1 1.756722 0.91404 0.52031 387.6196 2 1.715766 0.21526 0.12546 90.23294 3 1.710408 0.71897 0.42035 300.9061 4 1.522363 0.33935 0.22291 133.2036 5 2.345865 0.4505 0.19204 214.2301 6 2.09649 0.3207 0.15297 146.6511 7 2.05111 0.410099 0.19994 185.9739 8 1.9398 0.8481 0.43721 376.0593 9 1.905104 1.3254 0.69571 583.221 10 2.066649 2.3938 1.1583 1088.712 11 1.943333 1.6317 0.83964 724.0689 12 1.781846 0.99582 0.55887 425.1776 13 1.802458 0.87403 0.48491 375.1973 14 1.947248 0.80988 0.41591 359.6869 15 1.888244 0.54321 0.28768 238.1143 Mean 393.87 Quy trình 2 1 1.386965 0.60842 0.43867 224.77498 2 1.525349 1.3118 0.86 515.5222 3 1.701231 0.29171 0.17147 121.75639 4 1.461896 0.32745 0.22399 125.32965 5 1.701028 0.32277 0.18975 134.71233 6 1.432653 0.55064 0.38435 207.98656 7 1.498756 0.36733 0.24509 142.81817 8 1.706098 0.38191 0.22385 159.63539 9 1.859305 0.24937 0.13412 108.57053 10 1.891878 0.48801 0.25795 214.09629 11 1.797555 0.9927 0.55225 425.5983 12 2.044013 0.30233 0.14791 136.91797 13 1.900373 0.2907 0.15297 127.7811 14 2.084683 0.22919 0.10994 104.58211 15 1.859305 0.24937 0.13412 108.57053 Mean 190.5768 61 Quy trình Mẫu Tỷ lệ OD260/OD280 OD260 OD280 Lƣợng DNA Quy trình 3 1 2.28309 0.16033 0.070225 75.56657 2 2.135097 0.18728 0.087715 86.22172 3 1.859305 0.24937 0.13412 108.5705 4 1.706098 0.38191 0.22385 159.6354 5 1.75955 0.30171 0.17147 128.0464 6 1.751335 0.84297 0.48133 356.9493 7 1.900373 0.2907 0.15297 127.7811 8 2.044013 0.30233 0.14791 136.918 9 2.041153 0.21526 0.10546 97.43294 10 2.186371 0.40907 0.1871 189.949 11 1.949894 0.16033 0.082225 71.24657 12 2.135097 0.18728 0.087715 86.22172 13 1.859305 0.24937 0.13412 108.5705 14 1.891878 0.48801 0.25795 214.0963 15 1.939316 0.26237 0.13529 116.3263 Mean 62 MẪU PHIẾU ĐIỀU TRA NÔNG DÂN Ngày điều tra .............................................. 1. Họ tên chủ vƣờn: .................................................................................................... 2. Nơi chốn: Ấp: ............................ Xã, phƣờng: ........................................................ Huyện: ............................................ 3. Tổng diện tích canh tác: (ha). Số cây:……………… cây 4. Các giống tiêu hiện trồng và một số đặc điểm của chúng STT Tên giống Dài lá (cm) Rộng lá (cm) Gân lá Mép lá Màu sắc lá Dạng lá 1 2 3 4 STT Tên giống Chiều dài gié (cm) Đƣờng kính quả (mm) P 1000 hạt (g) Số hạt/gié Số gié/m2 Năng suất (kg/nọc) Kháng bệnh Sinh trƣởng 1 2 3 4 Ngày……….. tháng……..năm 2006 Ngƣời điều tra. STT Tên giống Dây lƣơn (số tháng sau trồng) Dây thân ( số tháng sau trồng) Năng suất vụ đầu (kg/trụ) Năng suất trung bình (sau 5 năm trồng, kg/trụ) 1 2 3 4 63 DANH SÁCH CÁC HỘ NÔNG DÂN ĐIỀU TRA Họ tên Họ tên Nguyễn Xuân Vinh Nguyễn Văn Ba Phạm Thị Chín Lê Thị Bảy Nguyễn Duy Khánh Phạm Thị Bé Em Nguyễn Thị Ánh Ngọc Trần Thị Oanh Trần Văn Lai Đặng Thu Liên Trần Thị Thiên Hƣơng Đinh Văn Trung Phạm Văn Ngà Hồ Sỹ Trí Nguyễn Văn Hùng Võ Thành Chung Lê Minh Tâm Mai Thanh Liêm Lê Thị Em Bùi Thanh Ngọc Phạm Văn Hai Trịnh Văn Hai Phạm Văn Ba Nguyễn Văn Thanh Nguyễn Thị Hƣơng Huỳnh Thị Hoa Biện Lan Thanh Lý Ngọc Minh Đinh Viết Quốc Nam Võ Hữu Tình Võ Thị Lũy Nguyễn Thị Nhàn Nguyễn Thị Thanh Minh Mạch Thị Bé Phan Văn Ba Mạch Thị Ánh Phạm Văn Sơn Nguyễn Khắc Thú Nguyễn Sinh Trƣờng Trần Văn Triều Lê Văn Cầu Lê Hữu Ngọ Nguyễn Văn Chái Võ Thị Tốt Huỳnh Văn Tiêm Nguyễn Văn Thuật Lê Quang Cảnh Đỗ Văn Đức Nguyễn Đình Khoa Nguyễn Nhƣ Cảm