MỞ ĐẦU
Nước ta có khí hậu và thảm thực vật khá phong phú và đa dạng. Dân tộc Việt Nam có truyền thống về sử dụng các loài thảo mộc làm thuốc chữa bệnh. Những năm gần đây xu hướng tìm kiếm một số hoạt chất trong các loài thảo mộc có tác dụng chữa bệnh ngày một tăng, thu hút các nhà khoa học nghiên cứu.
Theo các số liệu thống kê mới nhất thảm thực vật Việt Nam có trên
12000 loài, trong số đó có trên 3200 loài thực vật được sử dụng làm thuốc trong Y học dân gian [1], [2], [3], [4], [5].
Từ xưa đến nay, những cây thuốc dân gian vẫn đóng vai trò hết sức quan trọng trong việc chăm sóc sức khoẻ cho con người. Ngày nay những hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học được phân lập từ cây cỏ đã được ứng dụng trong rất nhiều ngành công nghiệp, nông nghiệp và chăm sóc sức khoẻ con người. Chúng được dùng để sản xuất thuốc chữa bệnh, thuốc bảo vệ thực vật, làm nguyên liệu cho ngành công nghiệp thực phẩm và mỹ phẩm v.v . Mặc dù công nghệ tổng hợp hoá dược ngày nay đã phát triển mạnh mẽ, tạo ra các biệt dược khác nhau sử dụng trong công tác phòng, chữa bệnh, nhờ đó giảm tỷ lệ tử vong rất nhiều, song những đóng góp của các thảo dược cũng không vì thế mà mất đi chỗ đứng trong Y học. Nó vẫn tiếp tục được dùng như là nguồn nguyên liệu trực tiếp, gián tiếp hoặc cung cấp những chất đầu cho công nghệ bán tổng hợp nhằm tìm kiếm những dược phẩm mới cho việc điều trị các chứng bệnh thông thường cũng như các bệnh nan y. Các số liệu gần đây cho thấy rằng, có khoảng 60% dược phẩm được dùng chữa bệnh hiện nay, hoặc đang thử cận lâm sàng đều có nguồn gốc từ thiên nhiên [7].
Trong công tác phòng chữa bệnh ở nước ta, Đảng và Nhà nước luôn chủ trương và khuyến khích Đông Tây y kết hợp để chăm sóc sức khoẻ cho nhân dân, kế thừa và phát huy vốn quý của nền Y học cổ truyền trong đó có nhiều cây thuốc quý.
Trong thế giới thực vật muôn màu, nhiều loài cây cỏ đã được sử dụng như những dược liệu quý. Trong số đó có cây Ké đầu ngựa đặc biệt là bộ phận quả của cây. Loài cây này mọc rất phổ biến ở Việt Nam, thường mọc ở vùng đất hoang, bờ ruộng, bờ đường, xen kẽ với các loại cỏ khác.
Dân gian thường dùng Ké đầu ngựa chữa phong hàn, đau đầu, chân tay đau co rút, phong tê thấp, đau khớp, mũi chảy nước hôi, mày đay, lở ngứa, chữa đau răng, đau họng, biếu cổ, hủi, eczema [4].
Để góp phần nghiên cứu làm rõ thành phần, tính chất của các chất hoá học trong thực vật làm thuốc chữa bệnh chúng tôi chọn hướng nghiên cứu hoá học các hợp chất thiên nhiên.
Tên đề tài là: “Nghiên cứu hoá học các hợp chất có hoạt tính sinh học trong quả Ké đầu ngựa (Xanthium strumarium L.)”, nhằm làm rõ các cơ sở khoa học cho việc sử dụng cây Ké đầu ngựa như một nguồn dược liệu quý, dùng làm thuốc chữa bệnh.
Với ý nghĩa khoa học và thực tiễn nêu trên, nhiệm vụ của đề tài này là tiến hành phân lập các chất hoá học có trong quả Ké đầu ngựa, nhận dạng cấu tạo hoá học của một số chất tách được bằng các phương pháp hoá lý hiện đại.
MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DÙNG TRONG LUẬN VĂN DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG LUẬN VĂN
DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ SƠ ĐỒ TRONG LUẬN VĂN
Trang
MỞ ĐẦU .1
CHưƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. KHÁI QUÁT VỀ HỌ CÚC (ASTERACEAE) VÀ CHI XANTHIUM 3
1.1.1. Họ cúc (asteraceae) . 3
1.1.2. Chi xanthium 3
1.2. GIỚI THIỆU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM CỦA CÂY KÉ ĐẦU NGỰA . 4
1.2.1. Đặc điểm thực vật . 4
1.2.2. Đặc điểm sinh thái . 4
1.3. MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VỀ THỰC VẬT CHI XANTHIUM . 5
1.3.1. Một số nghiên cứu hoá thực vật quả Ké đầu ngựa . 5
1.3.2. Sử dụng trong y học dân gian 8
1.3.3. Một số bài thuốc dân gian từ quả Ké đầu ngựa 9
1.4. CÁC DẠNG AXIT BÉO HAY GẶP TRONG TỰ NHIÊN .10
CHưƠNG 2: PHẦN THỰC NGHIỆM
2.1. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .18
2.1.1. Thu mẫu cây, xác định tên khoa học và phương pháp
sử lý mẫu 18
2.1.2. Phương pháp phân lập các hợp chất từ các dịch chiết . 20
2.1.3. Phương pháp khảo sát và xác định cấu trúc hoá học
các hợp chất 20
2.2. DỤNG CỤ, HOÁ CHẤT VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU .20
2.2.1. Dụng cụ và hoá chất . 20
2.2.2. Thiết bị nghiên cứu 22
2.3. CÁC DỊCH CHIẾT TỪ QUẢ KÉ ĐẦU NGỰA
(XANTHIUM STRUMARIUM L.) 22
2.3.1. Các dịch chiết 22
2.3.2. Thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định
(antimicrobial activity) 24
2.3.3. Phát hiện định tính các nhóm chất 25
2.3.3.1. Các ancaloit . 25
2.3.3.2. Các sterol 26
2.3.3.3. Các flavonoit . 26
2.3.3.4. Các saponin 26
2.3.3.5. Các cumarin 26
2.3.3.6. Các tanin 27
2.3.3.7. Các glucozit trợ tim 27
2.4. PHÂN LẬP VÀ TINH CHẾ CÁC CHẤT 28
2.4.1. Phân tích thành phần các axit béo trong dịch chiết n-hexan
của quả Ké đầu ngựa trên GC . 29
2.4.2. Phân lập và tinh chế các chất trong dịch chiết n-hexan;
etylaxetat của quả ké đầu ngựa bằng phương pháp sắc ký cột . 31
2.4.2.1. – Sitosterol (KĐN.H8) . 31
2.4.2.2. 3-O- -D-glucopyranosyl--Sitosterol (KĐN.E33) . 32
CHưƠNG 3: THẢO LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. NGUYÊN TẮC CHUNG 35
3.2. PHÁT HIỆN CÁC NHÓM CHẤT CÓ TRONG DỊCH CHIẾT N-HEXAN, DỊCH CHIẾT ETYLAXETAT VÀ DỊCH CHIẾT METANOL CỦA QUẢ KÉ ĐẦU NGỰA (XANTHIUM STRUMARIUM L.) .36
3.3. KẾT QUẢ THỬ HOẠT TÍNH KHÁNG VI SINH VẬT KIỂM ĐỊNH DỊCH CHIẾT
N-HEXAN, DỊCH CHIẾT ETYLAXETAT VÀ DỊCH CHIẾT METANOL CỦA
QUẢ KÉ ĐẦU NGỰA (XANTHIUM STRUMARIUM L) .36
3.4. XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG VÀ THÀNH PHẦN HOÁ HỌC CỦA QUẢ KÉ
ĐẦU NGỰA 38
3.4.1. Các axit béo . 38
3.4.2. Các hợp chất sterol . 41
3.4.2.1. β-sitosterol hay 24R-stigmast-5 en-3-õ-ol (KĐN.H8) 41
3.4.2.2. 3-O--D-glucopyranosyl--sitosterol (KĐN.E33) . 44
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45
TÀI LIỆU THAM KHẢO 46
PHỤ LỤC 49
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DÙNG TRONG LUẬN VĂN
ã Các phương pháp sắc ký
SKLM : Sắc ký lớp mỏng
CC : Column chromatography
ã Các phương pháp phổ
UV : Ultraviolet spectroscopy
GC : Gas Chromatography
GC - MS : Gas Chromatography - Mass Spectroscopy
EI - MS : Electron Impact Mass Spectroscopy
ESI - MS : Electron sprayionisation - Mass Spectroscopy FAB - MS : Fast Atom Bombardment Mass spectroscopy FT-IR : Fourier Transform Infrared Spectroscopy NMR : Nuclear Magnetic Resonance
1H-NMR : 1H-Nuclear Magnetic Resonance
13C-NMR : 13C- Nuclear Magnetic Resonance
DEPT : Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer
COSY : Correlated Spectroscopy
HMQC : Heteronuclear Multiple - Quantum Coherence HMBC : Heteronuclear multiple - Bond Correlation NOESY : Nuclear Overhauser and Exchange Spetroscopy MIC : Minimum inhibitory concentration
DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ SƠ ĐỒ TRONG LUẬN VĂN
Hình
Và sơ đồ Nội dung Trang
Hình 1.1 Công thức dạng tổng quát của các chất I, II, III 7
Hình 1.2 Cấu trúc của chất I 8
Hình 2.1 Cây Ké đầu ngựa 19
Hình 2.2: Quả Ké đầu ngựa 19
Sơ đồ 2.1 Quy trình ngâm chiết mẫu 23
Sơ đồ 2.2: Sơ đồ chung nghiên cứu một số thành phần hoá học quả
Ké đầu ngựa thuộc chi Xanthium strumarium L. 28
Sơ đồ 2.3 Phân lập chất từ dịch chiết n-Hexan của quả Ké đầu ngựa 31
Sơ đồ 2.4 Phân lập chất từ dịch chiết Etylaxetat của quả Ké đầu ngựa 33
Sơ đồ 3.1 Sự phân mảnh EI – MS của chất KĐN.H8 42
DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG LUẬN VĂN
Tên bảng Nội dung Trang
Bảng 1.1 Các dạng axit béo no thường gặp trong tự nhiên 13
Bảng 1.2 Các axit béo không no thường gặp trong tự nhiên 15
Bảng 2.1 Khối lượng cặn chiết từng phân đoạn của quả Ké đầu ngựa
(Xanthium strumarium L.) 24
Bảng 2.2 Kết quả thử hoạt tính sinh học các dịch chiết từ quả
Ké đầu ngựa 25
Bảng 2.3 Phát hiện định tính các nhóm chất 27
Bảng 2.4 Kết quả thành phần axit béo 30
Bảng 3.1 Các cấu tử có hàm lượng axit béo trên 1% trong quả Ké
đầu ngựa 39
Bảng 3.2 Các cấu tử có hàm lượng axit béo dưới 1% trong quả Ké
đầu ngựa 39
Bảng 3.3 Số liệu phổ 13C-NMR (CDCl3, 125Mhz) của õ-sitosterol 43 .
73 trang |
Chia sẻ: banmai | Lượt xem: 1923 | Lượt tải: 2
Bạn đang xem trước 20 trang tài liệu Luận văn Nghiên cứu hóa học các hợp chất có hoạt tính sinh học trong quả ké đầu ngựa, để xem tài liệu hoàn chỉnh bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
phần chính của
phosphatidylglycerol
-Có trong thực vật, khuẩn
que
-Có trong dong tảo, thực vật
bậc cao, vi khuẩn
16
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
cis-9- hexadecenoic
Palmitoleic -Phổ biến trong động vật,
thực vật, tổ chức vi sinh vật,
là cấu phần chủ yếu của một
vài loài hạt thực vật
18 cis-11-
hexadecenoic
cis-9-octadecenoic
cis-11-ctadecenoic
Palmivacceni
c
Oleic
Vaccenic
10,5
13,0
-Có trong dầu các hạt thực
vật.
-Phổ biến hầu hết trong các
động vật, thực vật và tổ chức
vi sinh vật
-Có trong E-coli và các vi
khuẩn khác
16
18
Axít béo 2 nối đôi
cis,cis-7,10-
hexadecadienoic
cis,cis-9,12-
hexadecadienoic
cis,cis-6-9-
octadecenoic
cis,cis-9-12-
octadecenoic
Linoleic
-5,0
Phổ biến trong thực vật,
rong, tảo…
-Cấu tử thứ yếu
Cấu phần thứ yếu ở động vật
sống.
-Cấu phần chủ yếu trong lipit
thực vật, ở động vật và con
người, nó chỉ bổ xung vào
qua con đường thức ăn rau
quả hoặc dầu mỡ thực vật và
sinh vật biển
Axít béo 3 nối đôi
17
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
16
18
16
16
20
(Phân cách đều
đặn bởi một nhóm
metylen)
all-cis-7,10,13-
hexadecatrienoic
all-cis-6,9,12-
octadecatrienoic
all-cis-9,12,15-
hexadecatrionic
Axít béo 3 nối đôi
(nối đôi liên hợp)
Cis-9,trans-
11,trans-13-
octadecatrienoic
Axít béo 4 nối đôi
all-cis-4,7,10,13-
hexadecatrionic
all-cis-5,8,11,14-
eicosatetraenoic
ó-Linoleic
ỏ-Linolenic
Elecostearic
Arachidonic
-11
44
-49,5
-Có ở thực vật bậc cao và
rong tảo biển
-Là cấu phần thứ yếu trong
động vật và một vài loài rong
biển.Là cấu thành rất quan
trọng của một vài loài thực
vật
-Phổ biến ở thực vật bậc cao
và rong tảo biển, là cấu phần
đặc biệt của galatosyl
diglycerit.
-Có trong dầu hạt một số loài
cây đặc biệt dầu trẩu
-Là cấu phần quan trọng của
lipit động vật và một vài rong
tảo biển. Đặc biệt là thành
phần chủ yếu của
phospholipit
Axit béo 5 nối đôi
18
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
22
22
All-cis-
7,10,13,16,19-
Docosapentaenoic
Axít béo 6 nối đôi
All-cis-
4,7,10,13,16,19-
docosahexanenoic
clupanodonic
DHA
Phổ biến ở động vật sống,
đặc biệt tham gia cấu thành
phospholipit, rất đa dạng ở
trong mỡ cá biển
Phổ biến ở động vật sống,
đặc biệt tham gia cấu thành
phospholipit, rất đa dạng ở
trong mỡ cá biển
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
18
CHƢƠNG 2: PHẦN THỰC NGHIỆM
2.1. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1.1. Thu mẫu cây, xác định tên khoa học và phƣơng pháp xử lý mẫu
Nguyên liệu để nghiên cứu là quả của cây Ké đầu ngựa được thu hái
vào cuối tháng 8 đầu tháng 9 năm 2006 tại huyện Phú Lương, tỉnh Thái
Nguyên.
Quả Ké đầu ngựa còn được gọi là Thương nhĩ tử (Trung Quốc). Có tên
khoa học là Xanthium strumarium L., thuộc họ Cúc Asteraceae [5].
Mẫu quả tươi thu hái về (16kg), đưa đi sấy ngay ở nhiệt độ 1100 C khoảng 10
phút để diệt men. Sau đó sấy khô ở 50-600 C cho tới khi độ ẩm nhỏ hơn 10%
thu được 8.8kg mẫu khô. Mẫu khô được nghiền nhỏ và được ngâm chiết kiệt
nhiều lần bằng etanol 900 ở nhiệt độ phòng.
Sau khi cất loại dung môi, cặn cô được chiết lần lượt bằng các loại
dung môi có độ phân cực tăng dần: n-hexan, etylaxetat và metanol.
Các dịch chiết được đuổi kiệt dung môi bằng thiết bị cô quay ở nhiệt độ
khoảng 500 C dưới áp suất giảm. Các cặn thô được đưa lên các loại cột sắc ký
khác nhau để phân lập các chất có trong từng phân đoạn và thường phải kết
hợp nhiều phương pháp khác nhau như: dùng hệ dung môi chạy cột có độ
phân cực tăng dần để phân ly các chất có độ phân cực gần giống nhau, kết
hợp với kết tinh phân đoạn và kết tinh lại trong dung môi thích hợp. Riêng
cặn thô n-Hexan được metyl hoá (este hoá) bằng MeOH xúc tác HCl. Đun hồi
lưu khoảng 8 tiếng, sau đó trung hoà bằng NaHCO3 cho đến pH = 7, chiết 3
lần bằng n-Hexan. Dịch chiết tổng cô khô và được đưa đi phân tích bằng thiết
bị GC.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
19
Hình 2.1. Cây Ké đầu ngựa
Hình 2.2. Quả Ké đầu ngựa
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
20
2.1.2. Phƣơng pháp phân lập các hợp chất từ các dịch chiết
Để phân lập được những hợp chất sạch từ các dịch cô khác nhau của
quả Ké đầu ngựa cần phối hợp sử dụng các phương pháp sắc ký và kết tinh lại
trong dung môi thích hợp :
- Sắc ký lớp mỏng (SKLM)
- Sắc ký cột Silicagel thường
2.1.3. Phƣơng pháp khảo sát và xác định cấu trúc hoá học các hợp chất
Các chất tinh khiết phân lập ra sẽ được xác định những hằng số lý hoá
đặc trưng: màu sắc, mùi vị, Rf, điểm nóng chảy, v.v...Sau đó sẽ tiến hành ghi
các các loại phổ như: phổ tử ngoại (UV), phổ hồng ngoại (FT-IR), phổ cộng
hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR), cacbon-13 (13C-NMR) với các kỹ thuật
một chiều (1D-NMR) và 2 chiều (2D-NMR) tuỳ theo từng hợp chất.
2.2. DỤNG CỤ, HOÁ CHẤT VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU
2.2.1. Dụng cụ và hoá chất
Các loại dung môi dùng để ngâm chiết mẫu là các loại tinh khiết (pure),
còn các loại dung môi dùng để chạy sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng hay dùng
trong phân tích là loại tinh khiết phân tích (PA).
Loại Silicagel G60 của hãng hoá chất Merck được dùng để tráng ra các
loại sắc ký lớp mỏng với các kích cỡ khác nhau trên tấm thuỷ tinh, và được
hoạt hoá 4 giờ ở nhiệt độ 1100 C. Ngoài ra các tấm sắc ký lớp mỏng đế nhôm
DC-Alufolien Kieselgel 60F254 Art.5554 và đế nhựa (polyme) DC-
Plastikfolien Kieselgel 60F254 Art.5735 tráng sẵn, độ dày 0,2mm cũng đã
được sử dụng để xác định số thành phần có trong các dịch chiết, các phân
đoạn chạy cột và kiểm tra sơ bộ độ sạch của sản phẩm thu được.
Các hệ dung môi triển khai SKLM.
1. n-Hexan-etylaxetat (2:1) Hệ A
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
21
2. n-Hexan-etylaxetat (5:1) Hệ B
3. n-Hexan-etylaxetat (8:1) Hệ C
4. Cloroform-metanol (9:1) Hệ D
5. Cloroform-metanol (5:1) Hệ E
Các tấm SKLM sau khi sấy khô được soi dưới đèn tử ngoại (UV-
BIOBLOCK) ở bước sóng =254nm (365nm) rồi được phun bằng thuốc thử
Vanilin 1% trong hỗn hợp metanol + H2SO4 đặc và sấy trên 100
0C hoặc đưa
vào buồng I2 để xác định thành phần cấu tử.
Các giá trị Rf trong hệ dung môi triển khai được biểu thị: RfA(B,
C)x100.
Sắc ký cột thường sử dụng silicagel Merck 60, cỡ hạt 230-400 mesh
(0,040 đến 0,063mm hoặc 0,1 đến 0,16mm).
Các dụng cụ khác được sử dụng trong quá trình nghiên cứu là:
- Cân phân tích.
- Máy cất quay chân không.
- Bộ chiết Shoxlet.
- Bình nón, bình định mức, bình cầu, buret, picromet, pipet
- Cột thủy tinh các cỡ có khóa để làm cột sắc ký
Hoá chất:
Dung dịch axit sunfuric (H2SO4).
Dung dịch axit chlohiđric (HCl).
Dung dịch axit axetic (CH3COOH).
Tinh thể muối natrisunfat khan (Na2SO4).
Dung dịch Sodium metanolat, axetyl chlorit.
Dung dịch axit HCl 0,5N trong nước
Dung dịch KOH 0,5N trong cồn
Dung dịch KOH 0,1N trong nước
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
22
Hỗn hợp dung môi ete etylic - cồn 950 (2:1 theo thể tích)
2.2.2. Thiết bị nghiên cứu
- Nhiệt độ nóng chảy đo trên máy Boátus (Đức) hoặc trên máy
Electrothermal IA-9200.
- Góc quay cực []D đo trên máy Polartronic-D, chiều dài cuvet = 1cm.
- Phổ hồng ngoại ghi trên máy IMPACT-410 (Viện Hoá học -
TTKHTN & CNQG) dạng viên nén KBr.
- Phổ khối lượng ghi trên máy MS-Engine-5989-HP ion hoá bằng va
chạm electron (EI-MS) 70eV, và sử dụng ngân hàng dữ liệu
DATABASE/WILLEY 250L. Phổ FAB-MS(NaCH3COO) ghi trên máy LC-
MS-Trap-00127.
- Phổ 1H-NMR và 13C-NMR ghi trên máy Bruker 500MHz (Viện Hoá
học –Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam ) hoặc Bruker 200MHz,
400MHz AVANCE (Bruker) nội chuẩn TMS, dung môi CDCl3 , DMSO-d6
hoặc C5H5N-d5.
- Phổ GC-MS ghi trên máy sắc ký khí Finigan Trace GC ultra-Colum, cột:
BFX70 (50Mx0.32MM x 0.25uM).
Carrier: N2, Pressure cant: 1000kPa, split 15:1, Air: 350ml/min,
H2:35ml/min.
Chương trình chạy nhiệt độ: 850(0/min.) -1500(10/min) -2000(10/min) -
230
0
(5/min).
2.3. CÁC DỊCH CHIẾT TỪ QUẢ KÉ ĐẦU NGỰA (XANTHIUM STRUMARIUM
L.)
2.3.1 Các dịch chiết.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
23
Quả Ké đầu ngựa đã sấy khô, nghiền nhỏ được ngâm chiết kiệt bằng
etanol ở nhiệt độ phòng cho đến khi thu được dịch không màu. Dịch chiết
được cất loại dung môi ở áp suất giảm đến dạng cao lỏng, sau đó lần lượt
chiết với các loại dung môi: n-hexan, etylaxetat và metanol.
Các dịch chiết nói trên được làm khan bằng Na2SO4, lọc và cất kiệt
dung môi bằng cô quay dưới áp suất giảm ở nhiệt độ 500 C. Cặn được sấy khô
và cân để xác định trọng lượng. Như vậy từ quả Ké đầu ngựa thu nhận được 3
phân đoạn là n-hexan, etylaxetat, metanol với các ký hiệu tương ứng là:
KĐN.H, KĐN.E và KĐN.M (xem trong sơ đồ 2.1).
Kí hiệu:
- KĐN.H sản phẩm thu được từ dịch chiết quả Ké đầu ngựa bằng n-Hexan
- KĐN.E sản phẩm thu được từ dịch chiết quả Ké đầu ngựa bằng EtOAc
- KĐN.M sản phẩm thu được từ dịch chiết quả Ké đầu ngựa bằng MeOH
Sơ đồ 2.1 Qui trình ngâm chiết mẫu
n-hexan EtOAc
Mẫu khô nghiền nhỏ
1. n-hexan (KĐN.H) 2. Etylaxetat (KĐN.E) 3. Dịch cái
1.Etanol
2.Cặn + H2O
4. Metanol (KĐN.M)
1.Cô khô
2.
Metanol
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
24
Bảng 2.1: Khối lƣợng cặn chiết từng phân đoạn
của quả Ké đầu ngựa
(Xanthium strumarium L.)
Bộ phận
Khối
lượng
mẫu (g)
Cặn chiết
n-hexan (g) EtOAc (g) MeOH (g)
KĐN.H KĐN.E KĐN.M
Quả 1600 62,7 14,8 93,2
2.3.2 Thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định
(antimicrobial activity).
* Đối tượng thử: Các chủng vi sinh vật và nấm gây bệnh kiểm định
- Vi khuẩn Gr (-): Pseudomonas aeruginosa (Pa), E. coli (Ec)
- Vi khuẩn Gr (+): Bacillus subtillis (Bs), Staphylococcus aureus (Sa).
- Nấm men : Candida albicans (Ca).
Chất tham khảo: Amphotericin B
Amoxicilin
*Phương pháp thử :
Bước1: Pha loãng mẫu thử bằng phương pháp pha loãng đa nồng độ
Mẫu ban đầu có nồng độ 20mg/ml được pha loãng bằng các nồng độ
khác nhau để thử hoạt tính với các chủng có từ nồng độ 128ỡg/ml; 32ỡg/ml;
8ỡg/ml; 2ỡg/ml; 0,5ỡg/ml đối với chất sạch, 256ỡg/ml; 64ỡg/ml; 16ỡg/ml;
4ỡg/ml; 1ỡg/ml đối với dịch chiết.
Bước 2: Thử hoạt tính:
Chuẩn bị dung dịch vi sinh vật hoặc nấm với nồng độ 5.105 khi tiến hành
thử.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
25
Lấy 10ỡl dung dịch mẫu thử theo các nồng độ đã được pha loãng thêm
200ỡl dung dịch vi sinh vật hoặc nấm, ủ 370 sau 24 giờ, đọc độ đục tế bào trên
máy Tecan, xử lý số liệu và tính toán giá trị IC50.
Bảng 2.2 Kết quả thử hoạt tính sinh học các dịch chiết
từ quả Ké đầu ngựa
STT Tên mẫu
Tên chủng vi sinh vật kiểm định
Ec.
Escherichia
coli
IC50 g/ml
Pa:
Pseudomonas
aeruginosa
IC50 g/ml
Bs:
Bacillus
subtilis
IC50 g/ml
Sa:
Staphylococcus
aureus
IC50 g/ml
Ca:
Candida
albicans
IC50
g/ml
01 KĐN.H > 256 > 256 > 256 > 256 > 256
02 KĐN.E > 256 > 256 > 256 > 256 > 256
03 KĐN.M > 256 > 256 > 256 > 256 > 256
Nhận xét : Các mẫu thử không có hoạt tính kháng các chủng vi sinh vật
kiểm định trên ở nồng độ < 256 g/ml.
2.3.3 Phát hiện định tính các nhóm chất
2.3.3.1. Các ancaloit
Lấy 0,01g cặn chiết của các phân loại, thêm 5ml H2SO4 5%, khuấy
đều lọc qua giấy lọc, sau đó lấy vào 3 ống nghiệm, mỗi ống 1ml nước lọc axit
này.
Ống 1: cho 1 – 2 giọt dung dịch silicostungtic axit 5%, nếu có tủa
trắng và nhiều là dương tính.
Ống 2: cho 1 – 2 giọt thuốc thử Dragendorff: nếu thấy xuất hiện
màu da cam là phản ứng dương tính.
Ống 3 : cho 3 – 5 giọt thuốc thử Mayer: nếu xuất hiện kết tủa trắng
là dương tính.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
26
2.3.3.2. Các sterol
Lấy 0,01gam cặn chiết của các phân đoạn cho thêm 2ml NaOH 10%
đun trên bếp cách thuỷ đến khô. Hoà tan cặn vào 2ml Clorofoc, sau đó thêm
một giọt thuốc thử Liebermann - Burchard (hỗn hợp 1ml anhyđric axetic+
1ml cloroform để lạnh ở 00C sau đó thêm 1 giọt H2SO4 đậm đặc). Nếu thấy
giữa hai lớp chất xuất hiện các màu xanh nhạt (có thể có màu lục, cam, hồng
hoặc đỏ) bền vững trong một thời gian là dương tính.
2.3.3.3. Các flavonoit
Lấy 0,01g cặn chiết của các phân đoạn, thêm 10ml Metanol , đun nóng
cho tan hết rồi lọc qua giấy lọc .
Lấy 2ml dung dịch trên cho vào ống nghiệm, thêm một ít bột Magiê
kim loại, sau đó cho vào 5 giọt HCl đậm đặc. Đun trong bình cách thuỷ vài
phút, quan sát thấy dung dịch xuất hiện màu đỏ hoặc hồng là dương tính với
các flavonoit.
2.3.3.4. Các saponin.
Chuẩn bị các dung dịch thử như 2.3.3.3. Lấy 2ml dịch thử cho vào
ống nghiệm cao 25cm, rồi thêm 25ml nước cất, bịt miệng ống nghiệm và
lắc trong vòng 5 phút theo chiều dọc, quan sát sự xuất hiện và mức độ bền
của bọt (nếu bọt cao quá 3 - 4cm và bền trên 15 phút là có dấu hiệu dương
tính). Dung dịch không tạo bọt là phản ứng âm tính.
2.3.3.5. Các Cumarin
Dung dịch để thử định tính được chuẩn bị như mục 2.3.3.3. Lấy vào 2
ống nghiệm mỗi ống 2ml dung dịch thử, cho vào một trong hai ống đó 0,5ml
NaOH 10%. Đun cả hai ống trên bếp cách thuỷ đến sôi, lấy ra để nguội rồi
mỗi ống lại cho thêm 5ml nước cất. Nếu chất lỏng ở ống nghiệm có kiềm
trong hơn ống không có kiềm có thể xem là dương tính. Nếu đem axit hoá
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
27
ống có kiềm bằng một vài giọt HCl đặm đặc sẽ làm cho dung dịch đang trong
xuất hiện vẩn đục và có thể tạo kết tủa là dương tính.
2.3.3.6. Các tanin.
Lấy 0,01gam chiết phẩm, thêm 10ml nước cất, khuấy đều, nhỏ 2 đến 3
giọt FeCl3 5%, nếu có màu xanh lục hoặc đen là dương tính.
2.3.3.7. Các glucozit trợ tim
Cần thực hiện 02 phản ứng
Phản ứng Kellere – Kaliani: Thuốc thử gồm 2 dung dịch:
Dung dịch 1: 100ml axit axetic loãng + 1ml FeCl3 5%
Dung dịch 2: 100 ml H2SO4 đậm đặc + 1mlFeCl3 5%
Cách làm : Lấy 0,01 gam cặn chiết các phân đoạn cho vào ống nghiệm,
thêm vào đó 1ml dung dịch 1, lắc đều cho tan hết, nghiêng ông nghiệm rồi
cho từ từ 1ml dung dịch 2 theo thành ống nghiệm, quan sát sự xuất hiện màu
đỏ hay nâu đỏ giữa 2 lớp chất lỏng. Nếu không thấy xuất hiện màu là phản
ứng âm tính với các glucosit tim vì các glucozit tim luôn luôn có mặt các
desoxysacarit.
Phản ứng Legal : Cho vào ống nghiệm 0,5 ml dịch thử , thêm vào 1 giọt
dung dịch prussiat 0,5% và 2 giọt NaOH 10% nếu thấy xuất hiện màu đỏ là
dương tính với vòng butenolid.
Bảng 2.3. Phát hiện định tính các nhóm chất
STT Nhóm chất Phản ứng đặc hiệu Kết quả thử các phân đoạn
KĐN.H KĐN.E KĐN.M
1 Ancaloit dd silicostungtic axit 5% + + +
2 Sterol Liebermanm-Burchard + + +
3 Flavonoit Xianidin - - -
4 Saponin Tạo bọt - + +
5 Cumarin Tác dụng kiềm và axit - - +
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
28
Chiết n - hexan Chiết Etylaxetat
Cất loại dung môi
Cất loại dung môi
GC - MS
Sắc ký cột
Silicagel
Sắc ký cột
Silicagel
6 Tanin FeCl3 5% - - +
7 Glucozit trợ tim Kelle-Kaliani - - -
2.4. PHÂN LẬP VÀ TINH CHẾ CÁC CHẤT
Sơ đồ 2.2. Sơ đồ chung nghiên cứu một số thành phần hoá học
quả Ké đầu ngựa thuộc chi Xanthium strumarium L.
Metyl hoá
Dịch chiết
n- hexan
Dịch chiết
Etylaxetat
Dầu béo
Cặn chiết
Etylaxetat
Xác định
hàm lượng
và TP axit
béo
Căn chiết n-
hexan
Chiết Shoxlet
1. n - hexan
2. Etylaxetat
KĐN.H8
KĐN.E33
Quả Ké đầu ngựa sấy
khô, nghiền nhỏ
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
29
2.4.1. Phân tích thành phần các axít béo trong dịch chiết n-Hexan của
quả Ké đầu ngựa trên GC.
Hàm lượng lipit tổng: % (so với trọng lượng mẫu tươi)
Thành phần axit béo được xác định dưới dạng metyl este trên sắc ký khí GC
theo phương pháp tiêu chuẩn ISO/FDIS 5509:1998, LB Đức. Trong thực
nhiệm 10mg dầu béo được hoà tan với 1ml n-Hexan lắc kĩ trong lọ nhỏ, nút
kín.
Bổ xung 25ml dung dịch CH3ONa trong metanol (2mol/l) và lắc kĩ trong 1
phút
Bổ xung 1ml nước cất vào, lắc kĩ và phân lớp bằng ly tâm 3000 vòng/phút.
Hút lớp sáp không phản ứng ở dưới loại đi.
Bổ xung 100 ml HCl, lắc kĩ và phân lớp bằng ly tâm 3000 vòng/phút.
Loại bỏ kiệt lớp bẩn dưới đáy, lớp dung môi trên được làm khan bằng Na2SO4
và phân lớp bằng ly tâm 3000 vòng/phút. Chuyển mẫu đã metyl hoá sang ống
mẫu đem phân tích thành phần axit béo bằng máy sắc kí khí .
* Điều kiện phân tích GC mẫu methyl este axit béo:
Máy sắc ký khí Finigan Trace GC ultra-Colum, cột: BPX70
(50Mx0.32MM x 0.25uM).
Carrier: N2, Pressure const: 1000kPa, split 15:1, Air: 350ml/min,
H2:35ml/min
Chương trình nhiệt độ: 850 (0/min) -1500 (10/min) -2000(10/min) -
230
0
(5/min).
Bảng 2.4. Kết quả thành phần axit béo
88 x100%
= 4,4%
2000
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
30
(Phổ và điều kiện phân tích máy GC kèm theo)
TT Axit béo Tên khoa học Tên thƣờng
Thời
gian
lƣu(R1)
Hàm
lƣợng
(%)
1 C10:0 Axit decanoic Caprylic 7.22 0.03
2 C15:0 Axit pentadecanoic - 13.00 0.35
3 C16:0 Axit hexadecanoic Palmitic 16.84 3.28
4 C18:1(n-9) Axit cis-9-Octadecenoic Oleic 25.72 27.67
5 C18:2(n-6) Axit
9,12-Octadecadienoic
Linoleic 27.90 23.21
6 C18:3(n-6) Axit
6,9,12-Linolenic
Linolenic 28.39 38.60
7 C19:1(n-9) Axit
10-nonadecaenoic
- 28.44 5.24
8 C22:5(n-3) Axit 5,8,11,14,17-
Docosapentaenoic
DPA 53.60 0.24
9 others 0.84
Tổng các axit béo no 4.2
Tổng các axit béo không no 94.96
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
31
2.4.2. Phân lập và tinh chế các chất trong dịch chiết n-Hexan;
Etylaxetat của quả Ké đầu ngựa bằng phƣơng pháp sắc ký cột.
2.4.2.1.β – Sitosterol (KĐN.H8)
Lấy 62,7g cặn chiết n- hexan đem tách trên cột có đường kính 1,5 cm
dài 45 cm, với chất hấp phụ là silicagel khối lượng 100g, có kích thước hạt
60m – 100 m, dung môi rửa giải là n – hexan: etylaxetat với tỷ lệ etylaxetat
tăng dần từ 0% - 100%. Các phân đoạn thu được từ cột được kiểm tra trên sắc
ký lớp mỏng với hệ dung môi triển khai là n – hexan: etylaxetat (8: 1), hiện
màu bằng thuốc thử vanilin/H2SO4 10%.
Sơ đồ 2.3 Phân lập chất từ dịch chiết n-Hexan
của quả Ké đầu ngựa
Các phân đoạn có thành phần giống nhau được gộp lại với nhau và đem
cất loại dung môi thu được 8 phân đoạn với nhiều cấu tử khác nhau.
Các phân đoạn từ 1 đến 6 và phân đoạn 7 đều là hỗn hợp, riêng phân
đoạn 8 (rửa giải cột bằng hỗn hợp n – hexan: etylaxetat (20: 1)) có Rf C là 32,
cất loại dung môi thu khối chất rắn vô định hình màu vàng nhạt, kết tinh lại
trong axeton thu được 0,9870g những tinh thể hình kim, không màu, nóng
chảy ở 138-1400C.
KĐN.H
62,7g
Silicagel
n-Hexan:EtOAc (20:1)
KĐN.H8
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
32
Phổ FT-IR (KBr): ớmax(cm
-1): 3426 (rộng, mạnh); 2983; 2932;
2868; 1651 (yếu); 1464; 1384; 1064, 804.
Phổ EI-MS, m/z (%): 414 [M]+ (20), 413 [M-1]+ (41), 398 (28), 397
(100), 395 (32), 383 (11), 361 (11), 257 (3), 255 (6,3), 151 (5,6), 139 (11).
Phổ 1H-NMR (200MHz, CDCl3, (ppm): 5,31 (1H, dd, J=5 Hz và 2
Hz, H-6); 3,51 (1H, m, H-3); 0,84 (3H, d, J29-27 = 6,6Hz, H-29); 0,81 (3H, d,
J28-27 = 6,6Hz, H-28); 0,92 (3H, d, J21-20 = 6,6Hz, H-21); 0,85 (3H, t, J26-25 =
7,1Hz, H-26); 0,68 (3H, s, H-19); 1,01 (3H, s, H-18).
Phổ 13C -NMR (50MHz, CDCl3), (ppm): 37,3 (t, C-1); 31,7 (t, C-2);
71,8 (d, C-3); 42,3 (t, C-4); 140,8 (s, C-5); 121,7 (d, C-6); 31,9 (t, C-7); 33,9
(d, C-8); 50,2 (d, C-9); 36,5 (s, C-10); 21,1 (t, C-11); 39,8 (t, C-12); 37,8 (s,
C-13); 56,8 (d, C-14); 24,3 (t, C-15); 28,3 ( t, C-16); 56,1 (d, C-17); 11,9 (q,
C-18); 19,4 (q, C-19); 36,2 (d, C-20); 18,8 (q, C-21); 29,5 (t, C-22); 26,2 (t,
C-23); 45,9 (d, C-24); 29,2 (d, C-25); 19,8 (q, C-26); 19,1 (q, C-27); 23,1 (t,
C-28); 11,9 (q, C-29).
2.4.2.2. 3-O--D-glucopyranosyl--sitosterol (KĐN.E33).
Lấy 14,8g cặn chiết Etylaxetat của quả Ké đầu ngựa đem tách trên cột
silicagel với khối lượng 70g. Cột có đường kính 2,5 cm, dài 45 cm. Rửa giải
cột bằng hỗn hợp dung môi Cloroform: metanol với tỷ lệ metanol tăng dần từ
0 – 100%. hệ dung môi chạy bản mỏng là Cloroform: metanol (5:1). Hiện
màu bằng thuốc thử vanilin/ H2SO4 10%, thu được tất cả 33 phân đoạn.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
33
Sơ đồ 2.4 Phân lập chất từ dịch chiết Etylaxetat
của quả Ké đầu ngựa
Phân đoạn 33 (rửa giải cột bằng cloroform: metanol (95:5)), sau khi cất
đuổi dung môi và kết tinh lại trong etylaxetat/metanol, rửa lại bằng axeton thu
được 0,007 g khối chất rắn vô định hình, nóng chảy ở 273 - 2750C, Rf E=35
Phổ 1H-NMR (CDCl3/MeOD, 500MHz,): (ppm) 0,71 (3H, s, Me-18);
0,77 (3H, s, Me-19); 5,36 (1H, H-6);
Phổ 13C – NMR (125 MHz, DMSO – d6); (ppm): 140,41 (s, C-5) ;
121,12 (d, C-6); 100,76 (d, C-1’); 76,89 (d, C-3’); 76,73(d, C - 5’); 76,69
(d - C3); 73,42 (d, C - 2’); 70,01 (d, C- 4’); 61,06 (t, C - 6’); 56,13 (d, C -
14); 55,39 (d, C-17); 50, 53 ( d, C-9); 49, 56 (d, C- 24);
45, 11 (s, C – 13); 40, 92 (t, C – 4); 39, 76 (t, C- 12); 36, 78 (t, C – 1);
35, 43 (s, C - 10); 33, 31 (d, C- 20); 31, 37 (t, C- 22); 31, 32 (d, C- 8);
KĐN.E
14,8g
KĐN.E33
Silicagel
Clorofom:metanol
(95:5)
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
34
29, 22 (t,C – 16); 28, 68 (t, C- 23); 27, 73 (t, C- 2); 25, 43 (t, C-25); 23, 80
(t, C- 15);
22, 572 (t, C – 28); 21, 05 (t, C–11); 20,86 (d, C–27); 19, 64 (q, C-
19); 19, 04 (q, C–26); 12, 05 (q,C– 29); 11, 73 (q, C – 18).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
35
CHƢƠNG3
THẢO LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. NGUYÊN TẮC CHUNG
Để phân lập được các hợp chất trong bất kỳ một thực vật nào mà không
làm ảnh hưởng tới thành phần hoá học có trong nó thì trước khi ngâm chiết
bằng dung môi hữu cơ, mẫu thực vật phải được đưa đi khử men ngay sau khi
thu mẫu và sấy khô ở điều kiện thích hợp.
Về nguyên tắc việc ngâm chiết mẫu thực vật có thể tiến hành theo 2
cách phổ biến sau [4].
1. Chiết và phân lập các hợp chất từ mẫu thực vật bằng các loại dung
môi có độ phân cực tăng dần: ete dầu hoả hoặc n-hexan, cloroform, etylaxetat,
metanol hoặc etanol v.v....
2. Chiết tổng bằng các ancol (metanol, etanol) hay hệ dung môi
ancol/nước. Sau đó tách loại các hợp chất bằng các loại dung môi có độ phân
cực tăng dần như phương pháp 1 để thu được các dịch chiết có chứa các hợp
chất có độ phân cực tương đối giống nhau.
Việc chiết mẫu quả Ké đầu ngựa được thực hiện theo phương án 2. (Sơ
đồ 2.1).
Các dịch chiết thô đem thử nghiệm với các phản ứng sinh học (biotest)
giúp cho việc định hướng tìm kiếm các hoạt chất trong những dịch chiết có
phản ứng dương tính với các biotest.
Kết quả thử hoạt tính với vi sinh vật kiểm định cho biết một số dịch
chiết có hoạt tính mạnh với vi sinh vật kiểm định.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
36
3.2. PHÁT HIỆN CÁC NHÓM CHẤT CÓ TRONG DỊCH CHIẾT
N – HEXAN, DỊCH CHIẾT ETYLAXETAT VÀ DỊCH CHIẾT METANOL CỦA
QUẢ KÉ ĐẦU NGỰA (XANTHIUM STRUMARIUM L.)
Việc phát hiện định tính các nhóm chất trong dịch chiết n-hexan và
dịch chiết etylaxetat của quả Ké đầu ngựa, được tiến hành thực nghiệm như ở
mục 2.3.3. Kết quả thực nghiệm thu được chỉ ra ở bảng 2.3 như sau:
Bảng 2.3 Phát hiện định tính các nhóm chất
STT Nhóm chất Phản ứng đặc hiệu Kết quả thử các phân đoạn
KĐN.H KĐN.E KĐN.M
1 Ancaloit dd silicostungtic axit 5% + + +
2 Sterol Liebermanm-Burchard + + +
3 Flavonoit Xianidin - - -
4 Saponin Tạo bọt - + +
5 Cumarin Tác dụng kiềm và axit - - +
6 Tanin FeCl3 5% - - +
7 Glucozit trợ tim Kelle-Kaliani - - -
3.3 KẾT QUẢ THỬ HỌAT TÍNH KHÁNG VI SINH VẬT KIỂM ĐỊNH
DỊCH CHIẾT N-HEXAN, DỊCH CHIẾT ETYLAXETAT VÀ DỊCH CHIẾT
ETYLAXETAT CỦA QUẢ KÉ ĐẦU NGỰA (XANTHIUM STRUMARIUM L.) .
Việc nghiên cứu hoá thực vật của bất kỳ 1 loài thực vật (hay những bài
thuốc dân gian) nào thường được bắt đầu bằng việc thử hoạt tính sinh học các
loại dịch chiết cô của nó, nhằm định hướng cho việc phân lập các hoạt chất có
trong cây.
Các mẫu nghiên cứu được đem thử nghiệm với các phản ứng sinh học
(biotest) và hoá học đặc hiệu sẽ cho biết chúng có những hoạt tính gì và lớp
chất nào có trong thực vật. Kết quả thử hoạt tính sinh học giúp cho việc định
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
37
hướng tìm kiếm hoạt chất, lựa chọn các phân đoạn ưu tiên để phân lập và
nhận dạng cấu trúc hoá học của hoạt chất.
Thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của dịch chiết n-hexan, dịch
chiết etylaxetat và dịch chiết metanol của quả Ké đầu ngựa được thực hiện tại
phòng Thử nghiệm hoạt tính Sinh học-Viện Hoá học các hợp chất Thiên
nhiên – Trung tâm Khoa học Tự nhiên và Công nghệ Quốc gia. Qui trình thử
chúng tôi đã trình bày cụ thể ở mục (2.3.2). Kết quả thử nghiệm được trình
bày ở bảng 2.2.
Bảng 2.2. Kết quả thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của
dịch chiết n – hexan, dịch chiết etylaxetat
và dịch chiết metanol của quả Ké đầu ngựa.
STT Tên mẫu
Tên chủng vi sinh vật kiểm định
Ec.
Escherichia
coli
IC50 g/ml
Pa:
Pseudomonas
aeruginosa
IC50 g/ml
Bs: Bacillus
subtilis
IC50 g/ml
Sa:
Staphylococcus
aureus
IC50 g/ml
Ca:
Candida
albicans
IC50 g/ml
01 KĐN.H > 256 > 256 > 256 > 256 > 256
02 KĐN.E > 256 > 256 > 256 > 256 > 256
03 KĐN.M > 256 > 256 > 256 > 256 > 256
Kết quả thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định cho thấy : dịch chiết
n - hexan, dịch chiết etylaxetat và dịch chiết metanol của quả Ké đầu ngựa
đều cho phản ứng âm tính với các chủng vi khuẩn. Điều này chính tỏ rằng các
dịch chiết trên của quả Ké đầu ngựa không có khả năng kháng khuẩn.
Những công trình nghiên cứu trước đây về khả năng kháng khuẩn của
dầu béo một số loài thực vật chi Xanthium strumarium L.cho thấy : trong dầu
hạt thưc vật thuộc chi Xanthium strumarium L., có khả năng kháng khuẩn khá
cao. Vậy sự khác nhau về kết quả nghiên cứu này, phải chăng nguyên nhân là
sự khác nhau về quy trình thu nhận dầu béo từ hạt thực vật.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
38
Trong tài liệu mà chúng tôi thu thập được không thấy tài liệu nào nói
về quy trình thu nhận dầu béo từ hạt thực vật. Theo chúng tôi, có thể các nhà
nghiên cứu trước đã thu nhận dầu béo từ hạt thực vật bằng phương pháp ép
trích li từ hạt, khi đó các hợp chất có chứa trong thành phần của hạt, kể cả
những chất có hoạt tính và những chất không có hoạt tính, đều được ép ra
cùng với dầu. Chính vì vậy hỗn hợp các chất này đã tạo cho dầu béo Quả Ké
đầu ngựa thu được bằng phương pháp này có khả năng kháng khuẩn cao.
Còn dầu Quả Ké đầu ngựa mà chúng tôi tiến hành nghiên cứu được
tách ra từ hạt theo phương pháp chiết shoxlet trong các dung môi khác nhau
(n-hexan, etylaxetat và metanol) chính vì lẽ đó mà các chất chứa trong dầu
béo của quả Ké đầu ngựa được chúng tôi tách chiết ra đã có sự chọn lọc theo
độ phân cực tăng dần của dung môi.
Kết quả thử hoạt tính sinh học cho thấy không có dịch chiết trong các
dung môi n – hexan, etylaxetat, metanol của quả Ké đầu ngựa là có khả năng
kháng khuẩn yếu, như vậy chứng tỏ những chất có khả năng kháng khuẩn
trong quả Ké đầu ngựa là những chất phân cực. Nhưng trong quá trình chiết
quả Ké đầu ngựa chúng tôi mới chỉ dừng lại ở dung môi metanol, nên có thể
những chất có độ phân cực cao hơn và có khả năng kháng khuẩn cao chưa
được tách ra .
3.4. XÁC ĐỊ NH HÀM LƯỢNG VÀ THÀNH PHẦN HOÁ HỌC CỦA QUẢ KÉ ĐẦU
NGỰA.
3.4.1. Các axit béo.
Sắc kí đồ của dầu quả Ké đầu ngựa xem ở phụ lục.
Bằng phương pháp GC chúng tôi đã xác định được, trong quả Ké đầu
ngựa mà chúng tôi nghiên cứu có 9 cấu tử, trong đó có 5 cấu tử có hàm lượng
axit béo trên 1%, 4 cấu tử có hàm lượng axit béo dưới 1% và một số cấu tử
khác chưa xác định cấu trúc cũng có hàm lượng axit béo dưới 1%.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
39
Bảng 3.1: Các cấu tử có hàm lƣợng axit béo trên 1%
trong quả Ké đầu ngựa
TT Axit béo Tên khoa học Tên thƣờng
Thời
gian lƣu
Hàm
lƣợng
%
1 C16:0 Axit hexadecanoic Palmitic 16.84 3.28
2 C18:1 (n-9) Axit
cis-9-Octadecenoic
Oleic 25.72 27.67
3 C18:2 (n-6) Axit 9,12-
Octadecadienoic
Linoleic 27.90 23.21
4 C18:3 (n-6) Axit 6,9,12-
Linolenic
Linolenic 28.39 38.60
5 C19:1 (n-9) Axit 10-
nonadecaenoic
- 28.44 5.24
Bảng 3.2: Các cấu tử có hàm lƣợng axit béo dƣới 1%
trong quả Ké đầu ngựa
TT Axit béo Tên khoa học Tên thƣờng
Thời
gian lƣu
Hàm
lƣợng
%
1 C10:0 Axit decanoic Caprylic 7.22 0.03
2 C15:0 Axit
pentadecanoic
- 13.00 0.35
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
40
3 C22:5 (n-3) Axit
5,8,11,14,17-
Docosapetaenoic
DPA 53.60 0.24
4 Other 0.84
Trong các cấu tử của quả Ké đầu ngựa mà chúng tôi nhận được qua
GC/MS, có 4.2 % cấu tử đã nhận dạng được là các axít béo no, 94.96 % các
cấu tử là các axít béo không no.
Các cấu tử chưa nhận dạng được đều là các chất có hàm lượng dưới
1%, chúng đều là những chất chưa có kết luận chắc chắn về cấu trúc phân tử.
Nhìn chung các axit có số nguyên tử cacbon chẵn và nối đôi có cấu
hình dạng cis hoặc Z, định vị bắt đầu từ nguyên tử cacbon số 9 kể từ nhóm
cacboxyl hoặc kể từ nhóm metyl (n-9). Đồng phân 9Z được tìm thấy nhiều
trong axit hexadecenoic. Nó là một hợp chất có nhiều trong dầu cá và là thành
phần chính trong một vài loại dầu hạt.
Axit oleic được phân bố rộng dãi nhất trong tất cả axit béo và đại diện
cho axit ở dạng một nối đôi. Axit này có hàm lượng khá cao trong quả Ké đầu
ngựa.
Axit linolenic chiếm hàm lượng cao nhất trong quả Ké đầu ngựa, đây là
một loại axit có nhiều trong hầu hết dầu hạt thực vật. Ngoài ra, nó có trong
lipit động vật và dầu cá ở mức độ thấp. Axit ó – Linolenic (n-6) – 18:3, là
bước chuyển hoá trung gian của axit linolenic tới axit archidonic. Các dầu
chứa axit này trong Y học được dùng để chữa trị một số bệnh: Eczema, viêm
khớp, xơ cứng động mạch, lão hoá.
Dựa vào sắc kí đồ ta thấy:
Thành phần chính của quả Ké đầu ngựa là 6,9,12 - Linolenic axit
(chiếm 38.60 %); Cis-7-Octadecenoic axit (chiếm 27,67 %); 9,12-
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
41
Octadecadienoic axit (chiếm 23,21 %). Ngoài ra trong thành phần của quả Ké
đầu ngựa còn chứa một số axit béo không no khác.
Dưới đây là công thức cấu tạo của chất chính có hàm lượng tương đối
cao trong quả Ké đầu ngựa.
o
o
9, 12 - octadecadienoic axit (23,21 %)
COOH
Oleic axit (27,67%)
COOH
9,6,12 – Linolenic axit (38,60 %)
3.4.2. Các hợp chất sterol
Những chất có khung steroit được tìm thấy trong các dịch chiết của quả
Ké đầu ngựa thường là các sterol C29 với bộ khung 3-ol 5-pregnan hoặc
dẫn xuất của nó, trong đó mạch nhánh có cấu hình và cấu dạng khác nhau.
Dựa vào các hằng số lý hoá và đặc tính quang phổ của các chất đã phân lập
được, so sánh với số liệu phổ của các chất chuẩn, đã chỉ ra những chất dưới
đây.
3.4.2.1. -sitosterol hay 24R-stigmast-5-en-3--ol (KĐN.H8)
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
42
Là những tinh thể hình kim không màu cũng thu được từ dịch chiết n-
hexan của quả Ké đầu ngựa, điểm nóng chảy 138-1400C. Khi trộn lẫn với chất
chuẩn có nhiệt độ nóng chảy không thay đổi.
Trong phổ EI-MS, quan sát thấy pic phân tử [M]+ của nó là 414, từ các
phổ FT-IR, 1H-NMR và 13C-NMR có thể khẳng định sự có mặt của nhóm
hydroxi (OH) : max = 3426 cm-1 (rộng, mạnh), H-3 = 3,53 ppm và
C-3 = 71,7 ppm, một nối đôi C=C : max = 1651cm-1 (yếu), H-6 = 5,35
ppm (d), J=5Hz, C-5 = 140,7 ppm và C-6 = 121,7 ppm.
Sơ đồ 3.1: Sự phân mảnh EI – MS của chất KĐN.H8
H O
m/z = 414
H O
m/z = 329 m/z = 396
CH2
H O
m/z = 273 m/z = 381
- H2O
- 15
- C4 H8
- H2O
- C6H13
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
43
Các số liệu về phổ FT-IR, MS, NMR và các hằng số vật lý của hợp chất
này hoàn toàn phù hợp với -sitosterol.
Bảng 3.3: Số liệu phổ 13C-NMR (CDCl3, 125Mhz) của õ-sitosterol
STT -sitosterol ppm
1 37.3 t
2 31.7 t
3 71.8 d
4 42.3 t
5 140.8 s
6 121.7 d
7 31.9 t
8 31.9 d
9 50.2 d
10 36.5 s
11 21.1 t
12 39.8 t
13 42.3 s
14 56.8 d
15 24.3 t
m/z = 255
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
44
STT -sitosterol ppm
16 28.3 t
17 56.1 d
18 11.9 q
19 19.4 q
20 36.2 d
21 18.8 q
22 33.9 t
23 26.1 t
24 45.9 d
25 29.2 d
26 19.1 q
27 19.4 d
28 23.13 t
29 11.9 q
3.4.2.2. 3-O--D-glucopyranosyl--sitosterol (KĐN.E33)
Chất rắn ở dạng vô định hình, không tan trong cloroform,
metanol, dễ tan trong hệ dung môi cloroform / metanol, nóng chảy ở 273-
275
0
C.
Phổ 13C-NMR quan sát thấy 35 tín hiệu của nguyên tử cacbon, trong đó
có 7 nguyên tử cacbon gắn với oxy (nằm trong vùng 61,1ppm đến 100,8ppm).
Hai tín hiệu ở 140,41 và 121,12ppm thuộc về một liên kết olefin. Phổ 1H-
NMR xác nhận sự có mặt của một liên kết đôi ở 5,36 ppm và của nhóm
hydroxy ở vùng 3,5ppm đến 4,0 ppm.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
45
Số liệu từ các phổ 1H- NMR, phổ 13C-NMR, DEPT 90 và DEPT 135
cho phép nghĩ đến cấu trúc của hợp chất glucozit có công thức C35H60O6.
Đem chất này thuỷ phân trong axit loãng đã thu được -sitosterol, đồng thời
trong phổ cũng thấy mất đi tín hiệu của gốc đường. Điều này cũng chứng tỏ
rằng một phân tử đường đã bị loại ra khỏi phân tử -sitosterol glucozit. Các
số liệu phổ thực nghiệm thu được so với số liệu phổ chuẩn đã khẳng định chất
rắn vô định hình nóng chảy ở 273-2750C chính là -sitosterol-3-O--D-
glucopyranosyl.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
46
14 56,79 (d) 56,75
15 24,32 (t) 24,15
16 28,26 (t) 28,25
17 56,09 (d) 56,02
18 0,6 (3H, s)
11,89 (q)
11,84
19 1,01 (3H, s) 19,41 (q) 19,46
20 36,16 (c) 36,07
21 0,92 (3H, d) 18,80 (q) 18,68
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
47
22 . 33,98 (t) 33,95
23 26,13 (t) 26,10
24 45,88 (d) 45,82
25 29,19 (d) 29,05
26 0,81 (3H, d) 19,05 (q) 19,77
27 0,88 (3H, d) 19,41 (q) 19,21
28 23,13 ()t 23,13
29 0,83 (3H, d) 11,99 (q) 11,04
OH
* Nhận xét: So sánh độ chuyển dịch hoá học 13C – NMR của KĐN.H8
mà chúng tôi phân lập được với độ chuyển dịch hoá học 13C – NMR của (3,
24R)
- sitosterol thấy rằng kết quả tơng đối giống nhau. Tuy nhiên một vài
số liệu hơi khác có thể là do chế độ máy chạy khác nhau.
Mặt khác trên phổ EI – MS dựa vào các pic cơ bản thấy sự phân mảnh
cũng phù hợp với sự phân mảnh của - Sitosterol mà dữ liệu phổ đa ra (độ
trùng lặp 83%) song pic ion phân tử và các mảnh chính đều tương đương
nhau.
Dựa vào các kích cơ bản trên phổ EI – MS chúng tôi đưa ra khả năng
phân mảnh của KĐN.H8 có thể xảy ra như sau:
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
48
Sơ đồ 3: Sự phân mảnh EI – MS của chất KĐN.H8
H O
m/z = 414
H O
m/z = 329 m/z = 396
CH2
- H2O
- 15
- C4 H8
- C6H13
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
49
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
19
11
12
18
14
13
17
16
15
20
21
23
22
24 25 26
27
28
* Tóm lại : Qua việc phân tích các số liệu phổ, kết hợp với các đặc
trưng vật lý, các tài liệu, một lần nữa chúng tôi khẳng đị nh rằng chất
KĐN.H8 mà chúng tôi phân lập được là (3, 24 R) - sitosterol có công thức
phân tử là C29 H50 O, và có công thức cấu tạo như đã trình bày ở trên.
3.4.2.2. - Sitosterol glucosid ( - Sitosterol –3 – o - - D -
Glucopyranosyl).
- Chất rắn vô định hình không màu (KĐN.E33) không tan trong
cloroform, axeton dễ tan trong metanol. tonc = 282 – 283. Rf = 35.
Phổ FT – I R (viên nén KBr) có các vân hấp thụ đặc trưng sau
m/z = 255
R O
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
50
3390 cm
-1 (mạnh, rộng) ứng với dao động hoá trị của nhóm hiđroxyl
(- OH)
2934, 2960 cm
-1
(mạnh) CH ứng với dao động hoá trị của các nhóm
– CH3 và > CH2 no.
1640 cm
-1
(yếu) C = C ứng với dao động hoá trị > C = C < an ken
1461 cm
-1
(trung bình) CH ứng với dao động biến dạng của các nhóm
> CH2 và - CH3
1373 cm
-1
(trung bình) CH3 ứng với dao động biến dạng mới xứng của
nhóm – CH3 (xem phụ lục).
- Phổ 1H – NMR (DMSO, 500 MHz), ppm: 3,648 (1H, m, - CH –
OH); 5,330 (1H, t, > CH -).
- Trong phổ 1H – NMR cũng cho thấy vân hấp thụ dày đặc của nhiều
nhóm hiđroxyl, đặc biệt trong phổ NMR cũng quan sát thấy proton “anome”
(H–1’) của hexosa xuất hiện dưới dạng doublet tại 4,32 ppm, có J = 7,8 Hz,
và c – 1’ tương ứng là 100,8 ppm.
- Phổ 13C – NMR (DMSO, 500 MHz), ppm: có hai tín hiệu ở 140, 56
(s, C - 5) và 121,33 (d, C – 6) thuộc về một liên kết olephin.
- Ngoài ra với các kỹ thuật khác nhau của 13C – NMR đã quan sát thấy
35 tín hiệu của nguyên tử các bon, trong đó có 7 nguyên tử các bon gắn với
oxy (nằm trong vùng 61,20 – 100,8 ppm)
- Từ số liệu của các phổ IR, MS, 1H và 13C – NMR, DEPT 90 và DEPT
135 cho phép nghĩ đến của 1 hợp chất glucozit có công thức phân tử C35 H60
O6. Khi đem thuỷ phân chất này bằng axit loãng đã thu được - sitosterol
đồng thời có một mảnh 396 m/z (M – C6 H12 O6), trong phổ EI – MS cũng xác
nhận một phân tử hexosa đã bị loại ra khỏi phân tử sitosterol glucozit.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
51
- Từ những dữ kiện trên và đem tiến hành đo điểm nóng chảy với hỗn
hợp chất mẫu, thấy không có sự thay đổi, đã cho phép khẳng định chất
(KĐN.E33) đã thu được từ dịch chiết Etylaxetat của quả Ké đầu ngựa là -
sitosterol – 3 – O - - D – glucopyranosyl.
31,69 (t) CH2 31,63
71,84 (d) CH 71,73
42,29 (t) CH2 42,20
140,78 (s) C 140,71
121,74 (d) CH 121,63
31,94 (t) CH2 31,90
31,95 (d) CH 31,81
50,17 (d) CH 51,13
36,53 (s) C 36,43
21,11 (t) CH2 21,09
39,81 (t) CH2 39,79
42,33 (s) C 42,37
56,79 (d) CH 56,75
24,32 (t) CH2 24,15
28,26 (t) CH2 28,25
56,09 (d) CH 56,02
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
52
11,89 (q)
CH3 11,84
19,41 (q) CH3 19,46
36,16 (c) CH 36,07
18,80 (q) CH3 18,68
33,98 (t) CH2 33,95
26,13 (t) CH2 26,10
45,88 (d) CH 45,82
29,19 (d) CH 29,05
26 0,81 (3H, d) 19,05 (q) CH3 19,77
27 0,88 (3H, d) 19,41 (q) CH3 19,21
28 23,13 ()t CH2 23,13
29 0,83 (3H, d) 11,99 (q) CH3 11,04
OH
* Nhận xét: So sánh độ chuyển dịch hoá học 13C – NMR của BĐQ mà
chúng tôi phân lập được với độ chuyển dịch hoá học 13C – NMR của (3,
24R)
- sitosterol thấy rằng kết quả tương đối giống nhau. Tuy nhiên một
vài số liệu hơi khác có thể là do chế độ máy chạy khác nhau.
Mặt khác trên phổ EI – MS dựa vào các pic cơ bản thấy sự phân mảnh
cũng phù hợp với sự phân mảnh của - Sitosterol mà dữ liệu phổ đưa ra (độ
trùng lặp 83%) song pic ion phân tử và các mảnh chính đều tương đương
nhau.
Dựa vào các kích cơ bản trên phổ EI – MS chúng tôi đưa ra khả năng
phân mảnh của BĐQ có thể xảy ra như sau.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
53
Sơ đồ 3: Sự phân mảnh EI – MS của chất BĐQ
H O
m/z = 414
H O
m/z = 329 m/z = 396
CH2
H O
m/z = 273
m/z = 255
m/z = 381
- H2O
- 15
- C4 H8
- H2O
- C6H13
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
54
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
19
11
12
18
14
13
17
16
15
20
21
23
22
24 25 26
27
28
* Tóm lại : Qua việc phân tích các số liệu phổ, kết hợp với các đặc
trưng vật lý, các tài liệu, một lần nữa chúng tôi khẳng đị nh rằng chất BĐQ
mà chúng tôi phân lập được là (3, 24 R) - sitosterol có công thức phân tử
là C29 H50 O, và có công thức cấu tạo như đã trình bày ở trên
3.4.2. - Sitosterol glucosid ( - Sitosterol –3 – o - - D -
Glucopyranosyl).
- Chất rắn vô định hình không màu (HBĐ) không tan trong cloroform,
axeton dễ tan trong metanol. tonc = 282 – 283. Rf = 32.
Phổ FT – I R (viên nén KBr) có các vân hấp thụ đặc trưng sau
3390 cm
-1 (mạnh, rộng) ứng với dao động hoá trị của nhóm hiđroxyl
(- OH)
2934, 2960 cm
-1
(mạnh) CH ứng với dao động hoá trị của các nhóm –
CH3 và > CH2 no.
1640 cm
-1
(yếu) C = C ứng với dao động hoá trị > C = C < an ken
1461 cm
-1
(trung bình) CH ứng với dao động biến dạng của các nhóm
> CH2 và - CH3
1373 cm
-1
(trung bình) CH3 ứng với dao động biến dạng mới xứng của
nhóm – CH3 (xem phụ lục ).
- Phổ 1H – NMR (DMSO, 500 MHz), ppm: 3,648 (1H, m, - CH –
OH); 5,330 (1H, t, > CH -).
R O
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
55
- Trong phổ 1H – NMR cũng cho thấy vân hấp thụ dày đặc của nhiều
nhóm hiđroxyl, đặc biệt trong phổ NMR cũng quan sát thấy proton “anome”
(H–1’) của hexosa xuất hiện dưới dạng doublet tại 4,32 ppm, có J = 7,8 Hz,
và c – 1’ tương ứng là 100,8 ppm.
- Phổ 13C – NMR (DMSO, 500 MHz), ppm: có hái tín hiệu ở 140, 56
(s, C - 5) và 121,33 (d, C – 6) thuộc về một liên kết olephin.
- Ngoài ra với các kỹ thuật khác nhau của 13C – NMR đã quan sát thấy
35 tín hiệu của nguyên tử các bon, trong đó có 7 nguyên tử các bon gắn với
oxy (nằm trong vùng 61,20 – 100,8 ppm)
- Từ số liệu của các phổ IR, MS, 1H và 13C – NMR, DEPT 90 và DEPT
135 cho phép nghĩ đến của 1 hợp chất glucozit có công thức phân tử C35 H60
O6. Khi đem thuỷ phân chất này bằng axit loãng đã thu được - sitostrol đồng
thời có một mảnh 396 m/z (M – C6 H12 O6), trong phổ EI – MS cũng xác nhận
một phân tử hexosa đã bị loại ra khỏi phân tử sitosterol glucozit.
- Từ những dữ kiện trên và đem tiến hành đo điểm nóng chảy với hỗn
hợp chất mẫu, thấy không có sự thay đổi, đã cho phép khẳng định chất (HBĐ)
đã thu được từ dịch chiết metanol của hạt Ba đậu là - sitostrol – 3 – O - -
D – glucopyranosid.
3.4.3. - amyrin axetat (urs – 12 – en - 3 - yl axetat)
AcO
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
56
Trong phổ EI – MS quan sát thấy mảnh ion phân tử M+ ở 468 (1,7) m/z
và có kiểu phân mảnh giống như urs – 12 – en – 3 – yl axetat [129 mh]. Phổ
13
C – NMR với các kỹ thuật khác nhau đã chỉ ra sự có mặt của 32 nguyên tử
các bon (xem bảng ).
Bảng : Độ chuyển dịch hoá học 1H – NMR và 13C – NMR của KSQ.
STT
của nguyên tử cacbon
Chất KSQ
C (độ bội) H (J, Hz)
1 38,493 (t)
2 23,265 (t)
3 80,975 (d) 4,507dd, J 6.0, 10.6 Hz
4 37,729 (s)
5 55,290 (d)
6 18,263 (t)
7 32,891 (t)
8 40,055 (d)
9 47,6,1 (d)
10 36,817 (d)
11 23,391 (t)
12 124, 344 (d) 5,126t, J 3.6 Hz
13 139,649 (s)
14 42,099 (s)
15 28,115 (t)
16 26,624 (t)
17 33,764 (s)
18 59,092 (d)
19 39,629 (d)
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
57
20 39,673 (d)
21 31,266 (t)
22 41,553(t)
23 28,053 (q) 0,877s
24 16,885 (q) 0,865s
25 15,747 (q) 0,970s
26 16,748 (q) 1,012s
27 23,241 (q) 1,067s
28 28,759 (q) 0,800s
29 17,513 (q) 0,796d, J4.20 Hz
30 21,403 (q) 0,922d, J 5.13 Hz
31 170,996 -
32 121,312 2,046s
(Ghi chú : Các dòng để trống trong phổ 1H là các tín hiệu không phân
giải hoặc cacbon bậc 4 (không chứa H)).
Phổ 1H – NMR chỉ ra sự có mặt của 6 nhóm metyl dạng singlet, 2
nhóm metyl ở dạng doublet trong vùng trường cao (0,79 đến 1,07 ppm) hoàn
toàn chứng tỏ đó là một tritecpen kiểu khung ursan. Sự có mặt của nhóm
axetyl trong (KSQ) được xác nhận bằng các tín hiệu cộng hưởng proton và
cac bon – 13 (2,0460 s; 170,990 s; 21,312q). Các số liệu phổ 13C – NMR
(bảng …..) hoàn toàn phù hợp với cấu trúc của urs – 12 – en - 3 - yl axetat
hay
- amyrin axetat [91 mH]. Có công thức cấu tạo như đã trình bày ở trên.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
45
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
I. KẾT LUẬN
1. Lần đầu tiên quả Ké đầu ngựa (Xanthium strumarium L.) mọc hoang
tại huyện Phú Lương, tỉnh Thái Nguyên được nghiên cứu sàng lọc hoá thực
vật. Một số dịch chiết của quả Ké đầu ngựa được thử hoạt tính với vi sinh vật
kiểm định cho thấy không có tác dụng với một số vi sinh vật kiểm định.
2. Từ quả Ké đầu ngựa (Xanthium strumarium L.) chúng tôi đã phân lập
được 4 chất hữu cơ tinh khiết, trong đó có hai chất đã được nhận dạng là:
KĐN.H8: β-sitosterol
KĐN.E33: 3-O-β-D-glucopyranosyl-β-sitosterol
Còn 2 chất rắn khác (do thời gian có hạn) đang được ghi các loại
phổ để xác định cấu trúc hoá học của chúng.
3. Bằng phương pháp GC so với các chất chuẩn chúng tôi đã xác định
được, trong quả Ké đầu ngựa có 9 cấu tử có hàm lượng axit béo cao, trong đó
có 5 cấu tử có hàm lượng axit béo trên 1% như: Axit 6,9,12 – linolenic
(38,60%), Axit oleic (27,67%), đặc biệt một số axit béo có những hoạt tính
sinh học tốt.
II. KIẾN NGHỊ
Cây Ké đầu ngựa là một loại thực vật mọc hoang dã ở Việt Nam, là một
cây thuốc quý, rất phổ biến và có nhiều ứng dụng đối với Y học dân gian. Do
điều kiện thời gian có hạn nên dịch metanol của quả Ké đầu ngựa chúng tôi
chưa tiến hành phân lập thành phần hoá học được, đặc biệt là thành phần axit
béo có trong quả Ké đầu ngựa. Chúng tôi mong muốn được tạo điều kiện tiếp
tục nghiên cứu phân lập thành phần axit béo có trong quả Ké đầu ngựa, cũng
như các thành phần khác trong dịch chiết MeOH của nó, nhằm làm sáng tỏ
thành phần hoá học của quả Ké đầu ngựa, định hướng cho việc sử dụng hữu
hiệu loài thực vật này.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
46
TÀI LIỆU THAM KHẢO
A. Tiếng Việt
1. 1900 loài cây có ích ở Việt Nam, NXB thế giới, Hà Nội, (9/1993).
2. Võ Văn Chi, Từ điển cây thuốc Việt Nam, NXB Y học, (1999).
3. Trần Đình Đại, Khái quát về hệ thực vật Việt Nam, Hội thảo
Việt - Đức về hoá học và các hợp chất thiên nhiên, Hà Nội, (1998).
4. Nguyễn văn Đàn, Nguyễn Viêt tựu, Phương pháp nghiên cứu hoá học cây
thuốc, NXB Y học chi nhánh thành phố Hồ Chí Minh, (1985).
5. Phạm Hoàng Hộ, Cây cỏ Việt Nam, NXB trẻ, (1999).
6. Đỗ Tất Lợi, Những cây thuốc và vị thuốc Việt nam, NXB Y học, (2001).
7. Phạm Quốc Long, Châu Văn Minh, Lipit và các axit béo hoạt tính sinh
học có nguồn gốc thiên nhiên, NXB khoa học và kỹ thuật, (2006)
8. Nguồn tài nguyên đa dạng sinh học rừng Việt Nam, Tạp chí Lâm
nghiệp,(1997).
9. Sách đỏ Việt Nam, NXB khoa học kỹ thuật, Hà Nội , (1996).
10. Ngô Văn Thu, Bài giảng dược liệu, tập 1, Trường Đại học dược Hà Nội,
(1998).
11. Nguyễn Quyết Tiến, Nghiên cứu thành phần hoá học và hoạt tính sinh
học của cây Ráy, luận án tiến sĩ. Hà Nội, (2003).
12. Vnexpress.net, Ké đầu ngựa chữa bệnh hiệu quả cao, Sức khoẻ,
(3B9E0855). (2005).
B. Tiếng Anh
13. Ageta.I.Goto.S., Hatano, T., Nishibe.S. and Okuda, T., Phytochemistry,
(33.508). (1993).
14. C. J. Kelley, R. C. Harruff, M Carmack, J Org.Chem., 41 (3), 449 (1976).
15. Chiu, N. Y. and Chang, K. H., in the Illustrated Medicinal Plants of
Taiwan, Vol. l. Southern Materials Center, lnc., Taipei, p.233. (1987)
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
47
16. Chang. H. M, and But, P. P.H., in Pharmacology and Applications
of Chinese Materia Medica, Vol. l. World Scientific, Singapore,
p. 589. (1986).
17. Editorial Board of China Herbal, State Administration of Traditional
Chinese Medicine, China Herbal, 7. Shanghai Science and Technology
Press, Shanghai, (1999).
18. Huang, K. C., in The Pharmacology of Chinese Herbs. CRC Press.
Boca Raton, p. 160. (1993).
19. N. Isutomu, I. Akira, K. Kazuco, Phytochemistry, 24 (2), 339 (1985)
Merfort. I., Phytochemistry. 31, 2111. (1992).
20. Morishita, H., Iwahashi, H, and Osaka, N., Kido, R., J. Chromatogr., 984,
315,325. (2000).
21. Pharmacopoeia of P. R. China (English Edition), Book 1. Chemical
Industry Press, Beijing, (2000).
22. Pohl, P. and Wagner, Fette Seifen Anstrichm., 74, 541 (1972)
23. Ting Han, Huiliang Li, Qiaoyan Zhang, HanchenZheng, Luping Qin,
“New Thiazinediones and other components from xanthium
strumarium”, Xumuò npupoỏohx coeỏueầuŭ, ạ5. (2006).
24. TCVN, 3703-90: Phương pháp xác định hàm lượng mỡ.
25. Takagi T. ct.al., Lipids, 17, p.716, (1982).
26. Turner A., Sereening methods in pharmacology, Academic Press. P.60-
68. (1965).
27. Vickery J.R., J. Am. Oil chem Soc., Vol. 57, P.87-91 (1980).
28. Warnaar,F. Lipids, 12, 707 (1993).
29. WHO: Research guidelines for evaluating the safaty and efficacy of
herbal
medicines, Manila P. 35-42 (1993).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
48
30. William W.C., Topics in Lipid Chemitry. Vol. I, F.D (1969).
31. Ying Tsun Ma, Mu Chi Huang, Feng Lin Hsu, “Thiazinedione from
Xanthium strumarium”, Phytochemistry, Vol. No. 6, pp. 1083-1085,
(1998) Elsevler Science Ltd, All rights reserved
Printed in Great Britain
32. Y., I., Chen, L., Xanthium, Flora Reipublicae Populariss Smicae. 75,
S cience Press, Beijing, (1979).
33. Youngken H.W: Marine Technology Soc. (1970).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
49
PHỤ LỤC
1. Kết quả phân tích mẫu Trang
1.1 Hàm lượng lipit tổng ……………………………………….50
1.2 Thành phần axit béo ………………………………………...50
1.3 Bảng kết quả thành phần axit béo……………………………51
1.4 Sắc kí đồ …………………………………………………….53
2. Các sterol và glucozit
2.1 õ-sitosterol (KĐN.H8)
2.1.1 Phổ EI-MS của β-sitosterol…………………………….54
2.1.2 Phổ FT-IR của β-sitosterol…………………………….55
2.1.3 Phổ 1H-NMR của β-sitosterol………………………...56
2.1.4 Phổ 13C-NMR và của β-sitosterol…………………….57
2.2 õ-sitosterol glucozit
2.2.1 Phổ 1H-NMR β-sitosterol glucozit …………………..58
2.2.2 Phổ 13C-NMR của β-sitosterol glucozit ……………...59
KĐN.E33 - 13C-CPD…………………………..59
KĐN.E33 - 13C-DEPT…………………….62
2.2.3 Bảng số liệu phổ………………………………………..64
3. Phiếu trả kết quả thử hoạt tính kháng sinh……………………………...67
Các file đính kèm theo tài liệu này:
- LV_07_SP_HH_NTHT.pdf