MỞ ĐẦU
Việt Nam nằm trong vùng nhiệt đới, gió mùa, mưa thuận gió hoà nên
hệ thực vật rất phong phú, đa dạng. Đó là nguồn tài nguyên sinh học quý giá
thuộc loại có thể tái tạo được. Ngay từ xa xưa cha ông ta đã biết khai thác
nguồn tài nguyên quý báu này để làm đồ ăn, thực phẩm, thuốc chữa bệnh, vật
liệu xây dựng và nhiên liệu phục vụ cuộc sống.
Trong thế giới thực vật ấy có những loài cung cấp thức ăn cho chúng ta,
có những loài cung cấp vật liệu, có loài cung cấp hương thơm, quả ngọt, có
nhiều loài được dùng để làm thuốc chữa bệnh, thuốc trừ sâu, cung cấp nguyên
liệu cho các ngành công nghiệp thực phẩm, mĩ phẩm và dược phẩm.
Việt nam có một vị trí thuận lợi về thiên nhiên như vậy nên nền Y học
dân tộc cổ truyền phát triển từ lâu đời, chiếm vị trí đặc biệt trong việc bảo vệ
sức khoẻ nhân dân trong suốt hàng ngàn năm đấu tranh dựng nước và giữ
nước. Tiếp thu truyền thống quý báu của các thế hệ cha ông, ngày nay Đảng
và Nhà nước ta đã xây dựng nhiều chính sách, nhiều hình thức động viên
nhằm kế thừa và phát huy tốt nguồn tài nguyên quý báu có thể tái tạo được
phục vụ con người có hiệu quả nhất.
Nhiều cây cỏ đã được trồng để dùng làm thuốc, nhiều loài dùng làm
nguyên liệu cung cấp tinh dầu cho công nghiệp dược phẩm và mỹ phẩm như
bạc hà, thanh hao hoa vàng, hoa hồi ., có loại được dùng làm thực phẩm
chức năng đồ uống như các loại trà, các loại sâm v.v . Trong số đó có cây đỏ
ngọn (Cratoxylum prunifolium) thuộc loại cây mọc hoang dại và phổ biến
khắp các vùng trên lãnh thổ nước ta. Đặc biệt cây đỏ ngọn có nhiều ở các
tỉnh miền núi phía Bắc, Tây Nguyên và Nam Bộ.
Cây đỏ ngọn đã và đang được dùng để làm thuốc và làm nước uống
trong phạm vi dân gian một cách khá phổ biến ở các nước châu Á, ở Việt
Nam đặc biệt vùng đồng bào dân tộc miền núi phía Bắc nước ta. Gần đây
người ta phát hiện dịch chiết của lá cây đỏ ngọn có tác dụng chữa bệnh gan,
có tác dụng tốt với hệ thần kinh và tác dụng của nó không thua kém gì các
thuốc nhập ngoại.
Cây đỏ ngọn được dùng trong dân gian đã có từ lâu, nghiên cứu hoá
thực vật cây đỏ ngọn thì mới chỉ được các nhà khoa học chú ý đến trong một
số năm gần đây, để góp phần làm rõ thêm thành phần hoá thực vật của cây đỏ
ngọn tạo thuận lợi cho việc dùng, sử dụng cây thuốc này làm dược liệu và
nguyên liệu cho các mục đích khác, chúng tôi chọn đề tài: “Nghiên cứu hóa
học và nhận dạng một số nhóm chất có trong cây đỏ ngọn (Cratoxylum
prunifolium).
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU 1
Chương 1. TỔNG QUAN . 3
1.1. Mô tả thực vật 3
1.2. Một số công dụng của chi Cratoxylum . 4
1.3. Tình hình nghiên cứu hóa học thực vật chi Cratoxylum 7
1.3.1. Các hợp chất có khung triterpen . 7
1.3.2. Các chất axit hữu cơ 8
1.3.3. Các chất có khung xanthone . 9
1.3.4. Một số đại diện của khung anthraquinon 15
1.3.5. Một số đại diện của khung flavonoit . 16
1.4. Những nghiên cứu hoá thực vật loài Cratoxylum prunifolium. 17
Chương 2. PHẦN THỰC NGHIỆM 19
2.1. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu 19
2.1.1. Thu mẫu cây, xác định tên khoa học và phương pháp xử
lý mẫu 19
2.1.2. Phương pháp phân lập các hợp chất từ các dịch chiết 19
2.1.3. Phương pháp khảo sát và xác định cấu trúc hoá học các
hợp chất . 20
2.2. Dụng cụ, hoá chất và thiết bị nghiên cứu . 20
2.2.1. Dụng cụ và hoá chất 20
2.2.2. Thiết bị nghiên cứu 21
2.3. Các dịch chiết từ cây đỏ ngọn (Cratoxylum prunifolium Kurtz) 21
2.3.1. Các dịch chiết 21
2.3.2. Khảo sát định tính các dịch chiết 23
2.3.3. Thử hoạt tính sinh học 23
2.4. Chiết suất, phân lập và tinh chế các chất từ cây đỏ ngọn . 25
2.4.1. Dịch chiết clorofom 26
2.4.1.1. Taraxeron (Friendoolean - 14- en-3-on) (ĐC1) . 26
2.4.1.2. Stigmast- 5,22- đien-24R-3β-ol 27
2.4.1.3. β- Sitosterol . 27
2.4.2. Dịch chiết trong etylaxetat (ĐE) . 28
Chương 3. THẢO LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 29
3.1. Nguyên tắc chung . 29
3.2. Phân tích định tính và phát hiện các nhóm chất 30
3.3. Phân lập và nhận dạng các hợp chất có trong các dịch chiết khác
nhau của cây đỏ ngọn 30
3.3.1. Taraxeron ( hay Frendoolean-14-en-3-on) (ĐC-1) 30
3.3.2. Stingmast -5,22-dien-24R-3β-ol (ĐC-2) 38
3.3.3. β-sitosterol (ĐC-3) . 44
3.3.4. Axit gallic (ĐE-1) 50
3.4. Thử hoạt tính sinh học 56
KẾT LUẬN 57
KIẾN NGHỊ . 57
TÀI LIỆU THAM KHẢO 58
111 trang |
Chia sẻ: banmai | Lượt xem: 1794 | Lượt tải: 2
Bạn đang xem trước 20 trang tài liệu Luận văn Nghiên cứu hoá học và nhận dạng một số nhóm chất có trong cây đỏ ngọn (cratoxylum prunifolium kurtz), để xem tài liệu hoàn chỉnh bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
O
CO
OH
OH
OH
OH
OH
OH
HO
O
XIII.b: Epicatechin-3-O-gallate
Theo Nguyễn Liêm và các cộng sự [10], bằng các phản ứng định tính
cho biết Cratoxylum prunifolium có chứa các flavonoit, tanin pyrocatechic
phitosterol saponin triterpen và các axit hữu cơ, đường khử. Tác giả còn cho
biết ở cây đỏ ngọn của Việt Nam không thấy có ancaloit và anthraquinon
Từ vỏ cây đỏ ngọn Cratoxylum prunifolium. Phạm Đình Hùng, Nguyễn
Diệu Liên Hoa và các cộng sự tại Đại học Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh
đã phân lập được macluraxanthone, 1,7-đihidroxanthone và hai xanthone mới
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
18
[6] và cho biết chúng đều có tác dụng diệt muỗi gây sốt rét và có tác dụng tốt
trong việc diệt mối.
Từ vỏ và rễ cây Cratoxylum prunifolium trồng ở tỉnh Nông Khai miền
Nam Thái Lan, Nawong Boonnak và các cộng sự đã chiết bằng điclometan,
phân lập các chất bằng sắc kí đã tách được 10 xanthone với sự khác nhau chỉ
là ở các mạch nhánh (R1 và R2) [22] và tác giả đã gọi tên chúng là các
prunifloron được đánh số từ 1 đến 10. Công thức của chúng có cấu trúc XIV.
O
OR1
R2
OH
OR
RO
HO
Prunifloron XIV; R1 ≠ R2 và đều là gốc ankyl hoặc dẫn xuất của nó.
R: là H hoặc CH3
Tên của chúng lần lượt là: XIV.1 Pruniflorone A; XIV.2 Pruniflorone
B; XIV.3 Pruniflorone C; XIV.4 Pruniflorone D; XIV.5 Pruniflorone E;
XIV.6 Pruniflorone F; XIV.7 Pruniflorone G; XIV.8 Pruniflorone H; XIV.9
Pruniflorone I; XIV.10 Pruniflorone J.
Cũng từ rễ của thực vật Cratoxylum prunifolium các tác giả Thái Lan
lại phát hiện được một anthraquinon mà cấu trúc của nó được tác giả mô tả có
dạng XV.
OOH OH
O
O
OH
XV: Anthraquinon
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
19
Chương 2
PHẦN THỰC NGHIỆM
2.1. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu
2.1.1. Thu mẫu cây, xác định tên khoa học và phương pháp xử lý mẫu
Nguyên liệu để nghiên cứu gồm lá cây đỏ ngọn, thu hái vào tháng 11
năm 2007 tại xã Thịnh Đức - Thành phố Thái Nguyên.
Cây đỏ ngọn, còn gọi là cây thành ngạnh đẹp, lành ngạnh đẹp, có tên
khoa học là: “Cratoxylum prunifolium Kurtz ”, họ Hyperaceas hay họ Ban.
Mẫu cây tươi thu hái gồm cả cành nhỏ và lá được đem sấy ở 80
0
C để
diệt men, sau đó sấy khô ở nhiệt độ 50
0
C cho tới khi khô hoàn toàn. Mẫu khô
được chia riêng thành các phần lá, và cành. Chọn mẫu lá làm đối tượng
nghiên cứu. Nghiền nhỏ mẫu ngâm, chiết trong etanol 90
o
ở nhiệt độ phòng
nhiều lần.
Sau khi cất loại dung môi, cặn cô được dưới dạng xiro, chiết lần lượt
bằng các loại dung môi có độ phân cực tăng dần: clorofom, etylaxetat,
n-butanol, metanol, các dịch chiết được bay hơi dung môi bằng thiết bị cất
quay ở nhiệt độ 50
0
C dưới áp suất thấp. Các cặn thô được phân chia bằng sắc
kí cột với các hệ dung môi rửa giải có độ phân cực tăng dần để phân lập các
chất có độ phân cực gần giống nhau, kết tinh phân đoạn và kết tinh lại trong
hệ dung môi thích hợp để thu được các chất sạch .
2.1.2. Phương pháp phân lập các hợp chất từ các dịch chiết
Để phát hiện, phân lập được những hợp chất sạch từ các dịch thô khác
nhau của cây đỏ ngọn chúng tôi đã phối hợp sử dụng các phương pháp sắc kí
và kết tinh lại trong dung môi thích hợp, các phương pháp gồm:
- Sắc kí lớp mỏng (SKLM).
- Sắc kí cột silicagen thường dùng Merck 63- 200nm.
- Kết tinh phân đoạn và kết tinh lại.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
20
2.1.3. Phương pháp khảo sát và xác định cấu trúc hoá học các hợp chất
Các chất kết tinh phân lập ra được xác định những tính chất vật lý đặc
trưng: màu sắc, mùi vị, hệ số Rf, điểm nóng chảy, ghi các loại phổ như: phổ tử
ngoại (UV), phổ hồng ngoại (FT-IR), phổ cộng hưởng từ hạt nhân
1
H- NMR,
phổ
13
C- NMR, tuỳ theo từng loại chất. Các số liệu phổ thực nghiệm của các
chất sạch được dùng để nhận dạng cấu trúc hoá học của chúng.
2.2. Dụng cụ, hoá chất và thiết bị nghiên cứu
2.2.1. Dụng cụ và hoá chất
Các loại dung môi dùng để ngâm, chiết mẫu là các loại tinh khiết
(pure), còn các loại dung môi dùng để sắc kí cột, sắc kí lớp mỏng hay dùng
trong phân tích là loại tinh khiết phân tích (PA).
Sắc kí lớp mỏng dùng tấm mỏng đế nhôm DC - Alufolien Kiesegel 60
F254 Art.5554 tráng sẵn, độ dày 0,2mm được sử dụng để xác định sơ bộ số
thành phần có trong các dich chiết, các phân đoạn chạy cột và kiểm tra sơ bộ
độ sạch của sản phẩm thu được.
Các hệ dung môi khai triển SKLM:
1. n-Hexan - etylaxetat 90:10 Hệ A
2. n-Hexan - etylaxetat 95:10 Hệ B
3. Clorofom - metanol 90:10 Hệ C
4. Clorofom - metanol 50:10 Hệ D
5. Clorofom - metanol 20:10 Hệ E
Các tấm SKLM sau khi sấy khô được soi dưới đèn tử ngoại (UV-
BIOBLOCK ) ở bước sóng
= 254nm và 365nm. Thuốc thử để hiện màu là
vanilin 1% trong dung dịch metanol-H2SO4 , sau đó sấy ở nhiệt độ trên 100
0
C
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
21
Các giá trị Rf trong hệ dung môi triển khai có biểu thức:
2.2.2. Thiết bị nghiên cứu
- Nhiệt độ nóng chảy đo trên máy Boetus (Đức) hoặc trên máy
Eletronthermal IA - 9200.
- Phổ hồng ngoại ghi trên máy IMPACT - 410.
- Phổ UV đo trên máy UV 1700 Phamaspec.
- Phổ khối ghi trên máy MS- Engine - 5989- HP ion hoá bằng va chạm
eletron (LC- MS) 70ev và sử dụng ngân hàng dữ liệu DATABASE/
WILLEY 250L.
- Phổ
1
H- NMR và
13
C- NMR ghi trên máy Bruker 500MHz nội chuẩn
TMS, dung môi CDCl3, MeOD.
2.3. Các dịch chiết từ cây đỏ ngọn (Cratoxylum prunifolium Kurtz)
2.3.1. Các dịch chiết
Lá cây đỏ ngọn đã sấy khô, nghiền nhỏ được ngâm chiết kiệt bằng
etanol 90
0
ở nhiệt độ phòng cho đến khi thu được dịch không màu. Dịch chiết
được cất loại hết dung môi ở áp suất giảm cho đến dạng cao lỏng, xác định
khối lượng cặn khô, sau đó thêm nước vào cặn và lần lượt chiết với các loại
dung môi clorofom, etylaxetat, n-butanol, cuối cùng đuổi hết nước và hoà tan
bằng metanol.
Các dịch chiết trên được làm khô bằng Na2SO4 lọc và cất dung môi
bằng thiết bị cất quay dưới áp suất giảm ở nhiệt độ 50
0
C. Cặn được sấy khô
và cân để xác định trọng lượng.
chiều dài di chuyển của chất thử
chiều dài di chuyển của dung môi
Rf =
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
22
Như vậy từ lá cây đỏ ngọn đã thu nhận được 04 phân đoạn cặn là: cặn
trong clorofom (ĐC), cặn trong etylaxetat (ĐE), cặn trong butanol (ĐB) và
cặn trong metanol (ĐM). Sơ đồ 2.1
1. Etanol
2. Cặn trong nước
CHCl3 EtOAc BuOH MeOH
Sơ đồ 2.1. Quy trình ngâm chiết
Bảng 2.1. Khối lượng chất tổng số được chiết từng phân đoạn lá cây đỏ
ngọn (Cratoxylum prunifolium Kurtz)
Khối lượng mẫu lá
(gam)
Cặn chiết
Clorofom Etylaxetat n-Butanol Metanol
787,4 52,264 34,654 40,411 26,604
100% 6,63% 4,40% 5,13% 3,38%
MẪU KHÔ
Cặn CHCl3
(ĐC)
Cặn BuOH
(ĐB)
Cặn EtOAc
(ĐE)
Cặn MeOH
(ĐM)
ĐC1
ĐE1
ĐC2 ĐC3
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
23
2.3.2. Khảo sát định tính các dịch chiết
Dùng các thuốc thử đặc hiệu để phát hiện các nhóm hợp chất thiên
nhiên có trong hoạt tính sinh lí cao trong thực vật [3] chúng tôi thu được kết
quả thử định tính với các nhóm chất, kết quả được chỉ ra ở bảng 2.2.
Bảng 2.2. Phát hiện các nhóm chất trong cây đỏ ngọn
Stt Nhóm chất Thuốc thử đặc hiệu Hiện tượng Kết quả
1 Saponin Tạo bọt Bọt bền trong axit ++
2 Glicozttim Kelle-Kiliani Vàng nâu -
3 Cumarin Axit và kiềm Kết tủa bông ++
4 Poliphenol (FeCl3+K3[Fe(CN)6]) 1% Xanh thẫm +++
5 Flavonoit Xianidin Từ hồng đến đỏ ++
6 Steroit Liberman-Bourchard Màu xanh vàng ++
7 Ancaloit Dragendorf Màu vàng da cam -
8 Đường khử Felinh
Cho kết tủa màu
đỏ gạch
++
Ghi chú: Dấu (+) là có phản ứng dương tính, (++) là có phản ứng tính
rất rõ, (-) là không có phản ứng.
2.3.3. Thử hoạt tính sinh học
Thử hoạt tính vi sinh vật kiểm định bằng định tính theo phương pháp
khuyếch tán trên thạch, sử dụng khoang giấy lọc tẩm chất thử theo nồng độ
tiêu chuẩn tại bộ môn Vi Sinh trường Đại học Y Thái Nguyên.
Các chủng vi sinh vật thử gồm đại diện các nhóm:
Vi khuẩn Gr (-) Escherichia coli.
Vi khuẩn Gr (+) Staphylococcus auresu.
Vi khuẩn: Salmonella typhi.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
24
Hình 2.1. Ảnh được gây ức chế xung quanh giếng thạch
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
25
Chúng tôi còn tiến hành thử các ứng dụng làm thực phẩm chức năng
tại cơ sở sản xuất kinh doanh thuốc thành phẩm, thực phẩm chức năng Y học
cổ truyền Thái Nguyên. Kết quả thử hoạt tính các dịch chiết thô được trình
bày trong bảng 2.3.
Bảng 2.3. Kết quả thử hoạt tính sinh học của dịch chiết thô
từ lá cây đỏ ngọn (Cratoxylum prunifolium)
Dịch chiết
Đường kính vùng ức chế xung quanh giếng thạch(mm)
Staphylococcus auresu Escherichia coli Salmonella typhi
Đường
kính
(mm)
Hoạt tính
Đường
kính
(mm)
Hoạt
tính
Đường
kính
(mm)
Hoạt
tính
Cặn tổng (H2O) 30 + 26 + 27 +
Cặn EtOAc 29 + 17 + 18 +
Chú ý: Dấu (+) là phản ứng có hoạt tính.
2.4. Chiết suất, phân lập và tinh chế các chất từ cây đỏ ngọn
Từ 787,4g lá Cratoxylum prunifolium khô chiết nhiều lần bằng etanol
90
0
đến khi dịch chiết trong suốt không màu, loại bỏ bớt dung môi rượu bằng
máy cất quay ở nhiệt độ 50
0
C đến khi dịch chiết còn lại ở dạng xiro đặc, thêm
nước, lắc cặn tổng số này với c lorofom đến khi thu được tất cả các chất có thể
tan được trong CHCl3 đều được lấy ra hết, cô cạn dung dịch CHCl3 ở nhiệt độ
thấp thu đuợc 52,264g chất (kí hiệu các chất ĐC).
Phần cặn không tan trong CHCl3 được lắc nhiều lần với EtOAc cho đến
khi dịch chiết EtOAc hoàn toàn không màu và trong suốt, cô cạn dịch EtOAc
trong máy cất quay thu được 34,654g chất tổng số (kí hiệu là các chất ĐE).
Phần không tan được trong EtOAc, được lắc với n-butanol sau đó
cũng cô cạn trong điều kiện áp suất thấp được 40,410g chất (kí hiệu là các
chất ĐB).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
26
Các chất cặn còn lại không tan trong các dung môi trên cho tan trong
MeOH thu đựoc 32,346g chất (kí hiệu là các chất ĐM).
2.4.1. Dịch chiết clorofom
Từ 11g cặn từ dịch clorofom của lá đỏ ngọn kí hiệu (ĐC) được phân
chia trên sắc kí cột silicagel với các hệ dung môi n-hexan - c lorofom với các
tỷ lệ tăng dần clorofom từ 0% đến 100% kiểm tra các phân đoạn trên sắc kí
lớp mỏng, các phân đoạn giống nhau đem gộp lại và cất loại dung môi thu
được ba chất ĐC-1, ĐC-2, ĐC-3.
2.4.1.1. Taraxeron (Friendoolean - 14- en-3-on) (ĐC1)
Rửa giải với các hệ dung môi n- hexan-clorofom (50:1), sau khi cất loại
dung môi, cặn thu được kiểm tra trên SKLM trong hệ dung môi B và phát
hiện bằng vanilin 1% trong dung dịch CH3OH- H2SO4, kết tinh lại trong dung
môi trên thu được 21mg chất rắn, tinh thể hình kim, màu trắng có nhiệt độ
nóng chảy 278-280
0
C và cho các đặc trưng của một tritecpen.
Phổ FT-IR (KBr); νmax (cm
-1
): 1720 (C=O); 1500 (C=C); 3050 (CH3);
2940 (CH).
Phổ LC- MS, m/z (%) 424 [M
+
]; 408 [M-O]
+
.
PHổ
1
H- NMR (500MHz, CDCl3): (ppm) 0,762ppm (3H, s, CH3);
0,84ppm (3H, s, CH3); 0,885ppm (3H, s, CH3); 0,996ppm (3H, s, CH3);
1,011ppm (3H, s, CH3); 1,02ppm (3H, s, CH3); 1,07ppm (3H, s, CH3)
5,48ppm (1H, dd, 3,21 và 8,17Hz).
Phổ
13
C - NMR (500MHz, CDCl3); (ppm): 38,35 (Cl); 33,08 (C2);
217,3 (C3); 47,56 (C4); 55,77 (C5); 19,91 (C6); 33,57 (C7); 38,87 (C8); 48,80
(C9); 33,57 (C10); 17,44 (C11); 36,67 (C12); 37,74 (C13); 157,59 (C14); 117,19
(C15); 34,12 (C16); 35,57 (C17); 48,70 (C18); 40,64 (C19); 28,79 (C20); 35,11
(C21); 37,69 (C22); 29,56 (C23); 21,57 (C24); 14,79 (C25); 25,56 (C26); 29,92
(C27); 26,12 (C28); 33,39 (C29); 21,47 (C30).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
27
2.4.1.2. Stigmast- 5,22- đien-24R-3β-ol
Rửa giải cột với hệ dung môi n-hexan- clorofom (50:5), sau khi cất loại
dung môi cặn thu được kiểm tra trên SKLM trong hệ dung môi A, phát hiện
bằng vanilin 1% trong dung dịch CH3OH- H2SO4, kết tinh lại trong hệ dung
môi trên thu được 29mg tinh thể hình kim, không màu, không mùi, có nhiệt
độ nóng chảy 152-155
0
C, Rf
100 =61.
Phổ FT-IR (KBr); νmax (cm
-1
): 3429,2 (OH); 2864,7 (C-H); 1651 (C=C).
Phổ EI- MS; m/z (%): 412 [M
+
] (7); 300 (7); 255 (11); 231 (4); 213
(8); 173 (7); 145 (20); 133 (20); 83 (49,3).
Phổ
1
H- NMR (500MHz, CDCl3); (ppm): 5,33 (1H, dd, j = 5Hz và
2H, H6); 515 (1H, dd, j22,23 = 15, Hz, j22,20= 5Hz, H-22); 5,01 (1H, dd, j23,22 =
15Hz, j23,24 = 5Hz, H-23).
Phổ
13
C- NMR (500MHz, CDCl3); (ppm): 36,4 (t, C1); 29,67 (t, C2);
71,8 (d, C3); 42,3 (t, C1); 139,2 (s, C5); 121,4 (d, C6); 37,3 (t, C7); 31,85 (d,
C8); 51,15 (d, C9); 36,12 (s, C10); 24,35 (t, C11); 42,18 (t, C12); 31,4 (s, C13);
56,83 (d, C14); 25,38 (t, C15); 31,6 (t, C16); 55,9 (d, C17); 12,01 (q, C18); 18,95
(q, C19); 40,47 (d, C20); 21,03 (q, C21); 138,4 (d, C22); 129,2 (d, C23); 50,01 (d,
C24); 33,9 (t, C25); 21,19 (q, C26); 19,79 (d, C27); 28,89 (q, C28); 12,22 (q, C29).
2.4.1.3. β- Sitosterol
Tiếp tục rửa giải trên cột với hệ dung môi n-hexan- clorofom (40:10),
sau khi cất loại dung môi, cặn thu được kiểm tra trên sắc kí lớp mỏng trong hệ
dung môi B, phát hiện nó bằng vanillin 1% trong dung dịch CH3OH- H2SO4,
kết tinh lại thu được 27mg chất rắn, tinh thể hình kim, nóng chảy 140- 141
0
C,
Rf .100 = 71.
Phổ FT-IR (KBr); νmax (cm
-1
): 3450 vân rộng (H32, C3); 3010- 1650
(liên kết đôi).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
28
Phổ EI- MS; m/z (%): 414 [M
+
] (20); 413 [M-H]
+
(41); 398 (28); 397
(100); 395 (32); 383 (11); 361 (11); 257 (3); 255 (6,3); 151 (5,6); 139 (11).
Phổ
1
H-NMR (500MHz, CDCl3); (ppm): 0,68 (3H, s, CH3-18); 1,01
(3H, s, CH3-19); 0,81 (3H, d, j, 7Hz, CH3-26); 0,88 (3H, d, j, 7Hz, CH3-27);
0,83 (3H, t, 7,32Hz, CH3-29); 0,92 (3H, d, j, 10Hz, CH3-21); 3,52 (1H, m, H-
3); 5,42 (1H, d, j, 5Hz, H-6).
Phổ
13
C- NMR (500MHz, CDCl3); (ppm): 141,1 (s, C5); 121,8 (d,
C6); 71,8 (d, C3); 56,8 (d, C14); 56,1 (d, C17); 50,2 (d, C9); 45,7 (d, C24); 42,5
(s, C13); 42,4 (t, C4); 39,8 (t, C12); 37,3 (t, C1); 36,5 (s, C10); 36,2 (d, C20);
33,9 (d, C8); 31,9 (t, C7); 31,7 (t, C2); 29,2 (d, C25); 28,3 (t, C16); 26,2 (t, C23);
24,2 (t, C15); 21,1 (t, C11); 19,8 (q, C26); 19,4 (q, C19); 19,1 (q, C27); 18,8 (q,
C21); 11,9 (q, C29); 11,9 (q, C18); 23,2 (t, C28).
2.4.2. Dịch chiết trong etylaxetat (ĐE)
Từ 15g cặn chiết etylaxetat của lá cây đỏ ngọn (ký hiệu ĐE) được tiến
hành tách các chất trên sắc kí cột silicagel, rửa giải cột sắc kí bằng hệ dung
môi clorofom- metanol có tỷ lệ theo độ tăng dần của dung môi phân cực,
metanol 0% -100%, kiểm tra các phân đoạn trên sắc kí lớp mỏng, thuốc thử
phát hiện (FeCl3 + K3[Fe(CN)6]) 1% sau đó gộp các phân đoạn giống nhau,
đuổi hết dung môi và kết tinh lại thu đựơc chất (ĐE1).
* Axit gallic (ĐE1)
Rửa giải trên cột bằng hệ dung môi clorofom- metanol (90:10), sau khi
kiểm tra bằng SKLM với hệ dung môi C, cất loại dung môi, thu được cặn thô,
kết tinh lại trong hệ dung môi trên thu được 70mg chất rắn màu vàng, tinh thể
hình kim, có tn/c khoảng 248- 258
0
C.
Phổ FT-IR (KBr); νmax (cm
-1
): 1700 (C=O); 3100 (OH) rất tù.
Phổ
1
H-NMR (500MHz, MeOD); (ppm): 7,092 (2H, C2 và C6).
PHổ
13
C-NMR (500MHz, MeOD); (ppm): 121,960 (C1); 139,559 (C4);
110,349 (C2, C6); 146,345 (C3, C5); 170,364 (C7).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
29
Chương 3
THẢO LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Nguyên tắc chung
Trong quá trình nghiên cứu hóa thực vật cần phải tôn trọng nguyên tắc
chung là không được làm thay đổi cấu trúc hóa học của các chất sẵn có trong
thực vật và không làm ảnh hưởng đến thành phần hoá học của chúng tại thời
điểm lấy mẫu. Như vậy, ngay sau khi mẫu thu hái xong phải được diệt men
để tránh sự chuyển hoá do các quá trình sinh tổng hợp xảy ra ở thực vật, sấy
khô ở nhiệt độ thích hợp, bảo quản mẫu trong điều kiện khô ráo.
Để tách các chất ra khỏi thực vật có thể được tiến hành bằng nhiều cách
khác nhau: ép lấy dầu béo, cất lôi cuốn bằng hơi nước để tách các tinh dầu,
ngâm chiết bằng dung môi hữu cơ v.v… Tuy nhiên có hai phương pháp phổ
biến hơn cả để tách các chất ra khỏi thực vật:
Cách 1: Trước tiên chiết bằng dung môi rượu-nước để tách hầu hết các
chất ra khỏi thực vật. Sau đó chiết sàng lọc bằng các dung môi từ không phân
cực đến các dung môi có độ phân cực tăng dần. Các dịch chiết chứa các hợp
chất có độ phân cực gần nhau sẽ được cất đuổi dung môi, bảo quản dùng cho
các quá trình tách tiếp theo.
Cách 2: Chiết và phân lập các chất mẫu thực vật bằng các loại dung
môi từ không phân cực đến có độ phân cực tăng dần như lần lươt là: n-hexan,
clorofom, etylaxetat, n-butanol, metanol(etanol), etanol-nước.
Việc chiết lấy chất từ lá thực vật (Cratoxylum prunifolium) được thực
hiện theo cách 1 (sơ đồ 2.1).
Các dịch chiết tổng số và các phần chiết thô đem thử nghiệm với các
tác động sinh học và độc tố tế bào nhằm giúp cho việc định hướng tìm kiếm
các chất có hoạt tính sinh lý cao trong những dịch chiết.
Kết quả thử hoạt tính với vi sinh vật kiểm định nêu trong bảng (2.2)
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
30
3.2. Phân tích định tính và phát hiện các nhóm chất
Dùng các thuốc thử đặc hiệu để phát hiện các nhóm hợp chất thiên
nhiên có hoạt tính sinh lý cao trong thực vật [3] cho thấy trong dịch chiết
bằng clorofom của lá cây đỏ ngọn có chứa các axit hữu cơ, streroit,
triterpenoit. Ở dịch chiết bằng etylaxetat của lá cây đỏ ngọn có chứa các hợp
chất polyphenol, các hợp chất flavonoit, cũng ở phần dịch chiết này đã tách
được axit gallic và dẫn xuất của nó. Trong dịch chiết n-butanol có chứa các
tanin, các đường khử. Không phát hiện thấy có ancaloit, các xianua trong các
dịch chiết của lá đỏ ngọn. Kết quả của các phản ứng định tính để xác định các
nhóm hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh lý cao được chỉ ra ở bảng 2.2.
3.3. Phân lập và nhận dạng các hợp chất có trong các dịch chiết khác nhau
của cây đỏ ngọn
Các dịch chiết từ cây đỏ ngọn (Cratoxylum prunifolium) đều là những
hỗn hợp phức tạp chứa các hợp chất khác nhau. Để phân lập từng chất ra khỏi
hỗn hợp đã sử dụng các phương pháp sắc kí cột, chất hấp phụ dùng là
silicagel, các hệ dung môi rửa giải thích hợp và thường phải lặp lại nhiều lần.
Việc tinh chế các chất thường dùng phuơng pháp kết tinh lại trong
dung môi hoặc hệ dung môi thích hợp. Nhờ cách làm đó đã thu được các đơn
chất có độ tinh khiết cao, đáp ứng các yêu cầu để khảo sát tính chất hoá lý và
xác định quang phổ của chúng.
Khi phân lập các thành phần hoá học từ lá cây đỏ ngọn được thực hiện
như trong sơ đồ 2.1. Bằng phương pháp phân lập trên, từ dịch chiết bằng
clorofom của lá cây đỏ ngọn chúng tôi đã thu được 3 hợp chất sạch là: một
tritecpen và hai steroit; còn dịch chiết etylaxetat phân lập được axit gallic và
hỗn hợp các xanthone với flavonoit.
3.3.1. Taraxeron ( hay Frendoolean-14-en-3-on) (ĐC-1)
Chất ĐC-1 là chất rắn tinh thể hình kim, màu trắng có nhiệt độ nóng
chảy ở 278-280
0
C nó được tách từ phần cặn chiết clorofom. Bằng sắc kí cột
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
31
silicagen với hệ dung môi n-hexan:clorofom thu được chất ĐC-1, chất này
cho các phản ứng định tính của terpenoit.
Khối lượng phân tử của chất ĐC-1 được xác định bằng phổ khối LC-
MS cho biết khối lượng phân tử của [M
+
] m/z bằng 424,2 tương ứng với khối
lượng phân tử bằng 424 u và tương ứng với công thức phân tử C30H48O.
Trong phổ LC-MS còn xuất hiện pic m/z 408,2 điều này tương ứng với
mảnh [M-O]
+
với m/z bằng 408
Phổ FT-IR: cho thấy các vân hấp thụ của nhóm xeton (C=O) ở νmax =
1720cm
-1
, liên kết đôi (C=C) ở νmax = 1500cm
-1
, các nhóm CH3 ở νmax =
3050cm
-1
và các nhóm CH ở νmax = 2940cm
-1
, không phát hiện thấy các vân
hấp thụ của nhóm OH. Điều này có thể khẳng định được hợp chất ĐC-1
không có chức rượu mà là có chức xeton.
Phổ
1
H-NMR và phổ DEPT: cho biết hợp chất ĐC-1 có tín hiệu của 8
nhóm CH3 đều ở dạng singlet (xem hình 3.2 và 3.4) có các độ chuyển dịch
hoá học như sau: ở độ chuyển dịch δ = 0,762ppm (3H, s, CH3); δ = 0,841ppm
(3H, s, CH3); δ = 0,847ppm (3H, s, CH3); δ = 0,885ppm (3H, s, CH3); δ =
0,996ppm (3H, s, CH3); δ = 1,011ppm (3H, s, CH3); δ = 1,021ppm (3H, s,
CH3); δ = 1,07ppm (3H, s, CH3). Độ dịch chuyển hoá học ở δ = 5,48ppm
(1H, d, J = 3,21 và 8,17Hz) là của proton liên kết tại cacbon ở liên kết đôi
(nhóm = CH tại C15).
Phổ
13
C-NMR: nhận thấy nguyên tử cacbon ở trạng thái lai hoá sp
2
thuộc nhóm =CH có độ chuyển dịch hoá học δ = 117,19ppm. Nguyên tử
cacbon bậc 4 cũng ở trạng thái lai hoá sp
2
tham gia vào liên kết đôi với
nguyên tử này có độ chuyển dịch hoá học ở δ = 157,59ppm.
Phổ
13
C-NMR còn cho một tín hiệu ở trường rất yếu tương ứng với độ
chuyển dịch hoá học δ = 217,43ppm đặc trưng cho cacbon trong nhóm
cacbonyl tại vị trí C-3.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
32
Như vậy, phổ NMR hoàn toàn phù hợp với phổ FT-IR không thấy có
vân đặc trưng của nhóm OH mà lại thấy xuất hiện vân đặc trưng của C=O.
Các nguyên tử H đối với nhóm C=O thấy chỉ có 2H với δ = 2,50ppm (2H,
dd, J = 7,1 và 11Hz), còn có 2 proton ở vị trí của nhóm =CH (tại C16) có độ
chuyển dịch hoá học δ = 2,27ppm (2H, dd, J = 3,3 và 4,08 và 6,39).
Trên cơ sở phân tích các tính chất hoá học, nhất là phân tích các thông
tin có được từ phổ LC- MS, FT-IR, phổ cộng hưởng từ hạt nhân
1
H-NMR,
13
C-NMR, phổ DEPT, phổ HMBC, HSQC, phổ H-H COSY và phần mềm
ACD/HNMR ACD/CNMR mô phỏng phổ NMR cũng đã cho phép chúng tôi
quy kết hợp chất ĐC-1 là một triterpen phải có công thức cấu tạo như sau:
27
O
29 30
28
23
24
25 26
1
3 5
6
8
9
10
15
18
20
22
13
19 21
7
11
14
16
2
4
12
17
Taraxeron (hay Frendoolean-14-en-3-on)
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
33
Bảng 3.1. Phổ
13
C-NMR và
1
H-NMR của taraxeron (ĐC-1) từ lá đỏ ngọn
Vị trí
cacbon
13
C-NMR
(δ-ppm)
ACD/
13
C-
NMR (δ-ppm)
1
H-NMR
(δ-ppm)
1 38,35 38,4 Vùng (1,2 - 1,6)
2 33,08 34,1 2,5 (2H; dd; 7,1 và 11,0)
3 217,3 217,3 -
4 47,56 47,6 -
5 55,77 55,8 (1,99)
6 19,91 20,0 Vùng (1,2 - 1,6)
7 33,57 35,2 Vùng (1,2 - 1,6)
8 38,87 38,9 -
9 48,8 48,7 (1,78 - 1,87)
10 33,57 37,6 -
11 17,44 17,5 Vùng (1,2 - 1,6)
12 36,67 35,8 Vùng (1,2 - 1,6)
13 37,74 37,7 -
14 157,59 157,6 -
15 117,19 117,2 5,48 (1H; d; 3,21; 8,17)
16 34,12 36,7 2,27 (2H; dd; 3,3; 4;1; 6,4)
17 35,57 37,7 -
18 48,7 48,8 (1,78 - 1,87)
19 40,64 40,7 Vùng (1,2 - 1,6)
20 28,79 28,8 -
21 35,11 33,6 Vùng (1,2 - 1,6)
22 37,69 33,1 Vùng (1,2 - 1,6)
23 29,92 29,9
0,76 - 1,07
(24H của 8 nhóm CH3)
24 14,79 14,8
25 29,86 29,9
26 21,34 21,5
27 25,56 25,6
28 26,12 26,2
29 33,36 33,4
30 21,47 21,4
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
34
Hình 3.1
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
35
Hình 3.2
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
36
Hình 3.3
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
37
Hình 3.4
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
38
3.3.2. Stingmast -5,22-dien-24R-3β-ol (ĐC-2)
Chất ĐC-2 là chất rắn kết tinh, có nhiệt độ nóng chảy ở 152
0
-155
0
C,
tách được từ dịch chiết clorofom, phân lập bằng sắc kí cột silicagen, rửa giải
bằng hệ dung môi n-hexan-clorofom (90:10).
Phổ EI-MS cho pic ion phân tử [M
+
] ở 412 m/z. Các phổ FT-IR,
1
H-
NMR và
13
C-NMR đều khẳng định sự có mặt của nhóm hydroxyl, phổ FT- IR
có vân 3410cm
-1
rộng, còn ở phổ NMR cho δH-3α = 3,47ppm và δC-3 =
71,6ppm). Phân tử có hai nối đôi không liên hợp (IR cho νmax ở 1622cm
-1
).
Phổ
1
H-NMR của các proton thuộc nhóm metyl (CH) cũng đã khẳng
định điều ấy, δH-6 = 5,33ppm (1H, dd, j =15Hz và 2Hz); δH-22 = 5,15ppm (1H,
dd, j =15Hz và 5Hz); δH-23 = 5,01ppm (1H, dd, j =15Hz và 5Hz). Phổ
13
C-
NMR cho thấy δC-5 = 139,2ppm; δC-6 = 121,4ppm; CC-22 = 138,4ppm và δC-23
= 129,2ppm. So sánh các số liệu phổ
1
H-NMR và
13
C-NMR của chất ĐC-2
với số liệu phổ NMR của stingmasterol [16] hoàn toàn tương tự nhau và được
chỉ ra ở bảng 3.2.
Dựa trên phân tích các số liệu về phổ EI-MS, FT-IR và các phổ NMR của
hợp chất ĐC-2 hoàn toàn phù hợp với cấu trúc của chất Stingmast -5,22-dien-
24R-3β-ol.
HO
2
1
3
4
5
6
7
8
9
10
18
12
13 16
17
19
21
22 24
26
27
28
29
11
14 15
23 2520
Stingmast -5,22-dien-24R-3β-ol
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
39
Bảng 3.2. Phổ
13
C-NMR của các chất ĐC-2 và stingmasterol [16]
Phổ
13
C-NMR của Stigmasterol
(ĐC-2)
Phổ
13
C-NMR của Stigmasterol
[16]
Vị trí
cacbon
13
C-NMR(δ-ppm)
Vị trí
cacbon
13
C-NMR(δ-ppm)
1 36 1 37,28
2 29 2 31,66
3 71 3 71,78
4 42 4 42,31
5 140 5 140,76
6 122 6 121,69
7 37 7 31,91
8 31 8 31,91
9 51 9 50,18
10 36 10 36,52
11 24 11 21,09
2 42 2 39,70
13 40 13 42,22
14 57 14 56,88
15 25 15 24,38
16 30 16 28,92
17 56 17 55,97
18 12 18 19,40
19 19 19 12,06
20 40 20 40,50
21 19 21 21,23
22 138 22 138,31
23 129 23 129,29
24 50 24 51,25
25 32 25 31,91
26 21 26 21,09
27 21 27 19,00
28 19 28 25,41
29 12 29 12,25
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
40
Hình 3.5
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
41
Hình 3.6
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
42
Hình 3.7
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
43
Hình 3.8
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
44
3.3.3. β-sitosterol (ĐC-3)
Chất ĐC-3 là chất rắn tinh thể hình kim, không màu, nóng chảy 140-
141
0
C, nó được tách từ dịch chiết clorofom, trong hệ dung môi n-hexan-
clorofom (40:10).
Phổ EI- MS, m/z (%) cho [M
+
] = 414 (23), [M-1]
+
= 413 (41).
Từ phổ EI-MS cho pic [M+] = 414 ứng với công thức phân tử C29H50O.
Phổ hồng ngoại, phổ
1
H-NMR và phổ
13
C-NMR cho thấy trong phân tử
có nhóm OH tại vị trí C-3 (IR có vân 3450 cm
-1
rộng, δH-3α = 3,57ppm và δC-3
= 72,1ppm). Một liên kết đôi tại C6 (phổ IR có νmax= 3010cm
-1
và 1650cm
-1
ứng với dao động hoá trị của liên kết đôi; còn trên phổ
1
H-NMR cho δH-6 =
5,42ppm (1H, d, J, 5,2Hz), phổ
13
C-NMR cho δC-5 = 141,1ppm và δC-6 =
121,7ppm). So sánh các số liệu phổ
1
H-NMR và
13
C-NMR của chất ĐC-3 với
số liệu phổ NMR của β-sitosterol [16] hoàn toàn tương tự nhau và được chỉ
ra ở bảng 3.3.
Dựa trên phân tích các số liệu về phổ EI-MS, FT-IR và các phổ NMR của
hợp chất ĐC-3 hoàn toàn phù hợp với cấu trúc của chất β-sitosterol.
HO
2
1
3
4
5
6
7
8
9
10
18
12
13 16
17
19
21
22 24
26
27
28
29
11
14 15
23 2520
β-sitosterol
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
45
Bảng 3.3. Phổ
13
C-NMR của các chất ĐC-3 và β-sitosterol [16]
Phổ
13
C-NMR của β-sitosterol
(ĐC-3)
Phổ
13
C-NMR của β-sitosterol
[16]
Vị trí
cacbon
13
C-NMR(δ-ppm) Vị trí cacbon
13
C-NMR(δ-ppm)
1 37 1 37,27
2 31 2 32,54
3 71 3 71,77
4 42 4 42,29
5 140 5 140,75
6 121 6 121,69
7 32 7 31,92
8 32 8 31,92
9 50 9 50,15
10 36 10 36,51
11 21 11 21,10
12 40 2 39,80
13 42 13 42,23
14 57 14 56,78
15 24 15 24,31
16 28 16 28,25
17 56 17 56,08
18 12 18 19,39
19 19 19 11,89
20 36 20 36,16
21 19 21 18,80
22 34 22 33,96
23 26 23 26,11
24 46 24 45,85
25 29 25 29,18
26 19 26 18,82
27 19 27 19,05
28 23 28 23,08
29 12 29 11,99
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
46
Hình 3.9
Hình 3.9
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
47
Hình 3.10
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
48
Hình 3.11
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
49
Hình 3.12
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
50
3.3.4. Axit gallic (ĐE-1)
Các chất thu được từ dịch chiết etylaxetat (ĐE) được phân chia trên sắc
kí cột với chất hấp phụ silicagel, rửa giải bằng hỗn hợp dung môi clorofom-
metanol với tỉ lệ metanol tăng dần từ 0% - 100% thu được nhiều phân đoạn
khác nhau trong đó có phân đoạn CHCl3:MeOH (9:1) chứa một chất sạch
được kí hiệu là chất ĐE-1.
Chất ĐE-1 là chất rắn, tinh thể hình kim có nhiệt độ nóng chảy ở
248
0
C-250
0
C.
Phổ IR cho vân hấp thụ mạnh ở νmax= 1700cm
-1
đặc trưng cho nhóm
cacboxyl có νmax = 1700cm
-1
, với vân rất tù có số sóng νmax = 3100cm
-1
đặc
trưng cho nhóm OH của phenol.
Phổ
1
H-NMR cho tín hiệu 7,092ppm ứng với hai proton ở hai vị trí C2
và C6.
Phổ
13
C-NMR cho thấy các tín hiệu: δC-1 = 121,960ppm; δC-4 =139,559
ppm; δC-2 = δC-6 =110,349ppm; δC-3 = δC-5 =146,345ppm; δC-7 =170,364ppm.
Những số liệu về phổ NMR của chất ĐE-1 hoàn toàn phù hợp với phần
mềm ACD/NMR của axit gallic (xem bảng 3.4).
Bảng 3.4. Số liệu phổ NMR của ĐE-1 và số liệu phổ NMR trong
phần mềm ACD/NMR của axit gallic
Vị trí
cacbon
Phổ của chất ĐE-1 Phần mềm ACD của axit gallic
13
C-NMR
(δ-ppm)
1
H-NMR
(δ-ppm)
ACD/
13
C-
NMR (δ-ppm)
ACD/
1
H-NMR
(δ-ppm)
1 121,96 - 123,88 -
2 110,35 7,092 111,35 7,11
3 146,35 - 147,44 -
4 139,56 - 138,18 -
5 146,35 - 147,44 -
6 110,35 7,092 111,35 7,11
7 170,36 - 167,37 -
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
51
Trên cơ sở phân tích các số liệu về phổ FT-IR, NMR và phần mềm
ACD/NMR. Cấu trúc của axit gallic là:
COOH
OH
HO
OH
2
3
4
5
6
7
1
Axit gallic
Từ dịch chiết etylaxetat, ngoài axit gallic còn thu được một số phân
đoạn không sạch khác có chứa các chất cho phản ứng màu với xianidin; cho
phản ứng tạo màu xanh đen với FeCl3. Các mẫu này có chứa hỗn hợp các
flavonoit, các polyphenol có hệ số Rf rất gần nhau và việc tách chúng bằng
cột silicagen chưa đạt được sự phân chia tốt.
Khi rửa giải bằng CH3OH 100% thu được phân đoạn cho các phản ứng
màu giống dịch chiết tổng số bằng n-butanol. Khi thực hiện phản ứng thuỷ
phân các mẫu này trong axit HCl 2N thu được glucozơ và axit gallic. Từ kết
quả thuỷ phân này có thể cho rằng các phân đoạn chiết bằng etylaxetat và
bằng n-butanol đều chứa các tannin và đó là galotanin. Tuy nhiên các tannin
ấy được tạo ra bởi liên kết C-glycoside hay O-glycoside cấu trúc và thứ tự
liên kết của chúng như thế nào, còn chưa được làm rõ vì chưa tách chúng
thành các đoạn sạch.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
52
Hình 3.13
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
53
Hình 3.14
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
54
Hình 3.15. Phổ
1
H-NMR của chất axit gallic
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
55
Hình 3.16. Phổ
13
C-NMR của chất axit gallic
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
56
3.4. Thử hoạt tính sinh học
Các chất tổng số được chiết, tách bằng dung môi có độ phân cực khác
nhau sau khi làm khô kiệt, loại bỏ hoàn toàn dung môi được gửi tới phòng thí
nghiệm vi sinh trường Đại học Y khoa Thái Nguyên để thử tác dụng sinh học
của chúng. Kết quả được nêu ở bảng 2.3 và hình 2.1 cho thấy tất cả các chất
thu được từ các dịch chiết của lá cây đỏ ngọn đều có tác dụng kháng khuẩn
đối với khuẩn Staphylococcus, E.coli, Salmonella typhi.
Chúng tôi cũng đã gửi mẫu chiết bằng etylaxetat và chiết bằng etanol
sau khi đã làm sạch dung môi đến cơ sở sản xuất kinh doanh thuốc thành
phẩm, thực phẩm chức năng Y học cổ truyền Thái Nguyên. Các mẫu đều có
tác dụng tốt đối với việc chăm sóc sức khoẻ con người, các chất có trong các
dịch chiết trên đều không gây độc đối với con người.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
57
KẾT LUẬN
1. Nghiên cứu sàng lọc hoá thực vật của lá cây đỏ ngọn (Cratoxylum
prunifolium) đã phát hiện thấy nhiều nhóm hợp chất thiên nhiên có hoạt tính
sinh lý cao; đó là đường khử, tritecpenoit, steroit, saponin, cumarin, axit hữu
cơ, các flavonoit, các chất polyphenol, các tannin, các chất xanthone.
2. Từ lá cây đỏ ngọn lần đầu tiên đã phân lập và dựa vào các đặc trưng
hoá lý, các số liệu phổ EI-MS, NMR, FT-IR đã nhận dạng được cấu trúc của 4
hợp chất hữu cơ thuộc các nhóm polyphenol, steroit, terpenoit.
3. Phân tích các phổ IR, UV, MS và NMR các chất tinh khiết được
tách ra nói trên đã nhận dạng được chúng là: taraxeron, stigmasterol , β-
sitosterol và axit gallic.
4. Từ dịch chiết tổng của lá đỏ ngọn (Cratoxylum prunifolium) chúng
hoàn toàn không gây độc hại với con người, có thể chế biến thành thức uống
hằng ngày như một thực phẩm chức năng có tác dụng kháng các khuẩn
Staphylococcusauresu (Tụ cầu vàng), E.coli (Thực khuẩn đường ruột) và
Salmonella typhi (Thương hàn).
KIẾN NGHỊ
Cây đỏ ngọn là một cây thuốc quý có nhiều tác dụng trong y học vì vậy
tôi đề nghị với các cấp có thẩm quyền tiếp tục cho nghiên cứu một cách sâu
rộng hơn về cây đỏ ngọn nhằm phục vụ tốt trong đời sống nhân dân.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
58
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng việt
1. Võ Văn Chi (1999), Từ điển cây thuốc Việt Nam, Nxb Y học, trang 969.
2. Trần Đình Đại (1998), “Khái quát về hệ thực vật Việt Nam”, Hội thảo
Việt - Đức về hoá học các hợp chất thiên nhiên, Hà Nộ i, trang 17-27.
3. Nguyễn Văn Đàn (1997), Các phương pháp nghiên cứu cây thuốc, Nxb
Y-Dược, TP Hồ Chí Minh .
4. Đề tài cấp bộ quốc phòng của Học viện Quân Y (2002) , “Nghiên cứu tác
dụng của dịch chiết từ cây đỏ ngọn lên một số chức năng của hệ thần
kinh trên động vật thực nghiệm”, Hà Nội
5. Phạm Hoàng Hộ (1999), Cây cỏ Việt Nam, Nxb Trẻ, Hà Nội.
6. PGS.TS Phạm Đình Hùng (2007), Nghiên cứu xác định cấu trúc các hợp
chất có hoạt tính sinh học cao, (Mã số đề tài 510402).
7. Hoàng Thanh Hương, Cầm Thị Ích, Hà Việt Sơn (2006), Khảo sát phần
dịch chiết etylaxetat của lá thành ngạnh, tạp chí Hoá học, T.44(1), trang
71-75.
8. Lê Khả Kế (1977), Cây cỏ thường thấy ở Việt Nam, tập 2, Nxb Khoa học
và kỹ thuật, trang 189.
9. Nguyễn Liêm, Triệu Duy Điệt, Đỗ Văn Bình (1996), Nghiên cứu tác dụng
chống oxi hoá (Antioxidant invitro) của một số cây thuốc Việt Nam, Công
trình nghiên cứu khoa học quân sự số 3, trang 30-33.
10. Nguyễn Liêm và cộng sự (1996), “Nghiên cứu tác dụng chống oxi hoá
(antioxydant), của cây đỏ ngọn để phòng và chứa các bệnh về rối loạn
huyết động”. Đề tài cấp Bộ quốc phòng, Hà Nội.
11. Đỗ Tất Lợi (2001), Những cây thuốc Việt Nam, Nxb Y học, trang 122-123.
12. Trần Cẩm Vinh (1997), “Tác dụng của cây đỏ ngọn trong quá trình đông
máu”, Công trình nghiên cứu y học quân sự, số 3, trang 7- 9.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
59
Tiếng Anh
13. A.K.Ratty, N.P.Das (1988), “Biochemical medicine and metabolic
biologo”, 39, 69-79.
14. Anake Kijjoa, Maria Jose, T.G.Gonzalez, Madalena M.M.Ana M.Damas,
§Ing-on Mondranondra, Llartur M.S.Silva and Werner Herz (1998),
“Xanthones from Cratoxylum Maingayi”. Phytochemistry Vol 49, No.7,
2159-2162.
15. G.M.Kitanov, I.Assenov I and Dam The Van (1988), “Flavonols and
Xanthones from Cratoxylum prunifloum kurz”, Pharnazie 43, 879 .
16. Goat J.L, Akihisa T.Analysis of steroit frested, pp.324. Chapman & Hall.
London, New York - Tokyo.
17. Guat-Lee Sia, Graham J.Bennett, Leslie J.Harrison and Keng-Yeow Sim
(1995), “Minor xanthones from the Bark of Cratoxylum cochinchinense”.
Phytochemistry, Vol 38, No.6, pp.1521-1528.
18. J. Graham (1993), “et al, triterpenoids, tocotrienols and xanthones from the
Bark of cratoxylon cochinchinense”, phytochemistry, Vol 32, No 5, 1245.
19. Lien Hoa Dieu Nguyen, Le Li J. Harrison (1998), “ritecpenoid and
xanthone constituents fo Cratoxylum conchinchinese”, phytochemisty
50, 471-476.
20. Macias, M.Ulloa, M.Ulloa, M. Gamboa, A. and Mata, R. “Phytotoxic
comopounds from the new coprophilous fungus Gnanomyces polytlrix”.
21. Munekazu Iinuma, Hideki, Tðtero Ito, Toshiyuki Tanaka and Domingo
A.Madulid (1996), “Two xanthones from roots of Cratoxylum
formosanum”. Phytochemistry, Vol, 42, No 4, PP.1195-1198.
22. Nawong Boonnak, Chatchanok Karalai, Suchada Chantrapromma, Channita
Ponglimanont, Hoong-Kun Fun (2006), “Bioac tive prenylated xanthones
and anthraquinones from Cratoxylum formosun ssp.pruniflorum”.
Tetrahedron 62 ,8850-8859.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
60
23. Pitchaon Maisuthisakul, Rungnaphar Pongsawatmanit, Michael H.Gordon
(2007), “Charaterization of the phytochemicals and antioxidant properties
of extracts from Teaw (Cratoxylum fromosum Dyer)”. Food chemistry
100 1620-1629.
24. Sompong Boonsri, Chatchanok Karalai, Chanita Ponglimanont, Akkharawit
Kanjana-Opas, Kan Chantrapromma (2006), “Anibac terial and cytotoxic
xanthones from the roots of Cratoxylum fomosum”. Phytochemistry 67,723-727.
25. Soon Yew Tang, Matthew Whiteman, Zhao Feng Peng, Andrew Jeniner, Eu
Leong Yong and Barry Halliwell (2004), “Charcterition of Antioxidant and
Antiglycation Properties and Isolation of Active Ing redients from
Traditional Chinese medicines”. Free Radical Biology & Medicine,
Vol.36, No.12, pp.1575-1587, .
26. Soon Yew Tang, Matthew Whiteman, Andrew Jeniner, Zhao Feng Peng
and Barry Halliwell (2004), “Mechanisin of cell death induced bi an
antioxidant extract of Cratoxylum cochinchinense”, Free Radical
Biology and Medicine, Vol 36, No.12,pp, 1588-1611.
27. Xue- Li Cao, Yu Tian, Tian-You Zhang, Yoichiro Ito (2000), “Supercritical
fluid extraction of catechins Cratoxylum prunifolium Dyer”. Joumal of
Chromatography A, 898, 75-81.
28. Xue- Li Cao, Yu Tian, Tian-You Zhang and Yoichiro Ito (2000),
“Beijing Institute of New Technology Application, Xizhimen
Southstree” No.16, Beijing 100035, China.
29. W. Mahabusaraka, W. Nuangnaowarat, W.C. Taylor (2006), “xanthone
derivativens from Cratoxylum cochinchinense roots”, Phytochemistry 67
470- 474.
30. K. Tawaraya, Y. Takaya, M. Turjaman, S.J. Tuah, S.H. Limin, Y. Tamai,
J.Y. Cha, T. Wagatsuma, M. Osaki (2003), “Arbuscular mycorrhizal
colonization of tree species grown in peat swamp forests of central
kalimantan, indonesia”, Forest Ecology and Management 182, 381- 386.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
61
PHỤ LỤC
I. Chất taraxeron Trang
Phổ LC-MS của taraxeron…………………………………………………. 62
Phổ FT-IR của taraxeron................................................................................65
Phổ
1
H-NMR của taraxeron…………………………………………………66
Phổ
13
C-NMR của taraxeron………………………………………………...71
Phổ C13CPD & DEPT của taraxeron……………………………………….73
Phổ C13CPD-COSYGP của taraxeron……………………………………...78
Phổ C13CPD-HSQC của taraxeron…………………………………………81
Phổ C13CPD-HMBC của taraxeron………………………………………...82
II. Chất stigmasterol
Phổ EI-MS của stigmasterol…….……………………………………….......84
Phổ FT-IR của stigmasterol ………………………………………………...85
Phổ
1
H-NMR của stigmasterol………………………………………………86
Phổ
13
C-NMR của stigmasterol……………………………………………...87
III. Chất β- Sitosterol
Phổ EI-MS của β- Sitosterol…………………………………………………88
Phổ FT-IR của β- Sitosterol………………………………………………….89
Phổ
1
H-NMR của β- Sitosterol………………………………………………90
Phổ
13
C-NMR của β- Sitosterol……………………………………………...95
Phổ C13CPD & DEPT của β- Sitosterol…………………………………….97
IV. Chất axit gallic
Phổ FT-IR củaaxit gallic ……………………………………………………98
Phổ tử ngoại UV của axit gallic............... ................................................... 99
Phổ
1
H-NMR của axit gallic………………………………………………..100
Phổ
13
C-NMR của axit gallic………………………………………………101
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
62
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
63
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
64
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
65
Phổ FT-IR của taraxeron
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
66
Phổ
1
H-NMR của taraxeron
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
67
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
68
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
69
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
70
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
71
Phổ
13
C-NMR của taraxeron
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
72
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
73
Phổ DEPT của taraxeron
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
74
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
75
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
76
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
77
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
78
Phổ COSYGP của taraxeron
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
79
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
80
Hình…
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
81
Phổ HSQC của taraxeron
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
82
Hình…
Phổ HMBC của taraxeron
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
83
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
84
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
85
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
86
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
87
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
88
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
89
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
90
Phổ
1
H –NMR của
β
- Sitosterol
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
91
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
92
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
93
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
94
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
95
Phổ
13
C –NMR của
β
- Sitosterol
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
96
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
97
Phổ DEPT của
β
- Sitosterol
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
98
Phổ IR của axit gallic
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
99
Phổ UV của axit gallic
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
100
Phổ
1
H – NMR của axit gallic
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
101
Phổ
13
C – NMR của axit gallic
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
102
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
103
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
104
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
105
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU .................................................................................................... 1
Chương 1. TỔNG QUAN........................................................................... 3
1.1. Mô tả thực vật .................................................................................. 3
1.2. Một số công dụng của chi Cratoxylum............................................... 4
1.3. Tình hình nghiên cứu hóa học thực vật chi Cratoxylum ...................... 7
1.3.1. Các hợp chất có khung triterpen ................................................. 7
1.3.2. Các chất axit hữu cơ .................................................................. 8
1.3.3. Các chất có khung xanthone ....................................................... 9
1.3.4. Một số đại diện của khung anthraquinon.................................. 15
1.3.5. Một số đại diện của khung flavonoit......................................... 16
1.4. Những nghiên cứu hoá thực vật loài Cratoxylum prunifolium. .......... 17
Chương 2. PHẦN THỰC NGHIỆM ........................................................ 19
2.1. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu ............................................ 19
2.1.1. Thu mẫu cây, xác định tên khoa học và phương pháp xử
lý mẫu ...................................................................................... 19
2.1.2. Phương pháp phân lập các hợp chất từ các dịch chiết ................ 19
2.1.3. Phương pháp khảo sát và xác định cấu trúc hoá học các
hợp chất................................................................................... 20
2.2. Dụng cụ, hoá chất và thiết bị nghiên cứu ......................................... 20
2.2.1. Dụng cụ và hoá chất ................................................................ 20
2.2.2. Thiết bị nghiên cứu .................................................................. 21
2.3. Các dịch chiết từ cây đỏ ngọn (Cratoxylum prunifolium Kurtz) ........ 21
2.3.1. Các dịch chiết .......................................................................... 21
2.3.2. Khảo sát định tính các dịch chiết .............................................. 23
2.3.3. Thử hoạt tính sinh học.............................................................. 23
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
106
2.4. Chiết suất, phân lập và tinh chế các chất từ cây đỏ ngọn................... 25
2.4.1. Dịch chiết clorofom.................................................................. 26
2.4.1.1. Taraxeron (Friendoolean - 14- en-3-on) (ĐC1) ................... 26
2.4.1.2. Stigmast- 5,22- đien-24R-3β-ol .......................................... 27
2.4.1.3. β- Sitosterol....................................................................... 27
2.4.2. Dịch chiết trong etylaxetat (ĐE) ............................................... 28
Chương 3. THẢO LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU.............................. 29
3.1. Nguyên tắc chung........................................................................... 29
3.2. Phân tích định tính và phát hiện các nhóm chất ................................ 30
3.3. Phân lập và nhận dạng các hợp chất có trong các dịch chiết khác
nhau của cây đỏ ngọn ............................................................................ 30
3.3.1. Taraxeron ( hay Frendoolean-14-en-3-on) (ĐC-1) .................... 30
3.3.2. Stingmast -5,22-dien-24R-3β-ol (ĐC-2) .................................... 38
3.3.3. β-sitosterol (ĐC-3) ................................................................... 44
3.3.4. Axit gallic (ĐE-1) .................................................................... 50
3.4. Thử hoạt tính sinh học .................................................................... 56
KẾT LUẬN .............................................................................................. 57
KIẾN NGHỊ ............................................................................................. 57
TÀI LIỆU THAM KHẢO........................................................................ 58
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
107
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1. Khối lượng chất tổng số được chiết từng phân đoạn lá cây
đỏ ngọn (Cratoxylum prunifolium Kurtz) ..................................... 22
Bảng 2.2. Phát hiện các nhóm chất trong cây đỏ ngọn ................................. 23
Bảng 2.3. Kết quả thử hoạt tính sinh học của dịch chiết thô từ lá cây đỏ
ngọn (Cratoxylum prunifolium) ................................................... 25
Bảng 3.1. Phổ
13
C-NMR và
1
H-NMR của taraxeron (ĐC-1) từ lá đỏ ngọn ...... 33
Bảng 3.2. Phổ
13
C-NMR của các chất ĐC-2 và stingmasterol [16] ............... 39
Bảng 3.3. Phổ
13
C-NMR của các chất ĐC-3 và β-sitosterol [16] .................. 45
Bảng 3.4. Số liệu phổ NMR của ĐE-1 và số liệu phổ NMR trong phần
mềm ACD/NMR của axit gallic .................................................. 50
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
108
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Ảnh cây đỏ ngọn (Cratoxylum Prunifolium Kurt, Hypericaceae) ... 4
Hình 2.1. Ảnh được gây ức chế xung quanh giếng thạch............................ 24
Hình 3.1 ................................................................................................... 34
Hình 3.2 ................................................................................................... 35
Hình 3.3 ................................................................................................... 36
Hình 3.4 ................................................................................................... 37
Hình 3.5 ................................................................................................... 40
Hình 3.6 ................................................................................................... 41
Hình 3.7 ................................................................................................... 42
Hình 3.8 ................................................................................................... 43
Hình 3.9 ................................................................................................... 46
Hình 3.10 ................................................................................................. 47
Hình 3.11 ................................................................................................. 48
Hình 3.12 ................................................................................................. 49
Hình 3.13 ................................................................................................. 52
Hình 3.14 ................................................................................................. 53
Hình 3.15. Phổ
1
H-NMR của chất axit gallic ............................................. 54
Hình 3.16. Phổ
13
C-NMR của chất axit gallic ............................................. 55
DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ
Sơ đồ 2.1. Quy trình ngâm chiết ................................................................ 22
Các file đính kèm theo tài liệu này:
- doc281.pdf