Luận văn Nghiên cứu khả năng phân huỷ các hợp chất cacbuahydro của một số chủng nấm sợi phân lập từ rừng ngập mặn Cần Giờ

9b 1222,6  0,002 63,93 223,8  0,005 5 Đ4a 1155,4  0,007 60,42 206,8  0,006 6 L3.2a 1152,6  0,006 60,27 196,4  0,007 7 Đ5a 1145,5  0,007 59,90 153,2  0,006 8 L35 1124,2  0,003 58,79 134,0  0,004 9 C’18.1 1124,2  0,006 58,78 193,8  0,007 10 L19 1081,2  0,008 56,54 205,9  0,005 11 C18 1,0772  0,004 56,33 152,5  0,008 12 Đ1a 1073,0  0,005 56,11 206,5  0,005 13 Đ7a 1062,7  0,008 55,57 166,8  0,006 14 Đ30 1044,7  0,005 54,63 256,7  0,004 15 Đối chứng (1912,4mg) 0,00 0,00 0,00 Qua bảng 3.3 ta có nhận xét sau: - Trong 14 chủng nấm sợi nghiên cứu đều có khả năng phân giải dầu mạnh từ 54,63%- 67,09% sau 15 ngày nuôi cấy. Lượng sinh khối sinh ra so với kết quả ở bảng 3.1 đa số chủng nấm sợi giảm (0.2- 0.6 mg ). Điều này cho thấy, các chủng nấm sợi hoạt tính sinh enzym phân giải dầu giảm đi do ảnh hưởng của thời gian và MT nuôi cấy. - Lượng dầu phân giải của các chủng nấm sợi phân lập thấp hơn (54,63-67,09%/ 15 ngày) và chậm hơn so với VK ở mỏ Bạch Hổ Vũng Tàu 94.16%-7 ngày; VK ở RNM Cần Giờ 74%- 7 ngày nuôi cấy ( tác giả Đặng Cẩm Hà và Nguyễn Ngọc Hạnh- 2004). Mặt khác, các chủng nấm sợi phân giải dầu không tạo chất hoạt động bề mặt như VK. Tuy nhiên, ưu điểm của nấm sợi là tạo được lượng sinh khối rất lớn nhờ đòng hoá lượng dầu từ MT. Đặc điểm này của nấm sợi có thể được ứng dụng trong công nghệ xử dụng chất thải cặn xăng dầu để thu sinh khối. 0 25 50 75 100 125 150 175 200 225 250 275 300 325 350 375 400 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Lượng sinh khối (mg) Tỉ lệ (%) dầu phân Chú thích: 1- C15.1; 2-Đ41; 3-L6.3; 4-Đ’9b; 5- Đ4a; 6-L3.2a;7- Đ5a; 8-L35; 9-C’18.1; 10- L19; 11- C18; 12-Đ1a; 13- Đ7a; 14-Đ30. Biểu đồ 3.1: Tương quan giữa sinh khối và tỉ lệ dầu phân giải Theo biểu đồ 3.1 chúng tôi thấy: Sinh khối VSV nói lên khả năng sử dụng dầu như là nguồn cacbon duy nhất để sinh trưởng. Tuy nhiên, sinh khối VSV và lượng dầu phân bị phân giải không phải lúc nào cũng tỉ lệ thuận với nhau. Như vậy, trong số 14 chủng ở trên có 4 chủng có khả năng phân giải dầu cao nhất từ 63-67% khối lượng dầu và trong 15 ngày nuôi cấy. Đó là các chủng ký hiệu C15.1; Đ41; L6.3; Đ’9b. Chúng tôi chọn những chủng này để nghiên cứu tiếp. Hình 3.1: Chủng nấm sợi nuôi cấy trên môi trường có dầu DO 3.1.2.3. Ảnh hưởng của thành phần môi trường đến khả năng phân giải dầu của các chủng được tuyển chọn Để hiểu sơ bộ về điều kiện phân giải dầu của 4 chủng nấm sợi tuyển chọn, chúng tôi đã tiến hành thí nghiệm: Nuôi cấy các chủng nấm sợi tuyển chọn trên 2 lô thí nghiệm với thời gian 15 ngày gồm: Lô đối chứng: Nuôi cấy nấm sợi trong bình tam giác 250ml chứa 47,5ml môi trường nghèo chất dinh dưỡng (môi trường khoáng) và 2,5ml dầu DO. Lô thí nghiệm: Nuôi cấy nấm sợi trong bình tam giác 250ml chứa môi trường giàu chất dinh dưỡng (môi trường phân lập) và 2,5ml dầu DO. Xác định lượng dầu bị phân giải theo phương pháp 2.2.2.2. Kết quả được trình bày ở bảng 3.4 Bảng 3.4: Tỉ lệ dầu bị phân giải bởi các chủng nấm tuyển chọn trên 2 môi trường khác nhau. Tỉ lệ (%) dầu bị phân giải Lượng sinh khối khô (mg) STT Kí hiệu chủng Môi trường khoáng Môi trường phân lập Môi trường khoáng Môi trường phân lập 1 C15.1 67,07 31,08 257,7 514,7 2 Đ41 67,0 30,17 356,2 537,5 3 L6.3 65,57 26,71 128,1 280,9 4 Đ’9b 63,89 27,14 224,4 510,6 0 10 20 30 40 50 60 70 C15.1 Đ41 L6.3 Đ'9b Môi trường khoáng Môi trường dinh dưỡng Biểu đồ 3.2: Khả năng phân giải dầu của các chủng nấm sợi trên 2 môi trường khác nhau Kết quả từ bảng 3.4 và biểu đồ 3.2 cho thấy: - Mặc dù trên cả hai loại môi trường các chủng nấm sợi tuyển chọn đều phân giải dầu. Song, trên môi trường khoáng chúng có khả năng phân giải dầu DO mạnh hơn rất nhiều (76,07% - chủng C15.1), so với môi trường phân lập (31,08%). Ngược lại, sinh khối sinh ra môi trường phân lập (514,5mg - chủng c15.1) lại lớn hơn môi trường khoáng (257,7mg). Số liệu này có thể giải thích: ở môi trường phân lập giàu các chất chứa nitơ và nguồn C (glucoza). Đó là những chất dễ hấp thụ hơn nhiều so với C trong dầu DO. Vì vậy, chúng sử dụng nguồn C dễ hấp thu trước, khi hết chúng mới sử dụng đến dầu DO. Nên lượng dầu DO vẫn bị phân giải [5]. Lượng sinh khối sinh ra từ nấm sợi ở MT khác nhau, chứng tỏ ảnh hưởng của nguồn cacbon đến sự sinh trưởng của nấm sợi. - Nhằm xác định phạm vi phân giải cacbuahydro trong các cơ chất khó phân hủy của các chủng nấm sợi tuyển chọn. Chúng tôi tiến hành khảo sát chúng trên các môi trường có thành phần cacbuahydro khác nhau. 3.1.2.4 . Khảo sát khả năng phân giải cacbuahydro của chủng nấm tuyển chọn từ các nguồn cơ chất khác nhau Trong thành phần của dầu DO. Ngoài các hydrocacbon no mạch thẳng, còn có hydrocacbon vòng thơm. Đây là hợp chất khó phân hủy. Về mặt sinh thái học, chúng là chất có khả năng gây ức chế các hoạt động sống và trao đổi chất. Do vậy, ảnh hưởng nghiêm trọng đến khả năng làm sạch môi trường trong tự nhiên của VSV và sinh vật khác. Chúng tôi tiến hành nuôi cấy chủng nấm sợi tuyển chọn trên môi trường khoáng (MT2) có chứa dầu DO, dầu hoả, phenol, toluen. Sử dụng phương pháp 2.2.2.2 để nhận xét đánh giá. Kết quả được trình bày ở bảng 3.5. Bảng 3.5: Khả năng sinh trưởng của các chủng nấm sợi trên môi trường có nguồn hidrocacbon khác nhau Lượng sinh khối (mg/50mll) STT Kí hiệu chủng Dầu DO Dầu hoả Toluen Phenol 1 C15.1 257.6 38.7 12.1 0 2 Đ41 355.2 40.2 10.3 0 3 L6.3 127.8 6.4 0 0 4 Đ'9b 223.9 8.3 0 0 Kết quả ở bảng 3.5 cho thấy: - Cơ chất chứa được phân giải mạnh nhất là dầu DO, tiếp đến là dầu hoả. Riêng 2 cơ chất là toluen và phenol có vòng hidrocacbon thơm, nấm sợi sinh trưởng yếu. - Môi trường có hợp chất toluen chỉ có chủng C15.1 và Đ41 sinh trưởng được. Đặc biệt nuôi trong môi trường chứa phenol, cả 4 chủng đều không sinh trưởng. Có thể thấy, các chủng nấm sợi phân lập sử dụng tốt hidrocacbon, nhưng khó phân giải hidrocacbon vòng thơm. Sau khi khảo sát khả năng sinh trưởng của các chủng nấm sợi trên môi trường có các nguồn hidrocacbon khác nhau. Chúng tôi thấy 2 chủng C15.1 và Đ41 có ưu điểm vừa phân giải dầu DO mạnh (67%), vừa có khả năng phân giải toluen.Vì vậy, chúng tôi chọn 2 chủng nấm (C15.1, Đ41) và cơ chất dầu DO làm môi trường để khảo sát các đặc điểm của nấm sợi tiếp theo. toluen Hình 3.2: Chủng C15.1, Đ41 trên môi trường có toluen, dầu hoả 3.1.2.5 . Khảo sát ảnh hưởng của thời gian Để khảo sát ảnh hưởng của thời gian và khả phân giải dầu DO của các chủng nấm sợi tuyển chọn, chúng tôi tiến hành thí nghiệm.  Ảnh hưởng của thời gian lên sự sinh trưởng của chủng tuyển chọn Nuôi cấy chấm điểm chủng nấm sợi tuyển chọn trên môi trường nuôi cấy (MT2). Xác định sự sinh trưởng của nấm sợi bằng đo đường kính khuẩn lạc của các chủng 24, 48, 72, 96, 120, 144, 168h. Kết quả trình bày ở bảng 3.6. Bảng 3.6: Ảnh hưởng của thời gian đến sự sinh trưởng các chủng nấm sợi Mức độ sinh trưởng (cm) STT Ký hiệu chủng nấm 24h 48h 72h 96h 120h 144h 168h 1 C15.1 0,2 0,6 1,0 1,4 1,6 2,4 2,4 2 Đ41 0,4 2,4 4,8 6,2 7,5 8,2 9,0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 Thời gian (ngày) Đư ờn g kí nh k hu ẩn lạ c (c m ) Đ41 C15.1 BiêBiểu đồ 3.3: Ảnh hưởng của thời gian lên sinh trưởng chủng C15.1 và Đ41 Từ bảng 3.6 và biểu đồ 3.3. cho thấy: Tốc độ sinh trưởng của nấm sợi trên môi trường nuôi cấy khác nhau. Tuỳ vào từng loài mà có thời gian sinh trưởng tối đa nhất định. Tuy nhiên, chủng Đ41 có tốc độ sinh trưởng (2,4cm/24h) nhanh hơn C15.1 (0,6cm/24h). Đồng thời, sau 120 h tốc độ sinh trưởng của C15.1 cũng chậm lại (1,6cm/120h, 2,4cm/144h, 2,4cm/168h) so với Đ41 (7,5cm/120h, 8,2cm/144h, 9,0cm/168h). Điều này cho thấy, ảnh hưởng của thời gian khác nhau đối với từng loài nấm sợi.  Ảnh hưởng của thời gian lên khả năng phân giải dầu Để tìm hiểu ảnh hưởng của thời gian lên khả năng phân giải dầu của các chủng nấm sợi, chúng tôi tiến hành nuôi cấy tĩnh chủng nấm sợi trên môi trường khoáng có dầu DO. Xác định lượng dầu phân giải bằng phương pháp 2.2.2.2. Đánh giá khả năng phân giải dầu của nấm ở 7, 15,13, 30 ngày qua sinh khối nấm, lượng dầu DO phân giải.Kết quả thu được ở bảng 3.7. Bảng 3.7: Ảnh hưởng của thời gian đến sự phân giải dầu của nấm sợi Lượng sinh khối (mg/50ml) Tỉ lệ (%) dầu bị phân giải Ký hiệu chủng nấm sợi STT Thời gian C15.1 Đ41 C15.1 Đ41 1 7ngày 42.81 46.52 21.35 18.01 2 15 ngày 256.3 352.6 66.42 66.86 3 23 ngày 296.6 401.3 86.14 87.1 3 30 ngày 301.5 413.7 90.21 91.12 Kết quả ở bảng 3.7 ta nhận thấy: - Sau 7 ngày nuôi cấy lượng sinh khối và dầu bị phân giải còn rất thấp so với kết quả ở bảng 3.1. - Từ 7 ngày đến 15 ngày lượng sinh khối và dầu phân giải tăng nhanh ( sinh khối: 5 -7,6 lần; dầu: 3.1 -3.7 lần). - Từ 15 ngày trở đi, tuy sinh khối và lượng dầu bị phân giải có tăng nhưng chậm dần.Có thể thấy, thời gian đầu sợi nấm sinh trưởng mạnh phân cần nhiều chất dinh dưỡng để xây dựng tế bào. Từ ngày 15 trở đi, trên bề mặt sinh khối sợi xuất hiện nhiều bào tử, nên khả năng phân giải dầu chậm lại. Đồng thời, ta thấy sau 30 ngày vẫn còn ít dầu chưa bị phân giải (≈ 10%). Điều này có thể suy đoán, dầu DO sử dụng là dầu trung bình nặng. Trong đó, có nhiều cacbuahydro mạch dài, vòng và tạp chất nên chủng nấm sợi phân lập không phân giải hoàn toàn. - Từ kết quả ở bảng 3.7, chúng tôi chọn thời điểm 15 ngày- đây cũng là thời gian tác giả Mai Thị Hằng đánh giá mức độ sinh trưởng của nấm sợi trên môi trường có dầu. - Vậy qua khảo sát ở mục 3.3; 3.4; 3.5. Chúng tôi chọn môi trường khoáng có dầu DO, thời gian nuôi cấy 15 ngày. Nhằm nghiên cứu yếu tố môi trường ảnh hưởng đến khả năng phân giải dầu của chủng nấm sợi C15.1 và Đ41. Hình 3.3: Ảnh hưởng thời gian đến khả năng sinh trưởng và phân giải dầu của chủng C15.1 Hình 3.4: Ảnh hưởng của thời gian đến sinh trưởng chủng nấm sợi (Đ41) trên môi trường nuôi cấy (MT2). 3.1.2.6. Khảo sát tác động lượng dầu DO trong MT thí nghiệm Để xác định tác động của lượng dầu đến sinh trưởng nấm sợi .Chúng tôi tiến hành thí nghiệm nuôi cấy chủng nấm tuyển chọn trên MT3 có hàm lượng dầu khác nhau 2,5ml, 5ml, 7,5ml, 10ml ( ≈ 4%, 8%, 12%, 16%). Thí nghiệm được tiến hành cấy 2ml bào tử nấm (6,3.106CFU/ml) trong 4 lô với MT: - Lô 1: 6 bình tam giác 250ml với 47,5ml MT3 + 2,5ml DO (4%). - Lô 2: 6 bình tam giác 250ml với 45ml MT3 + 5ml DO (8%) - Lô 3: 6 bình tam giác 250ml với 42,5ml MT3 + 7,5ml DO (12%) - Lô 4: 6 bình tam giác 250ml với 40ml MT3 +10ml DO (16%). Nuôi cấy tĩnh trong 15 ngày, xác định lượng dầu phân giải dầu theo phương pháp 2.2.2.2. kết quả thu được ở bảng 3.8. Bảng 3.8: Khả năng sinh trưởng của nấm sợi trong MT có hàm lượng dầu khác nhau. Lượng sinh khối sinh ra (mg) STT Ký hiệu chủng 4% DO 8%DO 12% DO 16% DO 1 C15.1 66,81 37,28 0 0 2 Đ41 66,26 29,64 0 0 Qua bảng 3.8 ta thấy: - Nấm sợi phân giải dầu có khả năng sinh trưởng trên môi trường có hàm lượng dầu DO khác nhau. - Khẳ năng sinh trưởng tốt nhất trên MT có hàm lượng dầu 4%. Ở MT có lượng dầu 8% chúng vẫn sinh trưởng được. Nhưng trên 10% chúng không có khả năng sinh trưởng. - Vi khuẩn phân giải dầu phân lập từ cặn thải xăng dầu theo tác giả Đặng Cẩm Hà và Nguyễn Bá Hữu (2003) có khả năng phân giải ở MT có 10% dầu. 3.2 . Khảo sát ảnh hưởng các yếu tố môi trường lên khả năng phân giải dầu của nấm sợi 3.2.1 . Ảnh hưởng của nguồn nitơ Theo nhiều nghiên cứu trên thế giới nguồn N, P và O có ảnh hưởng đến khả năng phân giải dầu của VSV [38]. Trong luận văn này, do điều kiện thời gian chúng tôi chỉ tìm hiểu ảnh hưởng của nguồn nitơ. Nhiều loài nấm sợi có khả năng đồng hoá cả muối amôn lẫn muối nitrat. Vì vậy, việc tìm ra những ảnh hưởng tích cực lên sự phát triển và phân giải dầu của chúng là rất cần thiết. Nghiên cứu của chúng tôi nhằm: - Xác định nguồn N thích hợp cho khả năng phân giải dầu DO của 2 chủng tuyển chọn C15.1 và Đ41. - Khảo sát nồng độ N phù hợp cho môi trường nuôi cấy nấm sợi phân giải dầu. Chúng tôi bố trí thí nghiệm theo phương pháp (2.2.2.4). Trong đó, lô đối chứng là nấm sợi trên môi trường khoáng có dầu và muối KNO3. Trong mỗi lô chúng tôi nuôi cấy nấm sợi với nồng độ N khác nhau 0.01, 0.04, 0.07, 0.1, 0.13. Nuôi cấy tĩnh các chủng nấm sợi trong thời gian 15 ngày ở nhiệt độ phòng. Đánh giá lượng dầu bị phân giải theo phương pháp (2.2.2.2 ) và dùng phương pháp thống kê để xác định kết quả. Kết quả được trình bày ở bảng 3.9. Bảng 3.9: Ảnh hưởng của nguồn N đến khả năng phân giải dầu của chủng nấm C15.1 và Đ41 . Khả năng phân giải dầu D.O (%) Nguồn nitơ Nồng độ N (%) Chủng C15.1 Chủng Đ41 0,01 45,59 45,45 0,04 49,6 48,67 0,07 55,28 45,72 0,1 62,8 52,26 NaNO3 0,13 60,13 48,22 0,01 44,6 45,56 0,04 49,21 50.02 0,07 56,33 57,66 0,1 67,4 67,83 KNO3 0,13 64,16 63,12 0,01 50,23 50,11 0,04 47,63 49,68 0,07 62,1 61,12 0,1 57,12 58,89 (NH4)2C2O4 0,13 54,34 52.91 0,01 60,4 59,22 0,04 65,27 66,4 0,07 66,55 66,82 0,1 68,28 67,57 NH4NO3 0,13 64,16 63,2 0,01 41,1 40,08 0,04 38,23 37,16 0,07 39,12 36,52 0,1 33,67 37,11 NH4Cl 0,13 31,14 34,81 0.01 38.12 38.01 0.04 40.23 41.22 0.07 39.16 40.36 0.1 43.35 43.72 (NH4)2SO4 0.13 41.56 42.27 Qua kết quả 3.9 chúng tôi thấy: + Trong 5 nguồn N nghiên cứu thì nguồn N từ muối NH4NO3 thích hợp nhất cho sự phân giải dầu của chủng Đ41 và C15.1. Tiếp đến là muối KNO3, muối (NH4)2C2O4, NaNO3 và (NH4)2SO4 ít thích hợp hơn. Muối NH4Cl là ít thích hợp nhất. Điều này, tác giả Nguyễn Đức Lượng cũng kết luận: Đa số nấm sợi phát triển yếu trên môi trường chứa NH4Cl. Nguyên nhân chính không phải ở bản thân gốc NH4+ mà độ chua sinh lý do các muối này tạo ra. Sau khi đồng hoá gốc NH4+ môi trường sẽ tích gốc Cl-. Vì vậy, hạ thấp trị số pH của môi trường. + Nồng độ N trong muối NH4NO3 thích hợp cho 2 chủng Đ41 và C15.1 phân giải dầu là 0,1 % (1 g/l) tương đương 2,9 gam NH4NO3 /1lit. So với hàm lượng khoáng ban đầu sự phân giải dầu D.O của 2 chủng Đ41 và C15.1 tăng lên 1,7 % và 0,81%. + Kết quả này cho thấy: Để tối ưu hoá khả năng phân giải dầu DO của nấm sợi cần đưa vào môi trường N với nồng độ và dạng thích hợp. Yếu tố này rất quan trọng trong quá trình xử lí môi trường nhiễm dầu bằng phương pháp phân hủy sinh học. + Để tìm thêm điều kiện tối ưu cho các chủng nấm sợi RNM tuyển chọn. Chúng tôi tiến hành khảo sát trên môi trường với độ mặn khác nhau. Hình 3.5: khả năng phân giải dầu ở nồng độ NH4NO3 khác nhau của chủng C15.1 và Đ41. 3.2.2. Ảnh hưởng của độ mặn đến C15.1 và Đ41 Nấm sợi RNM rất đa dạng. Chúng có thể là dạng ưa mặn tuỳ tiện hoặc ưa mặn cực đoan. Vì vậy, Chúng tôi tiến hành thí nghiệm trên nồng độ muối khác nhau. Nhằm xác định nồng độ muối thích hợp cho chủng nấm phân giải dầu. Để xác định khả năng sinh trưởng của các chủng nấm sợi RNM tuyển chọn. Chúng tôi nuôi cấy chấm điểm các chủng trên ở môi trường YEA, với nồng độ muối khác nhau trong 3 ngày theo phương pháp 2.2.2.3. Đánh giá mức độ phát triển qua đo đường kính khuẩn lạc. Kết quả thu được ở bảng 3.10. Bảng 3.10: Ảnh hưởng độ mặn lên sự sinh trưởng 2 chủng nấm sợi tuyển chọn C15.1 và Đ41 Mức độ phát triển (mm) STT Ký hiệu chủng nấm 0% NaCl 3% NaCl 5% NaCl 10% NaCl 1 C15.1 8 18 12 10 2 Đ41 45 52 35 24 Kết quả bảng 3.10 cho thấy: Các chủng nấm sợi RNM sinh trưởng tốt ở môi trường có nồng độ muối NaCl từ 0%-3%. Nồng độ muối NaCl 5% nấm sợi sinh trưởng trung bình và khi tăng lên nồng độ 10% các chủng phát triển yếu. Chứng tỏ, trước đây chúng là những VSV có nguồn gốc từ đất liền. Vì thế, chúng là dạng VSV chịu mặn tuỳ tiện thích ứng dần với môi trường ngập mặn và cư trú lâu dài trong hệ sinh thái này. Mục tiêu của chúng tôi là chọn các yếu tố môi trường thích hợp cho khả năng phân giải dầu của 2 chủng nấm sợi tuyển chọn. Do đó, chúng tôi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của độ mặn lên quá trình phân giải dầu của chúng. Chúng tôi nuôi cấy 2 chủng nấm sợi trên môi trường khoáng (MT3) với nồng độ muối khác nhau. Nuôi cấy tĩnh, sau 15 ngày ở nhiệt độ phòng. Đánh giá mức độ phân giải dầu theo phương pháp 2.2.2.2. Kết quả thu được ở bảng 3.11. Bảng 3.11: Ảnh hưởng độ mặn đến khả năng phân giải dầu DO của C15.1 và Đ41. Khả năng phân giải dầu D.O (%) ở nồng độ muối khác nhau STT Ký hiệu chủng nấm 0% 1% 3% 5% 10% 1 C15.1 5.7 53.7 66.24 42.26 38.97 2 Đ.41 9.32 48.6 66.95 43.23 2.99 0 10 20 30 40 50 60 70 0% 1% 3% 5% 10% nồng độ muối C15.1 Đ41 Biểu đồ 3.4: Ảnh hưởng độ mặn khác nhau đến khả năng phân giải dầu của C15.1 và Đ41 Qua kết quả ở bảng 3.11 và biểu đồ 3.4. Độ mặn ảnh hưởng đến khả năng phân giải dầu của chủng nấm sợi RNM. Nhưng ở chủng C15.1 khả năng chịu mặn ở nồng độ cao hơn so với Đ41 (độ mặn 10% C15.1 phân giải gấp 13 lần so với Đ41). Cả hai chủng đều có khả năng phân giải dầu tốt ở nồng độ muối 3%, với tỉ lệ dầu phân giải ≈ 67%. Theo nghiên cứu của tác giả Mai Thị Hằng cùng cộng sự. Độ mặn thích hợp cho nấm sợi phân giải dầu tỉnh Nam Định và Thái Bình cao hơn (5%). Nồng độ muối này tương quan với độ mặn của RNM Cần Giờ (2.4%-3%) do tác giả Phan Nguyên Hồng khảo sát. Do thời gian chúng tôi thu mẫu vào mùa mưa. Hình 3.6: Khả năng phân giải dầu của chủng C15.1 ở độ mặn khác nhau Ngoài yếu tố độ mặn, pH môi trường cũng ảnh hưởng trực tiếp khả năng sinh trưởng và phân giải dầu của nấm sợi RNM. Tuỳ theo chủng loại chúng có pH thích hợp khác nhau. Vì vậy, chúng tôi tiếp tục tiến hành khảo sát ảnh hưởng pH đến chủng nấm sợi tuyển chọn từ RNM. 3.2.3. Ảnh hưởng của pH đến khả năng phân giải dầu của 2 chủng C15.1 và Đ41 Yếu tố pH cũng như độ ẩm, oxy và các chất dinh dưỡng khác đều rất cần cho quá trình nuôi cấy VSV. Các yếu tố này ảnh hưởng lớn đến quá trình phân giải dầu của nấm sợi tuyển chọn từ RNM nói riêng và các loại VSV nói chung. Các ion H+ và OH- là hai ion hoạt động lớn nhất trong các loại ion. Những biến đổi dù nhỏ trong nồng độ của chúng cũng có ảnh hưởng đến đời sống VSV [8]. Vì vậy, việc xác định pH thích hợp cho sự sinh trưởng của các chủng tuyển chọn là hết sức cần thiết. Chúng tôi tiến hành thí nghiệm nuôi cấy chủng nấm sợi tuyển chọn trong môi trường khoáng có dầu (MT3). Mỗi lô thí nghiệm có pH khác nhau (từ 4.0-9.0). Điều chỉnh pH bằng axit Clohidric 10% và NaOH 10% nuôi cấy tĩnh ở nhiệt độ phòng trong 15 ngày. Xác định lượng dầu bị phân giải bằng phương pháp 2.2.2.2. Kết quả thu được ở bảng 3.12. Bảng 3.12: Ảnh hưởng của pH đến khả năng phân giải dầu của C15.1 và Đ41 Khả năng phân giải dầu D.O (%) ở độ pH khác nhau Ký hiệu chủng nấm sợi 4 4.5 5 5.5 6 6.5 7 7.5 8 9 C15.1 1.26 4.53 40.71 62.28 66.74 52.22 43.77 24.15 12.11 8.16 Đ.41 2.1 6.82 44.32 61.04 66.32 50.17 40.12 21.13 10.45 6.34 Qua bảng 3.12 chúng tôi có nhận xét sau: - Nấm sợi RNM Cần Giờ phân giải dầu tốt nhất ở pH =5.5- 6, thấp hơn pH thích hợp cho vi khuẩn phân giải dầu ở nơi đó (nghiên cứu của tác giả Nguyễn Ngọc Hạnh- 2004). - Các chủng nấm sợi RNM tuyển chọn có thể sinh trưởng và phát triển trên môi trường có phổ pH tương đối rộng (4.0-8.0): pHopt=6,0; pHmin =4,0; pHmax=9,0. Đặc điểm này có ý nghĩa quan trọng, giúp chúng tồn tại và hoạt động được trong môi trường nhiều biến động của RNM. 0 10 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 7 0 8 0 4 4.5 5 5.5 6 6.5 7 7.5 8 9 nồng độ pH Tỉ lệ ( % ) d ầu b ị p hâ n gi ải Chủng C15.1 Chủng Đ41 Biểu đồ 3.5: Ảnh hưởng của độ pH lên sinh trưởng của C15.1 và Đ41 Hình 3.7: Khả năng phân giải dẩu trên môi trường có pH khác nhau của C15.1 và Đ41. Sự tăng trưởng của VSV bị giới hạn bởi một số yếu tố hoá lý của môi trường như nhiệt độ, năng lượng chiếu xạ, hoá chất…Dựa vào đó con người có thể kiểm soát được sự tăng trưởng của VSV không mong muốn. Nhiệt độ cao có thể làm biến tính enzym, mất nước và oxi hoá các thành phần của tế bào. Nhiệt độ thấp có thể ức chế sự tăng trưởng của chúng. Chúng tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự tăng trưởng của các chủng nấm sợi phân giải dầu tuyển chọn. 3.2.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ Chúng tôi xác định nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trưởng của nấm sợi RNM phân giải dầu trong điều kiện in vitro. Nhằm xác định môi trường tối ưu nuôi cấy nấm sợi, chúng tôi tiến hành thí nghiệm nuôi cấy các chủng nấm sợi trên MT2 với nhiệt độ: Lô đối chứng ở nhiệt độ phòng, lô thí nghiệm ở các nhiệt độ 20oC, 25oC, 30oC, 35oC, 40oC. Xác định mức độ sinh trưởng bằng cách đo đường kính khuẩn lạc ở các nhiệt độ khác nhau. Kết quả được trình bày ở bảng 3.13. Bảng 3.13: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự sinh trưởng của chủng C15.1 và Đ41 mức độ phát triển của nấm sợi (mm) Ký hiệu chủng Đ/C 20oC 25oC 30oC 35oC 40oC C15.1 1,4 0,2 0,8 1,5 1,2 0,0 Đ41 4,8 0,8 3,8 4,8 4,2 1,5 0 1 2 3 4 5 6 20 25 30 35 40 Nhiệt độ (độ C) Đư ờn g kí nh k hu ẩn lạ c (m m ) C15.1 Đ41 Biểu đồ 3.6: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sinh trưởng của C15.1 và Đ41 Kết quả ở bảng 3.13 và biểu đồ 3.6 cho thấy: - Chủng nấm sợi tuyển chọn (Đ41) có khả năng sinh trưởng trên biên độ nhiệt rộng từ 20- 40oC và sinh trưởng tốt nhất ở 30oC. Đối với chủng nấm (C15.1) thì không sinh trưởng được ở 40oC. - Theo nghiên cứu của tác giả Bùi Xuân Đồng (2004): Khả năng hấp thu hay thoát hơi nước của nấm sợi đều liên quan đến nhiệt độ môi trường, khoảng từ 15- 30oC. Nấm sợi có nhiệt độ tăng trưởng tối ưu trong khoảng 25- 30oC. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ, được trình bày ở bảng 3.12 của chúng tôi cho thấy: Chủng nấm (C15. và Đ41) cũng có đặc tính như vậy, chúng sinh trưởng tối ưu ở nhiệt độ 30oC. Sau khi nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố MT lên khả năng phân giải dầu, chúng tôi thấy nấm sợi RNM Cần Giờ có khả năng sinh trưởng và phân giải dầu tốt ở độ mặn 3%, pH=6, nhiệt độ 30oC và phân giải mạnh nguồn cacbuahydro ở dầu DO. Các kết quả trên cho thấy các chủng nấm sợi (C15.1 và Đ41) có tiềm năng ứng dụng để giải quyết ô nhiễm dầu. Vì vậy, để làm cơ sở cho việc sử dụng chúng trong thực tiễn. Chúng tôi tiến hành định loại đến loài hai chủng nấm sợi trên. 3.3. Xác định lượng dầu DO bị phân giải ở điều kiện môi trường tối ưu Trong tất cả các thí nghiệm trên có thể thấy trong điều kiện phòng thí nghiệm các chủng nấm sợi phân lập được có khả năng phân giải dầu DO. Vậy trong tự nhiên (đất và nước biển) chúng có khả năng này không? Ở môi trường nuôi cấy và môi trường có điều kiện tối ưu khả năng phân giải dầu có chênh lệch nhiều không? Vì vậy chúng tôi tiến hành thí nghiệm sau đây: Nuôi cấy nấm sợi C15.1, Đ41 trong bình tam giác 250 ml với 3 lô thí nghiệm, mỗi lô gồm 3 bình: - Lô 1: Bình tam giác có chứa 47,5 ml nước biển + 2,5 ml dầu DO. - Lô 2 (Đ/C): bình tam giác có chứa 47,5ml MT3 + 2,5ml dầu DO. - Lô 3: Bình tam giác có chứa 47,5ml MT3 với lượng NH4NO3 thích hợp, pH, độ mặn tối ưu. Sau 15 ngày nuôi cấy tĩnh, xác định khả năng phân giải dầu của nấm sợi trong các bình nuôi cấy theo phương pháp 2.2.2.2. Kết quả trình bày ở bảng 3.14. Bảng 3.14: Khả năng phân giải dầu của chủng nấm sợi trên môi trường tối ưu. Tỉ lệ dầu bị phân giải(%) STT Ký hiệu chủng MT tự nhiên MT tối ưu MT Đ/C 1 C15.1 8.49 82.6 65.7 2 Đ41 8.18 84.4 66.1 Qua kết quả bảng 3.14 chúng tôi thấy: - Trong môi trường tự nhiên các chủng nấm mốc được tuyển chọn cũng có khả năng phân giải dầu khi không được bổ sung thêm nguồn khoáng N, P. - Trong điều kiện tối ưu các yếu tố môi trường cho quá trình phân giải dầu của nấm sợi, tỉ lệ dầu phân giải cao (82,6-84,4%). - Lượng dầu phân giải của môi trường tối ưu so với đối chiếu tăng (15,9-18,3%). - Điều này cho thấy sự thích ứng của nguồn gen VSV trong RNM. Chúng có ý nghĩa rất cao khi ứng dụng việc sử dụng các chủng VSV trong phương pháp phân huỷ sinh học để làm sạch môi trường ô nhiễm dầu. Hình 3.8: Khả năng phân giải dầu chủng nấm Đ41 trên các môi trường khác nhau 3.4. Định danh chủng nấm sợi tuyển chọn đến loài Nhằm xác định vị trí của hai chủng nấm sợi tuyển chọn (C15.1 và Đ41) trong hệ thống phân loại. Chúng tôi tiến hành thí nghiệm: - Nuôi cấy chấm điểm chủng nấm sợi tuyển chọn trên các môi trường thạch khác nhau (MT1, MT4, MT5) theo phương pháp 2.2.1.3. Mô tả đặc điểm khuẩn lạc: Đường kính, hình dạng khuẩn lạc, giọt tiết, sắc tố hoà tan. - Nuôi cấy phòng ẩm chủng nấm trên môi trường phân loại Czapek. Quan sát dưới kính hiển vi điện tử, mô tả: Cuống sinh bào tử, bào tử, cuống thể bình , thể bình. Dựa vào tài liệu của Nguyễn Lân Dũng (2000), Đặng Hồng Miên (1999), Bùi Xuân Đồng (2004). - Chúng tôi gửi chủng nghiên cứu sang công ty cổ phần Giám định và khử trùng FCC, để định danh đến loài, theo phương pháp quan sát hình thái. Dựa vào các khoá phân loại: The Genus Aspergillus- Kenneth B-Raper; Manual of the Penicillia by Kenneth B-Raper and Charles Thom (1968). 3.4.1. Định danh chủng Đ41 Sau khi nuôi cấy chủng nấm sợi trên MT YEA, MEA, Czapek. Chúng tôi quan sát tốc độ phát triển và đặc điểm của khuẩn lạc mô tả ở bảng 3.15. Dựa trên cơ sở mô tả của công ty khử trùng FCC và đặc điểm vi thể nấm sợi của khoá phân loại của các tác giả trên . Chúng tôi định danh chủng Đ41 theo bảng 3.15 Bảng 3.15: Đặc điểm chủng nấm sợi kí hiệu Đ41 Các đặc điểm Chủng Đ41 Chủng Aspergillus Oryzae (Ahlb) cohn var effesuss MEA - Khuẩn lạc phát triển nhanh, sau 1 ngày có d=0.4cm. - MTKL: Mép bằng phẳng, có màu trắng ngà. Xung quanh có tia toả tròn. - MSKL: Không màu - Khuẩn lạc phát triển khá nhanh. - MTKL: Dạng bông, lúc đầu trắng, sau vàng nhạt. - MSKL: Không tiết sắc tố YEA - Khuẩn lạc mọc nhanh, sau 1 ngày có d=0.8cm. - MTKL: Mép bông, chia vòng. Vòng ngoài màu trắng đục,vòng giữa màu xanh vàng, vòng trong trắng. Xung quanh có tia toả tròn. - MSKL: màu hồng nhạt. - Khuẩn lạc phát triển khá nhanh. - MTKL: Dạng bông, lúc đầu trắng, sau vàng nhạt, có tia toả tròn. - MSKL: Tiết sắc tố màu hồng nhạt Đặ c điể m n uô i c ấy tr ên c ác m ôi tr ườ ng d in h dư ỡn g Czapek - Khuẩn lạc phát triển nhanh, sau 1 ngày có d=0.4cm. - MTKL: Mép bắng, bông xốp có màu trắng kem.Sau chuyển sang xanh lục, cuối cùng là màu xanh vàng. Xung quanh có tia toả tròn. - MSKL: Không màu - Khuẩn lạc phát triển nhanh. - MTKL: Lúc đầu trắng, sau xanh lục, cuối cùng xanh vàng - MSKL: Không màu Các đặc điểm Chủng Đ41 Chủng Aspergillus Oryzae (Ahlb) cohn var effesuss Đầu - Mọc từ môi trường. Hình dạng toả tròn từ phía trên,chuỗi phân kỳ giống dạng trụ ngắn. - Kích thước: (30-120) x (50x70)μm. - Mọc từ môi trường. Dạng toả tròn phía trên có chuỗi. - Kích thước: (150- 300) x (30- 80)μm. Cuống - Có màu nâu vàng, nhám. - Kích thước: (250-600) x (2.5- 8)μm - Có màu vàng hoặc nâu vàng - Kích thước: (200- 600) x (1.5- 10)μm. Bọng - Hình chuỳ khi non và hình cầu khi già. - Kích thước: (20-30)μm - Hình chuỳ hay hình cầu - Kích thước: (15- 40)μm Thể bình - Một tầng, hình chai. - Kích thước (7-15) x (2.5- 3)μm - Xếp thành tầng hay cụm. - Kích thước (12-15) x (3- 5)μm Đặ c điể m c ơ q ua n sin h sản v ô tín h BTT - Hình cầu, vách nhẵn. - Kích thước: (4-5)μm. - Xếp thành chuỗi dài hay hình tia toả tròn. - Kích thước: (4.5-7)μm. Qua các đặc điểm trên ta có thể kết luận vị trí phân loại của Đ41: Lớp (Class): Deuteromyces Bộ (Order): Moniliales Họ (Family): Moniliaceae Chi (Genus): Aspergillus Loài: Aspergillus oryzae (Ahlb). Cohn var. effusus Hình 3.9: Khuẩn lạc chủng Aspergillus oryzae (Ahlb).Cohn var. effusus trên MT khác nhau Hình 3.10a: Hình thái khuẩn lạc Hình3.10b: Hình thái BT và giá BTT chủng Đ41 chủng Đ41 3.4.2. Định danh chủng C15.1 Để định danh chủng C15.1, chúng tôi cũng tiến hành nuôi cấy chấm điểm chủng C15.1 trên các MT (YEA, MEA, Czapek) và mô tả đặc điểm sinh trưởng, hình thái khuẩn lạc của chúng. ở bảng 3.16 Bảng 3.16: Đặc điểm chủng nấm sợi ký hiệu C15.1 Các đặc điểm Chủng C15.1 Chủng penicillium citrinum Thom MEA - Khuẩn lạc phát triển chậm, sau 2 ngày có d= 0.4cm - MTKL: Mép viền trắng mịn, kế tiếp xanh nhạt, trong cùng có điểm lồi ở giữa. - MSKL: Không màu - Khuẩn lạc phát triển chậm - MTKL: Có màu xanh lục, mặt nhung, viền trắng, đôi khi ở giữa bông xốp nhẹ - MSKL: Không màu YEA - Khuẩn lạc phát triển chậm, sau 2 ngày có d= 0.8cm - MTKL: Mép viền trắng đục mịn, kế tiếp xanh nhạt, trong cùng xanh đậm, chia thuỳ, lồi ở giữa. - MSKL: Sắc tố màu vàng tươi - Khuẩn lạc phát triển chậm - MTKL: Có màu xanh lục, mặt nhung, viền trắng, có vòng đồng tâm. - MSKL: Màu vàng cam Đặ c điể m n uô i c ấy tr ên c ác m ôi tr ườ ng d in h dư ỡn g Czapek - Khuẩn lạc mọc rất chậm, sau 2 ngày có d=0.2cm. - MTKL: Mép ngoài trắng,→ xanh xám nhạt→tâm xanh xám đậm - MTKL: Màu vàng nâu. Có nhiều giọt tiết vàng nâu to - Khuẩn lạc phát triển rất chậm - MTKL: Viền trắng mịn, giữa xanh, tâm hơi lồi. - MSKL: Có màu vàng đậm. Đôi khi có giọt tiết vào môi trường Các đặc điểm Chủng C15.1 Chủng penicillium citrinum Thom Cuống sinh BT - Chổi 2 tầng không cân đối, hình dạng cột. - Kích thước chổi: (12-20)μm - Mọc từ môi trường, có 1, 2 tầng, dạng trụ - Kích thước: (8- 25)μm Thể bình - Có 4-5 thể bình/1 cuống nhỏ. Dạng hình chai - Kích thước: (7.5-9) x (2-2.5)μm -Có từ 2-5 thể bình/1 nhánh -Kích thước: (5-15) x (2-3)μm. Đặ c điể m c ơ q ua n si nh s ản v ô tín h BTT - Hình cầu, tạo thành chuỗi có gai. - Kích thước: (2.5-3)μm - Hình cầu, gần cầu hay elip. Có gai hoặc nhẵn, xếp thành dạng chuỗi dài. -Kích thước: (2.2-3.2)μm Qua bảng 3.16, có thể kết luận vị trí phân loại của chủng Đ41: Lớp (Class): Deuteromyces Bộ (Order): Moniliales Họ (Family): Moniliaceae Chi (Genus): penicillium Loài: Penicillium citrinum Thom. Hình 3.11: Khuẩn lạc trên môi trường khác nhau của chủng Penicillum citrinum Thom Hình 3.12a: Khuẩn lạc chủng C15.1 Hình 3.12b: Sợi nấm chủng C15.1 Để có cái nhìn cụ thể hơn về chủng nấm sợi tuyển chọn. Chúng tôi tiến hành khảo sát các đặc tính sinh học khác của chủng nấm sợi này. 3.5. Khảo sát các đặc tính sinh học khác 3.5.1. Nghiên cứu khả năng đồng hoá nguồn cacbon khác nhau. RNM là khu vực có nguồn cacbon rất đa dạng, chúng tồn tại trong xác thực vật lẫn động vật. Do vậy, nhằm khảo sát khả năng sử dụng các loại cacbon này của chủng nấm sợi RNM. Chúng tôi tiến hành thí nghiệm nuôi cấy chấm điểm các chủng tuyển chọn trên các môi trường nước biển (MT4), có nguồn cacbon khác nhau theo phương pháp 2.2.2.3. Để ở nhiệt độ phòng. Đánh giá mức độ phát triển bằng cách đo đường kính khuẩn lạc. Kết quả thu được ghi ở bảng 3.17 Bảng 3.17: Khả năng đồng hoá nguồn cácbon khác nhau của các chủng nấm sợi tuyển chọn Đường kính khuẩn lạc (cm) STT Ký hiệu chủng Glucoza Lactoza Maltoza Galactoza Sucroza 1 C15.1 18 17 15 6 12 2 Đ41 51 49 43 18 34 Kết quả thí nghiệm ở bảng 3.17 cho thấy: Các chủng nấm sợi sử dụng được hầu hết các nguồn cacbon nhưng ở mức độ khác nhau. Các chủng nấm sợi tuyển chọn sử dụng rất tốt nguồn cacbon trong glucoza, lactoza, maltoza, sucroza còn galactoza thì không thích hợp lắm cho sự phát triển của nhìn chung các chủng. Số liệu bảng 3.17 chứng tỏ nấm sợi ở RNM có các enzym phân giải tốt các polisacarit. Đây là nguồn cacbon tự nhiên rất phổ biến ở khu RNM. Đặc tính sử dụngtốt nguồn cacbon tự nhiên giúp nấm sợi tồn tại và thích nghi trong khu hệ sinh thái RNM. 3.5.2. Khảo sát hoạt tính enzym ngoại bào Nấm sợi và VSV khác tồn tại và phát triển trong RNM có khả năng sử dụng nhiều nguồn dinh dưỡng khác nhau nhờ hệ enzym ngoại bào phong phú: amylaza, proteaza, xenlulaza, kitinaza,…. . Để xác định khả năng sinh các enzym ngoại bào của 2 chủng nấm tuyển chọn. Chúng tôi tiến hành thử hoạt tính enzym phân giải sau: 3.5.2.1. Hoạt tính enzym amilaza Để xác định khả năng sinh enzym ngoại bào amilaza của 2 chủng nấm sợi tuyển chọn. Chúng tôi tiến hành thí nghiệm nuôi cấy chấm điểm trong MT4 (glucose thay bằng tinh bột). Sau 3 ngày, xác định khả năng sinh enzym bằng cách đo đường kính vòng phân giải theo phương pháp 2.2.2.4. Kết quả ở bảng 3.18. Bảng 3.18: Hoạt tính enzym amilaza của chủng nấm sợi tuyển chọn. STT Ký hiệu chủng Hoạt tính enzym (D-d) cm 1 C15.1 0.3 2 Đ41 1 Qua bảng 3.18 ta thấy: Khả năng sinh enzym ngoại bào amilaza của chủng nấm sợi tuyển chọn không cao. Tuy nhiên, chúng vẫn sinh trưởng được trên môi trường có nguồn cacbon là tinh bột. Chủng C15.1 khả năng sinh enzym amilaza (0.3cm) yếu hơn so với chủng Đ41 (1cm) .Vậy, chủng Đ41 ngoài hoạt tính phân giải dầu mạnh còn có khả năng sinh enzym amilaza với mức độ trung bình. 3.5.2.2. Hoạt tính enzym xenlulaza RNM là nơi có nguồn cacbon dồi dào từ lá, thân cây mục, đa số các vi sinh vật dinh dưỡng bằng cách phân huỷ chất hữu cơ chủ yếu từ nguồn này. Vì vậy, để xác định chủng nấm sợi phân giải dầu ở RNM có khả năng đồng hoá nguồn cacbon từ xenlulose hay không, chúng tôi cũng tiến hành nuôi cấy các chủng nấm trên trong MT4 ( glucose thay bằng CMC) ở điều kiện nhiệt độ phòng. Sau 3 ngày, xác định khả năng sinh enzym bằng cách đo vòng phân giải theo phương pháp 2.2.2.4. Kết quả được ghi nhận ở bảng 3.19. Bảng 3.19: Hoạt tính xenlulaza của chủng nấm sợi tuyển chọn Hoạt tính enzym (D- d) cm STT Ký hiệu chủng Môi trường thích ứng xenlulose Môi trường thích ứng dầu DO 1 C15.1 0,3 0,3 2 Đ41 0,6 0,4 Ghi chú: Kết quả hoạt độ enzym với môi trường thích ứng xenlulose từ nguồn luận văn của tác giả Khưu Phương Yến Anh, 2007 Qua kết bảng 3.19 ta thấy: Các chủng nấm sợi tuyển chọn khi được thích ứng trong 2 môi trường khác nhau khả năng sinh enzym xenlulaza cũng khác nhau. Các chủng nấm sợi tuyển chọn khi được thích ứng nguồn cacbon từ dầu DO, sinh enzym xenlulaza có hoạt tính yếu hơn được thích ứng xenlulose. Điều này có thể suy đoán: Chủng nấm sợi khi thử ở thời điểm, điều kiện thích ứng khác nhau, thì kết quả không trùng khớp nhau. So với kết quả thử hoạt tính xenlulaza của tác giả Khưu phương Yến Anh thì yếu hơn. Có thể, sau thời gian giữ giống hoạt tính enzym đã giảm xuống. Hình 3.13: Hoạt tính enzym amilaza và xenlulaza của chủng C15.1 và Đ41 3.5.2.3. Hoạt tính proteaza Ngoài 2 enzym, nấm sợi RNM còn sinh enzym proteaza. Để xác định hoạt tính enzym này chúng tôi tiến hành thí nghiệm nuôi cấy chấm điểm trong môi trường MT4(thay glucose bằng casein). Nuôi cấy ở nhiệt độ phòng. Sau 3 ngày, xác định khả năng sinh hoạt tính enzym proteaza bằng cách đo vòng phân giải theo phương pháp 2.2.2.4. Kết quả ghi nhận ở bảng 3.20. Bảng 3.20: Hoạt tính enzym proteaza của chủng nấm sợi tuyển chọn. STT Chủng nấm Hoạt tính enzym (D- d) cm 1 C15.1 0,8 2 Đ41 0,7 Qua bảng 3.20 ta thấy, các chủng nấm sợi tuyển chọn sinh hoạt tính enzym ngoại bào proteaza rất yếu. Dù vậy, chủng vẫn phát triển được trên môi trường này. Hình 3.14 : Hoạt tính enzym proteaza của chủng C15.1 và Đ41 3.5.2.4. Hoạt tính kitinaza RNM là nơi tập trung nhiều nguồn cacbon đa dạng, phong phú. Một lượng cacbon không nhỏ từ xác côn trùng, vỏ các loài giáp xác trôi dạt do thuỷ triều. Vì vậy, một số các VSV sống hoại sinh có khả năng sinh enzym đồng hoá được nguồn cacbon này, trong đó có nấm sợi. Chúng tôi tiến hành thí nghiệm thử hoạt tính enzym kitinaza của chủng nấm sợi tuyển chọn bằng phương pháp cấy chấm điểm trên MT4 (glucose thay bằng kitin). Sau 3 ngày, xác định bằng cách đo vòng phân giải theo phương pháp 2.2.2.4. Kết quả ghi nhận được ở bảng 3.21. Bảng 3.21: Hoạt tính kitinaza của chủng nấm sợi tuyển chọn STT Chủng nấm Hoạt tính enzym (D- d) cm 1 C15.1 0,6 2 Đ41 0,8 Qua bảng 3.21 ta thấy: Các chủng nấm sợi tuyển chọn cũng có khả năng sinh enzym kitinaza phân hủy kitin. Khả năng sinh enzym kitinaza của các chủng tuyển chọn thấp hơn so với các chủng nấm sợi RNM Nam Định, Thái Bình do tác giả Nguyễn Vĩnh Hà nghiên cứu (2002). Tuy nhiên, các chủng này vẫn sinh trưởng được trên môi trường có nguồn cacbon là kitin. Đ41 Hình 3.15: Hoạt tính kitinaza chủng Đ41 3.4.2.5. Khả năng sinh kháng sinh của chủng nấm tuyển chọn Đối kháng là một trong những đặc tính sinh học của VSV trong đó có nấm sợi của nấm sợi. Ngày nay, các nhà khoa học muốn tìm kháng sinh mới chống nhờn thuốc. Vì vậy, để khảo sát xem 2 chủng nấm sợi phân giải dầu tuyển chọn có tính đối kháng không, chúng tôi tiến hành thí nghiệm với chủng VSV kiểm định là B. subtilis và E. coli theo phương pháp 2.2.2.4. Đánh giá hoạt tính đối kháng bằng cách đo đường kính vòng vô khuẩn. Kết quả thu được như sau: Chủng Đ41 không kháng được B.subtilis, còn chủng C15.1 kháng được B. subtilis. Nhưng cả hai không kháng được E.coli. Song song với công trình nghiên cứu của chúng tôi. Một tác giả cũng khảo sát về đặc tính này của các chủng nấm sợi phân lập từ RNM Cần Giờ. Từ kết quả nghiên cứu của tác giả Phan Thanh Phương cũng có kết quả tương tự: Chủng C15.1 và Đ41 có phổ kháng khuẩn hẹp chỉ ức chế 1 trong 2 loại VKGram dương hoặc Gram âm Để tổng quan hơn về đặc tính sinh học của chủng Đ41 và C15. Chúng tôi thiết lập biểu đồ 3.7 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 amilaza xenlulaza proteaza kitinaza B.subtilis E.coli Các đặc tính sinh học nấm sợi C15.1 Đ41 Biểu đồ 3.7: Khảo sát các đặc tính sinh học nấm sợi Qua kết quả khảo sát biểu đồ 3.7 về các đặc tính sinh enzym ngoại bào và khả năng sinh kháng sinh của chủng nấm sợi phân giải dầu tuyển chọn. Chúng tôi thấy, ngoài khả năng sinh enzym có hoạt tính phân giải dầu chủng nấm sợi tuyển chọn cũng sinh các enzym có khả năng phân giải các nguồn cacbon khác nhau, với hệ enzym phong phú này giúp các chủng nấm sợi dễ tồn tại trong môi trường tự nhiên nhiều biến động như RNM. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ  Kết luận. 1. Đã phân lập các chủng nấm sợi từ RNM Cần Giờ TP. Hồ Chí Minh. Sau khi thu mẫu, chúng tôi đã phân lập được 312 chủng nấm sợi từ RNM Cần Giờ TP. Hồ Chí Minh. Trong đó: + Từ đất có 114 chủng (93 chủng bề mặt, 21 chủng sâu 5- 10cm) + Từ lá có 96 chủng (lá vàng 34, lá phân huỷ 62). + Từ thân có 102 chủng (Thân tươi 35, thân khô- mục: 67) 2. Đã tuyển chọn các chủng phân giải dầu DO mạnh + Từ 312 chủng nấm sợi phân lập từ RNM Cần Giờ, chúng tôi đã chọn lọc được 83/312 chủng (26,6% tổng số chủng nấm sợi) có khả năng phân giải dầu DO in vitro ở mức độ khác nhau. Trong đó, 14 chủng nấm sợi (chiếm 16,86%) có khả năng phân giải mạnh, 12 chủng phân giải mức trung bình (chiếm 14,45%), còn lại là yếu. + Tuyển chọn 4 chủng có tỉ lệ phân giải dầu cao 63-67%. + Đã chọn nguồn hydrocacbon phù hợp trong dầu DO để tiến hành thí nghiệm. + Đã chọn thời gian nuôi cấy thích hợp để xác định lượng dầu bị phân giải là 15ngày. + Đã chọn 2 chủng C15.1 và Đ41 phân giải dầu mạnh nhất để khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khă năng phân giải của chúng. 3. Đã xác định được các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng phân giải dầu của2 chủng nấm sợi .  Ảnh hưởng nguồn N: Nguồn N từ NH4NO3 với nồng độ 0,1% là tốt nhất cho sự phân giải dầu của 2 chủng C15.1 (68.28%) và Đ41 (67,57%).  Ảnh hưởng độ mặn: Nồng độ muối tốt nhất cho phân giải dầu của cả 2 chủng C15.1 và Đ41 là 3%.  Ảnh hưởng pH: Độ pH= 5.5-6 là tối ưu cho nấm sợi phân giải dầu. Trong đó, pH tối ưu của chủng C15.1 pH= 5,5-6,5 và chủng Đ41 pH= 5,6-6.  Ảnh hưởng của nhiệt độ: Nấm sợi phân giải dầu sinh trưởng tốt nhất ở nhiệt độ 30- 35oC. Nhưng chủng C15.1 có phổ hẹp hơn 20- 35oC so với Đ41 từ 20- 40oC. 4 .Xác định lượng dầu phân giải trên môi trường tối ưu Ở môi trường tối ưu về nồng độ N, nguồn N thích hợp là NH4NO3, độ mặn phù hợp và pHopt=6. Chủng nấm C15.1 và Đ41 phân giải lượng dầu DO đạt 82-84,4%. 5. Đã xác định 2 chủng nấm sợi tuyển chọn đến loài Để xác định đến loài, chúng tôi nhờ công ty cổ phần Giám định và khử trùng FCC định danh đến loài, 2 chủng có khả năng phân giải dầu mạnh C15.1 và Đ41 theo phương pháp hình thái. Kết quả: + Chủng 1 ký hiệu C15.1 là Penicillium citrinum Thom. + Chủng 2 ký hiệu Đ41 là Aspergillus oryzae (Ahlb).Cohn var. effusus. 6. Đã xác định một số đặc điểm sinh học của chủng nấm C15.1 và Đ41. - Cả hai chủng đều sử dụng rất tốt nguồn cacbon là: Glucose, lactose, maltoseínucrose và chúng sử dụng yếu galactose. - Cả hai chủng C15.1 và Đ41 đều có khả năng sinh enzym thuỷ phân amilaza nhưng Chủng C15.1 ở mức yếu hơn (0,3cm) Chủng Đ41 (1cm). Đối với enzym proteaza 2 chủng nấm tuyển chọn đều có hoạt tính yếu (0,8cm, 0,7cm). Đồng thời khả năng sinh enzym kitinaza và xenlulaza của 2 chủng này cũng ở mức yếu (kitinaza=0,6-0,8cm, xenlulaza=0,3-0,4cm). Chủng C15.1 có khả năng đối kháng với B.subtilis,còn chủng Đ41 không kháng được VSV này, nhưng cả hai đều không kháng được E.coli  Đề nghị Để có đầy đủ cơ sở cho việc sử dụng 2 chủng nấm sợi tuyển chọn trong thực tiễn, chúng tôi đề nghị: + Chủng C15.1 và Đ41 là hai chủng nấm sợi được xác định có khả năng phân giải cacbuahydro trong dầu DO mạnh. Chúng tôi hy vọng các nghiên cứu sau sẽ tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về, khả năng phân giải các nguồn cacbuahydro trong môi trường tự nhiên chứa các sản phẩm khác của dầu mỏ như dầu FO, dầu thô và các nguồn độc tố khác… + Nghiên cứu sâu hơn về ảnh hưởng của nguồn P, O, các nguồn N khác đối với các chủng phân giải dầu tuyển chọn trong đề tài. + Thử khả năng đối kháng của 2 chủng Penicillium citrinum Thom và Aspergillus oryzae (Ahlb).Cohn var. effusus.trên các đối tượng VSV gây bệnh khác. Vấn đề ô nhiễm môi trường do tai nạn tràn dầu, rửa tàu.. là vấn đề thời sự mà nhiều nhà nghiên cứu môi trường đang quan tâm. Việc tìm ra các chủng nấm sợi phân giải dầu góp phần làm phong phú thêm nhóm VSV phân giải dầu trong phương pháp phân huỷ sinh học xử lí môi trường ô nhiễm dầu ngày nay. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt 1. Tô Kim Anh, Trần Thị Linh (2003), Khả năng phân giải hiếu khí phenol của tập hợp VSV làm giàu từ bùn thải nhiễm xăng dầu, Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, Hà Nội. tr 167- 171. 2. Kiều Hữu Ảnh (1987), Vi sinh Vật công nghiệp, Nxb Khoa học- Kĩ thuật, Hà Nội 3. Nguyễn Ngọc Ân, Nguyễn Đình Cương, Nguyễn Đình Quý (1998), Hệ sinh thái rừng ngập mặn Cần Giờ và biện pháp quản lí, phát triển, Nxb Nông nghiệp, tp. HCM. 4. Lê Huy Bá (2000), Sinh thái môi trường đất, Nxb Đại học Quốc gia, tp. HCM. 5. Phan Tử Bằng (2002), Công nghệ chế biến dầu và khí, Nxb Xây dựng, Hà Nội. 6. Nguyễn Lân Dũng (1972), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, Nxb Khoa học-Kĩ thuật, Hà Nội. 7. Nguyễn Lân Dũng và cộng sự (1993), Vi sinh vật tập 1, Nxb Đại học và Trung học chuyên nghiệp, Hà Nội. 8. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty, 1998, Vi sinh vật học, Nxb Giáo Dục. Tr 3-40,407 9. Nguyễn Lân Dũng (1983), Thực tập vi sinh vật học, Nxb Đại học và Trung học chuyên nghiệp, Hà Nội. 10. 10-Nguyễn Lân Dũng, Bùi Xuân Đồng, Lê Đình Lương (1982), Vi nấm, Nxb Khoa học- Kĩ thuật, Hà Nội. 11. Nguyễn Thành Đạt (2004) Cơ sở sinh học vi sinh vật, Nxb Đại học Sư phạm, Hà Nội. 12. Bùi Xuân Đồng và Hà Huy Kế (1999), Nấm mốc và phương pháp phòng chống, Nxb Khoa học- Kĩ thuật, Hà Nội. 13. Bùi Xuân Đồng (1978), Nấm mốc bạn và thù, Nxb Khoa học- Kĩ thuật, Hà Nội. 14. Bùi Xuân Đồng (1986) Nhóm nấm Hyphomycetes ở Việt Nam tập 1,2, Nxb Khoa học- Kĩ thuật, Hà Nội. 15. Bùi Xuân Đồng, Nguyễn Huy Văn (2000), Vi nấm dùng trong công nghệ sinh học, Nxb Khoa học – Kĩ thuật, Hà Nội. 16. Bùi Xuân Đồng (2003), Nguyên lí phòng chống mốc và mycotoxin, Nxb Khoa học- Kĩ thuật, Hà Nội. 17. Đặng Thị Cẩm Hà, Đinh Thuý Hằng, Lưu Bích Thảo(1997), Nghiên cứu nấm sợi sử dụng dầu thô và các sản phẩm của dầu phân lập từ những vùng ô nhiễm dầu Cát Lái và Cần Giờ, Tạp chí Khoa học Công nghệ 18. Đặng Thị Cẩm Hà, Nguyễn Quốc Việt, Nguyễn Bá Hữu, Mai Anh Tuấn, La Thị Thanh Phương, Hoàng Mĩ Hạnh, Nguyễn Thị Đệ (2003), Nghiên cứu xử lí làm sạch cặn dầu thô bằng phương pháp phân huỷ sinh học, Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc Hà Nội. tr 70-73. 19. Nguyễn Vĩnh Hà (2002), Khảo sát hoạt tính đối kháng của các chủng nấm sợi phân lập từ RNM khu vực Giao Thuỷ, Nam Định và Thái Thụy, thái Bình, luận vănTthạc sĩ khoa học Sinh học, trường ĐHSP Hà Nội. 20. Vũ Ngọc Hạnh (2004), Nghiên cứu khả năng phân giải dầu diesel (DO) của các chủng vi khuẩn phân lập từ một số mẫu đất thân, lá cây rừng RNM huyện Cần Giờ- TP. HCM, luận văn tốt nghiệp, trường Đại học Sư phạm Hà Nội. 21. Mai Thị Hằng (2001), Kết quả nghiên cứu về tính đa dạng và vai trò của nhóm nấm sợi phân lập từ một số RNM ở hai tỉnh Nam Định và Thái Bình, tổ CNSH- vi sinh, Đại học Sư phạm Hà Nội. Tr 135- 153. 22. Mai Thị Hằng, Nguyễn văn Diễn (2005), Bước đầu tìm hiểu thành phần loài nấm túi (Ascomycetes) hoại sinh trên các phần chết của cây dừa nước (Nypa fruiticán Wurmb) ở RNM Cần Giờ, Việt Nam, Tạp chí Sinh học, 27 (2), tr 49-56. 23. Mai Thị Hằng, Phan Thị Trang (1999), Khả năng phân giải hidrocacbon của một số chủng nấm trong RNM, báo cáo khoa học tổ CNSH- Vi sinh, Đại học Sư phạm, Hà Nội. 24. Lại Thuý Hiền, Đặng Thị Cẩm Hà, Lý Kim Bảng (1990), Khu hệ VSV trong các giếng khoan dầu khí Thái Bình, tạp chí sinh học, 12 (3), tr 1-6. 25. Phan Thị Phương Hoa, Mai Thị Hằng, Trần Thị Thuý, Phạm Thị Trang, (2001). Nghiên cứu một số hoạt tính enzym thuỷ phân ngoại bào của các chủng nấm sợi phân lập từ RNM Giao Thuỷ, Nam Định, Việt Nam. Báo cáo tại hội thảo khoa học đề án EP- DRC/MERD TP Nam Định tháng 12- 2001,Tr 82-88. 26. Nguyễn Bá Hữu, Vũ Thị Hồng Nga, Đặng Thị Cẩm Hà (2003), khả năng sử dụng hydrocacbon dầu mỏ của 3 chủng vi khuẩn phân lập từ cặn thải xăng dầu ở Việt Nam, Tạp chí Sinh học, 25(4), 62-68. 27. Nguyễn Đức Lượng (2003), Thí nghiệm vi sinh vật, Nxb Đại học Bách khoa, tp. HCM. 28. Nguyễn Đức Lượng (2004), Công nghệ vi sinh vật tập 1, Nxb Đại học Quốc gia, tp. HCM. 29. Đặng Vũ Hồng Miên (1998 ) Bảng phân loại một số nấm mốc thường gặp, Nxb Khoa học và Kĩ thuật, Hà nội. 30. Lương Đức Phẩm (2004), công nghệ vi sinh vật, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội. tr159- 161 31. Trần Thị Thanh (2000), Công nghệ vi sinh, Nxb Giáo dục, tp.HCM. 32. Nguyễn Xuân Thành và cộng sự (2005), Giáo trình vi sinh vật học công nghiệp, Nxb Giáo dục, tp. HCM. 33. Trần Thanh Thuỷ (1999), Thực hành vi sinh vật, Nxb Giáo dục, tp. HCM. 34. Trần Linh Thước (1999-2000), Thực hành vi sinh vật năm IV, Nxb Đại học Khoa học Tự Nhiên, tp. HCM. 35. Trần Cẩm Vân (2001), Giáo trình vi sinh vật học môi trường đất, Nxb Đại học Quốc gia, Hà Nội. Tiếng Anh 36. Atlas M Ronald, 1981, “Microbial degradation of petroleum hydrocacbons: An enviroment perspective”, Microbiology review, tr 108- 209. 37. A.D. Agate C.V. Subramania M. Vannucci (1988). Mangrove microbiology, UNDP/UNESCO Regional Projec RAS/86/1988. 38. Booth C. (1971), “the genus Fusarium” CMI kew, survey, England. 39. Collin Ratledge, 1989, Biochemistry of Microbiology. P1-25 40. Robert A.Samson, Ellen S. Hoekstra, Jens C. Frisvad (2004), Introduction to food and airborne fungi, centraalbureau voor Schimmelcultures, P.O.Box 85167, 3508 AD UTRECHT, the Netherland. 41. Miguel Ulloa and Richard T. Hanlin (2000), Illustrate Dictionary of MYCOLOGY, APS PRESS the American Phytopathological Society St. Paul, Minnesota. 42. NTC publishing Group (2000), enzyme technology, McGraw- Hill companies, USA. Trang web 43. gov.vn/hn/database/an pham dientu. 44. 45. 46. http:// www.hochiminhcity.gov.vn/home/left/tintuc/thoisu/2003. 47. http:// www.vietciences. Free. 48. http:// www.nea.gov.vn/htm/o nhiem/kiem soat html. 49. http:// www.geocities.com/Capnavaral/lab/2094/table.html Bioremediation methods for oil. 50. http:// www.geocities.com/Rainforest/Vines/4301. 51. http:// www.va21. org/uutien/14bien/14_ onhiembien. Htm 52. PHỤ LỤC Phụ lục 1: Khuẩn lạc của một số chủng nấm sợi phân lập từ đất RNM Cần Giờ TP. Hồ Chí Minh Đ41 Đ7a Đ’8b Đ4a Đ1 Đ5a Đ18 Đ’8 Đ1a Đ30 Đ6 Đ33 1 Phụ lục 2: Khuẩn lạc của một số chủng nấm sợi phân lập từ lá, thân RNM Cần Giờ Phụ lục 3: Mẫu một số chủng phân giải dầu sau 15 ngày nuôi cấy L3.2a Đ5a Đ16b Đ33.1 Đ7a Đ’9b Đ2b L15.5 C’18.1C4.1 Đ’8.1 Đ41 Đ/C Đ4a Đ3O L35 Phụ lục 4: Mẫu một số chủng phân giải dầu sau 15 ngày nuôi cấy L6.3 L24 L19 C18 Đ18a T8 TC2 C15.1 L1.8 L21.1 L3.2b Đ9.4 Phụ lục 5: Các lô thí nghiệm phân giải dầu của 14 chủng nấm sợi tuyển chọn Khối lượng dầu bị phân giải trong lô thí nghiệm (g) STT Tên chủng TN1 TN2 TN3 TN4 Khối lượng dầu bị phân giải (∆m)g Tỷ lệ (%) 1 C15.1 1,2856 1,2738 1,2928 1,2801 1,2831  0,007 67,09 2 Đ41 1,2804 1,2852 1,2863 1,2750 1,2817 0,005 67,02 3 L6.3 1,2635 1,2521 1,2438 1,2594 1,2547  0,007 65,60 4 Đ’9b 1,2235 1,2220 1,2252 1,2197 1,2226  0,002 63,93 5 Đ4a 1,2098 1,2041 1,2146 1,2252 1,2129  0,007 63,42 6 L3.2a 1,1856 1,1960 1,940 1,1847 1,191  0,006 62,27 7 Đ5a 1,1894 1,1783 1,1802 1,1866 1,1838  0,007 61,90 8 L35 1,1802 1,1806 1,1843 1,1859 1,1818  0,003 61,79 9 C’18.1 1,1894 1,1758 1,1856 1,1753 1,1815  0,006 61,78 10 L19 1,1653 1,1468 1,1547 1,1649 1,1579  0,008 60,54 11 C18 1,1596 1,1538 1,1503 1,1517 1,1538  0,004 60,33 12 Đ1a 1,1301 1,1338 1,1220 1,1367 1,1306  0,005 59,11 13 Đ7a 1,1038 1,0912 1,1138 1,0955 1,1011  0,008 57,57 14 Đ30 1,0847 1,0749 1,0893 1,0831 1,0830  0,005 56,63 15 Đ/C 1,9062 1,9181 1,9157 1,9094 1,9124 0,005 0