Luận văn Nghiên cứu khả năng sinh enzym cellulase của một số chủng nấm sợi phân lập từ rừng ngập mặn Cần Giờ

c định ảnh hưởng của độ mặn đến quá trình sinh tổng hợp enzym cellulase, ta cũng nuôi trên MT 11 với các nồng độ muối khác nhau 0%, 3%, 5%, 10%, 20%.  Ảnh hưởng nhiệt độ Để xác định ảnh hưởng của nhiệt độ ta cũng nuôi trên MT 11 và ủ ở các nhiệt độ khác nhau 250C, 300C, 400C, 500C.  Ảnh hưởng thời gian Để xác định ảnh hưởng thời gian ta cũng nuôi trên MT 11 ở các thời gian khác nhau 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ, 60 giờ, 72 giờ. Sau khi nuôi ủ, ly trích enzym cellulase theo phương pháp 2.2.2.6 và đánh giá khả năng sinh enzym cellulase theo phương pháp 2.2.3.1. 2.2.4. Phương pháp thực nghiệm 2.2.4.1. Phương pháp xác định khả năng đường hóa giấy in, giấy báo cũ đã qua sử dụng của enzym cellulase [40] Giấy in đã qua sử dụng được xay vụn bằng máy xay sinh tố, cho khoảng 0,6g lượng giấy vào ống nghiệm có chứa dịch 6ml enzym cellulase thu được. Cho phản ứng ở 500C, pH 4,8 trong 24 giờ. Định lượng đường khử bằng thuốc thử DNS dựa vào đường chuẩn theo phương pháp 2.2.3.1. Khả năng đường hoá giấy loại của enzym được tính như sau: Hiệu suất (%) = lượng đường khử (g) x 0,9 x (100/lượng giấy (g)) 2.2.4.2. Phương pháp đánh giá độ chín của phân ủ (Subrao- indian, 1980) [48] a. Nguyên tắc Dựa trên khả năng phân giải cellulose có trong rơm rạ của dịch enzym cellulase thô tạo thành mùn. b. Cách tiến hành Mẫu thí nghiệm (TN): Tiến hành ủ đống rơm rạ bằng phương pháp ủ quy mô nhỏ: - Ủ trong hộp xốp nhỏ. - Rơm rạ lấy từ ruộng lúa mới thu hoạch. - Bổ sung thêm: 0,5% NH4NO3, 0.5% ure và 5% dịch chiết enzym cellulase thô đã nuôi từ nấm sợi trên MT xốp cơ sở (MT11) trong 4 ngày. - Điều chỉnh độ ẩm về 60- 65%, pH 6-7. - Ủ 1 tháng ở nhiệt độ 300C. Mẫu đối chứng (ĐC): Ủ rơm rạ ở điều kiện tự nhiên không bổ sung thêm dịch nuôi cấy. Sau 1 tháng tiến hành so sánh lô ĐC với lô thí nghiệm (TN) ở các chỉ tiêu: - Nhiệt độ đống ủ trong tuần đầu. - Nhiệt độ đống ủ trong tuần cuối. - Nước chảy ra. - Độ giảm chiều cao của đống ủ. - Màu sắc của rơm rạ. - Độ dai của rơm. Sau đó, đánh giá độ chín của phân ủ còn gọi là độ “hoai” của phân ủ bằng phương pháp thử nghiệm đối với cây trồng. Gieo hạt đậu xanh trên khay chứa lượng phân sau khi đã ủ 1 tháng. Sau 7 ngày thu hoạch kiểm tra trọng lượng tươi, tỉ lệ hạt nảy mầm của cây đậu. Mức độ chín của phân ủ được đánh giá thông qua tỷ lệ nảy mầm, trọng lượng tươi trên mỗi khay. Nếu tỉ lệ nảy mầm trên 60% / 5g hạt đậu xanh/ khay và trọng lượng từ 60-100 g/ 5g hạt đậu xanh/ khay thì phân ủ đã “chín”. Chương 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 3.1. Phân lập, tuyển chọn các chủng nấm sợi có khả năng sinh enzym cellulase từ RNM Cần Giờ 3.1.1. Phân lập các chủng nấm sợi từ RNM Cần Giờ Qua 3 tháng tiến hành lấy mẫu theo phương pháp ở phần 2.2.2.1 từ đất mặt, đất sâu 5-10cm, lá vàng còn trên cây, lá mục, thân, cành khô, mục, chúng tôi đã phân lập được 312 chủng nấm sợi khác nhau như bảng 3.1. Bảng 3.1. Sự phân bố các chủng nấm sợi Cơ chất phân lập Số lượng chủng nấm sợi Tỷ lệ % Đầt: - Đất mặt - Đất sâu 5-10 cm 114 93 21 36,5% 29,8% 6,7% Lá: - Lá vàng - Lá mục 96 34 62 30,8% 10,9% 19,9% Thân: - Thân khô - Thân mục 102 39 63 32,7% 12,5% 20,2% (Ghi chú: Kết quả bảng 3.1 được tổng hợp từ phụ lục 13) Từ kết quả ở bảng 3.1 cho thấy ở RNM Cần Giờ hệ nấm sợi vô cùng phong phú. Chúng phân bố rộng rãi trên tất cả các cơ chất như trên lá, thân, cành cây, trên mặt đất và cả trong đất sâu 5-10cm. Trong đó, các chủng nấm sợi có trong MT đất là nhiều nhất (114/312 chủng) chiếm 36,5% tổng số nấm sợi phân lập được. Số chủng nấm sợi sống trên lớp đất mặt nhiều hơn lớp đất sâu. Điều này có thể giải thích do nấm sợi là VSV hiếu khí, do đó lớp đất mặt là nơi có nguồn O2 và nguồn thức ăn là xác lá, thân, cành, động vật, vỏ xác tôm cua, giáp xác…đang bị phân hủy. Đồng thời, với điều kiện thủy triều lên xuống hàng ngày nên lớp đất mặt luôn giữ được độ ẩm thích hợp cho các chủng nấm sợi sinh trưởng phát triển. Số chủng nấm sợi trên cơ chất lá (30,8%), trên thân cành (32,7%) ít hơn trong đất. Do RNM Cần Giờ là nơi có thảm thực vật rất dày đặc, thức ăn chủ yếu là hợp chất hữu cơ giàu cellulose, không đủ các nguồn dinh dưỡng như trong đất. Đồng thời, nước mưa sẽ làm rửa trôi lượng lớn bào tử nấm sợi. Đặc biệt, trên cơ chất lá mục và thân cành mục số lượng nấm sợi nhiều hơn. Vì đây là những nguồn hữu cơ đang bị phân hủy, một phần đã phân giải thành glucose là nguồn cacbon mà nấm dễ hấp thụ nhất [29]. Như vậy, MT sống ở RNM Cần Giờ mặc dù rất khắc nghiệt nhưng có đầy đủ các yếu tố cần thiết cho nấm sợi sinh trưởng và phát triển. Chúng sử dụng các chất hữu cơ sẳn có để tồn tại, đồng thời tham gia phân hủy các chất thải, giúp giảm bớt ô nhiễm MT ở RNM Cần Giờ. Từ các chủng thuần khiết phân lập được nói trên, chúng tôi tiến hành tuyển chọn các chủng nấm dựa trên khả năng sinh enzym cellulase của chúng. 3.1.2. Tuyển chọn những chủng nấm sợi có khả năng sinh enzym cellulase  Tuyển chọn lần 1 Kiểm tra khả năng sinh enzym cellulase của 312 chủng nấm sợi theo phương pháp 2.2.3.2. Kết quả trình bày ở bảng 3.2. Phân tích số liệu từ bảng 3.2 cho thấy: - Tổng số chủng có enzym : 183/312 chủng chiếm 58,65% + Chủng sinh enzym mạnh : 10/183 chủng chiếm 5,5% + Chủng sinh enzym khá mạnh : 6/183 chủng chiếm 3,3% + Chủng sinh enzym trung bình: 20/183 chủng chiếm 11%. + Chủng sinh enzym yếu : 147/183 chủng chiếm 80,2%. Trong đó: - Số chủng trên lá là 69/183 chiếm 37%. - Số chủng trên thân là 50/183 chiếm 27%. - Số chủng trên đất là 63/183 chiếm 34%. Bảng 3.2. Khả năng sinh enzym celllase của 312 chủng nấm sợi phân lập STT Kí hiệu chủng D-d (mm) STT Kí hiệu chủng D-d (mm) STT Kí hiệu chủng D-d (mm) 1 Đ1 2,0 62 Đ’3 27,5 123 L13.2 18,0 2 Đ2 4,5 63 Đ24 24,5 124 L1.5 12,0 3 Đ3 15,5 64 L2 10,5 125 L14.5 14,5 4 Đ4 6,5 65 L3 4,5 126 L21.1 3,5 5 Đ20a 23,5 66 L4 3,5 127 L33a 4,5 6 Đ8 5,5 67 L5 7,5 128 L36a 6,0 7 Đk 25,5 68 L6 5 129 L5.3 16 8 Đ11 5,5 69 L7 4,5 130 L41.8 13 9 Đ12 8 70 L8 7,5 131 L41.1 21 10 Đ14 6,5 71 L9 24,5 132 L28.1 17 11 Đ15 5 72 L11 5 133 T4 9 12 Đ18 3 73 L12 6,5 134 T3 1 13 Đ19 5 74 L13 15 135 T2 4 14 Đ20 4,5 75 L14 10 136 T1.4 26,5 15 Đ21 2,5 76 L15 1,5 137 C1.3 3,5 16 Đ23 4 77 L16 8,5 138 C6 4,5 17 Đ25 8 78 L18 2,5 139 C3.3 9,5 18 Đ27 4 79 L19 12,5 140 C3.4 10,5 19 Đ28 5 80 L20 8 141 C1.2 5,5 20 Đ29 14 81 L21 12,5 142 C4.1 3 21 Đ30 7,5 82 L22 6 143 C2 12 22 ĐB1 12,5 83 L23 1,5 144 (T) 24,5 23 Đ’0 29 84 L24 2 145 T4.5 10,5 24 ĐB2 6 85 L25 16 146 T4.4 24,5 25 ĐB3 2,5 86 L26 13 147 C5 4,5 26 ĐB4 2,5 87 L27 7,5 148 C8 8 27 ĐB5 6,5 88 L28 8 149 C8a 25,5 STT Kí hiệu chủng D-d (mm) STT Kí hiệu chủng D-d (mm) STT Kí hiệu chủng D-d (mm) 28 ĐB6 8,5 89 L29 5,5 150 C6 10,5 29 ĐB7 16,5 90 L30 8 151 C3.4 7 30 Đ’1 18,5 91 L31 10 152 CT 5,5 31 Đ’2 5 92 L32 14,5 153 T11.6 13 32 Đ’2.1 13 93 L33 1,5 154 C16.2 8 33 Đ’9 2 94 L34 13 155 C15.1 12 34 Đ’9.1 10 95 L1.3 24,5 156 C16.1 21 35 Đ’9.2 6 96 L38 2 157 C18 6,5 36 Đcc 4 97 L39 12,5 158 C34 4,5 37 Đ’1.1 6,5 98 L42 13 159 C11.3 7 38 Đ’1.2 4,5 99 L22.1 5 160 C17 11 39 ĐTH 4 100 L15.1 14,5 161 C18.3 19 40 ĐB 3 101 L5.1 17 162 T5a 8,5 41 Đ34 5,5 102 L1.4 14,5 163 C13.1 6,5 42 Đ34.1 1,5 103 L4.1 12 163 C16.2 4 43 Đ30.1 5,5 104 L1.2 5 165 C12 2,5 44 Đ33a 3 105 L3.5 17 166 T1.3 17,5 45 ĐTH0 17 106 L’12 14 167 C7 13,5 46 Đ’10 8,5 107 L22.2 3 168 C2.2 4,5 47 Đ31 4 108 L6.4 14,5 169 T’1.4 18,5 48 Đ’5.1 6 109 L34.1 12 170 C4.1 5,5 49 Đ’9.1 5 110 L33.1 3 171 C3b 6 50 Đ’9a 6 111 L37.1 15 172 C2a 15 51 Đ’9b 2 112 L30.1 4 173 C3.3 8,5 52 Đ’9.2c 19 113 L33a 9 174 T11.7 7,5 53 Đ30.2 3 114 L32.2 8,5 175 CT10.1 6 54 Đ’24 12,5 115 L36a 10 176 T7.1 10 55 Đ2b 27 116 L16a 12,5 177 T11.6 15,5 56 Đ’2.2 10 117 L6.3 9 178 T1.2 14,5 57 Đ’0a 7 118 L3.2b 6 179 T4.6 8,5 58 Đ’9.2a 9 119 L12.1 10,5 180 C11.4 17,5 59 Đ2a 2,5 120 L13.2 11 181 C16 16 60 Đ2.3 8 121 L15.1 6,5 182 C15b 4 61 Đ’14.1 13 122 L14.2 7 183 C18.3 17,5 (Ghi chú : Số liệu là kết quả trung bình của 3 lần lặp lại thí nghiệm) Qua phân tích có thể kết luận các chủng nấm sợi ở RNM Cần Giờ có khả năng sinh enzym cellulase khá cao (183/312 chủng) chiếm 58,65% số chủng nấm phân lập được. Số chủng nấm sợi sinh enzym cellulase sống trên lá là 37% cao hơn so với các chủng nấm sống trên thân cành và đất. Do nguồn thức ăn chủ yếu của nấm sợi sống trong RNM Cần Giờ là lá cây, nên chúng phải có khả năng tổng hợp enzym cellulase để phân giải các hợp chất cellulose khó phân hủy. Số chủng nấm sợi sống trên thân, cành sinh enzym cellulase thấp hơn ở lá (27%). Do trong vỏ thân, cành của thực vật ở RNM, thành phần lignin khá cao (trên 20% khối lượng gỗ khô) [49]. Lignin kết hợp với cellulose và hemicellulose tạo nên thành tế bào gỗ có độ bền cơ cao, rất khó phân hủy [52]. Enzym phân giải lignin được tổng hợp sẽ làm ức chế một phần sự tổng hợp cellulase [53]. Trong lớp đất mặt, số chủng nấm sợi sinh enzym cellulase chiếm 34% cao hơn ở thân nhưng thấp hơn ở lá. Ta thấy trên đất ngoài thức ăn là lá, thân cành rụng, còn có nhiều thành phần khó phân giải như rác rưởi, vỏ tôm cua, xác động vật….Nấm sợi phải cùng lúc tổng hợp nhiều loại enzym khác như protease, amylase, kitinase để phân hủy các thành phần này. Do đó, hiệu suất sinh enzym cellulase thấp hơn ở trên lá cây. Tuy nhiên, số chủng có hoạt tính enzym cellulase yếu khá lớn, chiếm 80,2%, trong khi số chủng có hoạt tính mạnh chỉ chiếm 5,5%. Thực tế, quá trình phân giải các hợp chất chứa cellulose trong tự nhiên diễn ra rất chậm, không chỉ dựa vào hệ nấm sợi mà phải có sự tham gia của các VSV khác như vi khuẩn, xạ khuẩn…để có kết quả cao hơn [30]. Trong 183/312 chủng nấm sợi có khả năng sinh enzym cellulase, chúng tôi bước đầu chọn 10 chủng có hiệu số D-d (mm) cao nhất để tiếp tục nghiên cứu (xem bảng 3.3). Bảng 3.3. 10 chủng nấm sợi có khả năng sinh enzym cellulase cao STT Kí hiệu chủng Nguồn gốc phân lập D-d (mm) 1 Đ20a Đất mặt 23,5 2 Đ’0 Đất mặt 29,0 3 Đk Đất mặt 25,5 4 Đ2b Đất mặt 27,0 5 Đ24 Đất mặt 24,5 6 Đ’3 Đất mặt 27,5 7 (T) Thân mục 24,5 8 T1.4 Thân khô 26,5 9 C8a Thân mục 25,5 10 L1.3 Lá khô 24,5 (Số liệu rút ra từ bảng 3.2 và phụ lục 13)  Tuyển chọn lần 2 Để đánh giá chính xác khả năng sinh enzym cellulase của 10 chủng làm cơ sở cho sự tuyển chọn tiếp theo, chúng tôi tiến hành xác định hoạt độ CMCase của chúng theo phương pháp trong phần 2.2.3.1. Kết quả ở bảng 3.4. Bảng 3.4. Hoạt độ CMCase của 10 chủng nấm sợi ( đơn vị IU/g) STT Kí hiệu chủng D-d (mm) Hoạt độ CMCase (IU/g) 1 Đ20a 23,5 13,48 2 Đ’0 29,0 55,70 3 Đk 25,5 28,17 4 Đ2b 27,0 53,10 5 Đ24 24,5 14,14 6 Đ’3 27,5 55,01 7 (T) 24,5 14,11 8 T1.4 26,5 37,84 9 L1.3 25,5 28,42 10 C8a 24,5 16,80 Kết quả ghi nhận được ở bảng 3.4 cho thấy kết quả định tính và định lượng enzym này của 10 chủng là thống nhất nhau. Trong đó ba chủng có hoạt độ CMCase cao nhất là chủng Đ’0 (55,70 IU/g), chủng Đ’3 (55,01 IU/g), chủng Đ2b (53,10 IU/g). Chúng đều có nguồn gốc từ lớp đất mặt, nơi có nguồn thức ăn rất phong phú và nhiều cơ chất cảm ứng khả năng sinh enzym cellulase. Kết quả được minh họa lại ở đồ thị 3.1. 0 10 20 30 40 50 60 Đ2 0a Đ’0 Đk Đ2 b Đ2 4 Đ’3 (T ) T1 .4 L1 .3 C 8a 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 C M C as e (I U /g ) 0 5 10 15 20 25 30 35 D -d (m m ) CMCase (IU/g) D-d (mm) Đồ thị 3.1. Hoạt độ CMCase của 10 chủng nấm sợi Từ đó, chúng tôi quyết định chọn 3 chủng Đ’0 (55,70 IU/g), chủng Đ’3 (55,01 IU/g) và chủng Đ2b (53,10 IU/g) để nghiên cứu tiếp tục. 3.2. Nghiên cứu các đặc điểm hình thái và phân loại ba chủng nấm sợi Tiến hành cấy ba chủng nấm trên các MT khác nhau theo phương pháp ở phần 2.2.2.3, phần 2.2.2.4. - Chủng Đ’0 cấy trên MT PGA. - Chủng Đ’3 và Đ2b cấy trên MT1. Khuẩn lạc được ghi nhận mô tả. Cấu trúc vi thể của nấm sợi được quan sát dưới KHV, chụp hình bào tử, sợi nấm… Chúng tôi sử dụng các khóa phân loại chủ yếu dựa vào các đặc điểm hình thái của Saccardo (1897), Bùi Xuân Đồng (1986), Micheli ex Fries (1832) để phân loại ba chủng nấm sợi đến chi. Kết quả trình bày ở bảng 3.5. Bảng 3.5. Đặc điểm hình thái và phân loại đến chi của ba chủng nấm Ký hiệu chủng Đặc điểm hình thái của ba chủng nấm Đặc điểm định loại đến chi Xếp loại thuộc chi Chủng Đ’0 - Khuẩn lạc: Tròn, mặt nhung mịn, có rãnh phóng xạ. Màu xanh xám, mép vàng cam, khi già có màu xám đen. Không tiết sắc tố. (Hình 3.1) - Hình thái vi thể: Sợi nấm không ngăn vách. Cuống sinh bào tử phân nhánh, gẫy khúc. Có bào tử túi hình cầu, bào tử trần hình quả lê, thể quả hình quả lê màu đen. (Hình 3.2) - Khuẩn lạc: màu xanh đến xanh xám, xám đen. Kích thước nhỏ. Có hoặc không có rãnh phóng xạ. Không hoặc có tiết sắc tố. - Sợi nấm không ngăn vách. Bộ máy mang bào tử gồm cuống sinh bào tử, bào tử trần hình cầu, gần cầu, quả lê, vách dày. Có bào tử túi và thể quả . Ascotricha (Theo Saccardo, 1897.) Chủng Đ’3 - Khuẩn lạc: Tròn, nhung mịn, bột rời. Màu xanh đậm, mép viền trắng, mặt trái có màu hơi nâu. Không tiết sắc tố.(Hình 3.3) - Hình thái vi trể: Sợi nấm ngăn vách. Chổi hình trụ dài, thể bình dạng chai, bào tử trần hình cầu, elíp, có gai thưa. (Hình 3.4) - Khuẩn lạc màu lục, vàng lục, xanh lục, lục xám, xám. Có hoặc không có vết khía xuyên tâm hay đồng tâm. - Sợi nấm ngăn vách. Bộ máy mang bào tử trần dạng chổi gồm 1 vòng hoặc 2 vòng thể bình mang bào tử trần . Penicillium (Theo Bùi Xuân Đồng, 1986.) Kí hiệu chủng Đặc điểm hình thái của ba chủng nấm Đặc điểm định loại đến chi Xếp loại thuộc chi Chủng Đ2b - Khuẩn lạc: Tròn, mặt trơn, nhung mịn. Mặt phải màu xanh ngọc bích sau chuyển sang xanh xám, có rãnh nhăn nhúm, mặt trái màu nâu vàng sau chuyển sang nâu đen. Không tiết sắc tố. (Hình 3.5) - Hình thái vi thể: Sợi nấm ngăn vách, phân nhánh, xanh xám. Cuống sinh bào tử không phân nhánh, đầu phình to thành bọng hình chùy ngắn, mang thể bình hình chai, một tầng. Bào tử trần hình cầu, vách dày có gai. (Hình 3.6) - Khuẩn lạc: màu xanh lục đến xanh xám, nâu, đen. Có hoặc không tiết sắc tố. - Sợi nấm ngăn vách. Bộ máy mang bào tử trần hình hoa cúc gồm giá bào tử trần, bọng đỉnh giá, thể bình. Bào tử trần tụ họp thành hình cột , hình cầu, hình tia tỏa tròn. Aspergillus (Theo Micheli ex Fries, 1832) Hình 3.1 Hình 3.2 Hình 3.1. Mặt phải khuẩn lạc chủng Đ’0 Hình 3.2. Hệ sợi nấm và cuống sinh bào tử của chủng Đ’0 (x40) Hình 3.3 Hình 3.4 Hình 3.3. Mặt phải khuẩn lạc chủng Đ’3 Hình 3.4. Hình dạng hệ sợi nấm và chổi của chủng Đ’3 (x40) Hình 3.5 Hình 3.6 Hình 3.5. Mặt phải khuẩn lạc chủng Đ2b Hình 3.6. Hình dạng sợi nấm và đầu bông cúc chủng Đ2b (x40) Sau đó, chúng tôi tiến hành định danh đến loài ba chủng nấm trên tại công ty cổ phần giám định và khử trùng FCC, 45 Đinh Tiên Hoàng, Quận 1, Tp. Hồ Chí Minh. Kết quả ở bảng 3.6. Bảng 3.6. Kết quả định danh đến loài của ba chủng nấm sợi Kí hiệu chủng Tên loài Khóa phân loại Chủng Đ’0 Ascotricha guamensis Ames, 1986 Chủng Đ’3 Penicillium oxalicum Thom and Currie, 1905 Chủng Đ2b Aspergillus fumigatus Kenneth B- Raper and Fennell, 1965 (Ghi chú: Kết quả ở bảng 3.6 dựa theo phụ lục kết quả định danh của công ty cổ phần giám định và khử trùng FCC) 3.3. Khảo sát một số yếu tố MT ảnh hưởng đến sự sinh trưởng phát triển và hoạt độ CMCase của ba chủng nấm sợi 3.3.1. Các yếu tố MT ảnh hưởng đến sự sinh trưởng phát triển của nấm sợi  Ảnh hưởng nguồn cacbon Chúng tôi cấy các chủng nấm sợi trên MT1, thay glucose bằng các nguồn cacbon khác nhau CMC, lactose, sucrose, galactose, tinh bột. Sau đó ủ ba ngày ở nhiệt độ phòng. Đánh giá mức độ sinh trưởng của nấm bằng cách đo đường kính khuẩn lạc d (mm) theo phương pháp ờ phần 2.2.3.5. Mẫu đối chứng cấy trên MT1. Kết quả trình bày ở bảng 3.7. Bảng 3.7. Khả năng đồng hóa nguồn cacbon của ba chủng nấm sợi Mức độ phát triển (mm) Nguồn cacbon A. guamensis P. oxalicum A. fumigatus Đối chứng 10 12,5 15 Lactose 6,5 10 20 Sucrose 7,5 11 19 Galactose 5,5 10 17 Tinh bột 6,5 10 11 CMC 9,0 11,5 13,0 (Ghi chú: Số liệu là kết quả trung bình của 3 lần lặp lại thí nghiệm) Kết quả ở bảng 3.7 cho thấy cả ba chủng nấm sợi đều sinh trưởng phát triển khá tốt trên MT có các nguồn cacbon khác nhau. Tuy nhiên, chúng không sinh trưởng mạnh bằng mẫu đối chứng. Cả ba chủng sinh trưởng phát triển khá tốt trên MT có chứa CMC (9,0mm, 11,5mm, 13mm). Đây là hợp chất giàu cellulose rất khó phân hủy, chỉ có những chủng nấm sợi nào có khả năng sinh enzym cellulase mới sử dụng được nguồn cacbon này để chuyển hóa thành glucose để hấp thụ. So với nuôi trên MT đối chứng có chứa nguồn cacbon là glucose ta thấy chúng sinh trưởng mạnh tương đương (10mm, 12,5mm, 15mm). Điều này chứng tỏ CMC là nguồn cacbon thích hợp cho ba chủng này. Riêng chủng A. fumigatus sinh trưởng mạnh nhất trên MT chứa nguồn cacbon từ đường như lactose (20mm). Sinh trưởng yếu trên MT chứa tinh bột (11mm). Sở dĩ có sự khác nhau này là do giá trị dinh dưỡng và khả năng hấp thụ của nấm sợi phụ thuộc vào cấu trúc, thành phần hóa học của nguồn cacbon và tùy vào từng chủng nấm sợi [29]. Kết quả được minh họa lại bằng biểu đồ 3.1 0 2 4 6 8 10 12 14 16 M ức độ p há t t ri ển (m m CMC Lactose Sucrose Galactose Tinh bột Nguồn cacbonA. guamensis P. oxalicum A. fumigatus Biểu đồ 3.1. Khả năng đồng hóa các nguồn cacbon của ba chủng nấm sợi Như vậy, cả ba chủng này đều rất thích hợp sống trong MT RNM Cần Giờ, nơi mà nguồn thức ăn chủ yếu là những hợp chất giàu cellulose.  Ảnh hưởng nguồn nitơ Tiến hành nuôi cấy ba chủng nấm sợi theo phương pháp ở phần 2.2.3.5. Mẫu đối chứng nuôi trên MT 1. Kết quả được trình bày ở bảng 3.8. Bảng 3.8. Khả năng đồng hóa các nguồn nitơ của ba chủng nấm sợi Mức độ phát triển (mm) Nguồn nitơ A. guamensis P. oxalicum A. fumigatus Đối chứng 10 12,5 15 Cao thịt 5,5 3 23 Cao nấm men 5 7 23 NH4NO3 7 11 26 Urea 1 8 11,5 (NH4)2SO4. 4,5 7,5 22,5 Bột đậu 6,0 9,0 21,0 (Ghi chú : Số liệu là kết quả trung bình của 3 lần lặp lại thí nghiệm) Kết quả bảng 3.8 cho thấy cả ba chủng đều có khả năng đồng hóa các nguồn nitơ vô cơ và hữu cơ khác nhau. Trong đó NH4NO3 là nguồn nitơ vô cơ thích hợp nhất cho cả ba chủng. So với mẫu đối chứng (15mm), chủng A. fumigatus (26mm) thích hợp với nguồn nitơ NH4NO3 hơn. Chủng A. guamensis (7,0mm), chủng P. oxalicum (11,0 mm) thích hợp với nguồn NaNO3 hơn. Nấm sợi đồng hóa nguồn nitơ hữu cơ thấp hơn nitơ vô cơ. Do nguồn nitơ hữu cơ muốn sử dụng phải được phân giải thành các axit amin và chuyển hóa thành NH3 nhờ enzym dezaminase. Do đó nấm sợi muốn sử dụng nguồn nitơ hữu cơ từ axit amin thì phải có khả năng sinh tổng hợp enzym này [53]. Kết quả được minh họa lần nữa bằng biểu đồ 3.2. 05 10 15 20 25 30 m ức độ p há t t ri ển (m m ) Bột đậu Cao thịt Cao nấm men NH4NO3 Ur ea (NH4)2SO4. nguồn nitơA. guamensis P. oxalicum A. fumigatus Biểu đồ 3.2. Khả năng đồng hóa nguồn nitơ của ba chủng nấm sợi  Ảnh hưởng pH đến sinh trưởng phát triển của ba chủng nấm sợi Tiến hành nuôi cấy ba chủng nấm sợi theo phương pháp ở phần 2.2.3.5. Sau khi ủ nấm sợi 3 ngày trên các MT có pH khác nhau và mẫu đối chứng là MT1 pH 6,5. Kết quả xem ở bảng 3.9, đồ thị 3.2. Bảng 3.9. Ảnh hưởng của pH đến sinh trưởng, phát triển của ba chủng nấm sợi Mức độ phát triển (mm) Độ pH A. guamensis P. oxalicum A. fumigatus Đối chứng 10 12,5 15 3 0 0 4 4 1 5,5 11 5 1,5 7 15 6 6 8 22 7 8,5 11 18 8 3 5 13 (Ghi chú : Số liệu là kết quả trung bình của 3 lần lặp lại thí nghiệm) Kết quả cho thấy ba chủng nấm sợi có thể hoạt động ở khoảng pH rất rộng từ 4-8. pH thích hợp nhất cho cả ba chủng là 6-7. Như vậy, ba chủng nấm này sinh trưởng phát triển mạnh ở pH 6-7, rất thích hợp với điều kiện sống ở RNM Cần Giờ. 05 10 15 20 25 pH 3 pH 4 pH 5 pH 6 pH 7 pH 8 độ pH m ức độ p há t t riể n (m m ) A. guamensis P. oxalicum A. fumigatus Đồ thị 3.2. Ảnh hưởng pH đến sinh trưởng phát triển của ba chủng nấm  Ảnh hưởng độ mặn đến sinh trưởng phát triển của ba chủng nấm Tiến hành nuôi cấy ba chủng nấm sợi theo phương pháp ở phần 2.2.3.5. Sau khi ủ nấm sợi 3 ngày trên các MT có độ mặn khác nhau và mẫu đối chứng là MT 1 không có muối pH 6,5. Kết quả trình bày ở bảng 3.10, đồ thị 3.3. Bảng 3.10. Ảnh hưởng độ mặn đến sinh trưởng phát triển của ba chủng nấm sợi Mức độ phát triển (mm) Độ mặn (%) A. guamensis P. oxalicum A. fumigatus Đối chứng 7 10 25 3 7 11 27 5 3 6 18 10 2 5,5 6 20 1 2 2 (Ghi chú : Số liệu là kết quả trung bình của 3 lần lặp lại thí nghiệm) Kết quả ở bảng 3.10 cho thấy cả ba chủng nấm sợi đều sinh trưởng phát triển trên MT nước ngọt lẫn nước mặn. Điều này chứng tỏ chúng có nguồn gốc từ đất liền du nhập vào RNM Cần Giờ và thích nghi điều kiện sống ở đó. Ta thấy cả ba chủng đều sinh trưởng mạnh nhất ở MT có nồng độ muối 3%, mạnh hơn so với MT không có muối, và giảm dần đến 20%. Mặc dù là nấm du nhập từ đất liền nhưng chúng thích hợp với điều kiện nước lợ hơn. Kết quả được minh họa một lần nữa qua đồ thị 3.3. 0 5 10 15 20 25 30 3% 5% 10% 20% Đối chứng độ mặn m ức độ p há t t riể n (m m ) A. guamensis P. oxalicum A. fumigatus Đồ thị 3.3. Ảnh hưởng độ mặn đến sinh trưởng phát triển của ba chủng nấm sợi Vậy, độ mặn thích hợp nhất cho ba chủng nấm sợi sinh trưởng là 3%, phù hợp với điều kiện nước lợ ở RNM Cần Giờ.  Ảnh hưởng nhiệt độ đến sinh trưởng phát triển của ba chủng nấm Tiến hành nuôi cấy ba chủng nấm sợi theo phương pháp ở phần 2.2.3.5. Sau khi ủ chúng 3 ngày ở các nhiệt độ khác nhau, kết quả ở bảng 3.11. Bảng 3.11. Ảnh hưởng nhiệt độ đến sinh trưởng phát triển của ba chủng nấm sợi Mức độ phát triển (mm) Nhiệt độ (0C) A. guamensis P. oxalicum A. fumigatus 25 1,0 3,0 7,0 30 4,5 11 15 40 3 4 12,5 60 0 0 1 (Ghi chú: Số liệu là kết quả trung bình của 3 lần lặp lại thí nghiệm) Kết quả cho thấy ở nhiệt độ cao quá 600C nấm không sống được, chỉ có chủng A. fumigatus là loài ưa nhiệt mới sống được ở nhiệt độ này. Còn ở 250C nấm phát triển rất yếu. Trong khoảng 300C-400C nấm sinh trưởng mạnh, nhất là ở 300C vì đây là nhiệt độ tốt nhất cho sợi nấm nảy mầm và tạo bào tử. Kết quả được minh họa ở đồ thị 3.4. 0 2 4 6 8 10 12 14 16 25 30 40 60 nhiệt độ m ức độ ph át tr iển (m m ) A. guamensis P. oxalicum A. fumigatus Đồ thị 3.4. Ảnh hưởng nhiệt độ đến sinh trưởng phát triển của ba chủng nấm sợi Vậy, nhiệt độ thích hợp nhất cho cả ba chủng sinh trưởng phát triển là 300C.  Ảnh hưởng thời gian đến sinh trưởng phát triển của ba chủng nấm sợi Cấy các chủng nấm sợi vào MT1, mỗi ngày đo đường kính khuẩn lạc từ ngày thứ 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7. Kết quả ở bảng 3.12 đồ thị 3.5. Bảng 3.12. Ảnh hưởng thời gian đến sinh trưởng của ba chủng nấm sợi Mức độ phát triển (mm) Thời gian (ngày) A. guamensis P. oxalicum A. fumigatus 1 0,5 3 3 2 2 6 10 3 6 10 22 4 8 14 25 5 11 19 34 6 13 24,5 35 7 18 25 35,5 (Ghi chú: Số liệu là kết quả trung bình của 3 lần lặp lại thí nghiệm) Kết quả ở bảng 3.12 cho thấy ba chủng đều sinh trưởng chậm, khuẩn lạc lớn dần theo thời gian nhưng vẫn bé hơn các chủng nấm sợi ở đất liền. Đến ngày thứ 7 thì sinh trưởng chậm lại. Đây là điểm đặc trưng của nấm sợi ở RNM. Riêng chủng A. fumigatus sinh trưởng mạnh và nhanh hơn hai chủng còn lại. 0 5 10 15 20 25 30 35 40 1 2 3 4 5 6 7 ngày m ức độ p há t t riể n (m m ) A. guamensis P. oxalicum A. fumigatus Đồ thị 3.5. Ảnh hưởng thời gian đến sinh trưởng phát triển của ba chủng nấm sợi Tóm lại, sau khi khảo sát các điều kiện MT ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của ba chủng nấm sợi, ta có thể rút ra đặc điểm đặc trưng của ba chủng nấm sống ở RNM Cần Giờ : - Ba chủng đều sinh trưởng chậm, khuẩn lạc nhỏ hơn các chủng nấm sống ở đất liền. - Có khả năng đồng hóa nguồn cacbon CMC tốt nhất. - Sử dụng nguồn nitơ vô cơ NH4NO3 tốt nhất. - Độ mặn thích hợp nhất cho sinh trưởng và phát triển là 3%. - pH thích hợp nhất từ 6-7. - Nhiệt độ thích hợp nhất cho sinh trưởng phát triển là 300C. 3.3.2. Nghiên cứu các yếu tố MT ảnh hưởng đến hoạt độ enzym CMCase của ba chủng nấm sợi  Ảnh hưởng thời gian đến hoạt độ CMCase của ba chủng nấm Thí nghiệm này nhằm mục đích xác định thời gian tối ưu để thu nhận enzym cellulase có hoạt lực cao nhất. Tiến hành nuôi nấm sợi trên MT11 ở các thời gian khác nhau 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ, 60 giờ, 72 giờ. Sau khi nuôi cấy, ly trích enzym và xác định hoạt độ CMCase theo phương pháp 2.2.3.1 Kết quả được ghi nhận ở bảng 3.13, đồ thị 3.6. Bảng 3.13. Ảnh hưởng thời gian đến hoạt độ enzym CMCase Hoạt độ CMCase (IU/g) Tên chủng 24 giờ 36 giờ 48 giờ 60 giờ 72 giờ A. guamensis 55,68 56,55 56,58 37,92 23,71 P. oxalicum 56,49 56,87 53,95 37,72 21,71 A. fumigatus 37,76 56,49 55,98 28,43 28,22 (Kết quả được tính từ phụ lục 10 theo công thức ở phần 2.2.3.1) Kết quả ghi nhận được ở bảng 3.13 cho thấy ba chủng có hoạt độ CMCase cao ở khoảng 24- 48 giờ. - Chủng A. guamensis có hoạt độ CMCase cao nhất sau 48 giờ nuôi cấy (56,58 IU/g), vì chủng này sinh trưởng chậm hơn hai chủng còn lại nên thời gian tổng hợp enzym cao nhất chậm hơn. - Chủng P. oxalicum có hoạt độ CMCase cao nhất 56,87 IU/g và A. fumigatus có hoạt độ enzym CMCase cao nhất 56,49 IU/g sau 36 giờ nuôi cấy Thời gian này nấm sợi bắt đầu tạo bào tử nên enzym cellulase được tổng hợp mạnh nhất [30]. Kết quả này phù hợp với kết quả nghiên cứu của Trần Thạnh Phong (2004). Ta thấy thời gian sinh trưởng của các chủng nấm sợi chậm kéo theo thời gian sinh enzym cellulase cũng chậm hơn so với nấm sợi sống ở đất liền. Đây là điểm đặc trưng của nấm sợi sống ở RNM Cần Giờ, thời gian sinh trưởng rất chậm và khả năng sinh enzym cellulase cũng tỉ lệ thuận với tốc độ sinh trưởng của nấm sợi. 0 10 20 30 40 50 60 24 giờ 36 giờ 48 giờ 60 giờ 72 giờ thời gian C M C as e ( IU /g ) A. guamensis P. oxalicum A. fumigatus Đồ thị 3.6. Ảnh hưởng thời gian đến hoạt độ CMCase của ba chủng nấm sợi  Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến hoạt độ CMCase của ba chủng nấm sợi Thí nhiệm này nhằm mục đích xác định nguồn cơ chất cảm ứng khả năng sinh enzym cellulase tốt nhất cho ba chủng nấm sợi. Tiến hành cấy dịch huyền phù bào tử ba chủng nấm trên môi trường bán rắn với tỉ lệ khác nhau theo phương pháp ở phần 2.2.3.2. Thời gian nuôi cấy chủng A. guamensis là 48 giờ, hai chủng còn lại là 36 giờ. Ly trích enzym theo phương pháp 2.2.2.6 và xác định hoạt tính CMCase theo phương pháp 2.2.3.1. Kết quả trình bày ở bảng 3.14, đồ thị 3.7. Kết quả ghi nhận được ở bảng 3.14 cho thấy hoạt độ CMCase của cả ba chủng đều cao trên các nguồn cacbon khác nhau. Nguồn cacbon hydrat mà chủng nấm sợi sử dụng được trong quá trình sinh tổng hợp cellulase là rất phong phú. Bảng 3.14. Ảnh hưởng nguồn cacbon đến hoạt độ CMCase Hoạt độ CMCase (IU/g) Tên chủng 6C: 4T 6C: 4BM 6C: 4GL 6C: 4MD 6GL: 4C A. guamensis 53,69 56,88 56,52 56,59 18,25 P. oxalicum 56,17 54 55,38 56,56 28,25 A. fumigatus 55,35 50,41 60,8 59,34 27,84 (Ghi chú: Số liệu được tính ra từ phụ lục 4 theo công thức ở phần 2.2.3.1) - Chủng A. guamensis có hoạt độ CMCase cao nhất trên MT 6C: 4BM (56,88 IU/g), các MT còn lại hoạt lực cũng cao tương đương. Nguyên nhân do bã mía có khả năng giữ nước tốt, hàm lượng cellulose trong bã mía tương đối cao nên có thể làm chất cảm ứng cho quá trình sinh enzym cellulase. Ngoài ra bã mía còn có độ tơi xốp cao, tạo nên độ thoáng khí của MT nuôi cấy tốt hơn. - Chủng P. oxalicum có hoạt lực CMCase cao nhất trên MT 6C: 4MD (56,56IU/g). Chủng A. fumigatus có hoạt lực cao nhất trên MT 6C: 4GL (60,80 IU/g). Kết quả này cũng phù hợp với kết quả trong các nghiên cứu của Loginova, 1976 đối với chủng Trichoderma [53]. So với kết quả nghiên cứu của Trần Thạnh Phong (2004), hoạt độ CMCase của chủng Trichoderma reesei VTT-D-80133 trên MT 6CM: 4BM là 98,35 IU/g thì chủng A. guamensis có hoạt độ CMCase thấp hơn. Có lẽ vì đây là chủng hoang dại chưa qua cải tạo bằng các phương pháp gây đột biến để có hoạt lực cao hơn. Tuy nhiên, so với chủng Aspergillus niger K84 trên MT 6CM: 4BM có hoạt độ CMCase là 10,22 IU/g thì chủng A. guamensis cao hơn [40]. Trên MT 6GL:4C, cả ba chủng đều có hoạt lực CMCase thấp nhất. Đây là MT có độ ẩm và hàm lượng cám thấp không đủ thành phần dinh dưỡng nên chưa thích hợp cho sự sinh trưởng và sinh enzym cellulase của nấm sợi. Do đó, cần tìm MT có hàm lượng cám mì cao, giữ được độ ẩm và hàm lượng cellulose thích hợp thì các chủng mới sinh enzym cellulase cao. Kết quả được minh họa lại ở đồ thị 3.7. 0 10 20 30 40 50 60 70 6C: 4T 6C: 4BM 6C: 4GL 6C: 4MD 6GL: 4C Nguồn cacbon C M C as e ( IU /g ) A. guamensis P. oxalicum A. fumigatus Đồ thị 3.7. Ảnh hưởng nguồn cacbon đến hoạt độ CMCase của ba chủng nấm sợi  Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến hoạt độ CMCase của ba chủng nấm sợi Trong thí nghiệm này, chúng tôi tiến hành nuôi ba chủng nấm sợi trên MT11 có bổ sung thêm 0,5% urê. 0,5% (NH4)2SO4, 0,5% pepton, 0,5% cao thịt, 0,5% cao nấm men. Nuôi cấy trong 48 giờ đối với chủng A. guamensis, 36 giờ đối với hai chủng còn lại. Ly trích enzym theo phương pháp 2.2.2.6 và xác định hoạt độ CMCase theo phương pháp 2.2.3.1 Kết quả được ghi nhận ở bảng 3.15, đồ thị 3.8. Bảng 3.15. Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến hoạt độ CMCase Hoạt độ CMCase (IU/g) Tên chủng Cao thịt Cao nấm men Pepton NH4NO3 (NH4)2SO4 A. guamensis 12,74 27,88 28,1 55,8 7,86 P. oxalicum 27,34 16,64 12,07 56,56 27,2 A. fumigatus 5,44 27,91 54,81 56,45 27,87 (Ghi chú: Số liệu được tính ra từ phụ lục 5 theo công thức ở phần 2.2.3.1) Kết quả cho thấy cả ba chủng đều sinh enzym CMCase mạnh nhất trên MT chứa nguồn nitơ vô cơ NH4NO3. Ở phần 3.2.1 ta đã kết luận ba chủng này cũng sinh trưởng phát triển tốt nhất trên MT có nguồn nitơ vô cơ NH4NO3 (kết quả ở biểu đồ 3.2). Do đó, tốc độ sinh trưởng và khả năng sinh enzym cellulase tỉ lệ thuận. Đây là đặc điểm rất thuận lợi khi sử dụng các chủng nấm sợi này để sản xuất enzym cellulase, vừa thu được sinh khối nấm sợi, vừa thu được lượng cellulase lớn trên cùng một loại MT. Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu của Nguyễn Đức Lượng (2004) là nguồn nitơ thích hợp nhất cho sinh tổng hợp cellulase là NaNO3 và NH4NO3 [30]. Kết quả này được minh họa chính xác hơn ở đồ thị 3.8. nguồn nitơ 0 10 20 30 40 50 60 Cao thịt Cao nấm men Pepton NH4NO3 (NH4)2SO4 C M C as e (I U /g ) A. guamensis P. oxalicum A. fumigatus Đồ thị 3.8. Ảnh hưởng nguồn nitơ đến hoạt độ CMCase của ba chủng nấm sợi  Ảnh hưởng độ pH đến hoạt độ CMCase của ba chủng nấm sợi Tiến hành nuôi chủng A. guamensis trên MT 6C: 4BM, chủng P. oxalicum trên MT 6C: 4MD, chủng A. fumigatus trên MT 6C: 4GL. Bổ sung thêm 0,5% NH4NO3, dùng HCl, NaOH điều chỉnh pH về các độ pH 4, 5, 6, 7, 8. Nuôi ở thời gian 36- 48 giờ. Ly trích enzym và xác định hoạt độ CMCase theo phương pháp 2.2.3.1. Kết quả được ghi nhận ở bảng 3.16, đồ thị 3.9. Bảng 3.16. Ảnh hưởng độ pH đến hoạt độ enzym CMCase Hoạt độ CMCase (IU/g) Tên chủng pH4 pH5 pH6 pH7 pH8 A. guamensis 28,28 48,85 56,85 56,51 28,26 P. oxalicum 28,18 55,99 56,08 56,15 34,89 A. fumigatus 28,38 53,45 54,5 55,89 53,26 (Ghi chú: Số liệu được tính ra từ phụ lục 6 theo công thức ở phần 2.2.3.1) - Chủng A. guamensis có hoạt độ CMCase cao nhất ở pH6 (56,86 IU/g). - Chủng P. oxalicum có hoạt độ cao nhất 56,15 IU/g và A. fumigatus có hoạt độ cao nhất 55,89 IU/g ở pH7. Kết quả thống nhất với nghiên cứu của Hoàng Quốc Khánh (2000) về khả năng sinh enzym cellulase của A. niger RNNL-363 [24]. Ở pH quá thấp (8) hoạt độ CMCase của các chủng nấm sợi giảm mạnh. Nguyên nhân do pH quá thấp, quá cao sẽ làm bất hoạt một số enzym cellulase và làm cố định enzym này bên trong khuẩn ty nấm, enzym không tiết ra ngoài sợi nấm nên hoạt độ giảm [29]. Kết quả được minh họa lại ở đồ thị 3.9. 05 10 15 20 25 pH 3 pH 4 pH 5 pH 6 pH 7 pH 8 độ pH m ức độ p há t t riể n (m m ) A. guamensis P. oxalicum A. fumigatus Đồ thị 3.9. Ảnh hưởng độ pH đến hoạt độ CMCase của ba chủng nấm sợi Riêng chủng A. fumigatus trên MT pH8 vẫn tổng hợp được enzym cellulase rất cao, nên rất thích hợp với điều kiện sống ở RNM Cần Giờ.  Ảnh hưởng độ ẩm đến hoạt độ CMCase của ba chủng nấm sợi Tiến hành nuôi: - Chủng A. guamensis trên MT 6C: 4BM, ở pH6. - Chủng P. oxalicum trên MT 6C: 4MD, ở pH7. - Chủng A. fumigatus trên MT 6C: 4GL, ở pH7. Bổ sung thêm 0,5% NH4NO3. Điều chỉnh độ ẩm bằng nước biển vô trùng về các độ ẩm 50%, 55%, 60%, 70%, 75%. Sau 36-48 giờ nuôi cấy, ly trích enzym và xác định hoạt tính CMCase theo phương pháp 2.2.3.1. Kết quả được ghi nhận ở bảng 3.17, đồ thị 3.10. Bảng 3.17. Ảnh hưởng độ ẩm đến hoạt độ CMCase của ba chủng nấm sợi Hoạt độ CMCase (IU/g) Tên chủng 50% 55% 60% 70% 75% A. guamensis 38,84 56,28 56,78 55,48 10,35 P. oxalicum 55,9 56,6 56,29 56,15 28,11 A. fumigatus 53,69 56,07 56,41 56,52 36,77 (Ghi chú: Số liệu được tính ra từ phụ lục 8 theo công thức ở phần 2.2.3.1) - Chủng A. guamensis có hoạt độ CMCase cao nhất ở độ ẩm 60% (56,78 IU/g). Kết quả này phù hợp với báo cáo của Kim và cs (1985) là tốc độ sinh trưởng tối ưu của Trichoderma reesei ở độ ẩm 60%, nhưng sinh ra enzym cellulase tối đa là ở độ ẩm khoảng 50% [53]. - Chủng P. oxalicum có hoạt độ CMCase cao nhất ở độ ẩm 55% (56,6 IU/g). - Chủng A. fumigatus có hoạt độ CMCase cao nhất ở độ ẩm 70% (56,52 IU/g). Kết quả được minh họa một lần nữa bằng đồ thị 3.10. 0 10 20 30 40 50 60 50% 55% 60% 70% 75% độ ẩm C M C as e (I U /g ) A. guamensis P. oxalicum A. fumigatus Đồ thị 3.10. Ảnh hưởng độ ẩm đến hoạt độ CMCase của ba chủng nấm sợi Các tác giả Toyama và Ogawa (1997) cũng nhận xét rằng các chủng nấm sợi khác nhau cần độ ẩm khác nhau cho quá trình phát triển của chúng. Khi tăng độ ẩm thích hợp có tác dụng làm cơ chất phồng lên, tăng độ xốp tạo điều kiện cho nấm sợi tiếp xúc với cơ chất dễ dàng hơn. Nếu tăng độ ẩm cao hơn sẽ làm cơ chất quá ẩm, độ xốp giảm và ngăn sự khuếch tán O2 từ bên ngoài vào MT, sự sinh trưởng của nấm sẽ chậm và khả năng sinh enzym sẽ giảm [30].  Ảnh hưởng độ mặn đến hoạt độ CMCase của ba chủng nấm sợi Tiến hành nuôi ba chủng nấm theo các điều kiện giống như ảnh hưởng độ ẩm. Điều chỉnh độ ẩm bằng nước muối có nồng độ 0%, 3%, 5%, 10%, 20%. Nuôi ở thời gian thích hợp, ly trích enzym theo phương pháp 2.2.2.6 và xác định hoạt tính CMCase theo phương pháp 2.2.3.1. Kết quả ở bảng 3.18. Bảng 3.18. Ảnh hưởng độ mặn đến sinh tổng hợp enzym cellulase (Ghi chú: Số liệu được tính ra từ phụ lục 9 theo công thức ở phần 2.2.3.1 ) Hoạt độ CMCase (IU/g) Tên chủng 0% 3% 5% 10% 20% A. guamensis 51,98 55,32 48,17 28,43 22,41 P. oxalicum 53,49 55,56 40,3 28,31 26,8 A. fumigatus 53,47 54,60 48,44 14,15 13,96 Đối với nấm sợi ở RNM thì khả năng chịu mặn là một đặc điểm đặc trưng của chúng. Qua kết quả ở bảng 3.18 ta thấy cả ba chủng có hoạt độ CMCase cao ở MT không có muối, nhưng sinh enzym CMCase cao nhất ở MT có nồng độ muối ở 3%, sau đó giảm dần đến 20%. Kết quả được minh họa lại ở đồ thị 3.11. 0 10 20 30 40 50 60 0% 3% 5% 10% 20% Độ mặn C M C as e (I U /g ) A. guamensis P. oxalicum A. fumigatus Đồ thị 3.11. Ảnh hưởng của độ mặn đến hoạt độ CMCase của ba chủng nấm sợi  Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt độ CMCase của ba chủng nấm sợi Tiến hành nuôi ba chủng ở MT giống MT xác định ảnh hưởng độ mặn. Ly trích enzym và xác định hoạt tính CMCase theo phương pháp 2.2.3.1. Kết quả được ghi nhận ở bảng 3.19, đồ thị 3.12. Bảng 3.19. Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt độ CMCase Hoạt độ CMCase (IU/g) Tên chủng 250C 300C 400C 500C A. guamensis 26,01 56,81 52,68 36,15 P. oxalicum 28,24 56,88 56,58 46,07 A. fumigatus 28,22 56,49 56,24 47,21 (Ghi chú: Số liệu được tính ra từ phụ lục 7 theo công thức ở phần 2.2.3.1) Nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến khả năng sinh enzym của nấm sợi. Kết quả cho thấy ba chủng có hoạt lực cao ở 30 - 400C, cao nhất ở 300C. Kết quả được minh họa lại ở đồ thị 3.12. 0 10 20 30 40 50 60 25 30 40 50 nhiệt độ C M C as e (I U /g ) A. guamensis P. oxalicum A. fumigatus Đồ thị 3.12. Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt độ CMCase Nhiệt độ sinh trưởng trùng với nhiệt độ sinh CMCase của ba chủng nấm nghiên cứu (300C), là nhiệt độ phổ biến ở RNM Cần Giờ. Chứng tỏ các chủng nấm sợi chúng tôi nghiên cứu có khả năng đưa vào sản xuất với điều kiện nhiệt độ ở đất liền. Kết quả này cũng phù hợp với kết quả của Norkrans (1967) là các chủng nấm có hoạt tính phân giải cellulose cao đều là các loại nấm ưa ấm, phát triển thích hợp nhất ở 25-30oC [53]. Tóm lại, các điều kiện MT thích hợp cho sự sinh tổng hợp CMCase của ba chủng nấm sợi nghiên cứu ở bảng 3.20. Bảng 3.20. Các điều kiện MT thích hợp cho sự sinh tổng hợp CMCase của ba chủng nấm sợi Chủng nấm Điều kiện MT A. guamensis P. oxalicum A. fumigatus 1. Nguồn cacbon 6C:4BM (56,88 IU/g) 6C:4MD (56,56 IU/g) 6C:4GL (60,8 IU/g) 2. Nguồn nitơ NH4NO3 (55,8 IU/g) NH4NO3 (56,56 IU/g) NH4NO3 (56,45 IU/g) 3. pH pH6 (56,85 IU/g) pH7 (56,15 IU/g) pH7 (55,89 IU/g) 4. Độ ẩm 60% (56,78 IU/g) 55% (56,6 IU/g) 70% (56,52 IU/g) 5. Độ mặn 3% (55,32 IU/g) 3% (55,56 IU/g) 3% (54,60%) 6. Nhiệt độ 300C (56,81 IU/g) 300C (56,88 IU/g) 300C 56,49 IU/g) 7. Thời gian 48 giờ (56,58 IU/g) 36 giờ (56,87 IU/g) 36 giờ (56,49 IU/g) 3.4. Nghiên cứu đặc tính sinh học khác của ba chủng nấm sợi  Hoạt tính enzym ngoại bào Chúng tôi tiến hành nuôi nấm sợi trên MT xốp cơ sở (MT11), chiết dịch enzym theo phương pháp như mục 2.2.16. Sau đó, kiểm tra khả năng sinh các loại enzym cellulase, protease, amylase, kitinase theo phương pháp ở phần 2.2.3.2, kiểm tra khả năng phân giải dầu theo phương pháp 2.2.3.4. Kết quả ở bảng 3.20, đồ thị 3.13, hình 3.7-3.10 Bảng 3.21. Khả năng tạo enzym ngoại bào của ba chủng nấm sợi Tên chủng cellulase (D-d), mm protease (D-d), mm amylase (D-d), mm kitinase (D-d) mm Phân giải dầu A. guamensis 29 15,5 18 24 0 P. oxalicum 27 15,5 14 17,5 0 A. fumigatus 27,5 21 21 21 0 Kết quả bảng 3.21 cho thấy cả ba chủng đều có hoạt tính enzym thủy phân ngoại bào mạnh. Ngoài khả năng sinh enzym cellulase cao, ba chủng nấm còn sinh enzym amylase, protease, kitinase rất cao. Sự kết hợp hoạt động của các enzym trên giúp phân giải mạnh các biopolymer, nguồn cơ chất phổ biến trong RNM Cần Giờ. Đặc biệt, ba chủng nấm này có hoạt tính enzym kitinase khá cao (D-d= 24mm; 17,5mm; 21mm). Nhờ đó chúng sẽ phân hủy xác động vật biển như các loài giáp xác, vỏ tôm, cua…hạn chế mùi hôi thối làm ô nhiễm MT RNM Cần Giờ. Tuy nhiên cả ba chủng đều không có khả năng sinh enzym phân giải dầu. Vì RNM Cần Giờ nằm sát biển nên thường bị ô nhiễm dầu do các tai nạn chìm tàu dầu. Nếu các chủng nấm sợi sinh trưởng ở RNM Cần Giờ có khả năng phân giải dầu sẽ góp phần làm sạch MT. Ba chủng nấm đều không có đặc tính quý giá này. Kết quả này được minh họa lại bằng biểu đồ 3.3 0 5 10 15 20 25 30 (D -d ) m m cellulase protease amylase Kitinase Phân giải dầu A. guamensis P. oxalicum A. fumigatus Biểu đồ 3.3. Khả năng tạo enzym, phân giải dầu của ba chủng nấm sợi (a) (b) (c) Hình 3.7. Hoạt tính cellulase của ba chủng nấm sợi (a) (b) (c) Hình 3.8. Hoạt tính enzym amylase của ba chủng nấm sợi (a) (b) (c) Hình 3.9. Hoạt tính enzym protease của ba chủng nấm sợi (a) (b) (c) Hình 3.10. Hoạt tính enzym kitinase của ba chủng nấm (Ghi chú: a. A. guamensis; b. P. oxalicum ; c. A. fumigatus)  Hoạt tính kháng sinh của ba chủng nấm sợi Chúng tôi cũng tiến hành nuôi các chủng nấm sợi trên MT xốp cơ sở (MT11), chiết dịch enzym theo phương pháp như mục 2.2.2.6. Kiểm tra hoạt tính kháng sinh theo phương pháp 2.2.3.3. Kết quả ở bảng 3.22, hình 3.11- 3.12. Bảng 3.22. Khả năng sinh kháng sinh của ba chủng nấm sợi Tên chủng E.coli (D-d), mm Bacillus subtillis (D-d), mm A. guamensis P. oxalicum A. fumigatus 5,0 4,0 1,0 1,0 5,0 2,0 (Ghi chú : Số liệu là kết quả trung bình của 3 lần lặp lại thí nghiệm) (a) (b) (c) Hình 3.11. Hoạt tính kháng E. coli của ba chủng nấm a. A. guamensis; b. P. oxalicum ; c. A. fumigatus (a) (b) (c) Hình 3.12. Hoạt tính kháng B. subtilis của ba chủng nấm sợi a. A. guamensis; b. P. oxalicum ; c. A. fumigatus Qua kết quả trên ta thấy ba chủng nấm đều có khả năng sinh kháng sinh tiêu diệt các VSV gây bệnh, nhưng mức độ đối kháng yếu. Chủng P. oxalicum có hoạt tính kháng sinh cao hơn hai chủng còn lại, điều này cũng phù hợp với các công trình nghiên cứu về kháng sinh Penicilin sinh ra từ nấm Penicillium. Như vậy, qua kết quả khảo sát ta thấy ba chủng nấm sợi đều có thể tổng hợp cùng lúc nhiều loại enzym thủy phân ngoại bào mạnh như cellulase, protease, amylase, kitinase, các chất kháng sinh chống lại các VSV gây bệnh như E.coli, B. subtilis. 3.5. Bước đầu thử nghiệm sử dụng dịch chiết enzym cellulase thô từ ba chủng nấm sợi 3.5.1. Thử nghiệm khả năng đường hóa giấy in, giấy báo cũ Để thấy được khả năng ứng dụng của enzym cellulase thu nhận được từ các chủng nấm sợi phân lập được từ RNM Cần Giờ, chúng tôi tiến hành khảo sát khả năng đường hóa giấy in, giấy báo cũ. Ba chủng nấm sợi nuôi cấy ở các điều kiện thích hợp để có hoạt tính CMCase cao nhất như đã nghiên cứu ở trên. Sau đó ly trích bằng dung dịch đệm Na-acetate 50mM pH5, lọc thu dịch enzym để đường hóa giấy in, giấy báo cũ theo phương pháp 2.2.4.1. Sau đó đo hàm lượng đường khử bằng thuốc thử DNS dựa vào đường chuẩn glucose ở phụ lục 1. Kết quả được trình bày qua bảng 3.23. Bảng 3.23. Khả năng đường hóa của enzym cellulase từ ba chủng nấm Dịch chiết enzym cellulase từ chủng nấm sợi % đường hóa Ascotricha guamensis 11,41 Penicillium oxalicum 10,12 Aspergillus fumigatus 14,62 Hổn hợp enzym từ 3 chủng 26,02 Bảng 3.23 cho thấy, enzym cellulase từ Ascotricha guamensis có khả năng đường hóa khoảng 11,41%, từ Penicillium oxalicum đường hóa khoảng 10,124%, Aspergillus fumigatus có khả năng đường hóa 14,62%. Kết quả này thấp hơn so với nghiên cứu của Trần Thạnh Phong (2004) đối với dịch chiết từ Trichoderma. Hỗn hợp dịch nuôi cấy của 3 chủng theo tỉ lệ 1:1:1 có khả năng đường hóa cao hơn các chủng riêng rẽ (26,02%). Do có một số chủng nấm chỉ sinh một loại enzym cellulase không phân cắt triệt để cellulose. Các chủng nấm khác nhau sẽ sinh ra các loại enzym endoglucanse hay exoglucase nhiều ít khác nhau. Các enzym này sẽ phối hợp hoạt động phân cắt cellulose thành glucose mạnh hơn, triệt để hơn. Như vậy, trong quá trình sử dụng enzym này cần có sự phối hợp dịch chiết enzym của ba chủng nấm sợi. 3.5.2. Bước đầu thử nghiệm dịch chiết enzym cellulase thô từ 3 chủng nấm sợi vào việc phân hủy rơm rạ làm phân bón Sau khi chọn được ba chủng, chúng tôi tiến hành ủ đống rơm rạ bằng phương pháp ủ quy mô nhỏ theo phương pháp 2.2.4.2.  Theo dõi sự thay đổi một số chỉ tiêu của đống ủ Sau 1 tháng, tiến hành theo dõi một số chỉ tiêu và so sánh với ủ trong hộp xốp có bổ sung dịch nuôi cấy nấm sợi. Kết quả ở bảng 3.24. Ở lô thí nghiệm nhiệt độ tăng cao hơn đối chứng do tác động của dịch chiết enzym phân cắt thành phần cellulose của rơm rạ, quá trình trao đổi chất tăng nhanh nên nhiệt độ cũng tăng cao hơn. Đến tuần cuối cùng, quá trình phân giải rơm rạ đã hoàn tất, nhiệt độ giảm. Trong khi ở mẫu đối chứng mới bắt đầu phân cắt sợi rơm nên nhiệt độ vừa tăng cao hơn nhưng thấp hơn so với mẫu thí nghiệm (320C). Kết quả là ở mẫu thí nghiệm sợi rơm đã bị phân hủy thành mùn nên màu sẫm lại, nhũn và mềm có thể làm phân bón cho cây trồng. Còn ở mẫu đối chứng sợi rơm vẫn còn màu nâu nhạt, chưa mềm nhũn. Bảng 3.24 . Một số chỉ tiêu theo dõi mẫu ủ Mẫu ủ Chỉ tiêu Đối chứng Thí nghiệm - Nhiệt độ đống ủ trong tuần đầu. - Nhiệt độ đống ủ trong tuần cuối. - Độ giảm chiều cao của đống ủ. - Màu sắc của rơm rạ. - Độ dai của rơm. Thấp hơn (320C) Cao hơn (350C) 12cm Nâu nhạt Sợi mềm, không nhũn. Tăng cao hơn (380C) Thấp hơn (320C) 20 cm Nâu sẫm Sợi rơm mềm, nhũn Ghi chú: Đối chứng: không bổ sung dịch nuôi cấy Thí nghiệm: Có bổ sung dịch nuôi cấy Từ kết quả ở bảng 3.24 ta thấy rằng việc bổ sung VSV vào đống ủ có hiệu quả hơn ủ nhờ VSV tự nhiên có trong đống ủ, rút ngắn thời gian ủ, giảm ô nhiễm MT gây ra do thời gian ủ kéo dài. Mẫu ủ không có bổ sung dịch nuôi cấy nấm sợi cũng phân hủy nhưng thời gian chậm hơn, phải kéo dài đến 65 ngày mới đạt được độ phân hủy giống như mẫu ủ có bổ sung dịch enzym.  Đánh giá độ chín của mẫu ủ Tiến hành trồng đậu theo 2 lô thí nghiệm và đối chứng theo phương pháp 2.2.4.2 (xem kết quả ở bảng 3.25). Kết quả bảng 3.25 cho thấy mẫu bổ sung dịch chiết enzym từ ba chủng đều cho kết quả cao hơn mẫu đối chứng. Như vậy phân ủ đã chín và có hiệu quả cao. Bảng 3.25. Tỷ lệ hạt nảy mầm, trọng lượng tươi của đậu xanh sau 7 ngày trồng trên phân ủ từ rơm rạ STT Bổ sung dịch chiết từ các chủng nấm Số hạt nảy mầm (hạt) Tỷ lệ hạt nảy mầm (%) Trọng lượng tươi thu được(g) 1 2 3 4 5 Đối chứng A. guamensis P. oxalicum A. fumigatus Nhiễm hỗn hợp dịch chiết enzym 29/57 48/57 42/57 36/57 50,57 50,8 84,2 73,7 63,2 87,7 55 150 120 95 180 (Đối chứng: Không bổ sung dịch chiết enzym) Mẫu nhiễm dịch chiết từ A. guamensis có trọng lượng tươi 150g, tỉ lệ hạt nảy mầm là 84,2% cao nhất. Do chủng này có hoạt độ CMCase cao nhất (55,70 IU/g) nên phân hủy rơm rạ thành mùn cao hơn hai chủng còn lại. Mẫu nhiễm hỗn hợp có trong lượng tươi là 180g, cao hơn mẫu nhiễm A. guamensis là 30g, cao hơn mẫu nhiễm P. oxalicum là 50g, cao hơn mẫu nhiễm A. fumigatus là 85g, và đặc biệt cao hơn mẫu không bổ sung dịch nuôi cấy nấm sợi là 125g. Do hoạt động phối hợp của các enzym từ các chủng khác nhau sẽ phân cắt sợi rơm rạ thành mùn tốt hơn. Kết quả này có thể được đánh giá là khá tốt. So với báo cáo của Lê Thị Thanh Thủy (2001) thì kết quả này thấp hơn, nhưng so với mức chuẩn để đánh giá độ chín của phân ủ là trọng lượng tươi 160g thì chủng A. guamensis 150g (93,75%), mẫu nhiễm hỗn hợp dịch chiết cao hơn 180g (112,5%). Như vậy, sử dụng hỗn hợp dịch chiết enzym sẽ cho kết quả cao hơn sử dụng riêng rẽ dịch chiết từng chủng nấm. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ  Kết luận Qua các kết quả thí nghiệm, chúng tôi đưa ra một số kết luận sau: 1. Đã phân lập được 312 chủng nấm sợi khác nhau từ RNM Cần Giờ. Trong đó có 114 chủng phân lập từ đất, 96 chủng phân lập từ lá, 102 chủng phân lập từ thân, cành. 2. Đã xác định được 183/312 chủng chiếm 58,65%. Trong đó: + 10/183 chủng sinh enzym mạnh chiếm 5,5% chủ yếu sống trong đất. + 6 /183 chủng sinh enzym khá mạnh chiếm 3,3% + 20/183 chủng sinh enzym trung bình chiếm 11%. + 147/183 chủng sinh enzym yếu chiếm 80,2%. Trên cơ sở đó tuyển chọn ba chủng có hoạt độ cellulase cao nhất là: chủng Đ’0 (55,70 IU/g), chủng Đ’3 (55,01 IU/g) và chủng Đ2b (53,10 IU/g). 3. Ba chủng nấm sợi tuyển chọn có nguồn gốc từ đất mặt ở RNM Cần Giờ được định danh như sau: - Chủng Đ’0 : Ascotricha guamensis Ames. - Chủng Đ’3 : Penicillium oxalicum Currie & Thom. - Chủng Đ2b : Aspergillus fumigatus Fresenius. 4. Đã xác định được điều kiện MT thích hợp cho sự sinh trưởng và sinh tổng hợp cellulase của ba chủng nấm sợi là: - Nguồn cacbon tốt nhất đối với chủng A. guamensis là 6C:4BM (56,88 IU/g), chủng P. oxalicum là 6C:4MD (56,56 IU/g), chủng A. fumigatus là 6C:4GL (60,80 IU/g). - Nguồn nitơ tốt nhất là NH4NO3. - Độ pH= 6-7. - Độ ẩm MT 55-70% - Độ mặn thích hợp nhất là 3%. - Nhiệt độ thích hợp nhất là 300C. - Thời gian thu enzym tốt nhất là 36- 48 giờ. 5. Kết quả nghiên cứu đặc tính sinh học của ba chủng nấm sợi cho thấy ngoài enzym cellulase, chúng còn có khả năng sinh cả 3 loại enzym là protease, amylase, kitinase. Mạnh nhất là kitinase (24mm). Có khả năng đối kháng với 2 loại VSV kiểm định (G+, G-) là E. coli, B. subtilis. 6. Bước đầu thử nghiệm sử dụng dịch chiết enzym cellulase thô từ ba chủng nấm sợi vào việc đường hóa giấy in, giấy báo cũ cho thấy sự phối hợp của ba chủng với tỉ lệ 1:1:1 cho kết quả cao nhất; Đồng thời, chúng còn có khả năng chuyển hóa nhanh rơm rạ thành mùn làm phân bón cho cây trồng, phân ủ được đánh giá đạt hiệu quả cao đối với dịch chiết hỗn hợp (112,5%). Như vậy, sử dụng phối hợp cả ba chủng nấm sợi sẽ cho hiệu quả cao. Tuy nhiên, trong ba chủng nấm sợi nghiên cứu ta thấy chủng A. guamensis rất phù hợp với điều kiện khí hậu Việt Nam và có hoạt độ CMCase cao nhất so với hai chủng còn lại. Trong bước đầu thử nghiệm sử dụng thì chủng này cũng cho kết quả cao hơn. Do đó, ta có thể chọn chủng A. guamensis nghiên cứu thêm để có thể ứng dụng vào sản xuất.  Kiến nghị Nếu có điều kiện nên nghiên cứu thêm một số vấn đề để hoàn chỉnh đề tài hơn: - Tách chiết và tinh sạch enzym cellulase với hàm lượng và hoạt tính cao từ MT nuôi cấy thích hợp của các chủng. - Tiếp tục thử nghiệm ứng dụng enzym cellulase của ba chủng trên các nguồn cơ chất khác nhau để làm tăng hiệu quả ứng dụng của đề tài.