Luận văn Nghiên cứu khả năng sinh enzym protease của một số chủng nấm sợi phân lập từ rừng ngập mặn Cần Giờ

222 chủng trên chúng tôi chọn ra được 6 chủng NS sinh enzym mạnh và khá mạnh để nghiên cứu tiếp Tuyển chọn lần 2 Để đánh giá chính xác khả năng sinh protease của 6 chủng làm cơ sở cho sự tuyển chọn tiếp theo, chúng tôi tiến hành xác định hoạt độ protease của 6 chủng theo phương pháp Anson. Bảng 3.3: Hoạt độ protease của 6 chủng NS tuyển chọn STT Kí hiệu chủng Nguồn gốc phân lập Hoạt tính protease D-d (mm) Hoạt độ protease (UI/ml) 1 TM217 Thân mục 24,0 0.88 2 Đ238 Đất mặt 24,5 1.071 3 C-Ư68 MT có chất cảm ứng 26,0 1.259 4 C-Ư32 MT có chất cảm ứng 25,0 0.951 5 C-Ư46 MT có chất cảm ứng 22.5 0.702 6 C-Ư25.1 MT có chất cảm ứng 21,0 0.589 Phân tích số liệu từ bảng 3.3 cho thấy kết quả định tính và định lượng enzym này của 06 chủng là thống nhất nhau. Trong đó một chủng có hoạt độ enzym cao nhất là C-Ư 68( 1,259 mol/ml ), có khả năng sinh trưởng tốt nhất và có nguồn gốc từ MT có chất cảm ứng. Như vậy để tuyển chọn nhanh các chủng NS sinh protease có thể sử dụng MT có chất cảm ứng là bột đậu nành. Từ đó chúng tôi quyết định chọn chủng C-Ư 68 để đi sâu nghiên cứu. Kết quả này được minh họa trong hình 3.1 và biểu đồ 3.1 và 3.2 Hình 3.1 Vòng phân giải casein của 6 chủng NS sinh protease mạnh Biểu đồ 3.1 Hoạt độ protease của 6 chủng NS Đ 238 C-Ư 46 C-Ư 25.1 C-Ư 68 C-Ư32 TM 217 Biểu đồ 3.2 Đường kính vòng phân giải protase của 6 chủng Kí hiệu chủng H o aï t ñ o ä p ro te as e ( U I/ m l) Kí hiệu chủng H o aï t ñ o ä p ro te as e ( U I/ m l) 2. Nghiên cứu đặc điểm hình thái và phân loại Nhằm bước đầu xác định được tên chi của chủng NS tuyển chọn, chúng tôi tiến hành theo phương pháp 2.2.1.4. Cấu trúc đại thể NS được quan sát dưới kính lúp 3 chiều. Cấu trúc vi thể NS được quan sát dưới KHV. Dựa vào đặc điểm khoá phân loại đến chi của các tác giả Robert A. Samson, Allen S. Heekstra, Jens C. Frisvad (2004) và Bùi Xuân Đồng (năm 2004). Kết quả trình bày ở bảng 3.4 Bảng 3.4: Các đặc điểm tương ứng để phân loại đến chi của chủng C-Ư 68 Đặc điểm hình thái chủng NS Các đặc điểm phân theo Bùi Xuân Đồng (2004) Xếp loại thuộc chi - Khuẩn lạc: Tròn, mặt phải lúc đầu màu trắng có sợi mịn như nhung về sau chuyển dần sang màu xanh rồi đến vàng hoa cau. Mặt trái lúc đầu trắng sau chuyển sang nâu vàng. Không tiết sắc tố. Mép khuẩn lạc xẻ rảnh nhỏ, sợi nấm mọc tỏa tròn - Sợi nấm màu xanh lục có vách ngăn, phân nhánh. - Cuống sinh BT không phân nhánh - Bọng hình chùy, hình cầu. - Thể bình một tầng hoặc hai tầng. - BT trần hình cầu không có vách ngăn. - Khuẩn lạc màu lục xám, xanh xám, xám, lục, lục vàng, lục nâu, nâu đen, trắng, vàng. - Sợi nấm có vách ngăn, phân nhánh, không màu hoặc màu nhạt. - Bộ máy mang BT không nhánh - Giá BT phát triển từ tế bào chân, không có hoặc có ít vách ngăn. - Bọng hình chuỳ, hình elíp, hình nữa cầu hoặc hình cầu. - Thể bình một tầng hoặc hai tầng. - BT trần không có vách ngăn, mặt ngoài nhẵn hoặc có gai, hoăc có nốt sần. Aspergillus Kết quả so sánh đặc điểm hình thái đại thể, vi thể chủng NS với đặc điểm tương ứng trong khóa phân loại của Bùi Xuân Đồng năm 2004, chúng tôi kết luận chủng này thuộc chi Aspergillus. Sau đó, chúng tôi tiến hành định danh đến loài của chủng NS trên bằng phương pháp giải trình tự gen 28S rRNA tại Phòng xét nghiệm NK-Biotek công ty Nam Khoa (793/58 Trần Xuân Soạn, Phường Tân Hưng, Q7 TP.HCM ) Kết quả giải trình tự gen 28S rRNA như sau: GCGTCCGTGCCGAAGCGCGTTCCTCGGTCCAGGCTGGCCGCATTGCACTCCCGG CTAAAGGTGCCCCGGAGGGCACTCATTCCGGGAGCCTTTGACCGGCCGCCCAAC CGACGCTGGCCCGCCCCCAGGGAAGTACACCGGCACGAATGCCGGCTGAACCCT GGAGGCGAGTCTGGTCGAAGCGCTTCCCTTTAAAATTTCAC Trình tự này được đem đối chiếu với trình tự 28S rARN của các NS đã được định loại trong ngân hàng gen BLAST. Kết quả đối chiếu cho thấy chủng C-Ư 68 thuộc loài Aspergillus oryzae với độ chính xác là 100% 3.3 Khảo sát các yếu tố MT ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và tổng hợp protease của chủng A. oryzae 3.3.1 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của NS. Hình 3.3 Hệ sợi nấm và cuống sinh bào tử chủng C-Ư 68 . a b Hình 3.2 Hình thaùi maët phaûi (a) vaø maët traùi (b) cuûa KL chuûng C-Ö 68 a. Ảnh hưởng nguồn cacbon Nhằm mục đích xác định nguồn cacbon thích hợp cho sự sinh trưởng của chủng NS đang nghiên cứu, chúng tôi tiến hành theo phương pháp 2.2.2.3. Mẫu đối chứng nguồn cacbon là glucose. Kết quả trình bày ở bảng 3.5 Bảng 3.5: Ảnh hưởng nguồn cacbon đến sự sinh trưởng của chủng A. oryzae Nguồn cacbon Đường kính KL của A. oryzae (mm) Đối chứng 29 Lactose 22.5 Sucrose 26 Sorbitol 22 Maltose 22.5 Kết quả ở bảng 3.5 cho thấy chủng A.oryzae sinh trưởng tốt ở các MT có nguồn cacbon khác nhau, tuy nhiên NS ở mẫu đối chứng có nguồn cacbon là glucose phát triển mạnh nhất và sự sinh trưởng giảm dần ở mẫu sucrose  maltose  lactose  sorbitol. Sở dĩ NS ở mẫu có nguồn cacbon là glucose phát triển mạnh nhất do glucose là nguồn cacbon đơn giản dễ sử dụng với hầu hết các VSV trong đó có NS . RNM Cần Giờ là nơi có nhiều xác thực vật, glucose có trong thành phần của thực vật và NS sống ở đây sẽ sử dụng nguồn cacbon này. Như vậy glucose là nguồn cacbon thích hợp cho A. oryzae sinh trưởng. Kết quả này được minh họa trong đồ thị 3.2 0 10 20 30 Glucose Lactose Sucrose Sorbitol Maltose Nguồn cacbon Đ K k h u ẩ n l ạ c (m m ) Đồ thị 3.1 Ảnh hưởng của nguồn cacbon lên sự sinh trưởng của chủng A.oryzae b. Ảnh hưởng của nguồn nitơ Mục đích của thí nghiệm này xác định nguồn nitơ thích hợp cho sự sinh trưởng của NS đang nghiên cứu. Chúng tôi tiến hành nuôi chủng NS theo phương pháp 2.2.2.3. Mẫu đối chứng nuôi trên MT có nguồn nitơ NaNO3. Kết quả trình bày ở bảng 3.6 Bảng 3.6: Ảnh hưởng nguồn nitơ đến sự sinh trưởng của chủng A.oryzae Nguồn nitơ Đường kính KL (mm) NaNO3 (ĐC) 29 NH4NO3 25 Bột đậu nành 34 Casein 23 Cao thịt 21 Kết quả từ bảng 3.6 cho thấy chủng A.oryzae có thể đồng hóa được các nguồn nitơ vô cơ và hữu cơ khác nhau, trong đó NS ở mẫu có bột đậu nành sinh trưởng mạnh hơn mẫu đối chứng khoảng 17,2%. Ở MT bổ sung bột đậu nành, KL mọc tốt và có màu sắc rất đẹp, đặc trưng của chủng A.oryzae. Do đó, chúng tôi cho rằng bột đậu nành là nguồn nitơ thích hợp cho sự sinh trưởng của chủng A.oryzae. Vì đây là nguồn nitơ mà ngay từ đầu chúng tôi đã chọn làm chất cảm ứng để phân lập nhanh những chủng NS có khả năng sinh protease cao. Mặt khác bột đậu nành là nguồn nitơ tự nhiên dễ kiếm và rẻ tiền, thích hợp cho việc nuôi cấy NS sinh enzym với số lượng lớn. Kết quả này phù hợp với nghiên cưú của Lê Thị Cẩm Tú ( 2003) là A.oryzae sinh trưởng tốt nhất trên nguồn nitơ là bột đậu nành. 0 5 10 15 20 25 30 35 NH4NO3 Bột đậu nành Casein Cao thịt Biểu đồ 3.3 Ảnh hưởng của nguồn nitơ lên sự sinh trưởng của chủng A.oryzae c. Ảnh hưởng của pH Cũng như nguồn cacbon và nitơ, pH là yếu tố ảnh hưởng mạnh đến sinh trưởng của NS. Để xác định độ pH thích hợp cho sự sinh trưởng của NS chúng tôi tiến hành theo phương pháp 2.2.2.3. Kết quả trình bày ở bảng 3.7 Đ K k hu ẩn l ạc ( m m ) Nguồn nitơ NH4NO3 Bảng 3.7 Ảnh hưởng của pH đến sự sinh trưởng của chủng A.oryzae pH Đường kính KL A. oryzae (mm) 6.5(ĐC) 27.5 4.0 8 4.5 14 5.0 19 5.5 23 6.0 25.5 6.5 27,5 7.0 26 7.5 24.5 8.0 23.5 Kết quả từ bảng 3.7 cho thấy chủng A.oryzae có thể hoạt động ở khoảng pH rất rộng từ 4.0 - 8.0. Ttuy nhiên, chủng NS này sinh trưởng mạnh trong khoảng pH từ 6.0-7.0 tốt nhất ở pH = 6.5 ( bằng với đối chứng) đồng thời sinh trưởng giảm dần ở pH dưới 6.0 và trên 7.0 . Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Mai Thị Hằng về pH của RNM Nam Định, Thái Bình dao động từ 6.5 -7.4 [12]. d. Ảnh hưởng của nhiệt độ Để xác định nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trưởng của NS đang nghiên cứu, chúng tôi tiến hành theo phương pháp 2.2.2.3. Kết quả trình bày ở bảng 3.9 Bảng 3.9: Ảnh hưởng nhiệt độ đến sự sinh trưởng của chủng A.oryzae Nhiệt độ (0C) Đường kính KL (mm) 30(ĐC) 31 25 13 30 31.5 Đồ thị 3.2 Ảnh hưởng của pH lên sự sinh trưởng của chủng A. oryzae Kết quả ở bảng 3.9 cho thấy ở nhiệt độ 500C chủng A.oryzae gần như không sinh trưởng được, vậy A. oryzae không phải là chủng ưa nhiệt. Trong khoảng nhịêt độ 300C - 350C A.oryzae sinh trưởng mạnh. Ở nhiệt độ 250C A.oryzae sinh trưởng yếu. Kết quả này phù hợp với đặc điểm sinh thái RNM Cần Giờ vì nơi đây biên độ nhiệt trong ngày dao động từ 5 – 70C, nhiệt độ trung bình 25,80C, nhiệt độ thấp tuyệt đối 18,80C, nhiệt độ cao tuyệt đối 350C [35]. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Nguyễn Thị Lan Hương ( 2009) khi khảo sát về ảnh hưởng của nhiệt độ lên sinh trưởng của A. oryzae . Đồ thị 3.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự sinh trưởng của A.oryzae e. Ảnh hưởng của thời gian Nhằm xác định khoảng thời gian A.oryzae sinh trưởng tốt nhất Chúng tôi tiến hành theo phương pháp 2.2.2.3. Kết quả trình bày ở bảng 3.10 Bảng 3.10: Ảnh hưởng của thời gian đến sự sinh trưởng của chủng A.oryzae 35 29 40 27 45 15 50 1 Qua kết quả ỏ bảng trên chúng ta thấy từ ngày 1 đến ngày 3, chủng A .oryzae sinh trưởng nhanh và tạo nên KL có kích thước lớn. Đến ngày thứ 3 trở đi là thời gian bắt đầu sinh bào tử, thì sự sinh trưởng của chủng này chậm hẳn lại Điều này phù hợp với nhiều kết quả nghiên cứu về thời gian sinh trưởng của chủng A.oryzae của các tác giả Nguyễn Lân Dũng ( 2000), Đoàn Văn Thược (2005), Löông Ñöùc Phaåm (2006) là chủng A.oryzae sinh trưởng nhanh trong 3 ngày đầu nuôi cấy. Đồ thị 3.4 Ảnh hưởng của thời gian lên sự sinh trưởng của chủng A.oryzae f. Ảnh hưởng của độ mặn Độ mặn là yếu tố rất quan trọng có ảnh hưởng lớn đến sự sinh trưởng và phát triển của các NS ở RNM Cần Giờ. Điều này càng đặc biệt hơn với các NS thuộc nhóm ưa mặn. Để xác định độ mặn thích hợp cho sự sinh trưởng của NS đang nghiên cứu, chúng tôi tiến hành theo phương pháp 2.2.2.3. Kết quả trình bày ở bảng 3.11 Bảng 3.11: Ảnh hưởng độ mặn đến sự sinh trưởng của chủng A.oryzae Thời gian (giờ) Đường kính KL A.oryzae (mm) 24 7 48 21 72 30 96 36 120 40 144 42 168 43 Khả năng chịu mặn là một đặc trưng của nấm sợi RNM Cần Giờ. Kết quả ở bảng 3.11 cho thấy chủng A.oryzae đều sinh trưởng tốt trên MT cả nước ngọt lẫn nước mặn. Ở MT có độ mặn 3% A.oryzae sinh trưởng mạnh hơn đối chứng 0% nhưng khi độ mặn tăng trên 3% thì sinh trưởng giảm dần. Điều này chứng tỏ đây là chủng NS chịu mặn, có nguồn gốc từ đất liền đưa tới lâu dần thích ứng với môi trường nước lợ ở RNM Cần Giờ. Như vậy, độ mặn thích hợp cho A.oryzae sinh trưởng là 3% phù hợp với điều kiện sinh thái ở RNM Cần Giờ. Vì nơi đây độ mặn trung bình từ 1,5 – 2,5% .Kết quả này cũng phù hợp với nhiều kết quả nghiên cứu khác về độ mặn tốt nhất cho sự sinh trưởng của A.oryzae của Khưu Phương Yến Anh (2007), Nguyễn Thị Lan Hương(2009), Võ Thị Bích Viên ( 2009) là 3%. Đồ thị 3.5 Ảnh hưởng của độ mặn lên sự sinh trưởng của A.oryzae Dưới đây là bảng tổng hợp các điều kiện thích hợp cho sự sinh trưởng của A.oryzae Độ mặn (%) Đường kính KL (mm) ĐC(0) 25 1 27 2 31 3 35 4 32 5 26 6 24 7 23 Bảng 3.12 : Các điều kiện MT thích hợp cho sự sinh trưởng của A.oryzae Kết luận: Chủng A.oryzae sinh trưởng nhanh, KL lớn và thích nghi với môi trường nước lợ ở RNM . Nguồn gốc của chủng này có thể từ đất liền đưa tới 3.4.2 Nghiên cứu các yếu tố MT ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp protease của chủng A.oryzae a. Ảnh hưởng của MT nuôi cấy. Để tìm ra MT thích hợp nhất cho khả năng sinh protease của chủng A.oryzae, chúng tôi tiến hành xác định hoạt độ protease của chủng NS nghiên cứu với các loại MT sau: - Môi trường M1 gồm: Cám : trấu : cao thịt – tỉ lệ ; 70%: 25%: 5% - Môi trường M2 gồm: Cám : trấu : casein - tỉ lệ ; 70%: 25%: 5% - Môi trường M3 gồm: Cám : trấu - tỉ lệ ; 70%: 30%: - Môi trường M4: cám : trấu : cao nấm men - tỉ lệ ; 70%: 25%: 5% - MT5 ( MT đối chứng): Cám : trấu : đậu nành – tỉ lệ ; 70%: 25%: 5%. Nuôi cấy chủng đạt đến độ trưởng thành, xác định hoạt độ protease theo phương pháp Anson. Kết quả trình bày ở bảng 3.13 Bảng 3.13: Ảnh hưởng của MT nuôi cấy đến hoạt độ protease của A.oryzae Ký hiệu MT MT5 ( ĐC) MT1 MT2 MT3 MT4 Hoạt độ protease ( UI/ml) 1.277 0.989 1.089 1.173 1.223 Từ kết quả ở bảng 3.13 cho thấy hoạt độ protease của A.oryzae đều cao trên các loại MT khác nhau. Điều đó cho thấy nguồn cacbon mà A.oryzae sử dụng tổng hợp protease rất phong phú. Các yếu tố khảo sát Các điều kiện thích hợp Đường kính KL (mm) Nguồn cacbon (g) Glucose 29 Nguồn nitơ (g) Bột đậu nành 29 pH 6.5 27,5 Nhiệt độ (0C) 30 31.5 Thời gian(giờ) 48-72 21-30 Độ mặn (%) 3 35 Ở thí nghiệm này, hoạt độ protease của A.oryzae cao nhất trên MT5 có chất cảm ứng là bột đậu nành, còn ở các MT khác A.oryzae có hoạt lực thấp hơn. Nguyên nhân do bột đậu nành là chất cảm ứng được chúng tôi đưa vào ngay từ lúc lấy mẫu nhằm nhanh chóng chọn được chủng có khả năng sinh protease cao, và A.oryzae là chủng thu được từ MT có chất cảm ứng có hoạt độ protease cao nhất trong số các chủng thu được từ RNM Cần Giờ. Từ đây chúng tôi chọn MT5 làm MT nuôi A.oryzae sinh protease trong các nghiên cứu tiếp theo. Kết quả nghiên cứu phù hợp với Lê Thị Cẩm Tú (2003) chọn MT bột đậu nành nuôi cấy A.oryzae thu protease có hoạt độ cao. Ngoài ra, chúng tôi nhận thấy trên MT có nguồn nitơ là bột đậu nành thì A. oryzae sinh trưởng mạnh hơn các nguồn nitơ khác. Như vậy đối với chủng A. oryzae mà chúng tôi tuyển chọn thì nguồn thức ăn nitơ là bột đậu nành là phù hợp cho sự sinh trưởng và sinh tổng hợp protease của chủng . 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 MT1 MT2 MT3 MT4 MT5 MT nuôi cấy Biểu đồ 3.4 Ảnh hưởng của MT nuôi cấy lên hoạt độ protease của A.oryzae b. Ảnh hưởng của thời gian Thời gian là yếu tố ảnh hưởng rất lớn đến khả năng tạo enzym của NS. Để xác định thời gian thích hợp nhất cho khả năng sinh protease của chủng A.oryzae, chúng tôi tiến hành thí nghiệm theo phương pháp 2.2.2.4 . Kết quả trình bày ở bảng 3.14 Bảng 3.14: Ảnh hưởng của thời gian đến hoạt độ protease của A.oryzae Thời gian (h) 24 36 48 60 72 Hoạt độ protease ( UI/ml) 0.821 0.890 1.391 1.249 1.152 Từ kết quả trên cho thấy chủng A. oryzae có họat độ protease cao nhất ở 48 giờ nuôi cấy. Vì trong khoảng thời gian đầu A. oryzae sinh trưởng rất mạnh, thời kì này enzym cũng được tạo thành. Đến giai đoạn bắt đầu tạo bào tử enzym được tổng hợp mạnh nhất [21]. Về sau quá trình trao đổi chất vẫn tiếp tục nhưng yếu dần nên tốc độ sinh trưởng chậm dần và việc tạo thành enzym của tế bào vẫn tiếp tục nhưng ít dần. Kết quả phù hợp với nghiên cứu của Lê Thị Cẩm Tú (2003) về H o ạt đ ộ p ro te as e (U I/ m l) thời gian sinh enzym cao nhất của chủng A. oryzea là 48 giờ. Kết quả này được minh họa bằng biểu đồ 3.5 . 0 0.5 1 1.5 24 36 48 60 72 Thời gian (h) Biểu đồ 3.5 Ảnh hưởng của thời gian lên hoạt độ protease của A.oryzae c. Ảnh hưởng của pH Thí nghiệm này được tiến hành theo phương pháp 2.2.2.4, dùng HCl 5% hoặc NaOH 5% điều chỉnh pH MT về các giá trị: 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5 8.0. Nhằm xác định pH thích hợp cho sinh tổng hợp protease của chủng A.oryzae. Kết quả trình bày bảng 3.15 Bảng 3.15: Ảnh hưởng của pH lên hoạt độ protease của A. oryzae pH 6.5 (ĐC) 5.0 5.5 6.0 7.0 7.5 8.0 Hoạt độ protease ( UI/ml) 1.163 1.007 1.046 1.188 1.383 0.99 0.98 Từ kết quả trên cho thấy chủng A. oryzae có hoạt độ protease cao trong khoảng pH từ 6.0 - 7.0 và cao nhất như ở pH = 7.0. Còn các mẫu ở pH dưới 6.0 và trên 7.0 đều có hoạt độ protease thấp hơn. Theo tác giả Mai Thị Hằng thì pH ở RNM dao động từ 6.5-7.4, với khoảng pH này thì NS sinh trưởng tốt, hơn nữa đối với chủng A. oryzae thì sinh trưởng và tạo enzym tỉ lệ thuận với nhau. Kết quả trên cũng phù hợp với các nghiên cứu của nhiều tác giả khác như Trần Thạnh Phong ( 2004), Lê Thị Cẩm Tú ( 2003) cho rằng A. oryzae có protease hoạt động mạnh ở MT axit hơi trung tính. Ở pH quá thấp hay quá cao hoạt độ enzym sẽ giảm mạnh. Nguyên nhân do pH quá thấp hay quá cao sẽ làm bất hoạt một số protease và làm cố định enzym này bên trong khuẩn ty nấm, enzym không tiết ra ngoài sợi nấm nên hoạt độ giảm [22]. H o ạt đ ộ p ro te as e( U I/ m l) Đồ thị 3.6 Ảnh hưởng của pH lên hoạt độ protease của A.oryzae d. Ảnh hưởng của nhiệt độ Thí nghiệm này được tiến hành theo phương pháp 2.2.2.4. Nuôi cấy chủng A. oryzae để ở các nhiệt độ khác nhau 200C, 250C, 300C, 350C, 400C, 450C, 500C nhằm xác nhiệt độ thích hợp cho sinh tổng hợp protease của chủng A. oryzae. Kết quả trình bày bảng 3.16 Bảng 3.16: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ protease của chủng A.oryzae Nhiệt độ ( 0C) 30 ( ĐC) 20 25 35 40 45 50 Hoạt độ protease ( UI/ml) 1.090 0.701 0.740 1.212 0.850 0.589 0.154 Từ kết quả bảng trên cho thấy, khoảng nhiệt độ 30-350C chủng A.oryzae có hoạt độ proteaes cao. Ở nhiệt độ 350C có hoạt độ cao hơn so với mẫu đối chứng. Mặt khác kết quả khảo sát về ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng của chủng A.oryzae thì ở khoảng nhiệt độ này thích hợp cho chủng A.oryzae sinh trưởng mạnh. Hơn nữa chủng A.oryzae mà chúng tôi đang nghiên cứu có quá trình sinh trưởng và tạo enzym xảy ra đồng thời. Như vậy chủng A.oryzae sinh trưởng mạnh ở 300C và có hoạt lực protease cao ở nhiệt độ 350C. Sở dĩ có kết quả như vậy là do khi nhiệt độ tăng lên trong giới hạn cho phép thì kéo theo các quá trình trao đổi chất cũng diễn ra nhanh hơn, trao đổi chất cần có enzym nên lúc này enzym được tạo ra nhiều dẫn đến hoạt lực tăng cao. Kết quả này phù hợp với đặc điểm sinh thái RNM Cần Giờ vì nơi đây biên độ nhiệt trong ngày dao động từ 5 – 70C, nhiệt độ trung bình 25,80C, nhiệt độ thấp tuyệt đối 18,80C, nhiệt độ cao tuyệt đối 350C [35]. 0 0.5 1 1.5 5 5.5 6 6.5 7 7.5 8 pH H o aï t ñ o ä p o te as e (U I/ m l) 0 0.5 1 1.5 20 25 30 35 40 45 50 Nhiệt độ ( C) Biểu đồ 3.6 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt độ protease của A.oryzae e. Ảnh hưởng của độ mặn Nhằm xác định độ mặn thích hợp cho quá trình tổng hợp protease của chủng A.oryzae chúng tôi tiến hành theo phương pháp 2.2.2.4. Nuôi cấy chủng A.oryzae ở các MT có độ mặn khác nhau 0%, 1%, 2%, 3%, 4% . Kết quả trình bày ở bảng 3.17 Bảng 3.17 Ảnh hưởng của độ mặn đến hoạt độ protease của A.oryzae Độ mặn (%) 0 1 2 3 4 Hoạt độ protease (UI/ml) 1.187 1.296 1.399 1.416 1.363 Từ kết quả ở bảng 3.17 cho thấy chủng A.oryzae có hoạt độ protease khá cao ở MT không có NaCl, nhưng cao nhất ở MT có nồng độ muối 3%. Kết quả này phù hợp với điều kiện sinh thái của RNM Cần Giờ vì nơi đây có độ mặn trung bình từ 1,5 – 2,5% . Ở độ mặn 3% chủng A.oryzae sinh trưởng rất mạnh.Vậy độ mặn thích hợp cho chủng A.oryzae sinh protease là 3%. Kết quả phù hợp với nghiên cứu của Khưu Phương Yến Anh (2007). Nguyễn Thị Lan Hương (2009) khi nghiên cứu ảnh hưởng của độ mặn sinh trưởng và tạo enzym của A.oryzae là 3%. H o ạt đ ộ P ro te as e (U I/ m l) 1 1.2 1.4 1.6 0 1 2 3 4 Độ mặn(%) Biểu đồ 3.7 Ảnh hưởng của độ mặn lên khả năng sinh protease của A.oryzae f. Ảnh hưởng của độ ẩm Để tìm ra độ ẩm thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp protease của chủng NS nghiên cứu, chúng tôi tiến hành theo phương pháp 2.2.2.4. Xác định hoạt độ protease của chủng trên các MT có độ ẩm khác nhau: 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% . Kết quả trình bày ở bảng 3.18 Bảng 3.18 Ảnh hưởng của độ ẩm đến khả năng sinh protease của chủng A.oryzae Độ ẩm (%) 45 50 55 60 65 70 Hoạt độ protease UI/ml) 1.180 1.224 1.280 1.047 0.846 0.836 Từ kết quả trên cho thấy chủng A. oryzae có hoạt độ protease mạnh nhất ở độ ẩm 55%. Chúng ta đã biết, độ ẩm là yếu tố rất quan trọng đối với sự lên men bề mặt. Vì nếu nuôi cấy trên khay hở độ ẩm trên 60% vi khuẩn dễ phát triển, dễ gây tạp nhiễm, khó thông khí. Đặc biệt ở độ ẩm 75%, MT bị bết lại vì quá nhiều nước làm NS sinh trưởng rất yếu nên hoạt độ enzym giảm rất mạnh còn độ ẩm là 45 - 50 % thì MT quá khô, NS sinh bào tử mạnh và làm giảm hoạt tính của enzym tạo thành. Như vậy để chủng A. oryzae có hoạt độ protease cao ta nên nuôi ở MT có độ ẩm 55%. Kết quả phù hợp với nghiên cứu của Lê Thị Cẩm Tú (2003) , Nguyễn Thị Lan Hương ( 2009) độ ẩm thích hợp cho sự tạo enzym của A. oryzae là 55%. H o ạt đ ộ p ro te as e( U I/ m l) 0 0.5 1 1.5 45 50 55 60 65 70 Độ ẩm (%) Đồ thị 3.7 Ảnh hưởng của độ ẩm lên sự tạo enzym protease của A.oryzae Dưới đây là bảng tổng hợp các điều kiện tối ưu cho quá trình tổng hợp protease của chủng A.oryzae Bảng 3.19: Tổng hợp các điều kiện thích MT hợp cho quá trình tổng hợp protease của chủng A.oryzae Các yếu tố khảo sát Các điều kiện thích hợp Hoạt độ (UI/ml) H o ạt đ ộ p ro te as e( U I/ m l) 3.4.3. Động thái quá trình sinh tổng hợp protease của A.oryzae Tiến hành nuôi cấy chủng A.oryzae ở những điều kiện thích hợp đã khảo sát ở trên và nghiên cứu động thái quá trình sinh tổng hợp protease với 3 thông số pH, nhiệt độ và hoạt độ của enzym tại các thời điểm 24h, 36h, 48h, 60h, 72h. Kết quả trình bày ở bảng sau: Bảng 3.20 Kết quả động thái quá trình sinh tổng hợp protease Thời gian (giờ) Các giá trị Nhiệt độ(0C) pH Hoạt độ (UI/ml) 0 30 6.5 0 24 30.5 6.6 0.511 36 34 6.8 0.876 48 33 7.2 1.391 60 32 8.1 1.332 72 31 7.4 0.983 Kết quả bảng 3.20 cho thấy tại thời điểm 48 đến 60 giờ, chủng A.oryzae cho hoạt độ protease có giá trị cao hơn hẳn so với các thời điểm khác. Đây chính là thời điểm thích hợp để thu enzym. Tương ứng với sự tăng hoạt độ enzym, pH của MT cũng tăng theo. Sau các thời điểm này thì hoạt độ enzym giảm rõ rệt. Tuy nhiên, theo thời gian pH ngày càng tăng. Điều này có thể giải thích do MT nuôi cấy sử dụng nguồn bột đậu nành bổ sung đã làm MT ngày càng chuyển sang trung tính, hơi ngã sang kiềm. Kết quả này cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu của Fenikxova, Silova ( 1960 ). Nhiệt độ của mẫu nuôi cấy cũng tăng theo thời gian, nhiệt độ tăng nhanh khoảng 24 -36 giờ đầu lúc này A.oryze sinh trưởng mạnh và bắt đầu tổng hợp enzym, sau 40 giờ nuôi cấy thì nhiệt độ giảm dần do A.oryze sinh trưởng chậm lại MT nuôi cấy (%) Cám : trấu : đậu nành tỉ lệ 70: 25: 5 1.277 pH 7.0 1.257 Nhiệt độ (0C) 35 1.214 Thời gian (h) 48 1.391 Độ mặn (%) 3 1.416 Độ ẩm (%) 55 1.282 Như vậy qua đồ thị động thái quá trình sinh tổng hợp proteae của chủng nghiên cứu cho thấy có sự tương quan thuận giữa hoạt độ protease với nhiệt độ và pH của MT. Đồ thị này khẳng định một lần nữa là thời gian thích hợp nhất để thu protease trong khoảng 48 – 60h, tốt nhất ở 48h. Kết quả này hoàn toàn thống nhất với kết quả khảo sát trong phần 3.4.2 (tr 66) của chúng tôi. Đồ thị 3.8 Động thái quá trình sinh tổng hợp protease của A.oryzae Tổng hợp kết quả trong phần 3.4.1 và 3.4.2 trong bảng sau Điều kiện nuôi cấy Sinh trưởng Sinh tổng hợp protease Nguồn cacbon (%) Glucose Cám gạo Nguồn nitơ (g) Bột đậu nành Bột đậu nành Nhiệt độ (0C) 30 35 Độ ẩm (%) 55 55 pH 6,5 7,0 Độ mặn (%) 3 3 Thời gian (h) 48-60 48 3.4.4 Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học khác của chủng A.oryzae a. Hoạt tính enzym ngoại bào Tiến hành theo phương pháp ở mục 2.2.1.5 để kiểm tra xem A.oryzae ngoài sinh protease ra còn có khả năng sinh các loại enzym ngoại bào khác nữa hay không. Kết quả trình bày ở bảng 3.21 Bảng 3.21 Hoạt tính enzym ngoại bào của chủng A.oryzae Chủng Hoạt tính enzym ngoại bào (D-d), mm Protease Cellulase Amylase Kitinase A.oryzae 26 18 8 19 Kết quả ở bảng 3.21. cho thấy chủng A.oryzae có khả năng sinh một số loại enzym ngoại bào khá cao. Các enzym trên đều là những enzym thủy phân giữ vai trò chủ đạo trong việc phân giải các chất hữu cơ trong tự nhiên. Các enzym này giúp NS dễ dàng phân giải nguồn cơ chất tự nhiên ở RNM Cần Giờ như xác động vật gồm các loài giáp xác, vỏ tôm cua đặc biệt là thảm TV, cung cấp nguồn nguyên liệu cho quá trình sống của chúng. Điều này cũng nhấn mạnh hơn nữa vai trò quan trọng của hệ NS đối với hệ sinh thái Cần Giờ. Hình 3.3 Hoạt tính protease Hình 3.4 Hoạt tính amylase Hình 3.5 Hoạt tính cellulase Hình 3.6 Hoạt tính kitinase b. Khả năng phân giải dầu Tiến hành thí nghiệm theo phương pháp ở mục 2.2.1.7. Cấy chủng A.oryzae trong bình tam giác 100ml có chứa 50ml MT khoáng MT8. Sau 15 ngày nuôi cấy tĩnh ở nhiệt độ phòng, sau đó quan sát sự sinh trưởng của A.oryzae, sự phân bố các giọt dầu và mùi dầu để đánh giá khả năng phân giải dầu của A.oryzae. Kết quả trình bày ở bảng 3.22 Bảng 3.22 Khả năng phân giải dầu của A.oryzae Chủng A.oryzae Khả năng phân giải dầu mg/ml 0 Từ kết quả trên cho thấy A.oryzae không có khả năng phân giải dầu, đây là một đặc tính quí nếu có sẽ góp phần làm sạch MT c. Hoạt tính đối kháng với VK kiểm định. Tiến hành theo phương pháp ở mục 2.2.1.8 nhằm khảo sát chủng A.oryzae có khả năng đối kháng với một số VK kiểm định hay không. Kết quả trình bày ở bảng 3.23 Bảng 3.23 Hoạt tính đối kháng của A.oryzae Chủng A.oryzae E.coli (D-d), mm B. subtillis (D-d), mm 0 9 Kết quả bảng 3.23 cho thấy A.oryzae chỉ có khả năng đối kháng được với VK gram dương (B. subtillis ) nhưng ở mức độ yếu và không đối kháng được với VK gram âm. Hình 3.7 Khả năng đối kháng với B. subtillis của chủng A.oryzae 3.4.5 Khảo sát một số đặc tính của enzym thô từ chuûng A.oryzae a. Thu nhận protease thô Sau khi nuôi chuûng A.oryzae trên MT ở các điều kiện thích hợp để sinh protease cao nhất , tiến hành thu enzym theo phương pháp ở mục 2.2.3 với các tác nhân tủa khác nhau. Kết quả trình bày ở bảng sau: Bảng 3.24 Thu nhận protease bằng các tác nhân tủa Tác nhân tủa Ethanol 960 Acetone (NH4)2SO4 Enzym/ DM (v/v) Hiệu suất thu nhận Enzym/ DM (v/v) Hiệu suất thu nhận Nồng độ Hiệu suất thu nhận 1:3 3.2g/100ml 1:2 2.9g/100ml 70% 2.7g/100ml Tiến hành thí nghiệm khảo sát với 0,1g chế phẩm protease thu được theo từng tác nhân tủa hòa tan trong 150ml nước cất. Đo hoạt độ protease bằng phương pháp Anson thu được kết quả như bảng sau: Bảng 3.25 Hoạt độ protease thô theo tác nhân tủa khác nhau Tác nhân tủa Hoạt độ protease (UI/g) Ethanol 960 1892,0 Acetone 1589.5 (NH4)2SO4 1254,0 Kết quả trên cho thấy sử dụng tác nhân tủa là ethanol 960 cho hiệu suất tủa cao nhất và đồng thời hoạt độ của enzym cũng được giữ lại cao nhất. Vì vậy trong các thí nghiệm sau chúng tôi sử dụng cồn ethanol 960 làm tác nhân tủa để nghiên cứu các tính chất của enzym thô. b. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt động của chế phẩm protease thô Chúng tôi tiến hành nuôi cấy chủng NS ở các điều kiện MT tối ưu như trên để thu được protease có hoạt độ cao nhất sau đó đo hoạt độ protease ở các nhiệt độ khác nhau: 300C, 400C, 500C, 600C, 700C, 800C theo phương pháp Anson. Bảng 3.26 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt động của chế phẩm protease thô Nhiệt độ (0C) 30 40 50 60 70 80 Hoạt độ protease của CP enzym thô (UI/ml) 0.912 1.312 0.815 0.803 0.427 0.064 Kết quả thu được ở bảng 3.26 cho thấy, protease hoạt động mạnh trong khoảng 30 đến 60oC. Hoạt động protease đạt giá trị cao nhất ở 40oC , kết quả này phù hợp với những công bố của Amos (1965), Liphsis và Bragnitsenko (1977) và Ashok Pandey và cộng sự (2000) về nhiệt độ tối thích cho sự hoạt động của protease thu từ NS. Đây cũng là thuận lợi để sử dụng enzym của chủng này trong việc bổ sung vào thức ăn chăn nuôi. Đồ thị 3.9 : Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt động của chế phẩm protease c. Độ bền nhiệt của protease thô. Nuôi cấy chủng NS ở điều kiện tối ưu. Dịch enzym thu được xử lý ở các nhiệt độ 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 1000C, sau đó đo hoạt độ protease so với đối chứng 40C để khảo sát độ bền của enzym với nhiệt độ. Bảng 3.27. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền của protease thô Nhiệt độ (oC) ĐC (4oC) 30 40 50 60 70 80 90 100 Hoạt độ protease còn lại (%) 100 100 99.1 83.5 77.6 62.1 18.9 9.8 0.0 Qua bảng 3.27 chúng ta thấy, nhiệt độ càng tăng cao thì hoạt tính protease càng giảm, đến 100oC thì enzym bị bất hoạt hoàn toàn. Hoạt tính protease của chủng vẫn cao nhất ở khoảng 30 đến 70oC, nhưng giảm mạnh từ khoảng 70, 80oC trở đi Qua đây, chúng ta thấy độ bền nhiệt của chủng với nhiệt độ cũng khá cao, phù hợp với nhận định của tác giả Nguyễn Đức Lượng là enzyme này thường bất hoạt từ 70oC trở đi [16]. Độ bền với nhiệt độ của protease thu được từ chủng NS này là ưu điểm cho việc sản xuất và nhất là ứng dụng trong bổ sung chế phẩm enzym vào thức ăn chăn nuôi (thường được ủ ở nhiệt độ cao trong nhiều giờ). 0 0.5 1 1.5 30 40 50 60 70 80 Nhieät ñoä (oC) H o a ït ñ o ä p ro te a se ( U I/ m l) Đồ thị 3.10 : Ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền của chế phẩm protease d. Ảnh hưởng của thời gian đến hoạt động của chế phẩm protease Chúng tôi tiến hành nuôi cấy chủng NS ở các điều kiện MT tối ưu như trên để thu được protease có hoạt độ cao nhất sau đó đo hoạt độ protease theo phương pháp Anson. ở các thời gian khác nhau:10’, 20’,30’, 40’, 50’, 60’, 70’, 80’, 90’, 100’. Kết quả trình bày ở bảng sau: Bảng 3.28 Ảnh hưởng của thời gian đến hoạt động của chế phẩm protease thô Thời gian (phút ) 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Hoạt độ protease UI/ml 1.002 1.523 1.686 1.733 1.740 1.762 1.760 1.760 1.754 1.753 Chủng A. oryzae có hoạt độ protease tăng nhanh từ 10 đến 30 phút và sau đó ổn định từ 40- 100 phút. Điều này cho thấy, protease của chủng NS này khá bền theo thời gian và có tiềm năng ứng dụng trong sản xuất công nghiệp. Đồ thị 3.11: Ảnh hưởng của thời gian hoạt động của chế phẩm protease e Ảnh hưởng của pH đến hoạt động của chế phẩm protease Chúng tôi tiến hành nuôi cấy chủng NS ở các điều kiện MT tối ưu như trên để thu được protease có hoạt độ cao nhất sau đó đo hoạt độ protease ở các pH khác nhau : 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5 theo phương pháp Anson. Kết quả trình bày ở bảng sau Bảng 3.29 Ảnh hưởng của pH đến hoạt động của chế phẩm protease pH 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 H o ạt đ ộ pr o te as e (U I/ m l) Hoạt độ protease (UI/ml ) 0.721 0.865 1.124 1.246 1.337 0.850 Bảng 3.29 cho thấy protease của chủng hoạt động mạnh ở pH axit hơi ngã sang trung tính. Hoạt động enzym tăng mạnh từ pH 6.0 đến 7.0, sau đó giảm dần ở pH =7.0 – 7.5. Kết quả này cũng phù hợp với nhận định của Nguyễn Đức Lượng [16] khi cho rằng pH tối thích cho hoạt động của protease NS là 5.5 đến 7.5. Đồ thị 3.12:Ảnh hưởng của pH đến hoạt động của chế phẩm protease Kết luận. Protease của A.oryzae hoạt động mạnh ở nhiệt độ 400C, pH tối thích là 7.0. Độ bền với thời gian của protease thu được từ chủng A.oryzae là 60 phút. Với các giá trị này thì chế phẩm protease của chủng A.oryzae có tiềm năng ứng dụng trong sản xuất công nghiệp. 3.4.6 So sánh hoạt độ protease của chủng A.oryzae với chế phẩm protease trên thị trường. Chế phẩm protease trên thị trường mà chúng tôi sử dụng để so sánh là enzym của Công ty TNHH dinh dưỡng Á Châu ( VN), địa chỉ: xã Bắc Sơn - huyện Thống Nhất - tỉnh Đồng Nai. Đây là loại chế phẩm enzym đang được sử dụng rộng rãi để bổ sung vào các sản phẩm thức ăn chăn nuôi. Tiến hành khảo sát với 0,1g chế phẩm protease mỗi loại hòa tan trong 150ml nước cất. Đo hoạt độ protease bằng phương pháp Anson thu được kết quả như bảng sau. Bảng 3.30 So sánh hoạt độ protease của A.oryzae với chế phẩm protease trên thị trường Loại enzym Hoạt độ (UI/g) Protease của chủng A.oryzae 1686.5 Protease trên thị trường 2458.5 H o ạt đ ộ p ro te as e( U I/ m l) Từ kết quả trên cho thấy protease của chủng A.oryzae phân lập từ RNM Cần Giờ khá tốt nhưng thấp hơn 1-2 lần chế phẩm protease trên thị trường. Điều này cũng dễ hiểu bởi vì chế phẩm enzym chuẩn dùng để so sánh đều là những enzym được thu được từ các chủng VSV có chọn lọc, gây đột biến và là enzym được sản xuất theo quy trình công nghệ nhằm bảo đảm hoạt tính enzym không bị giảm nhiều sau quá trình sản xuất. Ngoài ra, đây cũng là những chế phẩm dưới dạng cô đặc nên hoạt tính cũng tăng lên nhiều KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ KẾT LUẬN: Từ những kết quả trên, chúng tôi đưa ra một số kết luận sau: 1. Phân lập được 333 chủng NS khác nhau từ 4 xã RNM Cần Giờ 2. Xác định được 222/333 chủng có enzym protease chiếm 66.7% trong đó chủng mạnh: 2/222 chiếm 0.9%, khá mạnh: 9/222 chiếm 4.05%, trung bình: 53/222 chiếm 23.9%, yếu: 158/222 chiếm 71.15% Tuyển chọn một chủng có hoạt độ protease cao nhất là: C-Ư 68 (UI = 1.259) nghiên cứu tiếp 3. Kết quả định danh bằng phương pháp phân loại truyền thống kết hợp với phương pháp định danh bằng Di truyền phân tử cho thấy chủng C-Ư 68 thuộc loài Aspergillus oryzae 4. Đã xác định được điều kiện MT tối ưu cho chủng A.oryzae Sinh trưởng như sau: Nguồn Cacbon (g): glucose Nguồn Nitơ (g): bột đậu nành pH: 6.5 Nhiệt độ (0C): 30 Thời gian(giờ): 48-72 Độ mặn (%): 3 Sinh tổng hợp protease như sau: MT 5 có thành phần cám : trấu: bột đậu nành với tỉ lệ (%) 70 : 25: 5 pH: 7.0 Nhiệt độ (0C): 35 Thời gian( giờ): 48 Độ mặn (%): 3 Độ ẩm (%): 55 5. Chủng A. oryzae có khả năng sinh được 4 loại enzym ngoại bào là protease (mạnh), amylase (yếu ), cellulase và kitinase ( khá mạnh) . Ngoài ra Asperillus. oryzae còn có khả năng đối kháng với VK gram dương là B.subtilus. và không kháng được VK gram âm. 6. Để thu nhận chế phẩm enzym thô có thể dùng tác nhân tủa là Ethanol 960 Chế phẩm protease thô thu được từ chủng A. oryzae có độ bền ở nhiệt độ 30 - 40oC , độ bền về thời gian là 60 phút và pH = 7.0 . 7. So sánh hoạt độ protease của chủng A.oryzae với chế phẩm protease của Công ty TNHH dinh dưỡng Á Châu cho thấy hoạt độ của chủng A.oryzae đạt mức khá mạnh nhưng thấp hơn so với chế phẩm protease của Công ty TNHH dinh dưỡng Á Châu 1-2 lần. Loại enzym Hoạt độ (UI/g) Protease của nấm A.oryzae 1686.5 Protease trên thị trường 2458.5 ĐỀ NGHỊ Để có thể sớm đưa chủng này vào ứng dụng trong thực tiễn, tôi thấy cần được tiếp tục nghiên cứu các chỉ tiêu sau:  Khảo sát sâu các điều kiện tối ưu cho khả năng sinh tổng hợp enzym protease ở qui mô lớn hơn.  Bước đầu thử nghiệm chế phẩm trong việc xử lý trùn quế bổ sung vào thức ăn cho gia súc, gia cầm. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tieáng Vieät 1. Khưu Phương Yến Anh ( 2007), Nghiên cứu khả năng sinh enzym xellulase của một số chủng nấm sợi phân lập từ rừng ngập mặn Cần Giờ, Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trường ĐHSP Thành phố HCM 2. Kieàu Höõu Aûnh (1999),Giaùo t rình vi sinh vaät hoïc coâng nghie äp, NXB Khoa hoïc vaø Kyû thuaät Haø Noäi, trang 15-21 3. Nguyễn Ngọc Ân, Nguyễn Đình Cương, Nguyễn Đình Quý (1998), Hệ sinh thái rừng ngập mặn Cần Giờ và biện pháp quản lí, phát triển ,NXB Nông nghiệp Tp. Hồ Chí Minh 4. Trần Văn Ba, Phan Nguyên Hồng, Hoàng Thị Sản, Lê Thị Trễ, Nguyễn Hoàng Trí, Mai Sĩ Tuấn, Lê Xuân Tuấn (1997), Vai trò của rừng ngập mặn mặn Việt Nam, NXB Nông nghiệp Hà Nội, trang 78-96 5. Nguyễn Thị Kim Cúc(2001), Đánh giá hoạt tính CMCaza của một số chủng vi sinh vật phân hủy xellulose, Tạp chí sinh học, tháng 3 năm 2001, trang 37-43 6. Nguyeãn Laân Duõng, Phaïm Thò Traân Chaâu, Nguyeãn Thanh Hieàn, Leâ Ñình Löông, Ñoaøn Xuaân Möôïu, Phaïm Vaên Ty (1978),Moät soá phöông phaùp nghieân cöùu vi sinh hoïc (taäp 3) , NXB Khoa hoïc vaø Kyû thuaät Haø Noäi, trang 22-36 7. Nguyeãn Laân Duõng, Nguyeãn Ñình Quyeán, Phaïm Vaên Ty(2000), Vi sinh vaät hoïc (tập 1,2) NXB Đại học và Trung học chuyên nghiệp Hà Nội, trang 5-16 8. Nguyeãn Thaønh Ñaït(2005 ) Cô sôû sinh hoïc vi sinh vaät- taäp 2, NXB Ñaïi hoïc Sö phaïm, trang 28-31 9. Nguyeãn Thaønh Ñaït (chuû bieân), Mai Thò Haèng (2000), Sinh hoïc vi sinh vaät NXB Giaùo duïc, trang 17-22 10. Bùi Xuân Đồng (2000), Vi nấm dùng trong công nghệ sinh học, NXB Khoa hoïc kyõ thuaät Haø Noäi, trang 154-160, 184 -198 11. Nguyễn Vĩnh Hà, Mai Thị Hằng (2002), Khả năng diệt côn trùng của một số nấm sợi trong vùng rừng ngập mặn Giao thủy, Tổ CNSH-VS, Khoa Sinh –KTNN, Đại học Sư phạm Hà Nội 12. Mai Thị Hằng, Phan Nguyên Hồng (2002), Đánh giá vai trò của vi sinh vật trong hệ sinh thái Rừng ngập mặn, Trường ĐH Sư Phạm Hà Nội, trang 8-24, 101-128. 13. Nguyễn Thị Hiên (2005), Nghiên cứu phân loại các chủng thuộc chi Penicillium phân lập từ RNM Nam Định, Thái Bình, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trường ĐHSP Hà Nội, tr 5 – 15 14. Phan Nguyên Hồng (1994),” Nguyên nhân và Hậu quả của sự suy giảm tài nguyên môi trường RNM ở Việt Nam”, Hội thảo Quốc gia: Trồng và phục hồi Rừng ngập mặn ở Việt Nam- Cần Giờ, TP Hồ Chí Minh, 06-08/08-1994, trang 24-39. 15. Nguyễn Thị Lan Hương ( 2009), Phân lập, tuyển chọn một số chủng nấm sợi sinh amylase cao từ RNM Cần Giờ. Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trường ĐHSP Thành phố HCM 16. Nguyeãn Ñöùc Löôïng (2003), Thí nghiệm công nghệ sinh học tập 2, NXB ĐHQG Tp. Hồ Chí Minh, trang 108-116, 335-339 17. Löông Ñöùc Phaåm (2006) Coâng ng heä sinh hoïc t rong baûo quaûn v aø cheá bieán thöïc phaåm , NXB Haø Noäi , trang 262-277 18. Trần Thạnh Phong (2004), Khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzym cellulase từ Trichoderma reesei và Aspergillus niger trên môi trường lên men bán rắn . Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trường ĐHKHTN – TP.HCM 19. Phan Thanh Phương (2007), Khảo sát khả năng sinh kháng sinh của các chủng nấm sợi phân lập từ RNM Cần Giờ TP. Hồ Chí Minh, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trường ĐHSP, Tp Hồ Chí Minh, tr 90,91. 20. Nguyễn Xuân Thành, Nguyễn Bá Hiên, Hoàng Hải, Vũ Thị Hoan (2005), Giáo trình VSV học công nghiệp, NXB Giáo dục, trang 33-37. 21. Lưu Thị Bích Thảo,Nguyễn Quang Huy, Cù Việt Nga, Đặng Thị Cẩm Hà (2001), Khả năng phân giải Phenantrenen của ba chủng NS phân lập được tại một số vùng dầu bị ô nhiễm, Tạp chí Sinh học. 22. Phạm Thị Thanh Thuý (2007), Nghiên cứu khả năng phân giải Carbuahydro của một số chủng nấm sợi phân lập từ RNM Cần Giờ, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trường ĐH Sư phạm TP. Hồ Chí Minh, tr 85,86. 23. Trần Thanh Thuỷ (1998), Hướng dẫn thực hành VSV học, NXB Giáo dục. trang 54,70,71,85,168-172. 24. Nguyễn Hoàng Trí, Phan Nguyên Hồng (1995), “ Rừng ngập mặn Việt Nam, con người và HST phát triển bền vững”, NXB Nông nghiệp Hà Nội, trang 189-204. 25. Nguyễn Hoàng Trí (1999), Sinh thái học Rừng ngập mặn, NXB Nông nghiệp Hà Nội, trang 21-37, 128-138. 26. Lê Đức Tuấn (2006), Nghiên cứu sinh thái nhân văn khu dự trữ sinh quyển RNM Cần Giờ TP. Hồ Chí Minh, Luận án Tiến sĩ Trường ĐH Khoa Học tự nhiên, trang 47-68. 27. Lê Đức Tuấn (2002), Khu dự trữ sinh quyển RNM Cần Giờ, NXB Nông nghiệp TP. Hồ Chí Minh, trang 6-17. 28. Lê Ngọc Tú, La Văn Chứ, Phạm Trân Châu, Nguyễn Lân Dũng(1982), Enzym vi sinh vật tập 2, NXB- KHKT Hà Nội 29. Lê Thị Cẩm Tú (2003), Chọn chủng nấm mốc có hoạt tính phân giải protêin cao và chịu mặn . Luận văn thạc sĩ sinh học Trường Đại học KHTN – TP.HCM 30.Trần Cẩm Vân (2001), Giáo trình vi sinh vật môi trường, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội, trang 57-63. 31. Võ Thị Bích Viên( 2009) Khảo sát đặc điểm sinh học một số chủng nấm sợi thuộc chi Aspergillus và Penicillium từ Rừng ngập mặn Cần Giờ, Thành phố Hồ Chí Minh”. Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trường ĐHSP Tp Hồ Chí Minh Tiếng Anh 32. A.D.Agate C.V. Subramania M. Vannucci (1988), Mangrove microbiology, UNDP/UNESCO Regional Project RAS/86/1988, pp 9-18 33. Hawksworth DL (2006). “The fungal dimensi on of biodiversity: magnitude, significance, and conservation”. Mycol. Res. 95, pp 641–655. 34. Mueller G.M., Schmit J.P. (2006). “Fungal biodiversity: what do we know? What can we predict?”. Biodivers Conserv 16, pp 4 35. Katsuhiko Ando, (2002), Identification of Fungi Imperfecti, NITE Biological Resource Center National Intitute of Technology and Evaluation. 36. Dr. N. Rajendran - Research Officer Dr. S. Baskara Sanjeevi - Research Assistant, (2002), “ Mangroves of India” Environmental information system centre pp18 – 22. Trang Web 37. và Nguyễn Lân Dũng , Nguyễn Liên Hoa, Lê Hoàng Yến, Đào Thị Lương –000 38. 39. 40. 41. 42.. 43. 44. 45. 46. http: //www.cbs.knaw.nl (Ủy ban Quốc tế về Aspergillus và Penicillium) PHỤ LỤC Phụ lục 1: Kí hiệu 333 chủng nấm sợi phân lập được từ RNM Cần Giờ. Địa điểm lấy mẫu Kí hiệu chủng Đất mặt 45 chủng Đ238, Đ239, Đ242, Đ272, Đ267, Đ240, Đ246, Đ24, Đ244, Đ279, Đ48, Đ269, Đ7, Đ100, Đ11, Đ10, Đ273, Đ2, Đ9, Đ4, Đ234, Đ274, Đ275, Đ271, Đ277, Đ247, Đ34, Đ237, Đ49, Đ279, Đ241, Đ270, Đ4.1, Đ6, Đ5, Đ3, Đ8, Đ235, Đ39, Đ243, Đ249, Đ248, Đ276, Đ268, Đ151 Đất sâu 10cm 21 chủng ĐS77, ĐS79, ĐS266, ĐS253, ĐS253.1, ĐS46, ĐS46.1, ĐS1, ĐS255, ĐS256, ĐS256.1, ĐS260, ĐS262, ĐS263, ĐS265, ĐS258, ĐS259, ĐS267, ĐS261, ĐS262, ĐS43 Lá vàng 25 chủng L6, L90, L72, L67, L89, L91, L66, L74, L60, L76, L83, L90.1, L67.1, L3, L69, L63, L77, L95, L87, L63.1, L94, L71, L60.1, L64, L349 Lá mục 50 chủng LM122, LM108, LM120, LM122.1, LM138, LM125, LM89, LM131, LM136, LM137, LM191, LM117, LM1, LM110, LM61, LM204, LM112, LM1.1, LM109, LM105, LM78, LM132, LM44, LM86, LM75, LM118, LM78.1, LM27, LM115, LM11, LM99, LM130, LM113, LM124, LM102, LM96, LM123, LM58, LM106, LM139, LM48, LM49, LM155, LM129, LM116, LM43, LM101, LM111, LM29, LM78.1 Thân khô 31chủng TK146, TK147, TK144, TK141, TK1, TK2, TK145,TK143, TK344,TK53, TK140, TK142, TK145,TK208, TK195, TK43, TK30, TK216, TK192, TK229, TK172 Thân mục 70 chủng TM196, TM198, TM162, TM153, TM186, TM200, TM221, TM161, TM165, TM179, TM120, TM212, TM135, TM232, TM228, TM214, TM342, TM217, TM215, TM221, TM150, , TM1, TM53, TM201, TM174, TM197, TM207, TM178, TM167, TM151,TM164, TM187, TM169, TM149, TM160, TM163, TM158, TM189, TM156, TM209, TM45, TM20, TM142, TM179, TM312, TM211, TM302, TM210, TM193, TM21, TM231, TM202, TM61, TM140, TM226, TM218, TM223, TM152, TM225, TM45, TM222, TM333, TM213, TM203, TM230, TM1.5, TM179, TM37, TM168, TM184, MT có chất cảm ứng 101 chủng C-Ư16, C-Ư16.2, C-Ư9, C-Ư25.1, C-Ư13, C-Ư20.1, C-Ư32, C-Ư3, C-Ư20, C-Ư24.1, C-Ư1, C-Ư56, C-Ư68, C-Ư36.1, C-Ư23, C-Ư8, C-Ư20.2, C- Ư16.1, C-Ư24.1, C-Ư25.2, C-Ư29, C-Ư41, C-Ư45, C-Ư70, C-Ư35.1, C- Ư44, C-Ư50, C-Ư63, C-Ư35, C-Ư39, C-Ư29.2, C-Ư15, C-Ư14.1, C-Ư14, C-Ư12, C-Ư7, C-Ư3, C-Ư29.1, C-Ư33, C-Ư4, C-Ư6, C-Ư31, C-Ư11, C- Ư17,C-Ư18, C-Ư5.1, C-Ư90, C-Ư81, C-Ư89, C-Ư83, C-Ư82, C-Ư85, C- Ư88, C-Ư84, C-Ư80, C-Ư86, C-Ư87, C-Ư34.2, C-Ư44, C-Ư42, C-Ư57, C- Ư45, C-Ư54, C-Ư38, C-Ư53, C-Ư34.3, C-Ư48, C-Ư40, C-Ư41, C-Ư66, C- Ư62, C-Ư52, C-Ư34, C-Ư59, C-Ư64, C-Ư60, C-Ư71, C-Ư72, C-Ư75, C- Ư61, C-Ư36, C-Ư47, C-Ư46, C-Ư37, C-Ư5.2, C-Ư69, C-Ư74, C-Ư73, C- Ư51, C-Ư58, C-Ư25.1, C-Ư70.1, C-Ư43, C-Ư21, C-Ư19, C-Ư27, C-Ư28, C-Ư67, C-Ư10, C-Ư30, C-Ư2 Phụ lục 2: Tương quan hàm lượng tyrosine (mg/ml) và độ hấp thụ Hàm lượng tyrosine OD Số lần đo 0 0 0 0.2 0.244 0.240 0.247 0.246 0.4 0.543 0.540 0.546 0.542 0.6 0.868 0.867 0.861 0.872 0.8 1.256 1.265 1.250 1.251 1.0 1.690 1.72 1.74 1.60 Dựng đường chuẩn tyrosine Ống nghiệm 1 2 3 4 5 6 Lượng tyrosine (micromole) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 OD 0 0.244 0.543 0.868 1.256 1.690 Đường chuẩn tyosine là đường thẳng y=ax ( với 0x1mol/ml) x y a = y/x 0.2 0.244 1.22 0.4 0.543 1.36 0.6 0.868 1.45 0.8 1.256 1.57 1.0 1.690 1.69 Ta chọn giá trị gần đúng của a là giá trị trung bình cộng của các giá trị a . a = (1.22 + 1.36 + 1.45 + 1.57 + 1.69)/5 = 1.458 Vậy y= 1.46 x là đường chuẩn tyosine Sau đây là các giá trị x, y của biểu đồ. x 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 y 0 0.244 0.543 0.868 1.256 1.690 Phụ lục 3: Hàm lượng Tyrosine được tạo thành của 6 chủng nấm sợi STT Chủng Hàm lượng tyrozine OD Số lần đo Hoạt độ (UI/ml) 1 TM217 0.360 0.525 0.510 0.550 0.515 0.88 2 Đ238 0.438 0.640 0.630 0.650 0.638 1.071 3 C-Ư68 0.515 0.753 0.701 0.773 0.786 1.259 4 C-Ư32 0.389 0.569 0.577 0.567 0.562 0.951 5 C-Ư46 0.287 0.419 0.503 0.429 0.325 0.702 0 0.5 1 1.5 2 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 y= 0.7377 R2= 0.9923 Đồ thị : Đường chuẩn Tyrosine 6 CƯ25.1 0.241 0.352 0.317 0.437 0.301 0.589 Phụ lục 4: Ảnh hưởng nguồn Cacbon đến khả năng sinh protease của A. oryzea MT Hàm lượng tyrozine OD Số lần đo Hoạt độ (UI/ml) MT1 0.405 0.590 0.564 0.641 0.559 0,989 MT2 0.446 0.650 0.677 0.617 0.658 1.089 MT3 0.480 0.70 0.724 0.699 0.668 1.173 MT4 0.502 0.733 0.745 0.725 0.728 1.223 MT5 0.522 0.762 0.789 0.763 0.736 1.277 Phụ lục 5: Ảnh hưởng của thời gian đến khả năng sinh protease của A. oryzea Phụ lục 7: Ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh enzym protease của A. oryzea pH Hàm lượng tyrozine OD Số lần đo Hoạt độ (UI/ml) Thời gian(h) Hàm lượng tyrozine OD Số lần đo Hoạt độ (UI/ml) 24 0.336 0.490 0.486 0.496 0.487 0.821 36 0.364 0.531 0.536 0.515 0.541 0.890 48 0.569 0.830 0.825 0.836 0.829 1.391 60 0.511 0.745 0.740 0.736 0.758 1.249 72 0.471 0.687 0.682 0.685 0.693 1.152 pH=5 0.412 0.601 0.589 0.616 0.597 1.007 pH=5.5 0.428 0.625 0.615 0.638 0.622 1.046 pH=6 0.486 0.709 0.675 0.684 0.725 1.188 pH=6.5 0.566 0.866 0.841 0.811 0.832 1.383 pH=7 0.476 0.695 0.724 0.699 0.705 1.163 pH=7.5 0.405 0.590 0.564 0.641 0.559 0.99 pH=8 0.401 0.585 0.545 0.643 0.567 0.98 Phụ lục 8: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh enzym protease của A. oryzea Nhiệt độ Hàm lượng tyrozine OD Số lần đo Hoạt độ (UI/ml) 200C 0.287 0.419 0.503 0.429 0.325 0.701 250C 0.303 0.442 0.434 0.452 0.439 0.740 300C 0.446 0.650 0.677 0.617 0.658 1.090 350C 0.496 0.742 0.740 0.751 0.736 1.212 400C 0.348 0.508 0.506 0.515 0.504 0.850 450C 0.241 0.352 0.317 0.437 0.301 0.589 500C 0.063 0.092 0.087 0.112 0.076 0.154 Phụ lục 9: Ảnh hưởng của độ mặn đến khả năng sinh enzym protease của A. oryzea Độ mặn Hàm lượng tyrozine OD Số lần đo Hoạt độ (UI/ml) 0% 0.486 0.709 0.675 0.684 0.725 1.187 0.558 0.813 0.804 0.821 0.815 1.363 1% 0.573 0.835 0.842 0.851 0.813 1.399 2% 0.579 0.845 0.835 0.851 0.849 1.416 3% 0.530 0.773 0.761 0.778 0.781 1.296 4% Phụ lục 10: Ảnh hưởng của độ ẩm đến khả năng sinh enzym protease của A. oryzea Độ ẩm Hàm lượng tyrozine OD Số lần đo Hoạt độ (UI/ml) 50% 0.483 0.705 0.713 0.715 0.688 1.180 55% 0.524 0.765 0.763 0.759 0.773 1.280 60% 0.501 0.730 0.720 0.739 0.735 1.224 65% 0.429 0.625 0.611 0.630 0.634 1.048 70% 0.346 0.505 0.510 0.489 0.517 0.846 75% 0.342 0.499 0.478 0.516 0.503 0.836 Phụ lục 11: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ enzym protease của A. oryzea Nhiệt độ Hàm lượng tyrozine OD Số lần đo Hoạt độ (UI/ml) 250C 0.178 0.211 0.204 0.221 0.209 0.435 300C 0.277 0.409 0.501 0.427 0.323 0.677 350C 0.402 0.679 0.674 0.682 0.689 0.983 400C 0.492 0.740 0.739 0.750 0.735 1.203 450C 0.446 0.650 0.677 0.617 0.658 1.090 500C 0.348 0.508 0.506 0.515 0.504 0.850 550C 0.281 0.411 0.502 0.428 0.325 0.687 600C 0.245 0.356 0.319 0.438 0.304 0.599 Phụ lục 12: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền của enzym protease của A. oryzea Nhiệt độ Hàm lượng tyrozine OD Số lần đo Hoạt độ (UI/ml) 200C 0.291 0.425 0.475 0.394 0.415 0.711 300C 0.566 0.825 0.846 0.798 0.834 1.383 400C 0.620 0.905 0.919 0.894 0.913 1.515 500C 0.533 0.779 0.795 0.775 0.765 1.302 600C 0.093 0.135 0.139 0.131 0.134 0.227 700C 0.067 0098 0.085 0.102 0.106 0.164 Phụ lục 13: Ảnh hưởng của thời gian đến hoạt độ enzym protease của A. oryzea Nhiệt độ Hàm lượng tyrozine OD Số lần đo Hoạt độ (UI/ml) 10’ 0.410 0.599 0.612 0.587 0.595 1.002 20’ 0.623 0.908 0.912 0.915 0.899 1.523 30’ 0.690 1.006 1.003 1.009 1.004 1.686 40’ 0.709 1.035 1.059 1.016 1.017 1.733 50’ 0.712 1.038 1.065 1.018 1.026 1.740 60’ 0.721 1.051 1.041 1.057 1.060 1.762 70’ 0.537 0.783 0.795 0.774 0.781 1.312 80’ 0.472 0.688 0.684 0.687 0.692 1.153 90’ 0.419 0.612 0.625 0.613 0.592 1.024 100’ 0.331 0.483 0.487 0.479 0.481 0.809 Phụ lục 14: Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ enzym protease của A. oryzea pH Hàm lượng tyrozine OD Số lần đo Hoạt độ (UI/ml) 5.0 0.350 0.511 0.523 0.514 0.497 0.855 5.5 0.354 0.518 0.530 0.512 0.509 0.865 6.0 0.547 0.798 0.805 0.766 0.823 1.337 6.5 0.510 0.743 0.760 0.753 0.723 1.246 7.0 0.460 0.671 0.668 0.655 0.694 1.124 7.5 0.295 0.431 0.435 0.437 0.428 0.721 Phụ lục 15 : Hoạt độ protease với các tác nhân tủa khác nhau Tác nhân tủa Hàm lượng tyrozine OD Số lần đo Hoạt độ (UI/g) Ethanol 960 0.344 0.502 0.504 0.540 0.463 1892 Acetone 0.289 0.422 0.429 0.398 0.440 1589.5 (NH4)2SO 4 0.228 0.333 0.352 0.323 0.325 1254 Phụ lục 16 : Hoạt độ protease của nấm A.oryzea với enzym protease ngoài thị trường. Enzym Hàm lượng tyrozine OD Số lần đo Hoạt độ (UI/g) Enzym của nấm A.oryzea 0.343 0.501 0.495 0.482 0.528 1686.5 Enzym ngoài thị trường 0.447 0.652 0.624 0.676 0.657 2458.5