Luận văn Nghiên cứu khả năng sinh hoạt chất đối kháng vi sinh vật gây bệnh cho cây trồng của các chủng nấm sợi phân lập từ rừng Đà Lạt

bào, hay trong kem đá khô/ ethanol trong hơn 5phút, hay giữ trong tủ -70oC trong 15phút, hay trong tủ lạnh ngăn -20oC trong 30 phút. Ly tâm 13.000RPM trong 5 phút. Dùng pipette Pasteur hút bỏ phần nước nổi bằng cách vừa hút cạn dần vừa cho đầu pipette vào dọc thành tube đối diện với chổ đóng cắn DNA. Rửa cắn DNA với 1ml ethanol 70%, không vortex mà chỉ úp ngửa vài lần. Với DNA < 200bp, rửa cắn với ethanol 95%. Ly tâm 13.000RPM trong 5 phút, hút bỏ ethanol, và làm khô cắn trong máy lý tâm chân không hay úp tube trên giấy lọc trong 30 phút ở nhiệt độ PTN. Hòa tan cắn DNA trong 50-100µl đệm TE. 74 ¾ Phát hiện DNA vi nấm bằng PCR Thuốc thử : Sử dụng các loại hóa chất sau : (1) PCR master mix 2X của công ty Nam Khoa (được pha sẵn từ những nguồn nguyên liệu mua từ hãng BioRad, Merck, Sigma, Proligo) ; (2) MgCl2 50mM do BioRad sản xuất ; (3) UNG mua của Invitrogen ; (4) dUTP của Promega ; (5) Một cặp mồi được thiết kế đặc hiệu trên vùng 28S rDNA (Fungi_f, Fungi_r) của vi nấm cho sản phẩm khuếch đại là 260bp được gửi đến hãng Proligo sản xuất. Thiết bị PCR là máy MyCycler của BioRad có buồng ủ nhiệt 96 giếng. Phương pháp khuếch đại DNA được thực hiện trong những tube PCR 0,2ml với thể tích dung dịch phản ứng là 25ml bao gồm 2,5U Taq Polymerase, 3mM MgCl2, 100mX mồi ngược, UNG 1U/l, dNTP 25mM, dUTP 20mM. Phản ứng được thực hiện trong máy luân nhiệt MyCycler của BioRad với chu kỳ nhiệt như sau : 1 chu kỳ 40oC trong 10 phút, 1 chu kỳ 95oC trong 5 phút, 40 chu kỳ 95oC 30 giây, -55oC 30 giây, -72oC 1 phút, 1 chu kỳ 72oC 10 phút. Sản phẩm PCR được phát hiện trên gel agarose 2%. ¾ Giải trình tự trực tiếp sản phẩm khuyếch đại từ vùng gen 28S rDNA Sau khi xác định có sự hiện của sản phẩm khuếch đại dài khoảng260bp thì thực hiện tinh sạch sản phẩm PCR bằng cách sử dụng bộ tinh sạch PCR Clean-up của Promega (Cat#A9281). Sản phẩm PCR sau khi tinh sạch sẽ được điện di trên DNA chip của hệ thống BioAnalyzer để xác định hàm lượng DNA. Sau đó thực hiện phản ứng giải trình tự bằng cách sử dụng bộ thuốc thử của hãng ABI là BigDye Terminator v3.1 Cycler Sequencing Kit với mồi xuôi hoặc mồi ngược của công ty Nam Khoa thiết kế. Sản phẩm giải trình tự được làm tủa và tinh sạch bằng phương pháp tủa với ethanol. Cuối cùng thực hiện điện di mao quản sản phẩm giải trình tự trên máy ABI3130XL. Kết quả giải trình tự sau đó sẽ được so sánh với các trình tự chuẩn đã được công bố trên ngân hàng gen NBCI ( Từ đó xác định được loài vi nấm.[41] 75 Hình 2.2: Phương pháp giải trình tự và đọc kết quả tự động (đánh dấu bằng hóa chất huỳnh quang) [nguồn công ty TNHH Nam Khoa]. 76 Chương 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Kết quả phân lập và thuần khiết các chủng nấm sợi từ rừng Đà Lạt – Lâm Đồng. Mục đích của việc phân lập các chủng nấm sợi từ các mẫu khác nhau nhằm làm sáng tỏ một phần về quần thể nấm sợi, sự phân bố và các hoạt động sinh lí, sinh hoá cũng như vai trò của chúng trong hệ sinh thái rừng Đà Lạt, tuyển chọn các chủng có nguồn gen quí để có thể nghiên cứu ứng dụng vào thực tế. Từ các mẫu thân tươi, lá tươi, thân mục, lá mục, đất thu nhận được sau 4 lần lấy mẫu ở rừng Đà Lạt, trong khoảng thời gian từ tháng 10/2007 đến 11/2008. Chúng tôi đã phân lập và thuần khiết được 297 chủng nấm sợi khác nhau trong đó có : - 31 chủng từ lá tươi và 63 chủng từ lá mục. - 64 chủng từ thân mục và 21 chủng từ thân tươi - 105 chủng được phân lập từ đất Từ kết quả trên cho thấy nấm sợi có mặt trong mọi cơ chất ở rừng Đà Lạt. Tuy nhiên, trong đất có số lượng các chủng nấm sợi nhiều nhất. Số lượng nấm sợi trong các mẫu thân mục và lá mục nhiều hơn trong thân tươi, lá tươi điều đó có thể chứng minh khả năng phân giải các cơ chất này kèm theo sự tăng sinh khối của các loài nấm trên các cơ chất đó. Trong thân, cành mục có nấm sợi chứng tỏ chúng có vài trò phân giải xác các loài thực vật, một ít xác động vật làm nguồn cung cấp chất dinh dưỡng. Sự phân giải này góp phần làm giảm ô nhiễm môi trường, tham gia vòng tuần hoàn vật chất của lưới thức ăn. Các chủng được phân lập được tiến hành sơ tuyển để chọn những chủng nấm sợi có khả năng sinh hoạt chất đối kháng với các VSV gây bệnh cho cây trồng. 77 3.2 Khảo sát khả năng sinh hoạt chất đối kháng của các chủng nấm sợi phân lập được. Từ 297 chủng phân lập được, chúng tôi tiến hành xác định hoạt tính đối kháng với các VSV kiểm định Gr+ (B. subtilis), Gr- (E. coli) theo phương pháp: Thử khả năng sinh hoạt chất đối kháng của nấm sợi ở mục 2.2.3.2. Kết quả được ghi nhận ở bảng 3.1. Bảng 3.1 : Kết quả khảo sát khả năng sinh hoạt chất đối kháng của các chủng nấm phân lập từ rừng Đà Lạt – Lâm Đồng ở các vị trí lấy mẫu. 78 79 Ghi chú: D: Đường kính vòng vô khuẩn, d= 8mm: đường kính khối thạch Có 11/297 chủng nấm sợi phân lập từ Lá tươi và thân tươi (chiếm 3,7%) có hoạt tính đối kháng với VSV kiểm định. Có 26/297 chủng nấm sợi phân lập từ Đất (chiếm 8,8%) có hoạt tính đối kháng với VSV kiểm định. 80 Có 49/297 chủng nấm sợi phân lập từ Lá mục và thân mục (chiếm 16,5%) có hoạt tính đối kháng với VSV kiểm định. Các chủng có hoạt tính đối kháng có mặt trong mọi cơ chất của rừng Đà Lạt. Đặc biệt các chủng nấm sợi có ở trong các lớp đất, lá mục, thân cây mục nhiều hơn ở lá và cành cây tươi, điều đó có thể chứng minh khả năng phân giải các cơ chất này kèm theo sự tăng sinh khối của các loài nấm trên các cơ chất đó. Các nấm sợi phân lập từ cành, thân, lá tươi là các nấm kí sinh nội bào, chúng sử dụng chất dinh dưỡng của tế bào chủ khi sống. Kết quả này tương tự kết quả khảo sát khu hệ nấm sợi rừng ngập mặn Cần Giờ của Phan Thanh Phương nhưng tỉ lệ của các chủng tạo hoạt chất đối kháng thấp hơn và hoạt tính đối kháng cũng không cao lắm. Như vậy, chúng ta có thể nhận thấy dù ở hai hệ sinh thái khác nhau nhưng những VSV có hoạt tính đối kháng đã giúp cho các chủng nấm sợi thích nghi trong cuộc đấu tranh sinh tồn để tồn tại. Để có cái nhìn tổng quát hơn, từ bảng 3.1 chúng tôi thống kê lại thành bảng 3.2. Bảng 3.2: Kết quả thống kê hoạt chất đối kháng của các chủng nấm sợi phân lập từ rừng Đà Lạt – Lâm Đồng. Hoạt tính kháng sinh Mức độ hoạt tính STT VSV kiểm định Số chủng phân lập được Yếu Trung bình Mạnh Rất mạnh Tổng số chủng có hoạt tính kháng sinh 1 B.subtilis 297 56 27 2 1 86 2 E.coli 297 18 7 3 0 28 Ghi chú: D-d ≥ 25mm: hoạt tính rất mạnh; D-d ≥ 20mm: hoạt tính mạnh; D-d≥ 10 - 19,5mm: hoạt tính trung bình; D-d ≤ 10mm: hoạt tính yếu. Qua bảng 3.1 và 3.2 cho thấy: Hoạt tính đối kháng của các chủng nấm sợi phân lập từ rừng Đà Lạt với các VSV kiểm định ở các mức độ mạnh yếu khác nhau. 81 Có 86/297 chủng nấm sợi rừng Đà Lạt (chiếm 28,9%) có khả năng chống lại các VK Gr+, trong đó có 2 chủng (chiếm 0,67%) thể hiện hoạt tính mạnh và 1 chủng duy nhất (chiếm 0,34%) thể hiện hoạt tính rất mạnh. Có 28/297 chủng nấm sợi rừng Đà Lạt (chiếm 9,4%) có khả năng chống lại các VK Gr- trong đó có 1 chủng (0,34%) thể hiện hoạt tính mạnh. Trong 86 chủng có hoạt tính đối kháng có 28 chủng nấm sợi rừng Đà Lạt (chiếm 32,6%) có phổ kháng khuẩn rộng, vừa có khả năng chống lại VK gram dương và VK gram âm. Từ số liệu trên, chúng tôi nhận thấy: Khu hệ nấm sợi rừng Đà Lạt có tỉ lệ các chủng có hoạt tính đối kháng tương đối thấp, hoạt tính đối kháng cũng không cao nhưng tỉ lệ các chủng có phổ kháng khuẩn rộng tương đối cao. Các chủng nấm sợi này, chúng tôi tiếp tục nghiên cứu, nhằm tìm ra các chủng có hoạt tính đối kháng cao và phổ kháng khuẩn rộng, phục vụ cho công tác phòng chống bệnh ở cây trồng. 3.3 Tuyển chọn những chủng nấm sợi có hoạt tính đối kháng cao Từ 86 chủng có khả năng sinh hoạt chất đối kháng. Dùng phương pháp: Thử khả năng sinh hoạt chất đối kháng của nấm sợi theo phương pháp ở mục 2.2.3.2, lập lại thí nghiệm, tiến hành tuyển chọn các chủng có hoạt tính đối kháng cao nhất và có phổ kháng khuẩn rộng. Kết quả đã tuyển chọn được 4 chủng, ghi nhận ở bảng 3.3: 82 Bảng 3.3 : Những chủng nấm sợi có hoạt tính đối kháng cao Hoạt tính đối kháng (D-d,mm) STT Chủng nghiên cứu B.subtilis E.Coli 1 ĐTN3.7 20 10 2 ĐTN3.8 20 20 3 ĐTN3.9 12 21 4 ĐTN4.19 26 20 Hình 3.1: Họat tính đối kháng với VSV kiểm định của chủng ĐTN4.19. 83 Hình 3.2: Hoạt tính đối kháng với VSV kiểm định của các chủng ĐTN3.7, ĐTN3.8, ĐTN3.9. 3.4 Khảo sát phổ đối kháng với VSV gây bệnh Từ 4 chủng được tuyển chọn ở trên, chúng tôi tiến hành khảo sát phổ đối kháng của chúng với VSV gây bệnh cho cây trồng bằng các phương pháp khác nhau: Thử khả năng sinh hoạt chất đối kháng của nấm sợi ở mục 2.2.3.2; Thử hoạt tính đối kháng với các chủng nấm bệnh cho cây trồng bằng phương pháp cấy trên môi trường dịch thể ở mục 2.2.4.1 và phương pháp khuyếch tán trên môi trường thạch 2.2.4.2; Thử khả năng cạnh tranh với nấm gây bệnh cho cây trồng bằng phương pháp cấy chấm điểm ở mục 2.2.4.3. Kết quả được ghi nhận ở bảng sau: ĐTN3.9 E. coli ĐTN3.7 ĐTN3.8 B. subtilis ĐTN3.8 ĐTN3.7 ĐTN3.9 84 85 Qua bảng 3.4 chúng tôi nhận thấy: ™ Đối kháng với nấm gây bệnh bằng hoạt chất đối kháng (minh họa bằng hình 3.3A, 3.3B, 3.3C). ¾ Chủng ĐTN3.7: - Kháng mạnh 3/6 chủng nấm sợi gây bệnh được thử. - Kháng một phần 2/6 chủng nấm sợi gây bệnh được thử. ¾ Chủng ĐTN3.9: - Kháng mạnh 3/6 chủng nấm sợi gây bệnh được thử. ¾ Chủng ĐTN3.8: - Kháng mạnh 2/6 chủng nấm sợi gây bệnh đem thử. - Kháng một phần 4/6 chủng nấm sợi gây bệnh đem thử. - Kháng một phần (vòng vô khuẩn nhỏ) 2/2 vi khuẩn gây bệnh cho cây Địa Lan được thử. ¾ Chủng ĐTN4.19: - Kháng mạnh 3/6 chủng nấm sợi gây bệnh đem thử. - Kháng một phần 3/6 chủng nấm sợi gây bệnh đem thử. - Kháng mạnh 2/2 vi khuẩn gây bệnh cho cây Địa Lan được thử. 86 Chủng ĐTN4.19 kháng nấm bệnh (Pythium sp.) Chủng ĐTN3.8 kháng nấm bệnh (Pythium sp.) A: Chủng ĐTN4.19 kháng nấm bệnh (Pythium sp.) trên môi trường dịch thể. Nấm bệnh (Curvularia sp.) Nấm ĐTN4.19 kháng nấm Curvularia sp. bằng cách tạo vòng vô khuẩn. B: Nấm ĐTN4.19 kháng nấm Curvularia sp. bằng cách tạo vòng vô khuẩn. ĐTN3.8 P.sp & ĐTN3.8 Pythium sp. ĐTN4.19 P.sp & ĐTN4.19 Pythium sp. Curvularia sp. ĐTN4.19& C. sp. 87 Chủng ĐTN4.19 kháng vi khuẩn P.gladiol (mặt trước đĩa petri) Chủng ĐTN3.8 kháng vi khuẩn Erwinia sp. C: Chủng ĐTN3.8, ĐTN4.19 kháng vi khuẩn P.gladiol gây bệnh thối đen và Erwinia sp. gây bệnh thối vàng ở cây Địa Lan. Hình 3.3: Kháng với nấm gây bệnh cho cây trồng bằng hoạt chất đối kháng. A: Chủng ĐTN4.19 kháng nấm bệnh (Pythium sp.) trên môi trường dịch thể. B: Nấm ĐTN4.19 kháng nấm Curvularia sp. bằng cách tạo vòng vô khuẩn. C: Chủng ĐTN3.8, ĐTN4.19 kháng vi khuẩn P.gladiol gây bệnh thối đen và Erwinia sp. gây bệnh thối vàng ở cây Địa Lan. ™ Đối kháng với nấm bệnh bằng cách cạnh tranh (minh hoạ bằng hình 3.4 A, 3.4B, 3.4C) ¾ ĐTN3.8: đối kháng cạnh trang mạnh 6/6 chủng nấm sợi đem thử ¾ ĐTN4.19: đối kháng cạnh tranh với 2/6 chủng nấm sợi đem thử. ĐTN3.8 ĐTN4.19 Erwinia sp. ĐTN3.8 ĐTN4.19 P.gladiol 88 Chủng ĐTN3.8 kháng nấm Slerotium sp. (Mặt trước của đĩa petri) Chủng ĐTN3.8 kháng nấm Slerotium sp. (Mặt sau của đĩa petri) A: Chủng ĐTN3.8 kháng nấm Slerotium sp. Aspergillus niger Chủng ĐTN3.8 kháng Asp.niger B: Chủng ĐTN3.8 kháng Asp.niger ĐTN3.8 & Asp.niger. Aspergillus niger ĐTN3.8 & Slerotium sp. ĐTN3.8 & Slerotium sp. 89 Chủng ĐTN4.19 kháng nấm bệnh Rhizoctonia sp. (Mặt trước đĩa petri) Chủng ĐTN4.19 kháng nấm bệnh Rhizoctonia sp. (Mặt sau đĩa petri) C: Chủng ĐTN4.19 kháng nấm bệnh Rhizoctonia sp. Hình 3.4: Kháng với nấm gây bệnh cho cây trồng bằng cách cạnh tranh. A: Chủng ĐTN3.8 kháng nấm Slerotium sp. B: Chủng ĐTN3.8 kháng Asp.niger C: Chủng ĐTN4.19 kháng nấm bệnh Rhizoctonia sp. Như vậy, Có 2 chủng ĐTN3.8, ĐTN4.19 kháng với 6/6 chủng nấm gây bệnh ở cây trồng được thử nghiệm. Chủng ĐTN3.8 ức chế hoàn toàn với Pythium sp., Slerotium sp. và ức chế một phần với 4 chủng nấm gây bệnh Curvularia sp., Pyricularia oryzae, Rhizoctonia sp, Aspergillus niger; đối kháng cạnh tranh mạnh với cả 6 chủng nấm gây bệnh được thử nghiệm. Chủng ĐTN4.19 ức chế hoàn toàn với Pythium sp., Slerotium sp., Pyricularia oryzae; ức chế một phần với 3 chủng nấm gây bệnh Curvularia sp., ĐTN3.8 & Rhizoctonia sp. ĐTN3.8 & Rhizoctonia sp. 90 Rhizoctonia sp., Aspergillus niger; đối kháng cạnh tranh với Curvularia sp., Rhizoctonia sp. Cả 2 chủng ĐTN3.8 và ĐTN4.19 đều kháng với vi khuẩn P. gladioli và Erwinia sp. (minh họa bằng hình 3.5) nhưng chủng ĐTN4.19 có hoạt chất đối kháng mạnh hơn chủng ĐTN3.8. Do đó, chúng tôi chọn chủng ĐTN4.19 ứng dụng trong điều trị bệnh cho cây trồng. Chủng ĐTN 3.8 hoạt chất kháng sinh không mạnh bằng chủng ĐTN4.19 nhưng đối kháng bằng cạnh tranh rất mạnh. Do đó, chúng tôi chọn chủng ĐTN3.8 ứng dụng trong phòng bệnh cho cây trồng. Tất cả các chủng tuyển chọn đều không kháng với nấm men Saccharosemyces cerevisiae ( dùng trong ứng dụng sản xuất men bánh mì) chứng tỏ hoạt chất đối kháng này tiêu diệt VSV gây hại một cách có chọn lọc. Từ kết quả trên cho thấy, hai chủng ĐTN3.8, ĐTN4.19 là những chủng có tiềm năng lớn trong việc phòng chống các bệnh, để bảo vệ cây trồng. 3.5 Các đặc điểm sinh học và phân loại của các chủng nấm sợi đã tuyển chọn Để tìm hiểu sâu hơn về 2 chủng nấm đã được tuyển chọn, qua đó tạo thuận lợi cho việc nuôi cấy các chủng khi ứng dụng vào thực tế sản xuất, chúng tôi tiến hành định danh và khảo sát các đặc điểm sinh lí, sinh hóa của chúng. 3.5.1. Đặc điểm hình thái, phân loại. Các chủng nấm nghiên cứu được nuôi cấy trên các môi trường khác nhau [MT1], [MT2], nuôi ủ ở nhiệt độ 28oC trong thời gian 3-5 ngày. Quan sát sự phát triển của khuẩn lạc. Để quan sát đại thể chúng tôi làm KL khổng lồ. Để tiến hành quan sát vi thể chúng tôi làm phòng ẩm để quan sát bào tử, cuống sinh bào tử, hệ sợi nấm dựa vào các tài liệu của Bùi Xuân Đồng (2004), Nguyễn Đức Lượng (2006) để định dạng đến chi. 91 Để định danh các chủng tuyển chọn đến chi, loài; ngoài việc tự làm tại phòng thí nghiệm, chúng tôi đã gửi mẫu đến công ty TNHH Nam Khoa, công ty Cổ phần Giám định và khử trùng FCC để định danh. 3.5.1.1. Đặc điểm đại thể và vi thể của chủng nấm sợi ĐTN3.8 Chủng ĐTN3.8 có tốc độ sinh trưởng nhanh, kích thước khuẩn lạc đạt 3,2 – 3,4 cm sau 1 ngày và sau 4 ngày đạt 11,8 – 12 cm trên [MT1], có màu sắc khuẩn lạc thay đổi tùy theo môi trường nuôi cấy, theo thời gian nuôi cấy. Khuẩn lạc lúc non màu trắng đục, sau già chuyển sang xanh vàng cuối cùng sang xanh lục sẩm, dạng bông xồm (minh họa bằng hình 3.5A). Hệ sợi khuẩn ty có vách ngăn, trong suốt. Cuống sinh bào tử phân nhánh nhiều. Thể bình hình chai, cổ thót nhỏ. Bào tử vách nhẳn, hình cầu, gần cầu, oval, trứng (minh họa bằng hình 3.5B) Bảng 3.5: Đặc điểm phân loại của chủng nấm sợi ĐTN3.8. Đặc điểm chủng nấm tuyển chọn Đặc điểm phân loại theo tài liệu của Bùi Xuân Đồng (2004) và Nguyễn Đức Lượng (2006). ĐTN3.8 - KL tròn, bông xồm, từ màu trắng chuyển dần sang xanh vàng cuối cùng là xanh lục sẩm. - Sợi nấm có vách ngăn, khuẩn ty không màu - Cuống sinh bào tử ngắn, phân nhánh nhiều. - Thể bình hình chai - Bào tử vách nhẳn, hình cầu, gần cầu, oval, trứng (đa số hình cầu vào oval) Trichoderma - KL màu trắng đến lục, phát triển nhanh. - Cuống conidi dài và dày, thường có những đoạn sợi vô sinh kéo dài ra, nhánh bên phần nhiều ngắn và dày, mang những thể hình chai, cụm lại, ngắn, mập. - Khuẩn ty không màu - Bào tử liên kết thành chùm nhỏ, hình cầu, oval. 92 Qua các đặc điểm về hình thái khuẩn lạc, khuẩn ty và cơ quan sinh sản nêu trên và dựa vào mô tả của các tác giả, chúng tôi có thể kết luận chủng ĐTN3.8 là Tricoderma. Để kiểm chứng điều kết luận này và định danh đến loài, chúng tôi đã gửi đến chủng ĐTN3.8 (kí hiệu là ĐTN3.8TriB) đến công ty cổ phẩn giám định và khử trùng FCC để định danh. Kết quả định danh của chủng ĐTN3.8 là Trichoderma atroviride. A: Khuẩn lạc chủng ĐTN3.8 B: Khuẩn ty và cuống sinh bào tử của chủng ĐTN3.8 Hình 3.5: Hình thái đại thể và vi thể của chủng ĐTN3.8 A: Khuẩn lạc của chủng ĐTN3.8 B: Khuẩn ty và cuống sinh bào tử của chủng ĐTN3.8 93 3.5.1.2. Đặc điểm đại thể và vi thể của các chủng nấm sợi ĐTN4.19. Chủng ĐTN4.19 là chủng nấm có nhiều đặc điểm về hình thái khá lạ so với các chủng nấm sợi mà chúng tôi đã từng nghiên cứu trong quá trình phân lập cũng như trong các tài liệu mà chúng tôi tham khảo. Hình thái đại thể: Ở ngày thứ 1 và ngày thứ 3 hệ sợi mọc lan trong thạch, không có sợi khí sinh trên mặt thạch. Nếu chụp hình khuẩn lạc bằng hình thức thông thường là đặt đĩa petri lên bàn để chụp thì không thể thấy được khuẩn lạc. Khi tiến hành chụp hình khuẩn lạc, chúng tôi phải đưa đĩa petri lên cao, mới có thể nhìn rõ khuẩn lạc (minh họa bằng hình 3.6). Sau 3 ngày trở đi mới có sợi khí sinh trên mặt thạch (minh họa bằng hình 3.7A). Khuẩn lạc dạng bông xồm. Kích thước khuẩn lạc đạt 69-72 mm ở ngày thứ 5 trên [MT1]. Hình 3.6: Khuẩn lạc ĐTN4.19 sau 3 ngày nuôi cấy trên Czapek Dox. Màu sắc khuẩn lạc không có sự biến đổi đáng kể. Mặt phải lúc còn non hệ sợi khuẩn ty mọc lan trong thạch sau đó sợi khí sinh phát triển. Mặt trái thường không màu lúc còn non và già chuyển sang màu nâu đất rất nhạt. Không tiết sắc tố ra môi trường. 94 Hình thái vi thể: Hệ sợi khuẩn ty có vách ngăn, trong suốt. Cuống sinh bào tử và bào tử không thấy rõ. Đầu sợi khuẩn ty kéo dài, có sợi phình to lên như hình cái chuỳ (minh họa bằng hình 3.7B). A: Khuẩn lạc của chủng ĐTN4.19 B: Hình thái vi thể chủng ĐTN4.19 Hình 3.7: Hình thái đại thể và vi thể của chủng ĐTN4.19 A: Khuẩn lạc của chủng ĐTN4.19 (sau 4 ngày nuôi cấy) B: Hình thái vi thể chủng ĐTN4.19 Qua các đặc điểm về hình thái khá đặc biệt nêu trên, chúng tôi quyết định gửi mẫu đi các phòng thí nghiệm khác nhau để định danh. ™ Công ty Cổ phần giám định và khử trùng FCC. Kết quả: Phòng thí nghiệm Hóa Sinh – Công ty FCC không định danh được đến chi và loài chủng ĐTN4.19. ™ Công ty TNHH Nam Khoa. 95 Kết quả: Phòng xét nghiệm NK-BIOTEK – Công ty Nam Khoa định danh bằng phương pháp giải trình tự 28S rRNA và tra cứu trên BLAST SEARCH. Công ty Nam Khoa định danh 2 lần. Lần 1: Công ty Nam Khoa định danh chủng nấm sợi ĐTN4.19 là Trichoderma viride. Sau khi so sánh với đặc điểm đại thể, vi thể của chủng này, chúng tôi còn băn khoăn và đề nghị tiến hành làm lại lần thứ 2. Lần 2: Công ty Nam Khoa chưa xác định được chi và loài của chủng ĐTN4.19. Cả 2 lần giải trình tự đều cho kết quả giống với 7 loài nấm sợi khác nhau trong đó có 3 loài thuộc chi Trichoderma và 4 loài nấm sợi chưa định danh được. Từ kết quả chúng tôi nghiên cứu tại phòng thí nghiệm cùng với kết quả tại hai phòng thí nghiệm trên, chúng tôi chưa định danh đến chi chủng nấm sợi này được. Do đó, chúng tôi tiên đoán có thể đây là một chi mới, cần được tiếp tục nghiên cứu để xác định vị trí phân loại của chủng này. 3.5.2. Một số đặc điểm sinh lý, sinh hoá của các chủng nấm sợi nghiên cứu 3.5.2.1. Khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào của các chủng nấm sợi Ngoài việc tìm hiểu khả năng sinh hoạt chất đối kháng của các chủng phân lập được, chúng tôi tiến hành khảo sát khả năng sinh các enzyme ngoại bào, khả năng phân giải cacbuahydro. Đây là các đặc tính được quan tâm nhiều của các chủng nấm sợi. Chúng tôi tiến hành nuôi các chủng nghiên cứu trên [MT1] và thay đường glucose bằng cơ chất tương ứng là CMC, casein, tinh bột để thử enzyme ngoại bào theo phương pháp Kiểm tra hoạt tính enzyme ngoại bào của nấm sợi ở mục 2.2.3.1. Kết quả ghi nhận ở bảng 3.6. 96 Bảng 3.6: Hoạt tính enzyme của các chủng được tuyển chọn. Qua bảng 3.6 cho thấy: Hai chủng được tuyển chọn ngoài hoạt tính đối kháng còn có khả năng sinh enzyme ngoại bào như cellulaza, amylaza, proteaza. Hai chủng ĐTN3.8 và ĐTN4.19 có hoạt tính sinh cellulaza rất mạnh. Đây là một đặc tính đáng quý. Điều này có ý nghĩa rất lớn vì ngoài khả năng phòng trị bệnh cho cây trồng còn giúp phân giải các hợp chất hữu cơ, làm tăng độ phì nhiêu cho đất. Enzyme cellulaza là enzyme thuỷ phân có vai trò chủ đạo trong việc phân giải các biopolymer trong tự nhiên, khoáng hoá các đại phân tử này. Hai chủng nấm tuyển chọn đều có nguồn gốc từ Đất. Nhờ có hệ enzyme phong phú này mà chúng dễ dàng tồn tại. Hệ nấm sợi có ý nghĩa rất lớn trong hệ sinh thái rừng Đà Lạt để phân giải các chất lignocelluloza (lá rụng, cành cây chết, hoa, quả, cỏ…). Chính chúng là tác nhân tham gia tích cực phân giải các cơ chất lignocelluloza, protein, tinh bột ở rừng Đà Lạt. Hình 3.8: Hoạt tính enzyme cellulaza của chủng ĐTN4.19 và ĐTN3.8 Khả năng sinh enzyme cellulaza của chủng ĐTN3.8 97 3.5.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của một số điều kiện môi trưởng lên sự sinh trưởng và hoạt tính đối kháng của các chủng nấm sợi nghiên cứu. Để hiểu sâu hơn về các chủng ĐTN4.19 và ĐTN3.8, chúng tôi tiến hành nghiên cứu một số đặc điểm sinh lý, sinh hoá như thử khả năng đồng hoá các nguồn hydrat cacbon, nitơ; ảnh hưởng của độ pH, thời gian đến sự sinh trưởng, phát triển và hoạt tính đối kháng; độ bền nhiệt của hoạt tính đối kháng của các chủng nấm sợi đã được tuyển chọn 3.5.2.2.1 Khả năng đồng hoá nguồn Cacbon, Nitơ khác nhau Mục đích thí nghiệm: Chọn được nguồn Cacbon, Nitơ thích hợp để nuôi cấy các chủng nấm sợi được tuyển chọn sinh trưởng tốt nhất. Tiến hành thí nghiệm: Cấy các chủng nghiên cứu trên các [MT1]. Sau đó quan sát sự sinh trưởng của các chủng bằng cách đo đường kính khuẩn lạc. Kết quả thu được ghi ở bảng 3.7 và đồ thị 3.1, 3.2. 98 Bảng 3.7: Khả năng đồng hoá nguồn Cacbon, Nitơ khác nhau của các chủng nấm sợi đã được tuyển chọn. 99 ¾ Khả năng đồng hoá nguồn Cacbon khác nhau (minh họa bằng hình 3.9) Đồ thị 3.1: Khả năng đồng hóa nguồn Cacbon khác nhau của 2 chủng nấm sợi được tuyển chọn. Khả năng đồng hóa nguồn cacbon hai chủng nấm sợi được tuyển chọn 0 20 40 60 80 100 120 Glucose Sucrose Fructose Lactose Maltose CMC Nguồn cacbon ĐKKL(mm) ĐTN4.19 ĐTN3.8 A: Khả năng đồng hoá nguồn Cacbon của chủng ĐTN3.8 CMC Rỉ đường D-Glucose Tinh bột Maltose Sucrose Fructose Lactose D-Glucose 100 B: Khả năng đồng hoá nguồn Cacbon của chủng ĐTN4.19 Hình 3.9: Khả năng đồng hóa nguồn Cacbon khác nhau A: Khả năng đồng hoá nguồn Cacbon của chủng ĐTN3.8 B: Khả năng đồng hoá nguồn Cacbon của chủng ĐTN4.19 Qua bảng 3.7 và đồ thị 3.1 cho thấy các chủng nấm sợi tuyển chọn đều có khả năng đồng hóa nguồn Cacbon khác nhau. Chúng phát triển tốt trên tất cả các nguồn Cacbon đem thử. Trong đó nguồn Cacbon là rỉ đường thì các chủng nấm sợi nghiên cứu phát triển tốt nhất. Lý do là trong rỉ đường ngoài đường saccharose ra còn chứa rất nhiều chất hữu cơ, vô cơ, các chất thuộc vitamin và các chất kích thích sinh trưởng. Đặc biệt, cả hai chủng này vẫn sinh trưởng tốt trên môi trường CMC chứng tỏ các nấm sợi này có các enzyme phân giải cellulose rất mạnh. Riêng với chủng ĐTN4.19 thì khả năng phân giải tinh bột không được tốt. D-Glucose Rỉ đường D-Glucose Tinh bột Sucrose Tinh bột Lactose Maltose CMC 101 ¾ Khả năng đồng hoá nguồn Nitơ khác nhau (minh họa bằng hình 3.10). Đồ thị 3.2: Khả năng đồng hóa nguồn Nitơ khác nhau của hai chủng nấm sợi đã được tuyển chọn. Khả năng đồng hóa nguồn nitơ của hai chủng tuyển chọn 0 20 40 60 80 100 120 NaNO3 Cao t hịt Bột đậu NH4H2PO4 NH4Cl (NH4)2SO4 Cazein NH4C5H6O7 NH4HCO3 (NH4)6Mo7O24 NH4NO3 NaNO2 Nguồn Nitơ ĐKKL(mm) ĐTN4.19 ĐTN3.8 A: Khả năng đồng hoá nguồn Nitơ của chủng ĐTN3.8 NH4NO3 NaNO2 NH4C6H5O7 NH4H2PO4 Cao thịt (NH4)SO4 (NH4)6Mo7O24 NH4HCO3 Bột Đậu 4 Ngày NH4Cl 102 B: Khả năng đồng hoá nguồn Nitơ của chủng ĐTN4.19 Hình 3.10: Khả năng đồng hóa nguồn Nitơ khác nhau A: Khả năng đồng hoá nguồn Nitơ của chủng ĐTN3.8 B: Khả năng đồng hoá nguồn Nitơ của chủng ĐTN4.19 Qua bảng 3.7 và đồ thị 3.2 cho thấy các chủng nấm sợi tuyển chọn đều có khả năng đồng hoá nguồn Nitơ khác nhau, ở các mức độ mạnh và yếu khác nhau. Chúng đều đồng hoá tốt nguồn Nitơ hữu cơ (như cao thịt, bột đậu cũng như vô cơ là NO-3 nhưng khả năng đồng hoá NH4+, NO2- lại ở mức trung bình. Qua nghiên cứu các loại muối NH4+ khác nhau, chúng tôi nhận thấy các nấm sợi được tuyển chọn phát triển khác nhau trên các môi trường này. Như vậy nguyên nhân chính không phải ở bản thân gốc NH4+ mà do anion kết hợp với nó tức là do độ chua sinh lý của các muối này gây ra. Sau khi đồng hóa NH4+, môi trường sẽ tích lũy các anion sẽ làm giảm rất nhiều trị số pH của môi trường. Kết quả này phù hợp với kết quả của Nguyễn Đức Lượng. Như vậy, Cả hai chủng nấm sợi được tuyển chọn có khả năng đồng hoá tốt trên tất cả các nguồn Cacbon được thử và có khả năng đồng hoá các nguồn Nitơ NH4Cl NH4NO3 NaNO2 NH4C6H5O7 NH4H2PO4 Cao thịt (NH4)SO4 (NH4)6Mo7O24 NH4HCO3 NaNO3 NaNO3 Bột đậu 4 Ngày 103 khác nhau. Trong đó, rỉ đường - bột đậu là nguồn nguyên liệu thô, rẻ tiền, dễ kiếm so với nguồn glucose - cao thịt. Trong nuôi cấy, giá nguyên liệu rất quan trọng quyết định giá thành sản phẩm. Vì vậy, nếu các chủng tuyển chọn sử dụng được các nguyên liệu thô như rỉ đường, bột đậu là một yếu tố thuận lợi giúp cho việc nuôi cấy các chủng nói trên. 3.5.2.2.2 Ảnh hưởng của pH đến sự sinh trưởng, phát triển và khả năng sinh hoạt chất đối kháng của hai chủng nấm sợi được tuyển chọn. Mục đích thí nghiệm: Chọn được độ pH thích hợp để các chủng nấm sợi được tuyển chọn nuôi cấy sinh trưởng, phát triển tốt nhất và sinh hoạt chất đối kháng cao nhất. Tiến hành thí nghiệm: Hai chủng nấm sợi được tuyển chọn được nuôi cấy trên [MT1], điều chỉnh pH trong môi trường ban đầu, đo ĐKKL ở ngày thứ 2, 3, 4 sau khi cấy (minh họa bằng hình 3.11). Sau 4 ngày nuôi cấy thử hoạt tính đối kháng theo phương pháp Kiểm tra hoạt tính đối kháng của các chủng nấm sợi ở mục 2.2.3.2 với chủng kiểm định là B. subtilis. Kết quả được ghi nhận ở bảng 3.8, 3.9 và đồ thị 3.3, 3.4. 104 A: Ảnh hưởng của pH tới sự sinh trưởng, phát triển của chủng ĐTN3.8 B: Ảnh hưởng của pH tới sự sinh trưởng, phát triển của chủng ĐTN4.19 Hình 3.11: Ảnh hưởng của pH đến sự sinh trưởng, phát triển của các chủng nghiên cứu. A: Ảnh hưởng của pH tới sự sinh trưởng, phát triển của chủng ĐTN3.8 B: Ảnh hưởng của pH tới sự sinh trưởng, phát triển của chủng ĐTN4.19 Bảng 3.8: Khảo sát ảnh hưởng của độ pH tới sự sinh trưởng, phát triển của các chủng nấm sợi được tuyển chọn. pH=4 ĐTN4.19 pH=5 pH=7 pH=8 pH=6 4 ngày ĐTN3.8 pH=5 pH=4 pH=6 pH=7 pH=8 3 105 Đồ thị 3.3: Ảnh hưởng của pH đến sự sinh trưởng, phát triển của hai chủng nấm sợi được tuyển chọn. Ảnh hưởng của độ pH đến sự sinh trưởng của các chủng nấm sợi 0 20 40 60 80 100 120 1 2 3 4 5 6 7 8 9 pH Đ KK L (m m ) ĐTN4.19 ĐTN3.8 Qua bảng 3.8 và đồ thị 3.3 chúng ta thấy độ pH của môi trường ảnh hưởng rất lớn trong nuôi cấy VSV như khả năng sinh trưởng, phát triển của nấm sợi. Chủng ĐTN3.8 có khả năng mọc ở pH từ 4 đến 8 và chủng ĐTN4.19 có khả năng mọc ở pH từ 4 đến 7. Như vậy, các chủng nấm sợi đã được tuyển chọn từ rừng Đà lạt có khả năng phát triển tốt ở độ pH từ 4-7 nhưng độ pH thích hợp nhất là 5-6,5. Bảng 3.9: Khảo sát ảnh hưởng của độ pH lên hoạt tính đối kháng của 2 chủng nấm sợi được tuyển chọn. 106 Đồ thị 3.4: Ảnh hưởng độ pH ban đầu lên hoạt chất đối kháng của 2 chủng nấm sợi được tuyển chọn. Ảnh hưởng của môi trường pH ban đầu lên họat tính đối kháng 0 5 10 15 20 25 30 3 4 5 6 7 8 Độ pH ban đầu (D-d,mm) ĐTN4.19 ĐTN3.8 Qua bảng 3.9 và đồ thị 3.4 cho thấy pH ảnh hưởng lớn sinh tổng hợp hoạt chất đối kháng. pH quá cao hoạt quá thấp đều không có lợi cho khả năng sinh trưởng, phát triển cũng như tổng hợp hoạt chất đối kháng. Chủng ĐTN4.19 có khả năng sinh hoạt chất đối kháng ở pH từ 4 đến 7, chủng ĐTN3.8 có hoạt chất đối kháng ở pH từ 3 đến 7 nhưng pH thích hợp nhất là pH trung tính và hơi acid từ 5- 6. Tóm lại, pH ảnh hưởng lớn đến sự sinh trưởng, phát triển và khả năng sinh hoạt chất đối kháng của 2 chủng nấm sợi đã được tuyển chọn. Các chủng nấm sợi sinh trưởng, phát triển tốt và sinh hoạt chất đối kháng ở pH từ 4 đến 7 nhưng thích hợp nhất là từ 5-6. 3.5.2.2.3 Ảnh hưởng của thời gian đến sự sinh trưởng, phát triển của 2 chủng nấm sợi tuyển chọn Mục đích thí nghiệm: Chọn được thời điểm thích hợp để nuôi cấy các chủng nấm sợi đã được tuyển chọn sinh trưởng, phát triển tốt nhất và sinh hoạt chất đối kháng cao nhất. Xác định thời gian nào cho hoạt tính đối kháng cao là 107 việc làm cần thiết để từ đó biết dừng lại ở thời gian thích hợp khi nuôi cấy tạo chất đối kháng. Tiến hành thí nghiệm: Hai chủng nấm sợi đã được tuyển chọn được nuôi cấy trên [MT1]. Từ ngày thứ 2 đến ngày thứ 7 đo ĐKKL. Sau đó, dùng phương pháp Thử khả năng sinh hoạt chất đối kháng của nấm sợi ở mục 2.2.3.2 để thử hoạt tính đối kháng qua từng ngày nuôi cấy sau khi cấy với VKKĐ là B. subtilis. Kết quả được ghi nhận ở bảng 3.10 Bảng 3.10: Ảnh hưởng của thời gian đến sự sinh trưởng, phát triển và hoạt chất đối kháng của 2 chủng nấm sợi đã được tuyển chọn. ĐKKL (mm) Hoạt tính đối kháng (D-d, mm) Ký hiệu chủng ĐTN3.8 ĐTN4.19 ĐTN3.8 ĐTN4.19 Ngày 1 20 16 0 0 Ngày 2 53 25 0 0 Ngày 3 107 50 8 12 Ngày 4 119 83 20 24 Ngày 5 120 90 18 28 Ngày 6 121 97 14 22 Ngày 7 122 100 5 9 108 Đồ thị 3.5: Ảnh hưởng của thời gian đến sự sinh trưởng, phát triển của hai chủng nấm sợi được tuyển chọn. Ảnh hưởng của thời gian đến sự sinh trưởng và phát triển của các chủng nấm sợi 0 20 40 60 80 100 120 140 1 2 3 4 5 6 7 Thời gian Đ KK L (m m ) ĐTN4.19 ĐTN3.8 Đồ thị 3.6: Xác định thời gian sinh tổng hợp hoạt chất đối kháng Xác định thời gian sinh tổng hợp hoạt chất đối kháng 0 5 10 15 20 25 30 1 2 3 4 5 6 7 Thời gian (ngày) (D-d, mm) ĐTN4.19 ĐTN3.8 Qua bảng 3.10 và đồ thị 3.5, 3.6 cho thấy: Khuẩn lạc các chủng nấm sợi tuyển chọn lớn dần theo thời gian. Chủng ĐTN3.8 sinh trưởng, phát triển rất nhanh. Điều này liên quan đến khả năng đối kháng mạnh mẽ bằng cách cạnh tranh của nó đối với các chủng nấm sợi gây bệnh cho cây trồng. Chủng ĐTN3.8 có khả 109 năng sinh hoạt chất đối kháng mạnh nhất vào ngày thứ 4 còn chủng ĐTN4.19 vào ngày thứ 5. 3.5.2.3. Độ bền nhiệt Chúng tôi tiến hành khảo sát khả năng chịu nhiệt của dịch chiết hoạt chất đối kháng thô từ chủng khi nuôi cấy trên [MT2] không có agar. Dịch chiết hoạt chất đối kháng thô đem giữ ở nhiệt độ 60oC, 80oC, 100oC, 115oC, 121oC với thời gian nhất định rồi thử hoạt tính kháng sinh trên VK B. subtilis. Kết quả được ghi nhận ở bảng 3.11. Bảng 3.11: Độ bền nhiệt của dịch chiết hoạt chất đối kháng thô trong dịch lên men 110 Qua bảng 3.11 chúng tôi nhận thấy dịch chiết hoạt chất đối kháng thô này rất bền với nhiệt độ, hoạt chất đối kháng này không hề giảm hoạt tính khi ở nhiệt độ cao, kể cả nhiệt độ 121oC trong vòng 60 phút. Điều này thuận lợi trong khâu tách chiết, tinh chế, sử dụng trong nông nghiệp và bảo quản. Kết quả này phù hợp với kết quả của Nguyễn Thị Thu và Phan Thanh Phương. 3.6 Bước đầu ứng dụng các chủng nấm sợi được tuyển chọn để phòng và trị bệnh cho cây Địa Lan (Cymdibium) ở Đà Lạt. Các nông dân trồng Địa Lan tại Đà Lạt đang lao đao vì căn bệnh thối củ Địa Lan, nhiều vườn Địa Lan đang chết dần chết mòn và được coi là “vô phương cứu chữa”. Tỷ lệ vườn bị bệnh vào cuối năm 2007, đầu năm 2008 đã lên đến 70- 80%, trong đó tỷ lệ cây chết từ 30-60%, thậm chí nhiều vườn chết 100%. Do đó, ứng dụng khả năng đối kháng của các chủng nấm được tuyển chọn vào công tác phòng và trị bệnh cho cây Địa Lan (Cymdibium) là việc làm rất thiết thực. 3.6.1. Ứng dụng chủng Trichoderma atroviride trong phòng bệnh cho cây Địa Lan (Cymdibium) Mục đích thí nghiệm: - Phòng bệnh cho cây Địa Lan cũng như bổ sung thêm VSV có ích cho giá thể, tăng độ phì nhiêu cho giá thể trồng Địa Lan. - Tận dụng được lượng Dớn thải đang bị lãng phí. Chuẩn bị thí nghiệm: - Giống: Hai luống Địa Lan 1 năm tuổi. - DNC của Trichoderma atroviride sau 4 ngày nuôi cấy. - Giá thể trồng Địa Lan: + Rễ cây Địa Lan mọc bám trên vỏ cây, mặt đất (bì sinh hay phụ sinh); có loài rễ ăn sâu trong bọng cây, trong đất mùn (địa sinh hay 111 thực sinh) do đó giá thể để trồng cây rất quan trọng cho sự sinh trưởng và phát triển của cây. + Dớn là loại giá thể truyền thống mà người Nông dân Đà Lạt sử dụng để trồng Địa Lan. Giá thể dớn chứa nhiều đạm, kali, pH thích hợp và chậm phân huỷ. Nhưng dớn lại giữ nước rất tốt. Do vậy, khi trời mưa dầm, loại giá thế này sẽ giữ nước nhiều. Điều kiện ẩm ướt khiến dớn ở đáy chậu mục nhanh cùng sợi dớn bện lại làm bít lổ thoát nước trong chậu, điều này lại làm tăng lượng nước tích trong chậu. Sau mùa mưa, nhiệt độ ấm lên sẽ tạo điều kiện thuận lợi để VSV phát triển, gây bệnh cho cây. Ngoài ra, để có giá thể này trồng Địa Lan, người ta đã khai thác quá mức nguồn tài nguyên Dương sỉ từ rừng, do đó giá thành của nó tương đối cao. Người ta đã cải tiến thay dớn bằng các loại giá thể khác nhau như vỏ cà phê, xơ dừa hay bổ sung thêm vào dớn các loại vật liệu khác như vỏ thông, trấu, than, mùn cưa, bột nấm v.v… để tăng độ xốp cũng như giảm giá thành giá thể cho cây. Để giảm bệnh ở cây, ngoài việc kéo dàn nilon để ngăn nước mưa, chúng tôi đã dùng trấu để tăng độ xốp cho dớn theo tỉ lệ 1/1 trong thời gian 2 năm gần đây nhưng tình hình cây phát triển không tốt bằng dớn thuần túy. Mặc dù, số cây mắc bệnh có giảm nhưng không đáng kể. Bên cạnh đó, một lượng dớn thải đã bị bỏ phí. Sau khi có cây bị bệnh, nông dân phải mang cây bệnh sang khu vực cách li, xử lý bằng phun thuốc sát trùng khu vực có Địa Lan bệnh. Cây Địa Lan bị bệnh sẽ bị nhổ bỏ và ngay cả chậu và lượng dớn thừa của những cây này, nông dân cũng không thể tái sử dụng. Mặc dù, họ đã sử dụng nhiều biện pháp xử lý chậu như rải vôi, cọ rửa bằng thuốc sát trùng… nhưng khi trồng lại cây Địa Lan sau vẫn tiếp tục nhiễm bệnh, chúng tôi phải chọn giải pháp chậu nhựa thay cho chậu đất trước đây. 112 Vì những lý do trên, chúng tôi quyết định chọn giá thể trấu và dớn đốt để trồng cây Địa Lan. + Đốt hun loại hỗn hợp trấu và dớn (tỷ lệ 1/1) (minh họa bằng hình 3.12) trong 12 giờ để khử trùng nhằm tái sử dụng nguồn dớn cũ ở trang trại đang bị lãng phí. Tưới nước sạch để làm nguội hỗn hợp. Đốt trấu và dớn Trấu và dớn sau khi đốt hun và bổ sung T.atroviride 1%. Hình 3.12: Đốt Trấu và Dớn làm giá thể trồng Địa Lan và bổ sung Trichoderma atroviride. Bố trí thí nghiệm: - Chúng tôi chia hỗn hợp trấu và dớn đốt thành 2 phần: + 1 phần chúng tôi bổ sung thêm ĐTN3.8 (Trichoderma atroviride) tỷ lệ 1% (1l dịch nuôi cấy/100kg hỗn hợp) do chủng này vừa có khả năng sinh hoạt chất đối kháng, vừa có khả năng đối kháng bằng cách cạnh tranh rất mạnh với các VSV gây bệnh có trong giá thể trồng Địa Lan và có khả năng sinh enzyme cellulaza rất mạnh để tăng độ phì nhiêu cho giá thể trồng Địa Lan. 113 + 1 phần không bổ sung ĐTN3.8 (Trichoderma atroviride) để đối chứng. - Lô 1 (Lô đối chứng): Giá thể trồng Địa Lan là dớn và trấu đốt. - Lô 2 (Lô thí nghiệm): Giá thể trồng Địa Lan là Dớn và trấu đốt có bổ sung Trichoderma atroviride. Kết quả thí nghiệm: - Do cây Địa Lan là cây đa niên nên chúng tôi chỉ quan sát thấy rõ sự phát triển của cây sau 3 tháng (kết quả minh họa bằng hình 3.13, 3.14) trong đó: + Thân, Lá: Cây Địa Lan được trồng bằng giá thể dớn và trấu đốt có bổ sung Trichoderma atroviride (minh họa bằng hình 3.13B) phát triển mạnh hơn, nhanh hơn, lá xanh hơn cây Địa Lan được trồng bằng giá thể dớn và trấu đốt không có bổ sung Trichoderma atroviride (minh họa bằng hình 3.13A). Cây Địa Lan được trồng bằng giá thể dớn và trấu đốt có bổ sung Trichoderma atroviride phát triển tương đương với cây Địa Lan được trồng bằng dớn (minh họa bằng hình 3.13C) nhưng cây Địa Lan được trồng bằng giá thể trấu và dớn đốt có bổ sung Trichoderma atroviride có sức sống mạnh hơn, lá cũng xanh hơn. + Hệ rễ: Cây Địa Lan được trồng bằng giá thể dớn và trấu đốt có bổ sung Trichoderma atroviride (minh họa bằng hình 3.14B) có tốc độ ra rễ nhanh, nhiều, mập, trắng hơn so với cây Địa Lan trồng bằng trấu và dớn đốt không có bổ sung Trichoderma atroviride (minh họa bằng hình 3.14A) và cây Địa Lan được trồng bằng dớn (minh họa bằng hình 3.14C). 114 A: Địa Lan trồng bằng Dớn và Trấu đốt B: Địa Lan trồng bằng Dớn và Trấu đốt có bổ sung T.atroviride C: Địa Lan trồng bằng Dớn. Hình 3.13: Cây Địa Lan được trồng trên các loại giá thể khác nhau A: Địa Lan trồng bằng Dớn và Trấu đốt B: Địa Lan trồng bằng Dớn và Trấu đốt có bổ sung T.atroviride C: Địa Lan trồng bằng Dớn Lô 2: Lô thí nghiệm Lô 1: Lô Đối chứng 115 A: Rễ cây trồng bằng trấu và dớn đốt. B: Rễ trồng bằng trấu, dớn đốt có bổ sung T. atroviride C: Rễ cây Địa Lan trồng bằng Dớn Hình 3.14: Rễ cây Địa Lan sau 3 tháng được trồng trên các loại giá thể khác nhau. A: Rễ cây Địa Lan trồng bằng Dớn và Trấu đốt B: Rễ cây Địa Lan trồng bằng Dớn và Trấu đốt có bổ sung T.atroviride C: Rễ cây Địa Lan trồng bằng Dớn. 116 3.6.2. Ứng dụng chủng ĐTN4.19 trong trị bệnh thối rễ ở cây Địa Lan (Cymdibium) Mục đích thí nghiệm: Chữa bệnh thối rễ cho cây Địa Lan (Cymdibium). Chuẩn bị và bố trí thí nghiệm: - Đối chứng: 100 cây Địa Lan bị bệnh thối rễ. - Thí nghiệm: 100 cây Địa Lan bị bệnh thối rễ được chia thành 4 lô. Mỗi lô 25 cây: + Lô 1: Được bơm DNC nguyên chất của chủng nấm ĐTN4.19. + Lô 2: Được bơm DNC với tỷ lệ pha loãng 1/2 của chủng nấm ĐTN4.19. + Lô 3: Được bơm DNC với tỷ lệ pha loãng 1/3 của chủng nấm ĐTN4.19. + Lô 4: Được bơm DNC với tỷ lệ pha loãng 1/4 của chủng nấm ĐTN4.19. - DNC của chủng nấm ĐTN4.19 được pha loãng với tỷ lệ 1/2, 1/3, 1/4 và nguyên chất sau 5 ngày nuôi cấy. Bơm vào gốc cây bệnh 1 ngày 1 lần trong 10 ngày. Chúng tôi không sử dụng phân chuồng mà sử dụng phân bón đá (phân vô cơ) và phân bón lá (phân hữu cơ) để cách li mọi nguồn lây nhiễm. Bệnh thối rễ ở cây Địa Lan ban đầu rất ít biểu hiện nên việc phát hiện bệnh thường khó nhận biết sớm, chỉ xác định được khi thấy lá bị héo vàng/héo khô. Mụt con thối đen và dễ dàng rút khỏi thân cây. Lúc này nhổ cây lên thì bộ rễ đã thối gần hết. Khi bệnh nặng giả hành bị hư mô, mục rữa và chết hẳn. Do đó, 3 tháng sau khi bơm dịch nuôi cấy, chúng tôi mới nhổ cây lên để quan sát bộ rễ. 117 Kết quả thí nghiệm: - Đối chứng: Hệ rễ của cây Địa Lan thối hết; thân và lá chuyển sang vàng, nâu rồi đen, thối dần, giả hành bị hư mô, mục rữa và chết hẳn. Số cây Địa Lan chết 90%. - Thí nghiệm: + Lô 1: Hệ rễ của cây Địa Lan có dấu hiệu phục hồi. 17/25 cây đã xuất hiện rễ con (tỷ lệ 70%) (minh họa bằng hình 3.15). Tỷ lệ cây chết là 3/25 chiếm 12%. + Lô 2: Hệ rễ cây Địa Lan có dấu hiệu phục hồi, số lượng rễ con xuất hiện ít. Tỷ lệ cây chết là 8/25 cây chiếm 32%. + Lô 3: Hệ rễ của cây Địa Lan ít đen hơn lô đối chứng, quá trình thối rễ diễn ra chậm và cây chết chậm hơn so với lô đối chứng. Số cây chết 13/25 chiếm 52%. + Lô 4: Hệ rễ của cây Địa Lan thối gần hết; thân và lá chuyển sang vàng, nâu rồi đen, thối dần, giả hành đen, mục và chết. Số cây Địa Lan chết ít hơn so với lô đối chứng. Số cây chết 20/25 chiếm 80%. 118 Cây Địa Lan bị bệnh thối rễ Cây Địa Lan bị bệnh thối rễ khi nhổ gốc lên. Hình 3.15: Ứng dụng chủng ĐTN4.19 trong trị bệnh thối rễ cho cây Địa Lan Vì thời gian đề tài có hạn mà cây Địa Lan là cây lâu năm nên kết quả chỉ là sơ bộ bước đầu. Chúng tôi vẫn tiếp tục quan sát sự phát triển của những cây Địa Lan đang hồi phục. Rễ thối Rễ thối Cây Lan bệnh thối rễ Rễ con mới mọc khỏe mạnh KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1. Kết luận 1.1 Kết quả phân lập và tuyển chọn các chủng nấm sợi có khả năng sinh hoạt chất đối kháng từ rừng Đà Lạt – Lâm Đồng. - Từ 297 chủng nấm sợi thuần khiết phân lập được từ rừng Đà Lạt – Lâm Đồng, chúng tôi đã tiến hành khảo sát hoạt tính đối kháng. Có 86 chủng có hoạt tính đối kháng trong đó 28/297 chủng có phổ kháng khuẩn rộng, kháng cả vi khuẩn Gr+ và Gr-. - Đã chọn được 4 chủng nấm sợi có hoạt tính đối kháng cao và phổ kháng khuẩn rộng (vừa kháng VK Gr+ và Gr-) để tiếp tục nghiên cứu. - Từ 4 chủng được tuyển chọn, đã tiến hành thử khả năng kháng các nấm, vi khuẩn gây bệnh ở cây trồng. Kết quả đã chọn được 2 chủng: + Chủng ĐTN3.8 (được định danh là Trichoderma atroviride) kháng được tất cả 6 chủng nấm sợi gây bệnh được thử, 2 chủng vi khuẩn gây bệnh ở cây Địa Lan. + Chủng ĐTN4.19 có khả năng kháng tất cả 6 chủng nấm sợi gây bệnh được thử, 2 chủng vi khuẩn gây bệnh ở cây Địa Lan. 1.2 Đã nghiên cứu đặc điểm sinh học cơ bản của các chủng nấm sợi được tuyển chọn - Cả 2 chủng nấm sợi được tuyển chọn có enzyme cellulaza rất mạnh, riêng hoạt tính enzyme proteaza và amylaza kém. - Cả 2 chủng phát triển tốt trên nguồn Cacbon là rỉ đường, nguồn Nitơ là bột đậu. Nguồn rỉ đường, bột đậu đều là nguồn nguyên liệu thô. Điều đó có ý nghĩa thực tiễn trong việc chọn nguồn dinh dưỡng cho việc nuôi cấy 2 chủng sau này. - Cả 2 chủng nấm sợi sinh trưởng, phát triển tốt và sinh hoạt chất đối kháng ở pH từ 4 đến 7 nhưng thích hợp nhất là từ 5-6. - Cả 2 chủng đều có hoạt tính đối kháng từ ngày thứ 3 sau khi cấy. Chủng ĐTN3.8 hoạt tính đối kháng mạnh nhất vào ngày thứ 4 sau khi cấy. Chủng ĐTN4.19 có hoạt tính đối kháng mạnh nhất vào ngày 5 sau khi cấy. - Dịch chiết hoạt chất đối kháng thô của 2 chủng nấm tuyển chọn rất bền với nhiệt độ. - Chủng ĐTN3.8 được định danh là Trichoderma atroviride. - Chủng ĐTN4.19 là chủng nấm sợi có nhiều đặc điểm hình thái (vi thể và đại thể) rất mới lạ. Đã gửi đi định danh ở các phòng thí nghiệm khác nhau nhưng vẫn chưa định danh loài này được. Từ đó, chúng tôi tiên đoán có thể đây là một nấm sợi mới. Cần được tiếp tục nghiên cứu để xác định vị trí phân loại của chủng này. 1.3 Đã bước đầu thử nghiệm khả năng ứng dụng các chủng nấm sợi được chọn trong phòng và trị bệnh cho cây Địa Lan (Cymdibium) ở Đà Lạt. - Trên giá thể trồng cây Địa Lan là Trấu và Dớn đốt hun có bổ sung Trichoderma atroviride cây phát triển tốt, lá xanh, rễ con ra nhanh, trắng, mập so với lô đối chứng không có bổ sung Trichoderma atroviride. - Đã dùng DNC của chủng ĐTN4.19 để trị bệnh thối rễ trên cây Địa Lan. Kết quả cho thấy cây có dấu hiệu phục hồi so với lô đối chứng. Ở lô thí nghiệm bằng dịch nuôi cấy nguyên chất và tỷ lệ 1/2, cây bệnh đã có rễ con đã xuất hiện sau 3 tháng theo dõi. 2. Kiến nghị. Vì thời gian thực hiện đề tài có hạn, các trang thiết bị ở phòng thí nghiệm chỉ ở mức cơ bản. Mong rằng các nghiên cứu sau sẽ tiếp tục khảo sát sau hơn về các chủng nấm sợi ở rừng Đà Lạt: - Xác định bản chất hoạt chất đối kháng của các chủng nấm sợi đã được tuyển chọn. - Tiếp tục theo dõi việc sử dụng các chủng đã tuyển chọn để phòng và trị bệnh cho cây Địa Lan ở Đà Lạt. - Chủng ĐTN4.19 có những đặc điểm mới lạ nên tiếp tục nghiên cứu để xác định vị trí phân loại của chủng này. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Lê Huy Bá (2004), “Môi trường” – NXB Đại học Quốc gia TP. HCM 2. Bộ Y Tế (2007), “VSV Y học” , NXB Y học 3. Phạm Văn Biên, Bùi Cách Tuyễn (2003), “Cẩm nang sâu bệnh hại cây trồng”, NXB Nông Nghiệp Tp. HCM. 4. Lê Thị Châu (2004), “Nghiên cứu khu hệ vi nấm gây bệnh và có lợi cho cây thông vùng Đà Lạt , Lâm Đồng”, Viện Khoa học và công nghệ Việt Nam, Viện Sinh học Nhiệt đới, Phân viện Sinh học tại Đà Lạt. 5. Phạm Thị Kim Chi , “Nghiên cứu Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của các chủng nấm mốc được phân lập từ chế phẩm EM có khả năng sinh kháng kháng sinh kháng nấm gây bệnh ở cây trồng”, Luận văn tốt nghiệp cử nhân Đại học Sư Phạm Tp. HCM niên khoá 1997-2001. 6. Lê Đình Đôn, “Nguyên cứu nguyên nhân và biện pháp phòng trừ bệnh chết cây địa lan tại Đà Lạt-Lâm Đồng”, Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh (đề tài cấp Sở khoa học và Công nghệ Lâm Đồng) 2004-2005. 7. Nguyễn Lân Dũng, “Sử dụng VSV để phòng trừ sâu hại cây trồng”, NXB Khoa học Kỹ thuật Hà Nội. 8. Nguyễn Văn Đàn, Lê Nguyên Công (1983), “Sử dụng thuốc trừ sâu trong nông nghiệp”, Tạp chí Hoạt động Khoa học. 9. Nguyễn Lân Dũng, Phạm Thị Trân Châu, Nguyễn Thanh Hiền, Lê Đình Lương, Đoàn Xuân Mượu, Phạm Văn Ty (1978), “Một số phương pháp nghiên cứu VSV học Tập 3” , NXB Khoa học và Kỹ thụât Hà Nội. 10. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (1998), “VSV học”, NXB Giáo Dục. 11. Nguyễn Lân Dũng , “VSV tổng hợp” , NXB Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội 12. Nguyễn Thành Đạt (2005), “Cơ sở sinh học VSV Tập 1,2” , NXB ĐH Sư Pham Hà Nội. 13. Bùi Xuân Đồng (2004), “Nguyên lý phòng chống nấm mốc & mycotoxin”, NXB Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội 14. Mai Thị Hằng, Phan Nguyên Hồng (2002), Đánh giá vai trò của VSV trong hệ sinh thái rừng ngập mặn”, Trường Đại học Sư Phạm Hà Nội 15. Trương Phước Thiên Hoàng (2007), “Khảo sát hoạt tính một số hệ enzyme thủy phân amylase, cellulase, peectinase thu từ ba chủng Trichoderma phân lập từ miền Đông Nam bộ”, Luận án Thạc sĩ Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Tp. HCM 16. Nguyễn Thị Quảng Hoa (1995), “Tính khả thi về mặt khoa học của việc sản xuất chế phẩm B. thuringiensis tại Đà Lạt”. 17. TS Lê Thanh Hoà, GS. TSKH Đái Duy Ban (2002), “Công nghệ sinh học đối với cây trồng và vật nuôi Tập 2”, NXB Nông Nghiệp 18. Phạm Thành Hổ (2005), “Nhập môn công nghệ sinh học”, NXB Giáo Dục. 19. Hội thảo khoa học năm 2002, “Kết quả nghiên cứu khoa học và nâng cao nhận thức cho cộng đồng ở các vùng rừng ngập mặn thuộc Thái Bình và Nam Định”, Hà Nội. 20. Nguyễn Đức Lượng (2002), “Công nghệ vi sinh (T1,T2)”, NXB Đại học Quốc gia Tp. HCM. 21. Nguyễn Đức Lượng (2006), “Thí nghiệm Công nghệ sinh học (T1,2)”, NXB Đại học Quốc gia Tp. HCM. 22. Vũ Triệu Mân (2007), “Giáo trình bệnh cây chuyên khoa”, Đại học Nông nghiệp I Hà Nội. 23. Vũ Triệu Mân (2007), “Giáo trình bệnh cây đại cương”, Đại học Nông Nghiệp I Hà Nội. 24. Biền Văn Minh (2000), “Nghiên cứu khả năng sinh chất kháng sinh của một số chủng xạ khuẩn phân lập từ đất Bình Trị Thiên”, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội. 25. Đặng Vũ Hồng Miên (1999), “Bảng phân loại các loài nấm mốc thường gặp”, NXB Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội. 26. Lê Thị Thanh Nga (2001), “Nghiên cứu đặc điểm chủng xạ khuẩn THSD sinh kháng sinh chống bệnh hại cây trồng”, Luận văn thạc sĩ sinh học trường ĐH Sư phạm Tp. HCM. 27. Phan Thanh Phương (2007), “Khảo sát khả năng sinh kháng sinh của các chủng nấm sợi phân lập từ rừng ngập mặn huyện Cần Giờ Tp. HCM”, Luận văn thạc sĩ trường ĐH Sư Phạm Tp.HCM. 28. Lê Xuân Phương (2001), “VSV Công nghiệp”, NXB Xây dựng ĐH Đà Nẵng. 29. Lương Đức Phẩm (2007), “Công nghệ VSV”, NXB Nông Nghiệp. 30. Lương Đức Phẩm (2007), “Các chế phẩm sinh học dùng trong chăn nuôi và nuôi trồng thuỷ sản”, NXB Nông Nghiệp. 31. Lương Đức Phẩm, Hồ Sưởng (1978), “Vi sinh tổng hợp”, NXB Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội 32. TS Trần Thị Thanh (2007), “Công Nghệ Vi Sinh” , NXB Giáo Dục 33. Nguyễn Xuân Thành (chủ biên), Nguyễn Như Thành, Dương Đức Tiến (2004), “VSV Nông nghiệp”, NXB Đại học Sư Phạm 34. Nguyễn Xuân Thành, Lê Văn Hưng, Phạm Văn Toản (2003), “Giáo trình Công nghệ VSV trong sản xuất Nông Nghiệp và xử lý ô nhiễm môi trường”, NXB Nông Nghiệp. 35. Trần Thanh Thuỷ (1999), “Hướng dẫn thực hành VSV học” , NXB Giáo dục 36. Nguyễn Thị Thu (2005), “Nghiên cứu đặc tính sinh học và khả năng sinh kháng sinh của các chủng Streptomyces phân lập từ rừng ngập mặn Việt Nam”, Luận văn tốt nghiệp Trường ĐH Sư Phạm Hà Nội. 37. Lê Đức Tuấn (2002), “Khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ”, NXB Nông Nghiệp Tp.HCM. 38. Nguyễn Ngọc Tú, Nguyễn Cửu Thị Hương Giang (1997), “Bảo vệ cây trồng bằng các chế phẩm từ vi nấm”, NXB Nông Nghiệp Tp. HCM 39. Ủy ban nhân dân tỉnh Lâm Đồng (2008), “Địa Chí Đà Lạt”, NXB Tổng hợp TP.HCM. 40. Phân viện Khoa học Việt Nam (1976 – 1982), “Nghiên cứu sản xuất thuốc trừ sâu vi sinh Bt” 41. Liên hiệp khoa học sản xuất thuốc trừ sâu vi sinh B. thuringiensis. (1984). 42. Viện Sinh học Nhiệt Đới (1998), “Tuyển tập các công trình nghiên cứu khoa học (1993 – 1998), (1999-2000)”, NXB Nông Nghiệp Tp. HCM. 43. Các báo cáo của Viện Khoa học, “Sử dụng VSV chống côn trùng và các bệnh có hại cho cây trồng”. 44. 45. 46. 47. 48. 49. 50. 51. toan-cau.htm 52. contrung/24428_Virus_H1N1_nguy_hiem_hon_nhieu_so_voi_suy_nghi_cu a_con_nguoi.aspx 53. 54. 55. thuong 56. ries/37/Default.aspx 57. 9 58. 59. 60. 61. kha-nang-khang-thuoc.html 62. 63. 64. 65. 66. 67. 68. 69. 70. 71. 72. 73. 74. 75. 76. 77. 78. 79. 80. 81. cleID=1106 82. D=15 83. PHỤ LỤC Khuẩn lạc chủng T. atroviride trên môi trường Czapek Dox sau 4 ngày nuôi cấy Khuẩn ty và cuốg sinh bào tử của chủng Trichoderma atroviride. Khuẩn lạc chủng ĐTN4.19 trên môi trường khoai tây sau 4 ngày nuôi cấy. Hình thái vi thể của chủng ĐTN4.19 Hình thái vi thể của chủng ĐTN4.19 Hoạt tính đối kháng với B. subtilis và E. coli của chủng ĐTN4.19 (mặt sau đĩa petri) Khả năng bền nhiệt của dịch chiết hoạt chất đối kháng thô của chủng ĐTN4.19 ở nhiệt độ 121oC. Cây Địa Lan - Cam Lửa bị bệnh thối rễ. Cây Địa Lan phát triển mạnh trên hỗn hợp Trấu và Dớn đốt có bổ sung Trichoderma atroviride so với cây Địa Lan trồng trên hỗn hợp Trấu và Dớn không đốt. Địa Lan trồng trên Trấu và Dớn đốt có bổ sung Trichoderma atroviride rễ phát triển nhanh và trắng hơn trồng trên Dớn.