Luận văn Nghiên cứu một số biến đổi hình thái của sự phát sinh cơ quan in vitro của cây cọc rào (Jatropha curcas L.) từ nuôi cấy lớp mỏng tế bào lá

Kết quả - Thảo luận  Trang 43 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả 3.1.1. Khảo sát ảnh hưởng của Javel và thời gian khử trùng lên các chồi ngọn và chồi bên cây JCL khi đưa vào nuôi cấy in vitro Bảng 3.1: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của Javel và thời gian khử trùng lên các chồi ngọn và chồi bên cây JCL theo thời gian Ngày thứ 7 Ngày thứ 10 Ngày thứ 14 Nghiệm thức (1) (2) (3) (1) (2) (3) (1) (2) (3) J25-10 0 40 40 0 60 60 0 70 70 J25-20 0 60 60 0 80 80 0 90 90 J25-30 0 50 50 0 90 90 0 90 90 J50-10 10 30 20 10 40 30 10 50 40 J50-20 0 0 0 0 0 0 0 40 40 J50-30 0 0 0 0 0 0 0 0 0 J100-10 0 0 0 0 0 0 0 0 0 J100-20 0 0 0 0 0 0 0 0 0 J100-30 0 0 0 0 0 0 0 0 0 (1): Tỉ lệ nhiễm (%) (2): Tỉ lệ nảy chồi (%) (3): Tỉ lệ nảy chồi và không nhiễm (%) Nói chung khi đưa mẫu nuôi cấy của bất kỳ cây trồng nào vào nuôi cấy in vitro phục vụ công tác nghiên cứu đều cần phải khử trùng mẫu. Tuy nhiên, đối với cây JCL, thí nghiệm khử trùng mẫu được đặt thành vấn đề và được đặc biệt quan tâm, vì sau khi cắt mẫu khỏi cây mẹ thì ngay tại vết cắt, nhựa được tiết ra rất nhiều. Chính nhựa này có ảnh hưởng đến độ sống sót của chồi được đưa vào nuôi cấy. Hơn nữa, chất nhựa tạo cơ sở bám dính cho vi khuẩn và nấm nên làm cho việc khử trùng mẫu vô cùng khó khăn. Kết quả - Thảo luận  Trang 44 Kết quả ghi nhận cho thấy, việc sử dụng Javel (natri hypoclorid) trong khử trùng các mẫu chồi non cây JCL mang lại hiệu quả cao. Chỉ có nghiệm thức Javel ở nồng độ 50% (v/v), thời gian khử trùng 10 phút có hiện tượng nhiễm nấm, nhưng với tỉ lệ thấp (10%) so với những cây thân gỗ khác. Điều này cũng có thể còn do nguồn mẫu chồi non trước khi thí nghiệm đã tương đối sạch nấm bệnh. Khử trùng mẫu với nồng độ Javel 25% (v/v) trong thời gian 20-30 phút thích hợp để mẫu sau khử trùng không bị nhiễm và có tỉ lệ nảy chồi cao. 14 ngày 28 ngày Ảnh 3.1: Mẫu chồi bên đã khử trùng bằng Javel 25% (v/v) trong 30 phút nảy chồi khi được nuôi cấy trong điều kiện in vitro Ảnh 3.2: Mẫu bị nhiễm nấm Kết quả - Thảo luận  Trang 45 3.1.2. Sự hình thành mô sẹo từ nuôi cấy lớp mỏng tế bào lá JCL 3.1.2.1. Ảnh hưởng của auxin lên sự hình thành mô sẹo từ lớp mỏng tế bào lá JCL Qua quá trình khảo sát sơ bộ trên môi trường W không được bổ sung chất ĐHSTTV hoặc được bổ sung một trong các lọai auxin sau: IAA (0,1; 0,5; 1,0 và 1,5 mg/l); IBA (0,1; 0,5; 1,0 và 1,5 mg/l); 2,4-D (0,1; 0,5; 1,0 và 1,5 mg/l) hoặc TDZ (0,1; 0,3; 0,5 và 1,0 mg/l), chúng tôi nhận thấy có những biến đổi rất khác nhau về sự tạo mô sẹo từ nuôi cấy lớp mỏng tế bào lá cây JCL in vitro. Sau 14 ngày nuôi cấy, các mẫu cấy có biểu hiện biến đổi hình thái tạo mô sẹo hoặc không phát triển và hóa nâu, chết dần ở những nghiệm thức có bổ sung auxin khác nhau. Các biến đổi được ghi nhận cho thấy chỉ những mẫu cấy được nuôi trên môi trường W có bổ sung 2,4-D mới có khả năng tạo mô sẹo. Ở các nghiệm thức được bổ sung IAA, IBA, TDZ, hoặc không được bổ sung chất ĐHSTTV, các mẫu cấy đều không đáp ứng, hóa nâu và chết dần sau 14 – 28 ngày nuôi cấy. Để tìm hiểu rõ hơn về ảnh hưởng của auxin lên khả năng hình thành mô sẹo từ nuôi cấy lớp mỏng tế bào lá cây JCL, chúng tôi tiếp tục khảo sát các nghiệm thức môi trường có bổ sung 2,4-D và IBA. Ảnh hưởng của 2,4-D và IBA lên khả năng hình thành mô sẹo từ nuôi cấy lớp mỏng tế bào lá JCL Mẫu cấy được nuôi trong môi trường W có bổ sung riêng lẻ 2,4-D và IBA ở các nồng độ 0,1; 0,5; 1,0 và 1,5 mg/l. Kết quả cho thấy, mẫu cấy là lớp mỏng tế bào lá không có khả năng hình thành mô sẹo trên môi trường W chỉ được bổ sung IBA. Các mẫu cấy đều không đáp ứng, hóa nâu và chết dần sau 21 ngày nuôi cấy. Ảnh hưởng của 2,4-D lên trọng lượng tươi của các mẫu cấy được ghi nhận sau 28 ngày nuôi cấy và được trình bày ở bảng 3.2. Kết quả - Thảo luận  Trang 46 Bảng 3.2: Ảnh hưởng của 2,4-D lên sự hình thành mô sẹo sau 28 ngày 2,4-D (mg/l) Nghiệm thức Trọng lượng tươi (mg) % mẫu cấy tạo mô sẹo Biến đổi hình thái sau 28 ngày nuôi cấy 0,1 D0,1 3,95 ± 0,30 0 Mẫu cấy không đáp ứng, dần hóa nâu và chết 0,5 D0,5 4,05 ± 0,39 0 Mẫu cấy không đáp ứng, dần hóa nâu và chết 1,0 D1 22,15 ± 9,97 47,22 ± 5,55 Mẫu cấy tạo khối mô sẹo nhỏ, trắng hơi trong, kết cấu xốp và rời rạc 1,5 D1,5 74,18 ± 16,44 100 Mẫu cấy tạo khối mô sẹo to, màu trắng hơi trong, kết cấu xốp và rời rạc. Phần tiếp xúc với môi trường dần hóa nâu đen Kết quả cho thấy mẫu cấy là lớp mỏng tế bào lá cây JCL có khả năng hình thành mô sẹo trên môi trường W được bổ sung 2,4-D. Tỷ lệ mẫu cấy tạo mô sẹo và trọng lượng tươi của mô sẹo gia tăng cùng với hàm lượng 2,4-D. So với các nghiệm thức D0,1, D0,5 và D1 thì nghiệm thức D1,5 có sự khác biệt rất rõ về gia tăng trọng lượng tươi của mẫu cấy và tỷ lệ mẫu cấy hình thành mô sẹo. Ghi nhận sự biến đổi hình thái mẫu cấy trên các nghiệm thức môi trường này cho thấy, các mẫu cấy bắt đầu quá trình hình thành mô sẹo sau khỏang 7 – 10 ngày nuôi cấy. Khối mô sẹo hình thành có trạng thái xốp, trắng hơi trong sau 28 ngày nuôi cấy, nuôi cấy tiếp tục sẽ dần hóa nâu và chết sau 56 ngày. 3.1.2.2. Ảnh hưởng của tổ hợp auxin và cytokinin lên sự hình thành mô sẹo từ lớp mỏng tế bào lá JCL 3.1.2.2.1. Ảnh hưởng của tổ hợp 2,4-D và BA lên khả năng hình thành mô sẹo từ nuôi cấy lớp mỏng tế bào lá JCL Mẫu cấy được nuôi trong môi trường W bổ sung 2,4-D ở nồng độ 0,1 mg/l và BA ở nồng độ 1,0 mg/l. Kết quả sự thay đổi trọng lượng tươi của mẫu cấy và tỷ lệ mẫu cấy tạo mô sẹo theo thời gian được ghi nhận ở bảng 3.3. Kết quả - Thảo luận  Trang 47 Bảng 3.3: Sự biến đổi hình thái khối mô sẹo theo thời gian trên môi trường W + 0,1 mg/l 2,4-D + 1,0 mg/l BA Chỉ tiêu Thời gian (ngày) Trọng lượng tươi (mg) % mẫu cấy tạo mô sẹo Một số biến đổi hình thái 14 46,92 ± 23,59 100 Mẫu cấy phát triển, gia tăng kích thước mô cấy, tạo khối mô sẹo trắng, hơi trong, kết cấu chặt 28 100,50 ± 36,30 100 Phần trên khối mô sẹo chuyển dần sang màu xanh nhạt, kết cấu cứng chắc 56 117,54 ± 23,47 100 Mô sẹo hóa nâu và chết. Phần trên khối mô sẹo mất dần màu xanh và chuyển sang màu trắng hơi vàng, kết cấu trở nên lỏng lẻo; phần dưới hóa nâu đen, kết cấu chặt Ghi nhận sự biến đổi hình thái mẫu cấy trên môi trường này cho thấy các mẫu cấy có phản ứng rất sớm với tổ hợp auxin 2,4-D và cytokinin BA. Quá trình hình thành mô sẹo bắt đầu sau khỏang 7 ngày nuôi cấy, các mẫu cấy có dấu hiệu mất màu xanh. Sau 10 – 14 ngày, sự tăng sinh diễn ra mạnh mẽ. Sau khỏang 28 ngày nuôi, hình thành khối mô sẹo lớn, kết cấu cứng chắc, màu trắng, hơi trong, dần chuyển sang xanh lục nhạt. Nhìn chung, đây là dạng mô sẹo khó có khả năng tái sinh chồi. Sau 56 ngày, bên dưới khối mô sẹo (mặt tiếp xúc trực tiếp với môi trường) xuất hiện vùng hóa nâu đen, phần mô sẹo phía trên mất dần màu xanh, không tạo chồi. Quan sát tiếp tục cho thấy kết cấu khối mô sẹo dần trở nên lỏng lẻo, hóa nâu và chết. Kết quả - Thảo luận  Trang 48 2 tuần 4 tuần Ảnh 3.3: Hình thái mô sẹo trên môi trường W + 0,1 mg/l 2,4-D + 1,0 mg/l BA theo thời gian Kết quả - Thảo luận  Trang 49 3.1.2.2.2. Ảnh hưởng của tổ hợp IBA và BA lên khả năng hình thành mô sẹo từ nuôi cấy lớp mỏng tế bào lá JCL Mẫu cấy được nuôi trong môi trường W có bổ sung IBA ở nồng độ 0,1 mg/l và BA ở nồng độ 1,0 mg/l. Kết quả sự thay đổi trọng lượng tươi của mẫu cấy và tỷ lệ mẫu cấy tạo mô sẹo theo thời gian được ghi nhận ở bảng 3.4. Bảng 3.4: Sự biến đổi hình thái khối mô sẹo theo thời gian trên môi trường W + 0,1 mg/l IBA + 1,0 mg/l BA Chỉ tiêu Thời gian (ngày) Trọng lượng tươi (mg) % mẫu cấy tạo mô sẹo Một số biển đổi hình thái 14 13,41 ± 7,71 63,89 ± 5,56 Gia tăng kích thước mô cấy, tạo khối mô sẹo rất nhỏ, màu trắng, xốp 28 22,96 ± 6,56 94,45 ± 5,55 Gia tăng kích thước mô cấy, tạo khối mô sẹo trắng xanh nhạt, dần chuyển sang xanh trắng, kết cấu cứng xốp 56 23,51 ± 5,84 97,22 ± 5,55 Hình thành vùng hóa nâu đen có kết cấu chặt ở mặt tiếp xúc trực tiếp với môi trường; phần mô sẹo phía trên mất dần màu xanh, kết cấu dần trở nên lỏng lẻo, hóa nâu và chết Trên môi trường W + 0,1 mg/l IBA + 1,0 mg/l BA, mẫu cấy lớp mỏng tế bào lá JCL cũng có sự thay đổi. Quan sát hình thái bên ngòai và cấu trúc giải phẫu bên trong của mẫu cấy cho thấy sau khỏang 7 – 10 ngày nuôi, bắt đầu có sự tăng sinh tế bào ở vùng tế bào nhu mô của mô thịt lá, khối mô sẹo ban đầu có màu trắng, xốp. Sau 28 ngày, hình thành khối mô sẹo màu trắng xanh, dần chuyển sang xanh trắng, với kết cấu cứng xốp xen lẫn có khả năng tạo chồi. Trong khối mô sẹo là những đám tế bào phân chia mạnh nằm chủ yếu vùng nhu mô thịt lá, và xuất hiện các bó mạch nằm rải rác bên Kết quả - Thảo luận  Trang 50 trong khối mô. Sau 56 ngày, khối mô sẹo cũng hình thành vùng hóa nâu đen có kết cấu chặt ở mặt tiếp xúc trực tiếp với môi trường, phần mô sẹo phía trên mất dần màu xanh. Tiếp tục theo dõi cho thấy kết cấu mô sẹo dần trở nên lỏng lẻo, hóa nâu và chết. Nhìn chung, quá trình hình thành mô sẹo trên môi trường được bổ sung BA (1,0 mg/l) kết hợp với IBA (0,1 mg/l) diễn ra chậm và yếu hơn so với khi kết hợp với 2,4-D (0,1 mg/l); tuy nhiên, đây là dạng mô sẹo có thể có khả năng tái sinh cơ quan cao. Kết quả - Thảo luận  Trang 51 2 tuần 3 tuần 4 tuần Ảnh 3.4: Hình thái mô sẹo trên môi trường W + 0,1 mg/l IBA + 1,0 mg/l BA theo thời gian Kết quả - Thảo luận  Trang 52 Ảnh 3.5: Cấu trúc giải phẫu mẫu cấy lớp mỏng tế bào lá ban đầu Kết quả - Thảo luận  Trang 53 Ảnh 3.6: Cấu trúc giải phẫu mẫu cấy lớp mỏng tế bào lá trên môi trường W + 0,1 mg/l IBA + 1,0 mg/l BA, sau 1 tuần bắt đầu có sự phân chia tế bào ở vùng nhu mô thịt lá Kết quả - Thảo luận  Trang 54 Ảnh 3.7: Cấu trúc giải phẫu mẫu cấy lớp mỏng tế bào lá trên môi trường W + 0,1 mg/l IBA + 1,0 mg/l BA, sau 2 tuần có sự phân chia tế bào ở vùng nhu mô thịt lá, hình thành các khối u nhỏ những tế bào đồng đều phát triển khỏi lớp biểu bì Kết quả - Thảo luận  Trang 55 Ảnh 3.8: Cấu trúc giải phẫu mẫu cấy lớp mỏng tế bào lá trên môi trường W + 0,1 mg/l IBA + 1,0 mg/l BA, sau 4 tuần có sự phân chia mạnh tế bào và sự xuất hiện của các bó mạch Kết quả - Thảo luận  Trang 56 3.1.3. Sự tạo chồi từ mô sẹo tế bào lá cây JCL Sau 28 ngày được nuôi trong các môi trường cảm ứng tạo mô sẹo W + 0,1 mg/l 2,4-D + 1,0 mg/l BA và W + 0,1 mg/l IBA + 1,0 mg/l BA, các mẫu cấy tạo sẹo được cấy chuyển sang môi trường W không hoặc có bổ sung BA (1,0; 3,0 hoặc 5,0 mg/l), không có 2,4-D và IBA nhằm kích thích sự tạo chồi. Kết quả cho thấy những mô sẹo được tạo ra trong môi trường được bổ sung 2,4- D và BA không có khả năng tái sinh, hòan tòan không tạo chồi ở tất cả các nghiệm thức. Quan sát hình thái bên ngòai cho thấy, sau 14 ngày nuôi trong môi trường phát sinh chồi, các khối mô sẹo mất dần màu xanh. Sau khỏang 28 ngày, kết cấu mô sẹo trở nên lỏng lẻo, khối mô sẹo dần hóa nâu và chết. Chỉ những mô sẹo hình thành trên môi trường được bổ sung IBA kết hợp với BA là có khả năng tái sinh chồi. Kết quả thí nghiệm bao gồm tỷ lệ mẫu cấy tạo chồi và số chồi tái sinh trung bình trên một mẫu cấy được ghi nhận ở bảng 3.5. Kết quả - Thảo luận  Trang 57 Bảng 3.5: Khả năng phát sinh chồi từ nuôi cấy các mô sẹo trên môi trường W có bổ sung BA (1,0; 3,0 và 5,0 mg/l) hoặc không có BA theo thời gian Thời gian Môi trường tái sinh Nghiệm thức % mẫu cấy tạo chồi Số chồi/mẫu cấy W B0 0 0 W + 1,0 mg/l BA B1 13,33 ± 13,33 0,13 ± 0,13 W + 3,0 mg/l BA B3 13,33 ± 13,33 0,13 ± 0,13 14 ngày W + 5,0 mg/l BA B5 0 0 W B0 0 0 W + 1,0 mg/l BA B1 53,33 ± 13,33 4,35 ± 1,20 W + 3,0 mg/l BA B3 46,67 ± 13,33 4,01 ± 1,89 28 ngày W + 5,0 mg/l BA B5 0 0 W B0 0 0 W + 1,0 mg/l BA B1 86,67 ± 13,33 7,80 ± 1,52 W + 3,0 mg/l BA B3 60,00 ± 26,67 5,66 ± 1,04 56 ngày W + 5,0 mg/l BA B5 0 0 Trong bốn nghiệm thức môi trường được dùng để tái sinh, tỷ lệ mô cấy tạo chồi và lượng chồi thu được cao nhất từ môi trường nghiệm thức B1 (W + 1,0 mg/l BA). Môi trường nghiệm thức B0 (W không bổ sung BA) và B5 (W + 5,0 mg/l BA) cho kết quả tái sinh thấp nhất. Trên các môi trường nghiệm thức B0 và B5, các mẫu cấy hòan tòan không đáp ứng. Mô sẹo dần hóa nâu và chết sau khỏang 28 ngày được nuôi trong môi trường này. Trên môi trường nghiệm thức B3, các mô cấy có dấu hiệu đáp ứng. Sau 7 ngày nuôi cấy, có sự tăng sinh tế bào làm kích thước mô cấy tăng lên. Sau 14 – 21 ngày, trên bề mặt mô cấy hình thành vài khối nốt sần. Sau 21 – 28 ngày, mô cấy hình thành các cơ quan chồi. Tuy nhiên, trên môi trường này, tỷ lệ mẫu cấy có khả năng tái sinh chồi và số chồi trên một mẫu cấy thấp hơn so với môi trường nghiệm thức B1. Sau 56 ngày, trung bình đạt khỏang 60,00 ± 26,67% mô cấy tạo chồi, số chồi tái sinh trên một mẫu cấy là 5,66 ± 1,04 chồi. Những mô cấy không tái sinh dần bị mất màu xanh, hóa nâu và chết. Kết quả - Thảo luận  Trang 58 Trên môi trường nghiệm thức B1, sự đáp ứng của các mô cấy thể hiện rất rõ. Sau 7 ngày nuôi cấy, mô cấy là những mô sẹo tăng sinh mạnh; và sau 14 – 21 ngày tạo nên một khối mô dày với nhiều nốt sần trên bề mặt mô cấy có cấu trúc như những sơ khởi chồi. Sau 28 – 35 ngày nuôi cấy, trên bề mặt các nốt sần xuất hiện các chồi; trung bình có khỏang 86,67 ± 13,33% mô cấy tạo chồi với 7,80 ± 1,52 chồi / mẫu cấy sau 56 ngày. Cấu trúc giải phẫu của mẫu cấy sau 21 ngày nuôi cấy trên môi trường này rất phức tạp, có sự phân chia mạnh ở các nốt sần của vùng tế bào ở bề mặt trên mẫu cấy và rất nhiều bó mạch nằm rải rác bên trong, bề mặt nốt sần hình thành cấu trúc sơ khởi chồi. Kết quả - Thảo luận  Trang 59 Ảnh 3.9: Cụm chồi hình thành ở mẫu cấy trên môi trường W + 1,0 mg/l BA sau 8 tuần nuôi cấy Ảnh 3.10: Cụm chồi phát triển ở mẫu cấy trên môi trường W + 1,0 mg/l BA sau 10 tuần nuôi cấy Ảnh 3.11: Chồi phát triển trên môi trường W + 1,0 mg/l BA sau 16 tuần nuôi cấy Kết quả - Thảo luận  Trang 60 Ảnh 3.12: Sự biệt hóa một nốt mạch từ tế bào nhu mô Kết quả - Thảo luận  Trang 61 Kết quả - Thảo luận  Trang 62 Ảnh 3.13: Phát sinh chồi ở mô cấy trên môi trường W + 1,0 mg/l BA, sau 3 tuần có sự hình thành phát thể chồi, tế bào nhỏ dần, vách mỏng, tế bào chất đậm đặc, nhân to Kết quả - Thảo luận  Trang 63 3.1.4. Sự tạo rễ từ mô sẹo tế bào lá cây JCL Các mô sẹo hình thành trên môi trường W + 0,1 mg/l IBA + 1,0 mg/l BA sau khỏang 38 – 42 ngày được cấy chuyển sang môi trường W không có chất ĐHSTTV hoặc có bổ sung riêng lẻ IBA (0,5; 1,0; 3,0 và 5,0 mg/l) hoặc NAA (0,5; 1,0; 2,0 và 3,0 mg/l) nhằm kích thích sự tạo rễ. Kết quả cho thấy các khối mô sẹo chỉ có khả năng phát sinh rễ trong môi trường được bổ sung NAA. Kết quả thí nghiệm bao gồm tỷ lệ % mẫu cấy hình thành rễ, số rễ tái sinh trung bình trên một mẫu và chiều dài trung bình của rễ được ghi nhận ở bảng 3.6. Các mẫu cấy hòan tòan không đáp ứng trên các môi trường không được bổ sung chất ĐHSTTV hoặc được bổ sung IBA, mô sẹo dần hóa nâu và chết sau 14 – 28 ngày. Bảng 3.6: Khả năng phát sinh rễ từ nuôi cấy các mô sẹo trên môi trường W không có chất ĐHSTTV hoặc có bổ sung riêng lẻ NAA (0,5; 1,0; 2,0 và 3,0 mg/l) hoặc IBA (0,5; 1,0; 3,0 và 5,0 mg/l) sau 28 ngày Môi trường tái sinh Nghiệm thức % mẫu cấy tạo rễ Số rễ/mẫu cấy Chiều dài rễ (mm) W N0I0 0 0 0 0,5 mg/l N0,5 66,67 ± 2,45 4,10 ± 1,21 7,52 ± 1,86 1,0 mg/l N1 100 8,23 ± 1,75 11,9 ± 2,05 2,0 mg/l N2 100 5,41 ± 1,34 8,30 ± 1,90 W + NAA 3,0 mg/l N3 100 6,56 ± 0,87 7,43 ± 2,11 0,5 mg/l I0,5 0 0 0 1,0 mg/l I1 0 0 0 3,0 mg/l I3 0 0 0 W + IBA 5,0 mg/l I5 0 0 0 Kết quả ghi nhận cho thấy, sau khỏang 10 ngày nuôi cấy trên môi trường tạo rễ được bổ sung NAA, mẫu cấy là các mô sẹo dần phát triển thành các khối mô lớn, kết cấu chặt, màu trắng xanh lục nhạt. Sau khỏang 21 ngày, các sơ khởi rễ hình thành trên các khối mô này chuyển sang giai đọan kéo dài sơ khởi rễ. Rễ được tạo ra có kích thước lớn, nằm phía dưới bề mặt môi trường. Kết quả - Thảo luận  Trang 64 Trong bốn nghiệm thức môi trường được dùng để tái sinh rễ có bổ sung NAA, tỷ lệ mẫu cấy tạo rễ, số lượng rễ trung bình trên một mẫu cấy và chiều dài trung bình của rễ đạt cao nhất ở môi trường nghiệm thức N1 (W + 1,0 mg/l NAA). Môi trường nghiệm thức N0,5 (W + 0,5 mg/l NAA) cho kết quả tái sinh thấp nhất (bảng 3.6). Kết quả - Thảo luận  Trang 65 Ảnh 3.14: Rễ hình thành và phát triển ở mô cấy trên môi trường W + 1,0 mg/l NAA sau 4 tuần nuôi cấy Kết quả - Thảo luận  Trang 66 Ảnh 3.15: Cấu trúc giải phẫu rễ sau 4 tuần nuôi cấy trên môi trường W + 1,0mg/l NAA Kết quả - Thảo luận  Trang 67 3.1.5. Khảo sát họat tính các chất ĐHSTTV trong mẫu cấy ở các thí nghiệm nghiên cứu sự phát sinh hình thái từ nuôi cấy lớp mỏng tế bào lá cây JCL Các mô cấy lớp mỏng tế bào lá JCL tại các thời điểm nuôi cấy được đem ly trích, cô lập và sinh trắc nghiệm dịch trích để đo hàm lượng các chất ĐHSTTV nội sinh trong mẫu nuôi cấy. 3.1.5.1. Hàm lượng các chất ĐHSTTV trong mô cấy lớp mỏng tế bào lá JCL theo thời gian trên môi trường tạo mô sẹo W + 0,1 mg/l IBA + 1,0 mg/l BA Tiến hành sinh trắc nghiệm họat tính tổng cộng của các chất ĐHSTTV nội sinh trong mẫu cấy lớp mỏng lá cây JCL trên môi trường tạo mô sẹo ở các thời điểm T0 (mẫu cấy ban đầu), T1 (sau 14 ngày nuôi cấy), T2 ( sau 28 ngày nuôi cấy), T3 (sau 56 ngày nuôi cấy), thu nhận được kết quả theo bảng 3.7. Bảng 3.7: Họat tính tổng cộng của các chất ĐHSTTV nội sinh trong mẫu cấy theo thời gian trên môi trường tạo mô sẹo W + 0,1 mg/l IBA + 1,0 mg/l BA Họat tính chất ĐHSTTV nội sinh (mg/l) Chất ĐHSTTV T0 T1 T2 T3 Auxin 1,59 ± 0,07 2,02 ± 0,16 3,01 ± 0,29 0,75 ± 0,04 Cytokinin 0,42 ± 0,08 0,59 ± 0,10 1,27 ± 0,20 0,13 ± 0,03 Acid abcisic 0,37 ± 0,05 0,68 ± 0,04 0,50 ± 0,11 1,04 ± 0,09 Giberelin 2,06 ± 0,30 0,57 ± 0,10 1,98 ± 0,15 0 Kết quả - Thảo luận  Trang 68 Hình 3.1: Họat tính các chất ĐHSTTV nội sinh trong mô cấy lớp mỏng tế bào lá JCL theo thời gian trên môi trường tạo sẹo W + 0,1 mg/l IBA + 1,0 mg/l BA Kết quả cho thấy: Hàm lượng auxin nội sinh tổng số tăng dần theo thời gian nuôi cấy từ thời điểm T0 (1,59 ± 0,07 mg/l) đến thời điểm T2 (3,01 ± 0,29 mg/l), sau đó lại giảm xuống khi mô cấy giảm sự phát triển về sinh khối và dần hóa nâu ở thời điểm T3 (0,75 ± 0,04 mg/l). Cùng với auxin, cytokinin nội sinh tổng số cũng tăng dần theo thời gian từ thời điểm T0 (0,42 ± 0,08 mg/l) đến thời điểm T2 (1,27 ± 0,20 mg/l) và sau đó giảm dần đến hàm lượng rất thấp ở thời điểm T3 (0,13 ± 0,03 mg/l). Qua kết quả ở bảng 3.7, chúng tôi cũng ghi nhận tỷ lệ auxin/cytokinin trong mẫu cấy luôn lớn hơn 1 trong suốt thời gian nuôi cấy trên môi trường tạo mô sẹo. 3.1.5.2. Hàm lượng các chất ĐHSTTV trong mô cấy lớp mỏng tế bào lá JCL theo thời gian trên môi trường phát sinh chồi W + 1,0 mg/l BA Tiến hành sinh trắc nghiệm các chất ĐHSTTV nội sinh trong mẫu cấy lớp mỏng tế bào lá cây JCL tại các thời điểm T2-0 (mẫu cấy ban đầu, sau 28 ngày nuôi cấy trên môi trường tạo mô sẹo W + 0,1 mg/l IBA + 1,0 mg/l BA), T2-1 (sau 14 ngày nuôi cấy trên môi trường tái sinh chồi W + 1,0 mg/l BA) và T2-2 (sau 28 ngày nuôi cấy trên môi trường tái sinh chồi W + 1,0 mg/l BA), thu nhận được kết quả theo bảng 3.8. Kết quả - Thảo luận  Trang 69 Bảng 3.8: Họat tính tổng cộng của các chất ĐHSTTV nội sinh trong mẫu cấy theo thời gian trên môi trường tái sinh chồi W + 1,0 mg/l BA Họat tính chất ĐHSTTV nội sinh (mg/l) Chất ĐHSTTV T2-0 T2-1 T2-2 Auxin 3,01 ± 0,29 1,85 ± 0,17 1,09 ± 0,15 Cytokinin 1,27 ± 0,20 2,18 ± 0,23 2,74 ± 0,30 Acid abcisic 0,50 ± 0,11 0,52 ± 0,07 0,37 ± 0,24 Giberelin 1,98 ± 0,15 1,04 ± 0,16 1,29 ± 0,13 Hình 3.2: Họat tính các chất ĐHSTTV nội sinh trong mô cấy theo thời gian trên môi trường tạo chồi W + 1,0 mg/l BA Kết quả ghi nhận cho thấy: Hàm lượng auxin nội sinh tổng cộng trong mô cấy trên môi trường W + 1,0 mg/l BA tại thời điểm T2-2 (1,09 ± 0,15 mg/l) giảm mạnh so với thời điểm ban đầu T2-0 (3,01 ± 0,29 mg/l). Trong khi đó, hàm lượng cytokinin lại tăng dần lên từ thời điểm T2-0 (1,27 ± 0,20 mg/l) đến thời điểm T2-2 (2,74 ± 0,30 mg/l). Kết quả ghi nhận được cũng cho thấy tỷ lệ auxin/cytokinin dần đạt giá trị nhỏ hơn 1 sau khi mô cấy là các mô sẹo được cấy chuyển sang môi trường phát sinh chồi. Kết quả - Thảo luận  Trang 70 3.2. Thảo luận Về ảnh hưởng của các chất ĐHSTTV lên sự biến đổi hình thái từ nuôi cấy lớp mỏng tế bào lá JCL Mô sẹo (callus) là một khối tế bào không có tổ chức, hình thành từ các mô hoặc cơ quan đã phân hóa dưới các điều kiện đặc biệt như vết thương hoặc khi được xử lý bằng các chất ĐHSTTV. Đa số các mô và cơ quan của thực vật đều có khả năng tạo mô sẹo dưới một tác động thích hợp nào đó và chỉ có rất ít cơ quan thực vật không thể hiện được khả năng này. Sự phối hợp giữa auxin và cytokinin (BA) trong môi trường nuôi cấy có tác dụng kích thích sự phân chia vô tổ chức của tế bào, hình thành khối mô sẹo. Trong nhóm auxin, 2,4-D được xem là chất có hiệu quả mạnh trong việc tạo mô sẹo. Auxin có vai trò tăng rộng và kéo dài tế bào, thúc đẩy quá trình phân bào trong nuôi cấy. Theo kết quả nuôi cấy lớp mỏng tế bào lá JCL trên môi trường W có bổ sung riêng lẻ một số auxin như IAA, IBA, 2,4-D hoặc TDZ, chúng tôi nhận thấy chỉ có auxin 2,4-D có khả năng kích thích lớp mỏng tế bào lá JCL hình thành mô sẹo. Như vậy, với cùng một đối tượng tác động là lớp mỏng tế bào lá cây JCL thì các auxin khác nhau có thể có những đáp ứng khác nhau. Kết quả thí nghiệm cũng ghi nhận, 2,4-D là một auxin mạnh, sẽ kích thích quá trình phân chia tế bào mạnh mẽ dẫn đến tạo thành mô sẹo là một đám tế bào không phân hóa, có đặc tính phân chia mạnh. Dưới tác động của 2,4-D, tế bào phình to, phân chia, nhưng tạo ra khối mô gồm những tế bào nối kết lỏng lẻo, rời rạc, không phát sinh cơ quan, nhanh chóng bị hóa nâu và chết (Bùi Trang Việt, 2000). Với mẫu cấy là lớp mỏng tế bào lá cây JCL thì sự kết hợp giữa auxin 2,4-D ở nồng độ thấp (0,1 mg/l) và cytokinin BA ở nồng độ cao (1,0 mg/l) sẽ tạo nên khối mô sẹo có kết cấu cứng chắc, với một tỷ lệ mẫu cấy đáp ứng rất cao (100%). Tuy nhiên, những mô sẹo này cũng không có khả năng tái sinh chồi. Với cytokinin, vai trò chính của chúng là kích thích sự phân chia tế bào, tạo chồi với sự có mặt của auxin và trì hoãn quá trình lão suy (Bùi Trang Việt, 2000). Điều này được thể hiện rõ khi sự có mặt của BA trong môi trường nuôi cấy có 2,4-D hoặc IBA đã thúc đẩy quá trình phân chia tế bào, hình thành khối mô sẹo có màu xanh và làm chậm sự lão suy của mô cấy hơn so với chỉ bổ sung 2,4-D hoặc IBA. Trên môi Kết quả - Thảo luận  Trang 71 trường bổ sung 2,4-D kết hợp với BA, chúng tôi nhận thấy các mẫu cấy có sự đáp ứng rất sớm, mô cấy phát triển to. Tỷ lệ mẫu cấy tạo sẹo đạt 100% sau 14 ngày nuôi cấy trên môi trường này. Tuy nhiên, nồng độ 2,4-D tồn tại trong môi trường chỉ kích thích sự hình thành và duy trì tình trạng mô sẹo của mẫu cấy, nhưng kìm hãm khả năng phát sinh cơ quan của mẫu cấy. Các mẫu cấy nếu nuôi tiếp tục trên môi trường có auxin 2,4-D dù ở nồng độ thấp cũng sẽ dần hóa nâu và chết. Trên môi trường bổ sung IBA kết hợp với BA, tuy quá trình hình thành mô sẹo diễn ra chậm và yếu hơn, khối mô sẹo được tạo ra không lớn nhưng đây là dạng mô sẹo có khả năng phát sinh cơ quan. Những khối mô này có kết cấu cứng xốp xen lẫn. Trong sự tái sinh ở cây cà phê, Nguyễn Thị Quỳnh và cộng sự (1983) cũng đã ghi nhận, cần có sự hiện diện của cả hai lọai mô sẹo cứng và xốp với một tỷ lệ nhất định để quá trình tái sinh được khởi sự. Sự tương tác giữa hai lọai mô sẹo này, nếu có, cần được tiếp tục nghiên cứu để có cái nhìn rõ hơn về sự tái sinh và hình thành cơ quan. Sự tăng sinh khối của mô sẹo là kết quả của sự cân bằng giữa trạng thái sinh lý của mẫu cấy và tác động của các chất ĐHSTTV ngọai sinh được bổ sung vào môi trường nuôi cấy. Mô sẹo có khả năng tạo phôi thường tăng trưởng chậm hơn mô sẹo không có khả năng tạo phôi. Kết quả thí nghiệm cho thấy, các mô sẹo được cảm ứng hình thành trên môi trường bổ sung IBA và BA có sự gia tăng trọng lượng tươi chậm và ít hơn nhiều so với các mô sẹo được tạo ra trên môi trường có 2,4-D và BA. Sự phát triển chồi và rễ vẫn được xem là kết quả của sự biến đổi auxin/cytokinin đến một tỷ lệ thích hợp trong môi trường tái sinh. Theo Hwang (1981), khi thay đổi thành phần và nồng độ các chất ĐHSTTV thì tế bào mô sẹo lại được cảm ứng để phân hóa tạo cơ quan. Trên cơ sở đó, chúng tôi tiến hành cấy chuyền các mô sẹo thu được sang một số môi trường tái sinh chồi và rễ. Trên môi trường cảm ứng phát sinh cơ quan chồi (chỉ bổ sung BA, không có IBA hoặc 2,4-D), kết quả thí nghiệm cho thấy, khả năng tái sinh chồi của mô cấy là các khối mô sẹo chủ yếu phụ thuộc vào khối mô sẹo đó được hình thành trên môi trường nào mà sẽ có hoặc không có sự đáp ứng phát sinh hình thái, hay nói cách khác, thành phần các chất ĐHSTTV được bổ sung vào môi trường cảm ứng tạo mô sẹo là một trong những yếu tố quyết định khả năng tái sinh chồi của mô sẹo. Các mẫu cấy sau khi được nuôi trên môi trường cảm ứng tạo mô sẹo W + 0,1 mg/l 2,4-D + 1,0 mg/l Kết quả - Thảo luận  Trang 72 BA trong 28 ngày đã tạo nên những khối mô rất lớn, nhưng khi chuyển sang môi trường phát sinh chồi W + 1,0 mg/l BA không có 2,4-D và IBA thì hòan tòan không phản ứng, các mô cấy dần hóa nâu và chết; trong khi những khối mô sẹo được hình thành trên môi trường W + 0,1 mg/l IBA + 1,0 mg/l BA khi cấy chuyển sang môi trường phát sinh chồi thì lại có sự đáp ứng. Như vậy, có thể ghi nhận bản chất và nồng độ auxin quyết định hướng phát triển của mô cấy. Auxin 2,4-D dễ dàng cảm ứng tạo mô sẹo đối với mô cấy là lớp mỏng tế bào lá cây JCL nhưng không có hoặc ức chế khả năng phát sinh chồi. Bên cạnh đó, hàm lượng các chất ĐHSTTV trong môi trường tái sinh cũng ảnh hưởng đến khả năng tái sinh của mô cấy. Môi trường chỉ được bổ sung 1,0 mg/l BA cho kết quả tái sinh bao gồm tỷ lệ mẫu cấy phát sinh chồi và số chồi trên một mẫu cấy cao hơn các nghiệm thức môi trường khác (3,0 mg/l BA; 5,0 mg/l BA; hoặc không bổ sung chất ĐHSTTV). Sau 14 ngày nuôi cấy trên môi trường cảm ứng tạo chồi, chúng tôi nhận thấy có một tỷ lệ rất nhỏ mô cấy đã hình thành cấu trúc chồi hòan chỉnh, với số lượng chồi là không đáng kể, cho nên có thể đây là những chồi đã được phát sinh ngay từ trong môi trường cảm ứng tạo mô sẹo hay là dạng phát sinh chồi trực tiếp không thông qua trung gian mô sẹo từ mẫu cấy ban đầu là lớp mỏng tế bào mảnh lá JCL. Sau 28 ngày, tỷ lệ % mẫu cấy phát sinh chồi và số chồi trên một mẫu cấy gia tăng đáng kể, và đây là dạng phát sinh chồi gián tiếp thông qua mô sẹo. Như vậy, cũng giống như auxin, tác dụng của cytokinin trên mô cấy tùy thuộc vào nồng độ, bản chất và sự kết hợp với auxin nào cũng như đáp ứng với từng lọai mô cấy (Bùi Trang Việt, 2000). Trong sự phát sinh cơ quan rễ in vitro, auxin được xem là có vai trò rất quan trọng trong sự tạo rễ (Ahloowalia, 1991; Komamin và cộng sự, 1992; Liu và cộng sự, 1993; Zimmerman, 1993). Trong môi trường nuôi cấy, auxin thường gây ra sự tạo bướu ở các mô và cơ quan, kích thích sự phân chia tế bào, kích thích sự tạo rễ bất định (Pierik, 1987). Ở cây song tử diệp, auxin gây ra tình trạng rối lọan tổ chức của sinh mô ngọn rễ, kích thích họat động của chu luân và nội bì nên tạo ra một vùng tế bào phân sinh và xuất hiện nhiều mô phân sinh rễ. Trong sự phát sinh cơ quan rễ từ nuôi cấy lớp mỏng tế bào lá cây JCL, NAA khi được bổ sung vào môi trường nuôi cấy đã tỏ ra là lọai auxin thích hợp cho sự kích thích hình thành cơ quan rễ từ mô sẹo, trong khi IBA lại không có khả năng cảm ứng Kết quả - Thảo luận  Trang 73 sự tạo rễ trên mô sẹo từ lớp mỏng tế bào lá. Trong các nghiệm thức môi trường được dùng để tái sinh rễ có bổ sung NAA, tỷ lệ mẫu cấy tạo rễ, số lượng rễ trung bình trên một mẫu cấy và chiều dài trung bình của rễ đạt cao nhất ở môi trường W + 1,0 mg/l NAA. Kết quả ghi nhận cho thấy, sau khoảng 10 ngày nuôi cấy trên môi trường tạo rễ được bổ sung NAA, mẫu cấy là các khối mô sẹo dần phát triển thành các khối mô lớn, cứng chắc, có màu trắng xanh nhạt. Sau khỏang 21 ngày, các sơ khởi rễ hình thành trên các mô sẹo chuyển sang giai đọan kéo dài sơ khởi rễ. Rễ được tạo ra có kích thước lớn, nằm phía dưới bề mặt môi trường. Và theo ghi nhận của chúng tôi, đây là sự phát sinh rễ từ các mô nội sinh. Sự thay đổi hàm lượng và tỷ lệ các chất điều hòa nội sinh trong mô cấy lớp mỏng tế bào lá sau một thời gian nuôi cấy đóng vai trò quan trọng đối với kiểu phát sinh hình thái của mô cấy, nhất là tỷ lệ giữa auxin và cytokinin. Theo Skoog và Miller (1957), một tỷ lệ auxin và cytokinin sẽ xác định một chương trình phát sinh hình thái (Bùi Trang Việt, 2003). Tỷ lệ auxin/cytokinin cao kích thích sự tạo rễ và ngược lại sẽ kích thích sự tạo chồi. Kết quả khảo sát họat tính các chất ĐHSTTV trong mô cấy cho thấy, trong quá trình hình thành mô sẹo, hàm lượng cytokinin, đặc biệt là auxin nội sinh trong mẫu cấy thay đổi từ nồng độ thấp ở thời điểm T0 (mẫu cấy ban đầu, lớp mỏng tế bào lá JCL) đến nồng độ cao ở thời điểm T2 (sau 28 ngày nuôi cấy), và sau đó lại giảm mạnh tại thời điểm T3 (sau 56 ngày nuôi cấy), khi mà các mô cấy đang trong giai đọan hóa nâu và chết dần. Nhìn chung, trong quá trình nuôi cấy trên môi trường W bổ sung tổ hợp IBA và BA cảm ứng sự hình thành mô sẹo, tỷ lệ auxin/cytokinin nội sinh luôn lớn hơn 1 trong suốt thời gian nuôi cấy. Như vậy, khả năng phát sinh chồi của mô cấy trên môi trường này là rất thấp. Ngược lại, trong quá trình phát sinh chồi, chúng tôi nhận thấy hàm lượng auxin nội sinh thay đổi từ nồng độ cao ở thời điểm T2-0 (mẫu cấy ban đầu, sau 28 ngày nuôi cấy trên môi trường tạo mô sẹo) và giảm dần đến nồng độ thấp tại thời điểm T2-2 (sau 28 ngày nuôi cấy trên môi trường tái sinh chồi); trong khi đó, hàm lượng cytokinin thì thay đổi theo chiều ngược lại. Tỷ lệ auxin/cytokinin cũng thay đổi phù hợp với sự phát sinh hình thái. Tỷ lệ auxin/cytokinin trong mô cấy sau khi được cấy chuyển sang môi Kết quả - Thảo luận  Trang 74 trường tái sinh dần đạt giá trị nhỏ hơn 1 tại thời điểm T2-2. Lúc này mô cấy phân chia rất mạnh, các khối u phát triển hình thành các sơ khởi chồi và phát triển thành chồi hòan chỉnh. Về một số biến đổi hình thái trong nuôi cấy lớp mỏng tế bào mảnh lá JCL Trong quá trình hình thành mô sẹo, nhìn chung, sự đáp ứng với môi trường của các mô cấy trong những ngày đầu nuôi cấy đều giống nhau. Hầu hết các tế bào của mô cấy đều phình to ra dưới tác dụng làm tăng trưởng tế bào, thường được xem là tác dụng của auxin; tuy nhiên, cấu trúc cơ quan của những mô này vẫn chưa có sự thay đổi. Đây là giai đọan cảm ứng đầu tiên trong ba giai đọan của sự hình thành mô sẹo; khi đó, tế bào được chuẩn bị cho giai đọan phân chia tiếp theo bằng cách kích họat một số cơ chế biến dưỡng (Dodds và Roberts, 1985). Các tế bào khi bước vào giai đọan thứ hai thì có sự phân chia hỗn lọan và nhanh chóng trở thành dạng tế bào có kích thước nhỏ với số lượng nhiều, đưa tế bào cây mẹ thành dạng tế bào phản biệt hóa. Ở thời điểm này, các cấu trúc chuyên biệt của mô bắt đầu bị biến dạng, các bó mạch cũ bị chèn ép theo nhiều hướng khác nhau. Thời điểm giai đọan ba bắt đầu là khi khối mô sẹo bắt đầu biệt hóa tế bào nhu mô thành các nốt mạch nhỏ ở vị trí nhu mô trước đây với hệ thống mô mộc, libe, các vùng tế bào phân sinh hình thành rễ hoặc chồi sau này. Sự hình thành các bó mạch thường được xem như một đặc tính của auxin (Gaspar, 1996; Bùi Trang Việt, 2000). Các mẫu cấy là lớp mỏng tế bào lá cây JCL khi được nuôi cấy trên môi trường W + 0,1 mg/l 2,4-D + 1,0 mg/l BA cảm ứng tạo mô sẹo đã có những đáp ứng rất sớm (sau khỏang 7 ngày). Sự tăng sinh tế bào hình thành mô sẹo diễn ra mạnh mẽ, tạo nên những khối mô lớn, kết cấu cứng chắc. Như vậy, sự có mặt của BA trong môi trường có thể đã kích thích hình thành những tế bào nối kết chặt chẽ hơn so với môi trường chỉ bổ sung 2,4-D tạo các khối mô xốp. Tuy nhiên, dạng mô sẹo cứng chắc này thường không có hoặc khó có khả năng phát sinh cơ quan chồi. Lớp mỏng tế bào mảnh lá JCL khi được nuôi cấy trên môi trường W + 0,1 mg/l IBA + 1,0 mg/l BA cảm ứng tạo mô sẹo có sự đáp ứng chậm hơn, sự tăng sinh tế bào không diễn ra mạnh mẽ như trên môi trường được bổ sung tổ hợp 2,4-D và BA. Sau 28 ngày tạo nên những khối mô trắng xanh nhạt với kết cấu cứng xốp, và đây là dạng mô sẹo thường có khả năng phát sinh cơ quan cao. Phân tích cấu trúc giải phẫu của mô cấy là khối mô sẹo cho thấy sau 7 – Kết quả - Thảo luận  Trang 75 10 ngày nuôi cấy, vùng tế bào nhu mô của mô thịt lá đã phân chia sớm có thể phát triển thành những tế bào khử phân hóa. Sau 14 ngày, có sự phân chia tế bào mạnh mẽ ở vùng nhu mô thịt lá, hình thành những khối tế bào nổi lên trên bề mặt mẫu cấy, tạo thành những khối u nhỏ phát triển ra ngòai lớp biểu bì, có thể đây là bước chuyển tiếp từ tế bào ở trạng thái những tế bào phân hóa sang trạng thái những tế bào giống như mô phân sinh có khả năng sinh cơ quan. Điều này cũng phù hợp với lý thuyết cho rằng ngọn chồi có thể có nguồn gốc từ các tế bào bao quanh mạch của mô cấy (Bùi Trang Việt, 2003). Sau 28 ngày, có sự phân lớp từ ngòai vào trong mẫu cấy, bên ngòai là những đám tế bào nhỏ, đồng dạng, bên trong xuất hiện các bó mạch nằm rải rác, có thể đây chính là cấu trúc hình thành nên các bó mạch chồi về sau. Tuy nhiên, chúng tôi đã không ghi nhận được sự hình thành chồi khi nuôi cấy lớp mỏng tế bào lá JCL trên môi trường này. Sau khỏang 56 ngày, khối mô sẹo dần hóa nâu và chết. Theo những nghiên cứu của Chen và Galston (1967), nuôi cấy mô sẹo hình thành từ tế bào như mô lá có xuất hiện những nhân tố mạch được gọi là những nốt mạch (vascular nodules). Sự hình thành những nốt mạch này phụ thuộc vào lọai đường hoặc chất ĐHSTTV được bổ sung vào trong môi trường nuôi cấy. Sự hình thành những nốt mạch trong mô sẹo có thể biểu hiện hoặc dấu hiệu sớm của sự phát triển những cấu trúc đỉnh sinh trưởng chồi (Chen và Galston, 1967). Chen và Galston (1967), Cassels (1979) cũng ghi nhận sự xuất hiện những nốt mạch mộc trong mô sẹo cây Pelargonium báo hiệu sự phát triển cấu trúc chồi khi chuyển mẫu cấy mô sẹo vào môi trường không có auxin ngọai sinh. Ở cây JCL, chúng tôi nhận thấy khi chuyển những mô sẹo được nuôi trên môi trường có bổ sung auxin (W + 0.1 mg/l IBA + 1,0 mg/l BA) trong 28 ngày sang môi trường không bổ sung auxin (W + 1,0 mg/l BA) thì có sự hình thành các sơ khởi chồi sau 21- 28 ngày nuôi cấy và phát triển thành cấu trúc chồi hòan chỉnh sau 28 – 35 ngày. Như vậy, có thể chính sự hình thành các nốt mạch trong khối mô sẹo đã tạo tiền đề cho sự hình thành chồi và kích thích phát sinh cơ quan chồi khi chuyển sang môi trường không có auxin. Một tỷ lệ rất nhỏ các mẫu cấy đã hình thành cấu trúc chồi hòan chỉnh, với số lượng chồi là không đáng kể chỉ sau 14 ngày được cấy chuyển sang môi trường tái sinh (chỉ có BA, không có IBA). Hiện tượng này có thể là do tế bào nhu mô thịt lá đang ở giai đọan khử phân hóa để phát triển dần thành những tế bào có dạng như mô Kết quả - Thảo luận  Trang 76 phân sinh đã được BA định hướng phát triển trực tiếp hình thành cơ quan chồi mà không thông qua giai đọan trung gian mô sẹo. Tuy nhiên, chỉ một số rất ít tế bào trong quá trình khử biệt hóa có khả năng cảm ứng với BA để đi vào quá trình phát sinh hình thái, hình thành chồi trực tiếp ở rìa mẫu cấy.