Luận văn Nghiên cứu một số virus (TMV, CMV) gây bệnh trên cây Ớt tại huyện Củ Chi, thành phố Hồ Chí Minh bằng kỹ thuật ELISA và xây dựng quy trình phát hiện CMV bằng kỹ thuật RT-PCR

bộ hoặc một phần của lá đều có thể đƣợc dùng làm mẫu phân tích. Nguyên liệu đòi hỏi phải còn tƣơi, lá lớn và còn non, không sử dụng lá già. Chọn những lá có biểu hiện bệnh để thực hiện thí nghiệm chẩn đoán. Trƣờng hợp cây có sự phân bố không đều mầm bệnh thì phải thu thập những phần mà có biểu hiện bệnh mạnh nhất. (Theo Lê Lƣơng Tề - Vũ Triệu Mân, 1999). 2.4.2. Phƣơng pháp chẩn đoán bằng chỉ thị màu Đây là phƣơng pháp chẩn đoán có độ chính xác thấp, thƣờng chỉ đạt 70 - 90%. Chính vì vậy phƣơng pháp này chỉ sử dụng cho việc chẩn đoán ban đầu. Phổ biến là phƣơng pháp nhuộm màu bằng sunfat đồng. Các tế bào của cây họ bầu bí, cà khi bị nhiễm bệnh sẽ bị nhuộm màu nâu đỏ còn tế bào của cây khỏe chỉ có màu nâu hay không nhuộm màu. Ngƣời ta thƣờng dùng CuSO4.5H2O 3% để chẩn đoán cây nhiễm CMV. 2.4.3. Phƣơng pháp chẩn đoán bằng kính hiển vi điện tử Virus thực vật có những đặc điểm sinh vật sống, chúng tự nhân lên trong cây trồng và di truyền tính gây bệnh, chúng tự phân chia thành các phân tử nhỏ nhƣng cũng có thể tạo thành những tinh thể giống nhau chứa đựng những phân tử protein Chúng ta không thể thấy virus dƣới kính hiển vi quang học, nhƣng chúng ta có thể quan sát đƣợc chúng trên kính hiển vi điện tử với độ phóng đại 500.000 lần. 19 Phƣơng pháp đơn giản là sử dụng dung dịch chứa virus chiết từ lá cây bệnh hay thông qua làm tinh khiết cố định bằng hóa chất trên lƣới đồng để quan sát trên kính hiển vi điện tử. Đây là phƣơng pháp trực tiếp và đơn giản nhất. Có thể sử dụng kháng huyết thanh khi dùng phƣơng pháp xem trực tiếp để phân biệt trong trƣờng hợp nghi là mẫu bị lẫn virus khác. Phƣơng pháp này giúp ta xác định đƣợc hai virus khác nhau trong cùng một mẫu. Ngƣời ta còn dùng lát cắt cực mỏng bằng Ultramicrotom và nhuộm mẫu đƣợc cắt, quan sát sự hiện diện của virus trong các tế bào thực vật bị nhiễm bệnh. (Phạm Đức Toàn, 1996 – 2001) (Nguyễn Văn Tuất, 2002) 2.4.4. Phƣơng pháp ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) Đây là kỹ thuật khá nhạy và đơn giản, cho phép xác định kháng nguyên hoặc kháng thể ở nồng độ rất thấp (0,1ng/ml). So với với các kỹ thuật miễn dịch khác thì kỹ thuật này rẻ tiền và an toàn hơn mà vẫn đảm bảo độ chính xác. ELISA đƣợc dùng để xác định nhiều tác nhân gây bệnh nhƣ virus, vi khuẩn, nấm, kí sinh. Nguyên tắc của kỹ thuật này dựa trên sự gắn kết đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể, trong đó kháng thể đƣợc gắn với một enzyme. Khi cho thêm cơ chất thích hợp (thƣờng là p-nitrophenol phosphate) vào phản ứng, enzyme sẽ thủy phân cơ chất thành một chất có màu. Sự xuất hiện màu chứng tỏ đã xảy ra phản ứng đặc hiệu giữa kháng thể với kháng nguyên và thông qua cƣờng độ màu mà biết đƣợc nồng độ kháng nguyên hay kháng thể cần phát hiện. Hai kỹ thuật ELISA đƣợc dùng nhiều là kỹ thuật ELISA trực tiếp (direct Double Antibody Sandwich-ELISA) và ELISA gián tiếp (Indirect ELISA). Các enzyme thƣờng dùng là β-galactosidaze, glucosidaze, peroxidaze và phosphataze kiềm (Vũ Triệu Mân, 2003). 20 Hình 2.9. Nguyên tắc của phản ứng ELISA (Nguồn: Chemicon International) Phƣơng pháp ELISA trực tiếp kiểu Sandwich Gồm các bƣớc sau: Bƣớc 1: Cố định kháng thể đặc hiệu của virus vào đĩa ELISA. Bƣớc 2: Phủ dịch cây (có chứa virus cần xác định) vào đĩa ELISA. Bƣớc 3: Phủ kháng thể có gắn enzyme. Bƣớc 4: Cho cơ chất nền là cơ chất của enzyme vào đĩa ELISA. Kết quả đƣợc đọc trên máy đọc ELISA (ELISA reader) ở bƣớc sóng 405 nm. Để cố định màu sắc của đĩa ELISA, bảo quản trong tủ lạnh 4oC và cần xem vào khi khác có thể dùng dung dịch NaOH 3M nhỏ vào mỗi giếng 25 – 30 µl. Phƣơng pháp ELISA gián tiếp (Indirect ELISA) Kỹ thuật này thƣờng đƣợc dùng để định tính và định lƣợng kháng thể hiện diện trong mẫu cần xác định. Gồm các bƣớc: Bƣớc 1: Cố định kháng nguyên lên thành giếng. Bƣớc 2: Cho tiếp kháng huyết thanh (chứa kháng thể cần kiểm tra) vào. Bƣớc 3: Thêm cộng hợp kháng kháng thể có gắn enzyme vào. Bƣớc 4: Thêm cơ chất của enzyme vào để đọc kết quả (Vũ Triệu Mân, 2003). 2.4.5. Phƣơng pháp RT-PCR (Reverse Transcriptase - Polymerase Chain Reaction) 2.4.5.1. Kỹ thuật PCR Đƣợc giới thiệu lần đầu tiên bởi Tiến sĩ Kary Mullis vào năm 1985. PCR (Polymerase Chain Reaction) là một công cụ đơn giản và hiệu quả trong việc khuếch 21 đại DNA in vitro. Phản ứng xảy ra trong một máy luân nhiệt có khả năng lặp lại 3 bƣớc ủ ở các nhiệt độ khác nhau. 3 bƣớc trên gồm: 1. Biến tính (Denaturation): Sợi đôi DNA khuôn bị biến tính bởi nhiệt thành 2 sợi đơn. Nhiệt độ khoảng 94-950C. 2. Bắt cặp (Annealing): Cặp primer bắt cặp bổ sung với đoạn DNA khuôn. Nhiệt độ khoảng 550C. 3. Kéo dài (Extension): Cặp primer đƣợc kéo dài bởi DNA polymerase. Nhiệt độ khoảng 720C. Số bản sao của DNA đích tăng gấp đôi sau mỗi chu kỳ, sự khuếch đại theo hệ số mũ và có khả năng tạo ra hàng tỉ bản sao của đoạn DNA ban đầu. Hình 2.10. Sơ đồ phản ứng PCR Ngày nay kỹ thuật PCR đƣợc ứng dụng rộng rãi trong các lĩnh vực: Phân loại học, tiến hóa, y học, sinh thái học, khảo cổ, giám định pháp y… 2.4.5.2. Kỹ thuật RT-PCR Kỹ thuật RT-PCR gồm sự tổng hợp cDNA từ khuôn RNA và phản ứng PCR, là một phƣơng pháp phân tích biểu hiện gen nhanh chóng và rất nhạy. RT-PCR đƣợc sử dụng để phát hiện hay định lƣợng mRNA, thƣờng từ RNA khuôn có nồng độ thấp. Khuôn mẫu cho RT-PCR có thể là RNA tổng số hoặc RNA có đuôi poly (A). Phản ứng RT có thể thực hiện với primer ngẫu nhiên, oligo (dT) hoặc primer đƣợc thiết kế chuyên biệt (GSP) sử dụng enzyme reverse transcriptase. Có hai hình thức của 22 phản ứng RT-PCR: một bƣớc (one-step) hoặc hai bƣớc (two-step). Phản ứng RT-PCR hai bƣớc, mỗi bƣớc đƣợc thực hiện trong những điều kiện tối ƣu. Sự tổng hợp cDNA xảy ra đầu tiên trong dung dịch đệm RT và sản phẩm của phản ứng này đƣợc dùng cho PCR. Phản ứng RT-PCR một bƣớc, phản ứng RT và PCR xảy ra liên tiếp trong cùng một tube dƣới những điều kiện tối ƣu cho cả hai. Hình 2.11. Sơ đồ phản ứng RT Tế bào hoặc mô Hình 2.12. Sơ đồ phản ứng RT-PCR Ly trích RNA Tổng hợp cDNA (RT) Khuếch đại cDNA (PCR) 23 Hai loại reverse transcriptase thƣờng sử dụng là AMV (Avian Myeloblastosis Virus) Reverse Transcriptase và MMLV (Moloney Murine Leukemia Virus) Reverse Transcriptase. Cả hai loại enzyme này đều cần một primer để khởi đầu việc tổng hợp. AMV Reverse Transcriptase là một DNA polymerase phụ thuộc RNA (RNA- dependent DNA polymerase), có chức năng tổng hợp sợi DNA bổ sung với RNA khuôn từ một primer. Enzyme này còn có một số những hoạt tính khác nhƣ DNA polymerase phụ thuộc DNA (DNA-dependent DNA polymerase), RNase H, tháo xoắn, không có hoạt tính 3’- 5’ exonuclease. AMV Reverse Transcriptase thích hợp cho phản ứng sao chép ngƣợc những đoạn có cấu trúc bậc 2 do có nhiệt độ hoạt động tối ƣu khá cao: 420C. Tuy nhiên mặt hạn chế của nó là hoạt tính RNase H cũng khá cao làm giới hạn kích thƣớc và giảm năng suất tổng hợp cDNA. MMLV Reverse Transcriptase cũng là một enzyme DNA polymerase phụ thuộc RNA, có chức năng tổng hợp cDNA. Enzyme này còn có những hoạt tính khác nhƣ DNA polymerase phụ thuộc DNA và hoạt tính RNase H yếu, không có hoạt tính 3’–5’ exonuclease. Nhiệt độ hoạt động tối ƣu là 370C. Do hoạt tính RNase H thấp hơn nhiều so với AMV Reverse Transcriptase nên MMLV Reverse Transcriptase đƣợc khuyến cáo sử dụng để tổng hợp những cDNA có kích thƣớc lớn. Các vấn đề thƣờng gặp trong kỹ thuật PCR (RT-PCR): Có nhiều band tạp trên gel sau khi điện di Nguyên nhân: - Nồng độ DNA khuôn chƣa phù hợp. - DNA khuôn bị đứt gẫy. - Thời gian biến tính quá ngắn. - Nhiệt độ biến tính quá thấp. - Thời gian kéo dài quá thấp. - Số chu kỳ nhiều. - Primer không chuyên biệt. - Nhiễm. - Nồng độ Mg2+ chƣa phù hợp. - Vùng khuếch đại chứa nhiều GC hay có nhiều cấu trúc bậc hai. 24 Năng suất khuếch đại thấp hay không có sản phẩm khuếch đại Nguyên nhân: - Nồng độ enzyme thấp. - Thời gian biến tính quá ngắn. - Nhiệt độ biến tính quá thấp. - Thời gian kéo dài thấp. - Số chu kỳ ít. - Nồng độ DNA khuôn ít. - Mẫu đứt gẫy/nhiễm. - Enzyme mất hoạt tính. - dNTPs bị hƣ. - Primers không bắt cặp. - Nhiệt độ bắt cặp quá cao. - Thời gian bắt cặp ngắn. - Máy PCR. - Nồng độ Mg2+ chƣa phù hợp. - Vùng khuếch đại chứa nhiều GC hay có nhiều cấu trúc bậc 2. Có vết bẩn (smear) trên miếng gel sau khi điện di Nguyên nhân : - Nồng độ primer cao. - Primer thiết kế chƣa tốt. - Nồng độ enzyme cao. - Số chu kỳ cao. - Nhiệt độ bắt cặp thấp. - Thời gian kéo dài chƣa phù hợp. - Biến tính không hoàn toàn. - Có quá nhiều DNA mẫu. - Nồng độ Mg2+ chƣa phù hợp. - Nhiễm. (Nguồn: www.promega.com) 25 2.5. Một số kết quả nghiên cứu trong và ngoài nƣớc về bệnh do CMV, TMV gây ra trong thời gian gần đây 2.5.1. Ở nƣớc ngoài - Harald Jockusch, Christiane Wiegand, Birgit Mersch, và Daniela Rajes vào năm 2001 đã cho biết thể đột biến của TMV có protein vỏ nhạy cảm với nhiệt độ cảm ứng phản ứng sốc nhiệt (heat shock) ở lá thuốc lá. - F. L. Erickson, S. P. Dinesh - Kumar, S. Holzberg, C. V. Ustach, M. Dutton, V. Handley, C. Corr và B. J. Baker đã tìm hiểu về tƣơng tác giữa gen N của thuốc lá và TMV. Gen N của thuốc lá tạo phản ứng siêu nhạy cảm khi TMV xâm nhập vào cây thuốc lá. - Steve Whitham, Sheila Mccormick và Barbara Baker vào năm 1996 đã chuyển gen N của thuốc lá vào cà chua, tạo tính kháng TMV cho cà chua chuyển gen. - Ki Hyun Ryu, Chung - Ho Kim và Peter Palukaitis vào năm 1998 đã chứng minh rằng protein vỏ của CMV quy định dãy kí chủ của CMV khi nhiễm vào lúa mì. - Yoshiji Niimi, Dong-Sheng Han, Shiro Mori, Hitoshi Kobayashi vào năm 2002 đã xây dựng quy trình phát hiện CMV gây bệnh trên cây hoa Lili bằng kỹ thuật RT-PCR. Qua đó cho thấy kỹ thuật RT-PCR có độ nhạy cao hơn so với kỹ thuật ELISA trong việc phát hiện virus gây bệnh. 2.5.2. Ở Việt Nam Các nghiên cứu về bệnh virus còn khá mới, chỉ có một số nghiên cứu của trƣờng Đại học Nông Lâm trong những năm gần đây. - Nguyễn Ngọc Bích, trƣờng Đại học Nông Lâm TP. HCM vào năm 2003 đã bƣớc đầu nghiên cứu một số bệnh virus chính trên vùng thuốc lá tỉnh Tây Ninh. Dùng DAS - ELISA để chẩn đoán một số virus trên thuốc lá nhƣ TSWV, CMV, TMV đồng thời điều tra tình hình bệnh virus trên địa bàn tỉnh Tây Ninh. Kết quả cho thấy các virus này đang phát triển khá mạnh ở vùng thuốc lá tỉnh Tây Ninh. - Lâm Ngọc Hạnh, trƣờng Đại học Nông Lâm TP.HCM vào năm 2005 đã tiến hành đánh giá tình hình nhiễm bệnh virus TMV, CMV, TSWV trên cà chua ở tỉnh Lâm Đồng, sử dụng kỹ thuật DAS-ELISA và xây dựng quy trình chẩn đoán TMV bằng RT-PCR. 26 PHẦN III VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện Thời gian thực hiện đề tài từ tháng 03/2006 đến tháng 08/2006. Mẫu thí nghiệm đƣợc lấy ở 4 xã thuộc huyện Củ Chi là: Hòa Phú, An Nhơn Tây, Nhuận Đức, Trung Lập Thƣợng. Việc chẩn đoán bệnh đƣợc tiến hành tại Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh, trƣờng Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. 3.2. Vật liệu 3.2.1. Dụng cụ - Dụng cụ thu mẫu và điều tra gồm: Bảng mẫu câu hỏi điều tra, nhãn, bao nylon, máy chụp ảnh, thùng giữ lạnh, đá khô, tủ âm. - Dụng cụ nghiền mẫu gồm: Cối, chày. Mẫu đƣợc nghiền trong nitơ lỏng. - Dụng cụ, thiết bị dùng cho ELISA, RT - PCR gồm: Đĩa ELISA 96 giếng, máy rửa đĩa ELISA, máy đọc kết quả ELISA, đĩa Petri, máy ly tâm, eppendorf, đầu tip, pipet man, petcher, máy PCR, tủ mát, tủ âm, tủ laminar, bồn ủ nhiệt, tủ ủ nhiệt, tủ sấy, tủ hấp vô trùng (autoclave), máy điện di, bồn nhuộm Ethidium Bromide, máy chụp hình gel, máy in. 3.2.2. Hóa chất dùng trong kỹ thuật ELISA phát hiện CMV, TMV Bộ kit ELISA với đầy đủ các thành phần: - Dịch trích mẫu (Tampon De Broyage Extraction buffer 1X). - Dung dịch đệm để pha kháng thể (Coating buffer). - Kháng thể. - Dịch rửa (PBS - Tween). - Đối chứng dƣơng (Positive control). - Đối chứng âm (Negative control). - Dung dịch đệm để pha kháng thể có gắn enzyme (Conjugate buffer). - Kháng thể gắn enzyme alkaline-phosphatase (Conjugate antibodies). - Dung dịch đệm để pha chất chỉ thị màu. - Chất chỉ thị màu p-NPP. 27 Ngoài ra cần phải chuẩn bị: - Cồn 700. - Nƣớc cất hai lần khử ion và hấp khử trùng. 3.2.3. Hóa chất dùng trong kỹ thuật RT-PCR phát hiện CMV 3.2.3.1. Ly trích RNA RNA đƣợc ly trích theo quy trình của kit ly trích (The Aurum total RNA mini kit ) do Biorad sản xuất. Những loại hóa chất có sẵn trong kit: - Dịch trích mẫu (Lysis solution) 50 ml - Dịch rửa nhẹ 5X (Low stringency wash solution) 20 ml - Dịch rửa mạnh (High stringency wash solution) 40 ml - DNase I dạng bột 1 hủ - Dịch pha loãng DNase I 10 ml - Dịch hòa tan RNA (Elution solution) 10 ml Bên cạnh đó ta phải chuẩn bị một số hóa chất sau : - Polyvinylpyrolidone (PVP) 2%. - Tris-base. - β-mercaptoethanol. - Ethanol 95 - 100%. - NaOH 0,1 M. - EDTA 1M. - DEPC (diethyl pyrocabonate). 3.2.3.2. Tổng hợp cDNA Dùng kit tổng hợp cDNA (iScript cDNA kit) do Bio-Rad cung cấp với thành phần nhƣ sau: - Hỗn hợp phản ứng đã pha sẵn (5X iScript Reaction Mix)100 µl. Hỗn hợp này đã đƣợc trộn với primer poly T (oligo dT) và các hexamer ngẫu nhiên, chúng có khả năng bắt cặp với những RNA mục tiêu khác nhau. Hỗn hợp này sẽ cho kết quả tối ƣu với những sản phẩm < 1 kb. - Nƣớc không nhiễm enzyme thủy phân nucleotide (Nuclease free water) 1,5 ml. 28 - Enzyme phiên mã ngƣợc (iScript Reverse Transcriptase) 25 µl, là enzyme MMLV với hoạt tính RNAse H+ có độ nhạy cao hơn những enzyme có hoạt tính RNAse H-. Enzyme này đƣợc bổ sung thêm chất ức chế enzyme phân hủy RNA (RNAse). Ta chỉ cần bổ sung thêm RNA và chạy theo chu trình nhiệt của kit. 3.2.3.3. Thực hiện phản ứng PCR khuếch đại các phân tử cDNA Thành phần hóa chất cần thiết: - cDNA đƣợc lấy từ quá trình tổng hợp ở trên. - Nƣớc không chứa nuclease (Nuclease free water). - Dung dịch đệm PCR (10X PCR buffer). - MgCl2 50 mM. - Hỗn hợp dNTP 10 mM. - iTaq polymerase 5 U / µl. - Primer với trình tự nhƣ sau : Primer 1: 5’-ATG GAC AAA TCT GAA TCA AC-3’ Primer 2: 5’-TCA AAC TGG GAG CAC CC-3’ Bên cạnh đó cần phải chuẩn bị một số hóa chất khác nhƣ: - Agarose. - Loading dye. - Thang chuẩn (ladder) 1000bp, mỗi vạch cách nhau 100bp (Biorad). - TAE 0,5X. 3.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 3.3.1. Nội dung nghiên cứu - Điều tra tình hình nhiễm các loại virus TMV, CMV trên ớt tại huyện Củ Chi bằng phản ứng ELISA trên các mẫu thu thập tại các xã. - Kiểm tra các mẫu có phản ứng ELISA dƣơng tính với CMV bằng kỹ thuật RT- PCR. 3.3.2. Phƣơng pháp điều tra và lấy mẫu - Điều tra tại các hộ nông dân có trồng ớt theo mẫu điều tra đã chuẩn bị sẵn. Khâu lấy mẫu đƣợc thực hiện nhƣ sau: - Tùy theo diện tích có thể lấy từ 5 - 15 mẫu /vƣờn theo đƣờng chéo, lấy bốn gốc và ở giữa, còn lại lấy ngẫu nhiên và có theo phán đoán cá nhân. Lấy lá không non cũng không già lắm, phiến lá lớn. Mẫu đƣợc cho vào bao nylon có ghi nhãn cẩn thận về thời 29 gian, địa điểm, chủ vƣờn, loại cây, tuổi cây, triệu chứng, điều kiện canh tác. Mẫu đƣợc cho vào thùng xốp và đƣợc giữ lạnh cho đến khi kết thúc đợt lấy mẫu. - Mẫu đƣợc đem về phòng thí nghiệm trong điều kiện đƣợc giữ lạnh và bảo quản trong tủ lạnh -20oC cho đến khi phân tích. Bảng 3.1. Số mẫu thu thập từ 4 xã của huyện Củ Chi. STT Xã Số mẫu 1 Hòa Phú 30 2 An Nhơn Tây 26 3 Nhuận Đức 105 4 Trung Lập Thƣợng 16 Tổng số mẫu 177 3.3.3. Phát hiện TMV và CMV bằng kỹ thuật DAS-ELISA (Double Antibody Sandwich Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) Thực hiện theo sự hƣớng dẫn của bộ kit. Giai đoạn ly trích mẫu: Mẫu khi lấy về trữ ở -20oC, chọn những lá vừa không non cũng không già, phiến lá lớn, cân 0,5g cho vào cối, thêm 2,5ml dịch trích mẫu. Nghiền thật nát thành dạng dung dịch. Sau đó đổ vào eppendorf gần đầy và ghi ký hiệu thật cẩn thận. Đem ly tâm tốc độ 5000 vòng/phút trong 3 phút ở nhiệt độ 4oC. Trữ ở 4oC. Chẩn đoán ELISA:  Bƣớc 1: Chuẩn bị đĩa và sơ đồ bố trí. Mỗi đĩa đƣợc bố trí 2 đối chứng âm và 2 đối chứng dƣơng.  Bƣớc 2: Pha loãng kháng thể 1/100 trong dung dịch đệm (coating buffer). Hút 100µl dung dịch vừa pha vào mỗi giếng, dùng băng keo dán kín lại và đặt vào tủ ủ ở 37oC trong 2 giờ.  Bƣớc 3: Rửa với dung dịch đệm PBS – Tween bằng máy rửa, rửa 3 lần mỗi lần 3 phút.  Bƣớc 4: Mỗi đối chứng âm và dƣơng đƣợc hòa tan với 1ml nƣớc cất, hút 100µl mỗi loại đối chứng vào các giếng đối chứng, tiếp theo hút 100µl mẫu vào các giếng đã đƣợc bố trí. Đem ủ ở 4oC qua đêm. 30  Bƣớc 5: Rửa lại với PBS – Tween 3 lần mỗi lần 3 phút.  Bƣớc 6: Pha kháng thể có gắn enzyme vào dung dịch đệm tƣơng tự nhƣ pha kháng thể ở bƣớc 2. Hút 100µl dung dịch kháng thể có gắn enzyme đã đƣợc pha vào mỗi giếng , dán băng keo lại, sau đó đem ủ ở 37oC trong 2 giờ.  Bƣớc 7: Rửa lại với PBS – Tween 3 lần, mỗi lần 3 phút.  Bƣớc 8: Hoà tan p-NPP trong dung dịch đệm Subtrate để đạt nồng độ cuối là 1mg/ml của p-NPP. Cách pha: Nghiền nát thành bột mịn 7 viên p-NPP (mỗi viên 5mg), cho vào 35ml dung dịch đệm Subtrate (không màu), chờ 5 phút để pNPP tan hoàn toàn trong dung dịch đệm. Hút 100µl cho vào mỗi giếng, dán băng keo lại. Ủ ở 37oC trong 30 phút.  Bƣớc 9: Đọc kết quả bằng máy đọc OD sau 30 phút, 1 giờ, 2 giờ.  Những giếng xuất hiện màu vàng: giếng chứa mẫu bị nhiễm bệnh.  Những giếng không màu: giếng chứa mẫu không bị nhiễm bệnh. Những ô để trống Nƣớc cất Buffer Đối chứng dƣơng Đối chứng âm Mẫu ly trích Hình 3.1. Sơ đồ bố trí phản ứng ELISA 31 3.3.4. Chẩn đoán CMV bằng RT – PCR Các mẫu sau khi đƣợc kiểm tra bằng kỹ thuật ELISA sẽ đƣợc chọn ra để thực hiện tiếp phản ứng RT-PCR. Trong đề tài này chúng tôi chỉ thực hiện phản ứng RT- PCR trên đối tƣợng CMV. Tiêu chuẩn chọn mẫu để thực hiện RT-PCR: - Dƣơng tính với phản ứng ELISA. - Triệu chứng đƣợc quan sát phải đặc trƣng và biểu hiện ra ngoài. - Mẫu đƣợc bảo quản tốt (còn tƣơi). Dựa vào những tiêu chí trên, ta chọn ra đƣợc 3 mẫu để thực hiện phản ứng RT-PCR: mẫu 30, mẫu 44, mẫu 69. Kỹ thuật RT-PCR đƣợc sử dụng là 2 bƣớc (two steps), gồm giai đoạn tổng hợp cDNA (Reverse) và giai đoạn khuếch đại cDNA (PCR). Virus CMV đƣợc phát hiện dựa trên một đoạn gen có kích thƣớc 650 bp, mã hóa cho phân tử protein vỏ. Quá trình thực hiện gồm 2 giai đoạn: 3.3.4.1. Ly trích RNA theo AurumTM Total RNA Mini Kit (Biorad)  Bƣớc 1: Cân khoảng 60 mg mẫu lá ớt đã qua chẩn đoán ELISA cho kết quả dƣơng tính. Cho mẫu vào cối (đã qua xử lý với NaOH, EDTA, rửa lại bằng nƣớc cất siêu sạch, bọc giấy bạc rồi đem hấp khử trùng ở 121oC trong 20 phút, sấy khô trong một ngày đêm) nghiền thành bột mịn với nitơ lỏng. Thêm nitơ lỏng thƣờng xuyên.  Bƣớc 2: Lấy muỗng cho vào hết trong tube ly tâm 2ml có nắp đậy (không có RNase). Hòa tan mẫu bằng dung dịch ly giải (lysis solution) có bổ sung PVP 2% (hỗn hợp này đã đƣợc trộn trƣớc: 14µl PVP 2% + 700µl dung dịch ly giải cho mỗi mẫu).  Bƣớc 3: Cho 700µl dung dịch đã đƣợc trộn ở bƣớc trên vào tube chứa mẫu, trộn thật kỹ bằng pipet khoảng 10 lần .  Bƣớc 4: Ly tâm 13000 vòng trong 3 phút. Chuyển toàn bộ dịch nổi vào tube ly tâm 2ml mới.  Bƣớc 5: Thêm 700 µl ethanol 70%, hoà tan bằng pipet cho đến khi không còn sự phân lớp.  Bƣớc 6: Ủ ấm dung dịch hòa tan (elution solution) trong bồn ủ ở 70oC (để chuẩn bị cho bƣớc 15). Đặt RNA binding column (RNAbc) vào tube 2ml không nắp.  Bƣớc 7: Cho 700µl dung dịch ở bƣớc 5 vào RNAbc, ly tâm 12000 vòng trong 60 giây, loại bỏ dịch lọc. Thực hiện tƣơng tự cho đến hết phần dịch còn lại. 32  Bƣớc 8: Dịch rửa low stringency từ 5X pha loãng bằng ethanol 100% xuống còn 1X.  Bƣớc 9: Cho 700µl dung dịch low stringency vào RNAbc, ly tâm 12000 vòng trong 30 giây, loại bỏ dịch lọc.  Bƣớc 10: Pha DNase I với 250µl Tris 10mM pH 7,5. Hoà tan bằng pipet.  Bƣớc 11: Trộn 5µl Dnase I với 75µl dung dịch Dnase dilution trong tube 1.5ml, cho vào RNAbc. Ủ ở nhiệt độ phòng trong 15 phút, ly tâm 30 giây. Loại bỏ dịch lọc.  Bƣớc 12: Cho 700µl high stringency vào RNAbc, ly tâm 12000 vòng trong 30 giây, loại bỏ dịch lọc.  Bƣớc 13: Thực hiện tƣơng tự nhƣ bƣớc 12 nhƣng với dung dịch low stringency.  Bƣớc 14: Ly tâm 12000 vòng trong 1 phút để loại bỏ hoàn toàn dịch rửa.  Bƣớc 15: Chuyển RNAbc vào tube 1.5ml có nắp đậy, cho vào 80µl dung dịch hoà tan ở bƣớc 6. Để 1 phút, ly tâm 12000 vòng trong 2 phút để thu RNA tổng số. Bảo quản ở -20oC. 3.3.4.2. Khuếch đại RNA bằng RT – PCR Bƣớc 1: Tổng hợp cDNA Tổng hợp cDNA theo hƣớng dẫn của iScriptTMcDNA Synthesis kit (Biorad). Bảng 3.2. Thành phần hóa chất cho phản ứng tổng hợp cDNA. Thành phần Thể tích 5X iScript reaction Mix Reverse transcriptase RNA Nuclease-free water 4 µl 1 µl 3-5 µl thêm vào đủ 20 µl Tổng thể tích 20 µl 33 Chu trình nhiệt: 5 phút ở 250C 30 phút ở 420C 5 phút ở 850C Giữ ở 40C cDNA đƣợc tổng hợp (20 µl) có thể đem sử dụng ngay trong phản ứng PCR hoặc trữ ở -20oC để chạy PCR sau. Bƣớc 2: Khuếch đại cDNA bằng PCR Bƣớc này đƣợc thực hiện theo nghiên cứu của A. I. Bhat và CTV ở Phân viện bảo vệ thực vật, Viện nghiên cứu về giống, Ấn Độ vào tháng 6/2005. Chúng tôi đã tiến hành kiểm tra độ đặc hiệu của cặp primer sử dụng trong phản ứng PCR bằng phần mềm BLAST hiện có trên mạng Internet. Các bƣớc thực hiện nhƣ sau: - Bƣớc 1: Truy cập trang chủ NCBI ( - Bƣớc 2: Chọn thẻ BLAST. - Bƣớc 3: Nhập trình tự của cả hai primer vào. Sau khi kiểm tra độ đặc hiệu của primer, chúng tôi xác định thành phần hóa chất cho phản ứng PCR nhƣ bảng 3.3. Bảng 3.3. Thành phần phản ứng PCR. Thành phần Thể tích Nồng độ cuối 10X iTaq buffer 5 l 1X Primer 1 1µl 0,4 M Primer 2 1µl 0,4 M dNTP mix 10mM 1µl 0,2mM MgCl2 50mM 1,5 l 1,5mM cDNA 3-5 µl iTaq DNA polymerase 0,5µl 2,5U H20 thêm vào đủ 50 l Thể tích tổng 50 l 34 Chu trình nhiệt: 1 chu kỳ 1 phút ở 940C 40 chu kỳ 30 giây ở 940C 1 phút ở 500C 1 phút ở 720C 1 chu kỳ 10 phút ở 720C Giữ ở 40C trong 5 phút 3.3.4.3. Điện di trên gel agarose  Bƣớc 1: Chuẩn bị gel agarose 1,5%.  Bƣớc 2: Làm nguội agarose đã đƣợc nấu chín đến 50-60oC, sau đó đổ vào khuôn đã đƣợc đặt lƣợc vào trƣớc. Chờ cho gel đông.  Bƣớc 3: Lấy lƣợc ra, cho gel vào dung dịch TAE.  Bƣớc 4: Hút 2µl loading dye trộn với 4µl mẫu.  Bƣớc 5: Bơm vào các giếng một cách cẩn thận 4µl mẫu + dung dịch đệm.  Bƣớc 6: Chạy điện di ở 50V/250mA, cho đến khi thuốc nhuộm cách đầu tận cùng của gel khoảng 1cm.  Bƣớc 7: Lấy gel ra và ngâm vào dung dịch ethidium bromide trong 20 phút.  Bƣớc 8: Rửa nhẹ gel với nƣớc.  Bƣớc 9: Đọc kết quả dƣới tia UV, thẩm định kết quả với marker.  Bƣớc 10: Chụp bản gel để lƣu lại kết quả. 35 PHẦN IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Đánh giá tình hình nhiễm CMV, TMV bằng ELISA 4.1.1. Tỷ lệ nhiễm CMV, TMV trên tổng số mẫu điều tra Từ tổng số 177 mẫu thu thập ở các xã chúng tôi chọn ra đƣợc 135 mẫu để tiến hành kiểm tra bằng ELISA. Thể hiện qua Biểu đồ 4.1. Bảng 4.1. Kết quả ELISA trên tổng số mẫu. Tác nhân Số mẫu Số mẫu Tổng số Tỷ lệ nhiễm (%) gây bệnh dƣơng tính âm tính mẫu CMV 120 15 135 88,9 TMV 93 42 135 68,9 120 93 15 42 135 135 0 20 40 60 80 100 120 140 160 CMV TMV số lư ợn g m ẫu dương tính âm tính tổng số mẫu Biểu đồ 4.1. Số lƣợng mẫu dƣơng tính và âm tính với TMV và CMV  Kết quả trên cho thấy ớt trồng tại các xã của huyện Củ Chi đang bị nhiễm CMV, TMV ở mức độ cao, nhất là CMV lên đến gần 90%. Khi đi thu thập mẫu chúng tôi nhận thấy một số điểm nhƣ sau: 36 Các ruộng ớt thƣờng đƣợc trồng xen kẽ với hoa màu khác nhƣ bầu bí, cà chua, dƣa leo, thuốc lá…Sau khi đã thu hoạch hoa màu, phần tàn dƣ đƣợc xếp đống chờ phân hủy mà không có biện pháp xử lí thích hợp để tiêu diệt mầm bệnh. Bà con nông dân chƣa quan tâm đến nguồn gốc của hạt giống, chƣa nhận thấy mức độ nguy hiểm của bệnh do virus. Ruộng ớt đã bị nhiễm bệnh nặng vẫn không đƣợc đốt bỏ do tâm lí “đƣợc trái nào hay trái đấy”. Cỏ dại mọc rất nhiều trong ruộng ớt. Có nhiều vector lan truyền virus. Những nguyên nhân trên đã làm cho CMV, TMV vốn rất bền vững trong tự nhiên lại càng có cơ hội bùng phát mạnh mẽ, làm giảm năng suất ớt canh tác. 4.1.2. Tỷ lệ các mẫu nhiễm hỗn hợp virus TMV và CMV so với các mẫu nhiễm CMV hay TMV Thể hiện qua Biểu đồ 4.2. Bảng 4.2. Tỷ lệ các mẫu nhiễm hỗn hợp virus TMV và CMV so với các mẫu nhiễm CMV hay TMV. Chỉ tiêu Số mẫu Tổng số mẫu kiểm tra Tỷ lệ nhiễm (%) Chỉ nhiễm CMV 40 135 29,6 Nhiễm hỗn hợp TMV và CMV 80 59,3 Chỉ nhiễm TMV 12 8,9 Không nhiễm virus nào 3 2,2 29,6 59,3 8,9 2,2 0 10 20 30 40 50 60 70 Chỉ tiêu Tỷ lệ (% ) Chỉ nhiễm CMV Nhiễm hỗn hợp CMV và TMV Chỉ nhiễm TMV Không nhiễm virus nào Biểu đồ 4.2. Tỷ lệ nhiễm virus của các mẫu điều tra 37  Qua biểu đồ 4.2 có thể thấy số mẫu nhiễm hỗn hợp TMV và CMV chiếm tỷ lệ cao nhất (59,3%), kế đến là số mẫu nhiễm CMV (29,6 %) và số mẫu nhiễm TMV chiếm tỷ lệ thấp nhất (8,9%); trong tổng số mẫu kiểm tra chỉ có 3 mẫu không nhiễm cả hai loại virus trên (2,2%). Thực tế trên đồng một cây thƣờng bị nhiễm nhiều loại virus do sức đề kháng của cây bị giảm dần, tạo điều kiện cho nhiều virus khác xâm nhập (Marcelo Eiras, 2001). Do vậy kết quả số mẫu nhiễm hỗn hợp cả TMV và CMV chiếm tỷ lệ cao nhất là hợp lí. Tập quán canh tác ớt ở Củ Chi là trồng xen kẽ ớt với bầu bí, dƣa leo… là những cây kí chủ chính của CMV, còn thuốc lá thì đƣợc trồng thành những diện tích lớn riêng biệt cho nên đa số mẫu thu thập có tỷ lệ nhiễm CMV cao hơn so với TMV. Kết quả cũng cho thấy CMV đang bùng phát mạnh mẽ ở Củ Chi vào thời điểm khảo sát khi tỷ lệ nhiễm bệnh lên đến gần 90%. Chỉ có 2,2 % mẫu là sạch bệnh nhƣng cũng có thể là virus mới xâm nhập vào cây, chƣa đủ ngƣỡng để phát hiện. 4.1.3. Tỷ lệ nhiễm TMV và CMV tại các xã Thể hiện qua Biểu đồ 4.3. Bảng 4.3. Tỷ lệ nhiễm TMV và CMV tại các xã. Xã CMV TMV Tổng số mẫu Nhiễm Không nhiễm Tỷ lệ nhiễm (%) Nhiễm Không nhiễm Tỷ lệ nhiễm (%) Hòa Phú 26 4 86,7 23 7 76,7 30 Nhuận Đức 61 4 93,8 39 26 60,0 65 An Nhơn Tây 20 4 83,3 16 8 66,7 24 Trung Lập Thƣợng 13 3 81,3 14 2 87,5 16 38 86,7 93,8 83,3 81,3 76,7 60 66,7 87,5 0 20 40 60 80 100 Hòa Phú Nhuận Đức An Nhơn Tây Trung Lập Thượng Tỷ lệ nh iễm (% ) CMV TMV Biểu đồ 4.3. So sánh tỷ lệ nhiễm TMV và CMV tại các xã  Kết quả cho thấy tất cả 4 xã điều tra đều đã bị nhiễm virus TMV và CMV. Trong đó xã Nhuận Đức bị nhiễm CMV nặng nhất (93,8%) nhƣng nhiễm TMV thấp nhất (60%); ngƣợc lại xã Trung Lập Thƣợng bị nhiễm TMV nặng nhất (87,5%) nhƣng nhiễm CMV thấp nhất (81,3%). Điều này có thể do sự ức chế lẫn nhau giữa hai loại virus này, khi số lƣợng CMV phát triển đến mức cao sẽ ức chế sự phát triển của TMV và ngƣợc lại. Biểu đồ 4.3 cho thấy mức độ nhiễm virus ở các xã là đáng báo động, nếu không có biện pháp kịp thời thì thiệt hại về kinh tế cho bà con nông dân sẽ rất lớn. 4.1.4. Tỷ lệ nhiễm TMV và CMV theo từng giống ớt Khi điều tra, đa số hộ nông dân không nắm đƣợc tên giống ớt mà họ đang canh tác. Bà con mua giống từ các đại lí đem về trồng mà chƣa quan tâm nhiều đến tên giống. Do vậy trong nghiên cứu này, chúng tôi chƣa thể thống kê đƣợc tỷ lệ bệnh theo giống ớt. 4.1.5. Tỷ lệ nhiễm TMV và CMV theo triệu chứng Triệu chứng bệnh virus trên cây ớt khá đa dạng, dƣới đây là một số triệu chứng điển hình mà chúng tôi ghi nhận đƣợc trong quá trình lấy mẫu: Lá khảm vàng xanh, cong. Lá chấm vàng xanh, nhăn nheo, co lại, dày, giòn. Khảm vàng nhạt trên rìa lá, lá nhỏ. Lá khảm nặng, biến dạng, cây lùn, quả ít 39 Bảng 4.4. Tỷ lệ nhiễm TMV và CMV theo triệu chứng. Triệu chứng Số mẫu điều tra Số mẫu nhiễm Tỷ lệ nhiễm (%) Lá xanh nhạt, khảm vàng, cong 27 27 100 Lá chấm vàng xanh, nhăn nheo,co lại, dày, giòn 15 15 100 Khảm vàng nhạt trên rìa lá, lá nhỏ 37 37 100 Lá khảm nặng, biến dạng, cây lùn, quả ít 9 9 100  Kết quả trên cho thấy chúng ta có thể dựa vào những triệu chứng điển hình bên ngoài để chẩn đoán bệnh virus. Tỷ lệ nhiễm bệnh theo triệu chứng trong nghiên cứu này đều là 100%. Bên cạnh đó có những mẫu lá nhìn bề ngoài không có triệu chứng gì nhƣng khi kiểm tra vẫn phát hiện bệnh, điều này có thể lí giải là do virus chỉ mới xâm nhập vào cây nên chƣa có biểu hiện ra bên ngoài. Vì vậy ngoài việc dựa vào triệu chứng để chẩn đoán bệnh, còn phải kết hợp nhiều phƣơng pháp chẩn đoán khác nhƣ huyết thanh học, sinh học phân tử để đƣa ra một kết luận chính xác. 4.1.6. Tỷ lệ nhiễm TMV và CMV theo độ tuổi Khi tiến hành lấy mẫu thì các ruộng ớt đều bƣớc vào giai đoạn cuối vụ hoặc vừa mới đƣợc trồng đợt tiếp theo. Do vậy, chúng tôi chƣa thể thống kê đƣợc tỷ lệ bệnh theo độ tuổi. 4.2. Phát hiện CMV bằng kỹ thuật RT-PCR Từ kết quả chẩn đoán bằng ELISA, chúng tôi chọn những mẫu có chỉ số dƣơng tính cao và tiến hành phản ứng RT - PCR nhằm xây dựng quy trình chẩn đoán CMV bằng RT-PCR.  Sau khi ly trích RNA theo hƣớng dẫn của AurumTM Total RNA Mini Kit (Biorad) thu đƣợc 80 l RNA tổng số.  Phản ứng tổng hợp cDNA đƣợc thực hiện theo hƣớng dẫn của iScript™ cDNA Synthesis Kit (Biorad). Sau phản ứng thu đƣợc 20 l cDNA. Lƣợng cDNA này có thể đƣợc sử dụng cho phản ứng PCR ngay hoặc trữ ở -200C. 40 Trong quá trình thực hiện thí nghiệm, chúng tôi đã tiến hành thay đổi thể tích RNA và cDNA trong các phản ứng (3-5μl). Kết quả chúng tôi đã thu đƣợc thành phần hóa chất tối ƣu của phản ứng tổng hợp cDNA (Bảng 4.5) và phản ứng PCR (Bảng 4.6). Bảng 4.5. Thành phần hóa chất tối ƣu của phản ứng tổng hợp cDNA. Thành phần hóa chất Thể tích 5X iScript Reation Mix 4μl iScript Reverse Transcriptase 1μl RNA khuôn mẫu 5μl Nuclease-free water 10μl Tổng thể tích 20μl Lƣợng RNA thích hợp cho phản ứng tổng hợp cDNA là 5 µl. Quy trình nhiệt của phản ứng tổng hợp cDNA có thay đổi so với khuyến cáo của kit (tăng thời gian của giai đoạn 42oC từ 30 phút lên 40 phút). Chu kỳ nhiệt trong phản ứng tổng hợp cDNA: 25oC trong 5 phút. 42oC trong 40 phút. 85oC trong 5 phút. Giữ ở 4oC.  Lƣợng cDNA thích hợp cho phản ứng PCR là 5 μl. Bảng 4.6. Thành phần hóa chất tối ƣu của phản ứng PCR. Thành phần hóa chất Thể tích Nồng độ cuối Buffer 10X 5μl 1X MgCl2 50mM 1,5μl 1,5mM iTaq DNA polymerase 0,5μl 2,5U dNTPs 10mM 1μl 0,2mM Primer 1 1μl 0,4μM Primer 2 1μl 0,4μM cDNA 5μl H2O 35μl Tổng thể tích 50μl 41  Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu của primer: - Chỉ có một vị trí bắt cặp của primer trên gen đích. - Cặp primer sử dụng chỉ khuếch đại đoạn gen đặc trƣng của CMV. - Đoạn gen đƣợc khuếch đại mã hóa cho protein vỏ của CMV.  Chu trình nhiệt sử dụng trong phản ứng PCR là ổn định.  Kết quả điện di: 650bp Hình 4.1. Kết quả điện di sản phẩm PCR của CMV M: Thang DNA chuẩn 1000bp. 30, 44, 69: cDNA của mẫu số 30, 44, 69.  Primer là yếu tố quan trọng hàng đầu quyết định thành công của phản ứng PCR, đƣợc thiết kế dựa theo những trình tự nucleotide đã biết của virus. Nghiên cứu này sử dụng cặp primer thiết kế dựa vào trình tự đoạn gen mã hóa protein vỏ của virus CMV, khuếch đại sản phẩm có kích thƣớc khoảng 650bp của tác giả A. I. Bhat và CTV ở Phân viện bảo vệ thực vật, Viện nghiên cứu về giống, Ấn Độ.  Cặp primer đã sử dụng có độ đặc hiệu rất cao, chỉ cho đúng 1 band ở vị trí 650bp trên gel điện di.  Hình 4.1 cho thấy phản ứng RT-PCR đã thành công trong việc khuếch đại đoạn gen có kích thƣớc mong muốn (khoảng 650bp). Nhƣ vậy chúng tôi đã bƣớc đầu xây dựng đƣợc quy trình phát hiện CMV bằng kỹ thuật RT-PCR. Qua đó cho phép khẳng định các mẫu này đã bị nhiễm virus CMV. M 30 44 69 42 PHẦN V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận Từ các kết quả thu đƣợc chúng tôi rút ra một số kết luận sau:  Vào thời điểm nghiên cứu (03/2006), các ruộng ớt của 4 xã trong huyện Củ Chi đều đã bị nhiễm TMV và CMV với mức độ cao. Trong đó CMV đang bùng phát mạnh mẽ, TMV nhiễm với tỷ lệ thấp hơn.  Xã Nhuận Đức nhiễm CMV nặng nhất, xã Trung Lập Thƣợng nhiễm TMV nặng nhất.  Có thể dựa vào triệu chứng bệnh bên ngoài để chẩn đoán sớm bệnh virus, tuy nhiên cần kết hợp với kỹ thuật ELISA và RT-PCR để cho kết quả chính xác nhất.  Đã phát hiện đƣợc virus CMV trên cây ớt nhờ phản ứng RT-PCR khuếch đại đoạn gen mã hóa cho protein vỏ (650bp). Cặp primer đã sử dụng là rất đặc hiệu và chu trình nhiệt ổn định. 5.2. Đề nghị  Tiếp tục ứng dụng kỹ thuật ELISA và RT-PCR để phát hiện các virus khác gây bệnh trên cây ớt.  Tiếp tục nghiên cứu đánh giá ảnh hƣởng của giống và tuổi của cây ớt đến mức độ nhiễm các loại virus trên.  Thực hiện bƣớc giải trình tự sản phẩm PCR để so sánh mức độ tƣơng đồng của chủng virus đang nghiên cứu với các chủng trong ngân hàng gen.  Có thể ly trích RNA trực tiếp bằng phƣơng pháp siêu ly tâm trong khuynh độ đƣờng sử dụng ống cellulose.  Cung cấp giống sạch bệnh cho bà con nông dân và tuyên truyền thay đổi tập quán canh tác ớt nhƣ hiện nay để giảm mức độ nhiễm virus. 43 PHẦN VI TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT 1. Bùi Cách Tuyến, 1998, Bản dịch tiếng Việt, Tài liệu hướng dẫn đồng ruộng, Bệnh hại cây ớt, Nhà xuất bản Nông nghiệp, trang 42-56. 2. Lâm Ngọc Hạnh, 2001-2005, Luận văn tốt nghiệp Ngành Công nghệ sinh học: Đánh giá tình trạng nhiễm bệnh virus (Cucumber Mosaic Virus, Tobacco Mosaic Virus và Tomato Spotted Wilt Virus) trên cà chua (Solanum lycopersicum) ở tỉnh Lâm Đồng bằng kỹ thuật ELISA và bước đầu xây dựng quy trình chẩn đoán virus Tobacco Mosaic Virus bằng kỹ thuật RT-PCR. 3. Mai Thị Phƣơng Anh,1999. Kỹ thuật trồng một số loại rau cao cấp (ớt, ngô rau, măng tây, sulơ xanh, cải bao). Nhà xuất bản nông nghiệp Hà Nội, trang 5-11 4. Nguyễn Đình Trƣờng, 2001-2005, Luận văn tốt nghiệp Ngành Công nghệ sinh học: Nghiên cứu hiện trạng nhiễm bệnh TSWV (Tomato spotted wilt virus) trên cây ớt bằng kỹ thuật ELISA và bước đầu xây dựng phương pháp chẩn đoán bằng kỹ thuật RT-PCR. 5. Vũ Triệu Mân, Lê Lƣơng Tề, 1999. Bệnh vi khuẩn và virus hại cây trồng. Nhà xuất bản Giáo Dục, trang 143. 6.Vƣơng Hồ Vũ, 2001-2005, Luận văn tốt nghiệp Ngành Công nghệ sinh học: Nghiên cứu một số virus trên khoai tây (PVX, PVY, PLRV) tại Đà Lạt bằng kỹ thuật ELISA, RT-PCR và giải trình tự. TIẾNG NƢỚC NGOÀI 7. Alfred Nobel Dr. Hercules, CA 94547 USA, Inc, 2000, Aurum Total RNA Mini Kit Instruction Manual Biorad Laboratories, p.26-27. 8. Elisabeth Knapp and Dennis J. Lewandowski, 2001. Tobacco mosaic virus, not just a single component virus anymore. Molecular Plant Pathology 2: 117–123. Blackwell Science LTD, USA. 44 9. H. W. Jung, W. S. Yun, Y. I. Hahm và K.-H. Kim, 2001. Characterization of Tobacco mosaic virus Isolated from Potato Showing Yellow Leaf Mosaic and Stunting Symptoms in Korea. Plant Disease, Vol. 86, No. 2. The American Phytopathological Society, USA. 10. Joshiji Niimi, Dong-Sheng Han, Shiro Mori and Hitoshi Kobayashi, 2003. Detection of cucumber mosaic virus, lily symptomless virus and lily mottle virus in lilium species by RT-PCR technique. Scientia Horticulturae 97: 57-63. Elsevier Science B.V. 11. Ken Pernezny, Pamela D. Roberts, John F. Murphy and Natalie P. Goldberg, 2003. Compendium of Pepper Diseases. The American Phytopathological Society. p23-39. 12. Ray Cerkauskas, Tom Kalb, S.K. Green, L.L.Black and T.A. Zitter, 2004. Pepper Diseases: Cucumber Mosaic Virus. AVRDC – The World Vegetable Center, Shanhua,Taiwan. 13. Ray Cerkauskas, Tom Kalb, S.K. Green, L.L.Black and T.A. Zitter, 2004. Pepper Diseases: Tobacco Mosaic Virus, Tomato Mosaic Virus. AVRDC – The World Vegetable Center, Shanhua,Taiwan. 14. R. Madhubala, V. Bhadramurthy, A. I. Bhat, P. S. Hareesh, S. T. Retheesh and R. S. Bhai, 2005. Occurrence of Cucumber mosaic virus on vanilla (Vanilla planifolia Andrews) in India. J. Biosci 30: 339–350. Indian Academy of Sciences, India. 15. Sambrook and Russell, 2001. Molecular Cloning-A Laboratory Manual. 3 rd edition, volume 2. Cold spring harbor laboratory press, New York, USA. p 8.46-8.49. 16. Scott Adkins and Erin N. Rosskopf, 2002. Key West Nightshade, a New Experimental Host for Plant Viruses. Plant Disease, Vol. 86, No. 12. The American Phytopathological Society, USA. 45 CÁC WEBSITE 17. 18. 19. 20. 21. 22.< ConEne_Agro/$file/confidor_enemies.pdf> 23. www.biorad.com 24. www.promega.com PHỤ LỤC 1 HÌNH CHỤP CÁC ĐĨA CHỨA MẪU PHÂN TÍCH BẰNG ELISA Kết quả kiểm tra CMV bằng ELISA Kết quả kiểm tra TMV bằng ELISA PHỤ LỤC 2 AURUM TM TOTAL RNA MINI KIT PHỤ LỤC 3 TRUNG GIAN TRUYỀN BỆNH VIRUS Một số loài rệp Một số loài bọ trĩ PHỤ LỤC 4 MẪU ĐIỀU TRA Mã số ............................................................................................................. Nơi lấy mẫu ................................................................................................... Chủ hộ ........................................................................................................... Giống cây ....................................................................................................... Tuổi cây ......................................................................................................... Tình trạng vƣờn ............................................................................................. Cách trồng ..................................................................................................... Phƣơng pháp trồng ........................................................................................ Diện tích vƣờn, năng suất .............................................................................. Độ thuần của vƣờn ......................................................................................... Có vector truyền bệnh hay không .................................................................. Mùa vụ ........................................................................................................... Bệnh có thƣờng xảy ra không ........................................................................ Triệu chứng .................................................................................................... PHỤ LỤC 5 KẾT QUẢ KIỂM TRA PRIMER BẲNG PHẦN MỀM BLAST > gi|77917371|emb|AM114273.1| Cucumber mosaic virus partial 3a gene and partial cp gene for coat protein, genomic RNA, strain Le02 RNA3 Length=2216 Score = 40.1 bits (20), Expect = 0.27 Identities = 20/20 (100%), Gaps = 0/20 (0%) Strand=Plus/Plus > gi|111154124|gb|AC184073.2| Populus trichocarpa clone Pop1-50D1, complete sequence Length=139458 Score = 40.1 bits (20), Expect = 0.27 Identities = 20/20 (100%), Gaps = 0/20 (0%) Strand=Plus/Plus > gi|71467707|emb|AM055602.1| Cucumber mosaic virus CP gene for coat protein, genomic RNA, specific host Musa x paradisiaca (banana) Length=657 Score = 40.1 bits (20), Expect = 0.27 Identities = 20/20 (100%), Gaps = 0/20 (0%) Strand=Plus/Plus > gi|68146848|emb|AJ890465.2| Cucumber mosaic virus CP gene for coat protein, genomic RNA, specific host Lilium tigrinum Length=944 Score = 40.1 bits (20), Expect = 0.27 Identities = 20/20 (100%), Gaps = 0/20 (0%) Strand=Plus/Plus > gi|68146847|emb|AJ890464.2| Cucumber mosaic virus CP gene for coat protein, genomic RNA, specific host Oriental Lily Length=944 Score = 40.1 bits (20), Expect = 0.27 Identities = 20/20 (100%), Gaps = 0/20 (0%) Strand=Plus/Plus > gi|44893903|gb|AY541691.1| Cucumber mosaic virus strain CMV-G10 coat protein gene, complete cds Length=657 Score = 40.1 bits (20), Expect = 0.27 Identities = 20/20 (100%), Gaps = 0/20 (0%) Strand=Plus/Plus > gi|38537169|gb|AY450854.1| Cucumber mosaic virus strain CMV-G2 coat protein gene, complete cds Length=657 Score = 40.1 bits (20), Expect = 0.27 Identities = 20/20 (100%), Gaps = 0/20 (0%) Strand=Plus/Plus > gi|110564284|gb|DQ767971.1| Cucumber mosaic virus from lily coat protein gene, complete cds Length=657 Score = 40.1 bits (20), Expect = 0.27 Identities = 20/20 (100%), Gaps = 0/20 (0%) Strand=Plus/Plus > gi|55740407|gb|AY792596.1| Cucumber mosaic virus coat protein gene, complete cds Length=657 Score = 40.1 bits (20), Expect = 0.27 Identities = 20/20 (100%), Gaps = 0/20 (0%) Strand=Plus/Plus > gi|7242509|emb|AJ276481.1|CMO276481 Cucumber mosaic virus (strain Mf), complete RNA3 segment Length=2214 Score = 40.1 bits (20), Expect = 0.27 Identities = 20/20 (100%), Gaps = 0/20 (0%) Strand=Plus/Plus > gi|25809284|emb|AJ517802.1|CMO517802 Cucumber mosaic virus 3a gene for movement protein and cp gene for coat protein, genomic RNA Length=2216 Score = 40.1 bits (20), Expect = 0.27 Identities = 20/20 (100%), Gaps = 0/20 (0%) Strand=Plus/Plus > gi|25173584|emb|AJ511990.1|CMO511990 Cucumber mosaic virus 3a gene for movement protein and cp gene for coat protein, genomic RNA Length=2216 Score = 40.1 bits (20), Expect = 0.27 Identities = 20/20 (100%), Gaps = 0/20 (0%) Strand=Plus/Plus > gi|56684566|gb|AY754359.1| Cucumber mosaic virus isolate Kerala coat protein gene, complete cds Length=657 Score = 40.1 bits (20), Expect = 0.27 Identities = 20/20 (100%), Gaps = 0/20 (0%) Strand=Plus/Plus > gi|47156054|gb|AY600989.1| Cucumber mosaic virus isolate Danshen coat protein gene, complete cds Length=657 Score = 40.1 bits (20), Expect = 0.27 Identities = 20/20 (100%), Gaps = 0/20 (0%) Strand=Plus/Plus > gi|45331380|gb|AY560556.1| Cucumber mosaic virus isolate SG15 coat protein gene, complete cds Length=657 Score = 40.1 bits (20), Expect = 0.27 Identities = 20/20 (100%), Gaps = 0/20 (0%) Strand=Plus/Plus > gi|62177356|gb|AY871071.1| Cucumber mosaic virus isolate B23 capsid protein (CP) gene, complete cds Length=841 Score = 40.1 bits (20), Expect = 0.27 Identities = 20/20 (100%), Gaps = 0/20 (0%) Strand=Plus/Plus > gi|62177354|gb|AY871070.1| Cucumber mosaic virus isolate B13 capsid protein (CP) gene, complete cds Length=841 Score = 40.1 bits (20), Expect = 0.27 Identities = 20/20 (100%), Gaps = 0/20 (0%) Strand=Plus/Plus > gi|62177352|gb|AY871069.1| Cucumber mosaic virus isolate S337 capsid protein (CP) gene, complete cds Length=841 Score = 40.1 bits (20), Expect = 0.27 Identities = 20/20 (100%), Gaps = 0/20 (0%) Strand=Plus/Plus > gi|62177350|gb|AY871068.1| Cucumber mosaic virus isolate SH17 capsid protein (CP) gene, complete cds Length=841 Score = 40.1 bits (20), Expect = 0.27 Identities = 20/20 (100%), Gaps = 0/20 (0%) Strand=Plus/Plus > gi|46250517|emb|AJ635302.1| Cucumber mosaic virus partial cp gene for coat protein, genomic RNA Length=533 Score = 40.1 bits (20), Expect = 0.27 Identities = 20/20 (100%), Gaps = 0/20 (0%) Strand=Plus/Plus > gi|46250515|emb|AJ635301.1| Cucumber mosaic virus partial cp gene for coat protein, genomic RNA Length=533 Score = 40.1 bits (20), Expect = 0.27 Identities = 20/20 (100%), Gaps = 0/20 (0%) Strand=Plus/Plus > gi|46019642|emb|AJ634532.1| Cucumber mosaic virus segment RNA3 partial cp gene for coat protein and partial intercistronic region, genomic RNA Length=533 Score = 40.1 bits (20), Expect = 0.27 Identities = 20/20 (100%), Gaps = 0/20 (0%) Strand=Plus/Plus > gi|37183419|gb|AY380812.1| Cucumber mosaic virus from Eucharis grandiflora coat protein gene, complete cds Length=657 Score = 40.1 bits (20), Expect = 0.27 Identities = 20/20 (100%), Gaps = 0/20 (0%) Strand=Plus/Plus > gi|37181255|gb|AY380533.1| Cucumber mosaic virus coat protein gene, complete cds Length=657 Score = 40.1 bits (20), Expect = 0.27 Identities = 20/20 (100%), Gaps = 0/20 (0%) Strand=Plus/Plus > gi|37181253|gb|AY380532.1| Cucumber mosaic virus coat protein gene, complete cds Length=657 Score = 40.1 bits (20), Expect = 0.27 Identities = 20/20 (100%), Gaps = 0/20 (0%) Strand=Plus/Plus > gi|34979122|gb|AY377584.1| Cucumber mosaic virus coat protein gene, complete cds Length=657 Score = 40.1 bits (20), Expect = 0.27 Identities = 20/20 (100%), Gaps = 0/20 (0%) Strand=Plus/Plus > gi|34978959|gb|AY376840.1| Cucumber mosaic virus coat protein gene, complete cds Length=657 Score = 40.1 bits (20), Expect = 0.27 Identities = 20/20 (100%), Gaps = 0/20 (0%) Strand=Plus/Plus > gi|34811731|gb|AY374328.1| Cucumber mosaic virus coat protein gene, complete cds Length=657 Score = 40.1 bits (20), Expect = 0.27 Identities = 20/20 (100%), Gaps = 0/20 (0%) Strand=Plus/Plus > gi|34811729|gb|AY374327.1| Cucumber mosaic virus coat protein gene, complete cds Length=657 Score = 40.1 bits (20), Expect = 0.27 Identities = 20/20 (100%), Gaps = 0/20 (0%) Strand=Plus/Plus > gi|23345090|gb|AY138992.1| Cucumber mosaic virus clone Q6 coat protein mRNA, complete cds Length=988 Score = 40.1 bits (20), Expect = 0.27 Identities = 20/20 (100%), Gaps = 0/20 (0%) Strand=Plus/Plus > gi|72536104|gb|DQ141675.1| Cucumber mosaic virus coat protein gene, complete cds Length=657 Score = 40.1 bits (20), Expect = 0.27 Identities = 20/20 (100%), Gaps = 0/20 (0%) Strand=Plus/Plus > gi|33590514|gb|AY345895.1| Cucumber mosaic virus isolation-source Arachis repens capsid protein gene, complete cds Length=657 Score = 40.1 bits (20), Expect = 0.27 Identities = 20/20 (100%), Gaps = 0/20 (0%) Strand=Plus/Plus > gi|32395625|gb|AY210438.1| Cucumber mosaic virus coat protein mRNA, complete cds Length=713 Score = 40.1 bits (20), Expect = 0.27 Identities = 20/20 (100%), Gaps = 0/20 (0%) Strand=Plus/Plus > gi|32328355|gb|AY125575.1| Cucumber mosaic virus coat protein gene, complete cds Length=770 Score = 40.1 bits (20), Expect = 0.27 Identities = 20/20 (100%), Gaps = 0/20 (0%) Strand=Plus/Plus > gi|22506879|gb|AF533968.1| Cucumber mosaic virus clone N6 coat protein mRNA, complete cds Length=987 Score = 40.1 bits (20), Expect = 0.27 Identities = 20/20 (100%), Gaps = 0/20 (0%) Strand=Plus/Plus > gi|91984115|gb|DQ459482.1| Cucumber mosaic virus isolate CMV-YN coat protein (cp) gene, complete cds Length=657 Score = 40.1 bits (20), Expect = 0.27 Identities = 20/20 (100%), Gaps = 0/20 (0%) Strand=Plus/Plus > gi|91984113|gb|DQ459481.1| Cucumber mosaic virus isolate CMV-HLJ coat protein (cp) gene, complete cds Length=657 Score = 40.1 bits (20), Expect = 0.27 Identities = 20/20 (100%), Gaps = 0/20 (0%) Strand=Plus/Plus > gi|71648826|gb|DQ028777.2| Cucumber mosaic virus coat protein gene, complete cds Length=657 Score = 40.1 bits (20), Expect = 0.27 Identities = 20/20 (100%), Gaps = 0/20 (0%) Strand=Plus/Plus > gi|56684564|gb|AY690621.1| Cucumber mosaic virus coat protein gene, complete cds Length=657 Score = 40.1 bits (20), Expect = 0.27 Identities = 20/20 (100%), Gaps = 0/20 (0%) Strand=Plus/Plus > gi|56684562|gb|AY690620.1| Cucumber mosaic virus coat protein gene, complete cds Length=657 Score = 40.1 bits (20), Expect = 0.27 Identities = 20/20 (100%), Gaps = 0/20 (0%) Strand=Plus/Plus > gi|89474596|gb|DQ412732.1| Cucumber mosaic virus isolate Phy segment RNA3, complete sequence Length=2220 Score = 40.1 bits (20), Expect = 0.27 Identities = 20/20 (100%), Gaps = 0/20 (0%) Strand=Plus/Plus > gi|17933277|gb|AF444252.1|AF444252 Banana mosaic virus coat protein mRNA, complete cds Length=654 Score = 40.1 bits (20), Expect = 0.27 Identities = 20/20 (100%), Gaps = 0/20 (0%) Strand=Plus/Plus > gi|14030604|gb|AF368192.1|AF368192 Cucumber mosaic virus strain Pf coat protein gene, complete cds Length=657 Score = 40.1 bits (20), Expect = 0.27 Identities = 20/20 (100%), Gaps = 0/20 (0%) Strand=Plus/Plus > gi|14028598|gb|AF268597.1|AF268597 Cucumber mosaic virus isolate PE segment RNA3, complete sequence Length=2216 Score = 40.1 bits (20), Expect = 0.27 Identities = 20/20 (100%), Gaps = 0/20 (0%) Strand=Plus/Plus > gi|13448695|gb|AF350450.1|AF350450 Cucumber mosaic virus coat protein gene, complete cds Length=657 Score = 40.1 bits (20), Expect = 0.27 Identities = 20/20 (100%), Gaps = 0/20 (0%) Strand=Plus/Plus > gi|12698657|gb|AF316362.1|AF316362 Cucumber mosaic virus Chrysanthemum boreale coat protein gene, complete cds Length=657 Score = 40.1 bits (20), Expect = 0.27 Identities = 20/20 (100%), Gaps = 0/20 (0%) Strand=Plus/Plus > gi|40738314|gb|AY429437.1| Cucumber mosaic virus segment RNA3, complete sequence Length=2212 Score = 40.1 bits (20), Expect = 0.27 Identities = 20/20 (100%), Gaps = 0/20 (0%) Strand=Plus/Plus > gi|40738301|gb|AY429432.1| Cucumber mosaic virus segment RNA3, complete sequence Length=2219 Score = 40.1 bits (20), Expect = 0.27 Identities = 20/20 (100%), Gaps = 0/20 (0%) Strand=Plus/Plus > gi|10952732|gb|AF268599.1|AF268599 Cucumber mosaic virus 3A protein and coat protein genes, complete cds Length=2215 Score = 40.1 bits (20), Expect = 0.27 Identities = 20/20 (100%), Gaps = 0/20 (0%) Strand=Plus/Plus > gi|65994009|gb|DQ018288.1| Cucumber mosaic virus isolate M coat protein gene, complete cds Length=895 Score = 40.1 bits (20), Expect = 0.27 Identities = 20/20 (100%), Gaps = 0/20 (0%) Strand=Plus/Plus (Nguồn: