Luận văn Nghiên cứu, phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus sinh enzim protease từ đất vườn

sinh tổng hợp enzym với 3 thông số pH, sinh trưởng và hoạt lực của enzym. 2.4.18. Phương pháp xử lý số liệu thực nghiệm Sử dụng toán xác suất thống kê để xử lý các số liệu thu được cho ra kết quả.  Xác định giá trị trung bình Giá trị trung bình của các số liệu là tổng giá trị thực của mỗi lần đo chia cho số lần đo: n x x n i  Trong đó: : giá trị của một lần đo ix x : giá trị trung bình n : số lần đo Nếu thực hiện sự đo đạc lặp lại nhiều lần trên một mẫu thí nghiệm thì chúng ta có thể tiệm cận đến một giá trị trung bình thật. Để giá trị trung bình của các lần đo như là một giá trị gần đúng với giá trị trung bình thật, ta phải dùng phương pháp thống kê để đánh giá mức độ chính xác của các lần đo.  Tính toán độ lệch mẫu và độ lệch chuẩn  Độ lệch mẫu (Sample deviation): Là sự khác biệt giữa giá trị của một lần đo với giá trị trung bình. Độ lệch mẫu = xi - x Trong đó: 47 xi : giá trị của một lần đo. x : giá trị trung bình.  Độ lệch chuẩn (Standard deviation): Là sai số có thể có trong một lần đo. S  2i 1n xx    Với S : độ lệch chuẩn : giá trị của một lần đo ix x : giá trị trung bình n : số lần đo Vậy giá trị trung bình có thể diễn đạt như sau: Sx  Độ lệch chuẩn có thể chuyển đổi thành độ lệch chuẩn của giá trị trung bình hay còn gọi là sai số chuẩn được ký hiệu là Sm. Sm n S S: độ lệch chuẩn n: số lần đo. Công thức trên cho thấy, số lần đo càng lớn (n càng lớn) thì độ lệch chuẩn của giá trị trung bình (Sm) càng nhỏ, hay mức độ chính xác của lần đo đạc càng cao. Độ lệch chuẩn có thể được biểu diễn qua đường cong phân bố Gaussian. Kết quả cho thấy: 68,3% các giá trị quan sát sẽ nằm trong khoảng x  S. 95,5% các giá trị quan sát sẽ nằm trong khoảng x  2S. 99,7% các giá trị quan sát sẽ nằm trong khoảng x  3S. 48 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ THẢO LUẬN 3.1. Phân lập và tuyển chọn 3.1.1. Phân lập Từ các mẫu đất vườn, khoai tây và cỏ khô đã phân lập được 10 khuẩn lạc. Các khuẩn lạc lần lượt được kí hiệu là KT 1, KT 2, KT 3, KT 4, KT 5, KT 6, KT 7, KT 8, KT 9, KT 10. Các khuẩn lạc sau khi được làm sạch thuần khiết bằng cách phân lập và cấy lại nhiều lần, được tiến hành so sánh vòng phân giải enzim protease để chọn ra 3 chủng có vòng phân giải cao nhất. 3.1.2. Khảo sát vòng phân giải Tiến hành nuôi các chủng trên trong môi trường 2.2.3 lỏng trên máy lắc với tốc độ 200 vòng/phút sau 40 giờ kể từ lúc bắt đầu cấy vi khuẩn, ủ ở nhiệt độ phòng. Ly tâm dịch môi trường ở 5000vòng/ phút trong 20 phút để thu dịch chiết protease ngoại bào (loại bỏ cặn ở dưới). Nhỏ 0.2ml dịch ly tâm lên bề mặt thạch (môi trường 2.2.2 đặc) khoang lổ. Ta thu được kết quả đo bán kính vòng phân giải của 10 chủng vi khuẩn như sau: Bảng 3.1: Bán kính vòng phân giải casein của 10 chủng vi khuẩn phân lập Chủng vi khuẩn Vòng phân giải (mm) KT1 13 KT2 11 KT3 8 KT4 19 KT5 14 KT6 20 KT7 14 KT8 20 KT9 15 KT10 22 49 Qua bảng 3.1 ta nhận thấy: Các chủng vi khuẩn đều có khả năng tổng hợp enzim protease. Trong đó các chủng KT6, KT8, KT10 có bán kính vòng phân giải lớn hơn so với các chủng còn lại. Qua đó, có thể sơ bộ đánh giá khả năng sinh tổng hợp protease của 10 chủng vi khuẩn. Từ đó chọn 3 chủng KT6, KT8, KT10 để tiếp tục nghiên cứu đặc điểm hình thái khuẩn lạc. KT10 KT6 KT8 Hình 3.1: Vòng phân giải casein của chủng KT6, KT8, KT10. 50 3.1.3. Xác định các đặc điểm sinh học 3.1.3.1. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc Tiến hành pha loảng chủng KT 10, 6, 8 với nồng độ thích hợp với nước cất, tiến hành cấy dàn trên đĩa petri và quan sát khuẩn lạc của chúng dưới kính hiển vi với độ phóng đại 40 lần . KT 6 KT8 Hình 3.2: Khuẩn lạc của chủng KT6, KT8, KT10. Qua quan sát hình 3.2 ta nhận thấy: Khuẩn lạc của KT 6: màu trắng đục, bề mặt khuẩn lạc mịn, mép hơi nhăn. KT 10 51 Khuẩn lạc của KT 8: tròn đều, không thùy, mép tròn đều, hơi lượng sóng có màu kem. Khuẩn lạc của KT 10: bám chặt vào môi trường thạch, bề mặt nhăn nheo, màu kem, mép nhẳn, hơi lượn sóng. 3.1.3.2. Đặc điểm hình thái tế bào Sau 20 giờ nuôi cấy ta tiến hành nhuộm gram tế bào vi khuẩn KT 10, KT6, KT 8. Quan sát dưới kính hiển vi với độ phóng đại 1000 lần. Hình 3.3: Tế bào vi khuẩn KT6, KT8, KT10 nhuộm Gram. KT 6 KT8 KT 10 52 Qua quan sát hình 3.3 ta thấy tế bào của cả ba chủng đều bắt màu tím có dạng hình que chứng tỏ cả ba đều là vi khuẩn gram dương. Tế bào của cả ba chủng đều đứng riêng rẻ là chủ yếu. 3.1.3.3. Nghiên cứu sự hình thành bào tử Tiến hành sốc nhiệt với dịch sinh khối tế bào của từng chủng sau khi nuôi 72h, ở nhiệt độ 850C, trong 15 phút. Sau đó gạt dịch này lên bề mặt môi trường thạch đĩa, để ở 370C trong 24 giờ theo dõi thấy cả 3 chủng đều có xuất hiện khuẩn lạc, chứng tỏ cả ba chủng đều sinh bào tử. Chúng tôi tiến hành quan sát các mẩu nhuộm đơn dưới kính hiển vi có độ phóng đại 1000 lần ta thấy bào tử của cả 3 chủng phân bố chính tâm là chủ yếu. Hình 3.4: Bào tử vi khuẩn KT6, KT8, KT10. KT 8 KT6 KT 10 53 3.1.3.4. Nghiên cứu khả năng sinh enzim catalaza Tiến hành cấy từng chủng vi khuẩn ra đĩa petri và nuôi trong tủ ấm ở 370C. Sau khi xuất hiện khuẩn lạc thì giỏ lên khuẩn lạc 1 giọt H2O2 10%. Kết quả cho thấy khuẩn lạc bị giỏ H2O2 có xuất hiện bọt khí. Chứng tỏ cả ba chủng đều có khả năng sinh enzim catalaza để phân hủy H2O2 thành H2O và O2. Chính khí O2 bay lên làm xuất hiện bọt khí. H2O2 Catalase H2O + O2 Qua đó chứng tỏ cả ba chủng đều là vi sinh vật hiếu khí. Chính vì vậy trong quá trình nghiên cứu tiếp theo cần sử dụng máy lắc: bình tam giác 250ml chứa 50ml dịch môi trường được bổ sung 1-2% chủng giống được lắc ở 200vòng/ phút. 3.1.3.5. Xác định nồng độ NaCl ức chế sinh trưởng của vi khuẩn Hầu hết các chủng Bacillus đều ưa mặn, nên mục đích của thí nghiệm nhắm xác định độ mặn tối đa mà vi khuẩn có thể chịu được. Việc nghiên cứu khả năng chịu mặn của các chủng vi khuẩn có ý nghĩa rất lớn tới phạm vi ứng dụng của vi khuẩn như sản suất chế phẩm probiotic để nuôi tôm. Chuẩn bị môi trường MPA có nồng độ muối dao động từ 1% - 10% cấy vi sinh vật với tỷ lệ 1-2% vào các bình để trên máy lắc với tốc độ 200 vòng/ phút. sau 24h tiến hành đo OD sinh trưởng của vi khuẩn. Bảng 3.2: Sự sinh trưởng của vi khuẩn ở các nồng độ muối khác nhau Nồng độ NaCl % OD(620nm) KT6 OD(620nm) KT8 OD(620nm) KT10 1 0.680 ± 0.004 0.715 ± 0.001 0.725 ± 0.001 2 0.698 ± 0.005 0.722±0.001 0.754 ± 0.001 3 0.684 ± 0.0003 0.705 ± 0.001 0.737 ± 0.004 4 0.646 ± 0.002 0.693 ± 0.002 0.693 ± 0.003 5 0.557 ± 0.001 0.523 ± 0.001 0.613 ± 0.002 54 6 0.316 ± 0.002 0.257 ± 0.022 0.538 ± 0.001 7 0.113 ± 0.001 0.108 ± 0.003 0.207 ± 0.002 8 0.086 ± 0.002 0.069 ± 0.002 0.072 ± 0.002 9 0.060 ± 0.001 0.005 ± 0.001 0.063 ± 0.001 10 0.0040 ± 0003 0.005 ± 0.001 0.035 ± 0.003 Hình 3.5: Khả năng chịu măn của 3 chủng vi khuẩn Từ số liệu đo OD(620nm) của 3 chủng ta thấy ở độ mặn từ 1%- 5% cả 3 chủng KT6, KT8, KT10 đều sinh trưởng khá tốt: giá trị đo OD của cả 3 chủng đều dao động trong khoảng 0.7 – 0.5. Khi độ mặn tăng thêm thì sự sinh trưởng của cả 3 chủng đều yếu dần. Riêng chủng KT 8 ngừng phát triển ở độ mặn 9%. Hai chủng KT6, KT10 ngừng ở 10%. Theo như Kusher (Kusher et al.,1983) có thể xếp 3 chủng này vào nhóm ưa mặn. 55 3.1.4. Tuyển chọn chủng vi khuẩn Để có thể đánh giá chính xác chúng tôi tiến hành lên men 3 chủng vi khuẩn trên trong môi trường 2.2.3 lỏng và tiến hành đo hoạt độ của 3 chủng trên theo phương pháp Anson. Tiến hành nuôi các chủng trên trong môi trường có casein 1% trong điều kiện 370C trên máy lắc với tốc độ 200 vòng/ phút trong 48 tiếng. Sau đó ly tâm lấy dịch tiến hành đo hoạt độ protease theo phương pháp Anson thu được kết quả sau: Đường chuẩn Tyrosine Bảng 3.3: Đường chuẩn Tyrosine Lượng tyrosine (µM) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 ∆OD 0 0.324 0.543 0.868 1.099 1.293 Hình 3.6: Đồ thị đường chuẩn Tyrosine 56 Bảng 3.4: Kết quả đo tốc độ sinh trưởng và hoạt độ protease của 3 chủng Chủng OD sinh trưởng HĐP (UI/ml) KT 6 0.513 ± 0.011 1.764 ± 0.007 KT 8 0.460 ± 0.026 1.496 ± 0.017 KT 10 0.556 ± 0.006 1.907 ± 0.017 Theo bảng 3.4 ta thấy chủng số 10 có hoạt tính protease và tốc độ sinh trưởng cao nhất. Nên ta chọn chủng KT 10 để tiến hành nghiên cứu các đặc điểm sinh trưởng và phát triển tiếp theo 3.2. Phân loại và xác định tên của chủng tuyển chọn Từ những đặc điểm sinh học của chủng KT 10 mà ta thu nhận được trong các nghiên cứu ở trên ta tiến hành đối chiếu với bảng định loại của Harry Seeley và cộng sự (1994), ta có thể kết luận: Chủng KT 10 là một loài thuộc chi Bacillus. Để có thể xác định chính xác đó là loài nào ta dực vào kết quả phân tích trình tự 16s-rARN do phòng xét nghiệm NK-BIOTECH của công ty Nam Khoa xác định. Kết quả được trình bày ở hình sau: Hình 3.7: Trình tự 16S rARN của chủng KT 10 57 Trình tự này được đem đối chiếu với trình tự 16S rARN của các chủng vi khuẩn đã được định loại trong ngân hàng gen BLAST. Kết quả đối chiếu cho thấy chủng KT 10 là Bacillus subtilis với độ chính xác là 100%. Vì vậy ta gọi chủng này là Bacillus subtilis KT 10 3.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy lên khả năng sinh trưởng và tổng hợp protease của vi khuẩn. Chuẩn bị môi trường có các nguồn nguyên liệu khác nhau ở các nồng độ khác nhau:  Bổ sung Casein vào môi trường 2.2.3 thay glucose ở nồng độ 1, 2, 3, 4, 5%.  Bổ sung bột đậu nành vào môi trường 2.2.3 thay glucose ở nồng độ 1, 2, 3, 4, 5%.  Bổ sung bột cá vào môi trường cơ sở 2.2.3 thay glucose ở nồng độ 1, 2, 3, 4, 5%.  Dùng môi trường cơ sở 2.2.3 làm thí nghiệm đối chứng. Cho 50ml môi trường vào bình tam giác khữ trùng ở 1atm/30 phút, để nguội sau đó cấy vi khuẩn vào với tỷ lệ 1-2%. Các môi trường đều được chuẩn độ ở pH 7. Sau đó lắc ở 200 vòng/phút trong 40h ở 370C. Đo độ sinh trưởng và hoạt độ protein ta thu được kết quả ở bảng 3.5 Bảng 3.5: Sinh trưởng và hoạt độ enzim protease của KT10 trong các cơ chất khác nhau Cơ chất Nồng độ % OD sinh trưởng HĐP (UI/ml) 1 0.437 ± 0.005 0.944 ± 0.019 2 0.631 ± 0.004 1.270 ± 0.077 3 0.497 ± 0.003 1.078± 0.057 4 0.432 ± 0.004 1.066 ± 0.047 G lu co se 5 0.387 ± 0.009 0.777 ± 0.050 58 1 0.503 ± 0.005 1.904 ± 0.032 2 0.537 ± 0.003 1.931 ± 0.046 3 0.603 ± 0.003 1.977 ± 0.037 4 0.599 ± 0.002 1.811 ± 0.035 C as ei n 5 0.437 ± 0.003 1.680 ± 0.016 1 0.963 ± 0.002 1.400 ± 0.005 2 1.486 ± 0.002 1.758 ± 0.163 3 1.664 ± 0.002 1.811 ± 0.032 4 1.522 ± 0.003 1.716 ± 0.063 B ột cá 5 1.215 ± 0.002 1.412 ± 0.027 1 1.232 ± 0.014 1.902 ± 0.016 2 1.56 ± 0.008 1.945 ± 0.023 3 1.898 ± 0.003 2.018 ± 0.014 4 1.968 ± 0.006 2.094 ± 0.009 B ột đậ u nà nh 5 1.609 ± 0.002 1.791 ± 0.015 Bảng 3.6: Hoạt độ enzim protease ở mức cao nhất với các cơ chất khác nhau Cơ chất Nồng độ % OD sinh trưởng HĐP (UI/ml) Glucose 2 0.631 ± 0.004 1.270 ± 0.077 Casein 3 0.603 ± 0.003 1.977 ± 0.037 Bột cá 3 1.664 ± 0.002 1.811 ± 0.032 Bột đậu nành 4 1.968 ± 0.006 2.094 ± 0.009 59 Hình 3.8 Hoạt độ enzim protease trong các môi trường với cơ chất khác nhau Qua kết quả thu được ta thấy Glucose không phải là cơ chất cảm ứng sinh enzim protease nên vi khuẩn sinh enzim có hoạt độ thấp hơn hẳn khi ta thay glucose bằng các cơ chất cảm ứng sinh enzim như đậu nành, bột cá và casein với các nồng độ khác nhau. Trong đó môi trường đậu nành 4% và casein 3% vi khuẩn phát triển tốt nhất và cho hoạt độ enzim cao nhất. Tuy nhiên, do giá thành của bột đậu nành rẻ hơn, lại dể tìm nên ta chọn đậu nành là cơ chất cảm ứng sinh enzim sau này. Đồng thời trong quá trình phát triển, vi khuẩn sinh enzim làm thay đổi độ pH của môi trường nên ta có thể bổ sung thêm CaCO3 ở các nồng độ 0.3, 0.5, 1, 1.5%, để trung hòa lượng axit tạo thành.Tiến hành tiếp giống vào 50ml môi trường với tỷ lệ 1- 2% rồi nuôi lắc ở 370C trong 40h với chế độ lắc là 200 vòng/ phút. Đo OD sinh trưởng và hoạt tính protease của vi khuẩn ta thu được kết quả theo bảng sau. 60 Bảng 3.7: Ảnh hưởng của nồng độ CaCO3 lên sinh trưởng và hoạt độ enzim protease của KT10 Nồng độ CaCO3 % pH OD sinh trưởng HĐP(UI/ml) 0 8.63 1.906 ± 0.014 2.011 ± 0.007 0.3 8.68 1.927 ± 0.008 2.106 ± 0.008 0.5 8.85 1.935 ± 0.003 2.144 ± 0.010 1 8.64 1.914 ± 0.006 2.060 ± 0.028 1.5 8.60 1.902 ± 0.002 1.957 ± 0.007 Hình 3.9: Ảnh hưởng của nồng độ CaCO3 lên sinh trưởng và hoạt độ enzim protease của KT10 Qua đồ thị ta thấy nồng độ CaCO3 thích hợp nhất cho sự sinh trưởng và sinh enzim protease của vi khuẩn là 0.5%. Nên trong các thí nghiệm sau ta chọn môi trường có nồng độ cơ chất đậu nành là 4% và bổ sung CaCO3 với nồng độ là 0.5%. 61 3.4. Nghiên cứu các điều kiện môi trường ảnh hưởng đến sinh tổng hợp enzym prorease của vi khuẩn. 3.4.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp enzym protease của chủng vi khuẩn KT10 Nhằm xác định thời gian thích hợp để dừng nuôi cấy thu sinh lượng enzim tối đa, ta tiến hành nuôi vi khuẩn trong môi trường cảm ứng sinh enzim có cơ chất đậu nành 4%, bổ sung CaCO3 với nồng độ 0.5 %. Nuôi các bình này trong máy lắc với tốc độ 200 vòng/ phút. Sau từng khoảng thời gian xác định 20, 30, 36, 40, 44, 48, 52... Xác định hoạt tính của protease của môi trường bằng phương pháp Anson và đo OD sinh trưởng ở bước sóng 620nm. Số liệu thu được thể hiện ở bảng sau: Bảng 3.8: Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên sinh trưởng và sinh tổng hợp enzim protease của vi khuẩn KT 10 Thời gian nuôi cấy OD sinh trưởng HĐP (UI/ml) 20h 0.584 ± 0.001 0.836 ± 0.007 30h 1.367 ± 0.002 1.774 ± 0.008 36h 1.988 ± 0.003 2.026 ± 0.007 40h 1.968 ± 0.002 2.126 ± 0.016 44h 1.955 ± 0.003 1.893 ± 0.012 48h 1.505 ± 0.002 1.712 ± 0.006 52h 1.241 ± 0.002 1.369 ± 0.005 62 Hình 3.10: Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên sinh trưởng và sinh tổng hợp enzim protease của vi khuẩn KT 10 Sau khi tiến hành ly tâm thu dịch enzim thô và tiến hành khảo sát theo phương pháp Anson. Ta thấy sự sinh trưởng của vi khuẩn và hoạt độ enzim sinh ra tăng dần từ 20h – 40h sau đó giảm dần. Sự sinh trưởng đạt mức cao nhất ở 36h và hoạt độ enzim đạt cao nhất ở khoảng thời gian 40h. Vì vậy, trong các thí nghiệm sau ta chọn thời gian thích hợp để thu enzim là 40 giờ. 3.4.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy lên khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp enzym protease của chủng vi khuẩn KT 10 Nhiều nghiên cứu cho thấy nhờ khả năng sinh bào tử mà các vi khuẩn Bacillus có khả năng sinh trưởng trong giới hạn nhiệt độ khá rộng, nhưng hầu hết các vi khuẩn nhóm này đều là loài ưa ấm với nhiệt độ dao động từ 20 – 450C [21,22]. Nhằm tìm được nhiệt độ tối ưu cho sự sinh trưởng và sinh enzim của vi khuẩn KT10. Chủng giống được nuôi ở 370C, sau đó cấy 1 - 2% vào môi trường cảm ứng sinh 63 enzim có cơ chất đậu nành 4%, bổ sung CaCO3 với nồng độ 0.5 % trong bình trụ miệng nhỏ. Nuôi các bình này trong máy lắc ở các nhiệt độ 27, 32, 37, 42, 47... với tốc độ 200 vòng/ phút trong thời gian 40h. Ta thu được kết quả như bảng sau: Bảng 3.9: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp protease của vi khuẩn KT 10 Nhiệt độ OD sinh trưởng HĐP (UI/ml) 270C 1.180 ± 0.003 1.643 ± 0.018 320C 1.894 ± 0.002 2.039 ± 0.003 370C 1.985 ± 0.003 2.206 ± 0.009 420C 1.826 ± 0.002 2.183 ± 0.036 470C 1.508 ± 0.002 1.797 ± 0.014 Hình 3.11: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp protease của vi khuẩn KT 10 64 Theo số liệu ở bảng 3.9 ta thấy sự sinh trưởng và hoạt độ protease của vi khuẩn KT 10 đạt tối đa ở điều kiện nhiệt độ là 370C. Kết quả này là phù hợp vì các chủng Bacillus thường là các chủng ưa ấm.Vì vậy, trong các thí nghiệm tiếp theo ta chọn điều kiện nhiệt độ nuôi cấy thích hợp là 370C. 3.4.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của pH môi trường lên khả năng sinh trưởng và tạo enzym của chủng vi khuẩn KT 10 pH là chỉ tiêu để đánh giá khả năng sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn nên đây là một yếu tố quan trọng cần được nghiên cứu. Để đánh giá được sự phát triển cũng như khả năng sinh enzim của KT 10 ở các pH khác nhau, ta tiến hành nuôi các chủng giống, sau đó cấy 1 - 2% vào môi trường cảm ứng sinh enzim có cơ chất đậu nành 4%, bổ sung CaCO3 với nồng độ 0.5 %, ở mỗi pH môi trường khác nhau: 6,5; 7; 7,5; 8; 8.5 ... trong 40h và ở nhiệt độ 370C, ly tâm dịch enzym thô. Đo OD sinh trưởng và hoạt tính của protease ta được kết quả như sau: Bảng 3.10: Ảnh hưởng của pH đến sinh trưởng và sinh tổng hợpenzim protease của KT10 pH OD sinh trưởng HĐP (UI/ml) 6.5 1.780 ± 0.003 1.931 ± 0.011 7 2.035 ± 0.002 2.225 ± 0.017 7.5 2.022 ± 0.002 2.099 ± 0.013 8 1.926 ± 0.002 2.014 ± 0.008 8.5 1.908 ± 0.002 1.933 ± 0.008 65 Hình 3.12: Ảnh hưởng của pH đến sinh trưởng và sinh tổng hợp enzim protease của KT10 Qua bảng 3.10 ta thấy ở pH 6.5 vi khuẩn phát triển yếu. Khi pH tăng từ 7-8.5 vi khuẩn sinh trưởng và phát triển tốt hơn. Ở pH 7- 7,5 là khoảng mà vi khuẩn sinh trưởng tốt và cho hoạt tính enzim cao nhất. Do vậy, trong các thí nghiệm tiếp theo ta chọn độ pH thích hợp cho sự sinh trưởng và sinh enzim của vi khuẩn là 7-7.5. 3.4.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của sự hiếu khí lên khả năng sinh trưởng và tạo enzym của chủng vi khuẩn KT 10 Nồng độ oxi hòa tan trong môi trường có ảnh hưởng lớn đến quá trình sinh trưởng phát triển của vi sinh vật hiếu khí. Tuy nhiên ảnh hưởng này có khác nhau tùy theo từng loài vi khuẩn, hầu hết là làm tăng tốc độ sinh trưởng, rút ngắn pha tiềm phát, nâng cao lượng sinh khối nhưng trong một vài trường hợp thì thiếu oxi tuy có kiềm hãm sinh trưởng nhưng lại gia tăng quá trình sinh tổng hợp enzim. Để tìm hiểu ảnh hưởng của độ thông khí lên khả năng sinh enzim và sinh trưởng của vi khuẩn ta cho vào các bình tam giác có thể tích 250ml dung địch lên men có thể tích khác nhau từ 25ml – 125ml. Độ thông khí được tính bằng tỷ lệ thể tích môi trường so với thể 66 tích bình chứa để ở nhiệt độ 370C trên máy lắc với tốc độ 200 vòng/ phút trong 40 giờ. Tiến đo OD sinh trưởng và hoạt độ protease ta thu được kết quả như bảng sau: Bảng 3.11: Ảnh hưởng của sự hiếu khí lên sinh trưởng và sinh tổng hợp enzim protease của KT10 Độ thông khí % OD sinh trưởng HĐP (UI/ml) 10 1.874 ± 0.003 2.038 ± 0.012 20 1.890 ± 0.002 2.296 ± 0.008 30 1.764 ± 0.002 1.981 ± 0.008 40 1.590 ± 0.002 1.816 ± 0.025 50 1.542 ± 0.002 1.808 ± 0.005 Hình 3.13: Ảnh hưởng của sự hiếu khí lên sinh trưởng và sinh tổng hợp enzim protease của KT10 67 Dựa vào bảng 4.11 ta nhận thấy độ thông khí phù hợp cho sự sinh trưởng và sinh enzim của KT 10 là 20% tương đương với tỷ lệ giữa môi trường và bình chứa là 50/250 ml. Do vậy, độ thông khí thích hợp để nuôi vi khuẩn KT 10 là 20%. 3.5. Nghiên cứu tách enzym protease từ dịch môi trường. Dùng môi trường bột đậu nành 4% trong bình tam giác 250ml, cấy vi khuẩn với nồng độ 1 – 2 %, nuôi ở nhiệt độ 370C, trong 40 giờ đem ly tâm 5000 vòng/phút trong 20 phút loại bỏ cặn giữ lạnh ở 40C. Rồi tiến hành tủa enzim với các tác nhân tủa như trình bày ở phần trên. Ta thu được kết quả sau: Bảng 3.12: Thu nhận enzim bằng các tác nhân tủa Tác nhân tủa Ethanol 960 Acetone (NH4)2SO4 VddE/Vdm Hiệu suất thu nhận VddE/Vdm Hiệu suất thu nhận Nồng độ Hiệu suất thu nhận 1:3 3.8g/100ml 1:2 3.2g/100ml 70% 2.9g/100ml Tiến hành thí nghiệm khảo sát với 0,1g chế phẩm enzim protease thu được theo từng tác nhân tủa hòa tan trong 150ml nước cất. Đo hoạt độ enzim protease bằng phương pháp Ason ta thu được kết quả như bảng sau: Bảng 3.13: Kết quả đo hoạt độ enzim theo tác nhân tủa Tác nhân tủa HĐ P (UI/g) Ethanol 960 2485.1 ± 9.587 Acetone 1925.2 ± 25.688 (NH4)2SO4 1470.8 ± 9.148 Dựa vào bảng 3.13 ta nhận thấy sử dụng tác nhân tủa là ethanol 960 cho hiệu suất tủa cao nhất và đồng thời hoạt độ của enzim cũng được giữ lại cao nhất. Vì vậy trong các thí nghiệm sau ta sử dụng cồn ethanol 960 làm tác nhân tủa. 68 3.6. Xác định các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt độ enzim Sử dụng chế phẩm enzim protease được tinh sạch sơ bộ ở trên với độ pha loãng 1500 lần. Chúng tôi tiến hành khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến hoạt độ protease của chế phẩm 3.6.1. Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ enzim protease Casein được pha trong các dung dịch đệm có độ pH khác nhau 6, 6.5, 7, 7.5 , 8....Sau đó cho enzim protease tác dụng trong điều kiện nhiệt độ tối thích. Ta được kết quả như sau: Bảng 3.14 Hoạt độ enzim protease theo pH của dung dịch đệm pH HĐP (UI/g) 6 1036.7 ± 4.223 6.5 1687.9 ± 4.057 7 1967.8 ± 6.198 7.5 2257.9 ± 9.148 8 2272.1 ± 2.343 8.5 2363.4 ± 3.514 9 2241.7 ± 5.367 Hình 3.14: Hoạt độ enzim protease theo pH của dung dịch đệm 69 Dựa vào bảng 3.14 ta thấy pH có ảnh hưởng lớn đến hoạt tính của chế phẩm. Chế phẩm protease thu được có hoạt tính tương đối cao ở pH từ 7.5 – 9 . Đạt cao nhất ở độ pH là 8.5. Nên ta có thể kết luận chế phẩm protease thu được từ vi khuẩn KT 10 thuộc nhóm protease kiềm. 3.6.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ protease Sau khi nuôi cấy và tủa enzim protease ta tiến hành khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt độ protease của chế phẩm thu được kết quả sau: Bảng 3.15: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt độ enzim protease của chế phẩm Nhiệt độ (0C) HĐP (UI/g) 35 2253.9 ± 3.514 40 2296.5 ± 7.028 45 2312.7 ± 8.446 50 2410.1 ± 9.370 55 2109.8 ± 2.343 60 1795.4 ± 3.514 65 1024.5 ± 5.367 70 557.9 ± 9.587 Hình 3.15: Đồ thị kết quả đo hoạt độ enzim theo nhiệt độ phản ứng 70 Theo kết quả thu được ta thấy hoạt độ enzim của chế phẩm tương đối ổn định từ 350C – 550C. Đạt mức tối đa ở 500C (2410.1). Sau đó nếu nhiệt độ vẫn tiếp tục tăng thì hoạt tính của enzim giảm mạnh từ 1024.5 đến 557.9. 3.6.3. Ảnh hưởng của thời gian phản ứng đến hoạt độ protease Nhằm xác định được thời gian enzim tác dụng với cơ chất cho hiệu quả cao nhất, ta dùng chế phẩm enzim tủa được cho tác động với cơ chất casein1% trong thời gian: 10- 100 phút, ở nhiệt độ 500C và pH của dung đệm là 8.5. Tiến hành đo hoạt độ enzim ta thu được kết quả sau: Bảng 3.16: Hoạt độ enzim theo thời gian phản ứng Thời gian (phút) HĐ P (UI/g) 10 2318.8 ± 3.514 20 2373.5 ± 7.028 30 2408.0 ± 3.099 40 2467.9 ± 1.757 50 2593.9 ± 2.108 60 2605.8 ± 4.099 70 2247.5 ± 4.518 80 1748.2 ± 3.514 90 1466.7 ± 2.438 100 1164.3 ± 5.176 71 Hình 3.16: Hoạt độ enzim theo thời gian phản ứng Qua kết quả thu được ta thấy hoạt tính của chế phẩm tương đối ổn định trong khoảng từ 10-60 phút. Từ phút thứ 70, hoạt tính của chế phẩm giảm một cách nhanh chóng, và đến phút 100 chế phẩm có hoạt tính thấp nhất. Vì vậy khi tiến hành cho enzim phân hủy cơ chất ta có thể lựa chọn khoảng thời gian phù hợp cho phản ứng là từ 10 – 60 phút. 3.7. Nuôi cấy trong bình tam giác và nghiên cứu động học của quá trình này Từ các điều kiện tối ưu đã tìm được ở trên ta tiến hành cấy 1-2% chủng vi khuẩn KT 10 vào 250ml dịch lên men/ 1000ml bình chứa có cơ chất là bột đậu nành 4% có bổ sung 0.05% CaCO3, ở nhiệt độ 370C, pH 7. Sau từng khoảng thời gian xác định 20, 30, 36, 40, 44, 48, 52...tiến hành nghiên cứu động học quá trình sinh tổng hợp enzym với 3 thông số pH, sinh trưởng và hoạt độ enzim. Sau đó tủa enzim bằng cồn 960 rồi sấy khô ở 400C tiến hành pha loãng đo hoạt lực của enzym theo phương pháp Anson. Ta thu được kết quả theo bảng bảng 4.17 72 Bảng 3.17: Sinh trưởng, pH và hoạt độ của vi khuẩn KT 10 theo thời gian Thời gian pH OD sinh trưởng Hoạt độ enzim (UI/g) 20h 7.35 0.587 ± 0.002 0.837 ± 0.008 30h 7.86 1.374 ± 0.001 1.791 ± 0.003 36h 8.17 1.998 ± 0.002 2.115 ± 0.003 40h 8.37 1.978 ± 0.003 2.318 ± 0.006 44h 8.39 1.965 ± 0.002 2.200 ± 0.004 48h 7.85 1.513 ± 0.001 1.812 ± 0.003 52h 7.73 1.247 ± 0.002 1.549 ± 0.004 Hình 3.17 Động học sự sinh trưởng và sinh enzim của chủng KT 10 Như vậy sau một thời gian tiến hành phân lập, thử nghiệm các điều kiện nuôi cấy vi khuẩn KT 10 ta thấy khi được tiến hành nuôi với số lượng lớn hơn vi khuẩn vẩn có thể đảm bảo cho enzim protease kiềm có hoạt tính và tốc độ sinh trưởng của vi khuẩn không thay đổi nhiều so với khi nuôi ở qui mô nhỏ ( bình 250ml). 73 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ  KẾT LUẬN Từ những kết quả thu được ở trên, chúng tôi rút ra những kết luận sau đây: Từ đất vườn chúng tôi đã phân lập được10 khuẩn lạc khác nhau có hoạt tính protease. Trong đó có 3 chủng vi khuẩn cho hoạt tính protease tương đối mạnh là KT6, KT8, KT10. Sau đó tiến hành nghiên cứu hình thái tế bào, khuẩn lạc và một vài đặc điểm sinh học, ta thấy 3 chủng này là:  Trực khuẩn, gram (+), có khả năng hình thành bào tử.  Có hoạt tính catalase nên đây là vi sinh vật hiếu khí.  Nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trưởng là từ 300C-370C nên đây là những vi sinh vật ưa ấm .  Sinh trưởng tốt ở nồng độ muối 1% - 5%. Trong 3 chủng này thì chủng KT10 cho enzim với hoạt độ cao hơn hẳn 2 chủng còn lại nên KT10 được chọn làm chủng giống để nghiên cứu tiếp . Sau khi tiến hành định danh bằng phương pháp phân tử (PCR) đã xác định chủng KT10 là Bacillus subtilis với độ chính xác là 100%. Nghiên cứu nuôi cấy chủng KT10 trong các môi trường có cơ chất cảm ứng sinh enzim protease khác nhau như: casein, bột đậu nành, bột cá. Thì trong môi trường casein và bột đậu nành vi khuẩn KT 10 sinh tổng hợp enzim có hoạt độ cao hơn. Tuy nhiên, do bột đậu nành rẻ và dễ tìm nên bột đậu nành ở nồng độ 4% là cơ chất cảm ứng thích hợp để sinh enzim. Trong môi trường có 0.5% CaCO3 (đóng vai trò điều khiển pH) ta thấy vi khuẩn có thể sinh enzim có hoạt độ cao hơn. Các điều kiện tối ưu để nuôi cấy KT 10 là :  Nhiệt độ phù hợp là 370C.  Độ pH thích hợp cho môi trường ban đầu là 7. 74  Thời gian tối thích để chủng KT10 sinh tổng hợp enzim protease trên môi trường thích hợp trên là 40h.  Độ hiếu khí là 1/5 (50ml môi trường /250ml bình chứa) Chế phẩm enzim protease sau khi tinh sạch tiến hành tủa sơ bộ bằng nhiều tác nhân khác nhau. Trong đó cồn 960 là tác nhân tủa được nhiều và cho enzim protease có hoạt tính cao nhất với hiệu suất thu nhận enzim là 3.8g/100ml có hoạt độ là 2485.1UI/g. Enzim protease tủa được này cho hoạt độ cao nhất ở các điều kiện sau (Ở nồng độ cơ chất là 1% thời gian phản ứng 30phút pH của dung dịch đệm là 7.6, nhiệt độ 35.5):  Nhiệt độ phản ứng là 500C.  Độ pH của dung dịch đệm là 8.5 nên ta có thể kết luận đây là protease kiềm.  Thời gian enzim phản ứng với cơ chất là từ 10 – 60 phút . Tiến hành nuôi cấy nghiên cứu động học sự sinh trưởng và khả năng sinh tổng hợp enzim ở qui mô bình 1l ta thấy sự sinh trưởng và hoạt độ enzim của vi khuẩn gần như không thay đổi so với khi nuôi ở bình 250ml. Với các kết quả thu được từ các thí nghiệm hoàn toàn có thể làm cơ sở cho việc nghiên cứu sâu hơn về khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp enzim của chủng vi khuẩn này để có thể áp dụng vào sản xuất enzim protease kiềm trên qui mô lớn hơn.  ĐỀ NGHỊ Do điều kiện khách quan nên tôi không thể nghiên cứu sâu hơn. Nếu có điều kiện, chúng tôi sẽ tiếp tục đề tài với các nghiên cứu:  Khảo sát sâu các điều kiện tối ưu cho khả năng sinh tổng hợp enzim protease ở qui mô lớn hơn.  Nghiên cứu các ứng dụng của enzim protease kiềm trong thực tiễn như sản xuất các chế phẩm dùng trong chăn nuôi, bảo vệ môi trường v.v… 75 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 1. Nguyễn Trọng Cẩn ( chủ biên), Nguyễn Thị Hiền, Đỗ Thị Giang, Trần Thị Luyến (1998), Công nghệ enzyme, NXB Nông Nghiệp – Tp Hổ Chí Minh. 2. Lâm Thị Kim Châu, Văn Đức Chín, Ngô Đại Nghiệp (2004), Thực tập lớn sinh hóa, NXB Đại Học Quốc Gia Tp Hổ Chí Minh. 3. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2000), Vi Sinh vật học. NXB Giáo dục. 4. Nguyễn Lân Dũng (dịch) (1983), Thực Hành Vi Sinh Vật Học, NXB Đại Học và Trung Học Chuyên Nghiệp Hà Nội. 5. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Phùng Tiến, Đặng Đức Trạch, Phạm Văn Ty (1978), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, NXB Khoa học và Kỹ thuật. 6. Nguyễn Thành Đạt (1990), Thực hành vi sinh vật, NXB Nông nghiệp. 7. Cao Thị Hạnh (2007), Nghiên cứu nuôi vi khuẩn Bacillus thu sinh khối để sản xuất chế phẩm EMINA dùng trong chăn nuôi và bảo vệ môi trường, Khoá luận tốt nghiệp, Trường Đại học Nông nghiệp I – Hà Nội. 8. Phạm Thị Ánh Hồng (2003), Kỹ Thuật Sinh Hóa, NXB Đại Học Quốc Gia TP Hồ Chí Minh. 9. Nguyễn Đức Lượng (Chủ biên) Cao Cường, Nguyễn Ánh Tuyết, Lê Thị Thủy Tiên, Tạ Thu Hằng, Huỳnh Ngọc Oanh, Nguyễn Thúy Hương, Phan Thị Huyền (2004), Công Nghệ Enzym, NXB Đại Học Quốc Gia TP Hồ Chí Minh. 10. Nguyễn Đức Lượng (Chủ biên) Nguyễn Thị Huyền, Nguyễn Ánh Tuyết (2003), Thí nghiệm vi sinh vật học, NXB Đại Học Quốc Gia TP Hồ Chí Minh. 11. Nguyễn Đức Lượng, Nguyễn Hữu Phúc (1996), Công Nghệ Vi sinh vật ( tập 2) Vi Sinh Vật Học Công Nghiệp, NXB Trường Đại Học Bách Khoa TP Hồ Chí Minh. 76 12. Đặng Lê Minh (2006), Khảo sát khả năng tổng hợp và đặc tính protease của một số giống Bacillus Sp phân lập từ các sản phẩm thuốc thú y và thủy sản, Báo cáo thực tập tốt nghiệp, Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên. 13. Nguyễn Văn Mùi (2001), Thực hành hóa sinh học, NXB Khoa Học và Kỹ Thuật. 14. Lương Đức Phẩm (2007), Chế phẩm sinh học dùng trong chăn nuôi và nuôi trồng thủy sản, NXB Nông Nghiệp. 15. Lương Đức Phẩm (1998), Công nghệ vi sinh vật, NXB Nông Nghiệp. 16. Lương Đức Phẩm (2006), Công nghệ sinh học trong bảo quản và chế biến thực phẩm, Tài liệu dùng trong lớp cao học sinh học, Viện KHCN Việt Nam. 17. Âu Thị Bích Phượng (2006), Khảo sát khả năng tổng hợp và một số điều kiện kỹ thuật ảnh hưởng lên quá trình sinh tổng hợp protease của Bacillus sp,Báo cáo thực tập tốt nghiệp, Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên. 18. Nguyễn Thị Huyền Thu (2007), Nghiên cứu, phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus sinh enzym thuỷ phân từ đất vườn, Khoá luận tốt nghiệp, Viện Đại học Mở Hà Nội. 19. Đồng Thị Thanh Thu (2003), Sinh hóa ứng dụng, NXB Đại Học Quốc Gia TP Hồ Chí Minh. 20. Lê Ngọc Tú (1982), Enzym vi sinh vật, NXB Khoa học và Kỹ thuật. 21. Đào Thị Thanh Xuân (2008), Nghiên cứu sử dụng nhóm vi khuẩn Bacillus tạo chế phẩm sinh học xử lý môi trường nước nuôi thủy sản, Luận văn thạc sĩ khoa học, Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội. 22. Hội hóa sinh Việt Nam, Hội hóa sinh y học Việt Nam, Hội khoa học và công nghệ lương thực, thực phẩm Việt Nam (2008), Hội nghị khoa học toàn quôc lần thứ IV Hóa sinh và sinh học phân tử phục vụ nông, sinh, y học và công nghiệp thực phẩm, Hà Nội. 77 TÀI LIỆU NƯỚC NGOÀI 23. John G.Holt, Noel R. Krieg, Peter H.A. Sneath, James T. Staley, Stanley T. William (1994), Bergey’s Mannual of determinative bacteriology, A Waverly company, (30, 83,93,486,532, 559,560,566) 24. Harry Seeley, Jonh Lee (1994), Laboratory manual of Microbiology, pp 437. 25. Klaus Mosbach (1987). Part C: Immobilized Enzyms and Cells- Academic Press, INC. 26. Kushner, D.J (1983) Deverlopment of salt-resistant active transport in a moderately halophilic aerobic bacteria. Microbiol. Mol. Biol. Review 62, 504-544. 27. M. F. Chaplin and C. Bucke, (1990). Enzyme Technology. Cambridge University Press 28. Rosovitz, M. J., Voskuil, M. I., Chambliss, G. H. (1998) Bacillus. In: A. Balows and B. I. Duerden (Eds), Systematic Bacteriology, Arnold Press, London. 709-720. 29. Todar, K. Ph. D (2008) Bacillus and related endospore-forming bacteria. Todar’s online textbook of bacteriology. 30. Wolfgang Gerhartz (1990). Enzym in industry. V.H.C Weiheim, New York. TÀI LIỆU TRÊN INTERNET 31. 32. 33. llus.htm. 34. SK=ORGANISMSORT&kingdom=Bacteria&KLquickSearch=Bacillus. 35. 36. PHỤ LỤC 1. Xác định nồng độ NaCl ức chế sinh trưởng của vi khuẩn Bảng 1: Sự sinh trưởng của vi khuẩn ở các nồng độ muối khác nhau Số lần đo Nồng độ NaCl % 1 2 3 Trung bình Sai số 1 0.686 0.673 0.681 0.680 0.004 2 0.699 0.689 0.705 0.698 0.005 3 0.684 0.685 0.684 0.684 0.0003 4 0.643 0.647 0.649 0.646 0.002 5 0.556 0.558 0.556 0.557 0.001 6 0.315 0.32 0.312 0.316 0.002 7 0.112 0.113 0.114 0.113 0.001 8 0.088 0.087 0.083 0.086 0.002 9 0.06 0.059 0.061 0.060 0.001 OD(620nm) KT6 10 0.004 0.004 0.005 0.004 0.0003 1 0.713 0.715 0.716 0.715 0.001 2 0.723 0.724 0.72 0.722 0.001 3 0.706 0.703 0.705 0.705 0.001 4 0.693 0.697 0.69 0.693 0.002 5 0.523 0.521 0.524 0.523 0.001 6 0.234 0.237 0.301 0.257 0.022 7 0.105 0.113 0.106 0.108 0.003 8 0.069 0.072 0.065 0.069 0.002 9 0.004 0.005 0.007 0.005 0.001 OD(620nm) KT8 10 0.004 0.004 0.006 0.005 0.001 1 0.723 0.725 0.726 0.725 0.001 2 0.754 0.756 0.753 0.754 0.001 3 0.745 0.732 0.735 0.737 0.004 4 0.699 0.689 0.691 0.693 0.003 5 0.613 0.609 0.616 0.613 0.002 6 0.537 0.538 0.539 0.538 0.001 7 0.206 0.205 0.21 0.207 0.002 8 0.07 0.07 0.075 0.072 0.002 9 0.06 0.063 0.065 0.063 0.001 OD(620nm) KT10 10 0.03 0.04 0.035 0.035 0.003 2. Tuyển chọn chủng vi khuẩn Bảng 2: Tốc độ sinh trưởng và hoạt độ protease của 3 chủng Số lần đo Chủng 1 2 3 Trung bình Sai số OD sinh trưởng 0.497 0.506 0.535 0.513 0.011 ∆OD 0.652 0.648 0.657 0.652 0.003 Lượng tyrosine (μm) 0.481 0.478 0.485 0.481 0.002 KT 6 HĐP (UI/ml) 1.764 1.753 1.777 1.764 0.007 OD sinh trưởng 0.432 0.512 0.435 0.460 0.026 ∆OD 0.565 0.550 0.544 0.553 0.006 Lượng tyrosine (μm) 0.417 0.406 0.401 0.408 0.005 KT 8 HĐP (UI/ml) 1.528 1.488 1.471 1.496 0.017 OD sinh trưởng 0.518 0.584 0.567 0.556 0.020 ∆OD 0.693 0.714 0.708 0.705 0.006 Lượng tyrosine (μm) 0.511 0.527 0.522 0.520 0.005 KT 10 HĐP (UI/ml) 1.874 1.931 1.915 1.907 0.017 3. Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy lên khả năng sinh trưởng và tổng hợp protease của vi khuẩn. Bảng 3.1: Sinh trưởng và hoạt độ enzim protease của KT 10 không có cơ chất Số lần đo Cơ chất Nồng độ % 1 2 3 Trung bình Sai số OD sinh trưởng 0.428 0.439 0.444 0.437 0.005 ∆OD 0.361 0.337 0.349 0.349 0.007 Lượng tyrosine (μm) 0.266 0.249 0.257 0.257 0.005 1 HĐP (UI/ml) 0.976 0.912 0.944 0.944 0.019 OD sinh trưởng 0.638 0.629 0.626 0.631 0.004 ∆OD 0.519 0.420 0.470 0.470 0.029 Lượng tyrosine (μm) 0.383 0.310 0.346 0.346 0.021 2 HĐP (UI/ml) 1.404 1.137 1.270 1.270 0.077 OD sinh trưởng 0.498 0.502 0.491 0.497 0.003 ∆OD 0.362 0.435 0.399 0.399 0.021 Lượng tyrosine (μm) 0.267 0.321 0.294 0.294 0.016 3 HĐP (UI/ml) 0.979 1.177 1.078 1.078 0.057 OD sinh trưởng 0.425 0.435 0.436 0.432 0.004 ∆OD 0.364 0.424 0.394 0.394 0.017 Lượng tyrosine (μm) 0.269 0.313 0.291 0.291 0.013 4 HĐP (UI/ml) 0.985 1.148 1.066 1.066 0.047 OD sinh trưởng 0.388 0.402 0.371 0.387 0.009 ∆OD 0.319 0.255 0.287 0.287 0.018 Lượng tyrosine (μm) 0.235 0.188 0.212 0.212 0.014 G lu co se 5 HĐP (UI/ml) 0.863 0.690 0.777 0.777 0.050 Bảng 3.2: Sinh trưởng và hoạt độ enzim protease của KT 10 có cơ chất casein Số lần đo Cơ chất Nồng độ % 1 2 3 Trung bình Sai số OD sinh trưởng 0.498 0.505 0.506 0.503 0.003 ∆OD 0.722 0.682 0.708 0.704 0.012 Lượng tyrosine (μm) 0.533 0.503 0.522 0.519 0.009 1 HĐP (UI/ml) 1.953 1.845 1.915 1.904 0.032 OD sinh trưởng 0.534 0.542 0.535 0.537 0.003 ∆OD 0.744 0.685 0.713 0.714 0.017 Lượng tyrosine (μm) 0.549 0.505 0.526 0.527 0.013 2 HĐP (UI/ml) 2.012 1.853 1.929 1.931 0.046 OD sinh trưởng 0.602 0.595 0.612 0.603 0.005 ∆OD 0.755 0.707 0.731 0.731 0.014 Lượng tyrosine (μm) 0.557 0.522 0.539 0.539 0.010 3 HĐP (UI/ml) 2.042 1.912 1.977 1.977 0.037 OD sinh trưởng 0.601 0.595 0.601 0.599 0.002 ∆OD 0.695 0.658 0.656 0.670 0.013 Lượng tyrosine (μm) 0.513 0.485 0.484 0.494 0.009 4 HĐP (UI/ml) 1.880 1.780 1.773 1.811 0.035 OD sinh trưởng 0.432 0.441 0.438 0.437 0.003 ∆OD 0.620 0.611 0.632 0.621 0.006 Lượng tyrosine (μm) 0.457 0.451 0.466 0.458 0.004 C as ei n 5 HĐP (UI/ml) 1.677 1.653 1.709 1.680 0.016 Bảng 3.3: Sinh trưởng và hoạt độ enzim protease của KT 10 có cơ chất bột đậu nành Số lần đo Cơ chất Nồng độ % 1 2 3 Trung bình Sai số OD sinh trưởng 1.221 1.215 1.26 1.232 0.014 ∆OD 0.692 0.713 0.704 0.703 0.006 Lượng tyrosine (μm) 0.510 0.526 0.519 0.519 0.004 1 HĐP (UI/ml) 1.872 1.929 1.904 1.902 0.016 OD sinh trưởng 1.548 1.575 1.557 1.560 0.008 ∆OD 0.704 0.734 0.719 0.719 0.009 Lượng tyrosine (μm) 0.519 0.541 0.530 0.530 0.006 2 HĐP (UI/ml) 1.904 1.985 1.945 1.945 0.023 OD sinh trưởng 1.902 1.893 1.899 1.898 0.003 ∆OD 0.743 0.739 0.756 0.746 0.005 Lượng tyrosine (μm) 0.548 0.545 0.558 0.550 0.004 3 HĐP (UI/ml) 2.010 1.999 2.045 2.018 0.014 OD sinh trưởng 1.965 1.959 1.98 1.968 0.006 ∆OD 0.780 0.768 0.774 0.774 0.003 Lượng tyrosine (μm) 0.575 0.567 0.571 0.571 0.003 4 HĐP (UI/ml) 2.110 2.077 2.094 2.094 0.009 OD sinh trưởng 1.609 1.612 1.606 1.609 0.002 ∆OD 0.657 0.673 0.656 0.662 0.006 Lượng tyrosine (μm) 0.485 0.496 0.484 0.488 0.004 B ột đậ u nà nh 5 HĐP (UI/ml) 1.777 1.820 1.774 1.791 0.015 Bảng 3.4: Sinh trưởng và hoạt độ enzim protease của KT 10 có cơ chất bột cá Số lần đo Cơ chất Nồng độ % 1 2 3 Trung bình Sai số OD sinh trưởng 0.967 0.959 0.963 0.963 0.002 ∆OD 0.514 0.521 0.518 0.518 0.002 Lượng tyrosine (μm) 0.379 0.384 0.382 0.382 0.001 1 HĐP (UI/ml) 1.390 1.409 1.400 1.400 0.005 OD sinh trưởng 1.485 1.489 1.484 1.486 0.002 ∆OD 0.769 0.573 0.608 0.650 0.060 Lượng tyrosine (μm) 0.567 0.423 0.449 0.480 0.045 2 HĐP (UI/ml) 2.080 1.550 1.645 1.758 0.163 OD sinh trưởng 1.667 1.661 1.664 1.664 0.002 ∆OD 0.690 0.649 0.670 0.670 0.012 Lượng tyrosine (μm) 0.509 0.479 0.494 0.494 0.009 3 HĐP (UI/ml) 1.866 1.755 1.811 1.811 0.032 OD sinh trưởng 1.521 1.517 1.528 1.522 0.003 ∆OD 0.675 0.594 0.635 0.635 0.023 Lượng tyrosine (μm) 0.498 0.438 0.468 0.468 0.017 4 HĐP (UI/ml) 1.826 1.607 1.716 1.716 0.063 OD sinh trưởng 1.214 1.219 1.212 1.215 0.002 ∆OD 0.542 0.512 0.512 0.522 0.010 Lượng tyrosine (μm) 0.400 0.378 0.378 0.385 0.007 B ột cá 5 HĐP (UI/ml) 1.466 1.385 1.385 1.412 0.027 Bảng 3.5: Ảnh hưởng của nồng độ CaCO3 lên sinh trưởng và hoạt độ enzim protease của KT10 Số lần đo Cơ chất Nồng độ % 1 2 3 Trung bình Sai số OD sinh trưởng 1.908 1.904 1.906 1.906 0.001 ∆OD 0.739 0.748 0.744 0.744 0.003 Lượng tyrosine (μm) 0.545 0.552 0.548 0.548 0.002 0 HĐP (UI/ml) 1.999 2.023 2.011 2.011 0.007 OD sinh trưởng 1.923 1.927 1.931 1.927 0.002 ∆OD 0.780 0.773 0.783 0.779 0.003 Lượng tyrosine (μm) 0.575 0.570 0.577 0.574 0.002 0.3 HĐP (UI/ml) 2.110 2.091 2.117 2.106 0.008 OD sinh trưởng 1.936 1.931 1.938 1.935 0.002 ∆OD 0.786 0.799 0.793 0.793 0.004 Lượng tyrosine (μm) 0.580 0.589 0.585 0.585 0.003 0.5 HĐP (UI/ml) 2.126 2.161 2.144 2.144 0.010 OD sinh trưởng 1.908 1.915 1.919 1.914 0.003 ∆OD 0.766 0.777 0.742 0.762 0.010 Lượng tyrosine (μm) 0.565 0.573 0.547 0.562 0.008 1 HĐP (UI/ml) 2.072 2.102 2.006 2.060 0.028 OD sinh trưởng 1.895 1.903 1.908 1.902 0.004 ∆OD 0.729 0.721 0.721 0.724 0.003 Lượng tyrosine (μm) 0.538 0.532 0.532 0.534 0.002 C aC O 3 1.5 HĐP (UI/ml) 1.972 1.950 1.949 1.957 0.007 4. Nghiên cứu các điều kiện môi trường ảnh hưởng đến sinh tổng hợp enzym prorease của vi khuẩn. Bảng 4.1: Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên sinh trưởng và sinh tổng hợp enzim protease của vi khuẩn KT 10 Số lần đo Thời gian 1 2 3 Trung bình Sai số OD sinh trưởng 0.582 0.585 0.585 0.584 0.001 ∆OD 0.306 0.307 0.314 0.309 0.003 Lượng tyrosine (μm) 0.226 0.226 0.232 0.228 0.002 20h HĐP (UI/ml) 0.828 0.830 0.849 0.836 0.007 OD sinh trưởng 1.368 1.37 1.363 1.367 0.002 ∆OD 0.656 0.661 0.651 0.656 0.003 Lượng tyrosine (μm) 0.484 0.488 0.480 0.484 0.002 30h HĐP (UI/ml) 1.774 1.788 1.761 1.774 0.008 OD sinh trưởng 1.983 1.989 1.992 1.988 0.003 ∆OD 0.744 0.751 0.752 0.749 0.003 Lượng tyrosine (μm) 0.549 0.554 0.555 0.553 0.002 36h HĐP (UI/ml) 2.012 2.031 2.034 2.026 0.007 OD sinh trưởng 1.967 1.972 1.965 1.968 0.002 ∆OD 0.788 0.795 0.775 0.786 0.006 Lượng tyrosine (μm) 0.581 0.586 0.572 0.580 0.004 40h HĐP (UI/ml) 2.131 2.150 2.096 2.126 0.016 OD sinh trưởng 1.957 1.949 1.959 1.955 0.003 ∆OD 0.703 0.691 0.706 0.700 0.005 Lượng tyrosine (μm) 0.519 0.510 0.521 0.516 0.003 44h HĐP (UI/ml) 1.902 1.869 1.910 1.893 0.012 OD sinh trưởng 1.505 1.501 1.509 1.505 0.002 ∆OD 0.636 0.634 0.629 0.633 0.002 Lượng tyrosine (μm) 0.469 0.468 0.464 0.467 0.002 48h HĐP (UI/ml) 1.720 1.715 1.701 1.712 0.006 52h OD sinh trưởng 1.243 1.238 1.242 1.241 0.002 ∆OD 0.504 0.504 0.510 0.506 0.002 Lượng tyrosine (μm) 0.372 0.372 0.376 0.373 0.001 HĐP (UI/ml) 1.363 1.363 1.379 1.369 0.005 Bảng 4.2: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp protease của vi khuẩn KT 10 Số lần đo Nhiệt độ 0C 1 2 3 Trung bình Sai số OD sinh trưởng 1.178 1.185 1.177 1.180 0.003 ∆OD 0.616 0.612 0.595 0.608 0.007 Lượng tyrosine (μm) 0.454 0.451 0.439 0.448 0.005 27 HĐP (UI/ml) 1.666 1.655 1.608 1.643 0.018 OD sinh trưởng 1.891 1.895 1.896 1.894 0.002 ∆OD 0.755 0.752 0.755 0.754 0.001 Lượng tyrosine (μm) 0.557 0.555 0.557 0.556 0.001 32 HĐP (UI/ml) 2.042 2.034 2.042 2.039 0.003 OD sinh trưởng 1.987 1.979 1.989 1.985 0.003 ∆OD 0.811 0.822 0.814 0.816 0.003 Lượng tyrosine (μm) 0.598 0.606 0.600 0.602 0.002 37 HĐP (UI/ml) 2.194 2.223 2.202 2.206 0.009 OD sinh trưởng 1.828 1.822 1.828 1.826 0.002 ∆OD 0.809 0.783 0.829 0.807 0.013 Lượng tyrosine (μm) 0.597 0.578 0.612 0.595 0.010 42 HĐP (UI/ml) 2.188 2.118 2.242 2.183 0.036 OD sinh trưởng 1.505 1.507 1.512 1.508 0.002 ∆OD 0.674 0.657 0.663 0.665 0.005 Lượng tyrosine (μm) 0.497 0.485 0.489 0.490 0.004 47 HĐP (UI/ml) 1.823 1.777 1.792 1.797 0.014 Bảng 4.3: Ảnh hưởng của pH đến sinh trưởng và sinh tổng hợp enzim protease của KT10 Số lần đo pH 1 2 3 Trung bình Sai số OD sinh trưởng 1.783 1.775 1.782 1.780 0.003 ∆OD 0.717 0.706 0.719 0.714 0.004 Lượng tyrosine (μm) 0.529 0.521 0.530 0.527 0.003 6.5 HĐP (UI/ml) 1.939 1.910 1.945 1.931 0.011 OD sinh trưởng 2.032 2.036 2.037 2.035 0.002 ∆OD 0.830 0.810 0.828 0.823 0.006 Lượng tyrosine (μm) 0.612 0.598 0.610 0.607 0.005 7 HĐP (UI/ml) 2.245 2.191 2.238 2.225 0.017 OD sinh trưởng 2.018 2.023 2.025 2.022 0.002 ∆OD 0.774 0.769 0.785 0.776 0.005 Lượng tyrosine (μm) 0.571 0.567 0.579 0.572 0.003 7.5 HĐP (UI/ml) 2.094 2.080 2.123 2.099 0.013 OD sinh trưởng 1.922 1.927 1.929 1.926 0.002 ∆OD 0.740 0.743 0.751 0.745 0.003 Lượng tyrosine (μm) 0.546 0.548 0.554 0.549 0.002 8 HĐP (UI/ml) 2.002 2.010 2.030 2.014 0.008 OD sinh trưởng 1.905 1.91 1.909 1.908 0.002 ∆OD 0.718 0.709 0.717 0.715 0.003 Lượng tyrosine (μm) 0.530 0.523 0.529 0.527 0.002 8.5 HĐP (UI/ml) 1.942 1.918 1.938 1.933 0.008 Bảng 4.4: Ảnh hưởng của sự hiếu khí lên sinh trưởng và sinh tổng hợp enzim protease của KT10 Số lần đo Độ thông khí % 1 2 3 Trung bình Sai số OD sinh trưởng 1.869 1.876 1.877 1.874 0.003 ∆OD 0.762 0.750 0.749 0.754 0.004 Lượng tyrosine (μm) 0.562 0.553 0.552 0.556 0.003 10 HĐP (UI/ml) 2.061 2.029 2.025 2.038 0.012 OD sinh trưởng 1.893 1.887 1.890 1.890 0.002 ∆OD 0.855 0.846 0.846 0.849 0.003 Lượng tyrosine (μm) 0.631 0.624 0.624 0.626 0.002 20 HĐP (UI/ml) 2.313 2.288 2.288 2.296 0.008 OD sinh trưởng 1.763 1.767 1.762 1.764 0.002 ∆OD 0.727 0.734 0.737 0.733 0.003 Lượng tyrosine (μm) 0.536 0.541 0.543 0.540 0.002 30 HĐP (UI/ml) 1.966 1.985 1.992 1.981 0.008 OD sinh trưởng 1.593 1.588 1.589 1.590 0.002 ∆OD 0.687 0.673 0.655 0.672 0.009 Lượng tyrosine (μm) 0.507 0.496 0.483 0.495 0.007 40 HĐP (UI/ml) 1.858 1.820 1.770 1.816 0.025 OD sinh trưởng 1.541 1.545 1.540 1.542 0.002 ∆OD 0.667 0.666 0.673 0.669 0.002 Lượng tyrosine (μm) 0.492 0.491 0.496 0.493 0.001 50 HĐP (UI/ml) 1.804 1.801 1.819 1.808 0.005 5. Nghiên cứu tách enzym protease từ dịch môi trường. Bảng 5: Hoạt độ protease với các tác nhân tủa khác nhau Số lần đo Tác nhân tủa 1 2 3 Trung bình Sai số ∆OD 0.617 0.609 0.612 0.613 0.002 Lượng tyrosine (μm) 0.455 0.449 0.451 0.452 0.002 Ethanol 960 HĐP (UI/ml) 2503.4 2470.9 2481.1 2485.1 9.587 ∆OD 0.470 0.487 0.467 0.475 0.006 Lượng tyrosine (μm) 0.347 0.359 0.344 0.350 0.005 Acetone HĐP (UI/ml) 1907.0 1975.9 1892.8 1925.2 25.688 ∆OD 0.360 0.367 0.361 0.363 0.002 Lượng tyrosine (μm) 0.266 0.271 0.266 0.267 0.002 (NH4)2SO4 HĐP (UI/ml) 1460.6 1489.0 1462.7 1470.8 9.148 6. Xác định các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt độ enzim Bảng 6.1: Hoạt độ enzim protease theo pH của dung dịch đệm Số lần đo pH Chỉ tiêu 1 2 3 Trung bình Sai số ∆OD 0.254 0.255 0.258 0.256 0.001 Lượng tyrosine (μm) 0.187 0.188 0.190 0.188 0.001 6 HĐP (UI/ml) 1030.6 1034.6 1044.8 1036.7 4.223 ∆OD 0.415 0.415 0.418 0.416 0.001 Lượng tyrosine (μm) 0.306 0.306 0.308 0.307 0.001 6.5 HĐP (UI/ml) 1683.8 1683.8 1696.0 1687.9 4.057 ∆OD 0.487 0.482 0.486 0.485 0.002 Lượng tyrosine (μm) 0.359 0.356 0.359 0.358 0.001 7 HĐP (UI/ml) 1975.9 1955.6 1971.9 1967.8 6.198 ∆OD 0.559 0.552 0.559 0.557 0.002 Lượng tyrosine (μm) 0.412 0.407 0.412 0.411 0.002 7.5 HĐP (UI/ml) 2268.1 2239.7 2266.0 2257.9 9.148 ∆OD 0.560 0.561 0.559 0.560 0.001 Lượng tyrosine (μm) 0.413 0.414 0.412 0.413 0.0004 8 HĐP (UI/ml) 2272.1 2276.2 2268.1 2272.1 2.343 ∆OD 0.581 0.584 0.583 0.583 0.001 Lượng tyrosine (μm) 0.429 0.431 0.430 0.430 0.001 8.5 HĐP (UI/ml) 2357.3 2369.5 2363.4 2363.4 3.514 ∆OD 0.550 0.553 0.555 0.553 0.001 Lượng tyrosine (μm) 0.406 0.408 0.409 0.408 0.001 9 HĐP (UI/ml) 2231.5 2243.7 2249.8 2241.7 5.367 Bảng 6.2: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt độ enzim protease của chế phẩm Số lần đo Nhiệt độ (0C) Chỉ tiêu 1 2 3 Trung bình Sai số ∆OD 0.557 0.554 0.556 0.556 0.001 Lượng tyrosine (μm) 0.411 0.409 0.410 0.410 0.001 35 HĐP (UI/ml) 2259.9 2247.8 2253.9 2253.9 3.514 ∆OD 0.569 0.566 0.563 0.566 0.002 Lượng tyrosine (μm) 0.420 0.418 0.415 0.418 0.001 40 HĐP (UI/ml) 2308.6 2296.5 2284.3 2296.5 7.028 ∆OD 0.571 0.573 0.566 0.570 0.002 Lượng tyrosine (μm) 0.421 0.423 0.418 0.420 0.002 45 HĐP (UI/ml) 2316.7 2324.9 2296.5 2312.7 8.446 ∆OD 0.598 0.590 0.594 0.594 0.002 Lượng tyrosine (μm) 0.441 0.435 0.438 0.438 0.002 50 HĐP (UI/ml) 2426.3 2393.8 2410.1 2410.1 9.370 ∆OD 0.519 0.520 0.521 0.520 0.001 Lượng tyrosine (μm) 0.383 0.384 0.384 0.384 0.000 55 HĐP (UI/ml) 2105.8 2109.8 2113.9 2109.8 2.343 ∆OD 0.444 0.441 0.443 0.443 0.001 Lượng tyrosine (μm) 0.328 0.325 0.326 0.326 0.001 60 HĐP (UI/ml) 1801.5 1789.3 1795.4 1795.4 3.514 ∆OD 0.250 0.253 0.255 0.253 0.001 Lượng tyrosine (μm) 0.184 0.187 0.188 0.186 0.001 65 HĐP (UI/ml) 1014.3 1026.5 1032.6 1024.5 5.367 70 ∆OD 0.142 0.134 0.137 0.138 0.002 Lượng tyrosine (μm) 0.105 0.099 0.101 0.101 0.002 HĐP (UI/ml) 576.1 543.7 553.8 557.9 9.587 Bảng 6.3: Hoạt độ enzim theo thời gian phản ứng Số lần đo Thời gian Chỉ tiêu 1 2 3 Trung bình Sai số ∆OD 0.190 0.191 0.191 0.191 0.0003 Lượng tyrosine (μm) 0.140 0.141 0.141 0.141 0.0002 10 HĐP (UI/ml) 2312.7 2324.9 2318.8 2318.8 3.514 ∆OD 0.388 0.392 0.390 0.390 0.001 Lượng tyrosine (μm) 0.286 0.289 0.288 0.288 0.001 20 HĐP (UI/ml) 2361.4 2385.7 2373.5 2373.5 7.028 ∆OD 0.592 0.594 0.595 0.594 0.001 Lượng tyrosine (μm) 0.437 0.438 0.439 0.438 0.001 30 HĐP (UI/ml) 2402.0 2410.1 2412.1 2408.0 3.099 ∆OD 0.810 0.812 0.811 0.811 0.001 Lượng tyrosine (μm) 0.598 0.599 0.598 0.598 0.0004 40 HĐP (UI/ml) 2464.8 2470.9 2467.9 2467.9 1.757 ∆OD 1.067 1.064 1.066 1.066 0.001 Lượng tyrosine (μm) 0.787 0.785 0.786 0.786 0.001 50 HĐP (UI/ml) 2597.5 2590.2 2593.9 2593.9 2.108 ∆OD 1.288 1.281 1.285 1.285 0.002 Lượng tyrosine (μm) 0.950 0.945 0.948 0.948 0.001 60 HĐP (UI/ml) 2612.9 2598.7 2605.8 2605.8 4.099 ∆OD 1.288 1.297 1.293 1.293 0.003 Lượng tyrosine (μm) 0.950 0.957 0.953 0.953 0.002 70 HĐP (UI/ml) 2239.7 2255.3 2247.5 2247.5 4.518 ∆OD 1.153 1.149 1.145 1.149 0.002 Lượng tyrosine (μm) 0.851 0.848 0.845 0.848 0.002 80 HĐP (UI/ml) 1754.3 1748.2 1742.1 1748.2 3.514 ∆OD 1.081 1.087 1.086 1.085 0.002 Lượng tyrosine (μm) 0.797 0.802 0.801 0.800 0.001 90 HĐP (UI/ml) 1462.0 1470.1 1468.1 1466.7 2.438 ∆OD 0.952 0.965 0.953 0.957 0.004 Lượng tyrosine (μm) 0.702 0.712 0.703 0.706 0.003 100 HĐP (UI/ml) 1158.8 1174.6 1159.4 1164.3 5.176 7. Nghiên cứu động học sự sinh trưởng và hoạt độ protease của KT 10 Bảng 7: Sinh trưởng và hoạt độ của vi khuẩn KT 10 theo thời gian Số lần đo Thời gian 1 2 3 Trung bình Sai số OD sinh trưởng 0.584 0.589 0.588 0.587 0.002 ∆OD 0.307 0.306 0.315 0.309 0.003 Lượng tyrosine (μm) 0.226 0.226 0.232 0.228 0.002 20h HĐP (UI/ml) 0.830 0.828 0.852 0.837 0.008 OD sinh trưởng 1.371 1.375 1.376 1.374 0.001 ∆OD 0.660 0.663 0.663 0.662 0.001 Lượng tyrosine (μm) 0.487 0.489 0.489 0.488 0.0007 30h HĐP (UI/ml) 1.785 1.793 1.793 1.791 0.003 OD sinh trưởng 2.002 1.995 1.997 1.998 0.002 ∆OD 0.784 0.780 0.782 0.782 0.001 Lượng tyrosine (μm) 0.578 0.575 0.577 0.577 0.001 36h HĐP (UI/ml) 2.121 2.110 2.115 2.115 0.003 OD sinh trưởng 1.974 1.975 1.985 1.978 0.003 ∆OD 0.854 0.861 0.856 0.857 0.002 Lượng tyrosine (μm) 0.630 0.635 0.631 0.632 0.002 40h HĐP (UI/ml) 2.310 2.329 2.315 2.318 0.006 OD sinh trưởng 1.968 1.965 1.962 1.965 0.002 ∆OD 0.813 0.811 0.816 0.813 0.001 Lượng tyrosine (μm) 0.600 0.598 0.602 0.600 0.001 44h HĐP (UI/ml) 2.199 2.194 2.207 2.200 0.004 OD sinh trưởng 1.512 1.515 1.511 1.513 0.001 ∆OD 0.669 0.672 0.669 0.670 0.001 Lượng tyrosine (μm) 0.494 0.496 0.494 0.494 0.001 48h HĐP (UI/ml) 1.810 1.818 1.810 1.812 0.003 OD sinh trưởng 1.246 1.245 1.251 1.247 0.002 ∆OD 0.574 0.574 0.570 0.573 0.001 Lượng tyrosine (μm) 0.423 0.423 0.420 0.422 0.001 52h HĐP (UI/ml) 1.553 1.553 1.542 1.549 0.004