Luận văn Nghiên cứu quan hệ di truyền của một số giống đậu xanh [Vigna radiata (L.) wilczek]

d (%) Hàm lƣợng protein (%) T1 22,75 ± 0,18 24,96 ± 0,42 T16 2,65 ± 0,07 25,67 ± 0,41 T2 3,30 ± 0,24 23,75 ± 0,27 T17 2,21 ± 0,32 27,34 ± 0,27 T3 3,60 ± 0,50 22,77 ± 0,33 T18 3,46 ± 0,27 23,37 ± 0,34 T4 2,72 ± 0,26 25,26 ± 0,41 T19 2,39 ± 0,23 26,78 ± 0,55 T5 2,24 ± 0,06 26,99 ± 0,25 T20 3,76 ± 0,30 22,68 ± 0,15 T6 2,15 ± 0,03 27,59 ± 0,50 T21 3,93 ± 0,10 22,37 ± 0,32 T7 3,45 ± 0,02 23,45 ± 0,12 T22 3,12 ± 0,45 24,56 ± 0,40 T8 2,18 ± 0,07 24,62 ± 0,22 T23 4,30 ± 0,29 20,04 ± 0,52 T9 3,94 ± 0,52 21,39 ± 0,40 T24 3,35 ± 0,30 23,58 ± 0,21 T10 3,50 ± 0,40 22,89 ± 0,20 T25 3,89 ± 0,34 21,35 ± 0,32 T11 2,79 ± 0,24 24,83 ± 0,52 T26 2,68 ± 0,37 25,47 ± 0,18 T12 3,28 ± 0,05 23,82 ± 0,57 T27 3,32 ± 0,39 23,64 ± 0,16 T13 3,89 ± 0,31 22,54 ± 0,18 T28 1,70 ± 0,30 29,12 ± 0,87 T14 2,12 ± 0,08 28,37 ± 0,49 T29 2,85 ± 0,21 24,65 ± 0,14 T15 4,62 ± 0,27 19,27 ± 0,43 T30 3,48 ± 0,37 22,96 ± 0,19 Bảng 3.2 cho thấy hàm lượng protein và lipid của các giống khác nhau là khác nhau. Kết quả phân tích hàm lượng protein trong hạt đậu xanh của 30 giống nghiên cứu dao động từ 19,27% đến 29,12%. Trong đó, giống có hàm lượng protein cao nhất là T28 (29,12%), giống có hàm lượng protein thấp nhất là 36 T15 (19,27%). Hàm lượng protein trong hạt đậu xanh của 30 giống nghiên cứu có thể xếp theo thứ tự giảm dần như sau: T28 >T14 > T6 > T17 > T5 > T19 > T16 > T26 > T4 > T1 > T11 > T29 > T8 > T22 > T12 > T2 > T27 > T24 > T7 > T18 > T30 > T10 > T3 > T20 > T13 > T21 > T9 > T25 > T23 > T15. Theo Trần Đình Long (1991), hàm lượng protein trung bình trong hạt đậu xanh không tách vỏ đạt 23% - 28% [17]. Theo Chu Hoàng Mậu (2001), hàm lượng protein của các dòng đậu xanh đột biến và giống gốc tương đối cao (15,12% - 20,58%) [20]. Như vậy, các giống đậu xanh mà chúng tôi nghiên cứu đều có hàm lượng protein mức trung bình giống như thống kê của Trần Đình Long nhưng lại cao hơn so với những dòng đậu xanh đột biến của tác giả Chu Hoàng Mậu nghiên cứu. Phân tích hàm lượng lipid của 30 giống đậu xanh nghiên cứu cho thấy hàm lượng lipid của 30 giống đậu xanh dao động trong khoảng 1,70% đến 4,62%. Trong đó, giống có hàm lượng lipid cao nhất là T15 (4,62%), giống có hàm lượng lipid thấp nhất là T28 (1,70%). Hàm lượng lipid trong hạt đậu xanh của các giống nghiên cứu có thể xếp theo thứ tự giảm dần như sau: T15 > T23 > T25 > T9 > T21 > T13 > T20 > T3 > T10 > T30 > T18 > T7 > T24 > T27 > T2 > T12 > T22 > T8 > T29 > T11 > T1 > T4 > T26 > T16 > T19 > T5 > T17 > T6 > T14 > T28. Theo Trần Đình Long (1991), hàm lượng lipid trung bình trong hạt đậu xanh không tách vỏ đạt 1,3% [17]. Theo Chu Hoàng Mậu (2001), hàm lượng lipid của các dòng đậu xanh đột biến và giống gốc tương đối cao (4,15% - 6,53%) [20]. Như vậy, các giống đậu xanh mà chúng tôi nghiên cứu đều có hàm lượng lipid cao hơn mức trung bình so với thống kê của Trần Đình Long nhưng lại thấp hơn so với những dòng đậu xanh đột biến của tác giả Chu Hoàng Mậu nghiên cứu. 37 y = -0.3019x + 10.446 R2 = 0.977 0 1 2 3 4 5 0 5 10 15 20 25 30 35 % protein % lipid % protein Linear (% protein) Mặt khác qua bảng 3.2 nhận thấy, các giống có hàm lượng protein cao thì có hàm lượng lipid thấp và ngược lại, những giống có hàm lượng protein thấp thì hàm lượng lipid lại cao hơn. Điều này cho thấy giữa hàm lượng lipid và protein dự trữ trong hạt của các giống đậu xanh có thể có mối tương quan nghịch. Kết quả này phù hợp với các nghiên cứu của Chu Hoàng Mậu (2001) và Trần Thị Phương Liên (1999) [15], [20]. Để xác định mối tương quan giữa hàm lượng protein và lipid, chúng tôi đã xử lý số liệu bằng phần mềm Excel theo Chu Văn Mẫn (2003) để xác định hệ số tương quan R [19]. Kết quả thu được R= 0,988, vì hệ số tương quan R > 0,9 nên đây là mối tương quan chặt. Phương trình biểu diễn mối tương quan giữa hàm lượng lipid và protein của các giống đậu xanh nghiên cứu là : Y= -0,3019 + 10,446 Hình 3.1. Mối tương quan giữa hàm lượng protein và lipid của các giống đậu xanh nghiên cứu 38 3.2. PHÂN TÍCH ĐA HÌNH DNA BẰNG KỸ THUẬT RAPD Công nghệ sinh học đang có nhiều đóng góp có giá trị sản xuất nông nghiệp đặc biệt trong lĩnh vực chọn giống cây trồng với việc sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử với mục đích phân tích quan hệ di truyền và đánh giá hệ gen của thực vật thì RAPD là một kỹ thuật khá thuận lợi và có hiệu quả. Trong nghiên cứu này, chúng tôi trình bày kết quả ứng dụng RAPD vào việc phân tích đa hình DNA của 30 giống đậu xanh. 3.2.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số từ lá đậu xanh Lá non đậu xanh 7 ngày tuổi được sử dụng để tách chiết DNA tổng số. Kiểm tra chất lượng tách chiết DNA bằng phương pháp điện di trên gel agarose, kết quả thể hiện ở hình 3.2. Hình 3.2. Ảnh điện di DNA tổng số của 30 giống đậu xanh nghiên cứu 39 Hình 3.2 cho thấy, điện di đồ của DNA chỉ có một băng duy nhất, không có các vệt DNA bị đứt gãy trong quá trình thao tác. Đồng thời với phương pháp điện di, chúng tôi còn kiểm tra chất lượng DNA bằng phương pháp quang phổ hấp thụ. Kết quả được thể hiện ở hình 3.3. Hình 3.3. Phổ hấp thụ DNA của giống T15 ở bước sóng 260 nm Phổ hấp thụ DNA của các giống đậu xanh chỉ có một đỉnh duy nhất ở 260 nm và tỷ số A206/A280 dao động trong khoảng 1,8 - 2,0. Hình 3.2 và hình 3.3 cho thấy các mẫu DNA tách chiết được đều có chất lượng tốt, đủ tiêu chuẩn để tiến hành phản ứng RAPD và có thể được sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo. Sau khi kiểm tra chất lượng DNA bằng phương pháp quang phổ hấp thụ, chúng tôi đã xác định được hàm lượng DNA tách chiết từ các giống đậu xanh (bảng 3.3). Hình 3.2 và bảng 3.3 cho thấy, các mẫu DNA tổng số được tách từ lá non của các giống đậu xanh có hàm lượng cao dao động từ 82,5 - 3010 μg/ml. G iá t rị m ậ t đ ộ q u a n g Bước sóng (nm) 40 Bảng 3.3. Hàm lượng DNA của 30 giống đậu xanh nghiên cứu Tên giống A260 nm Hàm lƣợng (µg/ml) Tên giống A260 nm Hàm lƣợng (µg/ml) T1 0,097 242,5 T16 0,394 872,5 T2 0,076 190 T17 0,324 810 T3 0,044 110 T18 0,630 1575 T4 0,048 120 T19 0,510 1275 T5 0,033 82,5 T20 0,904 2260 T6 0,056 140 T21 0,633 1583 T7 0,080 300 T22 0,490 1225 T8 0,120 300 T23 0,506 1265 T9 0,101 252,5 T24 1,204 3010 T10 0,034 85 T25 0,750 1875 T11 0,116 290 T26 0,201 525 T12 0,068 170 T27 0,895 2238 T13 0,135 337,5 T28 0,116 290 T14 0,063 157,5 T29 0,262 655 T15 0,088 220 T30 0,229 572,5 3.2.2. Kết quả nghiên cứu quan hệ di truyền DNA bằng kĩ thuật RAPD Sau khi tách chiết DNA tổng số, chúng tôi pha loãng DNA về nồng độ 10ng/μl và tiến hành các phản ứng RAPD với 10 mồi ngẫu nhiên. Đánh giá tính đa hình thông qua giá trị PIC (giá trị PIC càng lớn thì tính đa hình của mồi đó càng cao), khoảng cách di truyền được xác định thông qua hệ số tương đồng và biểu đồ hình cây. 41 Trong đề tài này, chúng tôi sử dụng 10 mồi ngẫu nhiên (OPP08, OPV06, OPD13, OPB10, RA142, RA159, RA50, RA32, OPA15, RA40) để phân tích mối quan hệ di truyền của 30 giống đậu xanh. Sản phẩm RAPD với các mồi khác nhau được điện di trên gel agarose 1,8% để phân tích tính đa hình DNA của 30 giống đậu xanh nghiên cứu. Phân tích RAPD với 10 mồi kết quả thu được, số lượng các phân đoạn DNA được nhân bản với mỗi cặp mồi dao động từ 77 đến 201 phân đoạn. Kích thước các phân đoạn DNA được nhân bản trong khoảng từ 0,2 kb đến 2,75 kb. Tổng số phân đoạn DNA nhân bản được của 10 đoạn mồi RAPD khi phân tích 30 giống đậu xanh là 1208 phân đoạn. Kết quả thể hiện trên bảng 3.4. Từ bảng 3.4 cho thấy, trong số 10 mồi phân tích, số phân đoạn DNA được nhân bản của 30 giống đậu xanh ở mồi OPA15 là nhiều nhất (201 phân đoạn DNA) và số phân đoạn được nhân bản ít nhất là ở mồi OPD13 (77 phân đoạn DNA). Đối với từng giống thì số phân đoạn được nhân bản có sự khác nhau. Tổng số phân đoạn DNA được nhân bản của 30 giống đậu xanh dao động từ 31 phân đoạn đến 48 phân đoạn. Từ phân tích bảng 3.4 cho thấy, giống có tổng số phân đoạn DNA được nhân bản với 10 mồi nhiều nhất là giống T1 (48 phân đoạn), và giống có tổng số phân đoạn DNA được nhân bản với 10 mồi ít nhất là giống T11 (31 phân đoạn). 42 Bảng 3.4. Tổng số phân đoạn DNA của sản phẩm RAPD với 10 mồi ngẫu nhiên Mồi Giống OPP08 OPV06 OPD13 OPB10 RA142 RA159 RA50 RA32 OPA15 RA40 Tổng T1 7 3 5 6 6 3 4 4 7 3 48 T2 4 4 6 5 6 2 4 4 7 3 45 T3 4 4 5 6 6 3 4 4 7 3 46 T4 4 5 2 1 4 2 2 3 7 3 33 T5 4 4 2 7 2 1 2 3 7 3 35 T6 4 4 1 4 5 2 7 4 7 3 41 T7 6 4 1 3 8 2 4 4 7 3 42 T8 4 5 3 5 7 2 3 4 7 3 43 T9 7 3 2 2 5 2 6 8 7 3 45 T10 4 4 2 4 8 1 5 5 7 3 43 T11 4 2 2 5 2 2 2 2 7 3 31 T12 5 5 2 5 8 2 2 4 7 3 43 T13 4 5 2 6 4 4 2 2 7 4 40 T14 4 4 2 5 4 4 2 2 6 3 36 T15 5 7 2 6 6 1 3 4 7 4 45 T16 5 5 2 6 7 2 2 3 6 3 41 T17 4 7 2 5 8 2 2 2 6 4 42 T18 4 4 2 5 4 2 5 5 6 4 41 T19 4 3 2 4 5 2 2 5 6 4 37 T20 4 3 4 4 4 3 3 2 6 4 37 T21 4 6 2 4 4 5 3 2 7 3 40 T22 4 4 3 8 6 4 2 3 7 3 44 T23 4 4 3 7 5 7 2 4 7 3 46 T24 4 2 3 6 6 4 3 4 7 3 42 T25 4 3 3 6 5 5 2 4 7 3 42 T26 4 4 3 7 5 1 2 4 7 4 41 T27 4 1 2 3 4 3 3 3 6 3 32 T28 4 6 3 3 6 2 3 3 7 4 41 T29 4 3 2 2 5 2 2 4 6 3 33 T30 4 4 2 2 4 2 2 3 6 4 33 Tổng 131 122 77 142 159 79 90 108 201 99 1208 43 Tính đa hình thể hiện ở sự xuất hiện hay không xuất hiện của các phân đoạn khi so sánh giữa các giống đậu xanh với nhau trong cùng 1 mồi. Điều này được tổng kết và thể hiện qua tỷ lệ phân đoạn đa hình ở mỗi mồi nghiên cứu. Kết quả tổng hợp trên bảng 3.5. Bảng 3.5. Tỷ lệ phân đoạn đa hình khi sử dụng 10 mồi RAPD Mồi Số phân đoạn DNA Số phân đoạn đa hình Số phân đoạn đơn hình Tỷ lệ phân đoạn đa hình (%) OPP08 14 14 0 100 OPV06 16 16 0 100 OPD13 7 7 0 100 OPB10 12 12 0 100 RA142 11 11 0 100 RA159 10 10 0 100 RA50 14 12 2 85,71 RA32 10 10 0 100 OPA15 7 1 6 14,28 RA40 4 1 3 25 Tổng 105 94 11 89,52 Qua phân tích bảng 3.5 nhận thấy, tổng số phân đoạn DNA của 30 giống đậu xanh khi phân tích 10 mồi ngẫu nhiên là 105 phân đoạn, trong đó có 94 phân đoạn cho tính đa hình (chiếm 89,52%) và không đa hình là 11 phân đoạn (chiếm 10,48%). Kích thước các phân đoạn DNA được nhân bản trong khoảng từ 0,2 kb đến 2,75 kb. Số lượng các phân đoạn tương ứng với mỗi mồi nằm trong khoảng 4 đến 16 phân đoạn, trong đó mồi nhân bản được ít phân đoạn DNA nhất là mồi RA40 (4 phân đoạn), và mồi nhân được nhiều phân đoạn DNA nhất là mồi OPV06 (16 phân đoạn). Bảng 3.5 cũng cho thấy, cả 10 mồi đều biểu hiện tính đa hình. Tuy nhiên, mức độ đa hình giữa các mồi là khác nhau. Mức độ đa hình của 10 mồi nghiên cứu dao động từ 14,28% đến 100%. Mồi biểu hiện tính đa hình thấp 44 nhất đó là mồi OPA15 (14,28%), mồi biểu hiện tính đa hình cao nhất là các mồi OPP08, OPV06, OPD13, OPB10, RA142, RA159, RA32 (100%). Giá trị PIC (Polymophism Information Content) được sử dụng khi phân tích thông tin đa hình. Giá trị PIC không chỉ liên quan tới tỷ lệ phân đoạn DNA đa hình mà còn liên quan trực tiếp với số lượng cá thể cùng xuất hiện phân đoạn đa hình lớn hay nhỏ. Giá trị PIC càng lớn thì sự đa hình càng cao và ngược lại.    n i ifPIC 1 21 Trong đó, fi là tần số của alen thứ i Bảng 3.6. Thông tin tính đa hình (PIC) của 30 giống đậu xanh STT Tên mồi PIC STT Tên mồi PIC 1 OPP08 0,7348 6 RA159 0,8546 2 OPV06 0,8528 7 RA50 0,8498 3 OPD13 0,7316 8 RA32 0,7453 4 OPB10 0,7501 9 OPA15 0,0729 5 RA142 0,6630 10 RA40 0,2275 Tính đa hình của các mồi RAPD còn được đánh giá thông qua giá trị PIC, giá trị PIC càng lớn thì sự đa hình càng cao và ngược lại. Từ bảng 3.6 cho thấy, giá trị PIC dao động từ 0,0729 (mồi OPA15) đến 0,8546 (mồi RA159), trong đó, có 8/10 mồi RAPD (OPP08, OPV06, OPD13, OPB10, RA142, RA159, RA50, RA32) cho kết quả đa hình cao, với giá trị PIC > 0,5, (số liệu bảng 3.6 phù hợp với tỷ lệ đa hình của các phân đoạn DNA được nhân bản ở bảng 3.5). Tuy nhiên, sự đa hình của các mồi không tỷ lệ thuận với số lượng các phân đoạn DNA được nhân bản. Chẳng hạn, đối với mồi 45 RA159 chỉ có 10 phân đoạn DNA được nhân bản nhưng lại có giá trị PIC cao nhất (0,8546), trong khi đó mồi OPV06 có tới 16 phân đoạn DNA được nhân bản nhưng giá trị PIC lại thấp hơn (0,8528), và tương tự, mồi RA40 chỉ có 4 phân đoạn DNA được nhân bản lại có giá trị PIC cao (0,2275) hơn mồi OPA15 có 7 phân đoạn DNA được nhân bản nhưng lại có giá trị PIC thấp hơn rất nhiều (0,0729). Số liệu bảng 3.6 cho thấy, hầu hết các mồi đều cho tính đa hình cao (PIC > 0,5). Trong 10 mồi thể hiện tính đa hình về phân đoạn DNA được nhân bản chỉ có 2 mồi OPA15 và mồi RA40 là thể hiện tính đa hình thấp (PIC < 0,5). Điều này cho thấy mức độ đa dạng về phân đoạn DNA của các mẫu đậu xanh mà chúng tôi nghiên cứu đều cao. Như vậy, với 10 mồi ngẫu nhiên đã chỉ ra được sự đa dạng di truyền của 30 giống đậu xanh có nguồn gốc khác nhau. Kết quả điện di kiểm tra phản ứng RAPD trên gel agarose 1,8% của 10 mồi được chúng tôi phân tích chi tiết thông qua các ảnh điện di được trình bày dưới đây: Mồi OPP08 Kết quả diện di sản phẩm RAPD của 30 giống đậu xanh nghiên cứu với mồi OPP08 thu được các phân đoạn DNA được nhân bản ngẫu nhiên dao động trong khoảng 4 đến 7 phân đoạn. Các phân đoạn xuất hiện ở 14 vị trí khác nhau trên ảnh điện di. Kích thước các phân đoạn dao động 0,35 - 2,0 kb. Trong đó, giống T1, T9 có số phân đoạn là 7, giống T7 có số phân đoạn là 6, giống T5, T16 có số phân đoạn là 5, và các giống còn lại có 4 phân đoạn được nhân bản. Tại vị trí 1,4 kb xuất hiện phân đoạn DNA ở 1 giống T9. Tại vị trí 1,3 kb xuất hiện phân đoạn DNA ở 1 giống T16. Tại vị trí 1,1 kb, 0,4 kb chỉ xuất hiện phân đoạn DNA ở 2 giống T6 và T9. Tại vị trí 1,0 kb chỉ có T6 và T9 không xuất hiện phân đoạn DNA còn lại đều xuất hiện số phân đoạn ở 46 Ký hiệu: M: Marker 1kb 1.T1, 2.T2, 3.T3, 4.T4, 5.T5, 6.T6, 7.T7, 8.T8, 9.T9, 10.T10, 11.T11, 12.T12, 13.T13, 14.T14, 15.T15, 16.T16, 17.T17, 18.T18, 19.T19, 20.T20, 21.T21, 22.T22, 23.T23, 24.T24, 25.T25, 26.T26, 27.T27, 28.T28, 29.T29, 30.T30. các giống còn lại. Vị trí 0,9 kb có T6 xuất hiện và ở vị trí 0,8kb chỉ có giống T9 xuất hiện phân đoạn DNA. Tại các vị trí 0,6 kb, 0,7 kb và 0,75 kb chỉ có giống T6 là không có đoạn DNA được nhân bản, các giống còn lại đều xuất hiện số phân đoạn DNA. Ở vị trí 0,35 kb và 0,45 kb chỉ xuất hiện số phân đoạn ở giống T1, còn không xuất hiện số phân đoạn ở các giống còn lại. Vậy trong số 14 phân đoạn DNA xuất hiện cả 14 phân đoạn biểu hiện tính đa hình. Như vậy, với mồi OPP08 tổng số có 131 phân đoạn được nhân bản ở 30 giống đậu xanh và thể hiện sự sai khác trong cấu trúc DNA giữa các giống đậu xanh tại 14 vị trí 2,0 kb, 1,5 kb, 1,4 kb, 1,3 kb, 1,1 kb, 1,0 kb, 0,9 kb, 0,8 kb, 0,75 kb, 0,7 kb, 0,6 kb, 0,45 kb, 0,4 kb và 0,3 kb. Hình 3.4. Ảnh điện di sản phẩm RAPD với mồi OPP08 của 30 giống đậu xanh 0,25 kb M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 0,75 kb 0,5 kb 1,0 kb 16 17 18 19 20 21 22 13 24 25 26 27 28 29 30 M 1,0 kb 0,5 kb 0,25 kb 0,75 kb 47 Hình 3.5. Ảnh điện di sản phẩm RAPD với mồi OPV06 từ mẫu T11 đến mẫu T30 Ký hiệu: M: Marker 1kb 11.T11, 12.T12, 13.T13, 14.T14, 15.T15, 16.T16, 17.T17, 18.T18, 19.T19, 20.T20, 21.T21, 22.T22, 23.T23, 24.T24, 25.T25, 26.T26, 27.T27, 28.T28, 29.T29, 30.T30 Mồi OPV06 Kết quả điện di sản phẩm RAPD với mồi OPV06 được thể hiện ở hình 3.5. Hình 3.5 cho thấy, đã có từ 1 - 7 phân đoạn DNA được nhân bản. Các phân đoạn này có chiều dài ước tính từ 0,3 - 2,5 kb. Giống xuất hiện nhiều phân đoạn DNA nhất là giống T15 và T17 (7 phân đoạn). Giống T27 có số phân đoạn DNA ít nhất (1 phân đoạn). Với mồi OPV06 có 16 phân đoạn biểu hiện tính đa hình tương ứng với kích thước 2,5 kb, 2,0 kb, 1,9 kb 1,7 kb, 1,6 kb, 1,5 kb, 1,4 kb, 1,35 kb 1,2 kb, 1,0 kb, 0,9 kb, 0,75 kb, 0,55 kb, 0,5 kb, 0,45 kb và 0,3 kb. Ở kích thước 2,5 chỉ có 3 giống T15, T17, T21 xuất hiện phân đoạn DNA. Ở vị trí 2,0 kb chỉ có 1giống T5 và ở vị trí 1,5 kb có 1 giống T17 xuất hiện phân đoạn DNA. Ở vị trí 1,9 kb có chỉ 3 giống T7, T8, T9 xuất hiện phân đoạn DNA. Còn ở vị trí 1,7 kb có 9 giống xuất hiện số phân đoạn DNA trong tổng số 30 giống đậu xanh nghiên cứu, đó là các giống T15, T16, T17, T18, T21, T22, T23, T28, T29. Hai giống xuất hiện số phân đoạn DNA ở vị trí 48 1,6 kb là T12, T13. Đặc biệt ở 3 vị trí 1,35 kb, 0,9 kb, và 0,45 kb chỉ có duy nhất giống T30 xuất hiện số phân đoạn DNA được nhân bản, còn 29 giống còn lại đều không thấy xuất hiện. Tại 2 vị trí 1,4 kb và 1,2 kb có tới 25 giống xuất hiện số phân đoạn DNA và chỉ có 5 giống là không xuất hiện. Tại vị trí 1,0 kb có 12 giống xuất hiện số phân đoạn DNA là T2, T3, T4, T5, T6, T9, T15, T16, T17, T18, T21, T28. Tại vị trí 0,75 kb có 7 giống T7, T9, T11, T18, T24, T27, T29 không xuất hiện phân đoạn DNA, còn lại các giống đều xuất hiện. Tại vị trí thấp nhất 0,3 kb có 2 giống T5 và T9 xuất hiện số phân đoạn DNA còn các giống khác không xuất hiện phân đoạn này. Như vậy, với mồi OPV06 tất cả các các phân đoạn DNA đều thể hiện tính đa hình. Mồi OPD13 Kết quả điện di cho thấy, tính đa dạng thể hiện một cách rõ nét giữa các mẫu đậu xanh nghiên cứu. Từ giới hạn kích thước 0,4 - 1,35 kb có 7 băng DNA xuất hiện, tương ứng với tổng số 77 phân đoạn DNA được nhân bản trên tổng 30 mẫu đậu xanh nghiên cứu (hình 3.6). Có cả 7 băng cho tính đa hình phân đoạn DNA nhân bản. Ký hiệu; M: Marker 22. T22 23. T23 27. T27 24. T24 28. T28 25. T25 29. T29 26. T26 30. T30 Hình 3.6. Ảnh điện di sản phẩm RAPD với mồi OPD13 từ mẫu T22 đến mẫu T30 49 Hình 3.7. Ảnh điện di sản phẩm RAPD với mồi OPB10 từ mẫu T1 đến mẫu T15 Ký hiệu: M: Marker 1kb 1.T1, 2.T2, 3.T3, 4.T4, 5.T5, 6.T6, 7.T7, 8.T8, 9.T9, 10.T10, 11.T11, 12.T12, 13.T13, 14.T14, 15.T15 Cụ thể ở kích thước khoảng 1,35 kb chỉ có 2 giống T1 và T2 xuất hiện phân đoạn DNA nhân bản, 28 mẫu còn lại không xuất hiện. Ở kích thước 0,85 kb có 12 mẫu xuất hiện phân đoạn DNA được nhân bản là T1, T2, T3, T8, T11, T20, T22, T23, T24, T25, T26, T28, các mẫu còn lại đều không thấy xuất hiện. Hai mẫu T2, T3 xuất hiện số phân đoạn DNA ở vị trí 0,8 kb, còn lại các giống không xuất hiện. Ở vị trí 0,75 kb có 5 giống xuất hiện số phân đoạn DNA là T1, T2, T3, T8, T20. Chỉ có duy nhất ở T1 xuất hiện số phân đoạn DNA, còn 29 giống còn lại không thu được phân đoạn DNA ở kích thước khoảng 0,6 kb. Ở kích thước khoảng 0,5 kb có tới 28 mẫu thu được phân đoạn DNA nhân bản. Và cuối cùng là kích thước khoảng 0,4 kb có tới 27 mẫu có phân đoạn DNA nhân bản và 3 mẫu T1, T7, T11 là không thấy xuất hiện ở phân đoạn này. Mồi OPB10 Kết quả điện di sản phẩm RAPD từ hệ gen của 30 giống đậu xanh với mồi OPB10 được thể hiện ở hình 3.7. Kết quả điện di sản phẩm RAPD với mồi OPB10 có 12 phân đoạn DNA được nhân bản và cả 12 phân đoạn đều thể hiện tính đa hình. 50 Mồi RA142 Kết quả phân tích điện di sản phẩm RAPD của 30 giống đậu xanh với mồi RA142 được thể hiện ở hình 3.8. Kết quả cho thấy xuất hiện từ 2 - 8 phân đoạn DNA được nhân bản, chúng có chiều dài ước tính từ 0,3 - 2,0 kb. Giống T7, T10, T12, T17 có số phân đoạn DNA được nhân bản nhiều nhất với 8 phân đoạn. Giống T5, T11 có số phân đoạn DNA ít nhất là 2 phân đoạn. Tại vị trí kích thước 2,0 kb có 3 giống T22, T24, T28 xuất hiện phân đoạn DNA, trong khi đó các giống khác không xuất hiện phân đoạn này. Tại vị trí 0,4 kb duy nhất không xuất hiện phân đoạn DNA ở giống T11. Tại vị trí 1,35 kb xuất hiện số phân đoạn DNA ở 28 giống, còn 2 giống không xuất hiên số phân đoạn là T5 và T18. Tại vị trí 1,5 kb có 11 giống không xuất hiện số phân đoạn DNA là T1, T4, T5, T6, T9, T11, T14, T18, T20, T21, T27, các giống còn lại đều xuất hiện số phân đoạn ở vị trí này. Và ngược lại 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 1718 19 20 M 0,5 kb 0,75 kb 1,0 kb 1,5 kb Hình 3.8. Ảnh điện di sản phẩm RAPD với mồi RA142 từ mẫu T1 đến mẫu T20 Ký hiệu; M: Marker 1kb 1. T1, 2. T2, 3.T3, 4. T4, 5. T5, 6. T6, 7. T7, 8. T8, 9. T9, 10. T10, 11. T11, 12. T12, 13. T13, 14. T14, 15. T15, 16. T16, 17. T17, 18. T18 19. T19, 20. T20 51 là ở vị trí 1,1 kb lại có 11 giống xuất hiện số phân đoạn DNA trong tổng số 30 giống đậu xanh nghiên cứu. Các giống T4, T5, T8, T11, T13, T15, T16, T19, T20, T30 không xuất hiện số phân đoạn ở vị trí 1,0 kb các giống còn lại thì đều xuất hiện số phân đoạn DNA. Tiếp theo, tại vị trí 0,85 kb chỉ có 4 giống T15, T16, T18, T19 xuất hiện số phân đoạn DNA còn lại 26 giống không xuất hiện ở phân đoạn này. Ngược lại, ở vị trí 0,75 kb lại chỉ có 4 giống T5, T6, T9, T18 là không xuất hiện số phân đoạn DNA còn lại là 26 giống thì đều thấy xuất hiện số phân đoạn DNA ở tại vị trí này. Tại vị trí 0,7 kb có 4 giống T5, T6, T9, T18 lại xuất hiện số phân đoạn DNA các giống còn lại không xuất hiện. Có 7 giống T6, T7, T8, T9, T10, T12, T18 xuất hiện phân đoạn DNA ở vị trí 0,6 kb và 23 giống còn lại không xuất hiện phân đoạn DNA ở vị trí này. Ở vị trí 0,4 kb chỉ có duy nhất 1 giống T11 không xuất hiện số phân đoạn DNA, 29 giống đều xuất hiện số phân đoạn DNA. Cuối cùng là ở vị trí 0,3 kb có 8 giống xuất hiện số phân đoạn DNA là T1, T7, T8, T10, T12, T15, T16, T17 và 22 giống còn lại không thấy xuất hiện phân đoạn DNA ở vị trí này. Như vậy, với mồi RA142, các phân đoạn thể hiện tính đa hình ở 11 vị trí khác nhau (0,3 kb, 0,4 kb, 0,6 kb, 0,7 kb, 0,75 kb, 0,85 kb, 1,0 kb, 1,1 kb, 1,35 kb, 1,5 kb, 2,0 kb). Mồi RA159 Kết quả điện di sản phẩm RAPD của mồi RA159 cho thấy, trong phạm vi vùng phân tích từ 0,4 - 2,5 kb có 10 phân đoạn DNA được nhân bản, trong đó có tới 10 phân đoạn cho tính đa hình. Cụ thể ở kích thước khoảng 2,5 kb , chỉ có 2 giống T3, T24 nhân được phân đoạn DNA. Ở kích thước khoảng 2,0 kb cũng có 2 giống T21, T23 xuất hiên phân đoạn DNA. Và ở 1,7 kb có 3 giống T21, T23, và T24 nhân được phân đoạn DNA. Ở vị trí 1,4 kb có duy nhất 1 giống T23 nhân được phân đoạn DNA, 29 giống còn lại không thấy 52 xuất hiện. Tại vị trí 1,0 kb 24 giống không nhân được phân đoạn DNA, trong khi đó 6 giống T13, T14, T22, T23, T25, T27 đều xuất hiện phân đoạn DNA nhân bản. Ở phạm vi kích thước khoảng 0,9 kb 25 mẫu có phân đoạn DNA được nhân bản, 5 giống còn lại không xuất hiện phân đoạn này là T3, T15, T21, T24, T26. Phân đoạn tiếp theo cho tính đa hình ở kích thước khoảng 0,75 kb với sự xuất hiện phân đoạn DNA ở các mẫu số T1, T3, T11, T12, T13, T14, T20, T21, T23, T24, và T25 các mẫu còn lại không thu được phân đoạn này. Với kích thước 0,6 kb chỉ có 4 mẫu nghiên cứu là T21, T22, T25 và T30 nhân được phân đoạn DNA. 8 giống không thể hiện số phân đoạn DNA ở vị trí 0,5 kb là T2, T5, T10, T11, T12, T21, T24, T30, 22 giống còn lại đều thể hiện sự đa hình ở vị trí này. Cuối cùng là vị trí 0,4 kb chỉ có 3 giống xuất hiện phân đoạn đa hình là T2, T21, T24 và 27 giống còn lại không xuất hiện ở phân đoạn này (hình 3.9). Hình 3.9. Ảnh điện di sản phẩm RAPD với mồi RA159 từ mẫu T1 đến mẫu T15 Ký hiệu; M: Marker 1. T1, 2. T2, 3.T3, 4. T4, 5. T5, 6. T6, 7. T7, 8. T8, 9. T9, 10. T10, 11. T11, 12. T12, 13. T13, 14. T14, 15. T15 53 Mồi RA50 Kết quả điện di sản phẩm RAPD với mồi RA50 của 30 giống đậu xanh ở hình 3.9 cho thấy, trên các giếng của bản điện di có từ 2 đến 7 phân đoạn DNA được nhân bản với kích thước tương ứng khoảng 0,4 kb đến 2,0 kb. Giống T6 có số phân đoạn được nhân bản nhiều nhất 7 phân đoạn. Giống T9 có 6 phân đoạn, giống T10, T18 có 5 phân đoạn, giống T1, T2, T3, T4, T5, T7 có 4 phân đoạn, giống T8, T15, T20, T21, T24, T27, T28 có số phân đoạn DNA được nhân bản là 3 phân đoạn. 13 giống còn lại có số phân đoạn DNA ít nhất là 2 phân đoạn. Đặc biệt, ở vị trí 0,6 kb và vị trí 1,2 kb tất cả các giống xuất hiện phân đoạn DNA được nhân bản. Ở các vị trí 2,0 kb, 1,5 kb, và 1,3 kb chỉ thấy có 1 giống duy nhất xuất hiện số phân đoạn DNA được nhân bản tương ứng Hình 3.10. Ảnh điện di sản phẩm RAPD với mồi RA50 từ mẫu T11 đến mẫu T30 Ký hiệu: M: Marker 1kb 11. T11, 12. T12, 13. T13, 14. T14, 15. T15, 16. T16, 17. T17, 18. T18 19. T19, 20. T20, 21. T21, 22. T22, 23. T23, 24. T24, 25. T25, 26. T26, 27. T27, 28. T28, 29. T29, 30. T30 54 với các giống là T28, T18 và T15, 29 giống còn lại không xuất hiện số phân đoạn ở vị trí này. Ở vị trí 1,8 kb có 3 giống xuất hiện số phân đoạn DNA là T6, T9, T18 còn lại các giống không thấy xuất hiện. Xuất hiện số phân đoạn ở 2 vị trí 1,6 kb và 0,4 kb chỉ có 2 giống T6 và T9. Tại vị trí 1,4 kb cũng chỉ có 2 giống T1 và T10 trong tổng số 30 giống xuất hiện số phân đoạn DNA được nhân bản. Có 3 giống T1, T2, T3 xuất hiện số phân đoạn ở vị trí 1,1 kb, còn lại không xuất hiện. 4 giống T20, T21, T34, T28 xuất hiện số phân đoạn ở vị trí 1,0 kb. Tại vị trí 0,75 kb có 5 giống liền nhau từ T6 đến T10 xuất hiện số phân đoạn DNA, các giống còn lại không thấy xuất hiện số phân đoạn DNA được nhân bản. Tại 2 vị trí 0,65 kb và 0,6 kb cũng chỉ có 3 giống trong tổng số 30 giống xuất hiện số phân đoạn DNA được nhân bản. Như vậy, với mồi RA50 có 12 kích thước (0,4 kb, 0,6 kb, 0,65 kb, 0,75 kb, 1,0 kb, 1,1 kb, 1,3 kb, 1,4 kb, 1,5 kb, 1,6 kb, 1,8 kb và 2,0 kb) thể hiện tính đa hình và có 2 kích thước (0,5 kb và 1,2 kb) không biểu hiện tính đa hình . Thông qua giá trị PIC thấy mồi RA50 không phải là thể hiện 100% tính đa hình và tổng số phân đoạn DNA thu được cũng không phải là lớn nhất nhưng giá trị PIC vẫn cao vì số cá thể khác biệt nhau nhiều nên vẫn có giá trị PIC lớn (PIC = 0,8498). Mồi RA32 Kết quả điện di cho thấy, tính đa dạng thể hiện một cách rõ nét giữa các mẫu đậu xanh nghiên cứu. Từ giới hạn kích thước 0,35 - 1,8 kb, có 10 phân đoạn DNA xuất hiện, tương ứng với tổng số 108 phân đoạn DNA được nhân bản trên tổng 30 mẫu đậu xanh nghiên cứu. Có 10 phân đoạn cho tính đa hình phân đoạn DNA nhân bản. Cụ thể ở kích thước khoảng 1,8 kb chỉ có 1 mẫu T9 xuất hiện phân đoạn DNA nhân bản, 29 mẫu còn lại đều không xuất hiện 55 phân đoạn DNA nhân bản. Ở kích thước 1,3 kb lại có tới 28 mẫu xuất hiện phân đoạn DNA nhân bản và chỉ còn lại 2 mẫu T6 và T18 là không xuất hiện . Năm mẫu T6, T9, T17, T19, T20 không thu được phân đoạn DNA ở kích thước khoảng 0,8 kb. Ở kích thước khoảng 1,0 kb có tới 8 mẫu không thu được phân đoạn DNA nhân bản. Trong khi đó ở phạm vi kích thước khoảng 0,35 kb chỉ có 2 mẫu có phân đoạn DNA nhân bản là T1 và T19. Ở tất cả các kích thước xuất hiện đều biểu hiện tính đa hình. Hình 3.11. Ảnh điện di sản phẩm RAPD với mồi RA32 của 30 giống đậu xanh Ký hiệu: M: Marker 1kb 1.T1, 2.T2, 3.T3, 4.T4, 5.T5, 6.T6, 7.T7, 8.T8, 9.T9, 10.T10, 11.T11, 12.T12, 13.T13, 14.T14, 15.T15, 16.T16, 17.T17, 18.T18, 19.T19, 20.T20, 21.T21, 22.T22, 23.T23, 24.T24, 25.T25, 26.T26, 27.T27, 28.T28, 29.T29, 30.T30. 56 Mồi OPA15 Đây là mồi điển hình trong số 10 mồi cho tính đa hình các phân đoạn DNA được nhân bản. Tổng số phân đoạn DNA được nhân bản với 30 mẫu đậu xanh thu được 201 phân đoạn DNA tương ứng với 7 băng khi kiểm tra trên gel agarose 1,8%. Mặc dù số lượng phân đoạn DNA được nhân lên lớn nhất trong số các mồi sử dụng nhưng chỉ có một băng ở vị trí 1,1 kb cho tính đa hình phân đoạn DNA được nhân bản. Toàn bộ các băng vạch ở các phân đoạn khác đều giống nhau hoàn toàn giữa 30 mẫu đậu xanh nghiên cứu. Thể hiện tính đa hình thấp. Điều này được khẳng định thông qua giá trị PIC = 0,0727 (giá trị PIC thấp nhất). Kích thước các phân đoạn được nhân bản rất đa dạng dao động từ 0,35 kb tới trên 2,75 kb. Ảnh điện di cũng được tổng hợp và thể hiện trên hình 3.12. Hình 3.12. Ảnh điện di sản phẩm RAPD với mồi OPA15 từ mẫu T1 đến mẫu T20 Ký hiệu: M: Marker 1kb 1.T1, 2.T2, 3.T3, 4.T4, 5.T5, 6.T6, 7.T7, 8.T8, 9.T9, 10.T10, 11.T11, 12.T12, 13.T13, 14.T14, 15.T15, 16.T16, 17.T17, 18.T18, 19.T19, 20.T20. M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 0,25kb 0,75 kb 1,0 kb 0,5kb 1,5 kb 2,0 kb 57 Mồi RA40 Mồi RA40 khuếch đại được 4 phân đoạn với kích thước từ 0,2 - 1,6 kb. Biểu hiện đa hình của các giống đậu xanh nghiên cứu thể hiện ở một băng kích thước 1,6 kb. Ở ba kích thước còn lại (0,2 kb, 1,0 kb, 1,4 kb) không biểu hiện đa hình. Ảnh điện di được thể hiện qua hình 3.12. Hình 3.13. Ảnh điện di sản phẩm RAPD với mồi RA40 từ mẫu T1 đến mẫu T20 3.2.3. Mối quan hệ di truyền giữa các giống đậu xanh dựa trên phân tích RAPD Từ kết quả phân tích hình ảnh điện di sản phẩm RAPD, chúng tôi thống kê các băng điện di (xuất hiện = 1, không xuất hiện = 0) và xử lý số liệu phân tích RAPD bằng phần mềm NTSYSpc version 2.0i nhằm xác định khoảng cách di truyền giữa các mẫu đậu xanh nghiên cứu thông qua hệ số tương đồng di truyền và biểu đồ hình cây. Ký hiệu: M: Marker 1kb 1.T1, 2.T2, 3.T3, 4.T4, 5.T5, 6.T6, 7.T7, 8.T8, 9.T9, 10.T10, 11.T11, 12.T12, 13.T13, 14.T14, 15.T15, 16.T16, 17.T17, 18.T18, 19.T19, 20.T20. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 1213 14 15 16 1718 19 20 M MM 0,25 kb 0,5 kb 0,75 kkmk mkkk kkkkk kkbkk kkkkk kkkbk bkb 1,0 kb 1,5 kb 58 Để xác định quan hệ di truyền, chúng tôi đã tiến hành xác định giá trị tương quan kiểu hình theo ba phương pháp tính hệ số di truyền giống nhau (phương pháp của Jaccard, SM và Dice) với bốn kiểu phân nhóm (WPGMA, UPGMA, liên kết hoàn toàn và liên kết đơn lẻ) (bảng 3.7). Biểu đồ hình cây được thiết lập dựa trên giá trị tương quan cao nhất với các giá trị khi r  0,9: tương quan rất chặt, 0,8 ≤ r < 0,9: tương quan chặt, 0,7 ≤ r < 0,8: tương quan tương đối chặt, r < 0,7: tương quan không chặt. Bảng 3.7. Giá trị tương quan kiểu hình (r) UPGM A WPGMA Liên kết hoàn toàn TO toàn Liên kết đơn lẻ SM 0.8794 0.8352 0.7439 0.8600 Dice 0.8741 0.8331 0.7737 0.8418 Jaccard 0.8733 0.8228 0.7549 0.8324 Kết quả bảng 3.7 cho thấy, giá trị tương quan kiểu hình (r) của 30 mẫu đậu xanh nghiên cứu đều cao, trong phạm từ tương quan tương đối chặt đến tương quan chặt. Cụ thể giá trị (r) dao động từ 0,7439 đến 0,8794. Giá trị tương quan kiểu hình (r) lớn nhất 0,8794 khi tính theo hệ số di truyền SM và kiểu phân nhóm UPGMA. Vì vậy, sơ đồ hình cây được thiết lập theo hệ số di truyền giống nhau SM và kiểu phân nhóm UPGMA (hình 3.14). Kết quả xác định hệ số đồng dạng di truyền được thể hiện ở bảng 3.8. Hệ số đồng dạng di truyền phản ánh mối quan hệ di truyền của các giống đậu xanh với nhau. Các giống đậu xanh càng gần nhau về mặt di truyền thì hệ số đồng dạng di truyền giữa chúng càng lớn và ngược lại, các giống có hệ số đồng dạng di truyền thấp thì mối quan hệ di truyền giữa chúng càng xa nhau. 59 Bảng 3.8. Bảng hệ số tương đồng di truyền của 30 giống đậu xanh nghiên cứu Giống T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10 T11 T12 T13 T14 T15 T16 T17 T18 T19 T20 T21 T22 T23 T24 T25 T26 T27 T28 T29 T30 T1 1,00 T2 0,82 1,00 T3 0,85 0,91 1,00 T4 0,76 0,83 0,82 1,00 T5 0,74 0,79 0,80 0,83 1,00 T6 0,61 0,65 0,67 0,68 0,70 1,00 T7 0,79 0,80 0,79 0,84 0,74 0,69 1,00 T8 0,82 0,83 0,86 0,85 0,79 0,70 0,90 1,00 T9 0,59 0,66 0,65 0,71 0,73 0,81 0,72 0,70 1,00 T10 0,80 0,83 0,82 0,85 0,79 0,71 0,91 0,90 0,71 1,00 T11 0,82 0,79 0,82 0,83 0,83 0,68 0,80 0,83 0,68 0,81 1,00 T12 0,84 0,80 0,86 0,83 0,81 0,70 0,88 0,87 0,68 0,90 0,85 1,00 T13 0,77 0,76 0,81 0,82 0,80 0,69 0,77 0,82 0,65 0,80 0,88 0,86 1,00 T14 0,82 0,81 0,86 0,85 0,83 0,71 0,82 0,85 0,68 0,85 0,90 0,89 0,93 1,00 T15 0,80 0,81 0,86 0,83 0,81 0,66 0,82 0,85 0,64 0,83 0,81 0,89 0,84 0,85 1,00 T16 0,74 0,81 0,80 0,85 0,81 0,64 0,78 0,81 0,66 0,79 0,79 0,83 0,80 0,85 0,87 1,00 T17 0,76 0,81 0,80 0,85 0,79 0,66 0,80 0,81 0,68 0,81 0,79 0,81 0,80 0,85 0,87 0,89 1,00 T18 0,68 0,76 0,75 0,76 0,78 0,70 0,79 0,76 0,74 0,80 0,74 0,76 0,75 0,80 0,78 0,78 0,82 1,00 T19 0,77 0,80 0,79 0,86 0,80 0,69 0,79 0,82 0,72 0,80 0,82 0,80 0,83 0,86 0,82 0,86 0,90 0,81 1,00 T20 0,77 0,82 0,81 0,86 0,80 0,67 0,79 0,82 0,69 0,80 0,86 0,82 0,85 0,88 0,80 0,84 0,90 0,79 0,92 1,00 T21 0,72 0,77 0,78 0,81 0,73 0,58 0,72 0,75 0,58 0,75 0,79 0,77 0,80 0,83 0,77 0,73 0,77 0,70 0,74 0,78 1,00 T22 0,80 0,83 0,83 0,83 0,81 0,68 0,80 0,83 0,66 0,83 0,83 0,85 0,86 0,90 0,85 0,83 0,83 0,80 0,84 0,82 0,83 1,00 T23 0,79 0,80 0,85 0,83 0,78 0,63 0,77 0,82 0,65 0,80 0,82 0,84 0,83 0,88 0,82 0,80 0,78 0,75 0,81 0,81 0,82 0,90 1,00 T24 0,74 0,77 0,84 0,81 0,75 0,58 0,74 0,77 0,62 0,77 0,81 0,81 0,78 0,81 0,77 0,73 0,71 0,70 0,76 0,78 0,85 0,83 0,88 1,00 T25 0,83 0,84 0,89 0,86 0,82 0,69 0,83 0,80 0,69 0,86 0,88 0,88 0,89 0,93 0,84 0,80 0,82 0,79 0,85 0,87 0,84 0,93 0,92 0,86 1,00 T26 0,81 0,86 0,87 0,86 0,82 0,69 0,83 0,86 0,69 0,86 0,84 0,86 0,83 0,86 0,86 0,80 0,84 0,79 0,87 0,89 0,76 0,88 0,87 0,84 0,89 1,00 T27 0,73 0,80 0,79 0,86 0,78 0,65 0,83 0,80 0,72 0,82 0,82 0,82 0,81 0,88 0,78 0,80 0,80 0,79 0,85 0,85 0,78 0,88 0,85 0,84 0,89 0,83 1,00 T28 0,80 0,85 0,86 0,89 0,81 0,71 0,84 0,87 0,71 0,87 0,85 0,85 0,86 0,89 0,87 0,83 0,85 0,82 0,86 0,86 0,79 0,89 0,88 0,81 0,90 0,91 0,86 1,00 T29 0,78 0,85 0,84 0,59 0,81 0,70 0,88 0,85 0,75 0,87 0,85 0,87 0,84 0,90 0,85 0,87 0,87 0,86 0,90 0,88 0,81 0,89 0,88 0,83 0,90 0,88 0,93 0,92 1,00 T30 0,70 0,79 0,76 0,85 0,83 0,64 0,78 0,79 0,70 0,81 0,83 0,81 0,82 0,85 0,79 0,83 0,81 0,76 0,86 0,86 0,77 0,82 0,78 0,75 0,84 0,82 0,86 0,85 0,89 1,00 60 Kết quả phân tích bảng 3.8 cho thấy, hệ số tương đồng di truyền của 30 giống đậu xanh nghiên cứu dao động từ 0,58 đến 0,93. Trong đó, 4 cặp giống có hệ số đồng dạng di truyền cao nhất (0,93) là: T13 và T14, T14 và T25, T22 và T25, T27 và T29. 3 cặp giống có hệ số đồng dạng di truyền nhỏ nhất (0,58) là: T6 và T21, T6 và T24, T9 và T21. Hình 3.14. Sơ đồ quan hệ di truyền của 30 giống đậu xanh Sơ đồ hình cây tính theo hệ số SM và kiểu phân nhóm UPGMA (hình 3.14) đã chỉ ra mức độ sai khác di truyền giữa 30 giống đậu xanh. Mức độ khác nhau được biểu hiện bằng hệ số sai khác giữa các giống. Các giống có hệ số di truyền giống nhau tương tự sẽ được xếp thành một nhóm, giữa các nhóm lại có sự liên hệ với nhau. Nhóm I Nhóm II P I P II 61 Biểu đồ hình cây tạo được khi phân tích 30 giống đậu xanh với 10 mồi ngẫu nghiên chia làm 2 nhóm chính: * Nhóm I: Bao gồm 2 giống T6 có nguồn gốc từ Xuất Hoá - Bắc kạn và T9 có nguồn gốc từ Hàm Yên - Tuyên Quang, hai giống này có hệ số tương đồng là 0,81 và có hệ số di truyền sai khác so với các giống khác thuộc nhóm II là 33% (1 - 0,67). * Nhóm II: Bao gồm 28 giống còn lại và tiếp tục phân thành 2 nhánh phụ (PI và PII): + Nhánh phụ I: Gồm 1 giống T18 có nguồn gốc từ Đình Bảng - Bắc Ninh, giống này có hệ số di truyền sai khác với các giống ở nhánh phụ II 23% (1 - 0,77). + Nhánh phụ II: Gồm 27 giống còn lại, và chia thành 2 cụm: - Cụm I: Gồm 2 giống T21, T24, có hệ số tương đồng di truyền là 0,85 và có hệ số di truyền sai khác với cụm II là 21% (1 - 0.79). - Cụm II, gồm 25 giống còn lại, trong đó 4 cặp giống T13 và T14, T14 và T25, T22 và T25, T27 và T29 giống nhau nhiều hơn cả, hệ số sai khác giữa chúng là 7% (1 - 0,93). Từ kết quả phân nhóm trên chúng tôi nhận thấy tính đa hình của 30 giống đậu xanh trong phạm vi phân tích 10 mồi ngẫu bằng phản ứng RAPD đã chứng minh cho sự khác nhau trong cấu trúc DNA giữa các giống đậu xanh. Tuy nhiên, đậu xanh là cây tự thụ phấn cho nên hệ gen rất bảo thủ, chính vì vậy hệ số sai khác giữa các giống nghiên cứu là rất thấp. Điều này, cũng thể hiện ở kết quả của Nguyễn Vũ Thanh Thanh (2008) và Điêu Thị Mai Hoa (2006) khi nghiên cứu về quan hệ di truyền ở đậu xanh [8], [26]. 62 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 1. KẾT LUẬN 1.1. Khối lượng 1000 hạt của các giống đậu xanh dao động từ 40,27g đến 65,44g. Trong đó, giống T8 có khối lượng hạt cao nhất (65,44g), thấp nhất là giống T15 (40,27g). 1.2. Đánh giá chất lượng hạt cho thấy, hàm lượng protein và lipid đạt mức trung bình. Hàm lượng protein trong hạt của 30 giống đậu xanh dao động trong khoảng 19,27% đến 29,12%, hàm lượng lipid trong khoảng 1,7% đến 4,2%. 1.3. Đã tách chiết DNA tổng số từ lá non của 30 giống đậu xanh nghiên cứu. Qua kiểm tra cho thấy, các mẫu DNA tổng số tách chiết được đều có chất lượng tốt, có thể sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo. 1.4. Bằng kỹ thuật RAPD với việc sử dụng 10 mồi ngẫu nhiên đã nhận được 1208 phân đoạn DNA được nhân bản ngẫu nhiên từ hệ gen của 30 giống đậu xanh. Trong 10 mồi ngẫu nhiên sử dụng có cả 10 mồi biểu hiện tính đa hình. 1.5. Kết quả phân tích cho thấy, 30 giống đậu xanh nghiên cứu chia thành 2 nhóm chính, hệ số tương đồng di truyền giữa 2 nhóm là 67% (tức sai khác 33%). 2. ĐỀ NGHỊ Cần tiếp tục sử dụng kỹ thuật RAPD với nhiều mồi ngẫu nhiên và kết hợp nhiều kỹ thuật khác như SSR, AFLP, RFLP...để xác định mối quan hệ di truyền giữa các giống đậu xanh có độ tin cậy hơn nhằm tạo cơ sở cho việc lai tạo giống đậu xanh có hiệu quả. 63 CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN 1. Nguyễn Vũ Thanh Thanh, Hoàng Thị Thao, Đỗ Tiến Phát, Chu Hoàng Mậu (2010), “ Phân tích mối quan hệ di truyền của một số giống đậu xanh (Vigna radiata (L.) Wilczek) dựa trên chỉ thị RAPD”. (Bài gửi đăng tạp chí khoa học và công nghệ Đại học Thái Nguyên). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 64 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 1. Đái Duy Ban (2006), Công nghệ gen, NXB KH & KT. 2. Phạm Thị Trân Châu, Nguyễn Thị Hiền, Phùng Gia Tường (1998), Thực hành Hoá sinh học, NXB Giáo dục. 3. Nguyễn Mạnh Chính, Nguyễn Mạnh Cường (2008), Trồng đậu xanh, NXB Nông Nghiệp, Hà Nội, tr. 3-9. 4. Đường Hồng Dật (2006), Cây đậu xanh. Kỹ thuật thâm canh và biện pháp tăng năng suất, chất lượng sản phẩm, NXB Lao Động - Xã Hội, tr. 5 - 31. 5. Trần Thị Ngọc Diệp (2009), Nghiên cứu tính đa dạng di truyền của một số giống ngô (Zea mays L.), Luận văn thạc sĩ Sinh học, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên. 6. Vũ Anh Đào (2009), Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của một số giống đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) địa phương, Luận văn thạc sĩ Sinh học, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên. 7. Phạm Thành Hổ (2006), Di truyền học. NXB Giáo dục. 8. Điêu Thị Mai Hoa (2006), Nghiên cứu một số đặc điểm nông học, sinh lý và sinh học phân tử liên quan đến tính trạng chín tập trung của đậu xanh. Luận án Tiến sĩ Sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, tr.51-63. 9. Nguyễn Đăng Khôi (1997), “Các cây đậu ăn hạt ở Việt Nam”, Tạp chí Sinh học, số 2, tr. 5 - 6. 10. Kết quả nghiên cứu khoa học đậu đỗ 1991 - 1995 (1996), Viện Khoa học kỹ thuật Nông nghiệp, Việt Nam, tr. 4 - 188. 11. Kết quả nghiên cứu khoa học nông nghiệp 2000 (2001), NXB Nông Nghiệp. 12. Trần Văn Lài, Trần Nghĩa, Ngô Quang Thăng, Lê Trần Trung, Ngô Đức Dương (1993), Kỹ thuật gieo trồng đậu lạc vừng, NXB NN. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 65 13. Võ Thị Thương Lan và cộng sự (1999), “Nghiên cứu tính đa dạng của một số loài rong câu ở vùng ven biển miền nam Việt Nam bằng kỹ thuật RAPD - PCR”, Báo cáo khoa học hội nghị toàn quốc, tr. 1321 - 1327. 14. Nguyễn Thị Kim Liên (2003), Nghiên cứu định vị locus của một số tính trạng hình thái ở lúa cạn phục vụ cho việc chọn dòng lúa chịu hạn, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học Hà Nội, tr. 24 - 34. 15. Trần Thị Phương Liên (1999), Nghiên cứu đặc tính hoá sinh và sinh học phân tử của một số giống đậu tương có khả năng chịu nóng, chịu hạn ở Việt Nam, Luận án tiến sĩ Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học, Hà Nội. 16. Đỗ Tất Lợi (1997), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam. NXB KH & KT Hà Nội. 17. Trần Đình Long, Lê Khả Tường (1998), Cây đậu xanh, NXB NN. 18. Lê Đình Lương, Quyền Đình Thi (2002), Kỹ thuật di truyền và ứng dụng, NXB Đại học Quốc Gia, Hà Nội. 19. Chu Văn Mẫn (2003), Ứng dụng tin học trong sinh học, NXB Đại học Quốc Gia, Hà Nội, tr. 20 - 215. 20. Chu Hoàng Mậu (2001), Sử dụng phương pháp đột biến thực nghiệm để tạo các dòng đậu tương và đậu xanh thích hợp cho miền núi Đông Bắc Việt Nam, Luận án tiến sĩ Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học, Hà Nội. 21. Chu Hoàng Mậu, Nông Thị Man, Lê Xuân Đắc, Đinh Thị Phòng, Lê Trần Bình (2002), “Đánh giá genome của một số dòng đậu tương đột biến bằng kỹ thuật phân tích đa hình của DNA được nhân bản ngẫu nhiên”, Tạp chí sinh học 22, tr. 21 - 27. 22. Đinh Thị Phòng (2001), Nghiên cứu khả năng chị hạn và chọn dòng chịu hạn ở lúa bằng công nghệ tế bào thực vật, Luận án tiến sĩ Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học, Hà Nội. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 66 23. Nguyễn Minh Quế (2009), Đánh giá mối quan hệ di truyền của một số mẫu dẻ và nghiên cứu bảo tồn nguồn gen dẻ Trùng Khánh - Cao Bằng bằng kỹ thuật nuôi cấy mô - tế bào thực vật, Luận văn thạc sĩ Sinh học, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên. 24. Khuất Hữu Thanh (2006), Kỹ thuật gen nguyên lý và ứng dụng, NXB KH & KT. 25. Nguyễn Vũ Thanh Thanh (2003), Nghiên cứu thành phần hoá sinh hạt và tính đa dạng di truyền của một số giống đậu xanh có khả năng chịu hạn khác nhau, Luận văn thạc sĩ Sinh học, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên. 26. Nguyễn Vũ Thanh Thanh (2008), Nghiên cứu tính đa dạng di truyền và phân lập một số gen liên quan đến tính chịu hạn của cây đậu xanh (Vigna radiata (L.) Wilczeck), Luận án tiến sĩ Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học, Hà Nội. 27. Phạm văn Thiều (1997), Cây đậu xanh kỹ thuật trồng và chế biến sản phẩm, NXB Nông nghiệp. 28. Nguyễn Thị Tâm (2003), Nghiên cứu khả năng chịu cóng và chọn dòng chịu nóng ở lúa bằng công nghệ tế bào thực vật, Luận án tiến sĩ Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học, Hà Nội. 29. Nguyễn Hải Tuất, Ngô Kim Khôi (1996), Xử lý thống kê kết quả nghiên cứu thực nghiệm trong nông lâm ngư nghiệp trên máy vi tính, NXB Nông nghiệp Hà Nội. 30. Vũ Thanh Trà, Trần Thị Phương Liên (2006), “Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của một số giống đậu tương địa phương có phản ứng khác nhau với bệnh gỉ sắt bằng chỉ thị SSR”. Tạp chí nông nghiệp và phát triển nông thôn, tr. 21, 30 - 32. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 67 31. Trương Quang Vinh, Nguyễn Thị Tâm, Đỗ Tiến Phát, Nguyễn Thành Danh (2008), “Đánh giá sự đa hình DNA một số giống khoai tây (Solanum tuberosum L.) bằng kỹ thuật RAPD”, Tạp chí nông nghiệp và phát triển nông thôn, số 1. 32. Vander Maesen L. J. G. (1996), Tài nguyên thực vật Đông Nam Á, Tập 1 - Các cây đậu ăn hạt, NXB KH & KT, tr. 16 - 86. TÀI LIỆU TIẾNG ANH 33. Afzal M.A., Muynul Haque M., and Shanmugasundaram S (2004), “Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) analysys of selected mung bean (Vigna radiata L. Wilczek) cultivars”, Asian Journal of Sciences, 3(1), pp. 20 - 24. 34. Awan F. S., (2007), “Study of genetic divergence among wheat genotypes through random amplied polymorphic DNA, centre of Agricultural biochemistry and biotechnology”, Unversity of Agricultural Faisalabad Pakistan, 6(3), pp. 476 - 481. 35. Betal S., (2004) Roy C.P., Kundu S., Sen R.S, “Estimation of geneetic variability of Vigna radiata cultivars by RAPD analysis”, Biologia plantrum, 48(2), pp. 205 - 209. 36. Chen Y., Wang D., Arelli P., Ebrahimi M., Nelson R.L., (2006), “Molecular marker diversity of SCN-resistant sources in soybean”, Genome; 49, 8; ProQuest Central. 37. Dey N., Subarsana B., Chaudhuri T.R.,Dey S.R., mitu De,Ghose T.K., (2005), “RAPD - base genetic diversity analysis of aromatic rice”, Cababstractsplus, 6(3/4), pp. 133 - 142. 38. Doldi M., Vollmann J., Lellry T., (1997), Genetic doversity in soybean as determined by RAPD and microsatellite analysis, pp. 331 - 335. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 68 39. Foolad M. R., Arulsekar S., Rodrigues R.L.,(1995), “Application of polymerase chain reaction (PCR) in plant genome analysys”, In:Gamborg OL, Pjillips GC (eds), Fundamental methods of plant cell, tissue and organ culture and laboratory operation, Springer Verlag, Berlin, Heidelberg-New York-Tokyo, pp. 281 - 298. 40. Gawel N.J., Jarret R.H., (1991), Geneomic DNA isolation. 41. Humphry M.E., Magner T., McIntyre C.L., Aitken E.A., Liu C.J., (2003), “Identification of a major locus conferring resistance to powdery mildew (Erysiphe polygoni DC) in mungbean [Vigna radiata (L.) Wilczek] by QLT analysis”, Geneome, 46(5), pp. 738 - 744. 42. Hyung - Jin Baek, Jung - Hoon Kang, Tae - San Kim, Nam - Chon Paek (2008), “Genetic Diversity and Population Structure of Korean Soybean Landrace [Glycine max (L.) Merrill]”, J. Crop Sci. Biotech. (June) 11 (2), pp. 83 - 90. 43. Jorge (2003), “Genetic diffrentiation of Portugues tea plant using RAPD markers”, Hrt Science, 38(6), pp. 1191 - 1197. 44. Karuppanapandian T., Karuppudurai T., Sinha P. B., Kamarul Haniya A, Ma noharan K (2006), “Genetic diversity in green gram (Vigna radiata L.) landraces analyzed by using random amplified polymorphic DNA (RAPD)”, African Jounal of Biotechnology, pp. 1214 - 1219. 45. Lakhanpaul S., Chadha S., Bhat K.V (2000), “Random amplified polymorphic DNA (RAPD) analysis in Indian mung bean (Vigna radiata L. Wilczek) cultivars”, Genetica, 109(3), pp. 227 - 234. 46. Lambrides C. J., Lawn R. J., Godwin I. D., Manners J., Imrie B. C. (2004), “Two genetic linkage maps of mungbean (Vigna radiata L. Wilczek) using RFLP and RAPD markers”, Australian Journal of Agricultural Research , 51(4), pp. 415 - 425. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 69 47. Li Z., Nelson R.L., (2002), “RAPD Marker Diversity among Cultivated and Wild Soybean Accessions from Four Chinese Provinces”, Crop Science, 42, pp. 1737 - 1744. 48. Moretzsohn M.C., Hopkins M.S., Mitchell S.E., Kresovich S, valls J.F., Ferreira M.E. (2004), “Genetic diversity of peanut (Arachis hypogaea L.) and its wild relatives based on the analyis of hypervariable regions of the genome”, BMC plant Biol, 14,4(1). 49. Muthusamy S., Kanagarajan S., Ponnusamy S.(2008), “Efficiency of RAPD and ISSR markers system in accessing genetic variation of rice bean (Vigna umbellata) Landraces”, Electronic Journal of Biotechnology, 11(3). 50. Orozco C., Chalmers K. J., Powell W., Waugh R., (1996), “RAPD and organelle specific RCR re-affirms taxonomic relationships within the genus Coffea”, Plant Cell Reports, 15(5), pp. 337 - 341. 51. Paulo S., (2004), “Genetic diversity among maize (Zea mays L.) landraces assessed by RAPD markers”, Genetics and molecular biology, 27(2). 52. Raghunathachari P., Khanna V. K., Singh U. S., Singh N. K., RAPD analysis of genetic variability in Indian Scented germplasm (Oryza sativa L.). 53. Raina S.N.V, Kojima T., Ogihara Y., Singh K.P., Devarumath R.M., (2001), “RAPD and ISSR figerprints as useful genetic marker for analysis of genetic diversity, varietal identification, and phylogenetic relationships in peanut (Arachis hypogaea L.) cultirs and wild species”, Genome, 44(5), pp. 763 - 72. 54. Ranade R., Gopalakrishna T. (2001), “Characterization of blackgram [Vigna mungo (L.) Hepper] varieties using RAPD”, Plant varieties & Seeds, 14(3), pp. 227-233. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 70 55. Saini A., Reddy S. K., Jawali N., (2004), “Evaluation of long primers for AP-PCR analysis of mungbean [Vigna radiata (L.) Wilczek]: Genetic relationships and fingerprinting of some genotypes”, Indian Journal of Biotechnology, pp. 511 - 518. 56. Sangsiri C., Sorajjapinun W, Srinivesc P., (2005) “Gamma Radiation Induced Mutations, function, gene expression and regulation”. Colloids and surface, B. Biointerfaces, 45(3-4), pp. 131 - 135. 57. Santalla M., Power J. B, Davey M. R., (1998), “Genetic diversity in mung bean [Vigna radiata (L.) Wilczek] germplasm revealed by RAPD markers”, Plant Breeding, pp. 473 - 478. 58. Li Z., Nelson R.L., (2002), “RAPD Marker Diversity among Cultivated and Wild Soybean Accessions from Four Chinese Provinces”, Crop Science, 42, pp. 1737 - 1744. 59. Sholihin, Hautea D.M., (2002), “Molecular mapping of drought resistance in mungbean (Vigna radiata L.): 1.QTL linked to drought resistance, 2.Linkage map in mungbean using AFLP markers”, Jurnal Bioteknologi Pertanian, 7(1-2), pp. 17 - 61. 60. Singh S., Reddy K.S., Jawali N., (2000), “PCR analysis of mungbean genotypes using anchored simple sequence repeat primer”, In: DAE-BRNS symposium on the use of nuclear and molecular techniques in crop improvement, BARC, pp. 359 - 369. 61. Subramanian V., Gurtu S., Nageswara R.C., Nigam S. N., (2000), “Identification of DNA polymorphism in cultivated groundnut using random amplified polymorphic DNA (RAPD) assay”, Maharastra Hybrid Seeds Company (MAHYCO) Ltd., Andhra Pradesh, India, 43(4), pp. 656 - 660. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 71 62. Venkata C. L., Sreedhar R.V., Bhagyalakshmi N., (2007), “The use of genetic markers for detecting DNA polymorphism among banana cultivars”, Plant Cell Biotechnology Department, Central FoodTechnological Research Institute, KRS Road, Mysore, Karnataka 570 020, India, 18(12). 63. William J.G.K., Kubelik A.R., Livak K.J., Rafalski J.A., Tingey S.V., (1990), “DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers”, Nucleic Acids Reseach, pp. 6531 - 6535. 64. Young N.D, Kumar L., Menancio - Hautea, Danesh D., Talekar N.S,Shanmugasundarum S., Kim D.H., (1992), “RFLP mapping of a major bruchid resistance gene in mungbean (Vigna radiata L. Wilczek)”, Theoretical and Applied genetics, 44(7-8), pp. 839 - 844.