Luận văn Nghiên cứu quy trình sản xuất Rượu bắp sữa

ỡng và thải ra ngoài các sản phẩm trao đổi chất. Vỏ này được cấu tạo từ polysaccharid (glucan và manan). Ngoài ra ở thành vỏ còn có một lượng nhỏ chất béo, protid, chất khoáng. Các enzyme được tách ra từ tế bào tập trung ở lớp này, phân ly các đường có phân tử lượng lớn (maltose, saccharose), nhờ đó mà các đường này được đồng hoá. Vỏ trong của tế bào là màng plasma rất mỏng, dày khoảng 8nm, có chức năng điều chỉnh vận chuyển chất dinh dưỡng vào tế bào Cytoplasma là hệ thống keo, độ nhớt của nó phụ thuộc vào thời kỳ sinh trưởng và các yếu tố sinh lý. Ở tế bào non trẻ, độ nhớt của cytoplasma nhỏ hơn ở tế bào già, điều này đảm bảo cho việc vận chuyển sản phẩm trao đổi chất tốt hơn (protoplasma trong nhân tế bào có tên là nucleoplasma, còn nếu ở ngoài nhân có tên là cytoplasma). Vatulin gồm các chất chứa nitơ, dẫn xuất của acid nucleic. Vatulin nằm bên trong không bào, ở dạng hạt to (vatulin nằm yên) hay hạt nhỏ phân bố ở mặt trong không bào (vatulin hoạt động). Khi tiếp xúc với methylen blue, vatulin ở tế bào sống sẽ biến thành màu đỏ, còn ở tế bào chết sẽ biến thành màu xanh nhưng bản thân nấm men không đổi màu. Nhân tế bào được bao bọc bởi màng nhân. Bên trong chứa đầy nucleoplasma trong suốt và những sợi chỉ nhỏ dài gọi là cromoxom. Cromoxom đóng vai trò thực hiện chức năng di truyền và trao đổi chất, kiểm soát sự phân hoá tế bào và tổng hợp protid, lipoproteic và các quá trình khác, kể cả sự sinh sản. Mitokhondsi là những phần rất bé nhỏ ở cytoplasma. Chúng chứa nhiều các enzyme thuỷ phân protid, lipid và glucid. Chức năng chủ yếu của nó là ghép nối sự tổng hợp ATP và ADP với acid phosphoric để tạo ra nguồn năng lượng cung cấp cho hoạt động sống của tế bào. Riboxom là cytoplasma có dạng túi nhỏ. Đây là cấu tử nhỏ nhất của tế bào, có chức năng tổng hợp protein cho tế bào. Không bào là một túi chứa đầy dịch tế bào. Ở các tế bào trẻ không bào ít xuất hiện, ở các tế bào già không bào trở nên lớn, có khi chiếm hết cả tế bào. Đây là nơi xảy ra các quá trình enzyme sôi động để tạo ra các sản phẩm trung gian. Không bào cách biệt với cytoplasma bởi màng lypoprotein. Hình 1.22: Cấu trúc tế bào S.cerevisiae Thành phần hóa học của nấm men phụ thuộc vào chủng giống, môi trường, trạng thái sinh lý cũng như điều kiện nuôi cấy. Các chất khô của nấm men bao gồm các thành phần: Protein: chiếm khoảng 30 – 50%, có đủ các acid amin không thay thế. Về giá trị dinh dưỡng thì protein nấm men tương đương protein động vật, hơn protein thực vật. Glucid: chiếm khoảng 24 – 40%, chủ yếu là glycogen ( C6H10O5 )n, là chất dự trữ của tế bào. Chất béo: chiếm khoảng 2 – 5%, chứa chủ yếu trong nguyên sinh chất, là các chất dự trữ của nấm men. Chất khoáng: khoảng 5 – 11%, tuy với số lượng ít nhưng đóng vai trò vô cùng quan trọng trong hoạt động của tế bào nấm men, đặc biệt là phospho. Tế bào nấm men còn chứa ion K, Ca, Mg, Fe và các ion khác. 2.3.Sự sinh sản của nấm men Saccharomyces Nấm men có thể sinh sản vô tính thông qua mọc chồi hoặc hữu tính thông qua sự hình thành của nang bào tử. Trong quá trình sinh sản vô tính, chồi mới phát triển từ men mẹ khi các điều kiện thích hợp và sau đó, khi chồi đạt tới kích thước của men trưởng thành thì nó tách ra khỏi men mẹ. Khi các điều kiện dinh dưỡng kém các men có khả năng sinh sản hữu tính sẽ tạo ra các nang bào tử. Hình 1.23: Quá trình sinh sản của nấm men 1. Bắt đầu; 2. Kết hợp; 3. Bào tử. 2.4.Đánh giá chất lượng nấm men trong sản xuất Những nòi nấm men rượu được dùng trong sản xuất có những yêu cầu sau đây: hoạt lực lên men cao, chịu được độ rượu cao, có khả năng phát triển và hoạt động trong môi trường axit, có thể chịu đựng được một số sản phẩm trao đổi chất của vi sinh vật tạp nhiễm. Những giống men rượu tinh bột cần phải lên men được glucoza, maltoza và các mono- hoặc disaccharit khác có chứa trong môi trường cũng như biến đổi được các dextrin. Nấm men dùng trong thùng lên men cần có các chỉ số : Số lượng tế bào nẩy chồi 10 – 15%, lượng tế bào chết không quá 2 – 4% (số này tăng lên có nghĩa là trong môi trường có mặt các tác nhân kìm hãm hoạt động sống của nấm men; số tế bào chứa glycogen không nhỏ hơn 70%; số lượng tế bào nấm men trong 1 ml môi trường không thấp hơn 120 – 140 triệu. Khi soi kính không được thấy các vi khuẩn chuyển động, còn vi khuẩn không chuyển động không quá 4 – 6 tế bào trong môi trường dưới kính hiển vi. 2.5.Bảo quản giống nấm men Giống nấm men thuần khiết được bảo quản để giữ được các đặc tính ban đầu. Có nhiều phương pháp bảo quản nấm men. Các nhà máy thường giữ giống nấm men trên môi trường thạch – malt hoặc môi trường nước đường hóa – thạch đối với những giống lên men từ tinh bột, còn đối với những giống men lên men rỉ đường thường dùng hỗn hợp thạch – malt – rỉ đường. Các ống nghiệm giống thạch nghiêng được giữ ở nhiệt độ 4 – 100C và định kỳ cấy chuyền lại hai lần trong một tháng (mỗi kỳ cấy chuyền nên sơ bộ làm trẻ hóa cách nuôi chuyển qua dịch đường hóa hoặc dịch rỉ đường có thêm các nguồn khoáng). Có thể bảo quản giống dưới lớp parafin hoặc vazolin vô trùng. Phương pháp này có thể hàng năm mới cấy truyền lại. 3.Bản chất quá trình lên men rượu 3.1.Một số nghiên cứu đầu tiên: Lên men rượu đầu tiên đã rất lôi cuốn các nhà khoa học trên thế giới. Vào thế kỉ 18, Blac đã cho rằng sản phẩm của sự lên men rượu chỉ là C2H5OH và CO2. Năm 1789, Lavoise thực hiện một số thí nghiệm cho thấy rằng bên cạnh những sản phẩm chính là C2H5OH và CO2 còn có một số sản phẩm khác mà ông đặt tên là acid acetic. Theo ông, 95,5 % đường sẽ cho 57,7% C2H5OH, 33,3%CO2 và 2,5% acid acetic. Năm 1810, Tay Hussac đã nghiên cứu tỉ mỹ hơn về khám phá của Lavoise, ông cho rằng cứ 45 phần đường glucose thì tạo ra 23 phần rượu C2H5OH và 22 phần CO2. Từ đó ông cho ra phương trình sau: C6H12O6 = 2C2H5OH + 2CO2 Năm 1853, Pasteur đã công bố kết quả nghiên cứu của ông về sự lên men rượu, theo ông cứ 100 phần saccharose thì chuyển sang được 105,4 phần đường nghịch đảo và sau khi lên men sẽ cho 54,1 phần C2H5OH và 49,4 phần CO2, 3,2 phần glycerin, 0,7 phần acid sucenic và một phần các sản phẩm khác. Từ đó, người ta tính được cứ 45 phần glucose lên men rượu được 21,8 phần C2H5OH chú không phải là 23 phần như Tay – Hussac đã tính. Sau đó nhiều nhà khoa học đã đi sâu vào nghiên cứu quá trình lên men rượu và các giống vi sinh vật lên men, các yếu tố kĩ thuật trong quá trình lên men. 3.2.Bản chất của quá trình lên men Lên men là quá trình oxy hóa khử sinh học để thu năng lượng và các hợp chất trung gian. Lên men rượu là một quá trình sinh hóa phức tạp, đòi hỏi phải có sự tham gia của nấm men hoặc một số vi sinh vật khác. Trong quá trình lên men rượu, đường được biến đổi thành rượu ethylic và CO2. Quá trình lên men rượu kèm theo sự hình thành các sản phẩm đồng thời giải phóng ra năng lượng. Trong phản ứng lên men, đường được chia cắt thành các mạch cacbon cơ bản để hình thành nên các hợp chất carbon mạch ngắn hơn. Để thực hiện được các hoạt động sống như sinh trưởng, sinh sản và phát triển của mình, vi sinh vật cũng đòi hỏi phải có năng lượng. Lên men là quá trình cung cấp năng lượng và các hợp chất trung gian cho tế bào vi sinh vật. Nhưng tế bào sống chỉ sử dụng năng lượng dưới dạng năng lượng tàng trữ trong mạch cacbon và được giải phóng ra trong các phản ứng enzyme do sự chuyển electron từ mức năng lượng này sang mức năng lượng khác. Các phản ứng sinh hóa xảy ra trong các quá trình lên men là những phản ứng chuyển hydro. Nhưng sự chuyển hydro cũng tương đương với sự chuyển electron, vì lẽ nguyên tử hydro có thể tách ra thành proton H+ và electron. Các enzyme xúc tác quá trình tách nguyên tử hydro khỏi cơ chất gọi là enzyme dehydrogenaza. Như vậy, lên men là quá trình oxy hóa – khử có enzyme xúc tác hay nói cách khác là quá trình oxy hóa – khử sinh học. Trong quá trình đó, các nguyên tử cacbon của cơ chất bị oxy hóa đến CO2, còn các nguyên tử hydro tách ra khỏi cơ chất, đầu tiên được chuyển đến NAD+, sau đó từ NADH2 trong điều kiện yếm khí hydro có thể được chuyển đến những sản phẩm trung gian khác nhau hoặc đến chất tiếp nhận được tổng hợp nên chỉ nhằm mục đích đó, nghĩa là để tái sinh lại NAD+. Tùy thuộc vào chất tiếp nhận hydro cuối cùng mà phân biệt hô hấp lên men và hô hấp yếm khí. Lên men là quá trình để thu năng lượng, qua đó hydro tách ra khỏi cơ chất được chuyển đến chất tiếp nhận cuối cùng là chất hữu cơ. Hợp chất hữu cơ được khử đi vào môi trường dinh dưỡng và tích tụ lại trong đó. Phụ thuộc vào sản phẩm nào được tích tụ chiếm ưu thế hoặc sản phẩm nào đặc trưng mà người ta phân ra lên men rượu, lên men lactic hay lên men butyric,… Lên men khác với hô hấp yếm khí và sự oxy hóa không hoàn toàn. Hô hấp yếm khí cũng tiến hành trong điều kiện không có oxy tham gia nhưng hydro lại được chuyển qua mạch hô hấp mà đến chất tiếp nhận cuối cùng như nitrat hoặc sulfat. 3.3.Cơ chế quá trình lên men rượu [3,5]: Lên men rượu là một quá trình sinh học rất phức tạp xảy ra dưới tác dụng của nhiều enzyme. Theo lý thuyết hiện đại sự tạo thành rượu từ glucose thì trải qua các giai đoạn sau nay: 1./ Đầu tiên dưới tác dụng xúc tác của glucokinaza, đường gluco kết hợp với photphat của phần tử ATP ( Andenozitri – Photphat) trong tế bào nấm men tạo thành gluco – photphat và AND. C6H12O6 + ATP " CH2O(H3PO3)(CHOH)4CHO + ATP 2./ Tiếp sau đó gluco- 6- photphat do tác dụng của enzym đồng phân gloco-photphat-izomenaza sẽ biến thành fructophotphat. CH2O(H3PO3)(CHOH)4CHO 1 CH2O(H3PO3)(CHOH)3COCH2OH 3./ Giai đoạn tiếp theo dưới tác dụng của enzym photphofuctokinaza phân tử ATP thứ hai sẽ sẽ đính thêm một gốc photphat nửa vào fucto-6-photphat đđể tạo thành fucto-1-6-diphotphat và phân tử ADN thứ hai. CH2O(H3PO3)(CHOH)3COCH2OH + ATP 1 CH2O(H3PO3)(CHOH)3COCH2(H2PO3) + ADP Sự tạo thành fucto-1-6-photphat của giai đoạn chuẩn bị lên men. Giai đoạn thực hiện chuyển hóa mối liên kết cao năng thành dạng dễ biến đổi dưới tác dụng của enzym. 4./ Giai đoạn cuối xảy ra dưới tác dụng của xúc tác là aldolaza phân cắt phân tử fuctodiphotphat thành 2 phân tử trioza gồm aldehyt – photphoglyxeric và photphodioxyaceton. CH2O(H3PO3)(CHOH)3COCH2(H2PO3)1CH2O(H3PO3)COCH2OH+ CH2O(H3PO3)CHOHCHO 5./ Vai trò chủ yếu trong các biến đổi tiếp theo của quá trình lên men rượu andehyt- diphotphoglycerin. Nhưng trong dịch lên men chúng chứa rất ít, điều này chứng tỏ có sự đồng phân dưới tác dụng của enzym triphotphat izomeraza. CH2O(H3PO3)COCH2OH 1 CH2O(H3PO3)CHOHCHO. 6./ Giai đoạn tiếp theo là 2 phân tử aldehyde photphatglycerin bị oxy hóa. Phản ứng này xảy ra có sự tham gia của acidphotphorit. Trong canh trường nhờ xúc tác của enzym triphotphat dehydronaza. Coenzym của nó là ADN (nicotiamit-andenit-dinucleotic). CH2O(H3PO3)CHOHCHO + H3PO4 + NaDH 1 CH2O(H3PO3)CHOHCHO-H2PO3 + 2NaDH2 (1-3 diphotpho glyxerin acid) 7./ Giai đđoạn tiếp theo với sự tham gia của photphatglyxerinkinaza gốc photphat cao năng của 1- diphotphoglyxeric mới tạo thành sẽ chuyển vào phân tử ADP. CH2O(H3PO3)CHOHCHO-H2PO3 + 2ADP 1 CH2O(H3PO3)CHOHCOOH + 2ATP 8./ Dứoi tác dụng của photphoglyxeromutaza gốc acid sẽ chuyển từ vị trí cacbon thứ ba đến vị trí cacbon thứ hai. 2CH2O(H3PO3)CHOHCOOH 1 2CH2OCHO (H3PO3) COOH 9./ Dưới tác dụng của enolaza, acid 2-photphoglyceric sẽ mất nước và biến thành acid photphopyruvic. 2CH2OCHO (H3PO3) COOH 1 2CH2CO(H3PO3) COOH + 2H2O 10./ Acid phophopyruvic rất không bến dễ bị mất gốc acid photphoric do enzym pyrovackinaza và do đó acid pyruvic được tạo thành. 2CH2=CO-(H3PO3)COOH + 2ADP = 2CH3CO-COOH + 2ATP 11./ Tới đây acid pyruvic bị decacbonxyl đđể tạo thành aldehyde acetic. 2CH3COCOOH 1 2CO2 + 2CH3CHO 12./ Giai đoạn cuối cùng lên men rượi là aldehyt acetic bị khử bởi NADH2 2CH3CHO + 2NaDH2 1 2CH3CH2OH + 2NAD Phương trình tổng quát lên men rượu như sau: C6H12O6 " 2CO2 + 2C2H5OH Trong quá trình lên men rượu mỗi phần tử gam glucose sẽ giải phóng ra khoảng 50Kcal. Năng lượng này nấm men chỉ sử dụng chừng 20Kcal. Số còn lại sẽ thải ra canh trường làm tăng nhiệt độ dịch lên men. Hình 1.24: Sơ đồ quá trình lên men rượu Sản phẩm phụ và sản phẩm trung gian của quá trình lên men: Trong quá trình lên men ngoài sản phẩm chính là cồn etylic và CO2 còn tạo ra nhiều chất khác. Bằng phương pháp phần tích sắc kí người ta đã có trên 500 chất khác nhau. Nhưng về cơ bản có thể xếp vào 4 nhóm chính: acid, esste, andehyt, alcol ( bao gồm cả rượu bậc thấp lẫn rượu bậc cao là dầu fusel). Sự tạo thành acid: Trong quá trình lên men rượu thường tạo ra các acid hữu cơ như: acid acetic, acid lactic, acid citric, acid pyruvic,… nhưng chiếm chủ yếu là acid acetic và acid lactic. Acid Acetic: có thể tạo thành từ phản ứng oxy hóa giữa 2 aldehyt acetic CH3CHO + CH3CHO + 2H2O ó CH3COOH + 2C2H5OH Acid Lactic: đđược tạo bởi pyrovicdehydronaza theo phản ứng. CH3CO-COOH + 2NaDH2 ó CH3CHOHCOOH + NAD Hoặc: CH2O(H2PO3)CHOHCHO + CH3CHOHCOOH + H3PO4 Acid Citric: cũng được tạo thành từ aldehyt acetic theo phản ứng sau: 9CH3CHO + 4H2O ó (CH2COOH)2 + COH- COOH + 6C2H5OH Acid Succinic: được tạo thành theo 2 con đường đó là dehydro và trùng hợp hai phân tử acid acetic với phân tử aldehytacetic. CH3COOH + CH3CHO ó COOHCHCH2COOH + C2H5OH Glycerin và Aldehyt: là sản phẩm trung gian của lên men rượu trong điều kiện của lên men rượu trong điều kiện lên men chỉ nhằm mục đích thu alcol etylic. Người ta khống chế pH lên men trong giới hạn 4,5 ÷ 5,2 với điều kiện đó lượng glycerin tạo thành chỉ chiếm 0,3 ÷ 0,45 tương ứng 2 ÷ 3 % lượng đường ban đầu. Nếu tăng pH tới kiềm thì lượng glyxerin đạt 23,4 % và lượng aldehyt chưa chuyển thành rượu đạt 11,9%. Dựa vào tính chất này để tạo thành ra glycerin. Người ta còn dùng natrisunfit cho vào canh trường lên men nhằm điều chỉnh sản phẩm tạo thành. Tóm lại: tùy theo điều kiện môi trường lên men có thể xảy ra theo các kiểu khác nhau. Lên men rượu bình thường: C6H12O6 ó 2CO2 + 2C2H5OH Lên men rượu cho thêm Na2S2O3 C6H12O6 ó CH3CHO + C3H8O3 + CO2 Lên men ruọu trong môi trường kiềm: C6H12O6 ó 2CO2 + CH3COOH + C2H5OH + C3H8O3 Sự tạo thành Alcol cao phân tử: Một trong những sản phẩm phụ quan trọng được tạo thành trong quá trình lên men rượu có số nguyên tử cacbon lớn hơn hai đó là: aldol propylic, izobutylic, izoamylic, imylic,... Hàm lượng của chúng chỉ vào khoảng 0,4 ÷ 0,5% so với cồn etylic, nhưng chúng ảnh hưởng rất xấu đến chất lượng sản phẩm do đó gây ra cho sản phẩm có mùi hơi khó chịu. Các aldol này có tên chung là dầu Fusel hay còn gọi là dầu khét. Nguyên nhân hình thành dầu Fusel là do nấm men sử dụng nitơ của các acid amin trong quá trình sinh trưởng tạo thành. Phương trình tổng quát hình thành alcol cao phân tử được đơn giản theo phản ứng sau: R-CH-COOH + H2O "RCH2OH + NH3 +CO2 NH2 Nhiều nhà nghiên cứu cho thấy sự tạo thành alcol cao phân tử chỉ phụ thuộc vào cấu trúc và hàm lượng acid amin có trong dịch lên men. Sự tạo thành este: Song song với việc tạo thành acid và aldol thì dưới tác dụng của enzym estaraza của nấm men các acid và aldol sẽ tác dụng lẫn nhau để tạo thành este tương ứng có thể viết dưới dang tổng quát như sau: R1CH2OH + R2COOH " R2COO-CH2R1 + H2O 3.4.Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men rượu 3.4.1.Nhiệt độ: Mỗi một vi sinh vật đều có một nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của chúng. Đối với nấm men Saccharomyces nhiệt độ tối ưu nằm trong giới hạn 28 ÷ 320C. Khi lên men ở nhiệt độ thấp thì khả năng lên men kém và kéo dài hơn. Nếu có điều kiện làm lạnh dịch đường ban đầu xuống tới 20 ÷ 220C để hạn chế sự phát triển của tạp khuẩn. Sau 8 – 10 giờ nhiệt độ của môi trường sẽ tăng tới mức tối thích là 28 ÷ 300C. Tiếp đó là làm lạnh để ổn định nhiệt độ trong giới hạn tối ưu. Nhiệt độ cao, hoạt tính của nấm men giảm nhanh nhưng chủ yếu là dễ nhiễm vi khuẩn lactic và nấm men dại. Ở nhiệt độ 300C thì nấm men dại phát triển nhanh hơn nấm men Saccharomyces, còn ở nhiệt độ cao 35 ÷ 38 0C chúng phát triển nhanh hơn 6 ÷ 8 lần. Mặt khác khi lên men ở nhiệt độ cao sẽ tạo ra nhiều sản phẩm phụ như este, aldehyt và tổn thất rượu theo CO2 tăng. 3.4.2.pH môi trường: Nồng độ ion H+ trong môi trường ảnh hưởng rất lớn đến hoạt động của nấm men, chúng có khả năng làm thay đổi điện tích của các chất của vỏ tế bào, làm tăng hoặc giảm mức độ thẩm thấu của các chất dinh dưỡng cũng như chất lượng của sự lên men. Mỗi vi sinh vật có thể hoạt động tốt ở một trạng thái ion nhất định. Trạng thái này lại phụ thuộc vào pH của môi trường. Trong điều kiện lên men rượu, pH tối ưu để tạo thành alcol etylic sẽ là 4,5 ÷ 5,2. Nếu tăng pH cho môi trường lên men thì lúc này môi trường đễ bị nhiễm khuẩn. Glycerin sẽ tạo thành nhiều hơn và do đó giảm hiệu suất lên men. Ở pH nhỏ hơn 4,2 nấm men phát triển tuy chậm hơn so với 4,5 ÷ 5,2 nhưng tạp khuẩn hầu như không phát triển. Trong điều kiện sản xuất, người ta điều chỉnh pH tới 3,8 ÷ 4,0 để hạn chế sự phát triển của vi khuẩn nhất là vi khuẩn lactic và nấm men dại, lúc đó nấm men đủ mạnh để lấn áp tạp khuẩn thường làm tăng pH đến khoảng tối thích. 3.4.3.Nồng độ dịch lên men (nồng độ đường) Nồng độ dịch đường khá cao sẽ làm tăng áp suất thẩm thấu và làm mất cân bằng về trạng thái sinh lý của nấm men. Kết quả l ml độ rượu cao không những ức chế được tạp khuẩn mà ức chế cả nấm men. Mặc khác nếu nồng độ đường cao sẽ dẫn đến tổn thất hoặc kéo dài thời gian lên men. Ngược lại nếu nống độ dịch đường ban đầu thấp sẽ không kinh tế và làm giảm hiệu suất của thiết bị lên men, tốn năng lượng khi chưng cất và tăng tổn thất rượu trong bả và nước thải. Bình thường người ta khống chế hàm lượng nồng độ chất khô của dịch đường ban đầu từ 16 ÷ 180Bx ( tùy theo mức độ thuần khiết). Tương đương với 13 ÷ 15% đường để sau khi len men sẽ nhận được nồng độ rượu trong dịch dấm chín 8,5 ÷ 9,5%V. 3.4.4.Nồng độ cồn etylic: Rượu tạo ra trong quá trình lên men tác động ngược lại đến cường độ lên men. Thông thường nấm men lên men tới nồng độ đạt 12 ÷ 14% V. Một số nấm men có thể đạt được 17÷ 20%V. Với nồng độ cao hơn sẽ ức chế nấm men và gần như đình chỉ sự lên men rượu. Với nồng độ rượu đạt 4,5%V bắt đầu ảnh hưởng đến sự phát triển và sinh sản của nấm men. Khi nồng độ đạt đến 5%V thì sự sinh sản bắt đầu ngưng trệ, nếu lên tới 7÷8% V thì bắt đầu kết thúc giai đoạn lên men mạnh và cũng bắt đầu giai đoạn lên men chậm ( lên men phụ). 3.4.5.Thời gian lên men: Thời gian lên men phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: nhiệt độ lên men, nồng độ đường, chủng nấm men. Thời gian lên men được tính từ lúc cấy giống vào môi trường và trải qua giai đoạn sinh sản, sinh trưởng, lên men …. Người ta chưa xác định rõ khi nào thì quá trình lên men kết thúc. Thông thường người ta chia thành 2 giai đoạn lên men. - Giai đoạn lên men chính: là giai đoạn này kết thức khi nếm dịch lên men không còn vị ngọt của đường hay quan sát thấy khả năng tạo bọt rất yếu. - Giai đoạn lên men phụ: là giai đoạn ủ chín và tàng trữ, được tính từ lúc bắt đầu kết thúc quá trình lên men chính và thường kéo dài vài tháng trở lên. 3.4.6.Nồng độ O2 trong môi trường: Nấm men là loại vi sinh vật hô hấp tùy tiện, trong môi trương yếm khí nó sẽ lên men để tạo rượu và CO2, còn trong điều kiện đấy đủ O2 nó có khả năng oxy hóa dường thành CO2 và H2O, đồng thời sinh sản và phát triển rất mạnh, do đó có thể kìm hãm sự lên men bằng O2 hay còn gọi là hiệu ứng “Pasteur”. Do đó trong việc sản xuất rượu vang thì giai đoạn đầu cần tạo điều kiện hiếu khí để cho nấm men phát triển, sinh sản đủ số lượng tế bào cần thiết cho quá trình lên men. Sau đó phải yếm khí tuyệt đối cho nấm men chuyển hóa đường. 3.4.7.Nồng độ CO2 tạo thành: Khí CO2 được tạo thành trong quá trình lên men rượu từ dịch đường. Một phần sẽ tồn tại trong môi trường, một phần sẽ tách ra bên trên bề mặt môi trường, và một phần sẽ tích tụ lại làm một lớp ngăn cản không khí và môi trường. Khí CO2 tích tụ lại trong môi trường chỉ làm giảm khả năng sinh sản của nấm men chứ không làm yếu khả năng lên men của chúng. Theo Mike Hugar với nồng độ 0,25% trọng lượng CO2 trong môi trường sẽ làm ức chế sự sinh sản của nấm men. Cũng theo Smitener sự sinh sản của nấm men ngừng khi nồng độ CO2 trong môi trường lên đến 4,5% trọng lượng, tương ứng với áp suất 7,7 bar ở 150C. Khi môi trường chứa hàm lượng đường cao sẽ cản trở CO2 thoát ra ngoài, ức chế sự sinh sản của nấm men dẫn đến hiệu suất thấp. Khí CO2 nằm trong khoảng không gian giữa môi trường và không khí có tác dụng kìm hãm sự phát triển của vi sinh vật. 3.4.8.Ảnh hưởng của một số hóa chất và chất sát trùng: Trong điều kiện sản xuất dù vệ sinh có sạch đến đâu thì cũng khó bảo đảm sự vô trùng tuyệt đối vì vậy cần phải sử dụng một số hóa chất sát trùng để hạn chế và ngăn ngừa vi khuẩn. Tùy theo chất lượng hóa chất sử dụng nhiều hay ít sao cho hạn chế sự phát triển của tạp khuẩn nhưng không ảnh hưởng đến hoạt động của nấm men. Khi dùng formalin hay fluosilicac natri thì nồng độ không vượt quá 0,02% so với dịch lên men. Bảng1.8 :Ảnh hưởng của một số acid tới nấm men Chất Nồng Độ Ngừng sinh trưởng Tiêu diệt men Thời gian làm tê liệt % Mol % Mol Giờ Acid clohidric 0,14 0,038 0,72 0,195 0,46 Acid sulfuric 0,34 0,039 1,30 0,132 2,04 Acid phosphoric 0,30 0,031 2,00 0,204 1,28 Acid acetic 0,75 0,125 3,00 0,500 1,25 Acid lactic 0,40 0,100 3,00 0,333 1,27 Ngoài các chất kể trên trong dịch đường lên men luôn chứa một lượng furforol, melanoidin ảnh hưởng ít đến nấm men. Furforol: có nhiều trong mật rỉ, khoảng 6÷ 8 mg/100g chất khô. Nhưng nếu pha loãng đến nồng độ 20 ÷ 22% thì nổng độ furforol khoảng 1,5÷ 2,0 mg/100ml hay 0,015 ÷ 0,02% thì ảnh hưởng của furforol xem như không đáng kể. Melanoidin: chỉ ảnh hưởng trong quá trình nhân giống của nấm men. Melanoidin không hấp thu trên bề nặt của nấm men nhưng với nồng độ 0,005% sẽ làm nhiều tế bào bị chết. PHẦN 2: VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1.Khảo sát quy trình lên men rượu bắp 2.1.1.Quy trình chung Nước thải Lõi bắp Nước Bắp Hấp Làm nguội Rửa sạch Bào mỏng Lọc Gieo men Lên men Men Bã bắp Rượu bắp Hãm cồn Rượu gạo a/Nguyên liệu Bắp đường được mua ở chợ Nguyễn Tri Phương. Rượu gạo được mua từ nhà máy rượu Bình Tây. b/Nguồn giống Sử dụng men ngọt được sản xuất theo phương pháp truyền thống. Men được mua ở chợ Nguyễn Tri Phương. c/Cách tiến hành quy trình thí nghiệm Nguyên liệu bắp đường được rửa sạch nhằm loại bỏ đất cát, lá và râu bắp còn sót lại. Sau đó, bắp đường được bào mỏng bằng dao bào để quá trình hấp diễn ra nhanh hơn và nấm men được tiếp xúc nhiều hơn với bắp giúp thuận lợi cho quá trình lên men. Bắp sau khi bào mỏng được đem đi hấp ở nhiệt độ 100oC trong 1 giờ. Trong quá trình hấp, tinh bột bắp được hồ hóa giúp cho enzyme dễ dàng thủy phân tinh bột. Sau khi hấp, bắp được làm nguội về nhiệt độ phòng (28oC) vì nhiệt độ của bắp sau khi hấp rất cao nếu cho nấm men vào sẽ giết chết nấm men hoặc làm giảm khả năng lên men của nấm men. Để làm bắp mau nguội, ta trải bắp ra khay. Bắp sau khi làm nguội ta tiến hành gieo men: men được nghiền mịn và rải đều vào bắp. Trong lúc gieo men luôn đảo đều tay để men được tiếp xúc đều hoàn toàn với bắp để quá trình lên men tối ưu. Sau quá trình lên men (120 giờ), nồng độ cồn của rượu bắp khoảng 8,5%v/v. Với nồng độ cồn thấp như vậy rất dễ bị oxy hóa tiếp để tạo thành CO2 và H2O với sự có mặt của nhóm vi khuẩn acetic nên chúng tôi tiến hành hãm cồn (thêm cồn tinh khiết) sau quá trình lên men vừa tránh oxi hóa cồn vừa tăng độ cồn cho rượu bắp. Lọc hỗn hợp lên men qua vải lọc nhằm thu hồi dung dịch rượu, có thể ép chặt khối bã để thu được nhiều dịch hơn. Bã bắp có thể dùng làm thức ăn cho gia súc. 2.1.2.Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm: Khảo sát ảnh hưởng của lượng giống, thời gian lên men sau khi cố định hàm ẩm đến pH, mật độ tế bào, hàm lượng tinh bột còn lại trong cơ chất và hàm lượng cồn sinh ra. a/Mục đích: Xác định mật độ tế bào nấm men, hàm lượng tinh bột còn lại trong cơ chất và hàm lượng cồn sinh ra. b/Cách tiến hành thí nghiệm: Hàm ẩm của bắp trước khi gieo men là 77,4%. Lượng giống sử dụng là 17%, 20%, 23%, 26% được lên men ở nhiệt độ 28oC. Xác định pH: Phương pháp xác định pH: Sử dụng máy đo pH Tritino của phòng thí nghiệm. Tiến hành đo pH của dung dịch với 3 lần đo và lấy kết quả trung bình cộng của 3 kết quả để lấy pH chính xác nhất. Hình : Máy đo pH Tiến hành: Thí nghiệm được khảo sát trên bắp đã hấp (mẫu rắn) nên rất khó theo dõi pH theo từng giờ lên men. Do đó, ở đây chỉ tiến hành khảo sát sự thay đổi pH trong các mốc thời gian là: 0 giờ, 72 giờ (thời điểm sinh khối tăng nhiều), 120 giờ (thời điểm cồn sinh ra nhiều nhất), 168 giờ (thời điểm kết thúc quá trình lên men chính). Để có thể xác định pH vào thời điểm lúc bắt đầu lên men, tiến hành nghiền mịn 10 gam bắp sau đó hút 10 ml nước cất cho vào cốc 100ml và trộn đều. Đo và ghi nhận giá trị pH của dịch cháo này ( sử dụng máy đo pH với mức độ tin cậy là 0,001 ). Xác định mật độ tế bào nấm men bằng phương pháp đếm tế bào [9] Có nhiều phương pháp định lượng sự hiện diện của vi sinh vật, ví dụ như: đếm số lượng tế bào trực tiếp trên kính hiển vi, định lượng giá tiếp thông qua mức độ cản ánh sáng (độ đục), đếm số khuẩn lạc mọc trên một môi trường xác định, định lượng một cách thống kê phương pháp pha loãng tới hạn (phương pháp MPN)… Phương pháp đếm trực tiếp bằng buồng đếm hồng cầu. Cấu tạo buồng đếm hồng cầu: Buồng đếm hồng cầu thường là một phiến kính dày 2 – 3mm có một vùng đĩa đếm nằm giữa phiến kính và được bao bọc bởi một rãnh, Đãi đếm thấp hơn bề mặt của phiến kính khoảng 1/10mm, có hình tròn vì thế khi được phủ lên bằng một lá kính thì độ sâu của đĩa đếm sẽ đồng đều nhau. Vùng đĩa đếm có diện tích 1mm2 và được chia thanh 25 ô vuông lớn có diện tích mỗi ô là 1/25 mm2 và 400 ô vuông nhỏ hơn, mỗi ô có diện tích 1/400mm2. Cách tiến hành: Pha loãng huyền phù tế bào vi sinh vật thành năm độ pha loãng liên tiếp là 101, 102, 103, 104, 105. Lắc mạnh dịch huyền phù tế bào (đã pha loãng), dùng pippet để hút dịch huyền phù này. Đậy buồng đếm bằng một phiến kính mỏng. Nhẹ nhàng dung đầu pipipet (có một giọt huyền phù vi sinh vật), đặt vào cạnh buồng đếm (nơi tiếp giáp với phiến kính mỏng). Dịch huyền phù sẽ đi vào buồng đếm nhờ cơ chế mao dẫn. Di chuyển khung đếm để dịch huyền phù tràn đầy các khoang. Đặt buồng kính lên kính hiển vi, sử dụng vật kính x10 để tìm buồng đếm.Sau đó, chuyển sang vật kính x40 để quan sát. Điều chỉnh cường độ ánh sáng bằng cửa sập để có thể quan sát rõ ràng cả tế bào lẫn các đường kẻ. Chọn một ô trung tâm và bốn ô nằm ngoài bìa để đếm. Bắt đầu đếm tế bào sau khi nhỏ giọt dịch từ 3 – 5 phút, và đếm luôn tế bào nằm trên hai đường kẻ kề nhau được chọn của từng ô. Xác định hàm lượng cồn sinh ra bằng phương pháp chưng cất: Cơ sở khoa học của quá trình chưng cất cồn là: phân tách hỗn hợp chất lỏng có nhiệt độ sôi khác nhau (dẫn đến chúng có nhiệt độ bay hơi khác nhau). Ở điều kiện áp suất thường, nhiệt độ sôi của rượu là 78,30C và nước là 1000C. Khi tiến hành chưng cất, rượu sẽ bốc hơi sớm và nhanh hơn nước do vậy mà tách được rượu ra khỏi nước. Tiến hành: Lấy 50ml dịch bắp sau lên men và 1 tấm giấy lọc cho vào bình tam giác có dung tích 500ml. Chúng tôi sử dụng giấy lọc để bọt không trào lên, ảnh hưởng đến quá trình bay hơi của cồn. Tiến hành chưng cất với tốc độ đều cho đến hết cồn trong mẫu, thời gian khoảng 60 – 90 phút. Để cồn bay hơi ra nhanh không bị mất, ống sinh hàn phải được làm lạnh bằng nước đá và bình thu cồn phải đậy kín tránh cồn bay hơi. Để nguội đến nhiệt độ 250C, đem cồn vừa thu được cân xác định khối lượng riêng giữa cồn với nước (d250C/250C).Tra bảng 01: Density of ethanol at various temperatures( kg/l hoặc g/cm3) ở Phụ lục ta được phần trăm thể tích của cồn. Xác định hàm lượng tinh bột còn lại trong cơ chất bằng phương pháp thủy phân tinh bột bằng HCl [2]: Nguyên tắc: sau khi loại bỏ các tạp chất có trong mẫu vật, tinh bột được hòa tan trong HCl. Sau đó, tủa tinh bột bằng cồn 900C. Rửa tủa và sấy khô, đem cân để tính hàm lượng tinh bột trong mẫu vật. Tiến hành: Cân chính xác 2g bắp đã giã nát. Rửa hai lần với ete dầu hỏa, mỗi lần cho vào 25ml ete dầu hỏa, lắc 5 phút, ly tâm đổ bỏ dung môi ở phía trên(dung môi có thể bị vẫn đục). Đun ấm để dung môi còn lại trong ống bay hơi hết. Tiếp tục rửa bã trong ống hai lần vớ NaCl 10%, mỗi lần cho vào 50ml dung dịch NaCl 10%, lắc trong 15 phút, ly tâm đổ bỏ dung môi bên trên (dung môi có thể bị vẩn đục). Rửa cùng cách như trên them hai lần nữa – một lần với cồn 700 và một lần vớ nước, mỗi lần lắc 1 – 2 phút. Làm ấm vài phút để bay hơi hết nước, để nguội. Lấy hết bã tinh bột cho vào cốc thủy tinh, thêm 11ml nước cất và 14 ml HCl đậm đặc. Khuấy kỹ để tinh bột hòa tan trong dung dịch acid. Cho dung dịch tinh bột vào bình định mức 100ml, tráng rửa cốc thủy tinh và đổ vào bình. Làm đầy đến vạch mức. Lọc nếu có cặn. Lấy 50ml dung dịch tinh bột cho vào cốc thủy tinh 250ml, thêm vào 110ml cồn 960. Khuấy đều để yên khoảng 1 giờ để tinh bột kết tủa hết. Đem ly tâm.Rửa tinh bột hai lần, một lần với 25ml cồn 700 và một lần với 25ml cồn 960. Cho tủa tinh bột vào một đĩa peptri đã rửa sạch, sấy khô và cân trọng lượng trước. Sấy ở 1300C trong một giờ. Để nguội trong bình hút ẩm và cân. Công thức tính hàm lượng tinh bột còn lại trong cơ chất: Khối lượng tinh bột cân được có trong 100g mẫu vật. c/Sơ đồ bố trí thí nghiệm Nước thải Lõi bắp Nước Bắp Hấp To= 100oO,t = 1 giờ Làm nguội ToC=28oC Rửa sạch Bào mỏng Lọc Gieo men Lên men Men(17%, 20%,23%,26%) Bã bắp Rượu bắp Hãm cồn Rượu gạo d/Chỉ tiêu theo dõi Ở từng tỉ lệ phối giống và thời gian lên men, tiến hành theo dõi pH, mật độ tế bào đếm được, hàm lượng cồn sinh ra và hàm lượng tinh bột còn lại trong cơ chất. 2.2.Khảo sát tỷ lệ dịch sữa bột vào rượu bắp ảnh hưởng đến cảm quan của sản phẩm[1] 2.2.1.Quy trình thí nghiệm a/Nguyên liệu Rượu bắp được lên men. Sữa bột gầy được mua từ công ty sữa Tín Phi. Gelatin được mua ở chợ Kim Biên. b/Nguồn giống Sử dụng men ngọt được sản xuất theo phương pháp truyền thống. Men được mua ở chợ Nguyễn Tri Phương. c/Cách tiến hành quy trình thí nghiệm Rượu bắp sau khi lên men được phối trộn với dịch sữa bột và gelatin để đạt cảm quan tốt nhất. 2.2.2.Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm: Khảo sát tỷ lệ dịch sữa và rượu bắp đến cảm quan sản phẩm a/Mục đích: Xác định tỷ lệ dịch sữa bột và rượu bắp được ưa thích nhất. b/Cách tiến hành: Gelatin cho vào sản phẩm với hàm lượng 1% [6]. Cách làm dịch sữa bột: 50g sữa bột gầy + 180 ml nước ấm, khuấy đều cho sữa bột tan hoàn toàn trong nước. Tỷ lệ dịch sữa bột trong sản phẩm là 20%, 30%, 40%, 50%. Dịch sữa bột được phối trộn với rượu bắp và gelatin khi đồng hóa tạo màu sắc đồng nhất, mùi thơm đặc trưng của bắp hòa quyện cùng với mùi thơm cũa sữa bột, vị chua ngọt của rượu bắp và sản phẩm có cấu trúc mịn, đồng nhất. Các nghiệm thức: Mẫu A = Nghiệm thức 01: tỷ lệ dịch sữa bột trong sản phẩm là 20%. Mẫu B = Nghiệm thức 02: tỷ lệ dịch sữa bột trong sản phẩm là 30%. Mẫu C = Nghiệm thức 03: tỷ lệ dịch sữa bột trong sản phẩm là 40%. Mẫu D = Nghiệm thức 04: tỷ lệ dịch sữa bột trong sản phẩm là 50%. Chuẩn bị phiếu chuẩn bị thí nghiệm Phòng thí nghiệm phân tích cảm quan trường Công nghệ Sài Gòn PHIẾU CHUẨN BỊ THÍ NGHIỆM Phép thử so hàng Sản phẩm: Rượu bắp sữa Ngày thử: 29/07/2010. Tính chất: Mức độ ưa thích sản phẩm Mẫu Mã số A 296 B 628 C 319 D 693 Người thử Trật tự trình bày mẫu Mã số Kết quả so hàng 1st 2nd 3rd 4th 01 ABCD 296,628,319,693 296 693 319 628 02 BCDA 628,319,693,296 296 319 693 628 03 CDAB 319,693,296,628 296 693 319 628 04 DABC 693,296,628,319 296 693 628 319 05 ABCD 296,628,319,693 296 693 628 319 06 BCDA 628,319,693,296 296 693 319 628 07 CDAB 319,693,296,628 296 693 628 319 08 DABC 693,296,628,319 693 296 319 628 09 ABCD 296,628,319,693 319 693 296 628 10 BCDA 628,319,693,296 296 693 319 628 Chuẩn bị phiếu trả lời Phòng thí nghiệm phân tích cảm quan trường Công nghệ Sài Gòn PHIẾU TRẢ LỜI Phép thử so hàng Họ và tên: Ngày thử: 29/07/2010 Bạn nhận được 6 mẫu rượu sữa bắp trong 6 ly thủy tinh có ký hiệu …….., ……..., ….….,…….., …….., …….. . Bạn hãy cảm quan và sắp xếp theo mức độ ưa thích từ thấp đến cao. Mẫu ít được ưa thích nhất xếp vào vị trí 1 và mẫu được ưa thích nhất được xếp vào vị trí 6. Bạn có thể nêu vài nhận xét về sản phẩm của chúng tôi Chú ý: thanh vị sau mỗi lần thử bằng nước trắng. Trả lời: Vị trí 1 2 3 4 Mẫu có mã số Nhận xét: Mời người thử tham gia thí nghiệm. c/Sơ đồ bố trí thí nghiệm: Nước thải Lõi Nước Bắp Hấp (to=100oC, t- 1 giờ) Làm nguội (t o=28oC) Rửa sạch Bào mỏng Hãm cồn Lọc Gieo men (20%) Lên men (120 giờ) Men Gelatin Bã bắp Thành phẩm Phối trộn Đồng hóa (10 phút) Rượu gạo Bột sữa gầy Dịch sữa (20%, 30%, 40%, 50%) Nước ấm Ngâm ấm d/Chỉ tiêu theo dõi Tỷ lệ dịch sữa bột trong sản phẩm mà người tiêu dùng ưa thích nhất . PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1.Khảo sát ảnh hưởng của lượng giống, thời gian lên men sau khi cố định hàm ẩm đến pH, mật độ tế bào nấm men, hàm lượng tinh bột còn lại trong cơ chất và hàm lượng cồn sinh ra. Đồ thị 3.1: Biểu diễn sự thay đổi pH của dịch mẫu Dựa vào đồ thị 3.1 chúng tôi nhận thấy: Các mẫu có sự thay đổi pH gần như nhau trong suốt quá trình thí nghiệm. pH của các mẫu ban đầu nằm trong khoảng 5,5 gần với pH tối ưu cho quá trình lên men (4,5 – 5,2). Trong quá trình lên men, pH của dịch mẫu giảm vì quá trình lên men rượu ngoài sản phẩm là rượu ethanol còn có một số acid hữu cơ. Chính các acid này làm giảm pH của dịch mẫu. Sau khi pH giảm lại thấy tăng nhẹ vì lúc này các sản phẩm phụ được tạo ra làm tăng pH. Vậy, pH của dịch mẫu chịu ảnh hưởng của thời gian lên men, không bị ảnh hưởng bởi lượng giống nên trong quá trình lên men ta cần theo dõi pH thường xuyên. Đồ thị 3.2: Biểu diễn số tế bào nấm men đếm được Dựa vào đồ thị 3.2 và bảng 02 (bảng Anova về mật độ tế bào đếm được với α=0,05) ở phụ lục, chúng tôi nhận thấy: Số tế bào đếm được thay đổi theo lượng giống nấm men và thời gian lên men của các mẫu khác nhau có nghĩa với α = 0,05. Sinh khối nấm men của các mẫu tăng gần giống với đường cong sinh trưởng của vi sinh vật trong môi trường nuôi cấy tĩnh. Từ 0 – 96 giờ là thời gian nấm men thích nghi với môi trường và tăng sinh khối. Từ 96 – 192 là thời gian nấm men thực hiện quá trình lên men rượu. Các mẫu 20, 23 có sinh khối cao nhất. Và sau 120 giờ thì lượng sinh khối bắt đầu giảm chứng tỏ ngưng quá trình tăng sinh khối bắt đầu quá trình lên men rượu. Vậy thời gian lên men tối ưu là 120 giờ sau khi gieo men. Mẫu 17 có sinh khối nấm men thấp nhất trong 4 mẫu (80,2 triệu tế bào/ml). Điều này chứng tỏ mẫu 17 có khả năng lên men thấp hơn các mẫu khác càng khẳng định rõ hơn lượng giống nấm men ảnh hưởng đến quá trình lên men, lượng giống nấm men thấp thì khả năng lên men thấp. Mặc dù mẫu 26 (87 triệu tế bào/ml) có lượng giống nấm men nhiều hơn mẫu 20, mẫu 23 nhưng khả năng tăng sinh khối không bằng hai mẫu đó vì có quá nhiều tế bào phát triển sau 96 giờ gieo men nên sau 120 giờ gieo men thì lượng tế bào bắt đầu giảm do cạnh tranh dinh dưỡng trong môi trường và các sản phẩm tạo ra gây ức chế sự phát triển của nấm men. Mặc dù thời gian lên men được rút ngắn nhưng chúng tôi không chọn tỷ lệ giống 26% vì tốc độ lên men nhanh không ổn định được chất lượng sản phẩm và giá thành cho sản xuất sẽ cao. Mẫu 20 (93 triệu tế bào/ml) và mẫu 23(95 triệu tế bào/ml) có sinh khối cao hơn mẫu 17 và mẫu 26, chứng tỏ hai mẫu này có khả năng lên men tốt. Chúng tôi lựa chọn mẫu 20 để tiến hành lên men rượu bắp vì có khả năng lên men tốt và giá thành thấp hơn khi chọn mẫu 23. Đồ thị 3.3: Biểu diễn hàm lượng cồn sinh ra Dựa vào đồ thị 3.2, đồ thị 3.3, bảng 03 (bảng Anova về hàm lượng cồn sinh ra với α=0,05) ở phụ lục, chúng tôi nhận thấy: Hàm lượng cồn sinh ra thay đổi theo lượng giống nấm men và thời gian lên men của các mẫu khác nhau có nghĩa với α = 0,05. Thời gian đầu từ 0 – 72 giờ sau khi gieo men lượng cồn tăng chậm vì đây là thời gian nấm men thích nghi với môi trường chỉ tăng sinh khối, chưa lên men rượu nên chưa có sinh ra cồn. Trong khoảng thời gian sau 96 đến 192 giờ gieo men lượng cồn các mẫu tăng tốt vì nấm men ngưng tăng sinh khối và lên men rượu. Sau 120 giờ gieo men, mẫu 17 có lượng cồn thấp nhất trong 4 mẫu (7,0%v/v) vì lượng tế bào nấm men sinh ra ít nên khả năng lên men kém. Mẫu 20 và 23 có lượng cồn sinh ra tốt, tốc độ lên men tốt. Chúng tôi chọn lượng giống 20% để hạ giá thành sản xuất. Mẫu 26 có lượng cồn sinh ra nhiều nhất vì có sinh khối giảm mạnh nhất, khả năng lên men rượu tốt nhất nhưng chúng tôi không sử dụng lượng giống 26% vì chi phí cho sản xuất sẽ tăng vì dùng lượng men nhiều. Đồ thị 3.4: Biểu diễn hàm lượng tinh bột còn lại trong cơ chất Dựa vào đồ thị 3.3, đồ thị 3.4, và bảng 04 (bảng Anova về hàm lượng tinh bột còn lại trong cơ chất với α = 0,05), chúng tôi nhận thấy: Hàm lượng tinh bột của các mẫu thay đổi theo lượng giống nấm men và thời gian lên men khác nhau có nghĩa với α = 0,05. Hàm lượng tinh bột mẫu 17 giảm ít nhất trong 4 mẫu vì quá trình lên men rượu không hiệu quả, khả năng lên men kém, nồng độ cồn thấp. Hàm lượng tinh bột mẫu 26 giảm nhiều nhất trong 4 mẫu vì quá trình lên men tốt và nhanh hơn các mẫu khác, nồng độ cồn sinh ra cũng cao hơn các mẫu khác. Nhưng sử dụng lượng giống nấm men là 26% sẽ gia tăng chi phí sản xuất. Hai mẫu 20, 23 mức độ giảm tinh bột gần như nhau cho thấy khả năng lên men gần như giống nhau nên chúng tôi chọn mẫu 20 thực hiện quá trình lên men rượu bắp. 3.2. Khảo sát tỷ lệ dịch sữa và rượu bắp đến cảm quan sản phẩm[1] Bảng 3.1 : Bảng tổng hợp kết quả cảm quan bằng phương pháp so hàng: Người thử Mẫu Tổng A B C D 01 1 4 3 2 10 02 1 4 2 3 10 03 1 4 3 2 10 04 1 3 4 2 10 05 1 3 4 2 10 06 1 4 3 2 10 07 1 3 4 2 10 08 2 4 3 1 10 09 3 4 1 2 10 10 1 4 3 2 10 Tổng 13 37 30 20 100 Tra bảng phụ lục : Dựa và khoảng cách của tổng bé nhất (13) so với tổng lớn nhất (37). Nếu hai giá trị này càng cách xa nhau, sự sai khác càng có nghĩa. Phụ lục cho ta các giá trị tới hạn ở mức ý nghĩa α = 5%. Theo bảng này căn cứ vào số lượng mẫu là 4 và số thành viên thử là 10 ta tìm được cặp số 17 – 33 và 19 – 31. Cặp số 17 – 33 biểu thị giới hạn dưới và trên của sự khác nhau có nghĩa của toàn bộ mẫu. Nếu một hay nhiều tổng cột nhỏ hơn giá trị bên trái hoặc lớn hơn giá trị bên phải thì sự khác nhau giữa các mẫu là có nghĩa. Chúng tôi có tổng của mẫu A bằng 13, nhỏ hơn giới hạn dưới là 17 và tổng của mẫu B bằng 37 lớn hơn giới hạn trên là 33, nên có thể kết luận các mẫu có mức độ ưa thích khác nhau có nghĩa. Cặp số 19 – 31 biểu thị giới hạn dưới và trên của sự khác nhau có nghĩa giữa từng cặp mẫu. Nếu hai mẫu có tổng nằm ngoài giới hạn này thì khác nhau có nghĩa. Trong bốn mẫu, chúng tôi có hai mẫu A và B, A và C, A và D, B và C, B và D, C và D có tổng nằm ngoài giới hạn 19 – 31 nên hai mẫu này khác nhau có nghĩa. Báo cáo thí nghiệm Phòng thí nghiệm phân tích cảm quan trường Công nghệ Sài Gòn BÁO CÁO THÍ NGHIỆM Phép thử so hàng Mục đích: So sánh mức độ yêu thích sản phẩm rượu bắp sữa của 4 nghiệm thức A, B, C, D sử dụng phép thử so hàng. Mô tả thí nghiệm: Hội đồng cảm quan gồm 10 người đã qua huấn luyện. Mỗi người nhận được 25ml mẫu rượu bắp sữa trong ly thủy tinh trong, phòng thử có nhiệt độ là 22oC. Trong thí nghiệm đã sử dụng phương pháp dựa và khoảng cách của tổng bé nhất so với tổng lớn nhất để xử lý số liệu. Kết quả: Kết quả tính toán đã chỉ ra bốn mẫu khác nhau về mức độ yêu thích của người thử ở mức ý nghĩa 5%. Mẫu A ít được ưa thích hơn vì tỷ lệ dịch sữa quá ít, sản phẩm có màu vàng quá đậm, không thơm mùi sữa, vị quá chua, cấu trúc không đồng nhất. Mẫu D được người tiêu dùng yêu thích nhiều hơn mẫu A vì cải thiện được sản phẩm thơm mùi sữa và mùi bắp nhưng vị lại quá béo và màu trắng đục của sữa làm sản phẩm mất đi màu đặc trưng của bắp. Mẫu C được người tiêu dùng ưa thích nhưng tỷ lệ dịch sữa nhiều sẽ làm gia tăng chi phí sản xuất. Mẫu B đáp ứng được nhu cầu của người tiêu dùng, sản phẩm có màu vàng hơi đục của bắp và sữa, có mùi thơm hòa quyện giữa sữa bột và bắp làm cho sản phẩm có mùi thơm đặc trưng, vị chua ngot béo hài hòa, kích thích người tiêu dùng, cấu trúc sản phẩm mịn, đồng nhất, không có hiện tượng tách lớp… Dựa vào lập luận phía trên, chúng tôi chọn mẫu B (nghiệm thức 2=tỷ lệ dịch sữa phối trộn vào sản phẩm là 30%) cùng với 1 % gelatin và 69 % rượu bắp để tạo sản phẩm rượu bắp sữa cuối cùng PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Rượu bắp sữa được lên men theo quy trình Nước thải Lõi Nước Bắp Hấp (to=100oC, t- 1 giờ) Làm nguội (t o=28oC) Rửa sạch Bào mỏng Hãm cồn Lọc Gieo men (20%) Lên men (120 giờ) Men Gelatin Bã bắp Thành phẩm Phối trộn Đồng hóa (10 phút) Rượu gạo Bột sữa gầy Dịch sữa (30%) Nước ấm Ngâm ấm Giải thích quy trình: Bắp: chọn những trái bắp tươi mới thu hoạch, có màu vàng sáng, hạt căng tròn, không bị sâu, thối….Bóc hết lá bẹ và râu bắp. Chất lượng bắp ảnh hưởng rất lớn đến chất lượng sản phẩm sau này. Rửa sạch: mục đích loại bỏ những râu bắp, lá bắp còn sót trên bắp, loại bỏ cát, đất…tránh ảnh hưởng đến khả năng lên men của nấm men. Bào mỏng: mục đích giúp quá trình hấp và lên men dễ dàng hơn. Hiện nay chưa có thiết bị chuyên dụng để bào bắp nên dùng dao bào. Bắp được bào sát lõi. Lõi bắp có thể bỏ đi hoặc được phơi khô làm chất đốt. Hấp: mục đich làm hồ hóa tinh bột có trong bắp. Việc hồ hóa tinh bột sẽ tạo cấu trúc không gian 3 chiều dễ dàng cho enzyme thủy phân tinh bột. Nhiệt độ hấp luôn giữ ổn định 1000C trong thời gian hấp (1 giờ). Làm nguội: do nhiệt độ của bắp sau khi hấp rất cao nếu cho nấm men vào sẽ giết chết nấm men và làm giảm khả năng lên men của nấm men. Do đó, sau khi hấp bắp ta cần làm nguội bắp về nhiệt độ phòng, cách tốt nhất là trải bắp ra khay. Gieo men: men được nghiền mịn và rải đều vào bắp. Trong lúc gieo men luôn đảo đều tay để men được tiếp xúc đều hoàn toàn với bắp để quá trình lên men tối ưu. Lên men: Lên men rượu là một quá trình diễn ra ở nhiệt độ thường với các quá trình sinh hóa và vi sinh rất phức tạp, bao gồm 3 quá trình diễn ra song song với những mức độ khác nhau tùy thuộc vào từng giai đoạn lên men: Đầu tiên các tế bào nấm men sẽ sử dụng các chất dinh dưỡng sẵn có trong bắp để phát triển và tăng sinh khối, đồng thời dưới tác dụng của men amylase và glucoamylase trong nấm mốc thì các phân tử tinh bột sẽ bị phân cắt thành đường (do đó giai đoạn này còn được gọi là giai đoạn đường hóa). Tiếp theo, các phân tử đường vừa được tạo ra lại trở thành thức ăn cho nấm men sử dụng để thực hiện quá trình lên men rượu tạo thành rượu etylic và CO2 (còn gọi là quá trình rượu hóa). Quá trình rượu hóa diễn ra trong điều kiện yếm khí. Trong quá trình lên men có sự dịch chuyển của các bọt khí do các phân tử CO2 được sinh ra trong quá trình lên men bám vào bề mặt nấm men và làm các tế bào nấm men nổi lên trên, nhưng khi lên đến bề mặt, bọt khí vỡ ra, tế bào nấm men lại chìm xuống tạo ra sự đảo trộn giúp cho các tế bào nấm men tiếp xúc nhiều hơn với cơ chất (đường), kết quả là quá trình lên men tốt hơn. Hãm cồn: Sau quá trình lên men, nồng độ cồn của rượu bắp khoảng 7,3%v/v. Với nồng độ cồn thấp như vậy rất dễ bị oxy hóa tiếp để tạo thành CO2 và H2O với sự có mặt của nhóm vi khuẩn acetic nên chúng tôi tiến hành hãm cồn (thêm cồn tinh khiết) sau quá trình lên men vừa tránh oxi hóa cồn vừa tăng độ cồn cho rượu bắp. Lọc: lọc hỗn hợp lên men qua vải lọc nhằm thu hồi dung dịch rượu, có thể ép chặt khối bã để thu được nhiều dịch hơn. Quá trình lọc ngoài tác dụng tách riêng phần bã bắp, giúp làm tăng độ trong, tạo giá trị cảm quan cao cho sản phẩm dạng trong, còn có tác dụng loại bỏ bớt những thành phần có hại như những hợp chất phụ tạo ra trong quá trình lên men và những vi sinh vật nhiễm vào sản phẩm trong quá trình lên men, đây là những thành phần có ảnh hưởng không tốt đến chất lượng sản phẩm cũng như đối với người tiêu dùng. Bã bắp có thể dùng làm thức ăn cho gia súc. Phối trộn: phối trộn các thành phần khác như sữa bột, cồn thực phẩm, đường, phụ gia để tạo vị và trạng thái tốt nhất cho sản phẩm. Sử dụng thiết bị đồng hóa để quá trình phối trộn tối ưu. Đồng hóa: tiến hành đồng hóa với P= 100 – 250 bar trong 10 phút để dịch sữa và rượu bắp cùng với gelatin tạo cấu trúc đồng nhất. Thành phẩm: rượu bắp sữa có mùi thơm đặc trưng của bắp, màu vàng sữa của bắp và vị chua ngọt của rượu bắp. 4.1.Kết luận: Rượu bắp sữa là sản phẩm được phối trộn giữa dịch sữa bột và rượu bắp, là một quá trình phức tạp trong đó nguyên liệu, nhiệt độ, độ ẩm, tỷ lệ lượng giống sử dụng, thời gian lên men đều ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm. Qua các thí nghiệm khảo sát một vài yếu tố ảnh hưởng đến sản phẩm đã được tiến hành có thể kết luận về sản phẩm rượu bắp sữa: Nguyên liệu là bắp đường được trồng tại Việt Nam, sữa bột gầy của công ty sữa Tín Phi cùng với rượu gạo của nhà máy rượu Bình Tây. Sử dụng men ngọt được sản xuất theo phương pháp truyền thống, mua ở chợ Nguyễn Tri Phương. Độ ẩm của bắp trước khi gieo men là 77,4% Nhiệt độ lên men ở 28oC. Thời gian lên men là 120 giờ ( 5 ngày) sau khi gieo men. Lượng giống nấm men sử dụng là 20%. Lượng gelatin vào sản phẩm là 1%. Tỷ lệ dịch sữa bột trong sản phẩm là 30%. 4.2.Kiến nghị Do thời gian thực hiện đề tài ngắn và thiết bị dụng cụ cũng như phòng thí nghiệm còn thiếu thốn nên đề tài còn nhiều sai sót. Bên cạnh đó, kiến thức em còn hạn hẹp, chưa đủ điều kiện để tìm hiểu sâu hơn các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men rượu bắp. Tuy nhiên, bài luận văn này cũng nêu lên được bước đầu nghiên cứu sản phẩm mới rượu bắp sữa phù hợp với phụ nữ Việt Nam. Sau thời gian ngiên cứu, chúng tôi có một số kiến nghị như sau: Khảo sát thêm yếu tố nhiệt độ ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm ở những nhiệt độ khác nhau như khảo sát nhiệt độ lên men 25 – 350C. Khảo sát thời gian lên men phụ để sản phẩm ổn định chất lượng. Xác định các chỉ tiêu độc tố có thể có trong sản phẩm như: hàm lượng aldehyde, hàm lượng methanol, hàm lượng furfurol, các chỉ tiêu vi sinh vật… Phụ lục A/Xác định hàm ẩm của bắp trước khi gieo men bằng phương pháp sấy khô Nguyên tắc: Dùng sức nóng làm bay hơi hết hơi nước trong mẫu. Cân trọng lượng mẫu trước và sau khi sấy khô, từ đó tính ra phần trăm nước có trong thực phẩm. Tiến hành: Chén sứ rửa sạch, sấy đến khi khối lượng không đổi, ta được m0. Cho khoảng 5 – 10g mẫu vật vào chén sứ, đem cân ta được m1. Cho tất cả vào tủ sấy, điều chỉnh nhiệt độ khoảng 1050C, sấy đến khi khối lượng không đổi. Sấy xong làm nguội ở bình hút ẩm và cân ta được m2. Công thức tính hàm ẩm: W= (m1 – m2) *100/ (m1 - m0) Trong đó: m0: khối lượng chén sứ (g). m1: khối lượng chén sứ và mẫu trước khi sấy (g). m2: khối lượng chén sứ và mẫu sau khi sấy (g). Vậy hàm ẩm của cơ chất là: W= (31,85 – 26,61)*100/ (31,85 – 25,85) = 77,40% B/Xác định hàm lượng tinh bột ban đầu có trong bắp trước khi gieo men bằng phương pháp thủy phân bằng HCl Cách tiến hành ở mục 2.1.2 Khối lượng tinh bột = khối lượng sau sấy – khối lượng giấy lọc = 1,56 – 0,84 = 0,71g Khối lượng tinh bột/100g mẫu = 0,71*2*50 = 71g. Bảng 01: Density of ethanol at various temperatures( kg/l hoặc g/cm3) % wtethanol % volethanol gramsethanolper 100 cc15,56°C d 25°C/4°C d 30°C/4°C d 20°C/20°C d 25°C/25°C freezingtemp. 0,0 0,0 0,0 0,99708 0,99568 1,00000 1,00000 0°C 1,0 1,252 1 0,99520 0,99379 0,99813 0,99811 2,0 2,504 0,99336 0,99194 0,99629 0,99627 2,5 3,13 0,99537 –1°C 3,0 3,756 0,99157 0,99014 0,99451 0,99447 4,0 5,00 3,97 0,98984 0,98839 0,99279 0,99274 4,8 6,00 4,76 0,99140 –2°C 5,0 6,25 0,98817 0,98670 0,99113 0,99106 5,05 6,30 5,00 0,99098 6,0 7,485 0,98656 0,98507 0,98955 0,98945 6,8 8,47 0,98819 –3°C 7,0 8,719 0,98500 0,98347 0,98802 0,98788 8,0 9,965 0,98346 0,98189 0,98653 0,98634 9,0 11,210 0,98193 0,98031 0,98505 0,98481 10,0 12,40 9,84 0,98043 0,97575 0,98361 0,98330 11,0 13,64 0,97897 0,97723 0,98221 0,98184 11,3 14,0 11,11 0,98141 –5°C 12,0 0,97753 0,97573 0,98084 0,98039 13,0 0,97611 0,97424 0,97948 0,97897 Bảng 02: Bảng Anova về mật độ tế bào đếm được với α = 0,05 Anova: Two-Factor Without Replication ANOVA Source of Variation SS df MS F P-value F crit Rows 27136,23 7 3876,60 243,75 1,19E-18 2,49 Columns 599,14 3 199,71 12,58 6,41E-05 3,07 Error 333,99 21 15,90 Total 28069,36 31 Bảng 03: Bảng Anova về hàm lượng cồn sinh ra với α = 0,05 Anova: Two-Factor Without Replication ANOVA Source of Variation SS df MS F P-value F crit Rows 139,53 6 23,26 336,51 1,78E-17 2,66 Columns 2,36 3 0,79 11,38 0,000204 3,16 Error 1,24 18 0,07 Total 143,13 27 Bảng 04: Bảng Anova về hàm lượng tinh bột còn lại trong cơ chất với α = 0,05 Anova: Two-Factor Without Replication ANOVA Source of Variation SS df MS F P-value F crit Rows 7371,50 7 1053,07 111,55 3,64E-15 2,49 Columns 694,25 3 231,42 24,51 4,66E-07 3,07 Error 198,25 21 9,44 Total 8264,00 31 Bảng 05: Giá trị tới hạn của phép thử so hàng ở mức ý nghĩa α= 5%(tra bảng phụ lục 8 sách Kỹ thuật phân tích cảm quan thực phẩm)Tài liệu tham khảo Hà Duyên Tư – Kỹ thuật phân tích cảm quan thực phẩn – NXB Khoa học và kỹ thuật Hà Nội. Lâm Thị Kim Châu, Văn Đức Chín, Ngô Đại Nghiệp – Thực tập lớn sinh hóa – NXB Đại học Quốc Gia Thành phố Hồ Chí Minh, 2004. Lê Ngọc Tú – Hóa sinh công nghiệp – NXB Khoa học và kỹ thuật Hà Nội. Nguyễn Lân Dũng – Vi sinh vật học – NXB Giáo dục. Nguyễn Đức Lượng – Công nghệ vi sinh vật 1,2,3 – Trường Đại học Bách Khoa Hồ Chí Minh. Quy định danh mục các chất phụ gia được phép sử dụng trong thực phẩm – Bộ Y tế - Cục quản lý chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm – Hà Nội, 2001. Reinhard Schrieber, Herbert Gareis, Gelatine Handbook: Theory and Industrial Practice, WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA( 2007). Rose, P.I. Gelatin in encyclopedia of Polymer Scinece and engineering, volume 2, Wiley & Sons (1987). Trần Linh Thước – Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mỹ phẩm – NXB Giáo dục, 2007. Báo nông thôn ngày nay, 25/06/2005.