Luận văn Nghiên cứu quy trình xác định dư lượng ciprofloxacin và enprofloxacin trong thực phẩm bằng phương pháp hplc-Ms/ms

Luận án thạc sĩ khoa học – Hóa học NGUYỄN THỊ THANH NGA Trang 3 Chương 1: Tổng quan 1.1. Đôi nét về họ fluoroquinolone[ 1,7, 8] - Quinolone là một kháng sinh được sử dụng rộng rãi trong việc điều trị nhiễm trùng ở người và động vật. Mục tiêu chính của chúng là vi khuẩn the bacterial enzyme DNA gyrase hay topoisomerase II. Quinolone có thành phần hóa học là dẫn suất của acid nalidixic. Dựa trên phổ kháng khuẩn của nó, quinolone được chia thành nhiều thế hệ như: Quinolone thế hệ thứ nhất: cinoxacin, flumequine, nalidixic acid, oxilinic, .. Quinolone thế hệ thứ hai: ciprofloxacin., enoxacin, fleroxacin, lomefloxacin… Quinolone thế hệ thứ ba: balofloxacin, gatifloxacin, grepafloxacin… Quinolone thế hệ thứ tư: garenoxacin, clinafloxacin, gemifloxacin… - Fluoroquinolone là một nhóm kháng sinh thuộc họ quinolone trong đó có một nguyên tử F gắn ở vị trí số 6 của hệ thống trung tâm. Cả Quinolones và Fluoroquinolones đều là thuốc kháng sinh có khả năng giết chết vi khuẩn. 1.1.1 Công thức cấu tạo: Công thức cấu tạo chung của nhóm quinolone là hợp chất vòng thơm có chứa N, vị trí thứ 4 có gắn nhóm ketone, vị trí thứ 3 có gắn nhóm carboxylic. Các dẫn suất của quinolone gồm những hợp chất mà: Vị trí 1: có thể gắn thêm nhóm alkyl hoặc aryl; Vị trí 6: có thể gắn thêm F; Vị trí 2, 6, 8 có thể gắn thêm một nguyên tử N H1.1 Cấu trúc cơ bản của nhóm quinolone Acid nalidixic Cấu trúc cơ bản của nhóm quinolone Luận án thạc sĩ khoa học – Hóa học NGUYỄN THỊ THANH NGA Trang 4 1.1.2. Tính chất acid - base nhóm quinolone: Quinolone có một nhóm carboxylic ở vị trí số 3 nên đây là một hợp chất có tính acid. Một số quinolone có chứa thêm nhóm amine khác nên có thêm tính base. Dựa vào pKa có thể chia nhóm quinolone thành hai loại: Acidic quinolone (AQ) và Piperazinyl quinolone (PQ) - Acidic quinolone (AQ): chỉ có một giá trị pKa thuộc khoảng 6.0 đến 6.9. Trong nước chúng tồn tại ở dạng trung hòa hoặc dạng anion. Thường AQ gồm những quinolone thuộc thế hệ thứ nhất. H1.2 Cân bằng acid base của nhóm Acidic quinolone - Piperazinyl quinolone (PQ): có hai giá trị pKa, pKa1 khoảng 5.5 – 6.6 và pKa2 khoảng 7.2 - 8.9. Trong nước chúng có thể tồn tại ở ba dạng khác nhau: dạng cation, dạng trung hòa và dạng anion; một số PQ là Danofloxacin, Difloxacin, Norfloxacin, Ofloxacin, Benofloxacin, Marbofloxacin, Pipemidic acid H1.3. Cân bằng acid base của nhóm Piperazinyl quinolone 1.1.3. Ciprofloxacin: Ciprofloxacin là kháng sinh thuộc nhóm fluoroquinolone, loại PQ, có thể chống vi khuẩn gram dương và gram âm. Luận án thạc sĩ khoa học – Hóa học NGUYỄN THỊ THANH NGA Trang 5 Tên gọi: Công thức hóa học: C17H18FN3O3 Trọng lượng phân tử: 331.35 g/mol Nhiệt độ nóng chảy: 318-320oC H1.4. Công thức cấu tạo của Ciprofloxacin Tính chất: là bột kết tinh màu vàng nhạt, tan một phần trong nước, tan rất ít trong ethanol, methylene chloride. Tan tốt trong dung dịch acid acetic loãng, có hai giá trị pKa là 6.0 và 8.8 1.1.4. Enrofloxacin: Enrofloxacin là kháng sinh thuộc nhóm fluoroquinolone, loại PQ, có thể chống vi khuẩn gram dương và gram âm. Tên gọi: Công thức hóa học: C19H22FN3O3 Trọng lượng phân tử: 359.4 g/mol Nhiệt độ nóng chảy: 219-221oC H1.5. Công thức cấu tạo của Enrofloxacin Luận án thạc sĩ khoa học – Hóa học NGUYỄN THỊ THANH NGA Trang 6 Tính chất: là tinh thể màu vàng nhạt, tan nhẹ một phần trong nước ở pH = 7, có hai giá trị pKa: khoảng 5 và 8-9 1.1.5. Nguồn gốc của Ciprofloxacin và Enrofloxacin trong thực phẩm: Ciprofloxacin và Enrofloxacin được đưa vào thịt gà, cá…dưới dạng nguyên liệu thức ăn chăn nuôi, hoặc do người chăn nuôi trộn vào thức ăn gia súc, gia cầm, hoặc cho vào môi trường sống của các động vật thủy sản. Khi động vật ăn, hoặc sống trong môi trường đấy hoặc tiêm để chữa bệnh thì kháng sinh sẽ xâm nhập vào cơ thể. 1.1.6. Ứng dụng và ảnh hưởng của Ciprofloxacin và Enrofloxacin Ciprofloxacin và Enrofloxacin được dùng làm kháng sinh cho người và động vật. Hai loại kháng sinh này được con người sử dụng khi mắc các chứng bệnh về đường hô hấp, nhiễm trùng huyết xương khớp, viêm nhiễm cơ quan sinh dục… Nhóm fluoroquinolone nói chung (Ciprofloxacin, Enrofloxacin nói riêng) là nhóm kháng sinh có độc tính cao, chỉ sử dụng với liều nhất định, được quy định rất chặt chẽ và đều thuộc nhóm kháng sinh hạn chế sử dụng đối với trẻ em vì ảnh hưởng đến quá trình tăng trưởng. Nhóm fluoroquinolone nếu dùng liều cao và kéo dài sẽ làm ảnh hưởng trên sụn đầu xương và quá trình tăng trưởng của bé chậm lại, bị lùn.(theo bác sĩ Đào Thị Yến Phi- Trung tâm đào tạo –bồi dưỡng cán bộ y tế Tp. HCM) Trường hợp tồn dư 5ppb fluoroquinolone, nếu một người ăn trung bình 150-200g thịt/ngày thì lượng fluoroquinolone đưa vào cơ thể khoảng 2µg/ngày. Với lượng này sẽ không gây độc tính ngay, nhưng nếu tích lũy lâu dài hoặc ăn quá nhiều sẽ bị tác hại. Ngoài ra, việc sử dụng tràn lan cho vật nuôi các loại kháng sinh trong danh mục thuốc dùng cho người hoàn toàn có khả năng dẫn tới kháng thuốc ở vi khuẩn. Như vậy sẽ ảnh hưởng đến khả năng điều trị các bệnh lý nhiễm trùng trong cộng đồng loài người. 1.1.7. Giới hạn cho phép của dư lượng thuốc kháng sinh [1]: Ở Việt Nam, dư lượng tối đa của ciprofloxacin và enrofloxacin là 100ppb (quyết định 07/2005/QĐ-BTS ngày 24/2/2005 của Bộ Trưởng Bộ thủy sản). Tổ chức EU có quy định MRLs cho quinolone trong các mô động vật và sữa. Tuy nhiên lại cấm sử dụng trong gà đẻ vì dư lượng kháng sinh có thể chuyển vào trong trứng. Mỹ và các nước Bắc Mỹ: dư lượng tối đa là 0 Luận án thạc sĩ khoa học – Hóa học NGUYỄN THỊ THANH NGA Trang 7 H1.6. Danh mục hóa chất kháng sinh bị hạn chế sử dụng theo quyết định 07/2005/QĐ-BTS 1.2. Các phương pháp xác định Dựa vào cấu trúc và tính chất của Ciprofloxacin và Enrofloxacin, có nhiều phương pháp xác định hàm lượng trong nền mẫu thực phẩm như phương pháp so màu, sắc kí lỏng hiệu năng cao HPLC với các đầu dò khác nhau như: đầu dò huỳnh quang, đầu dò photodiode array, đầu dò UV… 1.2.1. Phương pháp trắc quang [9] Nguyên tắc: Dùng một số ion kim loại như Fe(III), Cu(II), Cd(II), Mn(II)…để tạo phức với nhóm quionlone. Đo cường độ bước sóng của phức tạo thành bằng máy trắc quang. Lập đồ thị biểu diễn cường độ hấp thu của chất tại bước sóng đó theo những nồng độ khác nhau. H1.7. Phức tạo thành giữa Fe(III) với Ciprofloxacin (λmax = 430nm). Ngoài kim loại có thể dùng Chloranillic acid, tetracyanoethylene để tạo hình thành phức chất chuyển điện tích. Phức của Chloranillic acid có bước sóng λmax = 520nm. Phức của tetracyanoethylene hình thành với Ciprofloxacin có λmax = 335nm, với Luận án thạc sĩ khoa học – Hóa học NGUYỄN THỊ THANH NGA Trang 8 Enrofloxacin là λmax = 290 nm. Quy trình này được ứng dụng trong việc xác định thuốc với độ chính xác 99.91% đến 100.40% tùy theo từng chất. Ưu điểm: Phương pháp này sử dụng thiết bị đơn giản, dễ vận hành, chi phí thấp nên được dùng để kiểm tra độ tinh khiết của chất hữu cơ. Nhược điểm: Độ chọn lọc không cao, độ nhạy kém, phân tích các chất ở nồng độ cao 1.2.2. Phương pháp HPLC – đầu dò UV và DAD [ 10,11,12,13,14, 15 ] Nguyên tắc: Do cấu trúc của Ciprofloxacin và Enrofloxacin có khả năng hấp thu bước sóng tử ngoại nên có thể dùng phương pháp HPLC - đầu dò UV ở bước sóng 275nm. Đường chuẩn: 10Æ 1000 ng/g LOD: 10 ng/g cho cả hai chất. 1.2.3. Phương pháp HPLC – đầu dò huỳnh quang[ 8,15,16, 17, 18,19,20,21,22,23,24,25,26,27] Nguyên tắc: mẫu sẽ được kích thích với nguồn sáng có bước sóng là 276nm, sau đó sẽ phát xạ ra bước sóng 442nm; đo cường độ chất ở bước sóng này theo nồng độ, từ đó tính nồng độ của mẫu. Đường chuẩn: Ciprofloxacin, Enrofloxacin: 1 - 500 ng/g Giới hạn phát hiện: Ciprofloxacin: 0.56ng/g; Enofloxacin: 0.12 ng/g Bước sóng: λ kích thích: 276nm - 295nm; λ phát xạ: 442nm - 500nm; Ưu điểm: Phương pháp này có độ nhạy và độ chọn lọc cao, phân tích được các chất có nồng độ bé. Do vậy, phương pháp này được nghiên cứu rất nhiều và được lựa chọn làm phương pháp chính trong tiêu chuẩn của Châu Âu 1.2.4. Phương pháp HPLC – đầu dò MS [1,2,10,13,29] Nguyên tắc: Dựa trên ái lực của các cấu tử với pha tĩnh (thường là chất rắn hoặc chất lỏng) và pha động mà mỗi cấu tử sẽ được rửa giải ra khỏi cột theo các thứ tự khác nhau. Cấu tử ra khỏi cột sẽ được đưa vào đầu do MS và ở đây cấu tử ion hóa, phân mảnh, được phát hiện dựa vào cường độ tỉ lệ m/z. Trên cở sở đó, đầu dò MS cho phép nhận danh và định lượng một cách rõ ràng về một hợp chất cụ thể. Với đầu dò MS nhóm fluoroquinolones có khuynh hướng tạo thành mảnh mẹ và những mảnh con: [MH-H2O]+; [MH-CO2]+; [MH-H2O-NR]+; [MH-CO2-NR]+ Luận án thạc sĩ khoa học – Hóa học NGUYỄN THỊ THANH NGA Trang 9 Kí hiệu Ý nghĩa [MH-H2O]+ M + 1(H) – 18(H2O) [MH-CO2]+ M + 1(H) – 44(CO2) [MH-H2O-NR]+ M + 1(H) – 18(H2O) – M(NR) [MH-CO2-NR]+ M + 1(H) – 44(CO2) – M(NR) Phương pháp này có độ nhạy và độ chọn lọc rất cao. Giới hạn phát hiện: Ciprofloxacin: 0.1ng/g; Enrofloxacin: 0.2ng/g; Đường tuyến tính:Ciprofloxacin: 3-30ng/g; Enprofloxacin: 3-30ng/g; Năng lượng đập mảnh của : Ciprofloxacin: 18 eV; Enprofloxacin: 20eV; Æ Phương pháp này rất phù hợp cho việc phân tích dư lượng chất kháng sinh trong thực phẩm. 1.2.5 Điều kiện xử lí mẫu và làm sạch mẫu [ 8,14,19,30,31]: Theo các tài liệu tham khảo, ciprofloxacin và enrofloxacin được nghiên cứu trên nhiều loại mẫu trứng, thịt heo, gan heo, nước bề mặt ……Tùy theo từng loại mẫu sẽ có cách xử lí mẫu cụ thể. Xu hướng xử lí mẫu chính là hoạt chất được chiết với các dung môi hữu cơ như ethanol, acetonitril, trichloroacetic acid, dichloromethane hoặc hỗn hợp acetic acid, phosphoric acid, dung dịch NH3 (lưu ý cần thận trọng lựa chọn dung môi chiết khi phân tích với đầu dò MS). Sau đó chất phân tích sẽ được tách trên các cột SPE. Các loại cột SPE thường dùng là cột C18, cột trao đổi cation SCX, cột trao đổi anion SAX. H1.8.Công thức cột SCX Luận án thạc sĩ khoa học – Hóa học NGUYỄN THỊ THANH NGA Trang 10 Hiện nay có xu hướng mới là sử dụng cột imprint polymer: Người ta sẽ tạo màng polymer có cấu trúc lỗ rỗng vừa đủ bằng kích thước của chất phân tích bằng cách trộn hỗn hợp 1.0nmol norfloxacin 8.0 mmol 2-hydroxyethyl methacrylate, ethylen glycol dimethaacrylate, α,α’-azobis isobutyronitrile trong dung môi MeOH-H2O, sau đó polymer hóa, rửa norfloxacin ra khỏi màng. (norfloxacin hiện diện với vai trò là chất tạm thời)[6,14] 1.3. Đôi nét về phương pháp sắc kí – sắc kí lỏng hiệu năng cao HPLC 1.3.1. Định nghĩa: Sắc kí là quá trình tách liên tục từng vi phân hỗn hợp các chất do sự phân bố không đồng đều của chúng giữa pha tĩnh và pha động khi cho pha động đi xuyên qua pha tĩnh. Sắc kí là một trong những phương pháp cho hiệu quả cao trong việc sử dụng để định tính và định lượng hỗn hợp nhiều cấu tử. 1.3.2. Một số đại lượng cơ bản của sắc kí: 1.3.2.1. Hệ số phân bố: Cân bằng của một cấu tử X bất kì trong hệ sắc kí được mô tả theo phương trình sau: Xpha động Xpha tĩnh Hằng số cân bằng K của cân bằng này được gọi là hệ số phân bố và được tính: Với Cs: nồng độ cấu tử trong pha tĩnh; CM: nồng độ cấu tử trong pha động. Hệ số K tùy thuộc vào bản chất của pha tĩnh, pha động và chất cần phân tích và nhiệt độ 1.3.2.2. Thời gian lưu: tR thời gian lưu của một cấu tử từ khi vào cột đến khí tách ra ngoài cột tO thời gian để một chất nào đó không có ái lực với pha tĩnh đi qua cột (thời gian lưu chết). t’R thời gian lưu hiệu chỉnh của một cấu tử t’R = tR -tO Cs K = CM Luận án thạc sĩ khoa học – Hóa học NGUYỄN THỊ THANH NGA Trang 11 H1.9: Thời gian lưu của cấu tử phân tích. 1.3.2.3. Hệ số chứa (the capacity factor): Trong đó: k’X là hệ số chứa. KX là hệ số phân bố của cấu tử X tR, tO là các giá trị nhận được từ sắc kí đồ. Khi hệ số chứa của một cấu tử < < 1 Æ quá trình rửa giải xảy ra quá nhanh. Khi hệ số chứa nằm trong khoảng từ 20 đến 30 Æ thời gian rửa giải quá dài. Giá trị tối ưu trong quá trình tách các cấu tử trong khoảng 1-5. 1.3.2.4. Hệ số chọn lọc α: là đại lượng đặc trưng cho khả năng phân tách đối với các cấu tử khác nhau trong hỗn hợp chất khảo sát. α càng lớn, khả năng tách càng cao. Để hai chất tách khỏi nhau, thường α > 1. Khi α = 1 hai chất không thể tách riêng được C(nồng độ) t (thời gian) tR t’R tO Luận án thạc sĩ khoa học – Hóa học NGUYỄN THỊ THANH NGA Trang 12 1.3.2.5. Độ phân giải của cột: Là đại lượng đặc trưng cho khả năng tách hai cấu tử ra khỏi nhau. Độ phân giải của cột được tính theo công thức: A và B là hai cấu tử cần tách khỏi nhau. ∆tR là khoảng cách giữa hai peak . Rs ≤ 0.75 : hai peak không tách được. Rs = 1 : hai peak chồng lập nhau khoảng 4%. Rs ≥ 1.5: hai peak tách hoàn toàn ra khỏi nhau. 1.3.2.6. Hiệu năng của cột sắc kí: Là đại lượng đặc trưng cho khả năng tách mũi sắc kí của các cấu tử trên cùng một cột. Số đĩa lí thuyết N càng lớn, hiệu năng tách càng cao. Số đĩa lí thuyết có thể được tính theo công thức: hay: W1/2 bề rộng của peak ở giữa chiều cao 1.3.3. Phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) Ưu điểm: HPLC có khả năng tách và định lượng đồng thời các chất có độ phân cực gần nhau. Vì vậy có thể tách được các đồng phân và đồng đẳng của nhau. Các đầu dò trong HPLC có độ nhạy cao (detector UV 10-9g; detector huỳnh quanh và điện hóa 10-12g) Luận án thạc sĩ khoa học – Hóa học NGUYỄN THỊ THANH NGA Trang 13 cho phép xác định đến nồng độ cỡ ppb, ppt (đầu dò MS).Phương pháp này cho độ tách tốt (các chất nhồi trong cột có kích thước rất nhỏ), cột tách có thể sử dụng nhiều lần; khả năng thu hồi mẫu cao vì hầu hết các detector không phá hủy mẫu; lượng mẫu cho phép bơm vào cột lớn (lớn hơn so với phương pháp sắc kí khí).Tính đến nay, số lượng các chất được xác định trên HPLC là rất lớn. Nhược điểm:Thiết bị đắt tiền; Thời gian làm sạch và ổn định sau mỗi lần chạy lâu. 1.3.3.1 Sơ đồ cấu tạo chung của hệ thống sắc kí lỏng: Đối với một thiết bị HPLC thông thường phải có các bộ phận chính sau: hệ thống pha động, bơm cao áp, cột tách, detector, bộ ghi. H1.10. Sơ đồ cấu tạo chung của một hệ sắc kí lỏng 1.3.3.2. Hệ thống pha động : Hệ thống pha động gồm các bình chứa các dung môi, thường có 4 kênh A,B,C, D và có thể có một chai để rửa kim tiêm trong hệ thống bơm tự động (đối với hệ thống sắc kí lỏng của Thermo, còn đối với hệ thống của Agilent thì không có). Pha động thường là các dung môi MeOH, ACN, isopropyanol… đối với cột pha đảo hoặc là dung môi dichlorometan, chloroform, hexane đối với cột pha thường. Pha động sẽ vận chuyển và tương tác với chất cần phân tích, do đó chúng giữ vai trò quan trọng trọng việc tách các chất phân tích. Yêu cầu của pha động: phải có độ tinh khiết cao, phải loại bỏ các khí hòa tan, để tránh hiện tượng tạo bọt khí làm tốc độ dòng không ổn định. Đối với hệ thống HPLC- MS/MS chỉ được phép sử dụng pha động là các dung môi dễ bay hơi (tránh các dung môi không bay hơi như đệm phosphate, borate, citrate…) Luận án thạc sĩ khoa học – Hóa học NGUYỄN THỊ THANH NGA Trang 14 1.3.3.3. Cột sắc kí: Cột sắc kí đóng vai trò quan trọng trong việc tách các chất cần phân tích, nguyên liệu chủ yếu làm cột là thép không rỉ, chiều dài cột từ 1-30cm, kích thước hạt cỡ 3-15µm Cột C18: là những hạt silica được phủ lên lớp hydrocarbon có mạch dài 18 C Yêu cầu cột: cột phải trơ, bền hóa học, bền nhiệt, chịu được acid, base ở khoảng pH rộng, ít bị ảnh hưởng của nhóm silanol Si-OH và chịu được áp suất cao. Cột có thể hư hỏng ngay cả khi sử dụng cột nhồi rất tốt từ các nhà sản xuất có tiếng như Water, Agilent, Alltech, HP, Phenomenex… Để kéo dài tuổi thọ của cột, chúng ta nên: + Tránh những thay đổi đột ngột điều kiện thí nghiệm(thay đổi tốc độ dòng, thay đổi pha động rất khác với pha động trước, thay đổi nhiệt độ, không làm rớt…) + Sử dụng cột bảo vệ. + Rửa cột kỹ sau khi sử dụng (nếu dùng đệm phải rửa thật kỹ, tránh hiện tượng lên men trong cột (ví dụ KH2PO4 – môi trường dinh dưỡng tốt). + Lưu giữ pha tĩnh trong acetonitrile, tránh lưu trong các alcohol như methanol (do có thể lên men yếm khí) + Luôn luôn đậy nắp kỹ để tránh dung môi bay hơi làm khô cột 1.3.3.4. Bơm cao áp: - Vai trò: tạo áp lực giúp pha động di chuyển trong hệ thống, tạo dòng ổn định ngay cả khi thành phần pha động thay đổi. - Áp lực bơm sử dụng tùy thuộc vào tốc độ dòng, độ nhớt pha động, kích thước pha tĩnh. - Có hai chế độ bơm: Chế độ đẳng dòng: thành phần pha động không thay đổi có nhược điểm là thời gian phân tích kéo dài, độ phân giải kém. Chế độ gradient dòng: thành phần pha động thay đổi có ưu điểm là thời gian phân tích ngắn, độ phân giải tốt. Tuy nhiên đòi hỏi bơm phải rất tốt. Luận án thạc sĩ khoa học – Hóa học NGUYỄN THỊ THANH NGA Trang 15 1.3.3.5. Bộ phận tiêm mẫu: Phổ biến nhất là bộ tiêm mẫu gồm một van 6 cổng có gắn vòng chứa mẫu: a)Tiêm mẫu vào b) Phần dư bị thải ra ngoài H1.11. Cấu tạo của vòng loop Yêu cầu đối với bộ tiêm mẫu: thể tích cho vào phải đều, độ lặp lại phải cao. 1.3.3.6. Đầu dò (detector): là bộ phận phát hiện của chất cần phân tích khi nó vừa ra khỏi cột. Dựa vào tích chất của các chất cần phân tích, có thể chia đầu dò ra làm nhiều loại như: + Detector UV, UV/VIS, diode array(DAD) + Đầu dò huỳnh quang(detector fluoresence) + Detetor điện hóa. + Dectector khối phổ MS. Nhiệm vụ của đầu dò khối phổ: có hai nhiệm vụ chính + Nhận danh hóa chất: Khi ghép với thiết bị sắc kí lỏng thì hóa chất được xác định bằng một peak trên sắc kí đồ ở thời gian lưu xác định đặc trưng cho hóa chất(giống các đầu dò khác). Đầu dò khối phổ còn nhận danh hóa chất thông qua khối phổ tương ứng của hóa chất hoặc khối phổ biểu diễn cường độ ion sinh ra từ một ion nhất định của hóa chất. Luận án thạc sĩ khoa học – Hóa học NGUYỄN THỊ THANH NGA Trang 16 Theo chỉ thị của cộng đồng Châu Âu 2002/657/EC, bắt buộc phải dùng phương pháp phổ để phân tích khẳng định các chất bị cấm tuyệt đối, nghĩa là áp dụng theo quy tắc 4 điểm nhận danh (identification point kí hiệu là IP) và chỉ được quyền kết hợp tối đa ba kỹ thuật. Mối liên hệ giữa kỹ thuật khối phổ và điểm nhận danh đạt được: Kỹ thuật khối phổ Điểm nhận danh đạt được cho mỗi ion Độ phân giải thấp Khối phổ độ phân giải thấp LRMS 1.0 Ion mẹ đem phân mảnh (precursor) 1.0 Ion con(transion) 1.5 Độ phân giải cao Khối phổ độ phân giải cao HRMS 2.0 Ion mẹ đem phân mảnh (precursor) 2.0 Ion con(transion) 2.5 Một số ví dụ về cách tính điểm nhận danh khi kết hợp các kỹ thuật: Kỹ thuật Số ion Các IP GC-MS (CI hoặc EI) N N GC-MS (CI và EI) 2(CI) và 2(EI) 4 GC-MS (CI hoặc EI) 2 dẫn xuất 2 dẫn xuất A và 2 dẫn xuất B 4 GC-MS2 1 ion mẹ, 2 ion con 4 GC-MS2 2 ion mẹ, 2 ion con (mỗi ion mẹ 1 ion con) 5 GC-MS và LC-MS 2 ion (GC)+2 ion(LC) 4 LC-MS N N LC-MS2 1 ion mẹ, 2 ion con 4 LC-MS2 2 ion mẹ, 2 ion con (mỗi ion mẹ 1 ion con) 5 + Định lượng nồng độ của hóa chất trong mẫu. Luận án thạc sĩ khoa học – Hóa học NGUYỄN THỊ THANH NGA Trang 17 1.3.4. Đầu dò khối phổ – Đầu dò MS ba tứ cực Các bộ phận chính của Detector MS là: bộ tạo ion(ionizer); bộ tách khối(mass analyser); bộ dò ion (detector). 1.3.4.1. Bộ tạo ion: Với hệ thống sắc kí lỏng MS - ba tứ cực của Agilent có 4 nguồn tạo ion đó là: ESI , APCI, APPI, MMI Trong nội dung của bài này, chúng tôi chỉ đề cập đến hai kỹ thuật APCI và ESI. a) Kỹ thuật APCI: Theo hình H1.12, phân tử phân tích và dung môi được đi qua một lò sấy, hóa hơi, các phân tử hơi được khí N2 phun ra và đi vào vùng phóng điện (corona discharge) –vùng này được tạo ra nhờ cây kim mang điện rất lớn (corona discharge needle). Hiện tượng ion hóa xảy ra. H1.12. Sơ đồ kỹ thuật APCI của hãng Agilent. Cơ chế tạo ion dương: N2 + e- Æ N2+. + 2e- H2O + e- Æ H2O .+ +2 e- H2O + H2O .+ Æ H3O + + .OH (phản ứng ion phân tử). M + H3O + Æ MH+ + H2O (phản ứng ion phân tử). Luận án thạc sĩ khoa học – Hóa học NGUYỄN THỊ THANH NGA Trang 18 Tạo ion âm: với những phân tử có H di động, trong vùng phóng điện, có sự ion hóa của phân tử bằng cách mất đi H+, phần còn lại là một anion .OH + M -e- Æ (M-H)- + H2O b) Kỹ thuật phun ion ESI: Các phân tử hóa chất và dung môi khi ra khỏi cột sắc kí được đưa vào một ống mao quản bằng kim loại cao thế (3-5kV) và sau đó được phun mịn bằng khí N2 thoát ra chung quanh ống mao quản. Dưới tác dụng của điện thế cao, có sự tạo thành những hạt nhuyễn mang điện tích thoát ra từ đầu ống mao quản. Các phân tử dung môi từ từ bốc hơi, các hạt mang điện tích có thể tích nhỏ dần và do sự đẩy nhau giữa các điện tích cùng dấu, sẽ bể dần ra thành các hạt nhỏ mang điện tích. Sau đó, các ion dương hoặc âm tạo thành được đưa vào bộ phận tách ion qua một của rất nhỏ. Dung môi và khí N2 bị bơm chân không hút ra ngoài. Xem hình H1.13 Điện thế dương ở đầu kim được quyết định tùy chất khảo sát, điện thế ở đầu kim dương tạo ion dương, điện thế ở đầu kim âm tạo ion âm . Thông thường, các chất acid tạo ion âm ở pH cao, các chất có tính base tạo ion dương ở pH thấp. H1.13. Sơ đồ kỹ thuật phun ESI của máy Agilent Technologies 6410 Triple Quad LC/MS Luận án thạc sĩ khoa học – Hóa học NGUYỄN THỊ THANH NGA Trang 19 Với hệ thống máy Agilent Technologies 6410 Triple Quad LC/MS: dòng khí nitrogen được gia nhiệt thổi vào mẫu, làm bay hơi dung môi (những hạt trung hòa ) ra khỏi chất cần phân tích Æ làm tăng độ nhạy. Ngoài ra ống mao quản bằng thủy tinh sẽ tốt hơn ống mao quản bằng thep không gỉ do làm tăng khả năng loại ion và tăng lượng ion đi vào. Đặc điểm của hai kỹ thuật này: ESI APCI - Ion tạo trong pha dung dịch. - Thích hợp cho chất không bền nhiệt. - Thích hợp cho chất khá phân cực. - Thích hợp cho chất có phẩn tử khối lớn - Ion tạo trong pha hơi. - Thích hợp cho chất bền nhiệt. - Thích hợp cho chất kém phân cực. - Thích hợp cho chất có phẩn tử khối nhỏ. *Hệ thống HPLC cần hai dòng khí mang N2 để dưa mẫu vào đầu dò: một nguồn khí cung cấp cho dòng sheath gas, một nguồn cung cấp cho dòng nebulizing. . H1.14. Vị trí của các dòng khí trong đầu dò MS Bộ tạo khí Nitơ: Thiết bị LC/MS dùng khí nitơ như là khí purge gas trong giai đoạn tạo sương(nebulizer), do vậy đòi hỏi phải có nguồn cung cấp khí đặc biệt. Bộ tạo khí Parker Balston tạo khí bằng kỹ thuật màng, trong khi bộ tạo khí của Domnick Hunter sử dụng kỹ thuật hấp thụ cân bằng áp suất (PSA-presure swing adsorption). Cả hai loại trên đều có thể cung cấp khí Nitơ đạt yêu cầu của LC/MS. Trong đề tài này hệ thống HPLC sử dụng thiết bị sinh khí của Parker Balston, cho phép cung cấp nitơ với độ tinh khiết lớn hơn 99.5%, tốc độ dòng: 30l/phút; áp suất đầu ra 100psi. Luận án thạc sĩ khoa học – Hóa học NGUYỄN THỊ THANH NGA Trang 20 Đặc điểm của bộ sinh khí Parker Balston: - Dùng kỹ thuật màng. - Máy nén không khí gắn liền (built-in compressor). - Có thể điều khiển tốc độ dòng khi cần thiết. 1.3.4.2. Bộ tách khối: Hiện nay có ba kỹ thuật tách có thể thực hiện MS/MS: kỹ thuật bẫy ion và kỹ thuật ba tứ cực, kỹ thuật TOF. Trong đề tài này tôi sử dụng thiết bị có kỹ thuật ba tứ cực, gồm các bước sau: + Các ion được hình thành từ sự ion hóa phân tử hóa chất tạo nên khối phổ MS của hóa chất, tách ra và cô lập thành một loại ion nhất định. + Phân mảnh ion cô lập + Đưa những mảnh ion đó vào bộ dò detector để từ đó tạo ra khối phổ MS của các ion đã cô lập. Æ ta có khối phổ MS/MS. a) Bộ phân tích khối một tứ cực (single quadrupole): Cấu tạo của bộ phân tích khối một tứ cực được thể hiện trong hình H1.18, gồm 4 thanh được đặt song song với nhau, hai thanh đối diện được nối với điện và thế, bao gồm thành phần radiofrequency (RF) và direct-current (DC), Thành phần RF được đặt vào hai cặp lệch nhau 180o . Tại giá trị đặc biệt của các volt thế này, những ion có m/z bền sẽ đi xuyên qua các thanh tứ cực, tiến vào bộ dò ion. Những ion không bền sẽ lọt qua khoảng trống giữa các khe đi ra ngoài H1.15. Cấu hình của một tứ cực. Đối với bộ phân tích khối một tứ cực của hãng Agilent : ion sau khi bị ion hóa bởi nguồn ion hóa (orthogonal ion source) sẽ đi qua bốn thanh octopole và vào detector. Luận án thạc sĩ khoa học – Hóa học NGUYỄN THỊ THANH NGA Trang 21 H1.16. Sơ đồ cấu tạo của bộ phân tích khối một tứ cực. b) Bộ phân tích khối ba tứ cực (triple quadrupole – triple quad): gồm ba bộ quad nối trực tiếp với nhau hình H1.17, trong đó Q1 và Q3 có cấu trúc giống cấu hình của một tứ cực và chỉ đóng vai trò chọn lọc ion. Chỉ có ở Q2, các ion sẽ bị đập thành những ion nhỏ. Xem hình H1.18 Đường đi của ion cần phân tích được tóm tắt như sau: Sau khi các ion được hình thành và đi vào bộ tách khối, tại Q1: áp một thế cố định để chỉ những ion mẹ cần phân tích, mới đủ bền để đi thẳng tới Q2. Tại Q2: ion mẹ sẽ bị đập ra thành nhiều mảnh ion nhỏ.Tất cả các ion này được đưa vào Q3. Tại Q3: lại áp một thế xác định để chọn các ion con cần phân tích. a) Dạng đơn giản Luận án thạc sĩ khoa học – Hóa học NGUYỄN THỊ THANH NGA Trang 22 b) Ba tứ cực H1.17. Sơ đồ cấu tạo ba tứ cực của hãng Agilent H1.18. Sự phân mảnh diễn ra ở Q2 Nhận xét: + Khối phổ kế một tứ cực không thực hiện được kỹ thuật MS/MS chính qui như trường hợp ba tứ cực hay bẫy ion. + Khối phổ kế ba tứ cực thực hiện được rất tốt kỹ thuật MS/MS. Với các tiến triển của công nghệ và khoa học hiện nay, khối phổ kế ba tứ cực rất nhạy, vượt cả bẫy ion. Luận án thạc sĩ khoa học – Hóa học NGUYỄN THỊ THANH NGA Trang 23 1.3.4.3. Một số kỹ thuật scan trên thiết bị MS/MS ba tứ cực: Với cấu trúc của ba tứ cực cho phép ta ghi tín hiệu theo những chế độ khác nhau xem H1.19: Full scan SIM Product ion MRM H1.19. Khối phổ của chất phân tích ứng với từng giai đoạn trong bộ ba tứ cực + Full scan: Khi thao tác ở chế độ full scan này, chất phân tích sau khi qua cột, được ion hóa sẽ qua Q1 để loại các ion tạp; rồi đi qua Q2,Q3 (lúc này Q2,Q3 không hoạt động) rồi đi vào ion detetor. Æ đầu dò sẽ nhận tất cả các mảnh ion để cho khối phổ toàn ion của tất cả các chất trong quá trình phân tích. Thiết bị sẽ quét trong một khoảng khối lượng nhất định (ví dụ như 50 đến 300). + SIM (selected ion monitoring): Với kỹ thuật này, các ion sẽ qua Q1 để chọn ion của chất cần phân tích(thường là ion mẹ), rồi đi qua Q2,Q3 (lúc này Q2,Q3 cũng chỉ cho một hoặc một vài ion đặc trưng đi qua) rồi đi vào ion detetor. Æ đầu dò sẽ nhận một số mảnh ion đặc trưng của chất cần phân tích: + Product ion: Với kỹ thuật này, các ion sẽ qua Q1 để chọn ion của chất cần phân tích(thường là ion mẹ), rồi đi qua Q2. Tại Q2 ion mẹ sẽ được đập thành nhiều ion con. Các ion này đi qua Q3 rồi tiến thẳng đến ion detetor. Æ đầu dò sẽ cung cấp toàn bộ mảnh phổ của ion mẹ ban đầu. Thông thường người ta sẽ áp thế đập phá tại ion mẹ sao cho ion mẹ vẫn còn lại khoảng 10%. Luận án thạc sĩ khoa học – Hóa học NGUYỄN THỊ THANH NGA Trang 24 + MRM( multiple reaction monitoring): Tương tự như product ion, ion mẹ cũng được chọn lọc tại Q1, đập tại Q2, nhưng đến Q3 các ion này sẽ được loại hết chỉ giữ lại một loại ion con đặc trưng sinh ra từ ion mẹ. Nhận xét: + Kỹ thuật lấy sắc kí đồ toàn ion: - Kỹ thuật này thường được dùng để phát hiện, nhận danh các thành phần hóa chất trong một hỗn hợp hay xác định cấu trúc của một hợp chất chưa biết. - Chỉ dùng sắc kí đồ toàn ion để định lượng khi chất phân tích có thành phần tương đối lớn. - Không dùng sắc kí đồ toàn ion để định lượng vết như dư lượng kháng sinh trong thực phẩm, thủy hải sản. + SIM (selected ion monitoring): Với kỹ thuật này, tất cả ion đều bị loại, chỉ còn ion muốn định lượng tồn tại và đi vào ion detector để ghi nhận, những ion khác kể cả ion tạp đều bị loại nên dùng để định lượng trong phân tích dư lượng thuốc kháng sinh trong thực phẩm, thủy hải sản được. + MRM( multiple reaction monitoring): chọn một ion để định lượng và loại bỏ hết các ion còn lại, như vậy đã loại bỏ được hai lần nhiễu nền: S giảm, N giảm nhiều hơn nên tỉ lệ S/N tăng. việc định lượng bằng kỹ thuật này có độ chọn lọc tốt cho hợp chất. 1.3.4.4. Bộ dò ion (detector): Sau khi ion đã được tách sẽ đi vào detector. Hai “dynodes” là “orthogonal “ sẽ định hướng dòng gồm ion và phân tử trung hòa. Sự định hướng này sẽ làm giảm các phân tử trung hòa và tập trung các ion với các thế cao khác nhau.Những dynode này sẽ chuyển các ion thành những electron trước khi chúng va chạm với bộ phận multiplier. “off-axis” được thiết kế sao cho các phân tử trung hòa xuyên qua mà không đâm vào detetor. Bộ phận multipliercó tuổi thọ dài vì chỉ có các electron mới được phép và chạm với nó. Các ion không bao giờ va chạm đến bề mặt của nó.