Luận văn Nghiên cứu sản xuất cellulose vi khuẩn từ Acetobacter xylinum

cellulose ñöôïc toång hôïp bôûi A. xylinum Ku-1 khi söû duïng nguoàn cô chaát laø mannitol vaø arabitol cao hôn 3 laàn so vôùi khi söû duïng cô chaát laø glucose (Oikawa et al., 1995). Beân caïnh ñoù, fructose laïi laø nguoàn cô chaát thích hôïp nhaát cho A. xylinum BPR2001 toång hôïp cellulose (Matsuoka et al., 1996). Jonas & Farah (1998) ñaõ so saùnh löôïng cellulose toång hôïp bôûi vi khuaån A. xylinum IFO 13693 khi söû duïng caùc nguoàn carbon khaùc nhau, glucose ñöôïc choïn laøm nguoàn carbon ñeå ñoái chöùng (baûng 2.4). Baûng 2.4: AÛnh höôûng cuûa nguoàn carbon leân söï toång hôïp cellulose cuûa A. xylinum IFO 13693 (Jonas & Farah, 1998) Nguoàn Carbon Naêng suaát toång hôïp cellulose (%) Monosaccharides D-Glucose D-Fructose D-Galactose D-Xylose D-Arabinose D-Sorbose Disaccharides Lactose Malnose Sucrose Cellobiose Polysaccharides Tinh boät Ethanol Ethylene glycol Propylene glycol Glycerol D-Arabitol D-Mannitol Acid höõu cô Citrate L-Malate Succinate Nhöõng chaát khaùc Glucono-lactate O-methyl-glucose 100 92 15 11 14 11 16 7 33 7-11 18 4 1 8 93 620 380 20 15 12 62 0.5 Tyû leä dieän tích beà maët – theå tích (S/V) Bôûi vì söï hình thaønh cellulose dieãn ra treân maët tieáp xuùc giöõa khoâng khí vaø moâi tröôøng (Masaoka et al.,1993) neân tæ leä dieän tích beà maët tieáp xuùc vaø theå tích moâi tröôøng laø nhaân toá coù vai troø khaù quan troïng trong söï hình thaønh vaø toång hôïp cellulose. Tæ leä toát nhaát ñoái vôùi caùc chuûng vi khuaån khaùc nhau vaø ñieàu kieän moâi tröôøng ñang söû duïng khaùc nhau laø khaùc nhau. Vandamme et al. (1998) ñöa ra keát luaän tæ leä S/V khoaûng 2,2 cm-1 cho keát quaû toát nhaát khi khaûo saùt treân daûi tæ leä töø 1 ñeán 3 cm-1. Trong khi ñoù, löôïng cellulose thu ñöôïc cao nhaát khi S/V baèng 0,7 cm-1 khi khaûo saùt treân daûi tæ leä töø 0,27 ñeán 2,13 cm-1 (Krystynowicz et al., 2002). ÖÙng duïng cuûa cellulose vi khuẩn. Maëc duø baûn chaát hoùa hoïc töông töï cellulose thöïc vaät nhöng nhôø saûn xuaát deã daøng, ñaëc tính cô hoïc cao, tính oån ñònh döôùi hoùa chaát vaø nhieät ñoä cao, cellulose vi khuaån laø vaät lieäu ñöôïc choïn cho nhieàu öùng duïng (Watanabe et al., 1998). Thöïc phaåm Caùc loaïi vi khuaån gaây thoái röõa laø nguyeân nhaân laøm cho thöïc phaåm bò hö hoûng vaø laøm giaûm thôøi gian söû duïng cuûa saûn phaåm thöïc phaåm. Vaán ñeà baûo quaûn saûn phaåm thöïc phaåm traùnh khoûi caùc vi sinh vaät gaây hö hoûng ñöôïc ñaëc bieät quan taâm. Coù nhieàu caùch ñeå baûo quaûn saûn phaåm, ví duï nhö duøng caùc hoaù chaát baûo quaûn choáng vi sinh vaät laø moät caùch khaù phoå bieán. Tuy nhieân, vôùi cellulose vi khuaån, ngöôøi ta coù theå öùng duïng ñeå laøm maøng bao choáng vi sinh vaät. Theo ñoù, chaát choáng vi sinh vaät seõ ñöôïc keát hôïp vôùi maøng, laøm caùc chaát baûo quaûn naøy taäp trung treân maøng bao laøm thaønh böùc töôøng baûo veä thöïc phaåm, ñoàng thôøi giaûm löôïng hoaù chaát baûo quaûn trong thöïc phaåm, khi söû duïng saûn phaåm, maøng naøy coù theå ñöôïc loaïi boû deã daøng. ÖÙng duïng laøm maøng bao baûo quaûn thöïc phaåm laø moät trong nhöõng öùng duïng quan troïng cuûa cellulose vi khuaån trong ngaønh coâng ngheä bao bì trong nhöõng naêm gaàn ñaây (Yoshinaga et al., 1997). Moät saûn phaåm thöïc phaåm ñöôïc bieát ñeán khaù nhieàu maø baûn chaát laø cellulose vi khuaån ñoù laø thaïch döøa (Nata de coco). Nata de coco laø moät chaát maøng maøu traéng hoaëc maøu vaøng kem ñöôïc toång hôïp trong quaù trình leân men cuûa A. xylinum treân beà maët cuûa moâi tröôøng coù ñöôøng vaø acid, ví duï nhu nöôùc traùi caây. Nata de coco ñöôïc cho raèng coù theå laøm thöïc phaåm aên kieâng giuùp choáng laïi beänh ung thö ruoät, chöùng xô cöùng ñoäng maïch, chöùng nhoài maùu cô tim vaø nhieàu beänh khaùc (El-Saied et al., 2004). Nata de coco ñaõ trôû thaønh moùn aên truyeàn thoáng cuûa Philippine vaø raát phoå bieán ôû nhieàu quoác gia khaùc, trong ñoù coù Vieät Nam (Lapuz et al., 1967). Y hoïc Vì khaû naêng giöõ nöôùc cao neân cellulose vi khuaån coù theå ñöôïc söû duïng nhö taám da nhaân taïo taïm thôøi ñeå chöõa phoûng. Hôn nöõa, cellulose vi khuaån coøn laøm taêng khaû naêng phaùt trieån teá baøo da ngöôøi. Saûn phaåm öùng duïng maøng cellulose vi khuaån trong lónh vöïc y hoïc laø laøm da taïm thôøi khaù phoå bieán nhö cheá phaåm Biofill®. Taïi Vieät Nam, boä moân Vi sinh khoa Döôïc tröôøng Ñaïi hoïc Y döôïc nghieân cöùu saûn xuaát maøng trò phoûng baèng maøng cellulose vi khuaån coù taåm daàu muø u vaø mang laïi hieäu quaû cao khi söû duïng cho beänh nhaân. Moät nhoùm caùc nhaø khoa hoïc, sinh hoïc vaø giaûi phaãu hoïc phaùt trieån saûn phaåm laø BASYC® (Bacterial Synthesised Cellulose). BASYC® laø oáng saûn xuaát theo phöông phaùp tónh ñöôïc söû duïng thay theá maïch maùu. Nghieân cöùu naøy baét nguoàn töø caáu truùc maïng sôïi sieâu mòn, tính chaát beàn cô cao vaø ñoä tröông phoàng cao cuûa cellulose vi khuaån (Klemm et al., 2001). Caùc ngaønh coâng nghieäp khaùc Saûn xuaát cellulose vi khuaån quy moâ lôùn cuûa Weyerhaeuser Co. (Tacoma, Washington USA) vaø Cetus Co. (Emeryville, California, USA) ñöa tôùi söï phaùt trieån cuûa cellulon® vôùi nhieàu öùng duïng roäng raõi. Ví duï bao goàm öùng duïng trong boä phaän khai moû, trong öùng duïng noái vaø phuû ñeå coá ñònh maøng vaø nhö thaønh phaàn thöïc phaåm ñeå laøm chaát ñoän, chaát keát caáu hay laøm giaûm celorie. ÖÙng duïng cuûa cellulose vi khuaån laøm chaát coá ñònh teá baøo ñöôïc Friedleer et al moâ taû. Biopolymer Research Co. Ltd, Japan thieát laäp muïc ñích xa hôn cuûa kyõ thuaät öùng duïng coâng nghieäp cuûa polymer sinh hoïc vaø baây giôø ñang taäp trung nghieân cöùu “Biocellulose”. Tính chaát cuûa polymer hieäu duïng coù nguoàn goác vi sinh vaät cuõng ñang ñöôïc xem xeùt (Watanabe et al., 1998). Cellulose vi khuaån hieän ñöôïc mong ñôïi laø vaät lieäu hoùa sinh môùi vôùi nhöõng öùng duïng thuù vò vaø ñang tieáp tuïc nghieân cöùu, phaùt trieån saûn xuaát haøng loaït. Caùc lónh vöïc öùng duïng cellulose vi khuaån ñöôïc trình baøy trong baûng 2.5 Baûng 2.5: ÖÙùng duïng cellulose vi khuaån trong nhieàu lónh vöïc khaùc nhau Lĩnh vực Sản phẩm Thực phẩm Thöïc phaåm traùng miệng (Nata de coco, kem, kẹo, snack, khoai taây chieân ít calorie) Thực phẩm giảm caân Thịt nhaân tạo Bao bọc thịt vaø xuùc xích Giảm huyết thanh cholesterol Thuốc rượu Kombucha hay traø Manchurian Y tế Maøng trò thöông, maøng trò phoûng Taùc nhaân vận chuyển thuốc Da nhaân tạo Mạch maùu nhaân tạo Maøng bao sụn Mỹ phẩm Kem thoa da Chất laøm se, chất ổn đñịnh Maøng nhaân tạo Chaát laøm daøy vaø taêng cöùng cho thuoác ñaùnh boøng moùng tay Moâi trường Vaät lieäu huùt veát daàu traøn hay chaát ñoäc haïi Maøng sieâu loïc laøm saïch nguoàn nöôùc Dầu mỏ Vaät lieäu thu hoài vaø taùi sinh khoaùng chaát vaø daàu Da giaày Da nhaân taïo Thể thao ngoaøi trời Leàu duøng moät laàn vaø ñoà duøng caém traïi Tieän ích coâng coäng Maøng thẩm thấu ngược Chăm soùc trẻ em Taõ giấy duøng một lần coù khả năng taùi sinh Aâm thanh Maøng rung chuyeån ñoåi aâm thanh Coâng nghiệp gỗ Chaát taêng cöùng cho goã nhaân taïo Chaát boå sung laøm giaáy Thuøng chöùa chòu löïc cao Coâng nghiệp giấy Giaáy löu tröõ hoà sô Giaáy laøm tieàn teä Giaáy ñieän töû Maùy moùc töï ñoäng vaø maùy bay Thaân xe hôi Yeáu toá caáu truùc cho maùy bay Maøng bao taøu vuõ truï Phoøng thí nghieäm Giaù theå nuoâi caáy moâ teá baøo thöïc vaät Lónh vöïc khaùc Maøng composite NGUYEÂN LIEÄU VAØ PHÖÔNG PHAÙP Nguyeân lieäu Chuûng vi sinh vaät Chuûng vi sinh vaät ñöôïc söû duïng ñeå sinh toång hôïp cellulose laø chuûng cuûa vi khuaån A. xylinum ñöôïc cung caáp bôûi phoøng Thí nghieäm Sinh hoïc, tröôøng Ñaïi hoïc Baùch khoa thaønh phoá Hoà Chí Minh. Chuûng vi sinh vaät ñöôïc giöõ treân thaïch nghieâng ôû 40C trong moâi tröôøng töï nhieân coù thaønh phaàn chính laø nöôùc döøa. Moâi tröôøng nuoâi caáy vi sinh vaät Caùc thí nghieäm ñeàu söû duïng moâi tröôøng cô baûn laø moâi tröôøng Hestrin – Schramm (HS) bao goàm thaønh phaàn nhö sau: glucose 20 gl-1, cao naám men 5 gl-1, peptone 3 gl-1, Na2HPO4 5 gl-1, acid citric 1,15 gl-1, neáu moâi tröôøng ñaëc thì coù theâm agar 20 gl-1, nöôùc caát vöøa ñuû 1 lít (Schramm et al., 1954). Moâi tröôøng nhaân gioáng ñöôïc chuaån vò baèng caùch laáy moät khuaån laïc rieâng reõ, cho vaøo 10 ml moâi tröôøng HS trong oáng nghieäm ñaõ ñöôïc tieät truøng ôû 1210C, 20 phuùt. Nuoâi caáy 3 ngaøy, sau ñoù loïc ñeå taùch laáy dòch gioáng ñi nhaân gioáng caáp 2. Moâi tröôøng nhaân gioáng caáp 2 cuõng coù thaønh phaàn dinh döôõng nhö ñoái vôùi moâi tröôøng nhaân gioáng caáp 1, tuy nhieân ñöôïc chuaån bò trong bình erlen 250 ml chöùa 90 ml moâi tröôøng HS. Theå tích gioáng caáp 1 cho vaøo laø 10% (v/v). Moâi tröôøng leân men ñöôïc chuaån bò vaøo caùc erlen 250 ml chöùa 90 ml moâi tröôøng HS vaø ñöôïc thanh truøng ôû nhieät ñoä 1000C, thôøi gian 20 phuùt. Löôïng dòch gioáng söû duïng leân men laø 10% (v/v). Keá hoaïch thí nghieäm xaây döïng nhö phaàn thieát keá thí nghieäm sau. Thieát keá thí nghieäm NOÄI DUNG THÍ NGHIEÄM Thí nghieäm 1: Khaûo saùt quaù trình phaùt trieån cuûa chuûng vi khuaån A. xylinum treân moâi tröôøng HS. Thí nghieäm 4: Khaûo saùt söï aûnh höôûng cuûa nguoàn carbon ñeán quaù trình sinh toång hôïp cellulose cuûa A. xylinum. Thí nghieäm 6: Toái öu hoùa moâi tröôøng baèng phöông phaùp quy hoaïch thöïc nghieäm. Thí nghieäm 2: Khaûo saùt quaù trình sinh toång hôïp cellulose cuûa vi khuaån A. xylinum treân moâi tröôøng HS. Thí nghieäm 3: Khaûo saùt aûnh höôûng cuûa pH leân hieäu suaát toång hôïp cellulose treân moâi tröôøng HS. Thí nghieäm 5: Khaûo saùt söï aûnh höôûng cuûa nguoàn nitô ñeán quaù trình sinh toång hôïp cellulose cuûa A. xylinum. Khaûo saùt quaù trình nhaân gioáng. Chuûng A. xylinum töø oáng nghieäm thaïch nghieâng ñöôïc baûo quaûn trong tuû laïnh. Chuaån bò moâi tröôøng HS vaøo caùc hoäp Petri. Caáy gioáng vi khuaån töø oáng thaïch nghieâng leân caùc hoäp Petri ñoù nhaèm phaân laäp, ñaûm baûo nguoàn gioáng ñöa vaøo söû duïng ñöôïc phaùt trieån töø moät khuaån laïc. Sau khoaûng 30 ngaøy tieán haønh phaân laäp laïi moät laàn nhaèm ñaûm baûo gioáng coù hoaït tính sinh hoïc cao nhaát. Sau 2 ngaøy, caùc khuaån laïc ñaõ phaùt trieån treân hoäp Petri thaønh töøng khuaån laïc rieâng reõ. Töø moät khuaån laïc ñoù, caáy leân caùc oáng nghieäm chöùa 10 ml moâi tröôøng nhaân gioáng caáp 1, nuoâi caáy trong tuû aám taïi nhieät ñoä 280C, thôøi gian 3 ngaøy. Sau thôøi gian 3 ngaøy, loïc dòch nhaân gioáng trong ñieàu kieän voâ truøng ñeå taùch caùc sôïi cellulose, thu dòch gioáng caáp 1 . Sau ñoù duøng dòch gioáng ñoù tieán haønh nhaân gioáng caáp 2. Chuaån bò 90 ml moâi tröôøng HS ñaõ tieät truøng vaøo erlen 250 ml, cho 10 ml dòch gioáng caáp 1 vaøo, laéc ñeàu vaø ñeå ôû nhieät ñoä 280C, khoâng khuaáy ñaûo. Tieán haønh xaùc ñònh maät ñoä teá baøo ngay sau khi baét ñaàu nhaân gioáng caáp 2 vaø sau moãi khoaûng thôøi gian 24 giôø. Muïc ñích cuûa thí nghieäm nhaèm ñaùnh giaù khaû naêng phaùt trieån cuûa chuûng A. xylinum hieän coù trong ñieàu kieän moâi tröôøng hoaù hoïc, töø ñoù choïn thôøi gian leân men cho caùc thí nghieäm tieáp theo. Khaûo saùt quaù trình sinh toång hôïp cellulose. Nuoâi caáy thu nhaän cellulose töø vôùi chuûng vi khuaån ñaõ ñöôïc nhaân gioáng caáp 2, xaây döïng thí nghieäm nhö sau: Cho 10ml dòch gioáng caáp 2 vaøo erlen 250 ml chöùa 90 ml moâi tröôøng HS ñaõ thanh truøng ôû nhieät ñoä 1000C, thôøi gian 20 phuùt. Sau khi caáy gioáng, ñeå ôû nhieät ñoä 280C, khoâng laéc ñaûo. Ñeán ngaøy thöù 5 thì baét ñaàu thu cellulose, khaûo saùt khoái löôïng cellulose thu ñöôïc taïi caùc ngaøy thöù 4, thöù 5, thöù 6, thöù 7. Chæ tieâu theo doõi: Khoái löôïng cellulose thu ñöôïc ôû caùc ngaøy thöù 4, 5, 6, 7. pH cuûa moâi tröôøng trong thôøi gian 4, 5, 6, 7 ngaøy. Khaûo saùt aûnh höôûng cuûa pH leân hieäu suaát toång hôïp cellulose cuûa vi khuaån A. xylinum Nhaèm ñaùnh giaù taùc ñoäng cuûa pH leân khaû naêng toång hôïp cellulose cuûa chuûng A. xylinum hieän taïi, chuùng toâi tieán haønh nuoâi caáy thu cellulose taïi caùc giaù trò pH ban ñaàu khaùc nhau, töø ñoù ruùt ra khoaûng pH toái öu cho khaû naêng sinh toång hôïp cellulose cuûa chuûng vi khuaån naøy. Phöông phaùp thí nghieäm nhö sau: nuoâi caáy A. xylinum treân moâi tröôøng cô baûn HS trong erlen 250 ml, tæ leä gioáng caáy laø 10%, thay ñoåi pH ban ñaàu töø 3 ñeán 7, nuoâi caáy ôû nhieät ñoä 280C. Sau khi keát thuùc quaù trình leân men, thu nhaän cellulose vaø nhaän xeùt aûnh höôûng cuûa pH leân khaû naêng toång hôïp cellulose cuûa chuûng vi khuaån A. xylinum. Khaûo saùt aûnh höôûng ñoäc laäp cuûa nguoàn carbon vaø nitô leân hieäu suaát toång hôïp cellulose cuûa vi khuaån A. xylinum Sau khi ñaõ xaùc ñònh ñöôïc thôøi gian nhaân gioáng cho chuûng vi khuaån A. xylinum, thöïc hieän khaûo saùt taùc ñoäng ñoäc laäp cuûa nguoàn carbon vaø nitô ñeán hieäu suaát sinh toång hôïp cellulose. Ñaây laø thí nghieäm nhaèm choïn löïa nguoàn carbon vaø nitô toát nhaát cho chuûng A. xylinum hieän taïi. Dòch gioáng sau khi nhaân gioáng caáp 2 seõ ñöôïc leân men trong caùc moâi tröôøng ñöôïc chuaån bò vôùi caùc thaønh phaàn nhö moâi tröôøng HS nhöng nguoàn carbon vaø nguoàn nitô ñöôïc thay ñoåi, caùc thaønh phaàn khaùc cuûa moâi tröôøng ñöôïc giöõ nguyeân. Cuï theå, nguoàn carbon ñöôïc thay ñoåi giöõa caùc chaát sau: mannitol, glucose, fructose, sucrose. Nguoàn nitô ñöôïc söû duïng goàm: cao naám men, cao thòt, peptone, tryptone, (NH4)2HPO4, (NH4)2SO4. Sau khi thu nhaän cellulose, so saùnh keát quaû, ñaùnh giaù hieäu suaát cuûa caùc nguoàn cô chaát treân ñoái vôùi khaû naêng sinh toång hôïp cellulose cuûa A. xylinum. Khaûo saùt aûnh höôûng ñoàng thôøi cuûa nguoàn carbon vaø nitô leân hieäu suaát toång hôïp cellulose cuûa vi khuaån A. xylinum Sau khi ñaõ xaùc ñònh ñöôïc nguoàn carbon vaø nguoàn nitô thích hôïp nhaát laøm thaønh phaàn cho moâi tröôøng cho chuûng A. xylinum naøy toång hôïp cellulose, chuùng toâi khaûo saùt aûnh höôûng ñoàng thôøi cuûa hai nguoàn cô chaát carbon vaø nitô leân khaû naêng toång hôïp cellulose cuûa vi khuaån A. xylinum. Nguoàn carbon thích hôïp nhaát vaø nguoàn nitô thích hôïp nhaát theo keát quaû cuûa thí nghieäm treân seõ ñöôïc khaûo saùt taïi nhieàu haøm löôïng khaùc nhau, ñaùnh giaù hieäu suaát thu nhaän cellulose taïi caùc haøm löôïng ñoù, töø caùc soá lieäu thöïc nghieäm, xaây döïng phöông trình hoài quy, ruùt ra haøm löôïng nguoàn carbon vaø nitô thích hôïp nhaát cho A. xylinum toång hôïp cellulose. Söû duïng phöông phaùp quy hoaïch thöïc nghieäm ñeå tìm ñieåm toái öu cho thaønh phaàn moâi tröôøng leân men. Thieát keá thí nghieäm nhö baûng 3.1 vaø 3.2. Baûng 3.1: Baûng thieát keá thí nghieäm toái öu nguoàn carbon vaø nguoàn nitô TN Bieán y y* x1 x2 1 -1 0 2 -1 +1 3 0 -1 4 0 +1 5 +1 0 6 +1 +1 7 -1 -1 8 +1 -1 9 0 0 10 0 0 11 0 0 Trong ñoù, y laø haøm löôïng cellulose trung bình thöïc teá thu ñöôïc trong caùc thí nghieäm, y* laø haøm löôïng cellulose thu ñöôïc theo phöông trình hoài quy trong caùc thí nghieäm, x1 laø yeáu toá aûnh höôûng thöù nhaát (nguoàn carbon), x2 laø yeáu toá aûnh höôûng thöù hai (nguoàn nitô). Caùc bieán ñoäc laäp seõ ñöôïc tieán haønh thu soá lieäu ôû 3 giaù trò noàng ñoä: möùc treân (+) vaø möùc döôùi (-) vaø möùc trung bình (0). Ñoái vôùi nguoàn nitô: Neáu peptone ñöôïc söû duïng laøm nguoàn nitô thì haøm löôïng ñöôïc cho ôû möùc 8 gl-1. Neáu peptone vaø cao naám men cuøng ñöôïc söû duïng laøm nguoàn nitô thì choïn toång haøm löôïng laø 8 gl-1 vôùi tæ leä 1:1 Baûng 3.2: Baûng maõ hoaù caùc yeáu toá aûnh höôûng caàn khaûo saùt Kí hieäu Nguoàn carbon x1 (gl-1) Nguoàn nitô x2 (gl-1) 0 25 8 -1 20 6 +1 30 10 Caùc phöông phaùp phaân tích. Soá löôïng vi khuaån Soá vi khuaån ñöôïc xaùc ñònh baèng phöông phaùp ñeám khuaån laïc treân ñóa thaïch. Dòch leân men ñöôïc pha loaõng vôùi 0,1% peptone (pH 5). Cho 0,1 ml dòch leân men ñaõ pha loaõng leân ñóa chöùa moâi tröôøng agar HS, nuoâi caáy ôû 280C. Soá khuaån laïc ñöôïc xaùc ñònh sau 3 ngaøy nuoâi caáy (Koula et al., 1997). Haøm löôïng cellulose Cellulose öôùt thu ñöôïc töø bình leân men ñöôïc röûa vôùi nöôùc caát ñeå loaïi boû caùc thaønh phaàn moâi tröôøng coøn soùt laïi. Sau ñoù, khoái cellulose öôùt ñöôïc xöû lyù vôùi dung dòch NaOH 0,5M ôû 90oC trong thôøi gian 1 giôø ñeå loaïi boû hoaøn toaøn caùc teá baøo vi khuaån coøn soùt. Sau ñoù, khoái cellulose ñöôïc röûa laïi baèng nöôùc caát ñeán khi pH dung dòch nöôùc röûa veà trung tính. Saáy cellulose saïch thu ñöôïc ôû 1050C ñeán khi khoái löôïng khoâng ñoåi. Caân xaùc ñònh khoái löôïng cuûa cellulose thu ñöôïc (Son et al., 2001). Phaân tích thoáng keâ Soá lieäu nghieân cöùu ñöôïc bieåu dieãn baèng trung bình keát quaû cuûa 3 laàn laëp laïi vôùi sai soá töông ñoái. Söï khaùc nhau cuûa caùc giaù trò rieâng leû ñöôïc kieåm ñònh baèng t – test baèng phaàn meàm R cho Windows® vôùi möùc yù nghóa 5% (P < 0,05). KEÁT QUAÛ VAØ BAØN LUAÄN Khaûo saùt quaù trình nhaân gioáng vi khuaån A. xylinum Nhaân gioáng caáp 2 vôùi tæ leä gioáng caáy caáp 1 laø 10%, trong moâi tröôøng cô baûn HS trong bình erlen 250 ml chöùa 90 ml moâi tröôøng, nhieät ñoä nuoâi caáy 280C, thôøi gian 7 ngaøy. Maät ñoä teá baøo vi khuaån A. xylinum ñöôïc xaùc ñònh ngay töø khi baét ñaàu tính thôøi gian nhaân gioáng. Ñoà thò ñöôøng cong sinh tröôûng cuûa chuûng vi khuaån A. xylinum ñang söû duïng trong thí nghieäm naøy thu ñöôïc nhö sau. Hình 4.1: Ñöôøng cong sinh tröôûng của A. xylinum Thôøi gian 24 giôø ñaàu cuûa quaù trình nhaân gioáng, döôùi ñaùy erlen baét ñaàu xuaát hieän nhöõng sôïi nhoû, moûng, lô löûng, ñoù laø nhöõng daûi sôïi cellulose ñaàu tieân do A. xylinum taïo ra trong moâi tröôøng, sau ñoù caùc daûi cellulose naøy seõ choàng chaäp, xoaén laïi vôùi nhau, baét ñaàu taïo thaønh lôùp maøng cellulose moûng, maøu traéng ñuïc treân beà maët moâi tröôøng sau ngaøy thöù ba, thöù tö cuûa quaù trình nhaân gioáng. Thôøi gian toång hôïp cellulose vaø khaû naêng toång hôïp cellulose coù lieân quan ñeán soá löôïng teá baøo vi khuaån A. xylinum. Maät ñoä teá baøo ban ñaàu ñöôïc xaùc ñònh ngay khi dòch gioáng ñöôïc laéc ñeàu trong bình nhaân gioáng (7,39 ± 0,05 log cfu ml-1) vaø taïi caùc thôøi ñieåm xaùc ñònh sau moãi 24 giôø. Maät ñoä naøy lieân tuïc taêng leân trong quaù trình nhaân gioáng, ñaït soá löôïng 8,73 ± 0,06 (log cfu ml-1) sau 96 giôø phaùt trieån. Maät ñoä teá baøo taêng nhanh trong 24 giôø ñaàu cuûa quaù trình nuoâi caáy, töông öùng vôùi thôøi gian teá baøo ñang ôû pha thích nghi. Ñeán giai ñoaïn pha sinh tröôûng thì maät ñoä teá baøo baét ñaàu taêng chaäm laïi, söï taêng chaäm laïi naøy dieãn ra vaøo khoaûng thôøi gian töø 24 giôø ñeán 96 giôø nhaân gioáng. Maät ñoä teá baøo ñaït soá löôïng lôùn nhaát taïi 96 giôø, sau ñoù giöõ oån ñònh ôû pha caân baèng roài giaûm daàn khi vaøo pha suy vong. Töø ñöôøng cong sinh tröôûng, ta söû duïng dòch gioáng sau 96h nhaân gioáng ñeå tieán haønh leân men thu cellulose laø toát nhaát. Vaäy, keát quaû thí nghieäm cho thaáy, treân moâi tröôøng hoaù hoïc, chuûng A. xylinum naøy cuõng coù khaû naêng phaùt trieån toát nhö treân moâi tröôøng töï nhieân vôùi thaønh phaàn chính laø nöôùc döøa. Khaûo saùt quaù trình sinh toång hôïp cellulose. Sau khi xaùc ñònh ñöôïc thôøi gian nhaân gioáng thích hôïp, caàn xaùc ñònh thôøi gian keát thuùc quaù trình leân men cho caùc thí nghieäm sao cho phuø hôïp. Do ñoù, chuùng toâi thöïc hieän khaûo saùt quaù trình sinh toång hôïp cellulose cuûa vi khuaån A. xylinum nhaèm choïn thôøi ñieåm keát thuùc quaù trình leân men moät caùch thích hôïp nhaát. Söû duïng dòch gioáng caáp 2 vôùi tæ leä gioáng caáy laø 10% ñeå nuoâi caáy thu nhaän cellulose treân moâi tröôøng cô baûn HS trong bình erlen 250 ml chöùa 100 ml dòch leân men, nhieät ñoä nuoâi caáy laø 280C. Trong quaù trình nuoâi caáy, khaûo saùt haøm löôïng cellulose ñöôïc ñöôïc toång hôïp trong caùc khoaûng thôøi gian khaùc nhau, ñoàng thôøi xaùc ñònh pH cuûa dòch leân men. Keát quaû thu ñöôïc cho thaáy, trong suoát quaù trình leân men, A. xylinum lieân tuïc toång hôïp cellulose, töông öùng vôùi quaù trình sinh tröôûng vaø phaùt trieån cuûa vi khuaån. ÔÛ ngaøy ñaàu tieân, do vöøa chuyeån töø moâi tröôøng nhaân gioáng sang moâi tröôøng leân men neân coù söï thay ñoåi ñoät ngoät veà moâi tröôøng, soá löôïng teá baøo trong moâi tröôøng chöa ñuû lôùn neân söï taïo thaønh cellulose haàu nhö chöa coù. Sau 2 ngaøy xuaát hieän nhöõng sôïi cellulose maûnh lô löûng trong moâi tröôøng vaø treân beà maët baét ñaàu xuaát hieän moät lôùp maøng cellulose moûng, maøu traéng. Sang ngaøy thöù 3 toác ñoä taïo cellulose taêng leân ñaùng keå khi beà maët bình leân men coù moät lôùp maøng cellulose khaù daøy. Tuy nhieân, löôïng cellulose taïo ra sau 3 ngaøy leân men vaãn raát ít neân chöa theå xaùc ñònh ñöôïc khoái löôïng. Löôïng cellulose taêng nhanh töø ngaøy leân men thöù tö ñeán ngaøy thöù saùu. Ñaây laø thôøi gian vi khuaån sinh toång hôïp cellulose maïnh nhaát sau khi ñaõ thích nghi vôùi moâi tröôøng vaø soá löôïng teá baøo ñaõ ñuû lôùn. Löôïng cellulose thu ñöôïc taêng leân töø 4,9 ± 0,3 gl-1 leân 7,4 ± 0,3 gl-1. Sang ngaøy thöù saùu thì toác ñoä taêng leân cuûa cellulose ñöôïc sinh toång hôïp ra ñaõ giaûm daàn, söï cheânh leäch laø 0,6 gl-1/ngaøy thay vì 1,19 gl-1/ngaøy nhö söï cheânh leäch giöõa ngaøy thöù tö vaø ngaøy thöù naêm. Ñeán ngaøy thöù baûy thì löôïng cellulose thu ñöôïc haàu nhö khoâng taêng hôn so vôùi ngaøy leân men thöù saùu, ñaït 7,5 ± 0,4 gl-1. Söï taêng leân naøy laø khoâng ñaùng keå. (P = 0,21 > 0,05). Hình 4.2: Ñoà thò bieåu dieãn troïng löôïng cellulose thu ñöôïc vaø giaù trò pH taïi caùc ngaøy leân men thöù 4, 5, 6, 7 Maët khaùc, trong quaù trình leân men, pH cuûa dòch leân men giaûm daàn töø pH ban ñaàu laø 5 tôùi pH sau ngaøy thöù baûy laø 3,52. Keát quaû cho thaáy, song song vôùi söï toång hôïp cellulose, löôïng cellulose caøng taêng leân thì pH cuûa dòch leân men giaûm. Söï giaûm pH naøy coù nguyeân nhaân ñöôïc xaùc ñònh raèng trong quaù trình sinh tröôûng vaø phaùt trieån, A. xylinum ñaõ söû duïng ñöôøng ñeå taïo ra acid gluconic (Tahara et al., 1997). Tuy nhieân, ñeán ngaøy thöù 6 thì pH baét ñaàu trôû neân oån ñònh, ít thay ñoåi. Quaù trình chuyeån hoaù ñöôøng thaønh acid gluconic ñaõ giaûm. Cuõng khaûo saùt bieán ñoäng cuûa pH trong quaù trình toång hôïp cellulose, trong nghieân cöùu cuûa mình, Vandame et al. (1998) thaáy raèng, pH dòch leân men giaûm roõ reät vaøo ngaøy thöù tö vaø thöù naêm cuûa quaù trình leân men, ñoù cuõng laø khoaûng thôøi gian cellulose ñöôïc vi khuaån toång hôïp maïnh nhaát. Khaûo saùt söï chuyeån hoaù cuûa ñöôøng, Vandame et al. (1998) thaáy raèng A. xylinum söû duïng gaàn 50% löôïng glucose trong moâi tröôøng chæ sau ngaøy leân men thöù hai, vaø phaàn lôùn löôïng glucose naøy ñöôïc chuyeån hoaù thaønh gluconate vaø acid gluconic. Beân caïnh ñoù, Hai-Peng et al. (2002) nghieân cöùu treân chuûng A. xylinum sucrofermentans BPR2001 cuõng cho thaáy, sau giai ñoaïn thích nghi, glucose ñöôïc chuyeån thaønh acid gluconic raát maïnh vaø pH dòch leân men giaûm roõ reät. Maët khaùc, söï oxy hoùa glucose, acid gluconic ñöôïc taïo ra vaø giaûi phoùng ra trong moâi tröôøng nuoâi caáy. Neáu quaù trình naøy xaûy ra maïnh seõ laø nguyeân nhaân laøm cho pH moâi tröôøng giaûm töø 1 tôùi 3 ñôn vò trong quaù trình nuoâi caáy, vaø kieàm cheá söï taïo thaønh cellulose (Krystynowicz et al., 2002). Do ñoù, khi pH oån ñònh cuõng coù theå laø daáu hieäu keát thuùc quaù trình leân men. Keát quaû cho thaáy, tuy troïng löôïng cellulose thu ñöôïc sau 7 ngaøy leân men laø cao nhaát nhöng so vôùi ngaøy thöù saùu thì söï cheânh leäch ñoù khoâng ñaùng keå (P > 0,05). Do ñoù, ñể ruùt ngaén thôøi gian leân men, choïn thôøi gian keát thuùc leân men thoáng nhaát cho caùc thí nghieäm tieáp theo laø sau 6 ngaøy leân men. Khaûo saùt aûnh höôûng cuûa pH leân hieäu suaát sinh toång hôïp cellulose cuûa vi khuaån A. xylinum Tieán haønh leân men thu nhaän cellulose khi nuoâi caáy vi khuaån A. xylinum treân moâi tröôøng HS nhö thí nghieäm treân taïi caùc ñieåm pH ban ñaàu khaùc nhau. Caùc giaù trò pH ñöôïc khaûo saùt laø 3; 3,5; 4; 4,5; 5; 5,5; 6; 6,5 vaø 7. Khaûo saùt haøm löôïng cellulose thu ñöôïc, ñaùnh giaù aûnh höôûng cuûa pH leân khaû naêng taïo cellulose cuûa vi khuaån. Töø ñoù choïn pH toát nhaát cho moâi tröôøng leân men. Keát quaû thu ñöôïc cho thaáy, taïi caùc giaù trò pH khaùc nhau löôïng cellulose thu ñöôïc laø khaùc nhau, ñieàu naøy chöùng toû pH laø moät yeáu toá aûnh höôûng ñeán hieäu suaát toång hôïp cellulose cuûa A. xylinum. Khoaûng pH cho chuûng A. xylinum trong thí nghieäm naøy laø khoaûng töø 4 – 5,5, löôïng cellulose thu ñöôïc ~5,1 gl-1. Löôïng cellulose taïo ra taïi caùc giaù trò pH khaùc nhau trong khoaûng treân thì söï khaùc bieät khoâng roõ raøng (P > 0,05). Ngoaøi khoaûng pH treân thì khaû naêng toång hôïp cellulose cuûa A. xylinum giaûm chæ ñaït töø 3,5 gl-1 ñeán 4,6 gl-1. AÛnh höôûng cuûa pH leân hieäu suaát sinh toång hôïp cellulose, xem hình 4.3 Hình 4.3: AÛnh höôûng cuûa pH leân hieäu suaát sinh toång hôïp cellulose cuûa A. xylinum Song song vôùi quaù trình toång hôïp cellulose, A. xylinum coøn toång hôïp caû cellulase. Khi cellulase ñöôïc taïo ra nhieàu thì khaû naêng polymer hoùa taïo cellulose cuûa vi khuaån giaûm, löôïng cellulose ñöôïc taïo ra ít hôn. Khi pH cao (pH > 5), löôïng cellulase ñöôïc taïo ra nhieàu hôn laøm cho cellulose giaûm, khi pH thaáp (pH < 5) cellulase taïo ra ít, söï taïo thaønh cellulose taêng leân. Theo nghieân cöùu cuûa Tahara et al. (1997) ñoái vôùi chuûng A. xylinum BPR2001, taïi pH 4 möùc ñoä polymer hoùa cuûa cellulose vaøo khoaûng 14000 – 16000, nhöng vôùi pH 5, DP giaûm töø 16800 xuoáng coøn 11000. Ñoä beàn cô hoïc cuûa cellulose ñöôïc toång hôïp taïi pH 4 cuõng cao hôn ñoä beàn cô cuûa cellulose ñöôïc saûn xuaát taïi pH 5 (Tahara et al., 1997). Theo nghieân cöùu cuûa Hutchen et al. (2006), vôùi chuûng vi khuaån Gluconacetobacter hansenii, nguoàn carbon laø mannitol thì khi pH ñaàu laø 5,5 löôïng cellulose ñöôïc taïo ra cao hôn ñaùng keå so vôùi khi pH 6,5. Nhöng cuõng trong nghieân cöùu naøy, neáu thay ñoåi nguoàn carbon laø glucose thì pH 6,5 laïi giuùp chuûng vi khuaån naøy toång hôïp cellulose toát hôn taïi pH 5,5. Maët khaùc, trong quaù trình toång hôïp cellulose, söï oxy hoùa glucose xaûy ra cung caáp cho quaù trình trao ñoåi chaát caùc ñieän töû laøm cho phaàn glucose duøng cho vieäc taïo thaønh cellulose giaûm. Caùc saûn phaåm phuï ñöôïc taïo ra khi glucose bò oxy hoùa bôûi moät soá enzyme cuõng coù theå giaûi thích taïi sao caùc nguoàn carbon khaùc nhau thì caùc chuûng vi sinh vaät khaùc nhau coù hieäu suaát sinh toång hôïp cellulose khaùc nhau taïi caùc giaù trò pH khaùc nhau (Krystynowicz et al., 2002). Nhö vaäy, pH cuõng laø moät yeáu toá coù theå gaây aûnh höôûng ñeán hieäu suaát toång hôïp cellulose cuûa vi khuaån. Vi khuaån A. xylinum toång hôïp cellulose toát hôn ôû moâi tröôøng coù pH thaáp hôn 5. Khaûo saùt aûnh höôûng cuûa nguoàn carbon vaø nitô leân hieäu suaát sinh toång hôïp cellulose cuûa vi khuaån A. xylinum AÛnh höôûng cuûa nguoàn carbon Ñeå khaûo saùt aûnh höôûng cuûa nguoàn carbon leân hieäu suaát sinh toång hôïp cellulose, A. xylinum ñöôïc nuoâi caáy treân moâi tröôøng HS vôùi caùc nguoàn carbon khaùc nhau: glucose, mannitol, sucrose, fructose. Sau 6 ngaøy leân men ôû nhieät ñoä 280C, cellulose ñöôïc thu nhaän vaø xöû lyù, phaân tích hieäu suaát. Sau 6 ngaøy leân men, chieàu daøy lôùp cellulose thu ñöôïc trong tröôøng hôïp moâi tröôøng coù nguoàn carbon laø mannitol xaáp xæ baèng chieàu cao cuûa lôùp dòch moâi tröôøng ban ñaàu. Ñaây cuõng ñöôïc coi laø löôïng cellulose lôùn nhaát thu ñöôïc trong quaù trình leân men so vôùi caùc nguoàn carbon khaùc (P < 0,05). Khoái löôïng cellulose ñaït ñöôïc 7,6 ± 0,4 gl-1 (hình 4.4). Maët khaùc, cellulose öôùt taïo thaønh coù caáu truùc ñeàu, beà maët nhaün, khoái cellulose chaéc, hieäu suaát thu cellulose sau khi saáy khoâ cao. Glucose laø nguoàn carbon cho keát quaû taïo cellulose ôû möùc trung bình, hieäu suaát toång hôïp cellulose khaù oån ñònh, löôïng cellulose ñaït ñöôïc ~5,7 ± 0,5 gl-1. Hai nguoàn carbon khaùc laø fructose vaø sucrose khoâng thích hôïp vôùi chuûng vi khuaån A. xylinum naøy neân khaû naêng söû duïng hai nguoàn carbon naøy keùm. Löôïng cellulose chæ ñaït khoaûng 3,5 gl-1. Baèng vieäc thay ñoåi nguoàn carbon söû duïng, keát quaû cho thaáy raèng chuûng vi khuaån naøy coù theå söû duïng nhieàu loaïi cô chaát khaùc nhau nhöng caùc nguoàn carbon khaùc nhau coù söï thích hôïp cho khaû naêng taïo cellulose cuûa chuûng vi khuaån cuõng khaùc nhau. Moãi chuûng vi sinh vaät A. xylinum khaùc nhau seõ thích hôïp vôùi moät nguoàn carbon khaùc nhau, tuøy chuûng vi sinh vaät maø caùc nguoàn carbon seõ thay ñoåi ñeå söû duïng cho phuø hôïp, töø ñoù taïo ra hieäu suaát toång hôïp cellulose cao nhaát. Keát quaû cho thaáy söï sai khaùc veà khaû naêng söû duïng nguoàn cô chaát carbon cuûa chuûng vi khuaån A. xylinum naøy so vôùi caùc chuûng A. xylinum ñaõ ñöôïc nghieân cöùu. Chaúng haïn, vôùi keát quaû naøy, chuûng vi khuaån A. xylinum söû duïng trong caùc thí nghieäm naøy söû duïng nguoàn cô chaát carbon thích hôïp nhaát laø mannitol, khoâng gioáng nhö keát quaû maø Masaoka et al. (1993) ñaõ ñaït ñöôïc, keát quaû cuûa oâng cho thaáy raèng, glucose môùi laø nguoàn carbon thích hôïp nhaát cho söï taïo thaønh cellulose cuûa vi khuaån A. xylinum IFO 13693, löôïng cellulose coù theå ñaït ñöôïc leân tôùi 0,6 g/g glucose/ngaøy sau 2 - 4 ngaøy leân men. Matsuoka et al. (1996) thaáy raèng fructose laø nguoàn carbon thích hôïp nhaát cho A. xylinum BPR2001. Fructose cuõng ñöôïc xem laø nguoàn carbon toát nhaát cho A. xylinum E22 toång hôïp cellulose (Krystynowicz et al., 2002). Tuy nhieân, keát quaû trong nghieân cöùu naøy phuø hôïp vôùi keát quaû nghieân cöùu cuûa Oikawa et al. (1995) vôùi vi khuaån A. xylinum Ku-1, haøm löôïng cellulose ñöôïc toång hôïp bôûi A. xylinum Ku-1 khi söû duïng nguoàn cô chaát laø mannitol cao hôn 3 laàn so vôùi khi söû duïng cô chaát laø glucose. Hutchens et al. (2006) vôùi chuûng A. xylinum hansenii, keát quaû cuûa caùc oâng cuõng thaáy raèng mannitol laø nguoàn carbon thích hôïp nhaát cho caùc chuûng A. xylinum ñoù toång hôïp cellulose. Hình 4.4: Troïng löôïng cellulose thu ñöôïc khi nguoàn carbon thay ñoåi Trong quaù trình toång hôïp cellulose, söï oxy hoùa glucose xaûy ra cung caáp cho quaù trình trao ñoåi chaát caùc ñieän töû laøm cho phaàn glucose duøng cho vieäc taïo thaønh cellulose giaûm, do ñoù caàn giaûm thieåu quaù trình thaát thoaùt glucose do quaù trình oxy hoùa naøy. Coù theå giaûm söï oxy hoùa glucose baèng caùch theâm ethanol hay glycerol vaøo moâi tröôøng nuoâi caáy nhö laø moät nguoàn ñieän töû doài daøo nhaèm taêng khaû naêng söû duïng cô chaát carbon cho muïc ñích taïo cellulose, töø ñoù taêng hieäu suaát sinh toång hôïp cellulose (Park et al., 2003). Mannitol, moät polyol, cung caáp ñieän töû cho söï trao ñoåi chaát cuûa vi khuaån vaø kích thích söï taïo thaønh cellulose toát hôn so vôùi glucose, ñieàu naøy ñaõ ñöôïc baùo caùo trong nghieân cöùu cuûa Brown et al. (1986). Khi moâi tröôøng ñöôïc cung caáp nguoàn carbon laø mannitol, söï acid hoùa khoâng xaûy ra trong quaù trình nuoâi caáy, ñieàu naøy phuø hôïp vôùi con ñöôøng trao ñoåi chaát cuûa vi khuaån söû duïng mannitol, mannitol ñöôïc A. xylinum chuyeån hoùa thaønh fructose (Matsushita et al., 2003), sau ñoù oxy hoùa tieáp thaønh 5-keto-d-fructose tröôùc khi haáp thu (Mowshoitz et al., 1973). Vôùi vieäc haïn cheá söï taïo thaønh acid, glucose ít bò toån thaát, löôïng cellulose taïo thaønh cuõng cao hôn. Khi caùc yeáu toá moâi tröôøng khaùc ñöôïc giöõ coá ñònh, thay ñoåi nguoàn carbon, ñoái vôùi chuûng A. xylinum söû duïng trong nghieân cöùu naøy, mannitol laø nguoàn carbon thích hôïp nhaát cho khaû naêng taïo cellulose cuûa vi khuaån. AÛnh höôûng cuûa nguoàn nitô Sau khi choïn ñöôïc nguoàn carbon thích hôïp nhaát cho chuûng A. xylinum hieän coù ñeå toång hôïp cellulose, khaûo saùt tieáp theo nhaèm ñaùnh giaù aûnh höôûng cuûa nguoàn nitô leân hieäu suaát toång hôïp cellulose. Cuõng chuaån bò moâi tröôøng HS, nguoàn carbon ñöôïc giöõ coá ñònh laø manitol vaø nguoàn nitô ñöôïc thay ñoåi: cao naám men, cao thòt, peptone, (NH4)2SO4 vaø (NH4)2HPO4, nuoâi ôû 280C, thôøi gian 6 ngaøy. Keát quaû cho thaáy, khi laáy tryptone laøm nguoàn nitô thì söï toång hôïp cellulose raát yeáu, khoâng ñaùng keå (0,5 ± 0,1 gl-1). Chöùng toû ñoái vôùi chuûng vi khuaån A. xylinum trong thí nghieäm naøy, nguoàn nitô treân khoâng phuø hôïp cho chuùng sinh toång hôïp cellulose. Hai hôïp chaát khaùc ñöôïc duøng laøm nguoàn nitô trong thí nghieäm laø (NH4)2SO4 vaø (NH4)2HPO4, löôïng cellulose thu ñöôïc cao hôn ñoái vôùi tryptone nhöng hieäu suaát taïo cellulose cuõng raát thaáp, chæ ñaït 2,5 ± 0,6 gl-1 vaø 2,3 ± 0,6 gl-1. Ñoái vôùi peptone, troïng löôïng cellulose taïo ra ôû möùc trung bình (4,7 ± 0,3 gl-1), đñiều này cho thaáy peptone laø nguoàn nitô phuø hôïp cho chuûng A. xylinum naøy hôn (NH4)2SO4 vaø (NH4)2HPO4 (P < 0,05). Khi nguoàn nitô ñöôïc thay baèng cao naám men vaø peptone vôùi tæ leä 5:3 hoaëc cao thòt thì khaû naêng taïo cellulose cuûa vi khuaån taêng leân ñaùng keå, ñaït töông öùng 6,8 ± 0,5 gl-1 vaø 6,1 ± 0,5 gl-1. Löôïng cellulose ñaït ñöôïc cao nhaát khi söû duïng nguoàn nitô laø cao naám men (8,1 ± 0,8 gl-1). Ñieàu naøy cho pheùp keát luaän raèng, ñoái vôùi chuûng vi khuaån A. xylinum ñang khaûo saùt thì nguoàn nitô toát nhaát trong moâi tröôøng leân men ñeå taïo cellulose laø cao naám men. Caùc kí hieäu: YE + Pep – Cao naám men vaø peptone YE - Cao naám men Pep – Peptone Tryp – Tryptone ME – Cao thòt Hình 4.5: Troïng luôïng cellulose thu ñöôïc khi thay ñoåi nguoàn nitô Nitô laø nguoàn dinh döôõng raát quan troïng ñoái vôùi A. xylinum. Cuõng nhö ñoái vôùi nguoàn carbon, nguoàn nitô ñoùng vai troø quyeát ñònh ñeán khaû naêng sinh tröôûng vaø phaùt trieån cuûa vi sinh vaät, ñaëc bieät ñoái vôùi quaù trình chuyeån hoùa toång hôïp cellulose. Nguoàn nitô höõu cô toát hôn cho vi sinh vaät sinh tröôûng vaø phaùt trieån. Do ñoù, nguoàn nitô höõu cô cuõng toát cho A. xylinum toång hôïp cellulose hôn khi so saùnh vôùi nguoàn nitô voâ cô. Vôùi vieäc thay ñoåi caùc nguoàn nitô khaùc nhau, keát quaû cho thaáy raèng chuûng vi khuaån A. xylinum nghieân cöùu cuõng coù khaû naêng söû duïng nhieàu nguoàn cô chaát nitô khaùc nhau. Vôùi nhöõng nguoàn nitô toâi tìm ñöôïc vaø thöû nghieäm trong nghieân cöùu naøy, naám men laø nguoàn nitô thích hôïp nhaát cho chuûng vi khuaån A. xylinum phaùt trieån vaø taïo cellulose. Moät soá nghieân cöùu khaùc cho thaáy corn steep liquor (CSL) laø nguoàn nitô thích hôïp nhaát ñeå A. xylinum taïo cellulose. Ví duï, CSL laø nguoàn nitô thích hôïp nhaát cho chuûng A. xylinus BRC5 (Yang et al., 1998), A. xylinus BPR2001 (Matsuoka et al., 1996). Cao naám men laø nguoàn nitô höõu cô, ngoaøi thaønh phaàn nitô ra, coøn chöùa caùc thaønh phaàn dinh döôõng khaùc toát cho vi khuaån phaùt trieån vaø hoã trôï söï taïo thaønh ATP trong quaù trình phaùt trieån cuûa vi khuaån (Sakairi et al., 1998) Toùm laïi, qua caùc thí nghieäm treân, nguoàn carbon vaø nguoàn nitô thích hôïp nhaát cho moâi tröôøng nuoâi caáy vi khuaån A. xylinum ñeå thu nhaän cellulose laø mannitol vaø cao naám men, caùc thí nghieäm sau ñeàu söû duïng nguoàn carbon laø mannitol vaø nguoàn nitô laø cao naám men cho moâi tröôøng leân men toång hôïp cellulose. Vaán ñeà ñaët ra laø caàn phaûi choïn haøm löôïng nguoàn carbon vaø nitô vôùi haøm löôïng nhö theá naøo laø toát nhaát cho moâi tröôøng leân men. Ñeå giaûi quyeát yeâu caàu naøy, caàn tieán haønh thí nghieäm tieáp theo, tìm ñieåm toái öu cuûa thí nghieäm. Toái öu hoaù noàng ñoä nguoàn carbon vaø nitô. Nguoàn carbon thích hôïp nhaát laø mannitol vaø nguoàn nitô thích hôïp nhaát theo keát quaû cuûa thí nghieäm treân laø cao naám men ñöôïc khaûo saùt vôùi caùc noàng ñoä khaùc nhau, ñaùnh giaù hieäu suaát thu nhaän cellulose taïi caùc haøm löôïng ñoù, töø caùc soá lieäu thöïc nghieäm, xaây döïng phöông trình hoài quy, ruùt ra haøm löôïng nguoàn carbon vaø nitô thích hôïp nhaát cho A. xylinum toång hôïp cellulose. Chuaån bò moâi tröôøng HS, nguoàn carbon laø mannitol, nguoàn nitô laø cao naám men vôùi noàng ñoä theo moâ hình thí nghieäm toái öu nhö baûng 4.1 vaø 4.2. Sau khi thu ñöôïc keát quaû thí nghieäm, soá lieäu ñöôïc xöû lyù theo phöông phaùp quy hoaïch thöïc nghieäm ñeå tìm ñieåm toái öu cho thaønh phaàn moâi tröôøng leân men. Phöông trình hoài quy baäc hai bieåu dieãn söï bieán ñoäng cuûa caùc yeáu toá aûnh höôûng ñeán caùc keát quaû thí nghieäm coù daïng sau ñaây: Trong ñoù: y – khoái löôïng cellulose khoâ (g) x1 , x2 - caùc yeáu toá aûnh höôûng b - caùc heä soá cuûa phöông trình hoài quy. Baûng 4.1: Baûng keát quaû thí nghieäm toái öu TN Bieán y x1 x2 1 -1 0 0,737 2 -1 +1 0,793 3 0 -1 0,801 4 0 +1 0,733 5 +1 0 0,807 6 +1 +1 0,817 7 -1 -1 0,807 8 +1 -1 0,713 9 0 0 0,811 10 0 0 0,820 11 0 0 0,791 Baûng 4.2: Baûng maõ hoaù caùc yeáu toá aûnh höôûng caàn khaûo saùt Kí hieäu Nguoàn carbon x1 (gl-1) Nguoàn nitô x2 (gl-1) 0 25 8 -1 20 6 +1 30 10 Trong thí nghieäm naøy, soá löôïng caùc yeáu toá caàn toái öu laø 2 yeáu toá, ñoù laø haøm löôïng nguoàn carbon (mannitol – x1) vaø haøm löôïng nguoàn nitô (cao naám men - x2). Caùc yeáu toá khaùc ñöôïc giöõ khoâng thay ñoåi. Sau khi hoaøn thaønh thí nghieäm, caùc soá lieäu ñöôïc xöû lyù thoáng keâ vaø xaùc ñònh caùc heä soá cuûa phöông trình hoài quy. Caùc heä soá cuûa phöông trình hoài quy treân ñaõ ñöôïc kieåm tra tính yù nghóa theo tieâu chuaån Student vôùi t0.05(2) = 2,12 ñaõ loaïi ñi caùc heä soá khoâng coù yù nghóa thoáng keâ. Sau khi boû ñi caùc heä soá khoâng yù nghóa, loaïi ñi caùc heä soá b1 cuûa bieán x1 vaø b11 cuûa bieán x12, phöông trình hoài quy thu ñöôïc nhö sau: Phương trình hồi quy ñược kiểm tra sự tương thích với thực nghiệm theo tieâu chuẩn Fisher (F). Kiểm tra hệ số F với giaù trị F0,05(f1, f2). f1, f2 tương ứng laø caùc bậc tự do, f1 = 7; f2 = 2. Sau khi kieåm tra söï töông thích cuûa phöông trình hoài quy vôùi thöïc nghieäm cho thaáy Ftính = 3,7 , F0,05 (7;2)= 4,7. Nhö vaäy phöông trình töông thích vôùi thöïc nghieäm. Chuyeån phöông trình hoài quy thu ñöôïc (daïng maõ hoùa) veà daïng phöông trình trong heä truïc töï nhieân. Ta ñöôïc phöông trình nhö sau: Toái öu hoùa thöïc nghieäm ñöôïc thöïc hieän baèng phöông phaùp ñöôøng doác nhaát, baét ñaàu töø ñieåm khoâng, laø möùc cô sôû: x1 = 15 vaø x2 = 6 Choïn böôùc chuyeån ñoäng cuûa yeáu toá x2 laø , suy ra böôùc chuyeån ñoäng cuûa yeáu toá x1 laø . Sau khi khaûo saùt caùc giaù trò thöïc nghieäm toái öu hoùa theo phöông trình hoài quy cho thaáy taïi vò trí x1 = 15,5 gl-1; x2 = 6,5 gl-1 cho hieäu suaát sinh toång hôïp cellulose laø cao nhaát, y* = 8,76 gl-1. Ñoù chính laø ñieåm toái öu thoûa maõn yeâu caàu cuûa thí nghieäm. Ñeå kieåm tra söï sai leäch giöõa lyù thuyeát vaø thöïc nghieäm, moät thí nghieäm nuoâi caáy thu nhaän cellulose vôùi thaønh phaàn moâi tröôøng leân men nhö ñieàu kieän toái öu lyù thuyeát treân. Keát quaû cho thaáy hieäu suaát thu nhaän cellulose khoâng ñaït ñöôïc nhö lyù thuyeát, tuy nhieân taïi ñieàu kieän ñoù, löôïng cellulose thu ñöôïc cuõng cao hôn taïi caùc ñieàu kieän khaùc. Löôïng cellulose ñaït ñöôïc ~8,3 gl-1. Nhö vaäy, keát quaû lyù thuyeát thu ñöôïc coù söï cheânh leäch so vôùi thöïc teá (5,5%), tuy nhieân söï cheânh leäch naøy coù theå chaáp nhaän ñöôïc. Mannitol laø moät polyol, noù vöøa ñoùng vai troø laø cô chaát cho söï toång hôïp cellulose, vöøa laø nguoàn naêng löôïng cho söï saûn sinh ATP, giuùp teá baøo taêng tröôûng vaø taêng khaû naêng taïo thaønh cellulose (Naritomi et al., 1998). Vôùi noàng ñoä mannitol 15,5 gl-1, noàng ñoä cao naám men 6,5 gl-1, löôïng cellulose thu ñöôïc coù theå ñaït ~8,7 gl-1. Tuy nhieân, noàng ñoä cuûa mannitol cao hôn 16 gl-1 vaø noàng ñoä cao naám men cao hôn 6,5 gl-1 laïi khoâng laøm taêng löôïng cellulose taïo thaønh maø ngöôïc laïi, löôïng cellulose taïo ra laïi coù xu höôùng giaûm khi noàng ñoä mannitol quaù cao. Ñieàu naøy khaù phuø hôïp vôùi keát quaû nghieân cöùu cuûa moät soá taùc giaû khaùc, chaúng haïn Masaoka et al. (1993), Oikawa et al. (1995), hay S.A. Hutchens et al. (2006). Ñieàu naøy coù theå giaûi thích bôûi söï öùc cheá A. xylinum taïi noàng ñoä cô chaát quaù cao. Nhö vaäy, qua caùc thí nghieäm ñaõ thöïc hieän, löôïng cellulose ñöôïc toång hôïp toát nhaát vôùi moâi tröôøng hoaù hoïc, löôïng cellulose coù theå ñaït ñöôïc ~8,3 gl-1 khi A. xylinum ñöôïc nuoâi caáy döôùi ñieàu kieän moâi tröôøng goàm coù 15,5 gl-1 mannitol; 6,5 gl-1 cao naám men; 5 gl-1 Na2HPO4; 1,15 gl-1 acid citric; taïi pH 5 vaø nhieät ñoä 280C. KEÁT LUAÄN VAØ ÑEÀ NGHÒ Keát luaän Nhö vaäy, khi khaûo saùt quaù trình sinh tröôûng cuûa chuûng vi khuaån A. xylinum ñöôïc cung caáp bôûi phoøng thí nghieäm Sinh hoïc, giöõ gioáng ôû 4oC treân moâi tröôøng coù thaønh phaàn dinh döôõng töï nhieân maø thaønh phaàn chính coù boå sung nöôùc döøa, cho thaáy chuûng A. xylinum naøy coù khaû naêng sinh tröôûng toát treân moâi tröôøng hoaù hoïc. Keát quaû khaûo saùt cuõng cho thaáy raèng, chuûng A. xylinum naøy coù khaû naêng sinh toång hôïp cellulose toát treân moâi tröôøng hoaù hoïc vaø hieäu suaát sinh toång hôïp cellulose cuûa A. xylinum bò taùc ñoäng nhieàu bôûi caùc yeáu toá ñieàu kieän nuoâi caáy vaø moâi tröôøng nuoâi caáy, trong ñoù coù pH, nguoàn carbon vaø nguoàn nitô. Coù theå naâng cao hieäu suaát sinh toång hôïp cellulose cuûa A. xylinum baèng caùch taùc ñoäng ñeán caùc yeáu toá aûnh höôûng naøy. Cuï theå, choïn pH cho moâi tröôøng nuoâi caáy thích hôïp, loaïi nguoàn carbon, loaïi nguoàn nitô thích hôïp nhaát ñoàng thôøi choïn noàng ñoä caùc nguoàn carbon vaø nitô toái öu cho quaù trình sinh toång hôïp cellulose cuûa A. xylinum. Ví duï, coù theå ñieàu kieän nuoâi caáy ñöôïc ñieàu chænh nhö sau: 15,5 gl-1 mannitol; 6,5 gl-1 cao naám men; 5 gl-1 Na2HPO4; 1,15 gl-1 acid citric; taïi pH 5 vaø nhieät ñoä 280C. Ñeà nghò Moät soá yeáu toá khaùc coù theå taùc ñoäng ñeán khaû naêng taïo cellulose cuûa A. xylinum chöa ñöôïc khaûo saùt trong luaän vaên naøy: caùc nguoàn cô chaát khaùc, caùc chuûng vi sinh vaät khaùc, ñieàu kieän nuoâi caáy coù boå sung oxy, khaû naêng taïo cellulose cuûa caùc chuûng A. xylinum ñoät bieán … Vì theá, moät soá ñeà nghò nghieân cöùu nhö sau: Khaûo saùt aûnh höôûng cuûa caùc nguoàn cô chaát khaùc nhaèm tìm ra caùc nguoàn cô chaát hieäu quaû maø reû tieàn, giaûm chi phí saûn xuaát. Khaûo saùt khaû naêng taïo cellulose cuûa caùc chuûng A. xylinum môùi khaùc ñeå tìm ra nguoàn gioáng vi sinh vaät toát hôn. Khaûo saùt tính chaát vaät lyù vaø hoùa hoïc cuûa caùc saûn phaåm cellulose taïo thaønh döôùi caùc ñieàu kieän nuoâi caáy tónh nhaèm naâng cao caùc tính chaát caàn thieát cho vieäc öùng duïng cellulose vi khuaån laøm maøng bao choáng vi sinh vaät trong thöïc phaåm. Nghieân cöùu theâm caùc khaû naêng öùng duïng cellulose vi khuaån trong thöïc phaåm vaø sinh hoïc: maøng bao thöïc phaåm choáng vi sinh vaät, coá ñònh vi sinh vaät, thöïc phaåm chöùc naêng … TAØI LIEÄU THAM KHAÛO Bae, S., Sugano, Y. & Shoda, M. (2004) Improvement of becterial cellulose production by addition of agar in a jar fermentor. Journal of Bioscience and Bioengineering. 97: 33-38. Bielecki, S., Krystynowicz, A. Turkiewicz, M. Kalinowska, H (2001) Bacterial cellulose. Institute of Technical Biochemistry, Technical Chemistry of Loùdz, Stefanowskiego: 37-46 Brown, R.M., Willison, J.H. & Richarson, C.L (1986) Cellulose biosynthesis in Acetobacter xylinum - Visualization of site of synthesis and direct measurement of in vivo process. Proceeding of the National Academic of Sciences of the United States of America. 73: 4565 - 4569. Chao, Y., Ishida, Sugano, Y. & Shoda, M. (2000) Bacterial cellulose production by Acetobacter xylinum in a 50L internal-loop airlift reactor. Biotechnol Bioeng. 68: 345– 352. Chao, Y.P., Sugano. Y., Kouda, T., Yoshinaga, F., Shoda, M. (1997) Production of Bacterial cellulose by Acetobacter xylinum with an air lift reactor. Biotechnology Techniques. 11: 829-832 El-Saied, H., Basta, A.H., & Gobran, R.H. (2004) Research progress in friendly invironmental technology for the production of cellulose products (bacterial and its application). Polymer-plastic Technology and Engineering. 43: 797-820. DeWulf, P., Joris., & Vandamme, K. (1996) Improved cellulose formation by an Acetobacter xylinum mutant limited In (Keto)Gluconate synthesis. Journal of Chemical Technology and Biotechnology. 67: 376-380. Galas, E., Kristynowicz, A. Tarabasz - Szymanska (1999) Optimization of the production of Bacterial cellulose using multivariable linear regression analysis. Biotechnology. 19: 251-260. George, J., Ramana, K.V., Sabapathy, S.N., Bawa, A.S. (2005) Physico-mechanical properties of chemically treated bacterial (Acetobacter xylinum) cellulose membrane. Microbiology and Biotechnology. 21: 1323-1327. Gindl, W., Keckes, J. (2004) Tensile properties of cellulose acetate butyrate composites reinforce with bacterial cellulose. Composites science and Technology. 64: 2407-2413. Hai Peng, C. (2002) Cultivation af Acetobacter xylinum for bacterial cellulose production in a modified airlift reactor. Biotechnol. Appl. Biochem: 25-132. Hestrin, S., & Schramm, M. (1954) Synthesis of cellulose by Acetobacter xylinum 2. Preparation of freeze-dried cells capable of polymerizing glucose to cellulose. Biochem J. 58: 345–352. Hwang, J.W., Hwang, J.K., Pyun, Y. R., Kim, Y.S. (1999) Effects of pH and dissolved oxygen on cellulose production by Acetobacter xylinum BRC5 in agitated culture. J Ferment Bioeng. 88: 183–188. Iguchi, M., Yamanaka, S., Budhiono, A. (2000) “Bacterial cellulose - a masterpiece of nature's arts,” Journal Of Materials Science 35 (2): 261-270 Jonas, R.F., Luiz (1998) Production and application of microbial cellulose. Polymer Degradation and Stability. 59: 101-106. Klemm D., Udhardt, U., Marsch, S.P (2001) Bacterial cellulose - artificial blood vessels for microsurgery. Progress in Polymer Science. 26: 1561-1603. Klemm, C. (2006) Influence of protective agents for preservation of Gluconacetobacter xylinus on its cellulose production. Cellulose 13: 485 –492. Krystynowicz, A., Czaja, W., Wiktorowska-Jezierska, M., Goncalves-Miskiewicz, M., Turkiewicz and Bielecki, S. (2002) Factors affecting the yield and properties of bacterial cellulose. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology. 29: 189 – 195 Leâ Vaên Vieät Maãn & Laïi Mai Höông (2006) Thí nghieäm vi sinh vaät hoïc thöïc phaåm. Nhaø xuaát baûn Ñaïi hoïc quoác gia Tp. Hoà Chí Minh. Masaoka, S. (1993) Production of cellulose from glucose by Acetobacter xylinum. Journal of fermentation and bioengineering. 75: 18-22. Nguyeãn Caûnh (2004) Quy hoaïch thöïc nghieäm. Nhaø xuaát baûn Ñaïi hoïc quoác gia Tp. Hoà Chí Minh. Nguyeãn Thò Dieãm Chi, Hoaøng Tuyeàn Yeán Linh vaø Nguyeãn Vuõ Thanh (2002) Nghieân cứu nuoâi cấy Acetobacter xylinum laøm maøng sinh học trị phỏng vaø caùc tổn thương da. Y học Tp.HCM. 6: 139-141. Nguyeãn Thuùy Höông (2006) Tuyeån choïn vaø caûi thieän caùc chuûng Acetobacter xylinum taïo cellulose vi khuaån ñeå saûn xuaát vaø öùng duïng ôû quy moâ pilot. Luaän aùn tieán só. Naritomi, T., Kouda, T., Yano, H., Yoshinaga, F (1998) Effect of ethanol on Bacterial cellulose production from fructose in continous culture. Fermentation and Bioengineer. 85: 598-603. Sakairi, N., Asano, M., Ogawa., Nishi, N., & Tokura, S (1998) A method for direct harvest of bacterial cellulose filaments during continuous cultivation of Acetobacter xylinum. Carbohydrate Polymers. 35: 233–237. Schramm, M., & Hestrin, S. (1954) Factors affecting production of cellulose at the air liquid interface of a culture of Acetobacter xylinum. Journal of Genneral Microbiology. 11: 123 –129. Son, H.J., Heo, M.S., Kim, Y.G., Lee, S.J. (2001) Optimization of fermentation conditions for the production of Bacterial cellulose by a newly isolated Acetobacter sp.A9 in shaking cultures. Biotechnology and Applied Biochemistry. 33: 1-5. Toda, K., Asukua, T. (1997) Cellulose production by acid acetic-resistant Acetobacter xylinum. Fermentation and Bioengineering. 84: 228-231. Vandamme, E.J., De Baets, S., Vanbaelen, A., Joris, K. & De Wulf, P. (1998) Improved production of bacterial cellulose and its application potential. Polymer Degradation and Stability. 59: 93-99 Watanabe K., T.M., Morinaga Y., Yoshinaga F. (1998) Structure features and properties of Bacterial cellulose produced in agitated culture. Cellulose. 5: 187-200. Yang, L.Z. (2007) Effect of addition of sodium alginate on bacterial cellulose production by Acetobacter xylinum. J Ind Microbiol Biotechnol. 34: 483–489. Yang, Y.K. (1998) Cellulose production by Acetobacter xylinum BRC5 under agitated condition. Fermentation and Bioengineering. 85: 312-317. Yoshinaga, T.T. (1997) Production of Bacterial cellulose by agitation culture systems. Pure and application chemistry. 69: 2453-2458. Zou, K., Wu, S.C., Wu, W.T. (2006) A hybrid model combining hydrodynamic and biological effects of bacterial cellulose with a pilot scale airlift reactor. Biochemical Engineer 29: 81-90. PHUÏ LUÏC Caùc coâng thöùc söû duïng ñeå tính toaùn trong thí nghieäm: Phöông trình hoài quy tuyeán tính coù daïng: Trong ñoù: b laø caùc heä soá Soá heä soá cuûa phöông trình hoài quy ñöôïc tính theo coâng thöùc: Trong ñoù, m laø soá heä soá cuûa phöông trình, k laø soá yeáu toá aûnh höôûng Tính toaùn caùc heä soá cuûa phöông trình: Phöông sai cuûa caùc heä soá: Kieåm tra tính yù nghía cuûa caùc heä soá cuûa phöông trình hoài quy theo tieâu chuaån Student, so saùnh ttính vôùi ttra Kieåm tra söï töông thích vôùi thöïc nghieäm cuûa phöông trình hoài quy baèng tieâu chuaån Fisher, so saùnh Ftính vôùi Ftra F ñöôïc tính theo coâng thöùc: Trong ñoù: N laø soá thí nghieäm, l laø soá heä soá cuûa phöông trình hoài quy, si laø caùc phöông sai cuûa caùc thí nghieäm, y laø khoái löôïng cellulose ôû caùc thí nghieäm.