Luận văn Nghiên cứu sản xuất enzym cellulase từ nấm mốc

ng tuaàn hoaøn carbon toaøn caàu. Veà maët hoùa hoïc, chuùng goàm 2 polymer maïch thaúng cellulose vaø hemicellulose vaø moät polymer coù caáu truùc 3 chieàu lignin. Cellulose ñöôïc bao quanh bôûi phaân töû hemicellulose vaø lignin. Hình 2.1– Caáu truùc cuûa ligno-cellulose Cellulose [2] Cellulose laø polysaccharide chuû yeáu cuûa thaønh teá baøo thöïc vaät. Trong boâng noù chieám treân 90%, coøn trong goã hôn 50%. Ngoaøi ra, ngöôøi ta coøn thaáy chuùng coù nhieàu ôû teá baøo moät soá loaøi VSV. Ôû teá baøo thöïc vaät vaø ôû teá baøo moät soá loaøi VSV, chuùng toàn taïi ôû daïng sôïi. Khi ñun soâi vôùi acid sulfuric ñaëc, cellulose seõ chuyeån thaønh glucose coøn khi thuûy phaân trong ñieàu kieän nheï nhaøng seõ taïo thaønh disacarit cellobiose. Cellulose khoâng coù trong teá baøo ñoäng vaät. Chuùng laø moät homopolimer maïch thaúng, ñöôïc caáu taïo bôûi caùc b-D-glucose-pyranose. Caùc thaønh phaàn naøy lieân keát vôùi nhau bôûi lieân keát b-1,4 glucoside. Tinh boät cuõng ñöôïc caáu taïo bôûi caùc glucose naøy vaø baèng lieân keát a-1,4 glucoside. Ñieåm khaùc bieät laø tinh boät chöùa caùc goác glucose phaân nhaùnh coøn cellulose chöùa caùc glucose khoâng phaân nhaùnh. Caùc goác glucose trong cellulose thöôøng leäch moät goùc 1800 vaø coù daïng nhö moät chieác gheá baønh. Cellulose thöôøng chöùa 10.000-14.000 goác ñöôøng vaø ñöôïc caáu taïo nhö sau: Ñaàu khoâng khöû Ñaàu khöû Hình 2.2- Caáu taïo phaân töû cellulose. Troïng löôïng phaân töû cuûa cellulose khoaûng töø 50000-2500000 Dalton. Caùc phaân töû cellulose keát hôïp vôùi nhau nhôø löïc huùt Van der war vaø lieân keát hydro. Caùc phaân töû cellulose taïo neân sôïi sô caáp coù ñöôøng kính khoaûng 3nm. Caùc sôïi sô caáp keát hôïp vôùi nhau taïo thaønh vi sôïi. Trong ñieàu kieän töï nhieân, caùc vi sôïi thöôøng khoâng ñoàng nhaát, chuùng thöôøng toàn taïi 2 vuøng: Vuøng keát tinh: caùc maïch cellulose keát vôùi nhau theo moät traät töï ñeàu ñaën nhôø lieân keát hydro noái nhoùm hydroxyl thöù nhaát cuûa maïch naøy vôùi nhoùm hydroxyl ôû maïch cacbon cuûa maïch khaùc. Ôû û vuøng naøy cellulose raát beàn vöõng döôùi taùc ñoäng cuûa ñieàu kieän beân ngoaøi. Enzym cellulase chæ coù taùc duïng ôû beà maët heä sôïi ôû vuøng naøy. Vuøng voâ ñònh hình: caùc maïch lieân keát vôùi nhau nhôø löïc Vander Waals. ÔÛ vuøng naøy cellulose coù caáu truùc khoâng chaët vaø deã bò taùc ñoäng bôûi caùc yeáu toá beân ngoaøi. Khi gaëp nöôùc, chuùng deã bò tröông phoàng leân, enzym cellulase raát deã taùc ñoäng, laøm thay ñoåi toaøn boä caáu truùc cuûa chuùng. Chieàu daøi phaân töû cellulose trong vuøng voâ ñònh hình thöôøng lôùn gaáp haøng chuïc laàn so vôùi chieàu daøi cuûa phaân töû cellulose keát tinh. Caùc caây goã laâu naêm thöôøng chöùa löôïng cellulose keát tinh nhieàu, caùc caây thaûo moäc ngöôïc laïi, chöùa nhieàu cellulose voâ ñònh hình. Trong phaân töû cellulose coù nhieàu lieân keát hydroxyl toàn taïi döôùi daïng töï do, hydrogen cuûa chuùng deã bò thay theá bôûi moät soá goác hoaù hoïc nhö metyl hoaëc goác acetyl taïo neân caùc daãn xuaát ete hoaëc este cuûa cellulose. Moät trong nhöõng daãn xuaát ñöôïc öùng duïng raát nhieàu laø CMC, trong ñoù moät soá nhoùm hydroxyl cuûa cellulose ñöôïc thay theá baèng goác –OCH2COOH. Hình 2.3–Caáu truùc cuûa CMC Trong thieân nhieân, khi thöïc vaät vaø VSV coù chöùa cellulose bò cheát, cellulose cuûa chuùng chæ bò phaân huûy bôûi caû moät taäp ñoaøn VSV. Caùc loaøi VSV seõ thay phieân nhau phaân huûy cellulose ñeå taïo ra muøn vaø töø ñoù caùc thaønh phaàn caáu taïo cuûa cellulose laïi ñöôïc ñi vaøo caùc con ñöôøng chuyeån hoùa trong chu trình chuyeån hoùa voâ taän cuûa thieân nhieân. Trong thöïc vaät, cellulose thöôøng toàn taïi moät löôïng raát lôùn. Soá löôïng cellulose thöôøng khoâng ñeàu ôû caùc cô quan khaùc nhau trong thöïc vaät. Ngöôøi ta thaáy raèng, löôïng cellulose ít nhaát ôû laù vaø nhieàu nhaát ôû thaân caây, ñaëc bieät ôû sôïi boâng, cellulose coù theå chieám ñeán 80-90%. Ôû VSV caáu truùc cuûa cellulose khoâng beàn vaø khoâng theo moät traät töï nhö ôû thöïc vaät. Ôû ñoù, cellulose thöôøng thuoäc loaïi voâ ñònh hình. Chính vì theá vieäc phaân huûy chuùng thöôøng raát deã thöïc hieän. Hemicellulose [1] Hemicellulose laø polysaccharide coù phaân töû löôïng nhoû hôn phaân töû löôïng cuûa cellulose raát nhieàu. Chuùng thöôøng ñöôïc caáu taïo töø 150 goác ñöôøng. Caùc goác ñöôøng naøy ñöôïc noái vôùi nhau baèng caùc lieân keát b-1,4; b-1,3; b-1,6 glucoside. Chuùng thöôøng laø nhöõng maïch ngaén, phaân nhaùnh. Caáu truùc cuûa hemicellulose khoâng beàn, chuùng khoâng hoøa tan trong nöôùc nhöng deã daøng bò phaân giaûi bôûi acid loaõng hoaëc kieàm. Hemicellulose cuõng laø thaønh phaàn cuûa teá baøo thöïc vaät vaø toàn taïi chuû yeáu ôû caùc phaàn nhö: voû haït, beï ngoâ, caùm, rôm raï, traáu. Khi thuûy phaân hemicellulose seõ thu ñöôïc caùc monosaccharide thuoäc nhoùm hexose nhö manose, galactose, nhoùm pentose nhö arabinose, xilose. Tuøy theo trong thaønh phaàn cuûa hemicellulose coù chöùa monosaccharide naøo maø noù seõ coù nhöõng teân töông öùng nhö mannan, galactan, vaø pentozan. Caùc polysaccharide nhö mannan, galactan, araban vaø xilan ñeàu laø caùc chaát phoå bieán trong thöïc vaät, chuû yeáu ôû caùc thaønh phaàn cuûa maøng teá baøo cuûa caùc cô quan khaùc nhau nhö: goã, rôm raï,… Trong thieân nhieân, loaïi hemicellulose deã gaëp nhaát laø xylan. Xylan thöôøng thaáy nhieàu trong rôm, raï (chieám khoaûng 30%), caây laù roäng (chieám khoaûng 20-25%). Ôû nhöõng caây laù kim thöôøng chöùa ít xylan. Lignin [21] Lignin laø moät hôïp chaát cao phaân töû, chuùng coù nhieàu ôû thöïc vaät baäc cao. Ôû caây goã, lignin chieám tôùi 20-30%. Trong thaønh phaàn cuûa lignin, carbon chieám tôùi 69%, hydro chieám 7% vaø oxy chieám 24% Lignin coù caáu taïo voâ ñònh hình, khoâng tan trong nöôùc vaø trong acid voâ cô. Döôùi taùc duïng cuûa bisulfite natri vaø H2SO4 lignin bò phaân giaûi taïo ra caùc hôïp chaát thôm. Trong thöïc vaät chuùng nhö chaát ximang lieân keát caùc teá baøo laïi vôùi nhau, laøm taêng ñoä beàn cô hoïc cho teá baøo, taêng khaû naêng choáng thaám nöôùc, ngaên chaën caùc ñoäc toá, caùc VSV töø beân ngoaøi. Trong suoát quaù trình phaùt trieån cuûa thöïc vaät, lignin ñöôïc taïo ra, khoâng bò bieán ñoåi sinh lyù. Chuùng coù caáu taïo raát phöùc taïp, taïo thaønh töø söï ngöng tuï cuûa caùc loaïi röôïu khaùc nhau. Hình 2.4–Caáu taïo phaân töû lignin Enzym cellulase [1,2,4,23] Phaân loaïi enzym cellulase [4] Teân goïi cellulase duøng ñeå chæ chung cho caùc enzym tham gia phaân caét hôïp chaát cellulose. Taát caû caùc enzym cellulase ñeàu coù taùc duïng phaân caét lieân keát b-1,4 giöõa 2 ñôn vò glucose vaø ñöôïc caùc nhaø khoa hoïc phaân ra laøm 3 nhoùm chuû yeáu sau ñaây: 1,4 b-D-glucan cellobiohydrolase (EC.3.2.1.91) (CBH). Enzym caét ñaàu cuoái cuûa chuoãi cellulose ñeå taïo thaønh cellobiose. Enzym naøy coøn coù moät loaït caùc teân khaùc nhö: cellobiohydrolase, cellobiosidase vaø avicellase. 1,4 b-D-glucan –4- glucanohydrolase (EC.3.2.1.4) (EG). Enzym naøy tham gia phaân giaûi lieân keát b-1,4 glucoside trong cellulose vaø b-D-glucanase. Saûn phaåm cuûa quaù trình phaân giaûi laø cellodextrin, cellobiose, vaø glucose. Enzym naøy coøn coù moät loaït teân khaùc nhö: endoglucanase, endo 1,4 b-D-glucanase, C-cellulase. b-D-glucoside glucohydrolase (EC.3.2.1.21). Enzym naøy tham gia phaân huûy cellobiose taïo thaønh glucose. Chuùng khoâng coù khaû naêng phaân huûy cellulose nguyeân thuûy. Trong caùc taøi lieäu khoa hoïc, chuùng coù teân laø cellobiase vaø b-glucosidase. Nhieàu nghieân cöùu cho thaáy raèng caùc enzym EG coù taùc duïng phaân caét toát treân cellulose voâ ñònh hình vaø ñaëc bieät coù taùc duïng treân cellulose bieán tính nhö CMC, HEC. Vì vaäy, ñeå xaùc ñònh hoaït tính enzym naøy ngöôøi ta thöôøng söû duïng cô chaát laø CMC. Coøn caùc enzym CBH thì coù taùc duïng treân cellulose keát tinh, ít treân cellulose voâ ñònh hình vaø haàu nhö khoâng coù taùc duïng phaân caét cellulose bieán tính. Trong heä thoáng enzym CBH thì enzym CBH I taán coâng töø ñaàu khöû, trong khi CBH II taán coâng vaøo ñaàu khoâng khöû cuûa chuoãi cellulose. Söï thuûy phaân cellulose laø söï keát hôïp cuûa 3 loaïi enzym treân. Ñaàu tieân enzym EG taán coâng vaøo giöõa maïch cellulose vaø giaûi phoùng caùc ñaàu cuoái cuûa chuoãi. Tieáp sau ñoù caùc enzym CBH tieáp tuïc phaân caét ñeå taïo saûn phaåm cuoái laø cellobiose. Vieäc phaân caét cuoái cuøng taïo thaønh glucose laø nhôø vaøo enzym thöù ba b-glucosidase. Vì vaäy tuy raèng enzym b-glucosidase khoâng coù taùc duïng treân chuoãi cellulose nhöng noù vaãn ñöôïc xeáp vaøo heä thoáng enzym cellulase. Baûng 2.1 –Söï phaân loaïi enzym phaân caét 1,4-b-glucans Teân heä thoáng Teân thöôøng goïi EC No. Cô chaát Lieân keát thuûy phaân Saûn phaåm chính Endo 1,4-b-D-glucan-4-glucanohydrolase Cellulase, endoglucanase (EG) 3.2.1.4 Cellulose, 1,3-1,4-b-glucans 1,4-b 1,4-b-dextrins, 1,3-1,4-b-dextrins 1,3-1,4-b-D-glucan-4-glucanohydrolase Lichenase, b-glucanase 3.2.1.73 Lichenin, 1,3-1,4-b-glucans Keá 1,4-b sau 1,3-b- Hoãn hôïp 1,3-1,4-b-dextrins 1,3-b-D-glucan-3/4-glucanohydrolase Laminarinase 3.2.1.6 Laminarin, 1,3-1,4-b-glucan Keá lieân keát 1,4-b- hoaëc 1,3-b- vaø sau 1,3-b- Hoãn hôïp 1,3-1,4-b-dextrins 1,3-b-D-glucan-3-glucanohydrolase Laminarinase 3.2.1.39 Laminarin, pachyman (1,3-1,4-b-glucans) 1,3-b 1,3-b-dextrins (1,4-b-dextrins) Exo 1,4-b-D-glucan-cellobiohydrolase Cellobiohydrolase (CBH) 3.2.1.91 Cellulose, 1,3-1,4-b-glucans 1,4-b Cellobiose ,4-b-D-glucan-glucohydrolase Exoglucanase 3.2.1.74 1,4-b-glucans 1,4-b glucose b-glucosidase Cellobiase 3.2.1.21 b-D-glucosides 1,4-b 1,3-b 1,6-b glucose Tuy nhieân söï phaân loaïi naøy chöa thaät söï thoûa ñaùng khi moät vaøi enzym CBH cuõng coù hoaït tính nhö enzym EG. Söï phaân loaïi enzym cellulase trôû neân phöùc taïp hôn khi chuùng coù hoaït tính treân polysaccharide nhö xylan. Do ñoù khoùa phaân loaïi môùi cho nhöõng enzym naøy cuõng nhö caùc enzym thuûy phaân lieân keát glucoside laø döïa treân söï töông ñoàng veà caáu truùc cuûa chuùng. Ñieàu naøy caàn nhöõng thoâng tin veà traät töï saép xeáp caùc aminoacid cuûa chuùng. Hieän nay ngöôøi ta phaân loaïi caùc enzym thuûy phaân lieân keát glycoside thaønh 111 nhoùm, trong ñoù enzym cellulase coù trong 11 nhoùm (töø nhoùm 5 ñeán nhoùm 10, 12, 26, 44, 45, vaø 48). [23]. Trong baøi naøy, teân enzym ñöôïc söû duïng theo caùch phaân loaïi cuõ. Moái quan heä caáu truùc-chöùc naêng trong enzym cellulase [4] Enzym coù caáu truùc 2 phaàn goàm phaàn xuùc taùc vaø phaàn lieân keát vôùi cô chaát laø ñaëc tröng cho enzym phaân caét cellulose ñöôïc thu nhaän töø caû naám moác vaø vi khuaån. Söï toàn taïi cuûa phaàn lieân keát vôùi cô chaát cuõng phoå bieán treân nhöõng enzym khaùc tham gia phaân caét cô chaát raén. Trong enzym cuûa naám moác, phaàn lieân keát vôùi cellulose (CBD) ñöôïc lieân keát vôùi phaàn xuùc taùc bôûi nhöõng lieân keát taùch bieät hoaøn toaøn giöõa 2 phaàn naøy. CBD coù theå laø ñaàu C hoaëc ñaàu N cuûa enzym. Trong moät vaøi tröôøng hôïp nhö trong enzym E4 cuûa vi khuaån Thermomonospora fusca, CBD laø moät phaàn caáu truùc beân trong cuûa enzym. Moät vaøi vi khuaån ñöôïc nghieân cöùu saûn xuaát enzym coù caáu truùc 2 phaàn nhö treân. Nhöng coù ñieåm khaùc bieät laø caùc phaàn ñöôïc lieân keát ñoàng hoaù trò vaø phaàn xuùc taùc tham gia thuûy phaân cellulose vaø hemicellulose cuõng nhö vuøng lieân keát vôùi cô chaát. Hình 2.7– Caáu truùc 2 phaàn cuûa enzym CBH töø Trichoderma reesei. Phaàn xuùc taùc lôùn ñöôïc lieân keát vôùi phaàn lieân keát vôùi cellulose nhoû hôn. Nhieàu VSV hieáu khí saûn xuaát soá löôïng lôùn phöùc chaát cellulosome – goàm nhieàu boù sôïi protein lieân keát khoâng ñoàng hoùa trò. Cellulosome coù theå bao goàm vaøi enzym EG, CBH, vaø nhöõng glycanase khaùc nhöng nhöõng protein cuõng tham gia trong lieân keát giöõa cellulosome vôùi cô chaát. Moãi moät enzym rieâng bieät trong phöùc heä enzym thoâng thöôøng khoâng coù hoaït tính treân cellulose keát tinh, nhöng cellulosome thì coù theå. Moãi moät thaønh phaàn enzym ñöôïc gaén vôùi protein khoâng phaûi enzym ñöôïc goïi laø scaffoldin. Polypeptide cuûa scaffoldin goàm nhöõng phaàn CBD laëp laïi beân trong caáu truùc phaân töû, phaàn naøy töông taùc vôùi enzym. Troïng löôïng phaân töû cuûa cellulosome coù theå ñeán 2000kDa. Maëc duø hieän nay ñaõ coù 13 loaïi CBD ñaõ ñöôïc xaùc ñònh döïa vaøo söï töông ñoàng cuûa chuùng nhöng chæ moät trong chuùng toàn taïi trong enzym töø naám moác. CBD naám moác ñöôïc phaân bieät do kích thöôùc nhoû cuûa chuùng (<40 aminoacid). Gioáng nhö phaàn lôùn protein lieân keát vôùi carbonhydrate, söï lieân keát vôùi cellulose chieám öu theá do töông taùc töø caùc amino acid coøn laïi. CBD laø thaønh phaàn quan troïng taïo chöùc naêng cuûa cellulase treân cô chaát raén. Neáu chuùng bò loaïi boû baèng caùc kyõ thuaät protein thì caû hoaït tính vaø lieân keát giöõa cellulase vaø cô chaát raén ñeàu bò giaûm nghieâm troïng. Trong nhieàu nghieân cöùu cho thaáy raèng lieân keát giöõa cellulase vaø cellulose laø khoâng thuaän nghòch, vaø ñoâi khi ngöôøi ta cho raèng nguyeân nhaân laø do CBD. Söï töông taùc raát phöùc taïp, tuy nhieân ñöôïc xem nhö laø söï taùc ñoäng laãn nhau giöõa phaàn xuùc taùc vaø phaàn lieân keát, vaø taïo ra keát quaû trong vieäc lieân keát vôùi cellulose. Trong enzym cuûa naám moác khoâng coù baèng chöùng cho raèng söï hieän dieän cuûa CBD coù vai troø taùc ñoäng trong vieäc thuûy phaân cellulose keát tinh. Caáu truùc khoâng gian cuûa protein theå hieän chi tieát tính chaát hoùa sinh cuûa enzym. Vì vaäy nhieàu moâ hình caáu truùc cuûa cellulase ñaõ ñöôïc ñeà ra. Ví duï EG I vaø CBH II cuûa T.reesei coù caáu truùc gioáng nhau 45%. So saùnh caáu truùc cuûa chuùng ta thaáy raèng trung taâm hoaït ñoäng cuûa CBH I ñöôïc ñaët beân trong oáng (tunnel) ñöôïc taïo thaønh bôûi caùc voøng xoaén ôû beà maët. Trong khi ñoù ôû EG I thì caùc voøng xoaén naøy ít hôn, chính vì theá enzym naøy coù trung taâm hoaït ñoäng coù dieän tích tieáp xuùc roäng hôn. Hình daùng oáng cuûa trung taâm hoaït ñoäng trong CBH I cuõng nhö trong caùc CBH khaùc, giaûi thích veà maët caáu truùc cho söï hoaït ñoäng cuûa enzym. Nhöõng tunnel naøy caøng daøi giöõ enzym lieân keát vôùi chuoãi cellulose caøng laâu vaø vì vaäy söï töông taùc nhieàu hôn khi noù di chuyeån doïc theo chuoãi ñeå thuûy phaân ñôn vò cellobiose. Trung taâm hoaït ñoäng môû cuûa EG cho pheùp chuùng thuûy phaân ôû giöõa maïch cellulose. Hình 2.8- Caáu truùc cuûa EG vaø CBH cuûa Trichoderma reesei Caáu truùc naøy cho thaáy nhoùm xuùc taùc cuûa CBH I ñöôïc bao quanh raát chaët cheõ coøn trong EG thì loûng leûo hôn. Caùc yeáu toá aûnh höôûng ñeán toác ñoä phaûn öùng cuûa enzym [1] Noàng ñoä enzym Trong ñieàu kieän thöøa cô chaát thì toác ñoä phaûn öùng enzym tæ leä tuyeán tính vôùi noàng ñoä enzym. Nhöng khi noàng ñoä enzym quaù lôùn toác ñoä phaûn öùng enzym cuõng taêng chaäm. V= k [E] Vôùi v: vaän toác phaûn öùng [E] noàng ñoä enzym. Hình 2.9– Aûnh höôûng noàng ñoä enzym ñeán toác ñoä phaûn öùng Noàng ñoä cô chaát Môû ñaàu phaûn öùng phaûi taïo thaønh phöùc enzym-cô chaát, sau ñoù phöùc ES chuyeån hoùa tieáp taïo thaønh saûn phaåm cuoái cuøng cuûa phaûn öùng enzym töï do, enzym laïi keát hôïp vôùi phaân töû cô chaát khaùc baét ñaàu voøng xuùc taùc môùi. Noàng ñoä cô chaát caøng cao toác ñoä phaûn öùng caøng taêng nhöng noàng ñoä cô chaát taêng ñeán möùc ñoä naøo ñoù thì duø noàng ñoä cô chaát coù taêng nhöng toác ñoä phaûn öùng vaãn khoâng ñoåi. Hình 2.10-Aûnh höôûng noàng ñoä cô chaát ñoái vôùi toác ñoä xuùc taùc ban ñaàu Vmax AÛnh höôûng cuûa caùc chaát kìm haõm Caùc chaát kìm haõm hoaït ñoäng cuûa enzym thöôøng laø caùc chaát coù maët trong caùc phaûn öùng enzym, laøm giaûm hoaït tính enzym nhöng laïi khoâng bò enzym laøm thay ñoåi tính chaát hoùa hoïc, caáu taïo hoùa hoïc vaø tính chaát vaät lyù cuûa chuùng. Caùc chaát gaây kìm haõm hoaït ñoäng cuûa caùc enzym bao goàm caùc ion, caùc phaàn töû voâ cô, caùc chaát voâ cô, caùc chaát höõu cô vaø caû protein. Caùc chaát kìm haõm coù yù nghóa lôùn trong ñieàu khieån caùc quaù trình trao ñoåi ôû teá baøo sinh vaät. Cô cheá kìm haõm cuûa caùc chaát kìm haõm coù theå laø thuaän nghòch hoaëc khoâng thuaän nghòch. Trong tröôøng hôïp caùc chaát kìm haõm thuaän nghòch, phaûn öùng enzym vaø chaát kìm haõm seõ nhanh choùng ñaït ñöôïc traïng thaùi caân baèng. Trong tröôøng hôïp chaát kìm haõm khoâng thuaän nghòch, caùc chaát kìm haõm keát hôïp vôùi enzym baèng lieân keát ñoàng hoùa trò. Ngoaøi ra caùc chaát kìm haõm keát hôïp vôùi enzym coøn theo moät cô cheá khaùc maø hieän nay caùc nhaø khoa hoïc vaãn chöa giaûi thích troïn veïn. Theo ñoù caùc chaát kìm haõm gaén raát chaët vôùi enzym taïo thaønh phöùc hôïp EI. Phöùc hôïp naøy bò phaân raõ raát chaäm. Chaát kìm haõm caïnh tranh laø caùc chaát coù caáu truùc töông töï nhö caáu truùc cuûa cô chaát. Chuùng thöôøng laø nhöõng chaát kìm haõm thuaän nghòch. Chuùng coù khaû naêng keát hôïp vôùi trung taâm hoaït ñoäng cuûa enzym. Khi ñoù chuùng seõ chieám vò trí cuûa cô chaát trong trung taâm hoaït ñoäng. Do ñoù cô chaát khoâng coøn cô hoäi tieáp xuùc vôùi trung taâm naøy. Vaø hoaït ñoäng cuûa enzym seõ bò giaûm. Chaát kìm haõm khoâng caïnh tranh: neáu nhö trong cô cheá kìm haõm caïnh tranh, caùc chaát kìm haõm chieám trung taâm hoaït ñoäng cuûa enzym thì trong cô cheá kìm haõm khoâng caïnh tranh, chaát kìm haõm khoâng chieám trung taâm hoaït ñoäng cuûa enzym maø laø ôû moät vò trí ngoaøi trung taâm hoaït ñoäng cuûa enzym. Keát quaû söï keát hôïp naøy chaát kìm haõm laøm thay ñoåi caáu truùc khoâng gian cuûa phaân töû enzym theo chieàu höôùng baát lôïi cho hoaït ñoäng xuùc taùc. Vì theá, caùc chaát kìm haõm laøm giaûm hoaït ñoäng cuûa enzym. Caùc chaát hoaït hoùa Caùc chaát coù taùc duïng laøm taêng hoaït tính enzym goïi laø caùc chaát hoaït hoùa enzym. Caùc chaát hoaït hoùa enzym coù baûn chaát hoùa hoïc raát khaùc nhau. Chuùng coù theå laø nhöõng anion, caùc kim loaïi töø oâ thöù 11 ñeán oâ thöù 55 trong baûng heä thoáng tuaàn hoaøn Mendeleev, caùc chaát höõu cô coù caáu truùc phöùc taïp. Caùc chaát hoaït hoùa chæ coù taùc duïng hoaït hoùa ôû moät noàng ñoä nhaát ñònh. Vöôït quaù noàng ñoä naøy, chuùng seõ gaây öùc cheá hoaït ñoäng cuûa enzym. Ôû noàng ñoä hoaït hoùa, caùc chaát hoaït hoùa thöôøng laøm nhieäm vuï chuyeån nhoùm hydrogen hoaëc nhöõng chaát coù khaû naêng phaù vôõ moät soá lieân keát trong phaân töû tieàn enzym hoaëc caùc chaát coù taùc duïng phuïc hoài caùc nhoùm chöùc trong trung taâm hoaït ñoäng cuûa enzym. Nhieät ñoä Nhieät ñoä coù aûnh höôûng raát lôùn ñeán phaûn öùng enzym. Toác ñoä phaûn öùng enzym khoâng phaûi luùc naøo cuõng tæ leä thuaän vôùi nhieät ñoä phaûn öùng. Toác ñoä phaûn öùng chæ taêng ñeán moät giôùi haïn nhieät ñoä nhaát ñònh. Vöôït quaù nhieät ñoä ñoù, toác ñoä phaûn öùng enzym seõ giaûm vaø daàn ñeán möùc trieät tieâu. Neáu ñöa nhieät ñoä cao hôn möùc nhieät ñoä toái öu, hoaït tính enzym seõ giaûm. Khi ñoù enzym khoâng coù khaû naêng phuïc hoài laïi hoaït tính. Nhieät ñoä toái öu cuûa enzym phuï thuoäc nhieàu vaøo söï coù maët cuûa cô chaát, kim loaïi, pH, caùc chaát baûo veä. Trong quaù trình phaûn öùng, ngöôøi ta thöôøng cho enzym phaûn öùng ôû nhieät ñoä döôùi nhieät ñoä toái öu vì neáu ta ñeå ôû nhieät ñoä toái öu thì chæ caàn söï thay ñoåi nhoû cuõng laøm cho enzym maát hoaït tính. Nhieät ñoä toái öu cho enzym cellulase hoaït ñoäng laø 45-600C. pH moâi tröôøng pH moâi tröôøng thöôøng aûnh höôûng ñeán möùc ñoä ion hoùa cô chaát, enzym vaø ñaëc bieät aûnh höôûng ñeán ñoä beàn cuûa enzym. Chính vì theá pH coù aûnh höôûng raát maïnh ñeán phaûn öùng cuûa enzym. Hình 2.11–Aûnh höôûng cuûa pH ñeán hoaït tính enzym Ñoái vôùi cellulase pH toái thích laø 5-6. Enzym cellulase töø VSV Söï thuûy phaân cellulose bôûi enzym cellulase VSV [2] Trong thieân nhieân cuõng toàn taïi nhöõng loaøi VSV chæ coù khaû naêng sinh toång hôïp moät loaïi enzym trong heä enzym cellulase. Hoaït tính enzym naøy thöôøng maïnh hôn caùc loaïi enzym coøn laïi. Chính vì theá, trong ñieàu kieän töï nhieân, moät loaøi VSV khoâng theå tham gia thuûy phaân trieät ñeå cellulose ñöôïc. Töø nhöõng nghieân cöùu rieâng reõ töøng loaïi enzym ñeán nghieân cöùu taùc ñoäng toång hôïp cuûa caû 3 loaïi enzym cellulase, nhieàu taùc giaû ñeàu ñöa ra keát luaän chung laø caùc loaïi enzym cellulase seõ thay phieân nhau phaân huûy cellulose ñeå taïo saûn phaåm cuoái cuøng laø glucose. Caùc loaøi VSV coù khaû naêng sinh toång hôïp cellulase trong ñieàu kieän töï nhieân thöôøng bò aûnh höôûng bôûi taùc ñoäng nhieàu maët cuûa caùc yeáu toá ngoaïi caûnh neân coù loaøi phaùt trieån raát maïnh, coù loaøi laïi phaùt trieån yeáu. Chính vì theá, vieäc phaân huûy cellulose trong töï nhieân thöôøng tieán haønh khoâng ñoàng boä, xaûy ra raát chaäm. Hình 2.6- Cô cheá chuyeån hoùa cellulose Trong ñieàu kieän phoøng thí nghieäm hay ñieàu kieän coâng nghieäp, vieäc phaân huûy cellulose baèng enzym ngoaøi caùc yeáu toá kyõ thuaät nhö nhieät ñoä, pH, noàng ñoä cô chaát, löôïng enzym,…, moät yeáu toá raát ñöôïc quan taâm ñoù laø tính ñoàng boä cuûa heä enzym cellulase töø nhieàu nguoàn VSV khaùc nhau. Quaù trình thuûy phaân cellulose chæ coù theå ñöôïc tieán haønh ñeán saûn phaåm cuoái cuøng khi söû duïng ñoàng boä ba loaïi enzym cellulase trong heä enzym cellulase. Moãi loaøi VSV chæ coù theå sinh toång hôïp öu vieät moät loaïi enzym. Chính vì theá ta phaûi khai thaùc enzym cellulase töø nhieàu nguoàn VSV. Caùc phöông phaùp nuoâi caáy VSV [2] Coù 2 phöông phaùp nuoâi caáy VSV laø nuoâi caáy beà maët vaø nuoâi caáy beà saâu. a) Phöông phaùp nuoâi caáy beà maët Moâi tröôøng loûng Ôû moâi tröôøng loûng VSV seõ phaùt trieån treân beà maët moâi tröôøng taïo thaønh khuaån laïc ngaên caùch pha loûng vaø pha khí. Ôû ñaây VSV seõ söû duïng chaát dinh döôõng töø dung dòch moâi tröôøng, oxy töø khoâng khí, tieán haønh quaù trình toång hôïp enzym. Enzym ngoaïi baøo seõ ñöôïc taùch ra töø sinh khoái vaø hoøa tan vaøo dung dòch moâi tröôøng. Enzym noäi baøo seõ naèm trong sinh khoái VSV. Trong phöông phaùp naøy ngöôøi ta quan taâm ñeán chieàu cao moâi tröôøng loûng. Neáu chieàu cao naøy quaù lôùn, VSV seõ khoâng coù khaû naêng ñoàng hoùa heát caùc chaát dinh döôõng ôû phía ñaùy khay nuoâi caáy. Neáu chieàu cao nhoû seõ thieáu chaát dinh döôõng hieäu suaát thu hoài enzym seõ khoâng cao. Moâi tröôøng ñaëc VSV khoâng chæ phaùt trieån treân beà maët moâi tröôøng maø coøn phaùt trieån treân beà maët cuûa caùc haït moâi tröôøng, naèm haún trong loøng moâi tröôøng. Moâi tröôøng nuoâi caáy vöøa coù ñoä xoáp cao vöøa phaûi coù ñoä aåm thích hôïp. Neáu ñoä aåm cao seõ laøm beát moâi tröôøng laïi, khoâng khí khoâng theå xaâm nhaäp vaøo trong loøng moâi tröôøng, neáu ñoä aåm thaáp khoâng thuaän lôïi cho VSV phaùt trieån. Thoâng thöôøng W=55-65% laø hôïp lyù. Öu ñieåm cuûa phöông phaùp nuoâi caáy beà maët laø deã thöïc hieän, khi nhieãm VSV laï thöôøng nhieãm cuïc boä ta deã daøng xöû lyù. b) Phöông phaùp nuoâi caáy beà saâu Phöông phaùp nuoâi caáy beà maët coù nhöôïc ñieåm raát lôùn laø toán nhieàu dieän tích vaø raát khoù cô giôùi hoùa, töï ñoäng hoùa. Trong phöông phaùp nuoâi caáy beà saâu ngöôøi ta thöôøng söû duïng moâi tröôøng loûng vaø thöïc hieän trong thuøng leân men. Trong thieát bò leân men ngöôøi ta thöôøng laép ñaët heä thoáng ñieàu khieån caùnh khuaáy, heä thoáng cung caáp oxy, heä thoáng ñieàu chænh pH vaø noàng ñoä caùc chaát dinh döôõng. Trong phöông phaùp naøy caàn phaûi coù heä thoáng thoåi khí vaø heä thoáng khuaáy troän lieân tuïc. Muïc ñích: Laøm xaùo troän moâi tröôøng, nhôø ñoù caùc chaát dinh döôõng vaø teá baøo VSV phaân phoái ñeàu khaép moâi tröôøng. Oxy ñöôïc cung caáp vaø hoøa tan vaøo moâi tröôøng. Doøng khí ñöôïc cung caáp lieân tuïc vaø laáy ra lieân tuïc seõ keùo theo nhöõng chaát khí ñöôïc taïo ra trong quaù trình phaùt trieån cuûa VSV. Nhöõng chaát khí ñöôïc taïo ra trong quaù trình trao ñoåi chaát naøy thöôøng gaây öùc cheá quaù trình trao ñoåi chaát, sinh saûn vaø phaùt trieån cuûa VSV. Caùnh khuaáy laøm xaùo troän moâi tröôøng laøm caùc thaønh phaàn moâi tröôøng khoâng laéng xuoáng, taêng khaû naêng tieáp xuùc giöõa VSV vaø cô chaát. Caùnh khuaáy laøm taêng nhanh quaù trình sinh saûn voâ tính do taùc ñoäng cô hoïc. Caùc yeáu toá aûnh höôûng ñeán quaù trình sinh toång hôïp enzym cuûa VSV Khi nuoâi caáy trong moâi tröôøng loûng, caùc yeáu toá sau ñaây aûnh höôûng raát lôùn ñeán söï sinh tröôûng vaø phaùt trieån cuûa VSV. Nhieät ñoä Nhieät ñoä coù aûnh höôûng raát lôùn ñeán söï sinh tröôûng vaø phaùt trieån cuûa VSV vì vaäy noù coù aûnh höôûng raát lôùn ñeán khaû naêng sinh toång hôïp enzym cuûa chuùng. Moãi loaøi VSV coù moät giaù trò nhieät ñoä toái öu maø taïi nhieät ñoä ñoù VSV coù khaû naêng sinh tröôûng vaø phaùt trieån toát nhaát. Cuõng nhö caùc loaøi naám moác khaùc, nhieät ñoä toái öu cho P.citrinum phaùt trieån laø 30-500C. pH Cuõng gioáng nhö nhieät ñoä, moãi loaøi VSV ñeàu coù giaù trò pH toái öu. Ña soá caùc loaïi naám moác ñeàu phaùt trieån treân moâi tröôøng acid, pH trong khoaûng 4-6. Noàng ñoä cô chaát VSV söû duïng cô chaát coù trong moâi tröôøng nuoâi caáy vaø toång hôïp enzym. Noàng ñoä cô chaát caøng lôùn khaû naêng sinh toång hôïp enzym caøng cao. Tuy nhieân noàng ñoä cô chaát caøng cao aùp suaát thaåm thaáu taïo ra trong moâi tröôøng nuoâi caáy caøng lôùn, aùp suaát naøy gaây öùc cheá söï sinh tröôûng vaø phaùt trieån cuûa VSV. Vì vaäy, VSV chæ phaùt trieån toát ôû giaù trò noàng ñoä cô chaát nhaát ñònh. Bình thöôøng khi khoâng coù cô chaát, chaát kìm haõm coù trong teá baøo seõ töông taùc vôùi gen ñieàu khieån, toaøn boä quaù trình toång hôïp enzym seõ bò phong toûa vaø khoâng hoaït ñoäng. Khi ta cho cô chaát vaøo moâi tröôøng nuoâi caáy, cô chaát seõ töông taùc vôùi chaát kìm haõm, gen ñieàu khieån thoaùt khoûi söï phong toûa cuûa chaát kìm haõm vaø caùc gen töông öùng. Enzym ñöôïc toång hôïp ra seõ phaân huûy cô chaát. Khi ñoù chaát kìm haõm seõ khoâng bò phong toûa vaø seõ töông taùc vôùi gen ñieàu khieån, toaøn boä heä thoáng bò ñoùng laïi, quaù trình toång hôïp bò ngöng treä. Nhö vaäy muoán enzym ñöôïc toång hôïp ta phaûi luoân cho vaøo moâi tröôøng leân men cô chaát caûm öùng. Caùch ñieàu khieån naøy raát coù yù nghóa trong saûn xuaát enzym caûm öùng. Thaéng lôïi hay thaát baïi trong saûn xuaát enzym caûm öùng phuï thuoäc raát nhieàu ôû vieäc xaùc ñònh cô chaát caûm öùng, veà lieàu löôïng caàn thieát cuûa chaát caûm öùng cho vaøo moâi tröôøng. Noàng ñoä oxy Do soáng trong moâi tröôøng hieáu khí neân haøm löôïng oxy cuõng laø yeáu toá raát quan troïng aûnh höôûng ñeán quaù trình sinh toång hôïp enzym. Löôïng oxy trong moâi tröôøng nuoâi caáy ñöôïc ñieàu khieån baèng toác ñoä maùy laéc vaø löôïng khí suïc vaøo moâi tröôøng. Thoâng thöôøng ñeå nuoâi caáy naám moác ngöôøi ta laéc ôû toác ñoä 200voøng/phuùt, möùc ñoä thoâng hôi laø1vvm. Heä thoáng enzym cellulase töø caùc VSV [4] Cellulase töø naám moác Cellulase töø Trichoderma reesei T.reesei laø VSV saûn xuaát cellulase ñöôïc nghieân cöùu nhieàu nhaát. Noù saûn xuaát 5 loaïi enzym endoglucanase, 2 loaïi enzym CBH vaø 2 loaïi b-glucosidase. Baûng 2.2– Heä enzym cellulase cuûa Trichoderma reesei vaø Humicola insolens Naám moác Enzym Teân môùi Kích thöôùc(kDa) pI pH toái thích T.reesei EGI EGII EGIII EGIV EGV CBHI CBHII BGLI BGLII Cel7B Cel5A Cel12A Cel61A Cel45A Cel7A Cel6A 50-55 48 25 37 23 59-68 50-58 71 52 4,6 5,5 7,4 2,8-3,0 3,5-4,2 5,1-6,3 8,7 4,8 4,5-5,5 4,5-5,5 4,5-5,5 4,5-5,5 4,5-5,5 4,5-5,5 4,5-5,5 4,6 4,0 H.insolens EGI EGII EGIII EGV EGVI CBHI CBHII BGLIV Cel7B Cel5A Cel12A Cel45A Cel6B Cel7A Cel6A 50 50 26 43 43 72 65 54 5,5 7,0 5,2 5,2 5,0 4,5 4,6-5,2 7,0-8,5 7,0-8,5 7,0-8,5 7,0-8,5 7,0-8,5 5,5 9,0 5,0 Taát caû EG tröø EG III vaø caû CBH ñeàu coù caáu truùc goàm 2 phaàn phaàn xuùc taùc vaø phaàn lieân keát vôùi cellulose. EG I khaùc nhöõng EG khaùc laø noù coù theå thuûy phaân xylan. Hoaït tính ñaëc bieät cuûa noù treân cô chaát xylan tan cuõng xaáp xæ hoaït tính treân daãn xuaát cellulose tan HEC. Taát caû caùc EG chuû yeáu phaân caét treân cô chaát cellulose voâ ñònh hình. Tuy nhieân EG II coù khaû naêng laøm giaûm möùc ñoä polymer nhanh hôn EGI. CBH I vaø CBH II töø Trichoderma reesei xuùc taùc caû 2 ñaàu cuûa chuoãi cellulose, nhöng chuùng coù tính ñaëc hieäu cô chaát khaùc nhau. CBH I phaân caét töø ñaàu khöû cuûa chuoãi cellulose trong khi CBH II thì coù taùc duïng treân ñaàu khoâng khöû. Vì vaäy taát caû cellulase naøy ñeàu coù taùc duïng treân nhöõng phaàn khaùc nhau cuûa chuoãi cellulose vaø hoã trôï laãn nhau trong quaù trình thuûy phaân toaøn boä chuoãi cellulose. CBH I cuõng gioáng nhö phaàn lôùn caùc exoglycanase caét töø ñaàu khoâng khöû cuûa chuoãi cellulose. CBH I laø enzym ñöôïc saûn xuaát vôùi soá löôïng lôùn bôûi Trichoderma reesei, noù laø enzym chuû choát trong vieäc phaân caét cellulose keát tinh. Nhöõng enzym cuûa Trichoderma thöôøng theå hieän hoaït tính cao nhaát ôû pH acid (~5) vaø nhieät ñoä (<550C). Cellulase töø Humicola insolens Ñaây laø loaøi naám moác ñöôïc quan taâm thöù hai trong saûn xuaát enzym cellulase thöông maïi. Loaøi naám moác naøy saûn xuaát haàu heát caùc loaïi enzym cellulase cuûa T.reesei, coù ít nhaát 5 loaïi EG, 2 loaïi CBH vaø moät vaøi b-glucosidase. Nhöõng enzym naøy cuõng coù caáu truùc töông töï, do ñoù chuùng coù cuøng nhoùm thuûy phaân glycoside. Theâm vaøo ñoù, coù söï toàn taïi söï töông ñoàng (50%) trong trình töï caùc aminoacid giöõa thaønh phaàn cellulase cuûa T.reesei vaø H. insolens. Tuy nhieân, moät vaøi cellulase cuûa H.insolens hoaït ñoäng ôû pH vaø nhieät ñoä cao hôn enzym cuûa T.reesei. Do ñoù chuùng coù nhöõng öùng duïng thöông maïi nhieàu hôn ñaëc bieät trong xöû lyù vaûi. 2 loaïi cellulase töø H.insolens, EG I vaø EG III, thieáu vuøng lieân keát vôùi cô chaát (CBD). EG I-III theå hieän hoaït tính töông töï treân CMC vaø cellulose voâ ñònh hình, trong khi EG V-VI coù hoaït tính xuùc taùc cao nhaát treân cellulose voâ ñònh hình. Khoâng moät loaïi enzym naøo trong chuùng coù khaû naêng thuûy phaân xylan. CBH I cuûa H.insolen taùc duïng treân cô chaát cellulose keát tinh, vaø noù ít bò öùc cheá bôûi saûn phaåm cuoái hôn CBH I cuûa T.reesei. Cellulase töø naám moác khaùc Nhieàu loaøi Aspergilus spp. saûn xuaát enzym cellulase. Loaøi A.aculeatus saûn xuaát moät vaøi loaïi cellulase EG V, EG I, vaø CBH I coù caáu truùc töông töï nhö EG II, EG III vaø CBH I töø T.reesei. Nhöõng loaøi naám moác khoâng coù hoaït tính cellulase nhö A.oryzae thì thöôøng ñöôïc söû duïng laø VSV nhaän ñeå chuyeån gen cellulase töø nhöõng loaøi naám moác khaùc. Gioáng Penicillium cuõng coù khaû naêng saûn xuaát cellulase, loaøi P.pinophilum saûn xuaát chuû yeáu laø endoglucanase. EG II vaø CBH I cuûa P.janthinellum thì töông ñoàng vôùi EG II vaø CBH I cuûa T.reesei. Giöõa caùc loaøi naám moác trong daï coû cuûa boø thì Neocallumastix frontalis ñöôïc nghieân cöùu nhieàu nhaát. Noù saûn xuaát cellulosome – moät phöùc heä protein bao goàm EG, CBH, vaø xylanase. Loaøi khaùc Piromyces sp. cuõng saûn xuaát phöùc heä cellulase töông töï. Ñaëc bieät laø caùc loaøi naám moác kò khí toàn taïi trong daï coû boø coù taùc duïng treân cellulose keát tinh hôn caùc loaøi naám hieáu khí khaùc. Nghieân cöùu treân caùc loaøi naám white rot Sporotrichum pulverulentum vaø Phanerochaete chrysosporium ngöôøi ta ñaõ phaùt hieän ra raèng naám moác coù taùc duïng phaân caét lignin cuõng coù khaû naêng saûn sinh ra moät loaït caùc enzym cellulase. Coøn loaøi naám brown rot coù theå phaân caét cellulose baèng 2 con ñöôøng oxy hoùa vaø thuûy phaân. Trong ñoù, cellulose keát tinh bò thuûy phaân baèng con ñöôøng khoâng enzym. Loaøi naám brown rot saûn xuaát caû EG vaø b-glucosidase. Söï phaân caét cuûa 2 loaøi naám naøy khaùc nhau. Brown rot thì taùc duïng tröïc tieáp treân toaøn boä vi sôïi cellulose trong khi loaøi white rot taán coâng vaøo beà maët cuûa vi sôïi, taïo ra söï xoùi moøn lieân tuïc. Cellulase töø vi khuaån Vi khuaån toàn taïi moät vaøi heä thoáng phaân caét cellulose. Chuùng coù theå taïo ra enzym ngoaïi baøo EG vaø CBH, enzym lieân keát teá baøo, hoaëc phöùc hôïp enzym. Ví duï nhö caùc loaøi vi khuaån sau saûn xuaát soá löôïng ít enzym EG vaø CBH: Clostridium, Acetovibrio, Ruminococcus, Streptomyces, Microsprora, vaø Cellulomonas. Enzym cellulase cuûa Cellulomonas fimi ñöôïc nghieân cöùu nhieàu nhaát. 4 loaïi enzym EG (CenA, -B, -C, -D), 1 loaïi CBH (CbhA), vaø 1 cellulase-xylanase (Cex) ñöôïc moâ taû caû tính chaát hoùa sinh vaø caáu truùc gen. Cellulase cuûa Thermomonospora fusca, vaø Microbispora bispora cuõng ñöôïc nghieân cöùu raát kyõ. Moät vaøi loaøi vi khuaån khoâng saûn xuaát enzym thuûy phaân cellulose rieâng bieät nhöng chuùng saûn sinh ra cellulosome. Phaàn lôùn nghieân cöùu cellulosome laø töø Clostrium thermocellum. Thaønh phaàn cuûa heä enzym cellulase töø loaøi naøy laø CBH, EG, 6 xylanase, 2 b-glucosidase, vaø 2 lichenases. Loaïi enzym naøy neáu toàn taïi ñoäc laäp coù theå thuûy phaân cellulose keát tinh raát chaäm, nhöng khi lieân keát vôùi phaàn protein bao goàm phaàn CBD noù thuûy phaân cô chaát moät caùch nhanh choùng. Cellulase töø vi khuaån trong nhieàu tröôøng hôïp ñöôïc nghieân cöùu coù hoaït tính cao hôn cellulase töø naám moác. Tuy nhieân, nhìn chung vi khuaån saûn xuaát enzym ngoaïi baøo soá löôïng thaáp hôn naám moác. Vaøi loaïi cellulase cuûa vi khuaån toàn taïi nhö moät phaàn cuûa cellulosome. Do ñoù cellulase töø vi khuaån ñöôïc saûn xuaát ôû quy moâ coâng nghieäp cuøng vôùi caùc loaïi VSV khaùc thích hôïp hôn. Nhöõng loaïi saûn phaåm naøy ñaõ ñöôïc baùn nhöng chuùng vaãn chöa ñöôïc söû duïng trong thöïc phaåm. Moät soá nghieân cöùu saûn xuaát enzym cellulase töø VSV Saûn xuaát cellulase töø Thermophilic Clostridium [6] Thôøi gian toái öu: 3 ngaøy Haøm löôïng yeast extract toát nhaát 0,5%, (vieäc boå sung baèng pepton, tryptose, proteose ñeàu cho keát quaû töông töï). Haøm löôïng cellulose trong moâi tröôøng nuoâi caáy: 1% Haøm löôïng glucose vaø cellobiose theâm vaøo moâi tröôøng nuoâi caáy coù hieäu quaû öùc cheá laø 0,05%; ôû haøm löôïng 0,3% cellobiose vaø 0,4% glucose coù taùc duïng öùc cheá hoaøn toaøn. Caû C1 vaø Cx ñeàu coù nhieät ñoä toái öu laø 670C, vaø pH toái öu laø 6,5. Hoaït tính Cx ño ñöôïc laø 183 mUI/ml. Saûn xuaát cellulase töø Aspergillus flavus [7] Trong nghieân cöùu naøy söû duïng 3 nguoàn carbon laø baõ mía, muøn cöa, vaø loõi baép. Keát quaû: hoaït tính CMCase treân cô chaát muøn cöa laø 0,0743UI/ml, baõ mía laø 0,0573UI/ml, loõi baép laø 0,0502 UI/ml ôû thôøi gian laø 12 giôø. Cô chaát muøn cöa cho hoaït tính enzym cao nhaát. Saûn xuaát cellulase töø Thermomonospora curvata [20] Cô chaát söû duïng laø sôïi cotton. Noàng ñoä cô chaát: 8mg/ml Thôøi gian nuoâi caáy: 6 ngaøy pH moâi tröôøng nuoâi caáy: pH=8 Nhieät ñoä nuoâi caáy: 450C Nhieät ñoä toái thích cuûa enzym 600C Hoaït tính ño ñöôïc C1 laø 110mUI/ml; Cx laø 5,9 UI/ml. Haøm löôïng ñöôøng khöû taïo thaønh ñöôïc ño baèng phöông phaùp Nelson. Cô chaát duøng ñeå xaùc ñònh hoaït tính enzym C1 laø cotton vaø Cx laø CMC. Saûn xuaát cellulase töø A. Niger Theo [8] saûn xuaát enzym cellulase töø nguoàn carbon laø xô döøa vaø muøn cöa: Baûng 2.4 – Hoaït tính cuûa enzym cellulase töø A.Niger Nguoàn carbon Ño hoaït tính CMCase Ño hoaït tính FPA pH Nhieät ñoä (0C) Hoaït tính (UI/ml) pH Nhieät ñoä (0C) Hoaït tính (UI/ml) Xô döøa 5 40 0,258 ± 0,003 7 40 0,338 ± 0,003 Muøn cöa 6 50 0,274 ± 0,003 7 40 0,340 ± 0,002 Trong ñoù hoaït tính CMCase ñöôïc ño baèng cô chaát CMC vaø hoaït tính FPA ño baèng cô chaát laø giaáy loïc. Thôøi gian nuoâi laø 5 ngaøy. Theo [10] nghieân cöùu saûn xuaát enzym cellulase töø nguoàn carbon laø pheá lieäu noâng nghieäp: Thôøi gian nuoâi caáy VSV toát nhaát 3 ngaøy Noàng ñoä nguoàn carbon söû duïng (laù vaø thaân ngoâ, loõi ngoâ, voû haït keâ, voû traáu ) toái öu 5% pH moâi tröôøng nuoâi caáy toát nhaát pH=3 Hoaït tính CMCase: laù vaø thaân ngoâ 68 ± 1,41 UI/ml; loõi ngoâ 103 ± 1,41 UI/ml; voû keâ 108 ± 1,41 UI/ml; voû traáu 81±1,41UI/ml. Ôû ñaây hoaït tính ñöôïc ño baèng löôïng enzym thuûy phaân cô chaát cellulose taïo ra 10mg glucose trong 30 phuùt. Nhieät ñoä toái thích cuûa enzym laø 550C. pH toái thích cuûa enzym laø pH=5 Saûn xuaát cellulase töø Aspergillus fumigatus[8] Baûng 2.5– Hoaït tính cuûa enzym cellulase töø Aspergillus fumigatus Nguoàn carbon Ño hoaït tính CMCase Ño hoaït tính FPA pH Nhieät ñoä (0C) Hoaït tính (UI/ml) pH Nhieät ñoä (0C) Hoaït tính (UI/ml) Xô döøa 5 40 0,292 ± 0,005 7 40 0,339 ± 0,003 Muøn cöa 6 50 0,272 ± 0,003 7 40 0,334 ± 0,002 Trong ñoù hoaït tính CMCase ñöôïc ño baèng cô chaát CMC vaø hoaït tính FPA ño baèng cô chaát laø giaáy loïc. Thôøi gian nuoâi laø 5 ngaøy. Saûn xuaát cellulase töø Bacillus pumilus[9] Thôøi gian nuoâi caáy toái öu 24h Nhieät ñoä toái thích cuûa enzym 600C pH toái thích cuûa enzym pH=6 Hoaït tính CMCase 0,079UI/ml. Saûn xuaát cellulase töø Aspergillus aculeatus[12] Thôøi gian nuoâi caáy toái öu 4 ngaøy Hoaït tính CMCase 5,5UI/ml. Saûn xuaát enzym cellulase töø Chaetomium globosum [16] Söû duïng nguoàn carbon laø sôïi cotton. Haøm löôïng nguoàn carbon toái öu laø 10g/l Haøm löôïng pepton toái öu laø 6g/l Hoaït tính CMCase laø 0,033 UI/ml. Saûn xuaát enzym cellulase töø T.reesei [17] Thôøi gian nuoâi caáy toái öu :7 ngaøy Hoaït tính CMCase 5,25UI/ml Caùc phöông phaùp xaùc ñònh hoaït tính enzym cellulase[3, 18] Xaùc ñònh hoaït tính enzym baèng caùch ño ñöôøng kính voøng thuûy phaân [3] Nguyeân taéc Khi enzym taùc duïng leân cellulose trong moâi tröôøng thaïch, cô chaát bò phaân giaûi laøm ñoä ñuïc cuûa moâi tröôøng giaûm ñi, moâi tröôøng trôû neân trong suoát. Ñoä trong suoát tæ leä vôùi hoaït tính enzym. Caùch tieán haønh Chuaån bò moâi tröôøng coù chöùa 2% thaïch, 1% CMC trong dung dòch ñeäm photphat pH=5 roài phaân phoái vaøo ñóa petri. Sau khi thaïch ñoâng, khoeùt loã nhoû treân beà maët thaïch cho vaøo dung dòch enzym vaøo vaø giöõ ôû 400C. Sau 48h ño ñöôøng kính phaàn moâi tröôøng trong suoát choã enzym taùc duïng. Hoaït ñoä enzym ño baèng soá mm ñöôøng kính voøng thuûy phaân. Xaùc ñònh hoaït tính enzym döïa vaøo söï giaûm troïng löôïng cô chaát [3] Nguyeân taéc Khi enzym taùc duïng phaân giaûi cô chaát cellulose thì troïng löôïng cô chaát giaûm ñi. Ñoä giaûm troïng löôïng cô chaát tæ leä vôùi hoaït tính enzym. Caùch tieán haønh Duøng giaáy Whatman soá 1 laøm cô chaát. Chuaån bò 10ml dung dòch enzym 1% trong dung dòch ñeäm acetat 0,1M, pH=5. Cho dung dòch enzym vaøo bình tam giaùc dung tích 250ml, theâm 1-1,5g cô chaát, cho vaøi gioït toluen. Nuùt kín bình laïi, giöõ treân maùy laéc taàn soá 160laàn/phuùt. Ly taâm röûa cellulose coøn laïi vôùi nöôùc caát nhieàu laàn, laøm khoâ ôû 600C roài ñem caân. Tieán haønh maãu kieåm tra song song vôùi maãu thí nghieäm trong ñoù chæ coù giaáy loïc vaø dung dòch ñeäm, giöõ cuøng ñieàu kieän vôùi maãu thí nghieäm, sau ñoù ly taâm vaø röûa cellulose nhö treân. Hieäu soá löôïng cô chaát coøn laïi giöõa 2 bình kieåm tra vaø thí nghieäm cho bieát löôïng cô chaát bò phaân giaûi. Hoaït ñoä enzym ñöôïc tính baèng soá gam cô chaát bò phaân giaûi hoaëc phaàn traêm cô chaát bò phaân giaûi. Xaùc ñònh hoaït tính enzym döïa vaøo söï giaûm ñoä nhôùt cuûa dung dòch cô chaát [3] Cô chaát ñöôïc söû duïng ôû ñaây laø CMC. Nhôùt keá ñöôïc söû duïng ñeå ño ñoä nhôùt cuûa dung dòch cô chaát tröôùc vaø sau khi enzym taùc duïng. Hoaït tính enzym ñöôïc bieåu dieãn baèng söï giaûm ñoä nhôùt cuûa dung dòch cô chaát tính theo %. Caùch tieán haønh: Cho 1ml dung dòch enzym vaøo bình ñöïng 5ml Na-CMC 0,3% trong dung dòch ñeäm acetat 0,05M vaø pH=5,0. giöõ hoãn hôïp phaûn öùng 2 phuùt ôû 400C trong nhôùt keá. Ño thôøi gian chaûy cuûa hoãn hôïp phaûn öùng. Maãu kieåm tra cuõng ñöôïc tieán haønh nhö treân nhöng enzym ñaõ bò ñun soâi tröôùc khi ñöa vaøo cô chaát. Xaùc ñònh hoaït tính enzym döïa vaøo löôïng ñöôøng khöû taïo thaønh [18] Hoaït tính enzym ñöôïc tính baèng ñôn vò UI/ml moâi tröôøng hoaëc UI/g cô chaát. Nguyeân taéc laø khi enzym thuûy phaân cô chaát cellulose taïo thaønh ñöôøng khöû, ño löôïng ñöôøng khöû taïo thaønh töø ñoù xaùc ñònh hoaït tính enzym. Caùch tieán haønh: 2ml dung dòch ñeäm photphat 0,1M, pH=5 Cho cô chaát cellulose vaøo (neáu cô chaát laø CMC thì haøm löôïng laø 1% töông öùng ta coù hoaït tính CMCase; neáu laø giaáy loïc thì söû duïng 50mg töông öùng ta coù hoaït tính FPA) Tieáp tuïc cho 1ml dung dòch enzym vaøo Cho phaûn öùng ôû 600C trong thôøi gian 20 phuùt. Cho 1ml DNS vaøo vaø ñun caùch thuûy 5 phuùt. Sau ñoù ño ñoä haáp thu ôû böôùc soùng 540nm. Neáu söû duïng giaáy loïc laøm cô chaát sau khi ñun caùch thuûy 5 phuùt, laøm nguoäi nhanh xuoáng nhieät ñoä phoøng sau ñoù loïc vaø tieán haønh ño ñoä haáp thu ôû böôùc soùng 540nm. 1UI ñöôïc ñònh nghóa laø löôïng enzym thuûy phaân cô chaát giaûi phoùng ra 1mmol glucose trong 1ml moâi tröôøng trong thôøi gian 1 phuùt ôû ñieàu kieän nhieät ñoä thích hôïp. Öùng duïng enzym cellulase töø VSV [1,2, 4] Öùng duïng enzym cellulase trong cheá bieán thöïc phaåm [4] Enzym cellulase khoâng phaûi laø enzym ñöôïc söû duïng nhieàu trong thöïc phaåm. So vôùi nhöõng enzym khaùc tæ leä öùng duïng enzym naøy vaøo khoaûng 1%. Ñaây laø con soá raát nhoû so vôùi enzym amylase. Trong nhieàu öùng duïng trong thöïc phaåm cellulase khoâng ñöôïc söû duïng nhieàu nhöng theâm vaøo ñeå laøm taêng hoaït tính cuûa nhöõng enzym khaùc, chuû yeáu laø pectinase vaø xylanase. Endoglucanase coù taùc duïng treân cô chaát 1,3-1,4-b-glucan, ngoaøi ra chuùng cuõng coù taùc duïng treân 1,3-1,4-b-glucanase, lichenase vaø laminarinase. 1,3-1,4-b-glucan vaø arabinoxylan laø thaønh phaàn chuû yeáu trong thaønh teá baøo nguõ coác vaø 1,3-1,4-b-glucan toàn taïi soá löôïng lôùn trong luùa maïch vaø yeán maïch. Baûng 2.3-Thaønh phaàn hoùa hoïc cuûa caùc loaïi nguõ coác Nguõ coác Tinh boät(%) b-glucan(%) Xylan(%) Protein (%) Chaát beùo(%) Luùa mì 60-73 0,5-3,8 5,5-7,8 9-17 2,1-3,8 Luùa maïch 53-67 3,0-10,6 4,0-11,0 8-13 0,9-4,6 Yeán maïch 39-55 2,2-5,4 3,2-12,6 11-15 5,0-9,0 Luùa maïch ñen 50-63 1,0-3,5 8-10,0 8-12 2,0-3,5 Vì vaäy, cellulase laø enzym höõu ích trong cheá bieán nguõ coác. Phaàn lôùn caáu truùc b-glucan khi hoøa tan trong nöôùc taïo ñoä nhôùt raát cao. Trong moät vaøi tröôøng hôïp chuùng coù lôïi do chuùng ñoùng vai troø nhö maøng loïc, nhöng trong moät vaøi tröôøng hôïp khaùc chuùng gaây khoù khaên cho quaù trình cheá bieán. Uû bia Quaù trình uû phuï thuoäc raát lôùn vaøo söï hoaït ñoäng cuûa enzym luùa maïch vaø naám men. Nhöõng enzym naøy ñöôïc hoaït hoùa suoát quaù trình naáu malt, hoà hoùa, vaø leân men. Suoát giai ñoaïn naáu malt, polymer cuûa nguõ coác bò phaân caét thaønh nhöõng caáu töû nhoû hôn bôûi amylase, protease vaø b-glucanase. Trong suoát quaù trình naøy, thaønh teá baøo coù caáu taïo töø polysaccharide nhö b-glucan vaø xylan seõ caûn trôû söï tieáp xuùc cuûa enzym vôùi cô chaát. Thaønh teá baøo coù theå laøm taêng ñoä nhôùt, taïo caáu truùc gel, vaø gaây ra vaán ñeà nghieâm troïng nhö quaù trình loïc dòch nha khoâng trieät ñeå, hieäu suaát chieát thaáp hoaëc taïo ñuïc cho saûn phaåm cuoái cuøng. Enzym töø thöïc vaät coù nhöôïc ñieåm laø keùm beàn nhieät vaø haàu nhö khoâng hoaït ñoäng sau khi haït naûy maàm. Trong khi ñoù enzym töø VSV chòu ñöôïc nhieät ñoä cao. Vì vaäy, enzym töø VSV thöôøng ñöôïc söû duïng trong quaù trình uû. b-glucanase (cellulase) ñöôïc theâm vaøo chuû yeáu trong quaù trình hoà hoùa, nhöng chuùng cuõng coù theå ñöôïc söû duïng trong quaù trình naáu malt hoaëc trong leân men chính. Cellulase saûn xuaát töø T.reesei coù hoaït tính enzym b-glucoside toát hôn cheá phaåm enzym b-glucoside thöông maïi. Vieäc boå sung enzym cellulase vaøo trong quaù trình uû seõ caûi thieän ñöôïc toác ñoä loïc vaø hieäu suaát cuûa toaøn quaù trình. Saûn xuaát röôïu vang vaø nöôùc eùp Maëc duø soá löôïng cuûa b-glucan trong taùo vaø traùi caây thaáp hôn nguõ coác, cellulase cuõng coù öùng duïng trong vieäc saûn xuaát röôïu vang vaøcaùc loaïi nöôùc eùp traùi caây. Chuùng thöôøng ñöôïc söû duïng keát hôïp vôùi hemicellulase vaø pectinase. Trong saûn xuaát röôïu vang, enzym ñöôïc söû duïng ñeå laøm meàm voû, caûi thieän maøu saéc dòch trích, thay vì phaûi qua coâng ñoaïn loïc, vaø taêng chaát löôïng vaø ñoä beàn cuûa röôïu vang. Vieäc söû duïng b-glucoside ñeå laøm taêng muøi töø nhöõng muøi töï nhieân. Cocktail vôùi traùi caây laøm meàm baèng enzym cellulase cuõng ñöôïc öùng duïng raát roäng raõi. Theâm vaøo ñoù, vieäc söû duïng nhöõng enzym naøy thuaän lôïi trong vieäc xöû lyù saûn phaåm cuûa ngaønh coâng nghieäp traùi caây baèng vieäc caûi tieán hieäu suaát chieát vaø hieäu quaû toaøn boä quaù trình cheá bieán. Hemicellulase vaø cellulase coù theå ñöôïc söû duïng ñeå taùch pectin töø traùi caây hoï citrus baèng caùch phaù vôõ thaønh teá baøo, taêng haøm löôïng pectin. Nöôùng Enzym ñöôïc söû duïng ñeå caûi tieán quaù trình vaø chaát löôïng saûn phaåm. Trong saûn xuaát theo phöông phaùp truyeàn thoáng enzym chính ñöôïc söû duïng trong nöôùng baùnh mì laø amylase vaø xylanase. b-glucoside ít ñöôïc chuù troïng hôn. Enzym phaân caét thaønh teá baøo ñöôïc söû duïng ñaëc bieät trong saûn xuaát baùnh mì ñeå laøm giaûm haøm löôïng thaønh teá baøo trong boät nhaøo. Haøm löôïng thaønh teá baøo nhieàu laøm giaûm theå tích baùnh, giaûm tính ñaøn hoài cuûa ruoät baùnh. Nhöõng polysaccharide tan khoâng theå tieâu hoùa ñöôïc, thöôøng ñöôïc goïi laødietary fiber, coù lôïi cho söùc khoûe con ngöôøi do giaûm haøm löôïng cholesterol (ñaëc bieät laø b-glucan), ngaên caûn teá baøo ung thö, vaø laø chaát dinh döôõng ñaëc bieät cho vi khuaån ñöôøng ruoät. Vì vaäy, baùnh mì vôùi haøm löôïng chaát xô cao ñang ñöôïc quan taâm phaùt trieån. Trong quaù trình nöôùng boät mì, vieäc theâm nhöõng b-glucan tan trong nöôùc ñeå caûi tieán ruoät baùnh. Vieäc xöû lyù b-glucan baèng enzym b-glucanase tröôùc khi theâm vaøo boät mì laøm giaûm vuïn naùt trong khi nöôùng. Neáu boät mì ñöôïc boå sung caùm, enzym xylanase vaø cellulase laøm cho polysacharide ôû thaønh teá baøo deã hoøa tan hôn vaø coù chöùc naêng hôn. Enzym theâm vaøo laøm boät mì meàm hôn, theå tích baùnh mì vaø caáu truùc ruoät baùnh ñöôïc caûi thieän, toác ñoä oâi giaûm. Ñaëc bieät söï keát hôïp nhieàu enzym coù hieäu quaû hôn töøng enzym rieâng bieät. Söï khaùc nhau cô baûn vieäc nöôùng luùa maïch ñen vaø luùa mì laø protein cuûa luùa maïch ñen khoâng coù caáu truùc gluten. Thay vì gluten, löôïng xylan tan vaø enzym endogenous coù vai troø quyeát ñònh chaát löôïng baùnh nöôùng trong luùa maïch ñen. Do chaát gum trong boät mì cuûa chuùng coù vai troø quan troïng trong vieäc oån ñònh phaân töû khí trong teá baøo. Xylan caûi tieán chaát löôïng boät mì baèng caùch laøm taêng ñoä nhôùt boät mì. Caû enzym xylanase vaø endoglucanase ñeàu coù taùc duïng laøm meàm boät mì, taêng theå tích boät mì vaø ruùt ngaén thôøi gian leân men. Trích ly tinh boät vaø caùc polysaccharide khaùc Öùng duïng khaùc laø trong coâng ngheä cheá bieán tinh boät, thuûy phaân tinh boät thaønh glucose baèng heä enzym amylase vaø trong söï ñoàng phaân glucose taïo syrup noàng ñoä fructose cao. Tinh boät ñöôïc saûn xuaát chính töø boät mì hoaëc baép baèng phöông phaùp nghieàn vaø trích ly. Caùc phöông phaùp chieát taùch coù theå caûi tieán baèng vieäc söû duïng enzym ñeå phaân caét thaønh teá baøo. Enzym thöôøng ñöôïc söû duïng trong tröôøng hôïp naøy laø b-glucanase, xylanase hoaëc hoãn hôïp cuûa chuùng. Moät vaøi chaát trong thöïc phaåm nhö carrageenan, alginate vaø agar ñöôïc thu nhaän töø taûo. Sau coâng ñoaïn taùch, saûn phaåm thöôøng bao goàm thaønh phaàn cellulose töø thaønh teá baøo cuûa taûo, gaây caûn trôû tính chaát chöùc naêng cuûa nhöõng polysaccharide naøy. Cellulase trong moät vaøi tröôøng hôïp ñöôïc söû duïng döôùi daïng tinh khieát ñeå phaân caét cellulose coøn thöøa tröôùc khi taùch thu nhaän caùc polysaccharide thì hieäu quaû seõ cao hôn. Ngoaøi ra noù coøn ñöôïc söû duïng ñeå ñieàu khieån quaù trình phaân caét caùc polysaccharide tan trong nöôùc nhö CMC, konjac glucomannan, vaø moät vaøi exopolysaccharide töø vi khuaån nhö xanthan. Saûn xuaát thöùc aên gia suùc [1] Moät löôïng lôùn nguõ coác hoaëc nhöõng boä phaän khaùc nhau cuûa nguõ coác ñöôïc söû duïng laøm thöùc aên gia suùc. Trong nhieàu loaïi nguõ coác, thaønh phaàn taïo naêng löôïng thöôøng bò nhoát trong caáu truùc polysaccharide khoâng phaûi tinh boät, maø ñoäng vaät thöôøng khoâng theå tieâu hoùa ñöôïc. Do ñoù nhöõng enzym nhö cellulase vaø hemicellulase ñöôïc theâm vaøo ñeå phaân caét lieân keát thaønh teá baøo laøm taêng naêng löôïng trao ñoåi chaát. Arabinoxylan vaø 1,3-1,4-b-glucan cuõng gaây khoù khaên cho vieäc haáp thu vaøtieâu hoùa chaát dinh döôõng, ñaëc bieät bôûi ñoäng vaät monogastric nhö gaø vaø lôïn. Ñoä nhôùt coù aûnh höôûng raát lôùn ñeán söï tieâu hoùa ñoäng vaät do caûn trôû söï khueách taùn cuûa enzym, cô chaát vaø saûn phaåm phaûn öùng. Thoâng thöôøng noàng ñoä cao cuûa nhöõng chaát trong thöùc aên laøm giaûm khaû naêng vaän chuyeån caùc chaát trong cô theå sinh vaät, söï taêng troïng chaäm, phaân loûng ñaëc bieät laø vôùi gia caàm. Vieäc theâm enzym chuû yeáu laø xylanase, vaø b-glucanase (cellulase) trong thöùc aên phaân caét nhöõng polysacharide töông öùng vaø laøm taêng söï haáp thu nhöõng thaønh phaàn thöùc aên bao goàm protein vaø chaát beùo. Do ñoù laøm taêng khaû naêng vaän chuyeån thöùc aên vaø taêng troïng. Hieäu quaû cuûa vieäc boå sung enzym laø laøm giaûm ñoä nhôùt vaø giaûm naêng löôïng thích hôïp cho thöïc phaåm aên kieâng, vaät lieäu reû tieàn vaø chi phí saûn xuaát thaáp. Thuûy phaân pheá lieäu giaøu cellulose [1] Caùc pheá lieäu nhö goã, rôm, muøn cöa, baõ mía, traáu raát giaøu cellulose, reû tieàn vaø coù theå duøng cheá phaåm cellulase ñeå thuûy phaân thaønh caùc ñöôøng ñôn giaûn coù theå cheá bieán thaønh thöùc aên gia suùc, saûn xuaát coàn coâng nghieäp,…