Luận văn Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của cây đước đôi (Rhizophora apiculata BLUME.) ở khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ bằng kỹ thuật RAPD

điện di qua gel agarose, thấm qua màng lai và lai với một mẫu dò DNA (đƣợc đánh dấu phóng xạ) liên kết với một locus đặc biệt. Sự khác biệt vị trí cắt giữa hai cá thể sẽ tạo ra những phân đoạn cắt khác nhau. RFLP có ƣu điểm là marker đồng trội cho phép phân biệt đƣợc cá thể đồng hợp và dị hợp. Do kích thƣớc DNA khảo sát trong RFLP lớn vì vậy số lƣợng marker tạo ra nhiều đủ đáp ứng nhu cầu nghiên cứu. Tuy nhiên do qui trình thực hiện phức tạp, nguy hiểm đối với sức khoẻ ngƣời nghiên cứu (sử dụng phóng xạ đánh dấu), DNA yêu cầu có chất lƣợng cao đã làm hạn chế việc sử dụng kỹ thuật này. 21 Cùng với sự phát triển kỹ thuật PCR, kỹ thuật RFLP trở nên đơn giản hơn. Một cặp mồi oligonucleotide có thể dùng khuếch đại một vùng DNA cần khảo sát, sau đó đoạn DNA đƣợc khuếch đại đƣợc cắt bằng các restriction enzyme, điện di và phân tích trên gel nhuộm ethidium bromide hoặc bạc. PCR-RFLP bỏ qua bƣớc lai phóng xạ nên giá thành rẻ hơn và ít nguy hiểm hơn phƣơng pháp RFLP. 2.5.3 Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP ) AFLP đƣợc định nghĩa là sự đa hình các đoạn cắt khuếch đại, là kỹ thuật kết hợp giữa RFLP và PCR. AFLP sử dụng enzyme cắt giới hạn cắt DNA bộ gene, sử dụng những phân đoạn DNA làm khuôn cho phản ứng khuếch đại PCR. AFLP có thể dùng để phân biệt các cá thể rất gần nhau, thậm chí ngay cả những dòng đẳng gene. Sự khác nhau trong chiều dài các đoạn khuếch đại có thể do những thay đổi của các base trong vùng trình tự mồi, hoặc thêm, mất đoạn ở giữa hai vị trí cắt. Thông thƣờng, restriction enzyme sử dụng trong AFLP là một cặp enzyme, một enzyme cắt thƣờng xuyên (tạo ra những trình tự nhỏ) và một enzyme cắt không thƣờng xuyên (nhằm hạn chế số lƣợng các đoạn cắt). Cặp enzyme thƣờng đƣợc dùng nhất là EcoRI - MseI. Sau khi cắt bằng cặp enzyme này, một trình tự nối mạch đôi (adaptor) sẽ đƣợc gắn vào hai đầu đoạn DNA cắt bằng enzyme ligase. Đoạn adaptor gồm 2 phần: phần trình tự lõi và phần trình tự đặc hiệu cho vị trí cắt enzyme. Mồi của phản ứng PCR đƣợc thiết kế dựa trên trình tự adaptor và chứa một trình tự chọn lọc khoảng vài nucleotide. Chỉ những phân đoạn DNA nào chứa cả trình tự adaptor và trình tự nucleotide chọn lọc mới đƣợc khuếch đại, chính trình tự chọn lọc sẽ làm giảm sự xuất hiện sản phẩm PCR và làm đơn giản quá trình phân tích AFLP nhanh, không phức tạp nhƣ RFLP nhƣng vẫn khảo sát đƣợc toàn bộ gene. Kỹ thuật này đòi hỏi ít lƣợng DNA ban đầu, không cần biết trƣớc trình tự đích và độ lặp lại phản ứng cao, các mồi sử dụng không cần đặc hiệu loài (các mồi thƣơng mại có thể dùng cho hầu hết các loài). Tuy nhiên AFLP là một marker trội, điều này làm hạn chế phân biệt cá thể đồng hợp và dị hợp. 2.5.4 Microsatellite Rải rác ở những vị trí khác nhau trên bộ gene eukaryote là những vùng có tính biến dị cao. Những vùng này có chứa các trình tự DNA gọi là VNTR (variable number 22 tandem repeat) còn gọi là các tiểu vệ tinh. Các VNTR này đặc trƣng bởi số lần lặp lại của trình tự lõi (đơn vị trình tự) DNA nhƣ: (AC)n, (AG)n, (AT)n, (TAT)n, (TCT)n, (CAG)n …. Microsatellite là các VNTR có số đơn vị trình tự lõi từ 1-6bp, số lần lặp lại của microsatellite khoảng 70 lần. Do số lần lặp lại của mỗi microsatellite là khác nhau ở mỗi cá thể nên tính đa hình tạo ra khi sử dụng phƣơng pháp này là rất cao. Dựa trên trình tự DNA microsatellite đƣợc bảo tồn ở các cá thể cùng loài cho phép chúng ta thiết kế mồi để khuếch đại trình tự lặp lại trong toàn bộ kiểu gene, trình tự mồi sử dụng trình tự đặc hiệu ở hai đầu locus microsatellite. Kích thƣớc các đoạn DNA đƣợc khuếch đại thƣờng từ 100 - 200 bp. Kết quả tạo ra các đoạn DNA có chiều dài khác nhau phân tách trên gel polyacrylamide. Xác định trình tự đặc hiệu hai đầu locus microsatellite là bƣớc đầu tiên rất quan trọng trong việc phân tích kỹ thuật này. Do đó, việc sử dụng microsatellite gặp phải nhƣợc điểm lớn là phải xác định trình tự đặc hiệu cho mỗi locus đa hình. Ƣu điểm lớn nhất của microsatellite là có tính đa hình cao và là một marker đồng trội. 2.5.5 Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphism DNA). 2.5.5.1 Giới thiệu. Là phƣơng pháp xác định sự đa hình về kích thƣớc các đoạn DNA sau khi thực hiện PCR mẫu DNA thí nghiệm. Kỹ thuật cho phép phát hiện thể đa hình mà không cần biết trƣớc thứ tự các nucleotide bằng cách dùng các primer tổng hợp, đơn, ngắn, dãy mã đƣợc thiết kế ngẫu nhiên để thực hiện PCR. Sau khi bắt cặp tại các vị trí chuyên biệt trên sợi DNA, primer tiến hành sự khuếch đại để tạo ra các đoạn có kích thƣớc khác nhau, có khi lên tới 2 kb. Các đoạn với kích thƣớc khác nhau này đƣợc nhận biết bằng điện di. Một primer có thể tạo nên sự đa hình DNA giữa các cá thể và các đoạn đa hình này có thể đƣợc dùng nhƣ những marker để xác định sự đa dạng di truyền. RAPD đƣợc xem nhƣ một phƣơng pháp tạo sự đa hình DNA nhanh và hữu hiệu. Các bộ kit primer dùng cho RAPD đã đƣợc thƣơng mại hóa trên thị trƣờng và các primer cũng rất dễ đƣợc tổng hợp. Về trang thiết bị chỉ cần có máy PCR và hệ thống điện di. Cần quan tâm đến yếu tố nồng độ DNA, điều kiện thí nghiệm, chƣơng trình chạy PCR và cần lựa chọn primer thích hợp cho sự đa hình cao. 23 Có thể tóm tắt kỹ thuật RAPD nhƣ sau: 3’ 1 2 3 5’ DNA mẫu 5’ 4 5 6 3’ Sự bắt cặp và khuếch đại trong phản ứng RAPD - PCR Ghi chú: Các mũi tên biểu thị cho các primer (các primer có trình tự giống nhau, khoảng 10 nucleotide); các số 1, 2, 3, 4, 5, 6 tƣợng trƣng cho các vị trí trên DNA mẫu mà primer gắn vào; các primer bắt cặp vào các vị trí 1, 2, 3 trên mạch đơn DNA mẫu 3’- 5’, các primer bắt cặp vào các vị trí 4, 5, 6 trên mạch đơn DNA mẫu 5’ - 3’. Trong trƣờng hợp này, có 2 sản phẩm PCR đƣợc tạo thành: - Sản phẩm A: Là sản phẩm PCR khuếch đại một đoạn DNA nằm giữa hai vị trí 2 và 5. - Sản phẩm B: Là sản phẩm PCR khuếch đại một đoạn DNA nằm giữa hai vị trí 3 và 6. - Không có sản phẩm PCR hình thành bởi các primer nằm ở vị trí 1 và 4 do hai vị trí này quá xa nhau để cho phép hoàn thành sự khuếch đại. - Không có sản phẩm hình thành bởi các primer nằm ở vị trí 2 và 4, 3 và 5, do các primer không có chiều hƣớng vào nhau. Kỹ thuật RAPD đƣợc thực hiện theo ba bƣớc cơ bản: - Tách chiết DNA tổng số, nhân DNA bằng máy PCR - Điện di trên gel agarose hoặc gel polyacrylamid - Xác định tính đa dạng di truyền bằng các phần mềm thông dụng (NTSYSpc, UPGMA cluster, Gelcompar, lập dendrogram) các số liệu thu đƣợc cho thấy sự gần gũi hoặc cách biệt di truyền của các mẫu nghiên cứu. Tuy nhiên trong thực tế khi thực hiện phản ứng RAPD – PCR thƣờng gặp phải một số vấn đề: - Nồng độ DNA mẫu khác nhau có thể làm thay đổi số band trên bảng gel điện di. Nồng độ DNA mẫu thích hợp cho mỗi phản ứng là 20 – 50 ng. Sản phẩm B Sản phẩm A 24 - PCR buffer thƣờng đƣợc cung cấp theo Taq - polymerase và có thể có hoặc không có Mg2+. Kỹ thuật RAPD phụ thuộc rất nhiều vào nồng độ Mg2+, nếu nồng độ Mg2+ khác nhau thì sản phẩm RAPD sẽ khác nhau. - Taq - polymerase của các nhà sản xuất khác nhau cho kết quả sản phẩm khác nhau rất lớn. Vì vậy, loại Taq - polymerase và nồng độ của Taq đòi hỏi phải chính xác và đƣợc xác định qua thực nghiệm. - Chu kỳ nhiệt có thể có sự thay đổi về số chu kỳ và nhiệt độ, điều này phụ thuộc vào máy PCR và độ dày của eppendorf. - Kết quả không ổn định. Với cùng 1 mẫu DNA, cùng 1 thành phần hóa chất nhƣng ở 2 lần thực hiện khác nhau có thể cho ra kết quả khác nhau. 2.5.5.2 Ứng dụng của kỹ thuật RAPD Nghiên cứu sự đa dạng di truyền. Marker phân tử  Ƣu điểm của kỹ thuật RAPD Không đòi hỏi chất lƣợng DNA mẫu cao, lƣợng DNA mẫu cần ít. Dễ thực hiện và dễ thành công do không cần biết trƣớc trình tự bộ gene của đối tƣợng cần nghiên cứu, thao tác đơn giản. Thời gian thực hiện nhanh. Khả năng nhân bản cao. Chi phí thực hiện thấp. Kỹ thuật RAPD thƣờng đƣợc sử dụng kết hợp với những kỹ thuật cao cấp khác để đánh giá đa dạng di truyền và nhận diện chỉ thị phân tử có độ tin cậy cao.  Nhƣợc điểm của kỹ thuật RAPD Độ chính xác không cao, kết quả không ổn định. Khả năng nhân bản trong phản ứng PCR cao nhƣng khả năng xuất hiện đa hình thấp và độ tin cậy không cao. Khả năng nhận diện chỉ thị phân tử thấp và có độ tin cậy không cao. 25 2.5.6 Một số nghiên cứu về DNA marker trên cây đƣớc. Năm 1997, Madasamy Parani và cộng sự đã sử dụng kỹ thuật RAPD và RFLP để nghiên cứu mối quan hệ giữa cây đƣớc đôi (Rhizophora apiculata Blume.) và cây đƣng (Rhizophora mucronata). Kết quả nghiên cứu cho thấy có mối quan hệ rất gần giữa cây đƣớc đôi (Rhizophora apiculata Blume.) và cây đƣng (Rhizophora mucronata). Bảng 2.4: Mối quan hệ di truyền giữa cây đƣớc đôi (Rhizophora apiculata Blume.) và cây đƣng (Rhizophora mucronata) khi phân tích bằng các primer khác nhau 26 Cũng tƣơng tự nhƣ sự phân loại các loài cây ngập mặn, sự phân biệt các loài trong họ đƣớc (Rhizophoreae) trƣớc hết đƣợc dựa vào các đặc điểm hình thái. Tuy nhiên nhiều đặc tính hình thái lại không đặc thù và bị trùng lắp. Điều này đã gây khó khăn trong việc phân biệt các loài. Năm 1988 Ballment và cộng sự đã báo cáo về hệ isozyme của cây dà (Ceriops). Năm 1998 Sun và cộng sự đã nghiên cứu sự khác nhau về kiểu gene của cây trang (Kandelia). Năm 2002, bằng kỹ thuật RAPD và RFLP, Mukkamala Lakshmi và cộng sự đã nghiên cứu mối quan hệ giữa các cây thuộc họ đƣớc (Rhizophoreae) tại Ấn Độ và cho kết quả đƣợc thể hiện ở hình 2.5 Hình 2.4 Hình 2.4: Sản phẩm RAPD trên 10 loài thuộc họ đƣớc (Rhizophoreae) trong rừng ngập mặn ở Ấn Độ với 4 primer: (A) OPD 18; (B) OPD 20; (C) OPA 04; (D) OPA 01 27 Hình 2.5: Cây di truyền giữa 10 loài thuộc họ đƣớc (Rhizophoreae) trong rừng ngập mặn ở Ấn Độ 2.6 Khái niệm đa dạng sinh học. Hiện nay có ít nhất 25 định nghĩa thuật ngữ "Đa dạng sinh học”. Theo Công ƣớc Đa dạng sinh học, khái niệm "Đa dạng sinh học" (biodiversity, biological diversity) có nghĩa là sự khác nhau giữa các sinh vật sống ở tất cả mọi nơi, bao gồm: Các hệ sinh thái trên cạn, trong đại dƣơng và các hệ sinh thái thủy vực khác, cũng nhƣ các phức hệ sinh thái mà các sinh vật là một thành phần,...; thuật ngữ này bao hàm sự khác nhau trong một loài, giữa các loài và giữa các hệ sinh thái. Có thể coi thuật ngữ "đa dạng sinh học" lần đầu tiên đƣợc Norse và McManus (1980) định nghĩa, bao hàm hai khái niệm có liên quan với nhau là: đa dạng di truyền (tính đa dạng về mặt di truyền trong một loài) và đa dạng sinh thái (số lƣợng các loài trong một quần xã sinh vật). Đa dạng sinh học (Biological Diversity) có nghĩa là sự phong phú, đa dạng của các dạng sống hiện đang tồn tại trên Trái Đất. Đa dạng sinh học bao gồm sự đa dạng của các dạng sống, vai trò sinh thái mà chúng thể hiện và đa dạng di truyền mà chúng có. Sự đa dạng sinh học đƣợc biết ở ba mức, đó là: - Sự đa dạng của các hệ sinh thái. - Sự đa dạng của các loài. - Sự đa dạng di truyền hay sự đa dạng của các nguồn gene bên trong loài. Năm 1991, J. Steele đề xuất một cấp thứ tƣ - đa dạng chức năng - sự đa dạng của những phản ứng khác nhau đối với những thay đổi của môi trƣờng, nhất là sự đa 28 dạng về quy mô không gian và thời gian mà các sinh vật phản ứng với nhau và với môi trƣờng. Các định nghĩa khác về Đa dạng sinh học: - Bao gồm tất cả các loài thực vật, động vật, vi sinh vật, các hệ sinh thái và quá trình sinh thái học mà chúng tham gia . Đây là khái niệm bao trùm cho mức độ phong phú của tự nhiên, bao gồm cả số lƣợng và tần số xuất hiện của các hệ sinh thái, các loài và các gene di truyền trong một tổ hợp xác định. (McNeely và cộng sự, 1990). - Tính đa dạng của gene di truyền, kiểu gene và các bộ gene cũng nhƣ mối quan hệ của chúng với môi trƣờng ở mức phân tử, loài, quần thể và hệ sinh thái (FAO, 1990). - Tính đa dạng của sinh vật ở mọi cấp độ, từ những biến dị di truyền trong cùng một loài đến sự đa dạng của các loài, giống/chi, họ và thậm chí cả các mức phân loại cao hơn; bao gồm cả đa dạng hệ sinh thái, gồm cả các quần xã sinh vật trong các sinh cảnh cụ thể và các điều kiện vật lý mà chúng sinh sống trong đó (Wilson, 1992). - Tính đa dạng về cấu trúc và chức năng của các dạng sống ở các mức di truyền, quần thể, loài, quần xã và hệ sinh thái (Sandlund và cộng sự., 1993). - Là toàn bộ đa dạng di truyền, đa dạng loài và đa dạng sinh thái, cũng nhƣ những tác động tƣơng hỗ giữa chúng, trong một vùng xác định, tại một thời điểm xác định (di Castri, 1995). 2.7 Khái niệm đa dạng di truyền. Đa dạng di truyền là tất cả các gene di truyền khác nhau của tất cả các cá thể thực vật, động vật, nấm, và vi sinh vật. Đa dạng di truyền tồn tại trong một loài và giữa các loài khác nhau . Đa dạng di truyền là sự đa dạng về thành phần gene giữa các cá thể trong cùng một loài và giữa các loài khác nhau; là sự đa dạng về gene có thể di truyền đƣợc trong một quần thể hoặc giữa các quần thể. Đa dạng di truyền là biểu hiện sự đa dạng của các biến dị có thể di truyền trong một loài, một quần xã hoặc giữa các loài, các quần xã. Xét cho cùng, đa dạng di truyền 29 chính là sự biến dị của sự tổ hợp trình tự của bốn cặp baze cơ bản, thành phần của acid nucleotide, tạo thành mã di truyền. Một biến dị gene xuất hiện ở một cá thể do đột biến gene hoặc nhiễm sắc thể, ở các sinh vật sinh sản hữu tính có thể đƣợc nhân rộng trong quần thể nhờ tái tổ hợp. Ngƣời ta ƣớc tính rằng, số lƣợng các tổ hợp có thể giữa các dạng khác nhau của các trình tự gene ở ngƣời cũng nhƣ ở ruồi giấm đều lớn hơn số lƣợng các các nguyên tử trong vũ trụ. Các dạng khác của đa dạng di truyền có thể đƣợc xác định tại mọi cấp độ tổ chức, bao gồm cả số lƣợng DNA trong mỗi tế bào, cũng nhƣ số lƣợng và cấu trúc nhiễm sắc thể. Tập hợp các biến dị gene trong một quần thể giao phối cùng loài có đƣợc nhờ chọn lọc. Mức độ sống sót của các biến dị khác nhau dẫn đến tần suất khác nhau của các gene trong tập hợp gene. Điều này cũng tƣơng tự trong tiến hoá của quần thể. Nhƣ vậy, tầm quan trọng của biến dị gene là rất rõ ràng: Nó tạo ra sự thay đổi tiến hoá tự nhiên cũng nhƣ chọn lọc nhân tạo. Chỉ một phần nhỏ (thƣờng nhỏ hơn 1%) vật chất di truyền của các sinh vật bậc cao là đƣợc biểu hiện ra ngoài thành các tính trạng kiểu hình hoặc chức năng của sinh vật; vai trò của những DNA còn lại và tầm quan trọng của các biến di gene của nó vẫn chƣa đƣợc làm rõ. Ƣớc tính cứ 109 gene khác nhau phân bố trên sinh giới thì có 1 gene không có đóng góp đối với toàn bộ đa dạng di truyền. Đặc biệt, những gene kiểm soát quá trình sinh hóa cơ bản, đƣợc duy trì bền vững ở các đơn vị phân loại khác nhau và thƣờng ít có biến dị, mặc dù những biến dị này nếu có sẽ ảnh hƣởng nhiều đến tính đa dạng của sinh vật. Đối với các gene duy trì sự tồn tại của các gene khác cũng tƣơng tự nhƣ vậy . Hơn nữa, một số lớn các biến dị phân tử trong hệ thống miễn dịch của động vật có vú đƣợc quy định bởi một số lƣợng nhỏ các gene di truyền. 30 Article 3. PHẦN 3: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện. 3.1.1 Thời gian thực hiện. Đề tài đƣợc thực hiện từ 10/02/2006 đến 01/08/2006 3.1.2 Địa điểm thực hiện. Mẫu lá đƣớc đƣợc thu thập tại Khu Dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ. Mẫu lá đƣợc ly trích DNA và chạy RAPD tại Trung tâm Phân tích Thí nghiệm Hóa Sinh trƣờng Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh. 3.2 Vật liệu thí nghiệm. Mẫu lá đƣớc đƣợc thu thập tại tiểu khu 4b, tiểu khu 6b, tiểu khu 11, tiểu khu 12, tiểu khu 15, khu An Hòa, An Phƣớc thuộc Khu Dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ. Nguyên tắc thu thập mẫu: - Xác định đƣợc vị trí cụ thể của cây lấy mẫu trêm bản đồ thông qua hệ thống định vị toàn cầu GPS (Global Position System). - Thu thập lá của cây đƣớc đôi (lá già, lá non, lá bánh tẻ). - Chọn mẫu lá từ những cây có đặc điểm khác biệt nhƣ: thân cây to, cây mọc tốt, cây mọc yếu ớt, cây bị mối, cây có u, cây có hình dáng lá khác lạ … - Chọn mẫu lá từ trên những cây đƣớc đôi có năm tuổi khác nhau nhƣ đƣớc 74, 78, 79, 80. Ký hiệu tên mẫu: Mẫu đƣợc đặt tên là xxRAyy với xx là năm trồng, yy là thứ tự của mẫu. 31 3.3 Phƣơng pháp thí nghiệm. 3.3.1 Quy trình ly trích DNA. 3.3.1.1 Vật liệu dùng trong ly trích DNA. a. Thiết bị và dụng cụ. Chày và cối (Đức). Bình và khay đựng Nitơ lỏng. Cân điện tử (Ohaus - Mỹ). Bồn ủ nhiệt (Memmert-Anh). Tủ lạnh 4oC và -20oC. Máy Vortex (IKA - Đức). Máy hút và tủ cấy vô trùng (Việt Nam /Anh). Máy vi ly tâm lạnh (Hettich - Đức). Nồi hấp Autoclave (ToMy - Nhật Bản). Lò Viba (Electrolux). Tủ sấy (Jencons-Anh). Máy điện di (Biorad). Máy chụp ảnh DNA (Biorad - Thụy Điển). Đầu típ các loại (Đức). Pipet các loại (Nichiryo – Nhật Bản). Máy đo hấp thu quang phổ (HP - Mỹ). Máy PCR (BioRad – Thụy Điển). Tủ lạnh các loại (Sanyo - Nhật Bản). Eppendorf 1,5 ml và 0,2 ml (Pháp). 32 Hóa chất ly trích. HÓA CHẤT CÔNG DỤNG CÁCH PHA CTAB (C19H42NBr, M=364,5 g/mol) Phá vỡ màng tế bào, màng nhân Hòa tan trong nƣớc cất 2 lần ở 65oC Ethanol 100% Tủa DNA ở nồng độ muối Sodium acetate cao và nhiệt độ thấp Dung dịch gốc Ethanol 70% Rửa DNA Pha với tỷ lệ 7 thể tích ethanol 100% và 3 thể tích nƣớc cất 2 lần đã hấp tiệt trùng Iso Propanol Tủa DNA ở nhiệt độ thấp, không cần muối Sodium Acetate Dung dịch gốc Chloroform Biến tính protein và các sắc tố có trong mẫu. Tách lớp sau khi ly tâm Dung dịch gốc Iso Amylalcohol Tránh tạo bọt trong quá trình vortex hay ly tâm tốc độ cao Dung dịch gốc Hỗn hợp Chloroform:Isoamyl Alcohol (24:1) Biến tính protein và các sắc tố trong mẫu. Tách lớp sau khi ly tâm, DNA đƣợc phóng thích sẽ nằm trong pha nƣớc ở lớp trên Pha với tỷ lệ 24 thể tích Chloroform và 1 thể tích Isoamyl Alcohol EDTA 0,5M (C10H14N2Na2O3, M=372,54 g/mol) Gắn nối các ion hóa trị II (Mg ++ , Ca ++…) có trong dịch ly trích, ngăn chặn sự hoạt động của các enzyme phân hủy DNA. Các enzyme này hoạt động rất mạnh nếu có sự có mặt của các ion hóa trị II nhất là ion Mg++ Pha 100ml: - 18,622 g bột EDTA + 80ml nƣớc cất 2 lần. Khuấy tan. - Chỉnh pH đạt 8, thêm nƣớc cất 2 lần cho đủ 100ml. - Hấp 121oC/20phút trƣớc khi dùng. Tris-HCl 1M (C4H12ClNO3, M=157,6 g/mol) Dung dịch đệm, đảm bảo môi trƣờng ly trích ổn định ở pH8. Ở độ pH này DNA ổn định nhất Pha 100ml: - 19,7 g bột Tris-HCl + 80ml nƣớc cất 2 lần. Khuấy tan. - Chỉnh pH đạt 8, thêm nƣớc cất 2 lần cho đủ 100ml. - Hấp 121oC/20 phút trƣớc khi dùng. 33 NaCl 5M (M=58,5 g/mol) Môi trƣờng đệm thuận lợi cho việc kết tủa DNA Pha 100ml: - 29,25 g NaCl + 100ml nƣớc cất 2 lần. Khuấy tan. - Hấp 121oC/20 phút trƣớc khi dùng. TE 10X Dung dịch Stock Pha 100ml: - 10ml Tris-HCl 1M + 2ml EDTA 0,5M + 88ml nƣớc cất 2 lần. - Hấp 121oC/20 phút trƣớc khi dùng. TE 1X Hòa tan DNA Pha 100ml: 10ml TE 10X + 90ml nƣớc cất 2 lần EB (Extraction Buffer) Dung dịch ly trích Pha 100ml: - 57ml nƣớc cất 2 lần + 2g CTAB (lắc nhẹ trong bồn ủ 65oC cho tan, hạn chế tạo bọt). - Thêm vào 28ml NaCl 5M + 10ml Tris-HCl 1M + 4ml EDTA 0,5M + 1ml Mercaptro Ethanol. - Bọc giấy bạc, trữ ở 4oC, tránh ánh sáng trực tiếp. Sodium Acetate 3M (CH3COONa, M=82 g/mol) Dung dịch đệm, làm tăng lực ion trong dịch trích, tạo điều kiện thuận lợi cho DNA kết tủa với ethanol 100% trong điều kiện -20oC Pha 100ml: - 24,6g bột Sodium Acetate + 100ml nƣớc cất 2 lần. Khuấy tan. - Hấp 121oC/20 phút trƣớc khi dùng RNase (Ribonuclease) (10%, w/v) Enzyme thủy phân RNA có trong dịch trích Pha 1ml: - 10mg bột RNase + 1ml nƣớc cất 2 lần. - Bọc giấy bạc, trữ ở 4oC, tránh ánh sáng trực tiếp. Mercaptro Ethanol Bảo vệ DNA Dung dịch gốc 34 3.3.1.2 Quy trình ly trích DNA Trong đề tài nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành thực hiện ly trích DNA tổng số trên 2 quy trình: quy trình ly trích mẫu tƣơi (Doyle và Doyle (1988)) và quy trình ly trích cải tiến. a. Quy trình 1: Quy trình ly trích mẫu tƣơi (Doyle và Doyle (1988)) gồm 12 bƣớc:  Bƣớc 1: Cân 0,15 g lá đã rửa sạch. Cho 1,2 ml dịch trích EB vào eppendorf, nghiền lá với dung dịch này. Vortex thật kỹ. Ủ ở 650 C trong 45 phút.  Bƣớc 2: Thêm 500 l Chloroform: isoamyl alcohol (24: 1), khuấy bằng vortex 10 phút, li tâm 5 phút 14.000 vòng ở 100 C.  Bƣớc 3: Chuyển lấy dịch trong lặp lại bƣớc 2.  Bƣớc 4: Chuyển lấy dịch trong, thêm vào 2 l RNase, ủ ở 370 C trong 1giờ.  Bƣớc 5: Thêm vào 250 l dung dịch isopropanol lạnh. Để tủa ở –200 C khoảng 30 phút (nên để qua đêm).  Bƣớc 6: Li tâm 5 phút 14.000 vòng ở 100 C. Đổ bỏ dịch trong.  Bƣớc 7: Cho vào 300 l TE 1X, ủ ở 370 C trong 1giờ.  Bƣớc 8: Thêm 20 l muối Sodium acetate 3 M, và 640 l Ethanol 100%, trộn đều và để – 200 C trong 30 phút.  Bƣớc 9: Li tâm 10 phút 14.000 vòng ở 100 C, đổ bỏ dịch trong.  Bƣớc 10: Rửa cặn với 400 l Ethanol 70% bằng cách ly tâm 2 phút 14.000 vòng ở 100 C, đổ bỏ dịch trong.  Bƣớc 11: Lặp lại bƣớc 10. Để khô cặn, hoà tan cặn trong 100 l TE 1X, ủ ở 370 C trong 30 phút.  Bƣớc 12: Bảo quản mẫu ở 40 C. 35 b. Quy trình 2: Quy trình ly trích cải tiến gồm 12 bƣớc:  Bƣớc 1: Lấy 0,2 g lá non rửa sạch và lau khô, nghiền trong nitơ lỏng, cho vào eppendorf.  Bƣớc 2: Thêm 1,2 ml dịch trích EB, vortex kỹ ở tốc độ thấp (600-800 vòng/phút). Ủ qua đêm ở 55oC.  Bƣớc 3: Ly tâm 12.000 vòng trong 15 phút ở 4oC. Thu dịch nổi.  Bƣớc 4: Thêm 500 l Chloroform: Isoamyl alcohol (24:1), đảo nhẹ. Ly tâm 12.000 vòng trong 15 phút ở 4oC. Thu dịch nổi.  Bƣớc 5: Lập lại bƣớc 4. Thu đƣợc V l dịch nổi.  Bƣớc 6: Thêm 0,2 V Sodium acetate 3M và 0,6 V Isopropanol lạnh. Đảo trộn kỹ. Ủ -20oC trong 90 phút.  Bƣớc 7: Ly tâm 10.000 vòng trong 10 phút ở 4oC. Đổ bỏ dịch trong, thu kết tủa.  Bƣớc 8: Rửa kết tủa bằng cách thêm 400 l ethanol 70% và ly tâm 10.000 vòng trong 1 phút ở 4oC. Đổ bỏ dịch trong.  Bƣớc 9: Rửa kết tủa bằng cách thêm 400 l ethanol 100% và ly tâm 10.000 vòng trong 1 phút ở 4oC. Đổ bỏ dịch trong.  Bƣớc 10: Phơi thật khô kết tủa ở nhiệt độ phòng.  Bƣớc 11: Hòa tan kết tủa trong 100 l TE 1X, ủ ở 37oC đến khi kết tủa tan hoàn toàn (có thể ủ qua đêm).  Bƣớc 12 : Bảo quản mẫu ở -20oC. 3.3.1.3 Kiểm tra kết quả ly trích DNA. a. Kiểm tra định lƣợng DNA bằng quang phổ kế. Một cách tổng quát, hàm lƣợng DNA trong mẫu ly trích đƣợc tính theo công thức: DNA (ng/ l) = [(62,9 * OD260nm) – (36 * OD280nm)] * n Với: a. OD260nm: Giá trị mật độ quang của mẫu ở bƣớc sóng 260nm. b. OD280nm: Giá trị mật độ quang của mẫu ở bƣớc sóng 280nm. c. n: Độ pha loãng (thƣờng n = 100). 36 Cách tiến hành: - Xây dựng đƣờng chuẩn: Dùng dung dịch TE 1X để tạo đƣờng chuẩn. - Pha loãng dung dịch DNA đến nồng độ thích hợp để đo (thƣờng pha loãng 100 lần) với dung dịch TE 1X: Hút 20 l dung dịch DNA cho vào Curvette, hòa tan với 1,8 ml TE 1X. Tiến hành đo OD. b. Kiểm tra định tính DNA bằng phƣơng pháp điện di trên gel. Mẫu DNA ly trích đƣợc điện di trên gel agarose 0,8% ở hiệu điện thế 100 V, cƣờng độ dòng điện 250 mA trong 15 phút. Sau khi chạy điện di xong, ngâm gel trong hỗn hợp Ethidium Bromide 0,5 g/ml và TAE 0,5X trong 15 phút. Gel sau khi nhuộm đƣợc rửa nhẹ dƣới vòi nƣớc sạch và đƣa vào máy chụp ảnh DNA. Dƣới tia UV, Ethidium Bromide liên kết với sợi đôi DNA sẽ phát quang và tạo thành các band trên gel. 3.3.2 Thực hiện kỹ thuật RAPD. 3.3.2.1 Dụng cụ và hóa chất dung trong kỹ thuật RAPD a) Dụng cụ, thiết bị: Pipet (0,5-10 l, 10-100 l). Đầu típ (10 l, 100 l). Eppendorf loại 200 l. Tủ cấy vô trùng (Anh). Máy PCR (BioRad – Thụy Điển). b) Hóa chất: Taq polymerase (BioRad – Thụy Điển). Buffer free Mg ++ . MgCl2. Nƣớc siêu sạch. Primer: Sử dụng hai primer: - Trình tự của primer 11 (OPN 06): 5’GAGACGCACA 3’ và Tm = 35,3 0 C - Trình tự của primer 5 (OPA 05): 5’GGGTAACGCC 3’ và Tm = 37,4 o C 37 3.3.2.1 Bố trí thí nghiệm. Nhằm tìm ra đƣợc chu kỳ nhiệt và thành phần hóa chất tối ƣu cho kỹ thuật RAPD trên cây đƣớc, chúng tôi đã tiến hành 3 thí nghiệm.  Thí nghiệm 1: Sử dụng primer 11 (OPN 06), với thành phần các chất và chu kỳ nhiệt đƣợc thể hiện ở bảng 3.1 và bảng 3.2 Bảng 3.1: Thành phần hóa chất sử dụng trong phản ứng RAPD ở thí nghiệm 1 Hóa chất Nồng độ đầu Thể tích sử dụng Nồng độ cuối PCR buffer 10X 2,5 l 1X MgCl2 25 mM 2 l 2 mM dNTP 10 mM 0,3 l 120 M Primer 10 pM 0,65 l 2,6 pM Taq DNA polymerase 5 U 0,1 l 0,5 U DNA mẫu 20 ng/ l 1 l 20 ng H2O 18,45 l Tổng thể tích phản ứng 25 l Bảng 3.2: Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RAPD của thí nghiệm 1 Số chu kỳ Nhiệt độ (0C) Thời gian (phút) 1 94 3 33 94 1 36 1 72 1 1 72 10 Hold 4 0 C 38  Thí nghiệm 2: Sử dụng primer 5 (OPA 05), với thành phần các chất và chu kỳ nhiệt đƣợc thể hiện ở bảng 3.3 và bảng 3.4 Bảng 3.3: Thành phần hóa chất sử dụng trong phản ứng RAPD ở thí nghiệm 2 Hóa chất Nồng độ đầu Thể tích sử dụng Nồng độ cuối PCR buffer 10X 2,5 l 1X MgCl2 25 mM 2,5 l 2,5 mM dNTP 10 mM 0,25 l 100 M Primer 100 pmol/ l 6,5 l 26 pM Taq DNA polymerase 5 U 0,2 l 1 U DNA mẫu 20 ng/ l 2 l 40 ng H2O 16,9 l Tổng thể tích phản ứng 25 l Bảng 3.4: Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RAPD của thí nghiệm 2 Số chu kỳ Nhiệt độ (0C) Thời gian (phút) 1 94 3 40 94 1 36 1 72 2 1 72 15 Hold 4 0 C 39  Thí nghiệm 3: Sử dụng primer 11 (OPN 06), với thành phần các chất và chu kỳ nhiệt đƣợc thể hiện ở bảng 3.5 và bảng 3.6 Bảng 3.5: Thành phần hóa chất sử dụng trong phản ứng RAPD ở thí nghiệm 3 Hóa chất Nồng độ đầu Thể tích sử dụng Nồng độ cuối PCR buffer 10X 2,5 l 1X MgCl2 25 mM 2,5 l 2,5 mM dNTP 10 mM 0,25 l 100 M Primer 100 pmol/ l 6,5 l 26 pM Taq DNA polymerase 5 U 0,2 l 1 U DNA mẫu 20 ng/ l 2 l 40 ng H2O 16,9 l Tổng thể tích phản ứng 25 l Bảng 3.6: Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RAPD của thí nghiệm 3 Số chu kỳ Nhiệt độ (0C) Thời gian (phút) 1 94 3 40 94 1 36 1 72 2 1 72 15 Hold 4 0 C 40 Một số lưu ý khi thực hiện phản ứng RAPD: Trong thành phần của phản ứng, Taq polymerase đƣợc sử dụng với thể tích rất nhỏ (0,1 - 0,2 l) và không có pipet nào có thể hút chính xác một thể tích nhỏ nhƣ vậy. Vì vậy, để đảm bảo độ chính xác của thí nghiệm, thông thƣờng ngƣời ta trộn (mix) một lần nhiều phản ứng, sau đó đem chia ra các ống và cho DNA mẫu vào sau cùng. Các thao tác mix mẫu phải đƣợc thực hiện trong tủ cấy vô trùng nhằm tránh sự tạp nhiễm. Trong quá trình mix mẫu, hóa chất và DNA mẫu phải đƣợc giữ lạnh để tránh hƣ hỏng. Các thao tác mix mẫu phải tiến hành nhẹ nhàng, tránh tạo bọt trong quá trình mix. Taq polymerase phải đƣợc bỏ vào sau cùng. Sau khi đã cho Taq vào trong hỗn hợp, các thao tác tiếp theo phải tiến hành nhanh chóng vì Taq sẽ hoạt động ngay. 41 (A) (B) Article 4. PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết quả thu thập mẫu đƣớc tại Khu Dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ. Chúng tôi đã tiến hành thu thập đƣợc hơn 40 mẫu lá đƣớc gồm nhiều năm tuổi với những đặc điểm hình thái khác nhau nhƣ: cây bị mối mọt ăn; cây ốm yếu; cây to, khỏe; cây có hai màu trái (đỏ và xanh); cây có 4 hoa (Rhizophora x Lamarckii)…. Hình 4.1: Hoa đƣớc (A) Hoa của cây đƣớc lai Rhizophora x Lamarckii (4 bông) (B) Hoa của cây đƣớc đôi Rhizophora apiculata Blume Hình 4.2: Vị trí lấy mẫu trên bản đồ Cần Giờ 42 Hình 4.3 Cây đƣớc đôi có cả trái màu xanh và trái màu đỏ Tuy số mẫu thu thập đƣợc chỉ là rất ít so với tổng diện tích hơn 70.000ha của Khu Dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ nhƣng cũng đã đại diện đƣợc phần nào quần thể đƣớc tại đây. 4.2 Bảo quản mẫu và hoàn thiện quy trình ly trích DNA. 4.2.1 Bảo quản mẫu. Mẫu lá đƣớc không thể bảo quản lâu dài ngay cả trong điều kiện -20oC. Mẫu lá đƣợc bảo quản trong tủ lạnh -20oC sẽ nhanh chóng bị hƣ hỏng (hóa nâu, dập…) ngay khi vừa lấy ra khỏi tủ lạnh. Khoảng thời gian mẫu bị hƣ hỏng chỉ trong hơn 10 giây, không kịp để nghiền mẫu trong dịch trích. Điều này là do khi trữ ở -20oC, các tinh thể nƣớc có kích thƣớc lớn đã đƣợc tạo thành và phá vỡ vách cellulose của tế bào lá đƣớc. Trái màu đỏ Trái màu xanh Trái màu xanh 43 Ở điều kiện nhiệt độ phòng, các tinh thể nƣớc tan ra làm cho hợp chất phenol có trong tế bào lá đƣớc đƣợc phóng thích ra ngoài và làm hóa nâu mẫu lá. Qua một số thí nghiệm về thời gian tồn trữ mẫu, chúng tôi đã có kết luận: - Cách trữ mẫu tốt nhất là cho vào trong túi nilông, ép hết không khí trong túi ra ngoài và trữ ở 4oC. Với cách trữ này thì mẫu có thể trữ đƣợc trong vòng 10 ngày mà không bị hƣ hỏng khi lấy ra ngoài điều kiện nhiệt độ phòng. - Việc trữ mẫu đã nghiền trong nitơ lỏng ở điều kiện -70oC có thể trữ đƣợc trong vòng 20 ngày và mẫu nhanh chóng bị hƣ hỏng (hóa nâu, dập…) ngay khi vừa lấy ra khỏi tủ lạnh. - Để đạt đƣợc kết quả ly trích tốt nhất nên ủ mẫu với dịch trích EB ngay khi vừa nghiền xong. 4.2.2 Hoàn thiện quy trình ly trích. Ban đầu chúng tôi thực hiện theo quy trình 1 (Quy trình ly trích mẫu tƣơi (Doyle và Doyle (1988)). Kết quả chúng tôi không thu đƣợc DNA mẫu hoặc là lƣợng DNA thu đƣợc không tinh sạch và bị gẫy vụn rất nhiều. Có thể điều này là do quá trình bảo quản mẫu không tốt làm cho mẫu bị hƣ hỏng. Ngoài ra còn có thể do các thao tác ly trích chƣa đƣợc chuẩn nhƣ vortex quá mạnh, nghiền mẫu quá mạnh làm DNA bị đứt gẫy. Mẫu DNA thu đƣợc từ quy trình này hoàn toàn không tinh sạch và không đủ tiêu chuẩn để chạy RAPD. Việc ly trích DNA từ mẫu đƣớc gặp nhiều khó khăn vì lá đƣớc có chứa nhiều polysaccharide làm cho dịch trích rất nhớt. Có thể chất nhớt này đã hạn chế sử kết tủa của DNA và làm cho DNA bị trôi đi khi đổ bỏ dịch trong ở bƣớc 6, 9, 10, 11. Đồng thời trong lá đƣớc còn chứa nhiều chất thứ cấp nên làm hạn chế tác dụng của các hóa chất ly trích. Sau nhiều lần thay đổi một số yếu tố nhƣ thời gian ủ, lƣợng mẫu, tốc độ ly tâm, thử nghiền mẫu trong nitơ lỏng … chúng tôi đã hoàn thiện và quyết định ly trích theo quy trình 2 (Quy trình cải tiến). Mẫu DNA thu đƣợc từ quy trình 2 tốt và đủ tiêu chuẩn để chạy RAPD. 44 Qua quá trình hoàn thiện quy trình ly trích, chúng tôi rút ra một số kết luận: - Việc sử dụng nitơ lỏng trong giai đoạn nghiền mẫu cho kết quả ly trích tốt hơn so với mẫu nghiền trực tiếp với dịch trích EB. Mẫu lá đƣớc sau khi nghiền với nitơ lỏng nên ủ ngay với dịch trích EB để cho kết quả tốt hơn. - Tăng thời gian ủ mẫu và giảm nhiệt độ ủ giúp cho lƣợng DNA đƣợc phóng thích tốt hơn. - Giảm tốc độ ly tâm tránh cho DNA bị đứt gẫy. - Việc ly tâm và thu dịch nổi trƣớc khi thêm Chloroform có thể đã loại bỏ đƣợc phần lớn chất thứ cấp trong lá đƣớc giúp cho Chloroform có tác dụng tốt hơn. - Ly trích DNA từ mẫu lá đƣớc non sẽ dễ dàng hơn và DNA ly trích đƣợc có độ tinh sạch cao hơn. Lá non còn nằm trong 2 lá phụ màu đỏ đƣợc rửa sạch và lau khô để tiến hành ly trích. Hình 4.4: Phần lá non dùng để ly trích DNA DNA mẫu thu đƣợc từ quy trình này khá tốt, kết quả điện di cho thấy rõ chất lƣợng của DNA mẫu thu đƣợc từ hai quy trình. DNA mẫu thu đƣợc từ quy trình này khá tốt, kết quả điện di cho thấy rõ chất lƣợng của DNA mẫu thu đƣợc từ hai quy trình. Phần dùng để ly trích DNA tốt nhất trên cây đƣớc 45 Hình 4.5: Sự khác biệt giữa DNA mẫu ly trích theo quy trình của Doyle (quy trình 1) và mẫu ly trích theo quy trình cải tiến (quy trình 2). Hình 4.6: Các mẫu DNA ly trích đƣợc theo hai quy trình ly trích Tuy nhiên kết quả đo OD cho thấy tỷ lệ mẫu đạt tiêu chuẩn còn thấp. Điều này là do những mẫu đó đã đƣợc ly trích lâu và trữ ở 4oC làm mất dần lƣợng DNA trong mẫu. Vì vậy chúng tôi quyết định trữ mẫu ở -20oC nhằm hạn chế sự mất dần lƣợng DNA trong mẫu. Với kết quả nhƣ trên, chúng tôi quyết định ly trích DNA mẫu theo quy trình cải tiến (tóm tắt ở sơ đồ 4.1) để tiếp tục thực hiện kỹ thuật RAPD. 46 Sơ đồ 4.1 Quy trình cải tiến ly trích DNA từ lá đƣớc Quy trình ly trích sử dụng -mercaptoethanol có tác dụng phá hủy mạnh thành tế bào giúp cho việc giải phóng DNA hiệu quả hơn, muối sodium acetate làm bất hoạt enzyme phân hủy DNA và cho chloroform isoamyl acohol 2 lần với việc ly tâm tốc độ cao giúp loại bỏ đƣợc tạp chất nhƣ protein, polysaccharide...qua đó chất lƣợng DNA thu đƣợc tốt hơn. Nhìn chung quy trình ly trích khá ổn định và hiệu quả, vấn đề là tìm cách hạn chế sự đứt gãy của DNA, điều này phụ thuộc nhiều vào các tác nhân cơ học nhƣ nghiền mẫu, vortex mẫu. Chúng tôi tiến hành ly trích trên 45 mẫu, kết quả thu đƣợc DNA trên 30 mẫu. Những mẫu ly trích không thành công là những mẫu lá đã trƣởng thành. Điều này là do lá trƣởng thành chứa nhiều chất thứ cấp nhƣ phenol, polysaccharide … làm ảnh hƣởng đến hoạt tính của hóa chất ly trích và làm mất một lƣợng lớn DNA trong quá trình loại bỏ tạp chất. Ngoài ra, việc bảo quản mẫu không tốt cũng là nguyên nhân làm cho lƣợng DNA trong mẫu bị mất đi. Bƣớc 4 Bƣớc 5 Bƣớc 6 Bƣớc 7 Bƣớc 8 Thu đƣợc dung dịch đồng nhất màu xanh Thu đƣợc dung dịch màu vàng nhạt Thu đƣợc dung dịch màu xanh Thu đƣợc dung dịch trong suốt, hơi vàng Thu đƣợc dịch huyền phù màu trắng Thu đƣợc kết tủa màu trắng, trong suốt Mẫu phải đƣợc nghiền mịn nhƣ bột Nghiền 0,2 g mẫu lá non trong nitơ lỏng Thêm 1,2 ml dịch trích EB, vortex kỹ, ủ 55oC qua đêm Ly tâm 12.000 vòng/15phút/4oC, hút dịch nổi Thêm 500 l Chloroform:Isoamyl alcohol (24:1), đảo nhẹ. Ly tâm 12000vòng/15ph/4oC, hút dịch nổi Thêm 0,2 V Sodium acetate 3M và 0,6 V Isopropanol lạnh. Đảo trộn kỹ. Ủ -20 o C trong 90 phút Lập lại bƣớc 4, thu đƣợc V l dịch nổi Ly tâm 10000 vòng trong 10 phút ở 4 o C. Đổ bỏ dịch trong, thu tủa Rửa tủa bằng cách thêm lần lƣợc 400 l ethanol 70%, ethanol 100% và ly tâm 10.000 vòng trong 1phút ở 4oC. Đổ bỏ dịch trong Phơi khô tủa ở nhiệt độ phòng và hòa tan tủa trong 100 l TE 1X. Bảo quản mẫu ở -20 o C Bƣớc 1 Bƣớc 2 Bƣớc 3 Bƣớc 9 47 4.3 Kết quả chạy RAPD. 4.3.1 Thí nghiệm 1: Sử dụng primer 11 với chu kỳ nhiệt 1 Qua thí nghiệm 1, chúng tôi thu đƣợc kết quả đƣợc thể hiện ở hình 4.7 Hình 4.7 Sản phẩm PCR ở thí nghiệm 1 Kết quả điện di cho thấy chu kỳ nhiệt và thành phần hóa chất trong phản ứng RAPD trong thí nghiệm 1 không phù hợp cho cây đƣớc. Chúng tôi không thu đƣợc sản phẩm PCR trên hầu hết các mẫu. Chỉ có hai mẫu có đoạn DNA đƣợc khuếch đại nhƣng rất mờ. Do không thể phân biệt đƣợc các band nên kết quả này chƣa thể có ý nghĩa trong việc nghiên cứu đa dạng di truyền. Điều này có thể do một số nguyên nhân nhƣ: - Chất lƣợng mẫu chƣa tốt, còn lẫn nhiều tạp chất làm ảnh hƣởng đến phản ứng PCR. - Lƣợng DNA mẫu chƣa đủ. - Lƣợng Taq polymerase sử dụng chƣa đủ hoạt tính. - Lƣợng primer chƣa đủ. - Chu kỳ nhiệt chƣa tốt, thời gian kéo dài chƣa đủ dẫn đến sản phẩm PCR không hoàn thiện. Với những nhận định trên, chúng tôi đã có những thay đổi trong thành phần hóa chất cũng nhƣ chu kỳ nhiệt để có thể tối ƣu hóa phản ứng PCR ở các thí nghiệm sau. Sản phẩm PCR 48 1750bp 600bp 1750bp 4.3.2 Thí nghiệm 2: Sử dụng primer 5 với chu kỳ nhiệt ở bảng 3.4 Qua thí nghiệm 2, chúng tôi thu đƣợc kết quả đƣợc thể hiện ở hình 4.8 Hình 4.8: Sản phẩm PCR thí nghiệm 2 Kết quả điện di cho thấy sản phẩm PCR tốt nhƣng chỉ cho 1 band đồng hình kích thƣớc 600 bp. Mặc dù có những vệt smear có vẻ nhƣ là có thêm band nhƣng qua phân tích trên công cụ “Detected band” của phần mềm Quality One cho kết quả là sản phẩm PCR với primer 5 chỉ có 1 band. Do chỉ có 1 band đồng hình nên kết quả ở thí nghiệm 2 không có ý nghĩa trong việc nghiên cứu đa dạng di truyền ở cây đƣớc đôi. Tuy nhiên có thể band 600 bp là band đặc trƣng cho cây đƣớc đôi (Rhizophora apiculata Blume) và có thể là marker để phân biệt loài đƣớc với các loài khác trong họ Rhizophorceae. Do đó nên tách band này để giải trình tự nhằm phục vụ cho công tác nghiên cứu đặc thù cây đƣớc ở rừng Cần Giờ. 600bp 100bp L 78 R A 0 1 7 9 R A 0 1 8 0 R A 0 1 9 1 R A 0 1 9 6 R A 0 1 1500bp 49 4.3.3 Thí nghiệm 3: Sử dụng primer 11 với chu kỳ nhiệt ở bảng 3.6 Qua thí nghiệm 3, chúng tôi thu đƣợc kết quả đƣợc thể hiện ở hình 4.9 Hình 4.9: Sản phẩm PCR của thí nghiệm 3 Kết quả điện di cho thấy sản phẩm PCR tốt, cho độ đa hình cao. Chúng tôi thực hiện chạy RAPD với primer 11 trên 7 mẫu kết quả thu đƣợc trung bình 3,5 band/mẫu. Số lƣợng band/mẫu không cao nhƣng lại thể hiện rõ sự đa hình giữa các mẫu. Chúng tôi thu đƣợc 8 band đa hình chiếm tỷ lệ 88,9% và 1 band đồng hình chiếm tỷ lệ 11,1% (kích thƣớc khoảng 500 bp), kích cỡ của các band khoảng từ 200 bp – 1700 bp (hình 4.9). Band đồng hình có mặt trong tất cả các mẫu còn band đa hình có ở mẫu này nhƣng không có ở mẫu kia. Các band đa hình là cơ sở phân biệt giữa các mẫu có tính trạng khác nhau từ đó làm nền tảng để phân chia và xác định giống. Có band đa hình chỉ xuất hiện ở một vài mẫu nhƣ các band có kích thƣớc khoảng 200 bp (mẫu 80RA01, 78RA01, 78RA02), 400 bp (mẫu 80RA01, 78RA01, 78RA02, 91RA01, 96RA01), 700 bp (mẫu 80RA01, 78RA02, 91RA01, 96RA01). Tuy lƣợng mẫu nghiên cứu không lớn nhƣng trong tất cả các mẫu nghiên cứu, band đồng hình 500 bp luôn xuất hiện. Band này có thể là band đặc biệt dùng để phân biệt loài đƣớc (Rhizophora apiculata Blume) với các loài khác thuộc họ Rhizophorceae. Do đó nên tách band này để giải trình tự nhằm giải đáp cho sự chênh lệch và phục vụ cho công tác phân biệt và chọn giống. L 80 R A 0 2 78 R A 0 2 78 R A 0 1 79 R A 0 1 80 R A 0 1 91 R A 0 1 96 R A 0 1 50 Từ kết quả thu đƣợc trên gel điện di chúng tôi mã hóa thành dạng nhị phân 0 và 1 để phân tích mối tƣơng quan di truyền giữa các mẫu nghiên cứu bằng phần mềm NTSYS phiên bản 2.1. Hình 4.10: Cây phân loài một số cây đƣớc đôi tại Khu Dự trữ sinh quyển ngập mặn Cần Giờ Việc phân tích kết quả PCR trên phần mềm NTSYS cho kết quả nhƣ sau: - 7 mẫu đƣớc đƣợc khảo sát đƣợc chia làm 2 nhóm chính với khoảng cách phân nhóm là 0,41. Nhóm I gồm 6 mẫu: 78RA01, 78RA02, 79RA01, 80RA01, 80RA02, 91RA01. Đây là những mẫu đƣớc đƣợc lấy từ những cây trồng từ nguồn giống tại Cà Mau. Các cây này có hệ số đồng dạng di truyền cao từ 0,66 – 0,89. Các cây trồng cùng năm có hệ số đồng dạng di truyền là 0,89. Nhóm II chỉ có 1 mẫu 96RA01 đƣợc trồng từ nguồn giống tại Cần Giờ. - Những cây đƣớc đôi cùng năm tuổi (78RA01 và 78RA02; 80RA01 và 80RA02) có hệ số đồng dạng di truyền khá cao vào khoảng 89%. Điều này là hợp lý vì nguồn cây con để tái tạo rừng ngập mặn Cần Giờ từ năm 1978 đến 1990 đều lấy từ rừng ngập mặn Cà Mau. - Những cây đƣớc đôi trồng từ nguồn giống tại chỗ và trồng từ nguồn giống từ Cà Mau có hệ số đồng dạng di truyền khá thấp. Đây là kết quả của quá trình lai tạo và thụ phấn chéo giữa các cây đƣớc đôi. Càng về sau thì hệ số đồng dạng di truyền giữa các cây đƣớc đôi sẽ giảm và sẽ tạo đƣợc sự đa dạng sinh học cần thiết để tái tạo rừng. Nguồn giống từ Cà Mau Nguồn giống tại chỗ (I) (II) 51 PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận. Từ các kết quả thu đƣợc, chúng tôi rút ra một số kết luận nhƣ sau:  Quá trình bảo quản mẫu lâu dài ở -20oC, -80oC có ảnh hƣởng đến chất lƣợng DNA mẫu thu đƣợc khi ly trích.  Sử dụng lá đƣớc non để ly trích sẽ thu đƣợc lƣợng DNA mẫu tốt nhất.  Mẫu lá khi vừa nghiền xong nên ủ ngay với dịch trích EB.  Quy trình ly trích DNA của lá đƣớc khá ổn định. Ly trích đƣợc 35 mẫu (trên tổng số 45 mẫu) đạt DNA tiêu chuẩn dùng trong các kỹ thuật sinh học phân tử.  Quá trình bảo quản DNA mẫu rất quan trọng. Một số mẫu DNA đƣớc ly trích đã bị mất dần lƣợng DNA khi bảo quản ở 4oC.  Quy trình RAPD vẫn chƣa hoàn thiện. Có thể là do sử dụng những mẫu DNA đƣớc đã ly trích lâu hoặc quy trình nhiệt chƣa ổn định. Chúng tôi đã không thành công trong việc chạy RAPD trên mẫu đƣớc có trái màu đỏ và mẫu đƣớc Rhizophora x lamarckii (đƣớc 4 bông).  Primer 11 dùng trong kỹ thuật RAPD cho 9 band đối với các mẫu thí nghiệm, trong đó có 1 band đồng hình và 8 band đa hình. Primer 11 có tính đa hình đối với quần thể đƣớc đôi (Rhizophora apiculata Blume) tại Khu Dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ. Độ đa hình dạng giữa các mẫu thấp ngoại trừ mẫu 96RA01.  Primer 5 dùng trong kỹ thuật RAPD chỉ cho 1 band đồng hình. Primer 5 có độ đa hình thấp đối với quần thể đƣớc đôi (Rhizophora apiculata Blume) tại Khu Dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ.  Với việc phân tích RAPD sử dụng primer 11 thì quần thể đƣớc tại Khu Dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ có hệ số đồng dạng di truyền trên cây phát sinh chủng loại dao động trong khoảng 0,41 – 0,89. 52 5.2 Đề nghị.  Tối ƣu hóa quy trình RAPD trên cây đƣớc đôi.  Tiếp tục sử dụng primer 11 để đánh giá tính đa dạng di truyền với một lƣợng mẫu lớn hơn đối với quần thể đƣớc.  Khảo sát thêm các primer khác nhằm có đƣợc kết quả đa dạng di truyền chính xác nhất.  Tách riêng band 600 bp khi chạy RAPD với primer 5 và band 500 bp khi chạy RAPD với primer 11 để giải trình tự nhằm phục vụ cho việc phân biệt giữa loài đƣớc (Rhizophora apiculata Blume) với các loài khác thuộc họ Rhizophorceae trong rừng ngập mặn.  Phải có chính sách làm giàu nguồn tài nguyên di truyền, nâng cao tính đa dạng và bảo đảm sự phát triển bền vững của Khu Dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ nói chung và của quần thể đƣớc đôi (Rhizophora apiculata Blume) nói riêng.  Nghiên cứu thêm về những cây đƣớc đôi có hình thái khác lạ trong Khu Dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ. Tại Khu Dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ còn có một loài có tên địa phƣơng là đƣớc râu với những đặc điểm hình thái rất khác so với giống đƣớc (Rhizophora apiculata Blume.). Do vị trí phân bố của đƣớc râu khá xa (thuộc tiểu khu 14) nên chúng tôi chƣa có điều kiện lấy mẫu nghiên cứu. Hiện nay vẫn chƣa xác định đƣợc tên khoa học chính xác của loài này. Vì vậy chúng tôi đề nghị nghiên cứu trên cây đƣớc râu để có khả năng phát hiện ra đƣợc một loài mới tại Việt Nam. 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT: 1. Bùi Trang Việt, 2002. Bài giảng Sinh học phân tử. Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. 2. Hồ Huỳnh Thuỳ Dƣơng, 2002. Sinh học phân tử. Nhà xuất bản giáo dục. 3. Nguyễn Đức Thành, 2004. Một số kỹ thuật chỉ thị phân tử. Nhà xuất bản viện khoa hoc và công nghệ Việt Nam – Viện Công nghệ Sinh học Hà Nội. 4. Nguyễn Ngọc Bình, 2004. Cẩm nang ngành Lâm nghiệp. Nhà xuất bản Giao thông vận tải. 5. Nguyễn Thị Lang, Bùi Chí Bửu, 2005. Sinh học phân tử giới thiệu phương pháp và ứng dụng. Nhà xuất bản Nông Nghiệp. 6. Phạm Văn Bình, 2005. Đánh giá sơ bộ mức độ đa dạng di truyền của quần thể điều (Acanardium occidentale L.) hiện được trồng tại tỉnh Ninh Thuận bằng kỹ thuật RAPD và AFLP. Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. 7. Phạm Thành Hổ, 1998. Di truyền học. Nhà xuất bản giáo dục TP. Hồ Chí Minh. TÀI LIỆU TIẾNG NƢỚC NGOÀI: 1. Akira Komiyamaa, 1998. Mortality and growth of cut pieces of viviparous mangrove (Rhizophora apiculata and R. mucronata) seedlings in the field condition. Forest Ecology and Management, 112 (1998) p 227 – 231. 2. Bo Christensen, 1978. Biomass and primary production of Rhizophora apiculata Bl. In a mangrove in Southern Thailand. Aquatic Botany, 4 (1978) p. 43 – 52. 3. F. Blasco, 1996. Mangroves as indicators of coastal change. Catena, 27 (1996) p. 167 – 178. 4. IIka C. Feller and Marsha Sitnik, 1996. Mangrove ecology workshop manual. Smithsonian Institution,Washington. DC. 5. J. Terrados, 1997. The Effect of Increased Sediment Accretion on the Survival and Growth of Rhizophora apiculata Seedlings. Estuarine, Coastal and Shelf Science (1997) 45, p 697 – 701. 54 6. Kazutoshi Okuno and Shuichi Fukuoka, 1998. Manual for DNA extraction in plants. Japan international cooperation agency. 7. Madasamy Parani, 1997. Molecular Phylogeny of mangroves III Parentage analysis of a Rhizophora hybrid using Random Amplified Polymorphic DNA and Restriction Fragment Length Polymorphism markers. Aquatic Botany 58 (1997) p 165-172. 8. Mukkamala Lakshmi, 2002. Molecular phylogeny of mangroves IX Molecular marker assisted intra-specific variation and species relationships in the Indian mangrove tribe Rhizophoreae. Aquatic Botany, 74 (2002) p. 201 – 217. TRANG WEB: 1. 2. 55 PHỤ LỤC Bảng thống kê các mẫu đước đôi thu thập được tại Khu Dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ. STT TÊN MẪU VỊ TRÍ LẤY MẪU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI 1 80RA01 Tiểu khu 11 Cây to, mọc tốt, chia làm 3 thân chính. 2 80RA02 Tiểu khu 11 Cây ốm yếu, bị mối ăn. 3 80RA03 Tiểu khu 11 Cây mọc tốt. 4 80RA04 Tiểu khu 11 Cây mọc tốt. 5 80RA05 Tiểu khu 11 Lá cây có màu xanh đậm. 6 80RA06 Tiểu khu 11 Cây mọc yếu ớt. 7 80RA07 Tiểu khu 12 Cây mọc yếu, gốc bị sạt lở. 8 80RA08 Tiểu khu 12 Cây mọc yếu, gốc bị sạt lở. 9 80RA09 Tiểu khu 12 Cây mọc yếu, gốc bị sạt lở. 10 80RA10 Tiểu khu 12 Cây mọc yếu, gốc bị sạt lở. 11 80RA11 Tiểu khu 11 Cây mọc yếu, bị dây leo quấn. 12 80RA12 Tiểu khu 11 Cây mọc yếu, bị dây leo quấn. 13 80RA13 Tiểu khu 11 Cây mọc yếu, thân bị u. 14 80RA14 Tiểu khu 11 Cây mọc yếu, thân bị u. 15 80RA15 Tiểu khu 11 Cây mọc yếu, bị mối ăn. 16 79RA01 Tiểu khu 11 Cây mọc tốt. 17 79RA02 Tiểu khu 11 Cây mọc tốt. 18 79RA03 Tiểu khu 11 Cây mọc tốt. 19 79RA04 Tiểu khu 12 Cây mọc yếu, gốc bị sạt lở. 20 79RA05 Tiểu khu 12 Cây mọc yếu, gốc bị sạt lở. 21 78RA01 Tiểu khu 11 Cây mọc yếu, gốc bị sạt lở. 22 78RA02 Tiểu khu 11 Cây mọc yếu, gốc bị sạt lở. 56 23 78RA03 Tiểu khu 11 Cây mọc yếu, gốc bị sạt lở. 24 78RA04 Tiểu khu 12 Cây mọc yếu, gốc bị sạt lở. 25 78RA05 Tiểu khu 12 Cây mọc yếu, gốc bị sạt lở. 26 92RA01 Khu An Hòa, An Phƣớc Cây to, phát triển tốt. 27 92RA02 Khu An Hòa, An Phƣớc Cây to, phát triển tốt, cây có 3 thân chính. 28 91RA01 Tiểu khu 6b Cây nhỏ, phát triển kém. 29 91RA02 Tiểu khu 6b Cây nhỏ, phát triển kém. 30 91RA03 Tiểu khu 6b Cây nhỏ, phát triển kém. 31 91RA04 Tiểu khu 6b Cây nhỏ, phát triển kém. 32 96RA01 Khu An Hòa, An Phƣớc Cây to, phát triển tốt. 33 96RA02 Khu An Hòa, An Phƣớc Cây to, phát triển tốt. 34 96RA03 Khu An Hòa, An Phƣớc Cây to, phát triển tốt. 35 96RA04 Khu An Hòa, An Phƣớc Cây to, phát triển tốt. 36 96RA05 Khu An Hòa, An Phƣớc Cây to, phát triển tốt. 37 96RA06 Khu An Hòa, An Phƣớc Cây to, phát triển tốt. 38 74RA01 Tiểu khu 4b Cây cao, mọc yếu ớt. 39 74RA02 Tiểu khu 4b Cây cao, mọc yếu ớt. 40 74RA03 Tiểu khu 4b Cây cao, mọc yếu ớt. 41 74RA04 Tiểu khu 4b Cây cao, mọc yếu ớt. 42 74RA05 Tiểu khu 4b Cây cao, mọc yếu ớt. 43 80TĐ01 Tiểu khu 11 Cây có cả trái đỏ và xanh. 44 80TĐ02 Tiểu khu 11 Cây có cả trái đỏ và xanh. 45 RL01 Tiểu khu 15 Cây đƣớc lai, có 4 bông. Ghi chú:  80RA01: Cây đƣớc đôi trồng năm 1980, thứ tự lấy mẫu là 01.  80TĐ01: Cây đƣớc đôi trồng năm 1980, có cả trái đỏ và trái xanh, thứ tự lấy mẫu là 01.  RL: Cây đƣớc lai Rhizophora x lamarckii (đƣớc 4 bông). 57 Danh mục các loài thuộc họ đước Rhizophoraceae TÊN KHOA HỌC TÊN VIỆT NAM Bruguiera cylindrical (L.) Blume Vẹt trụ Bruguiera gymnorrhize (L.) Lamk Vẹt dù Bruguiera parviflora (Roxb.) W. & Arn. Ex. Griff Vẹt tách, Vẹt khang Bruguiera sexangula (Lour.) Poir. In Lamk Vẹt đen Ceriops decandra (Griff.) Ding Hou Dà quánh Ceriops tagal (Pers) C.B. Rob Dà vôi Kandelia candel (L.) Druce Trang Rhizophora apiculata Bl. Đƣớc đôi Rhizophora mucronata Poir. in Lamk. Đƣng, Đƣớc xanh Rhizophora stylosa Griff. Đƣớc vòi (Nguồn : Viên Ngọc Nam (1993)) 58 Danh mục các loài sinh vật quí hiếm ở Khu Dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ Tên khoa học Tên địa phƣơng Reptilia Lớp bò sát Gekko gecko Tắc kè Varanus salvator Kỳ đà nƣớc Python molurus Trăn đất Pythonreticulatus Trăn gấm Bugaris fasciculatus Rắn cạp nong Naja naja SĐVN xếp T Rắn hổ mang Ophiophagus hannah Rắn hổ chúa Chelonia mydas Vích Eretmochelis imbricata Đồi mồi Lepidochelus olivacea Quân đồng Crocodylus porosus Cá sấu hoa cà Aves Lớp chim Pelecanus philppensis Bộ nông chân xám Mycteria leucocephala Giang sen Mycteria cinerea Cò lạo xám Leptoptilos Javanicus Già đảy nhỏ Tringa guttifer Choắt lớn mỏ vàng Pica pica Ác là Mammalia Lớp thú Lutra lutra Rái cá thƣờng Aouyx cinerea Rái cá vuốt bé Felis viverrina Mèo cá Felis bengulensis Mèo rừng Nguồn: Bùi Lai và cộng sự. 1996, (MAB Vietnam, 1998. Proposed Biosphere Reserve of Can Gio Mangroves. HCM City) 59 Thống kê hiện trạng rừng – đất của 24 tiểu khu thuộc Khu Bảo tồn thiên nhiên rừng ngập mặn Cần Giờ Tiểu khu Rừng trồng (ha) Rừng tự nhiên (ha) Đất trống Đất khác Tổng diện tích (ha) 1 890,41 309,14 29,65 1.229,20 2 1.236,41 355,04 34,03 232,16 1.857,64 3 719,09 449,85 81,22 1.250,16 4 1.200,39 369,20 34,14 137,50 1.741,23 5 772,17 252,15 21,21 99,42 1.144,95 6 980,40 397,79 29,45 125,25 1.532,89 7 624,71 230,83 265,68 1.121,22 8 960,49 133,17 157,84 268,72 1.520,22 9 923,34 440,43 86,06 129,97 1.579,80 10 1.236,58 298,89 5,63 62,53 1.603,63 11 667,28 314,47 5,55 249,52 1.236,82 12 775,53 141,59 261,52 1.178,64 13 898,42 243,55 373,61 1.515,58 14 740,17 299,43 486,33 1.525,93 15 1.024,04 539,97 212,09 414,16 2.190,26 16 782,36 325,82 13,80 492,33 1.614,31 17 1.252,85 569,35 172,77 1.994,97 18 746,54 468,82 466,85 1.682,21 19 518,49 354,16 421,15 1.293,80 20 762,90 618,33 80,04 448,73 1.910,00 21 722,62 322,85 5,90 778,16 1.829,53 22 300,83 246,09 2,80 229,93 779,65 23 1.434,00 416,86 1.093,18 2.944,04 24 1.257,42 860,28 57,56 212,04 3.387,30 Tổng 21.427,44 8.958,06 746,10 7.532,38 38.663,98 (Nguồn: Ban quản lý Khu Bảo tồn thiên nhiên rừng ngập mặn Cần Giờ)