Luận văn Nghiên cứu sự phát triển của hệ sợi nấm Hương (Lentinula edodes) trong môi trường nuôi cấy lỏng

nấm song nhân có thể tạo ra các bào tử màng dày (bào tử áo – chlamydospore) giúp sợi nấm sống sót qua các trường hợp bất lợi này. Bào tử màng dày khi điều kiện thuận lợi sẽ nảy mầm tạo ra những sợi nấm mới. Khi sợi nấm thứ cấp đã phát triển dày đặc trên cơ chất sẽ bắt đầu quá trình phân hóa để tạo ra quả thể. Trước khi ra quả thể thì hệ sợi nấm Hương này phát triển sinh khối đến mức tối đa chuẩn bị cho quá trình ra quả thể. Nhưng điều đặc biệt là trong hệ sợi nấm Hương có đẩy đủ về về lượng cũng như về chất giống như quả thể, nó có thể phòng và chữa bệnh cho người. Được sử dụng như một món ăn hay một chế phẩm sinh học. Trong giai đoạn phát triển hệ sợi, nấm cần các nguồn dinh dưỡng môi trường đảm bảo các nguồn cung cấp về các bon, nitơ và khoáng [3]. 2.1.3. Giá trị dinh dưỡng của nấm Hương cũng như hệ sợi nấm Nấm Hương có giá trị dinh dưỡng cao, sử dụng nấm Hương làm rau như một thực phẩm cung cấp vitamin (như vitamin B1,B2, vitamin PP, vitamin D2…) chất khoáng (Fe, Mn, K, Ca, Mg, Cd, Cu, P và Zn) cho cơ thể. Đặc biệt trong hệ sợi nấm Hương cũng đầy đủ các vitamin và khoáng chất như ở quả thể, có thể bổ sung dinh dưỡng cho con người. Các chất tạo nên hương thơm: xetôn, sunfit, ankan, axit béo…Theo Mizuno yếu tố tạo nên hương thơm, vị ngon của nấm là monosodium glutamate, nucleotit, amino axit tự do, chuỗi peptit, axit hữu cơ (axit malic, axít fumalic, axít glutaric, axít oxalic, axít lactic,… ) và đường [2, 12]. Hơn nữa trong nấm Hương và hệ sợi nấm Hương có tới 40 loại enzyme, đáng chú ý nhất là các enzyme β (1-3) glucozidaza, kitinaza, esteraza, lipoidaza, ligninaza, almondaza, pepsin, loxintinaza, tannaza, pectinaza, saccaraza, transferaza, maltaza, xenlulaza, hemixenlulaza, amylotransferaza, inulaza, melibiaza, glycozidaza, ureaza, insulinaza, asparaginaza, peroxydaza, lactaza, carboxylpeptidaza, tyrozin oxydaza, zymaza, lichen amylaza, chymosin, metalloproteaza…[12]. 2.2. Tính chất dược học của nấm Hương và hệ sợi nấm Hương 2.2.1. Các hoạt chất tách chiết từ hệ sợi nấm Hương a) Chế phẩm LEM (Lentinula Edodes Mycelium): Chiết xuất từ hệ sợi nấm Hương lên men trên giá thể bã mía được coi là một thành công lớn của Nhật Bản và Trung Quốc. LEM rất giàu Lentinan - hoạt chất quan trọng nhất của nấm Hương, nó có thể được chiết xuất từ quả thể cũng như từ sinh khối sợi nấm, là chất chính tạo nên tác dụng dược lý của nấm Hương. LEM được tách chiết từ hệ sợi nấm Hương ở dạng bột. Hệ sợi của Lentinula edodes (LEM). Trong 1 kg bột chứa 6-7g LEM. b) LAP là chế phẩm được tách chiết từ hệ sợi nấm Hương. Dung dịch hệ sợi nấm Hương + 4 lần thể tích ethanol được gọi là LAP. LAP ≈0,3g LEM Hệ sợi nấm Lentinula edodes và LAP là glycoprotein bao gồm đường glucose, galactose, xylose, arabinose, manoza, fructozo. LEM và LAP cũng chứa các dẫn xuất của axít nucleic và vitamin B (như B1, B2) và ergosterol. Tạo nên giá trị dinh dưỡng và tính dược lý của hệ sợi nấm Hương. Năm 1990, EP3 đã thu được từ LEM. Là cơ chất hoạt hóa miễn dịch bao gồm nhiều nhóm cacboxyl. Chính vì vậy LEM và LAP kích thích hoạt hóa hệ thống miễn dịch chống lại bệnh tật. c) Hệ sợi nấm Hương ở dạng bột: Sinh khối sợi nấm Hương chế biến và bổ sung thành thực phẩm bổ dưỡng ở dạng bột. Dạng bột ăn liền này có thể sử dụng thuận tiện như bột canh hoặc pha với nước sôi trước khi sử dụng. Có thể tìm thấy sản phẩm kiểu này trong các siêu thị ở Nhật Bản [12]. 2.2.2. Tính chất dược học Hệ sợi nấm Hương chứa một loại polysaccarit tên là Lentinan - hoạt chất quạn trọng nhất của hệ sợi nấm Hương cũng như của quả thể nấm, mà nó đã tạo nên tính dược lý cho nấm Hương. Lentinan được chiết xuất từ sinh khối sợi nấm Hương và là thành phần chính của hệ sợi. Năm 1969 các nhà khoa học Nhật Bản đã chứng minh rằng lentinan là một loại polysaccarit – công thức nguyên là (C6H5O)n như các loại tinh bột khác, nhưng có trọng lượng phân tử là 5x1015. Ngoài ra còn có maunose peptit KS –Z với trọng lượng phân tử khoảng 6-9,5x104, glycoprotein (hiệu quả chống HIV còn mạnh hơn cả so với thuốc AZT), chất eritadenine (làm giảm colestêrin trong máu) [12]. Sử dụng nấm Hương cũng như hệ sợi nấm Hương để phòng và chữa bệnh: Hoạt tính chống ung thư: Lentinan trong nấm Hương đã được chấp nhận như một liệu pháp phụ trợ trong tiến trình dùng hóa trị liệu. Nó có khả năng kích thích tết bào của hệ miễn dịch làm tăng sức đề kháng. Nó cũng kích thích các tế bào “sát thủ tự nhiên” trong cơ thể để chúng tấn công những tế bào ung thư. Nó còn có tác dụng chống virus viêm gan B. Các thử nghiệm cũng cho thấy, chất lentinan đơn độc không có tác dụng gì đối với HIV, nhưng nếu kết hợp với AZT thì tác dụng diệt virus tăng lên 24 lần so với dùng AZT đơn độc. Lentinan còn có khả năng giúp những người bị lao phổi chống lại độc tố của vi khuẩn lao. Đặc biệt khi bệnh nhân trị liệu bằng lentinan thì tăng được thời gian sống sót cho bệnh nhân. Hoạt tính kháng sinh: Chihara [16] đã chứng minh khả năng của Lentinan trong kháng khuẩn, kháng virus, kháng nấm bệnh và ký sinh trùng. Đặc biệt, Lentinan làm giảm mạnh sự suy sụp khi trị liệu hóa chất cho chuột gây lao phổi thực nghiệp, chống lại sự xâm nhiễm của virus viêm não, virus Abelson, Schistosoma mansoni và Schistosoma japonicum, chống bội nhiễm khuẩn ở các bệnh nhân AIDS. Do Lentinan có khả năng làm tăng đề kháng của vật chủ khỏi sự tấn công của virus ung thư và virus lạ. Hoạt động ngoại trừ chlosterol: Nấm Hương có thể làm giảm chlosterol trong máu do có chứa chất Eritidenin. Chất Eritidenin (Lentysin, Lentinacin) được Mizuno xác định trong quả thể nấm Hương nuôi trồng [17, 18]. Chất này về sau lại được Lelik và CS xác định trong sinh khối sợi lên men công nghiệp và đã được chứng minh là có khả năng làm giảm mức cholesrol và các lipid trung tính trong máu [19]. Chính vì vậy nấm Hương có hiệu quả đối với tim mạch. Bởi hầu hết các bệnh nhân mắc bệnh về tim mạch do hàm lượng chlosterol trong máu cao. Hoạt tính chống virus, vi khuẩn và ký sinh: Lentinan và dẫn xuất của nó có tác dụng chống lại vi khuẩn, virus (kể cả virus AIDS) và nhiễm ký sinh trùng. Trong nghiên cứu in vitro cho thấy Lentinan khi được sử dụng cùng với hợp chất AZT (azido-Thymidine) có thể ngăn chặn virus làm giảm miễn dịch ở người (virus HIV) trên tế bào T hơn là chỉ sử dụng AZT đơn độc [20]. 2.3. Tình hình sản xuất và tiêu thụ nấm Hương 2.3.1. Tình hình ngoài nước Đầu thế kỷ 20 nấm Hương đã được nuôi trồng nhân tạo ở quy mô công nghiệp tại Nhật, Pháp, Mỹ. Nấm Hương hiện đang được trồng theo phương pháp đơn giản ở quy mô lớn tại nhiều tỉnh Trung Quốc (Phúc Kiến, Chiết Giang, Giang Tô, Giang Tây…). Năm 1994 tỉnh Phúc Kiến trồng được 190.000 tấn nấm Hương, có 15.000 tấn được xuất khẩu. Năm 1993 tỉnh Chiết Giang sản xuất được 185.000 tấn, có 8.500 tấn được xuất khẩu [3]. Gần đây Nhật Bản, Trung Quốc, Triều Tiên là những nước trồng nhiều nấm Hương nhất trên thế giới. Tổng sản lượng hàng năm đạt trên 1 triệu tấn. Sản phẩm nấm được sử dụng chủ yếu ở dạng tươi và sấy khô. Các nước này còn phát triển sản xuất sinh khối sợi nấm Hương và đang cung cấp cho thị trường trong và ngoài nước một số sản phẩm dạng bột và dạng lỏng rất có giá trị về dinh dưỡng và phòng trị bệnh. Chế phẩm LEM (Lentinula edodes Mycelium) chiết xuất từ hệ sợi nấm Hương lên men trên giá thể bã mía được coi là một thành công lớn của Nhật Bản và Trung Quốc. Khắp thế giới, nhất là Châu Á đều thích nấm Hương. Nó có giá thành cao chủ yếu do có giá trị cao về dinh dưỡng và “thực phẩm chức năng”, nhưng một mặt cũng do khó ươm trồng, thời gian phát triển dài, năng suất thấp. Một số nghiên cứu trong và ngoài nước đã sử dụng chất thải nông nghiệp và công nghiệp chế biến để cung cấp nguồn cacbon cho nuôi cấy rắn và lỏng [9]. Trong các siêu thị ở Nhật Bản có bán bột sợi nấm Hương thu được từ sinh khối sợi nấm. Sử dụng bột sợi nấm này như một loại bột canh sử dụng hàng ngày. Từ nhu cầu về dinh dưỡng và tác dụng phòng và chữa bệnh của nấm Hương cũng như hệ sợi nấm Hương thì các nước trên thế giới không ngừng nghiên cứu và gần đây việc nghiên cứu thu sinh khối sợi nấm đang được chú ý, vì điều kiện phát triển hệ sợi không yêu cầu khắt khe như nuôi lấy quả thể nấm. 2.3.2. Tình hình trong nước Nấm Hương rất quen thuộc đối với người Việt Nam từ lâu đời và có nhiều món ăn được chế biến với nấm Hương. Nhưng dù sao thì việc ươm trồng loại nấm này ở nước ta vẫn chưa được phát triển nên ở nước ta phần lớn sử dụng nấm ở dạng quả thể nấm khô được nhập từ Trung Quốc. Có thể tìm thấy nấm Hương dạng quả thể khô ở khắp các siêu thị ở nước ta, và có bán trên thị trường do nhu cầu sử dụng rộng rãi của người dân. Hiện nay có một số tỉnh trồng nấm Hương với quy mô nhỏ vì còn phù thuộc vào điều kiện thời tiết, nó chỉ hợp với với nhiệt độ vào mùa đông ở miền Bắc nước ta. Một số tỉnh triển khai trồng nầm như: Cao Bằng, Hà Giang, Lạng Sơn, Lào Cai (sapa)… 2.4. Các phương pháp nuôi trồng nấm Hương lấy quả thể 2.4.1. Trồng nấm Hương trên cây gỗ [1] Theo truyền thống thì ban đầu nấm Hương được trồng trên gỗ và về sau đã từng bước áp dụng thêm phương pháp nuôi trồng giá thể đóng túi sử dụng mùn của một số cây và các loại phụ phế thải nông nghiệp khác. Cần chọn các loại gỗ không có tinh dầu, cây còn tươi tốt, không sâu bệnh. Nhóm gỗ thích hợp nhất để nấm Hương sinh trưởng và phát triển cho năng suất cao, chất lượng tốt là gỗ sồi, dẻ, sau sau. Lựa chọn những đoạn gỗ thẳng, cắt thành khúc có đường kính từ 5-20cm, chiều dài 1,0-1,2m. Không làm sây xát lớp vỏ. Để gỗ trong nhà thoáng mát, sạch sẽ, sau 5-9 ngày là trồng được. Các đoạn gỗ đạt tiêu chuẩn đem rửa sạch, dùng nước vôi đặc quét hai đầu đoạn gỗ. Lấy búa chuyên dùng hoặc khoan tạo lỗ trên đoạn gỗ, đường kính lỗ 1,5cm, sâu 3-4cm, cứ cách 15-20cm tạo một lỗ; hàng nọ cách hàng kia 7-10cm; các lỗ so le nhau. Tra giống nấm gần đầy miệng lỗ, lượng giống dùng 3kg/1m3, dùng phoi gỗ đã tạo ra làm nắp đậy (chiều dày bằng chiều dày của vỏ cây), lấp kín lớp giống cấy. Phía ngoài dùng xi măng hòa thành bột giống như vữa trát tường quét trên miệng nắp để bịt kín miệng lỗ. Xếp gỗ theo kiểu "cũi lợn" thành đống, cách mặt đất 15-20cm cao 1,5m, chiều dài tùy theo khối lượng gỗ đem trồng. Phía trên cùng dùng bao tải gai dấp ướt để ráo nước phủ kín toàn bộ đống ủ. Hàng ngày chăm sóc đống ủ, chủ yếu là tưới nước. Lượng nước tưới chỉ đủ ướt lớp bao tải. Tuyệt đối không tưới nhiều, nước sẽ thấm sâu vào thân gỗ làm chết giống. Tốt nhất nên ươm trong nhà thoáng mát, tránh mưa nắng. Thời gian ươm kéo dài 6-16 tháng tùy thuộc theo từng chủng loại gỗ. Cứ 2 tháng lại tiến hành đảo đống gỗ một lần. Khi đảo cần kiểm tra độ ẩm của gỗ. Nếu thấy gỗ quá khô cần dùng bình để phun nước nhẹ xung quanh thân gỗ, sau đó mới ủ đống lại. Khi phát hiện các đoạn gỗ bị bệnh cần để cách ly khỏi đống ủ nhằm tránh lây lan sang các đoạn gỗ khác. Khi kết thúc giai đoạn ươm, nấm Hương bắt đầu hình thành quả thể. Quan sát trên bề mặt thân gỗ có những chấm màu hồng nhạt, chúng lớn dần như hạt ngô và hình thành nên cây nấm hoàn chỉnh. Dựng đứng thân gỗ, xếp theo kiểu giá súng, hàng nọ cách hàng kia 50-60cm. Có thể xếp gỗ trong nhà có mái che, thoáng mát, độ ẩm không khí cao, ánh sáng khuyếch tán. Hàng ngày tiến hành tưới nước nhẹ vài lần trực tiếp lên thân gỗ. Khi nấm đủ lớn thì bắt đầu hái. Hái nấm xong cắt bỏ phần gốc bám vào thân gỗ. Tiêu thụ ở dạng tươi hoặc sấy khô. Cứ khoảng 2 tháng một lần cần đảo đầu đoạn gỗ trên quay xuống dưới để độ ẩm trong thân gỗ đều hơn. Quá trình chăm sóc, thu hái nấm liên tục như vậy trong khoảng thời gian 2-3 năm. Năng suất trung bình khi kết thúc toàn bộ quá trình thu hái đạt 15-20 kg nấm khô/1m3 gỗ. 2.4.2. Trồng nấm Hương trên mùn cưa và giá thể khác [1] Xử lý nguyên liệu: Chọn các loại mùn cưa không có tinh dầu, không bị mốc và không có các độc tố (dầu mỡ, hóa chất...). Một số cơ chất thường sử dụng để nuôi trồng nấm Hương như: mùn cưa, rơm rạ, bã mía, vỏ hạt bông, vỏ lạc, khô dầu đậu đỗ, lạc vừng…. Làm ẩm đạt độ thủy phân 70%. Ủ đống có khối lượng từ 300 kg/đống trở lên. Thời gian ủ kéo dài 4-6 ngày, đảo một lần mỗi lần cách nhau 2-3 ngày. Mùn cưa đã ủ xong trộn thêm 3% bột nhẹ (CaCO3) hoặc 1,5% vôi bột đóng vào túi nilon chịu nhiệt. Kích thước túi rộng 25cm, cao 40cm. Khối lượng 1,5kg/túi. Nút cổ túi bằng ống nhựa và bông, đưa túi mùn cưa vào nồi thanh trùng. Cấy giống nấm: Túi mùn cưa đã được thanh trùng theo một trong hai cách trên, lấy ra để trong phòng sạch sẽ, đến khi nguội. Cấy giống nấm trong các tủ cấy vô trùng sang túi mùn cưa theo tỷ lệ 2,5-3% lượng giống so với nguyên liệu. Ươm túi mùn cưa đã cấy giống và chăm sóc: Chuyển các túi mùn cưa đã cấy giống vào nhà ươm có nhiệt độ 24-26o C. Nhà cần thoáng, mát, sạch sẽ, không có ánh sáng. Thời gian ươm bịch kéo dài khoảng 60-70 ngày. Sợi nấm phát triển, ăn dần vào nguyên liệu, tạo nên màu trắng đồng nhất. Chăm sóc và thu hái nấm: Khi kết thúc thời gian nuôi sợi (pha sợi) ta chuyển các túi mùn cưa đã có sợi nấm ăn kín đáy túi, mở túi bông và miệng túi rộng ra, đặt sang phòng khác. Yêu cầu nhà có ánh sáng, nhiệt độ đạt 16-18oC, độ ẩm không khí 80%. Dùng bình phun tưới nước dưới dạng sương mù ngày 2-3 lần. Khoảng 15 ngày sau, nấm bắt đầu lên và thu hoạch. Thời gian thu hoạch kéo dài 4-5 tháng sẽ kết thúc một đợt nuôi trồng. Trong suốt quá trình chăm sóc và thu hái nấm cần chú ý đảm bảo việc tưới nước đúng lúc theo nguyên tắc: nấm lên nhiều và kích thước lớn thì lượng nước tưới nhiều lần trong ngày, hết đợt nấm ra phải tạo nên sự thay đổi đột ngột về nhiệt độ "cú sốc" xuống 13-15o C kéo dài 8-12h để kích thích sự hình thành quả thể mạnh hơn. Năng suất nấm trung bình khi hết một chu kỳ thu hái mỗi túi cho thu hoạch 600-800g nấm tươi. Nấm thu hoạch xong có thể tiêu thụ ở dạng tươi hoặc phơi sấy khô ở nhiệt độ 40-45oC. Giữ nấm khô trong túi nilon, buộc chặt. Trong nhân dân có thói quen treo trên gác bếp sẽ bảo quản nấm được lâu hơn. 2.5. Nuôi cấy hệ sợi nấm Hương trong môi trường lỏng 2.5.1. Quá trình lên men chìm đối với vi sinh vật 2.5.1.1. Khái niệm Là quá trình nhân nuôi vi sinh vật trong môi trường lỏng có sục khí để bổ sung oxy hoặc nuôi tĩnh. Giống vi sinh vật sau khi được cấy vào môi trường lên men thì bắt đầu phát triển ở giai đoạn tiềm phát (pha lag) rồi chuyển sang phát triển trong pha lũy thừa (pha log). Ở giai đoạn này thành phần môi trường dinh dưỡng giảm nhanh, nhu cầu oxy tăng, nhiệt lượng tạo ra cao đồng thời bề mặt môi trường tạo thành bọt và lớp bọt tăng dần đến khi nhiều có thể trào ra khỏi bình lên men, làm mất bớt dịch và tăng khả năng nhiễm vi sinh vật lạ không mong muốn. Ưu điểm của phương pháp: - Hiệu suất sử dụng không gian cao (ba chiều), lượng hoạt chất được sinh tổng hợp trên thể tích sử dụng cao, hiệu suất lên men cao. - Vì quá trình lên men diễn ra trong lòng chất lỏng nên tránh được nhiễm khuẩn. - Sử dụng môi trường dinh dưỡng tối ưu đáp ứng được nhu cầu sinh lý của vi sinh vật. - Các thiết bị cơ giới hóa và tự động hóa, tiết kiệm mặt bằng và tốn ít nhân công. Tuy nhiên kỹ thuật lên men chìm đòi hỏi nhiều trang thiết bị kỹ thuật, các thiết bị chịu áp lực và đòi hỏi đảm bảo vô trùng tuyệt đối. 2.5.1.2. Các phương pháp lên men chìm a. Lên men gián đoạn: Quá trình này còn gọi là lên men theo mẻ có hoạt động như là một hệ thống đóng kín. Sự phát triển vi sinh vật được phân chia thành 4 pha đặc thù: Pha lag (pha tiềm tàng), pha log (pha lũy thừa), pha dừng, và pha suy tàn. Pha lag: Khi cấy các tế bào vi sinh vật từ môi trường này sang môi trường khác, khoảng thời gian đầu số tế bào không thay đổi. Trong giai đoạn này vi sinh vật làm quen với môi trường, thích nghi dần với điều kiện môi trường mới. Pha log: Cuối pha lag các tế bào đã thích nghi với điều kiện sống mới và bắt đầu phát triển mạnh mẽ, quần thể vi sinh vật chuyển sang pha log, pha phát triển năng động nhất. Pha dừng hay pha ổn định: Sau khi đồng hóa các chất dinh dưỡng hay sau khi tích lũy các sản phẩm trao đổi chất, sinh trưởng của vi sinh vật giảm xuống hay hoàn toàn ngừng lại. Trong pha ổn định này sinh khối có thể còn tăng chậm hoặc không đổi. Pha suy tàn: Đặc trưng của pha này là các chất dinh dưỡng bị cạn kiệt. Năng lượng của tế bào giảm đến tối thiểu và tế bào chết dần. Minh hoạ các pha phát triển nêu trên hình 2.2. b. Lên men bổ sung Kỹ thuật lên men bổ sung ứng dụng thích hợp cho các trường hợp sau: Nồng độ cơ chất khá thấp nhưng lại cần ổn định (lên men nấm men) Nồng độ cơ chất cần khá cao và không đổi Phải bổ sung tiền chất liên tục. logxx III IV II I t |h| Hình 2.2. Đường cong sinh trưởng của vi khuẩn (I- Pha lag, II- Pha log, III- Pha ổn định, IV- Pha suy tàn) 2.5.2. Ảnh hưởng của chủng giống Theo một số kết quả nghiên cứu thấy rằng cùng một loài nấm Hương, nhưng các chủng giống nấm khác nhau tốc độ phát triển của chúng cũng khác nhau. Mata và CS [6] khi nuôi cấy 11 chủng giống nấm Hương trên đĩa Petri với môi trường MEA đã thu nhận được đường kính sợi nấm dao động từ 4,9 đến 7,1cm. Chủng Q616 có đường kính phát triển thấp nhất là 4,9cm, chủng M115 và V084 có đường kính phát triển lớn nhất sau 7 ngày nuôi cấy. Các chủng còn lại có đường kính từ 5,9cm đến 6,8cm. Theo nghiên cứu của De Carvalho [7] thì đường kính phát triển của 2 chủng Lentinula edodes em BDA và Lentinula edodes em SDA trên môi trường thạch là khác nhau. Sau 10 ngày, kết quả đo đường kính phát triển của chúng tương ứng là 9,2cm và 4,5cm. 2.5.3. Môi trường nuôi cấy lỏng cho nấm Hương 2.5.3.1. Nhu cầu dinh dưỡng của nấm Hương Về nguồn cacbon, nấm Hương có thể đồng hóa rộng rãi nhiều nguồn cacbon khác nhau như đường đơn, đường kép, đa đường (như tinh bột, chất xơ, chất gỗ). Về nguồn nitơ, nấm Hương có thể sử dụng nitơ hữu cơ như protein, peptit, axit amin hay urê. Tỷ lệ C:N trong môi trường ở giai đoạn nuôi sợi nên dùng tỷ lệ 25-40:1. Nhưng tỷ lệ C:N tối ưu cho sự phát triển của hệ sợi nấm là 30:1. Theo nghiên cứu của nhóm tác giả Rossi và CS khi sử dụng môi trường rỉ đường thì tỷ lệ C:N là 107:1, còn khi bổ sung thêm 40% cám gạo thì tỷ lệ C:N là 38:1. Theo nghiên cứu này bổ sung cám gạo vào môi trường đến một lượng nhất định thu được kết quả tỷ lệ C:N phù hợp nhất là 30:1 cho sự phát triển của hệ sợi nấm Hương [14]. Về nhu cầu nguyên tố khoáng, ngoài Mg, S, P, K nấm hương còn cần một số nguyên tố khoáng vi lượng như Fe, Zn, Mn…Mỗi lít dung dịch nuôi cấy nên bổ sung thêm khoảng 2mg đối với từng loại Fe, Zn, Mn. Khi có Fe, Mn, Zn tồn tại trong môi trường với nồng độ thích hợp thì việc bổ sung thêm một chút Cu và Mo có thể làm xúc tiến sự sinh trưởng của hệ sợi nấm. Khi nuôi trồng nấm Hương cần lưu ý bổ sung vitamin B1. Các vitamin khác nấm Hương đều có thể tự tổng hợp. Trong 1 lít môi trường nuôi cấy cần bổ sung 100μl vitamin B1. Một số chất điều hòa sinh trưởng thực vật như gibberellin (GA3), axit indolaxetic (IAA), kinetin (KT)…cũng có tác dụng xúc tiến sự phát triển của hệ sợi nấm Hương [1]. Các môi trường nuôi cấy để nuôi hệ sợi cũng phải có đầy đủ nguồn cácbon, nitơ, chất khoáng… đáp ứng cho nhu cầu phát triển của hệ sợi nấm Hương. 2.5.3.2. Môi trường giữ giống Có hai loại môi trường thường được sử dụng cho mục đích giữ giống nấm Hương, đó là môi trường PDA và môi trường MEA. Môi trường PDA: Áp dụng để giữ giống trong ống thạch nghiêng và đĩa Petri. Thành phần trong 1 lít môi trường gồm: 200g khoai tây, 20g glucoza (có thể thay bằng đường kính hoặc maltoza), 20g thạch và nước. Trong 200g khoai tây có 38g hydratcacbon, 0,2 chất béo, 6g protein và 158g nước. Bên cạnh đó, khoai tây còn chứa các chất dinh dưỡng như vitamin, chất khoáng. Môi trường MEA: Thành phần gồm chiết malt 15g và thạch 20g trong 1 lít môi trường. 2.5.3.3. Môi trường nuôi cấy lỏng đối với nấm Hương 1. Môi trường YEM: 2g chất chiết nấm men, 10g chất chiết malt, 1 gam CaSO4 . Tính cho 1 lít. 2. Môi trường PD (đường và khoai tây): 200g khoai tây, 10 g glucose (hoặc dextrose). Tính cho 1 lít. 3. Môi trường YMPG: 3 g chất chiết men, 3g chất chiết malt, 5g peptone, 10g glucose. Tính cho 1 lít. 4. Môi trường ME: 15 g chất chiết malt, 5g pepton. Tính cho 1 lít. 5. Môi trường YME: 2% chất chiết malt, 0.2% chất chiết nấm men. Tính cho 1 lít. 6. Môi trường PDR: 200 g khoai tây, 10 g glucose; 0,25 g cám gạo. Tính cho 1 lít. 7. Môi trường PDY: 20g chất chiết nấm men, 10g glucose; 250g khoai tây. Tính cho 1lit. 8. Môi trường MP: 20g chất chiết malt, 250g khoai tây, 20g glucose. Tính cho 1 lít 9. Môi trường SMPY: 10g Sucrose; 10g chất chiết malt; 5g pepton; 5g chất chiết nấm men. Tính cho 1 lít. 10. Môi trường CYM 2g pepton; 2g chất chiết nấm men; 20g glucose; 0,5g K2HPO4; 0,5g MgSO4; 0,46g KH2PO4. Tính cho 1 lít [5,6,10,11]. 2.5.4. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy lỏng đối với nấm Hương 2.5.4.1. Nồng độ ôxy Nấm Hương thuộc nhóm nấm hoại sinh và hiếu khí, vì vậy trong quá trình nuôi hệ sợi nấm Hương nên bổ sung ôxy bằng thiết bị lắc, khuấy hay sục khí. Bào tử nấm sau khi được cấy vào môi trường lên men thì bắt đầu phát triển ở giai đoạn tiềm phát (pha lag) khoảng 24 giờ, rồi chuyển sang phát triển trong pha lũy thừa (còn gọi là pha log). Cuối pha lag các bào tử nấm đã thích nghi với điều kiện sống mới và bắt đầu phát triển mạnh mẽ. Ở giai đoạn này thành phần môi trường dinh dưỡng giảm nhanh, nhu cầu ôxy tăng, nhiệt lượng tạo ra cao đồng thời bề mặt môi trường tạo thành bọt và lớp bọt tăng. Nên phải cấp khí ôxy bằng cách lắc ở quy mô phòng thí nghiệm và dùng thiết bị sục khí như khuấy, sục khí ở quy mô sản xuất để tăng hiệu suất lên men cao tạo sinh khối sợi nấm Hương. Theo nghiên cứu của Hassegawa trong môi trường nuôi cấy lỏng với sự cung cấp ôxy thông qua chế độ nuôi có lắc và không lắc (nuôi tĩnh) sử dụng môi trường YEM ở nhiệt độ 25oC. Khi nuôi cấy tĩnh chỉ thu được hàm lượng sinh khối sợi khô của nấm Hương tối đa là 4 mg/ml. Trong khi nuôi cấy có lắc với tốc độ 150 vòng/phút thì hàm lượng sinh khối sợi khô của nấm Hương tăng lên 5 mg/ml [5]. 2.5.4.2. Nhiệt độ môi trường Bào tử nấm Hương nảy mầm tốt nhất ở nhiệt độ 22-26oC. Trong điều kiện khô hạn ở 70oC bào tử đảm của nấm sẽ bị chết sau 5 giờ. Nếu ở 80oC thì sẽ chết chỉ sau 10 phút. Nhiệt độ có ảnh hưởng lớn đến sự phát triển của hệ sợi nấm Hương. Sợi nấm phát triển ở dải nhiệt độ từ 5 đến 35oC nhưng phát triển tốt nhất ở 20 đến 25oC. Đây là nhiệt độ phù hợp với điều kiện khí hậu ở nhiều vùng của nước ta. Còn dưới nhiệt độ 10oC và trên nhiệt độ 32oC sự sinh trưởng của hệ sợi nấm bị hạn chế. Đến nhiệt độ 35oC sợi nấm bắt đầu ngừng phát triển [3]. Theo nghiên cứu của Hassegawa thì ở nhiệt độ 20oC thu được lượng sinh khối sợi nấm là lớn nhất, hay 20oC là nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của hệ sợi nấm Hương. Tác giả này đã nghiên cứu với nhiều môi trường khác đều cho kết quả ở nhiệt độ này là tối ưu [5]. Trong nhiều nghiên cứu khác, người ta thường dùng khoảng nhiệt độ 20 đến 25o cho sự phát triển của hệ sợi. Nghiên cứu tại Trường đại học Utah [13] cho biết điều kiện nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển của hệ sợi nấm trong môi trường rắn và lỏng đều là 25oC. Theo nghiên cứu của nhóm tác giả Ishikawa và CS [8] thì nhiệt độ phù hợp cho sự phát triển của hệ sợi nấm Hương cũng là 25oC. Nhiều nghiên cứu cho thấy ở nhiệt độ 25oC cho sinh khối sợi cao và nhiệt độ này là khoảng nhiệt độ phòng thí nghiệm và thường phù hợp với điều kiện tự nhiên của nhiều vùng nên không đòi hòi khắt khe về thiết bị nuôi, giảm chi phí cho quá trình lên men. 2.5.4.3. Độ pH môi trường Độ pH thích hợp cho sự sinh trưởng của hệ sợi của nấm Hương trên môi trường nuôi cấy rắn là pH 5,0-6,0. Sau khi nuôi cấy được vài ngày, pH môi trường sẽ giảm đi rất nhanh do nấm Hương sản sinh ra một số axit hữu cơ như axit axetic, axit sucxinic, axit oxalic. Trong giai đoạn nuôi sợi, pH không ảnh hưởng nhiều đến sinh khối sợi. Thường sử dụng pH tự nhiên của môi trường dinh dưỡng. Trong nuôi cấy lỏng, theo nghiên cứu của Hassegawa và CS thì pH tối ưu cho sợi nấm phát triển trên môi trường dung dịch là 4,5. Tuy nhiên, ở pH 4,5 này thì vi khuẩn cũng phát triển mạnh, nên pH từ 3 – 3,5 là tốt nhất vì ở pH này hệ sợi phát triển tốt và kháng khuẩn [5]. 2.5.4.3. Cường độ ánh sáng Ánh sáng không ảnh hưởng nhiều đến quá trình phát triển hệ sợi, vì trong giai đoạn phát triển hệ sợi không cần quan tâm đến cung cấp ánh sáng. Khi nuôi trên môi trường thạch đĩa, thường nuôi ở trong tủ ấm, không có ánh sáng, hệ sợi nấm Hương vẫn phát triển tốt. Tuy nhiên, đối với nuôi cấy môi trường lỏng (trong thiết bị lên men) thì thường sử dụng nuôi ở ánh sáng phòng hay trong tối [9]. PHẦN 3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Nội dung và phương pháp bố trí thí nghiệm 3.1.1. Sự phát triển của các chủng nấm Hương khác nhau trên môi trường thạch PDA Để đánh giá và so sánh sự phát triển của các chủng nấm Hương, chúng tôi tiến hành nuôi các chủng nấm này trên môi trường nuôi cấy rắn (môi trường thạch PDA). Đối tượng nghiên cứu là 3 chủng nấm Hương: Lentinula edodes Thái, Lentinula edodes Sapa, Lentinula edodes L170. Sử dụng môi trường nuôi cấy rắn PDA (200 khoai tây, 20g glucose, 20g agar/1 lít môi trường), pH tự nhiên của môi trường. Nhiệt độ môi trường nuôi cấy là 25oC trong tủ ấm. Xác định đường kính phát triển của các chủng giống sau 6, 9 và 12 ngày nuôi cấy. Từ đánh giá tốc độ phát triển của các chủng nấm Hương trên môi trường thạch đĩa để kết luận chủng giống nào phát triển tốt nhất trên môi trường rắn làm cơ sở cho sự nghiên cứu phát triển của các chủng giống này trong môi trường nuôi cấy lỏng tiếp theo. 3.1.2. Sự phát triển của các chủng nấm Hương khác nhau trong môi trường lỏng Đối tượng nghiên cứu là 3 chủng nấm Hương trên (đã nghiên cứu ở phần 3.1.1). Môi trường nuôi cấy là PDR lỏng. Trước tiên tăng sinh giống trong môi trường PD lỏng (200g khoai tây, 20g glucose/ 1 lít môi trường) sau 10 ngày phát triển, số lượng giống đã tăng lên đáng kể thì cấy chuyển sang môi trường lỏng PDR. Nuôi cấy ở cùng điều kiện của môi trường phòng thí nghiệm (20-30oC), pH 4,5, tốc độ lắc 150 vòng/ phút (lắc 8 giờ/ ngày chia làm 2 lần). Lấy mẫu để xác định khối lượng sinh khối khô vào các ngày 10, 15, 20, 25 và 30. Kết quả cần xác định là sự biến đổi sinh khối của các chủng giống để xem chủng nào có khả năng phát triển tốt nhất trong môi trường lỏng và thời gian nuôi cấy bao lâu để đạt được giá trị sinh khối lớn nhất. 3.1.3. Ảnh hưởng của thành phần môi trường tới sự phát triển sinh khối của nấm Hương trong môi trường lỏng Từ mục 3.1.1 và 3.1.2. có được chủng giống nấm Hương có khả năng mọc tốt nhất trong môi trường rắn và lỏng. Chon một chủng giống tốt nhất để sử dụng cho thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của thành phần môi trường nuôi cấy lỏng. Sử dụng 5 môi trường nuôi cấy lỏng khác nhau: 1- Môi trường PD (200g khoai tây, 20g glucose), PDR (200g khoai tây, 20g glucose, 25g cám gạo), YME (2g chất chiết nấm men, 10g chất malt, 1g CaSO4 ), ME (chiết malt 40ml), YMPG (3g chất chiết nấm men, 3g chất chiết malt, 5g peptone, 10g glucose). Hàm lượng trong các môi trường tính cho 1 lít. Điều kiện nuôi cấy có cùng nhiệt độ, pH 4,5, tốc độ lắc 150vòng/phút (8 giờ/ngày chia làm 2 lần). Tại thời điểm sinh khối lớn nhất (xác định được từ mục 3.1.2.) sẽ dừng thí nghiệm để xác định khối lượng sinh khối khô của tất cả các mẫu. 3.1.4. Ảnh hưởng của pH tới sự phát triển sinh khối của nấm Hương trong môi trường lỏng Sử dụng kết quả thu được của mục 3.1.1 và 3.1.2 sẽ biết được chủng giống thích hợp và thời gian phát triển tối ưu. Sử dụng kết quả của mục 3.1.3 sẽ biết được loại môi trường thích hợp cho sự phát triển. Sử dụng các kết quả đó cho phần này để xác định khoảng pH tối ưu. Các điều kiện nuôi cấy được duy trì như các phần trên, chỉ có sự khác biệt về pH trong khoảng 3,0-6,0. Dự chọn 7 giá trị pH là: 3,0; 3,5; 4,0; 4,5; 5,0; 5,5; 6,0. 3.2. Nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu 3.2.1. Đối tượng nghiên cứu Các chủng giống nấm Hương: 1- Chủng lentinula edodes Thái do Viện Di truyền nông nghiệp cung cấp. Chủng giống này có nguồn gốc xuất xứ từ Thái Lan. 2- Chủng lentinula edodes Sa Pa của Viện Bảo tàng Vi sinh vật cung cấp. Chủng giống này được phân lập tại Sa Pa. 3- Chủng lentinula edodes L170 do Viện Nghiên cứu hạt nhân Đà Lạt cung cấp. Theo PGS-TS Lê Xuân Thám là người tặng chủng giống thì chủng này có nguồn gốc xuất xứ từ Nhật Bản. 3.2.2. Thiết bị và dụng cụ tiến hành Nồi hấp khử trùng, tủ cấy vô trùng, tủ ấm, tủ sấy, tủ lạnh, máy lắc, cân kỹ thuật (độ chính xác đến 10-4), bếp điện, máy đo độ đường. Dụng cụ thủy tinh các loại: bình tam giác 250ml, ống nghiệm, ống đong, phễu, cốc, que cấy, que trang, đũa thủy tinh, đĩa petri. Micropipet loại 1ml và 0,2ml, giấy đo pH và thang đo pH. Các dụng cụ khác: bình định mức 1 lít, đầu côn, bông, giấy báo, nồi nấu, dao, vải màn lọc, que đục lỗ thạch. 3.2.3. Môi trường nuôi cấy 3.2.3.1. Môi trường nuôi cấy rắn Môi trường thạch PDA (200g khoai tây, 20g glucose, 20g agar). Tính cho 1 lít. 3.2.3.2. Môi trường nuôi cấy lỏng 1- Môi trường PD: 200g khoai tây, 20g glucose. 2- Môi trường PDR: 200g khoai tây, 20g glucose, 25g cám gạo. 3 - Môi trường YME: 2g chất chiết nấm men, 10g chất chiết malt, 1g CaSO4. 4 - Môi trường ME: 40ml dịch chiết malt. 5 - Môi trường YMPG: 3g chất chiết men, 3g chiết malt, 5g peptone, 10g glucose. Các thành phần của các môi trường nêu trên đều tính cho 1 lít môi trường sau khi hoàn thành. 3.2.4. Phương pháp chuẩn bị môi trường thạch đĩa PDA Khoai tây (đã gọt vỏ, cắt nhỏ) – 200g, glucoza – 20g, 20g thạch và nước cho đủ 1 lít. Đun sôi đến chín kỹ khoai tây rồi lọc qua vải màn. Sau đó mới thêm thạch bổ sung cho đủ 1 lít rồi đun cho tan thạch. Phân vào các bình tam giác, đậy nút bông rồi hấp khử trùng ở điều kiện áp suất 1at trong 20 phút. Môi trường này không cần điều chỉnh pH. Sau khi khử trùng môi trường để nguội xuống khoảng 50oC tiến hành đổ vào đĩa Petri vô trùng khoảng 20ml rồi dùng tay xoay tròn cho môi trường dàn đều trong đĩa. Sau đó đậy nắp để thạch đông thì lật ngược lại cho vào tủ ấp. Sau một ngày kiểm tra đĩa thạch nào bị nhiễm mốc xanh hay đen thì loại bỏ. Các đĩa sử dụng phải vô trùng mới mang đi cấy giống nấm. 3.2.5. Phương pháp chuẩn bị các môi trường nuôi cấy lỏng 3.2.5.1. Chuẩn bị dịch chiết men và dịch chiết malt - Chuẩn bị dịch chiết malt Lấy 300g malt và 1lít nước (điều chỉnh pH 8 bằng axit lactic). Khuấy đều cho malt tan và nâng nhiệt độ lên 52oC trong thời gian là 30 phút, sau đó nâng tiếp nhiệt độ lên 60oC trong 30 phút, tiếp tục nâng nhiệt độ lên 62oC trong thời gian 15 phút, sau đó nâng nhiệt độ lên 70oC trong thời gian 30 phút, cuối cùng nâng nhiệt độ đến 75oC trong thời gian 15 phút rồi lọc qua vải màn, tiếp tục lọc qua vải lọc malt. Sau khi lọc sạch bằng vải lọc dùng máy đo độ đường điều chỉnh bằng nước cất sao cho độ đường Brix = 10. Sau đó phân vào các bình nón, đậy nút bông và bọc giấy báo mang đi hấp khử trùng trong nồi hấp khử trùng ở 120oC trong thời gian 25 phút, và để nguội, cho vào tủ lạnh để bảo quản đến khi sử dụng. - Chuẩn bị dịch chiết nấm men Lấy 1 kg men bia (bã) hòa với 3 lít nước thủy phân ở nhiệt độ 52oC trong 42 giờ. Sau đó ly tâm (lọc) lấy phần nước ở trên, phân vào các bình tam giác, và đậy nút bông, bọc giấy báo mang khử trùng ở điều kiện nhiệt độ 120oC, 1at trong thời gian 25phút. Để nguội 1 ngày mới bảo quản trong tủ lạnh cho đến khi sử dụng. 3.2.5.2. Chuẩn bị 5 môi trường nuôi cấy lỏng 1- Môi trường PD (môi trường dịch chiết đường khoai tây: 200g khoai tây, 20g glucose. Tính cho 1 lít): Khoai tây gọt vỏ cắt nhỏ được 200g bổ sung 1 lít nước đem nấu chín kỹ rồi mang lọc qua vải màn. Lúc này lượng nước đã giảm, phải định lượng thêm nước đến 1 lít môi trường rồi bổ sung 20g đường glucose. Đun nóng cho tan đường rồi điều chỉnh pH theo yêu cầu. Phân vào các bình tam giác dung tích 250ml, mỗi bình 100 ml rồi tiệt trùng ở 160oC trong 2 giờ. 2- Môi trường PDR (môi trường dịch chiết khoai tây đường bổ sung cám gạo: 200g khoai tây, 20g glucose, 25g cám gạo. Tính cho 1 lít): Khoai tây gọt vỏ cắt nhỏ được 200g bổ sung 1 lít nước đem đun chín kỹ rồi bổ sung 25g cám gạo vào và khuấy đều. Đem lọc qua vải màn rồi lọc tiếp bằng vải lọc malt. Sau đó định lượng đến một lít, bổ sung 20g đường glucose. Đun nóng cho tan đường rồi điều chỉnh pH theo yêu cầu. Phân vào các bình tam giác dung tích 250ml, mỗi bình 100 ml rồi tiệt trùng ở 160oC trong 2 giờ. 3- Môi trường YME (2g chất chiết nấm men, 10g chất chiết malt, 1g CaSO4. Tính cho 1 lít): Sử dụng dịch chiết nấm men và dịch chiết malt đã được chuẩn bị như đã nêu ở mục 3.2.5.1 và được bảo quản trong tủ lạnh. Tiến hành lấy 2ml dịch chiết nấm men, 10ml dịch chiết malt, 1g CaSO4 cho vào bình đựng môi trường, định lượng thêm nước đến 1 lít sau đó khuấy và đun ở nhiệt độ thấp (khoảng 50oC) cho hòa tan dung dịch. Điều chỉnh pH theo yêu cầu. Phân vào các bình tam giác dung tích 250ml, mỗi bình 100 ml rồi tiệt trùng ở 160oC trong 2 giờ. 4- Môi trường ME (dịch chiết malt 40ml): Lấy 40ml dịch chiết malt vào nồi đựng môi trường. Các bước tiếp theo tương tự như thực hiện chuẩn bị các môi trường khác đã nêu. 5- Môi trường YMPG (3g chất chiết nấm men, 3g chất chiết malt, 5g peptone, 10g glucose, tính cho 1 lít): Lấy dịch chiết malt và dịch chiết nấm men vào bình định mức 100ml. Các thao tác thực hiện trong tủ cấy vô trùng như ở trên. Sau đó cho thành phần của dịch chiết malt và dịch chiết nấm men vừa đong vào bình môi trường. Định lượng thể tích đến 1 lít môi trường và bổ sung 5g pepton, 10g glucose, khuấy đều cho dung dịch môi trường được hòa tan. Điều chỉnh pH rồi phân vào các bình tam giác dung tích 250ml, mỗi bình 100 ml rồi tiệt trùng ở 160oC trong 2 giờ. 3.2.6. Phương pháp nuôi cấy 3.2.6.1. Phương pháp đặt thạch Thực hiện trong tủ cấy vô trùng. Dùng que cấy móc, khử trùng bằng dung dịch cồn 70oC và hơ trên ngọn lửa đèn cồn. Khi móc nguội dùng lấy sợi nấm trong ống nghiệm giống gốc rồi chấm vào 3 điểm trên đĩa thạch. Sau đó lật ngược lại nuôi trong tủ ấm với nhiệt độ 25oC. Sau 10 ngày khi sợi nấm phát triển rộng thì tiến hành đục lỗ thạch (nơi có sợi nấm phát triển) bằng cái đục tròn rỗng có đường kính 5mm. Dùng kẹp đã khử trùng gắp mảng thạch đường kính 5mm đó đặt vào tâm đĩa thạch khác và tiếp tục nuôi ở nhiệt độ 25oC trong tủ ấm. Theo dõi sự phát triển thông qua đo đường kính khuẩn lạc. 3.2.6.2. Phương pháp nhân nuôi chủng nấm Hương trong môi trường lỏng Tăng sinh giống trong môi trường PD: Mỗi chủng giống cần chuẩn bị 3 bình tam giác 250ml đựng môi trường PD đã tiệt trùng. Trong tủ cấy vô trùng, gắp cho vào mỗi bình một mảnh thạch 5 mm như đã chuẩn bị nêu ở mục 3.2.6.1. Dùng que thủy tinh đã khử trùng đánh tan miếng thạch. Đậy nút bông và ủ trên máy lắc ở 25oC, tốc độ lắc 150 vòng/ phút trong 10 ngày. Cấy chuyển sang môi trường lỏng: Chọn một bình giống đã tăng sinh sau 10 ngày có tốc độ mọc tốt nhất. Sử dụng máy đánh đồng thể với đầu dao đã tiệt trùng đánh tan sinh khối trong bình tạo thành một thể keo đồng nhất. Dùng pipet 1ml vô trùng hút 1 dịch giống đã tăng sinh chuyển sang bình môi trường mới. Bắt đầu nuôi cấy trong điều kiện nhiệt độ 25oC, tốc độ lắc 150 vòng/phút (8h/ngày). 3.2.7. Phương pháp xác định khối lượng sinh khối khô Sử dụng loại giấy lọc có đường kính 9mm, sấy giấy lọc ở nhiệt độ 105oC trong thời gian 4 tiếng. Sau đó để nguội trong bình hút ầm có silicagel. Cân các giấy lọc để biết khối lượng của chúng. Dùng các giấy lọc đó để lọc sinh khối từ các bình tam giác sau khi nuôi cấy. Dùng phễu để đỡ tờ giấy lọc. Sau khi chảy hết môi trường qua giấy lọc sẽ đem sấy sinh khối cùng giấy lọc. Sấy ở nhiệt độ 60oC trong 18 giờ rồi đem để nguội trong bình hút ẩm trước khi cân. Tính toán khối lượng sinh khối khô thông qua chênh lệch khối lượng. Lượng sinh khối được tính theo mg trên 1 ml môi trường. Giá trị trung bình được tính từ 3 mẫu song song. 3.2.8. Phương pháp xử lý thống kê Số liệu nghiên cứu được xử lý thống kê bằng Microsoft Excel để tính giá trị trung bình. Ngoài ra cũng sử dụng ANOVA để tính toán so sánh các giá trị trung bình. PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Đánh giá sự phát triển của các chủng giống nấm Hương trên môi trường thạch PDA Đường kính phát triển hệ sợi của các chủng nấm Hương trên môi trường PDA được xác định sau 6, 9 và 12 ngày của quá trình nuôi cấy. Kết quả được trình bày trong bảng 1. Sau 6 ngày, đường kính phát triển của hệ sợi nấm của 3 chủng nấm Hương Lentinula edodes Thái, Lentinula edodes Sa Pa và Lentinula edodes L170 lần lượt là: 3,98cm; 3,83 và 1,30cm. Như vậy, sau 6 ngày nuôi cấy, tốc độ phát triển của chủng giống Thái cao nhất và chủng giống L170 là thấp nhất. Kết quả đo đường kính phát triển của 3 chủng giống nấm Hương Thái, Sa Pa và L170 trên môi trường PDA sau 9 ngày lần lượt là: 7,37cm; 6,98cm và 1,87cm. Như vậy, sau 9 ngày nuôi cấy, tốc độ phát triển của chủng giống Thái cao nhất và chủng giống L170 là thấp nhất. Kết quả đo đường kính phát triển của 3 chủng giống nấm Hương Thái, Sa Pa và L170 trên môi trường PDA sau 12 ngày lần lượt là: 8,99cm; 8,50cm và 2,50cm. Như vậy, trong quá trình phát triển trên môi trường PDA, sự khác biệt về tốc độ phát triển của các chủng giống nấm Hương vẫn được duy trì. Trong đó, chủng giống Thái phát triển tốt nhất còn chủng giống L170 thấp nhất. Trong cùng điều kiện về môi trường nuôi cấy PDA, nhiệt độ 25oC trong tủ ấm thì tốc độ phát triển của ba chủng nấm Hương trong nghiên cứu này là khác nhau. Sự khác biệt này là do bản chất về chủng giống. Kết quả thu được trong nghiên cứu này cũng phù hợp với một số kết quả nghiên cứu của các tác giả nước ngoài trước đây. Mata và CS [6] khi nuôi cấy 11 chủng giống nấm Hương trên đĩa Petri với môi trường MEA đã thu nhận được đường kính sợi nấm sau 7 ngày dao động từ 4,9 đến 7,1cm. Theo kết quả nghiên cứu của De Carvalho [7] thì đường kính phát triển của hai chủng Lentinula edodes em BDA và Lentinula edodes em SDA trên môi trường thạch sau 10 ngày tương ứng là 9,2cm và 4,5cm. Bảng 4.1. Đường kính (cm) hệ sợi nấm Hương của các chủng giống nấm Hương trên môi trường PDA Ngày xác định Ngày xác định 6 9 12 Chủng nấm Hương Thái 3,98 ± 0,13 7,37 ± 0,17 8,98 ± 0,23 Chủng nấm Hương Sa Pa 3,83 ± 0,14 6,98 ± 0,14 8,50 ± 0,18 Chủng nấm Hương L170 1,30 ± 0,17 1,87 ± 0,15 2,50 ± 0,19 Hình 4.1. Sự phát triển của 3 chủng giống nấm Hương sau 6 ngày phát triển trên môi trường thạch PDA (Chủng Thái bên trái, chủng Sapa giữa và chủng L170 bên phải) Kết luận: Chủng giống nấm Hương Lentinula edodes Thái tốc độ phát triển lớn nhất nên là chủng giống nấm Hương phát triển tốt nhất trên môi trường thạch PDA. Hình 4.2. Sự phát triển của 3 chủng giống nấm Hương sau 9 ngày phát triển trên môi trường thạch PDA (Chủng Thái bên trái, chủng Sapa giữa và chủng L170 bên phải) 4.2. Đánh giá sự phát triển của các chủng giống nấm Hương trong môi trường lỏng Để có kết luận liệu có nên chọn chủng giống Lentinula edodes Thái sử dụng trong các nghiên cứu tiếp theo, chúng tôi cần nghiên cứu sự phát triển của cả 3 chủng giống trong môi trường nuôi cấy lỏng. Kết quả xác định sinh khối sợi nấm khô của 3 chủng nấm Hương nuôi cấy trong thời gian 30 ngày trong môi trường lỏng PDR ở cùng điều kiện nhiệt độ, pH môi trường là 4,5, tốc độ lắc 150 vòng/phút (8giờ/ngày) được trình bày trên bảng 4.2 và hình 4.2. Từ bảng và hình thấy rằng cả ba chủng giống nghiên cứu đều đạt mức độ cực đại về sự phát triển khối lượng sinh khối sợi nấm sau 20 ngày nuôi cấy. Tuy nhiên, các chủng giống khác nhau thì giá trị sinh khối là khác nhau. Chủng giống Lentinula edodes Thái và Sa Pa có sinh khối khô đạt giá trị tương đương nhau, lần lượt là 3,04 và 2,98 mg/ml. Chủng giống L170 đạt được lượng sinh khối sợi khô thấp nhất là 0,83mg/ml. Đối với cả 3 chủng giống, trong cùng một điều kiện nuôi cấy đều cho kết quả lượng sinh khối lớn nhất tại thời điểm ngày thứ 20. Trong khoảng 15 ngày đầu, mặc dù tốc độ tăng sinh khối nhanh, nhưng tổng lượng sinh khối khá nhỏ. Trong giai đoạn này các chủng nấm Hương cần thích nghi với môi trường sống. Khi đã bắt đầu thích nghi với môi trường thì tốc độ phát triển của hệ sợi mới bắt đầu tăng dần và đạt cực đại sau khoảng 20 ngày. Vì khoảng lấy mẫu là 5 ngày cách nhau, nên con số 20 ngày chỉ mang tính chất tương đối, có thể dịch chuyển xung quang giá trị 20 ngày. Bảng 4.2. Sự biến đổi khối lượng sinh khối sợi nấm khô của các chủng nấm Hương nuôi cấy trong môi trường PDR Ngày xác định Sinh khối sợi khô (mg/ml) Chủng nấm Hương Thái Chủng nấm Hương Sa Pa Chủng nấm Hương L170 10 0,33 ± 0,13 0,29 ± 0,12 0,09 ± 0,11 15 2,87 ± 0,19 2,76 ± 0,21 0,82 ± 0,13 20 3,04 ± 0,21 2,98 ± 0,23 1,23 ± 0,21 25 2,86 ± 0,24 2,85 ± 0,23 1,17 ± 0,27 30 2,71 ± 0,21 2,72 ± 0,25 0,83 ± 0,24 Khi lượng sinh khối lớn sẽ dẫn tới dinh dưỡng môi trường giảm dần. Điều này làm cho lượng sinh khối ghi được ở cuối kỳ (ngày thứ 30) đều nhỏ hơn ngày 20 và 25. Tuy nhiên, sau thời điểm 20 ngày thì tốc độ giảm sinh khối của 3 chủng là khác nhau. Ở chủng Thái và Sa Pa có tốc độ giảm nhanh hơn so với chủng L170. Lý do là ở chủng L170 có lượng sinh khối thấp, dinh dưỡng vẫn đủ cho sự phát triển. Như vậy, sự giảm dần sinh khối ngoài lý do dinh dưỡng còn liên quan đến độ già của hệ sợi nấm tức là khả năng hấp thu và khả năng phát triển. Kết quả ở phần nghiên cứu này cho chúng ta kết luận cả hai giống nấm Hương Thái và Sa Pa đều có khả năng phát triển tốt trong môi trường nuôi cấy lỏng. Khi kết hợp kết quả phát triển trên môi trường thạch đĩa PDA vả trong môi trường lỏng PDR chúng ta chọn được chủng giống nấm Hương Thái để sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo vì chủng này có thể phát triển tốt trong cả hai loại môi trường. Hình 4.2. Sự biến đổi khối lượng sinh khối sợi nấm khô của các chủng nấm Hương nuôi cấy trong môi trường PDR Hình 4.3. Sự phát triển sinh khối sợi nấm Hương sau 28 ngày nuôi cấy trong môi trường PDR của các chủng nấm Thái (hình trên cùng), Sa Pa (hình giữa) và chủng L170 (hình bên dưới) 4.3. Ảnh hưởng của thành phần môi trường tới sự phát triển sinh khối sợi nấm Hương trong môi trường lỏng Từ các kết quả nghiên cứu ở phần trên, trong thí nghiệm tiếp theo này chúng tôi chỉ sử dụng chủng giống nấm Hương Thái. Để đánh giá ảnh hưởng của thành phần môi trường tới sự phát triển của chủng giống này, chúng tôi đã sử dụng 5 môi trường khác nhau. Cụ thể: Môi trường PD (200g khoai tây, 20g Glucose) Môi trường PDR (200g khoai tây, 20g Glucose, 25g cám gạo) Môi trường YME (2g chất chiết nấm men, 10g chiết malt, 1g CaSO4) Môi trường ME (chiết malt 40ml) Môi trường YMPG (3g chất chiết nấm men, 3g chiết malt, 5g peptone, 10g glucose). Điều kiện nuôi cấy được duy trì trong cùng một điều kiện về nhiệt độ, ánh sáng, cung cấp ô xy. Độ pH môi trường nuôi cấy được điều chỉnh như nhau cho cả 5 môi trường là pH=4,5. Số liệu xác định lượng sinh khối khô sau 20 ngày nuôi cấy được trình bày trong bảng 4.3 và hình 4.3. Từ bảng thấy rằng các giá trị khối lượng sinh khối khô nằm trong khoảng từ 2,6 mg/ml đến 4,1 mg/ml. Môi trường YMPG cho sinh khối sợi khô lớn nhất là 4,1mg/ml, môi trường PD cho sinh khối sợi nhỏ nhất là 2,1mg/ml. Môi trường PDR, YME và ME cho sinh khối sợi khô lần lượt là 2,9mg/ml, 3,3mg/ml và 3,6mg/ml. Từ kết quả hàm lượng sinh khối sợi khô của nấm Hương trong các môi trường khác nhau ta thấy môi trường YMPG cho kết quả hàm lượng sinh khối khô là lớn nhất. Môi trường YMPG chứa dịch chiết nấm men, dịch chiết malt, pepton và đường đã đáp ứng đầy đủ nhất về nguồn dinh dưỡng cho sự phát triển của hệ sợi nấm. Vậy môi trường YMPG là môi trường đáp ứng được thành phần dinh dưỡng phù hợp cho sự phát triển của hệ sợi nấm Hương cho sinh khối sợi khô lớn nhất. Môi trường PD cho sinh khối sợi nhỏ nhất có thể do thành phần môi trường PD (khoai tây và đường) thiếu nguồn dinh dưỡng cung cấp đủ vitamin và khoáng chất cho sự phát triển của hệ sợi nấm Hương. Kết luận: Môi trường YMPG là phù hợp nhất cho sinh khối khô lớn nhất. Bảng 4.3. Sự khác biệt về sinh khối khô (mg/ml) của chủng nấm Hưng Thái nuôi cấy trong các môi trường khác nhau Sinh khối sợi khô (mg/ml) Môi trường PD PDR YME ME YMPG 2,6 ± 0,11 2,9 ± 0,13 3,3 ± 0,18 3,6 ± 0,21 4,1 ± 0,26 Hình 4.3. Hàm lượng sinh khối sợi nấm Hương phát triển sau 20 ngày trong các môi trường khác nhau 4.4. Ảnh hưởng của pH môi trường tới sự phát triển sinh khối của chủng giống nấm Hương Thái trong môi trường lỏng Để có kết luận pH phù hợp nhất cho sự phát triển của hệ sợi nấm Hương sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo. Chúng tôi sử dụng chủng giống Lentinula edodes Thái (đã nghiên cứu ở phần 4.1 và 4.2), môi trường YMPG (đã nghiên cứu ở phần 4.3) với khoảng pH 3,0 – 6,0, thông qua 7 điểm pH 3,0; 3,5; 4,0; 4,5; 5,0; 5,5; 6,0. Kết quả hàm lượng sinh khối sợi khô theo pH khi nuôi ở cùng điều kiện nhiệt độ, tốc độ lắc 150 vòng/phút (8giờ/ngày) sau 20 ngày phát triển được thể hiện trên bảng 4.4 và hình 4.4. Từ bảng và hình ta thấy pH trong khoảng 3,5-4,0 cho sinh khối sợi khô lớn nhất. Tại pH 6,0 cho hàm lượng sinh khối sợi nhỏ nhất là 2,1mg/ml. Như vậy khi pH tăng lên (môi trường trở nên trung tính) thì sự phát triển của sinh khối sợi nấm Hương giảm đi. Dải pH phù hợp cho sự phát triển của hệ sợi là 3,5-4,0. Kết quả về sự phát triển của sinh khối hệ sợi nấm Hương phụ thuộc vào pH, cụ thể là nấm này phù hợp trong vùng axit đã được một số nghiên cứu của nước ngoài khảng định từ trước. Hassegawa cũng chỉ ra rằng dải pH 3,0-4,5 có tính axit tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của hệ sợi nấm Hương. Bảng 4.4. Sự khác biệt về sinh khối sợi nấm khô (mg/ml) của chủng nấm Hưng Thái nuôi cấy trong các môi trường có pH khác nhau pH 3,0 3,5 4,0 4.5 5,0 5.5 6,0 Sinh khối (mg/ml) 3,7 ±0,19 4,3 ±0,23 4,1 ±0,27 3,2 ±0,13 2,9 ±0,11 2,6 ±0,24 2,1 ±0,18 Hình 4.4. Sinh khối sợi khô của chủng nấm Hương Lentinula edodes Thái trong môi trường YMPG theo pH Hình 4.5. Nuôi sinh khối sợi nấm trên máy lắc với tốc độ 150 vòng/phút (lắc 8 giờ/ngày) PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận Từ các kết quả nghiên cứu đã trình bày ở các phần trên, chúng tôi có một số kết luận sau đây: Trong 3 chủng nấm Hương nghiên cứu: Lentinula edodes Thái, Lentinula edodes Sa Pa, Lentinula edodes L170 thì chủng Lentinula edodes Thái có sự phát triển sinh khối hệ sợi tốt nhất. Điều này được thể hiện khi ươm nuôi sinh khối trên môi trường thạch đĩa và cả trong môi trường lỏng. Trong 5 môi trường lỏng khác nhau đã nghiên cứu gồm: 1- Môi trường PD (khoai tây và glucose, 2- Môi trường PDR (khoai tây, glucose và cám gạo), 3- Môi trường YME (dịch chiết nấm men và malt), 4- Môi trường ME (malt) và 5- Môi trường YMPG (chiết nấm men, malt, peptone và glucose) thì môi trường YMPG là môi trường phù hợp nhất cho sự phát triển của hệ sợi nấm Hương khi nuôi cấy lỏng. Trong khoảng pH 3,0-6,0 đã nghiên cứu thì dải pH 3,5-4,0 là phù hợp nhất cho sự phát triển của hệ sợi nấm Hương vì đạt được lượng sinh khối sợi nấm cao nhất. Trong môi trường lỏng PDR có pH 4,5, chủng giống nấm Lentinula edodes Thái đạt được sinh khối lớn nhất sau 20 ngày nuôi cấy. 5.2. Đề nghị Tiếp tục nghiên cứu một số ảnh hưởng khác đến sự phát triển của hệ sợi nấm Hương trong môi trường lỏng, ví dụ ảnh hưởng của nhiệt độ, lượng ô xy cung cấp, tỷ lệ giống trên thể tích môi trường. Tiếp tục hoàn thiện để xây dựng được qui trình sản xuất giống theo phương pháp nuôi cấy lỏng. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Nguyễn Hữu Đống (Chủ biên), 1997. Nấm ăn cơ sở khoa học và công nghệ nuôi trồng. NXB Nông nghiệp HN, 177 tr. Lê Duy Thắng, 2001. Kỹ thuật trồng nấm. NXB Nông nghiệp HN. Nguyễn Lân Dũng, 2003. Công nghệ nuôi trồng nấm. NXB Nông nghiệp HN, 244 tr. Lê Xuân Thám, Võ Thị Phương Khanh, Nguyễn Anh Dũng, 2000. Bổ sung vào nhóm nấm chống ung thư ở Việt Nam: Nấm Hương (Nấm Donko, nấm shiitake). Tạp chí dược học, số 1/2000. B. Tài liệu tiếng Anh Hassegawa R.H., Kasuya M.C.M., 2005. Growth and antibacterial activity of Lentinula edodes in liquid media supplemented with agricultural wastes. Electronic Journal of Biotechnology, 8(2), 213-216. Gerado M., Philippe D., Jean M. S., 2001. Selection of trains of Lentinula edodes and Lentinula boryana adapted for efficient mycelial growth on wheat straw. Rev. Lberoam Micol. 18, 118-112. Maira Peres de Carvaho, 2007. Investigation of the antibacterial activity of basidiomycetes Lentinuala boryana and lentinula edodes. Porto Alegre, 15(2), 173-179. Ishikawa N. K., Kasuya M. C. M., Vanetti M. C., 2001. Antibacterial activity of Lentinula edodes grown in liquid medium, Brazilian Journal of Microbiology, 32, 206-201. United States Patent 4874419. Substrate for growing shiitake mushrooms. United States Patent 5934012. Process for production of mushroom inoculum. United States Patent 7043874. Substrate and method for growing shiitake mushrooms [lentinus edodes (Berk.) singer)] and new shiitake strain Solomon P. W., 1999. Shiitake (Lentinus edodes),. Marcel Dekker, INC., New York, 656-660. University of Utah Research Park, Salt Lake City, 1990. Mannitol Metabolism in Lentinus edodes, the Shiitake Mushroom, Applied and Environmental Microbiology, 35, 1990, 250-253. Rossi I. H., Monteiro A. C., Machado J. O., Barbosa J. C., 2003. Supplementation of sugarcane bagasse with rice bran and sugarcane molasses for shiitake (lentinula edodes) spawn production, Brazilian Journal of Microbiology, 34, 61-65. United States Patent 2928210. Fermentation process for producing edible mushroom mycelim. Chihara G., 1990. Lentinan and it’s raleted polysaccharides as host defence potentiator: their application to infectiuos diseases and cancer. In:Immunotherapeutic Prospects of lnfectious Diseases, 9-18. Mizuno T., 1990. Development and utilization of bioactive substances from medicinal and sdible mushroom fungi. The Chemical Times, 1, 3-12. Mizuno T., 1993. Food function and medicinal effect of mushroom fungi. Food & Food Ingredients, 158. Lelik L., Vitanyi G., Lefler J., Hegoczky M., Nagy G., and Vereczkey G., 1997. Production of mycelium of Shiitake (Lentinula edodes) mushroom and investigation of it’s bioactive compounds. Acta Alimentaria, 26 (3), 271-272. Tochikura T.S., 1988. Inhibition (in vitro) of replication and of the cytopathic effect of human immunodeficiency virus by an extract of the culture medium of Lentinus edodes, Microbiol, 177, 235-244.