Luận văn Nghiên cứu sự tổng hợp cảm ứng pectinase ở một số chủng bacillus

ctin 5 0,051 0,406 0,355 98,450 Không có 0,043 0,156 0,113 31,367 Pectin 1 0,051 0,324 0,273 75,688 Pectin 2 0,052 0,458 0,406 112,607 Pectin 3 0,054 0,584 0,530 147,120 Pectin 4 0,051 0,502 0,451 125,283 Bl2 Pectin 5 0,048 0,423 0,375 104,094 Đồ thị 3.1: Hoạt độ pectinase trong canh trường nuôi cấy 2 chủng Bacillus không có chất cảm ứng và có chất cảm ứng là pectin. Nhận xét: Trong môi trường không có chất cảm ứng (môi trường bán rắn cơ bản), 2 chủng Bacillus vẫn có khả năng sinh tổng hợp enzym với hoạt độ là Bacillus licheniformic(Bl2): 31,367 (UI/g CT) và Bacillus subtilis(Bs4): 28,093 (UI/g CT). Trong môi trường có chất cảm ứng là pectin, hoạt độ enzym pectinase của 2 chủng Bacillus: Bl2 và Bs4 tăng đáng kể. Điều này chứng tỏ enzym pectinase của 2 chủng Bacillus này là một enzym cảm ứng. 129,170 147,120 0,000 20,000 40,000 60,000 80,000 100,000 120,000 140,000 160,000 0% 1% 2% 3% 4% 5% Lượng pectin bổ sung vào môi trường nuôi cấy(%) Ho ạt độ p ec tin as e( UI /g C T) Bs4 Bl2 Hoạt độ pectinase đạt cao nhất trong môi trường có chất cảm ứng pectin 3% ở Bl2 là 147,120 (UI/g CT) (gấp 4,75 lần hoạt độ pectinase trong môi trường không có chất cảm ứng), ở Bs4 là 129,170(UI/g CT) (gấp 4,95 lần hoạt độ pectinase trong môi trường không có chất cảm ứng). Hoạt độ pectinase giảm dần khi môi trường có hàm lượng pectin 4% và 5%. 3.3.2. Xác định hoạt độ pectinase trong canh trường nuôi cấy hai chủng Bacillus có bổ sung nguyên liệu cảm ứng là cà rốt Từ kết quả xác định hàm lượng pectin của cà rốt ở mục 3.2 chúng tôi điều chỉnh lượng cà rốt bổ sung vào môi trường nuôi cấy để đạt nồng độ pectin là 3%, nuôi cấy các thời gian khác nhau theo mục 2.3.3, quá trình tách chiết enzym được thực hiện theo mục 2.3.4, sử dụng dung dịch enzym sau tách chiết như dịch enzym thô. Dựa vào công thức xác định hoạt độ ở mục 2.3.5, kết quả thu nhận được trình bày trong bảng 3.5 và đồ thị 3.2. Bảng 3.5: Hoạt độ pectinase trong canh trường nuôi cấy 2 chủng Bacillus có chất cảm ứng là cà rốt. Chủng Bacillus Thời gian nuôi cấy(h) OD0 trung bình ODt trung bình OD trung bình Hoạt độ pectinase(UI/g CT) 24 0.084 0,613 0.529 146.935 48 0.124 1,360 1.236 343.003 72 0.211 1,826 1.615 448.300 96 0.205 1,726 1.521 422.207 120 0.186 1,523 1.337 371.131 Bl2 144 0.129 1,212 1.083 300.532 24 0.072 0,512 0.440 122.137 48 0.127 1,326 1.199 332.732 72 0.164 1,484 1.320 366.320 96 0.201 1,712 1.511 419.523 120 0.185 1,655 1.470 408.142 Bs4 144 0.146 1,322 1.176 326.533 Đồ thị 3.2: Hoạt độ pectinase trong canh trường nuôi cấy 2 chủng Bacillus có chất cảm ứng là cà rốt. Nhận xét: Ở chủng Bl2, hoạt độ tăng nhanh đáng kể từ sau 24 h nuôi cấy và đạt cực đại tại 72h nuôi cấy với giá trị hoạt độ là 448,022 (UI/g CT). Gấp 14,3 lần so với hoạt độ pectinase trong môi trường nuôi cấy không có chất cảm ứng, gấp 3,05 lần trong môi trường có chất cảm ứng pectin 3%. Ở chủng Bs4, hoạt độ pectinase đạt cực đại tại 96h nuôi cấy với giá trị hoạt độ là 419,523 (UI/g CT). Gấp 15,58 lần so với hoạt độ pectinase trong môi trường nuôi cấy không có chất cảm ứng, gấp 3,25 lần trong môi trường có chất cảm ứng pectin 3%. 3.3.3. Xác định hoạt độ pectinase trong canh trường nuôi cấy hai chủng Bacillus có bổ sung nguyên liệu cảm ứng là vỏ bưởi Từ kết quả xác định hàm lượng pectin của vỏ bưởi ở mục 3.2 chúng tôi điều chỉnh lượng vỏ bưởi bổ sung vào môi trường nuôi cấy để đạt nồng độ pectin là 3%, nuôi cấy các thời gian khác nhau theo mục 2.3.3, quá trình tách chiết enzym được thực hiện theo mục 2.3.4, sử dụng dung dịch enzym sau tách chiết như dịch enzym thô. Dựa vào công thức xác định hoạt độ ở mục 2.3.5, kết quả thu nhận được trình bày trong bảng 3.6 và đồ thị 3.3. Bảng 3.6: Hoạt độ pectinase trong canh trường nuôi cấy 2 chủng Bacillus có chất cảm ứng là vỏ bưởi Chủng Bacillus Thời gian nuôi cấy(h) OD0 trung bình ODt trung bình OD trung bình Hoạt độ pectinase(UI/g CT) Bl2 24 0,061 0,253 0,192 53,204 448,022 419,523 0 100 200 300 400 500 24h 48h 72h 96h 120h 144h Thời gian nuôi cấy(h) Ho ạt độ e nz im p ec tin as e( UI /g C T) Bl2 Bs4 205,043 182,929 0 50 100 150 200 250 24h 48h 72h 96h 120h 144h Thời gian nuôi cấy(h) Ho ạt độ e nz im p ec tin as e( U I/g C T) Bl2 Bs4 48 0,068 0,543 0,475 131,945 72 0,071 0,597 0,526 145,917 96 0,075 0,814 0,739 205,043 120 0,062 0,687 0,625 173,491 144 0,065 0,603 0,538 149,433 24 0,059 0,156 0,097 27,018 48 0,063 0,324 0,261 72,357 72 0,066 0,652 0,586 162,757 96 0,071 0,703 0,632 175,341 120 0,074 0,733 0,659 182,929 Bs4 144 0,069 0,702 0,633 175,804 Đồ thị 3.3: Hoạt độ pectinase trong canh trường nuôi cấy 2 chủng Bacillus có chất cảm ứng là vỏ bưởi Nhận xét: Đối với chủng Bl2, sau 24h hoạt độ pectinase tăng nhanh và đạt cực đại tại 96h nuôi cấy với giá trị hoạt độ là 205,043 UI/g CT ( gấp 6,5 lần so với hoạt độ pectinase trong môi trường nuôi cấy không có chất cảm ứng, gấp 1,39 lần so với hoạt độ pectinase trong môi trường có chất cảm ứng pectin 3%, tuy nhiên thấp hơn 2,19 lần so với môi trường nuôi cấy có chất cảm ứng là cà rốt). Đối với chủng Bs4, hoạt độ pectinase đạt cực đại tại 120h nuôi cấy với giá trị hoạt độ là 182,929 UI/g CT (gấp 7,01 lần so với môi trường không có chất cảm ứng, gấp 1,42 lần so với môi trường có chất cảm ứng là pectin 3%, tuy nhiên thấp hơn 2,29 lần so với môi trường có chất cảm ứng là cà rốt). Như vậy, trong môi trường nuôi cấy có bổ sung chất cảm ứng vỏ bưởi thì thời gian nuôi cấy để hoạt độ enzym pectinase đạt giá trị cực đại dài hơn (dài hơn 24h) và giá trị hoạt độ enzym pectinase cực đại thấp hơn so với trong môi trường nuôi cấy có bổ sung chất cảm ứng là cà rốt (do cà rốt ngoài cung cấp nguồn cacbon còn rất giàu các chất dinh dưỡng khác như vitamin, khoáng chất và axit amin). Vì vậy chúng tôi quyết định chọn cà rốt là chất cảm ứng cho quá trình sinh tổng hợp pectinase của hai chủng Bs4 và Bl2. 3.4. XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ PECTINASE TRONG CANH TRƯỜNG NUÔI CẤY HAI CHỦNG BACILLUS CÓ BỔ SUNG CÁC NGUỒN NITƠ KHÁC NHAU Thí nghiệm xác định nguồn nitơ phù hợp nuôi cấy để thu enzym pectinase có hoạt độ cao nhất. Quá trình nuôi cấy hai chủng Bacillus Bs4 và Bl2 được thực hiện trên môi trường bán rắn theo mục 2.3.3. Chúng tôi khảo sát hoạt độ enzym pectinase trong các môi trường nuôi cấy có bổ sung các nguồn nitơ khác nhau (cao nấm men, (NH4)2SO4, NH4NO3) với các điều kiện nuôi cấy như sau: - Nhiệt độ: 370C - Khối lượng canh trường: 10g - Lượng giống cho vào canh trường: 106 tế bào/g canh trường - Độ ẩm 50-60% - Cơ chất cảm ứng: cà rốt - Thời gian nuôi cấy: ở chủng Bl2 là 72h, ở chủng Bs4 là 96h Quá trình tách chiết enzym được thực hiện theo mục 2.3.4, sử dụng dung dịch enzym sau tách chiết như dịch enzym thô. Dựa vào công thức xác định hoạt độ ở mục 2.3.5, kết quả thu nhận được trình bày trong bảng 3.7, 3.8, 3.9 và biểu đồ 3.2, 3.3. Bảng 3.7: Hoạt độ pectinase trong canh trường nuôi cấy 2 chủng Bacillus có bổ sung cao nấm men với các tỉ lệ khác nhau Chủng Bacillus Tỉ lệ cao nấm men(%) OD0 trung bình ODt trung bình OD trung bình Hoạt độ pectinase(UI/g CT) 1% 0,215 1,832 1,617 448,855 2% 0,223 1,923 1,700 471,895 3% 0,226 2,098 1,872 519,639 4% 0,268 2,433 2,165 600,879 Bl2 5% 0,251 2,312 2,061 572,195 Bs4 1% 0,23 1,832 1,602 444,599 2% 0,234 1,882 1,648 457,553 3% 0,252 1,916 1,664 461,901 4% 0,294 2,063 1,769 491,140 5% 0,267 1,976 1,709 474,300 Bảng 3.8: Hoạt độ pectinase trong canh trường nuôi cấy 2 chủng Bacillus có bổ sung (NH4)2SO4 với các tỉ lệ khác nhau Chủng Bacillus Tỉ lệ (NH4)2SO4 OD0 trung bình ODt trung bình OD trung bình Hoạt độ pectinase(UI/g CT) 1% 0,211 1,829 1,618 449,040 2% 0,216 1,849 1,633 453,296 3% 0,215 1,835 1,620 449,780 4% 0,213 1,830 1,617 448,855 Bl2 5% 0,212 1,827 1,615 448,392 1% 0,2 1,715 1,515 420,541 2% 0,207 1,743 1,536 426,278 3% 0,205 1,735 1,530 424,613 4% 0,202 1,727 1,525 423,317 Bs4 5% 0,202 1,722 1,520 421,837 Bảng 3.9: Hoạt độ pectinase trong canh trường nuôi cấy 2 chủng Bacillus có bổ sung NH4NO3 với các tỉ lệ khác nhau Chủng Bacillus Tỉ lệ NH4NO3 OD0 trung bình ODt trung bình OD trung bình Hoạt độ pectinase(UI/g CT) 1% 0,212 1,831 1,619 449,503 2% 0,245 1,899 1,654 459,126 3% 0,219 1,840 1,621 450,058 4% 0,217 1,834 1,617 448,855 Bl2 5% 0,22 1,835 1,615 448,392 1% 0,203 1,733 1,530 424,705 2% 0,213 1,756 1,543 428,406 Bs4 3% 0,224 1,796 1,572 436,456 4% 0,217 1,762 1,545 428,961 5% 0,215 1,748 1,533 425,630 Biểu đồ 3.2: Hoạt độ pectinase trong canh trường nuôi cấy chủng Bl2 bổ sung các nguồn nitơ với các tỉ lệ khác nhau Nhận xét: Trong 3 nguồn nitơ thì cao nấm men ảnh hưởng rõ nét đến khả năng tổng hợp enzym pectinase của chủng Bl2 , hoạt độ pectinase cao nhất trong môi trường nuôi cấy bổ sung cao nấm men với tỉ lệ 4% với giá trị hoạt độ là 600,879 UI/g CT( gấp 1,34 lần so với môi trường nuôi cấy tương ứng không bổ sung nitơ). Chúng tôi quyết định sử dụng cao nấm men là nguồn cung cấp nitơ cho các quá trình nuôi cấy tiếp theo để thu nhận enzym pectinase của chủng Bl2. Biểu đồ 3.3: Hoạt độ pectinase trong canh trường nuôi cấy chủng BS4 bổ sung các nguồn nitơ với các tỉ lệ khác nhau Nhận xét: 600,879 380 420 460 500 540 580 620 1% 2% 3% 4% 5% Lượng các nguồn nitơ bổ sung vào môi trường nuôi cấy(%) Ho ạt độ e nz im p ec tin as e( UI /g C T) cao nấm men amonisunphat amoninitrat 491,140 380 400 420 440 460 480 500 1% 2% 3% 4% 5% Lượng các nguồn nitơ bổ sung vào môi trường nuôi cấy(%) Ho ạt độ e nz im p ec tin as e( UI /g C T) cao nấm men amonisunphat amoninitrat Cũng như đối với chủng Bl2, ở Bs4 trong 3 nguồn nitơ thì cao nấm men ảnh hưởng rõ nét đến khả năng tổng hợp enzym pectinase của chủng Bl2 , hoạt độ pectinase cao nhất trong môi trường nuôi cấy bổ sung cao nấm men với tỉ lệ 4% với giá trị hoạt độ là 491,140UI/g CT (gấp 1,17lần so với môi trường nuôi cấy tương ứng không bổ sung nitơ). Chúng tôi quyết định sử dụng cao nấm men là nguồn cung cấp nitơ cho các quá trình nuôi cấy tiếp theo để thu nhận enzym pectinase của chủng Bs4. 3.5. XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ PECTINASE TRONG MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY HAI CHỦNG BACILLUS CÓ PH KHÁC NHAU. Thí nghiệm nhằm xác định pH của môi trường nuôi cấy hai chủng Bl2 và Bs4 thích hợp để thu được hoạt độ enzym pectinase cao nhất. Quá trình nuôi cấy hai chủng Bacillus Bs4 và Bl2 được thực hiện trên môi trường bán rắn theo mục 2.3.3. Chúng tôi khảo sát hoạt độ enzym pectinase trong các môi trường nuôi cấy có pH khác nhau (4,5,6,7,8,9) với các điều kiện nuôi cấy như sau: - Nhiệt độ: 370C - Khối lượng canh trường: 10g - Lượng giống cho vào canh trường: 106 tế bào/g canh trường - Độ ẩm 50-60% - Cơ chất cảm ứng: cà rốt - Nguồn nitơ cao nấm men 4% - Thời gian nuôi cấy: ở chủng Bl2 là 72h, ở chủng Bs4 là 96h Quá trình tách chiết enzym được thực hiện theo mục 2.3.4, sử dụng dung dịch enzym sau tách chiết như dịch enzym thô. Dựa vào công thức xác định hoạt độ ở mục 2.3.5, kết quả thu nhận được trình bày trong bảng 3.10 và đồ thị 3.4. Bảng 3.10: Hoạt độ enzym pectinase trong môi trường nuôi cấy có pH khác nhau Chủng Bacillus pH OD0 trung bình ODt trung bình OD trung bình Hoạt độ pectinase(UI/g CT) 3 0,121 0,714 0,593 164,608 4 0,136 1,587 1,587 440,435 5 0,227 2,135 1,908 529,725 6 0,278 2,513 2,235 620,310 7 0,264 2,484 2,220 616,331 8 0,25 2,130 1,880 521,860 Bl2 9 0,206 1,959 1,753 486,607 Bs4 3 0,106 0,524 0,418 115,938 4 0,124 0,796 0,672 186,537 5 0,152 1,057 0,905 251,214 6 0,205 1,656 1,451 402,683 7 0,237 2,195 1,958 543,419 8 0,256 2,157 1,901 527,597 9 0,213 1,928 1,715 476,151 Đồ thị 3.4: Hoạt độ enzym pectinase trong môi trường nuôi cấy có pH khác nhau Nhận xét: Hoạt độ enzym pectinase tăng nhanh khi pH tăng từ 3 đến 6. Ở chủng Bl2, hoạt độ enzym cao nhất tại pH 6 với giá trị hoạt độ là 620,310 UI/g CT. Ở chủng Bs4, hoạt độ enzym pectinase cao nhất tại pH 7 với giá trị hoạt độ là 543,419 UI/g CT, sau đó hoạt độ enzym pectinase giảm chậm dần, chứng tỏ cả hai chủng này đều có khả năng chịu kiềm. Chúng tôi chọn pH 6 ở chủng Bl2, pH 7 ở chủng Bs4 là pH để nuôi cấy thu nhận enzym pectinase của 2 chủng Bacillus trong các thí nghiệm tiếp theo. 3.6. XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ ENZYM PECTINASE Ở CÁC ĐIỀU KIỆN NHIỆT ĐỘ NUÔI CẤY KHÁC NHAU Thí nghiệm nhằm xác định nhiệt độ nuôi cấy tối ưu để thu được hoạt độ enzym pectinase cao nhất của hai chủng Bacillus Bl2 và Bs4. Quá trình nuôi cấy hai chủng Bacillus Bs4 và Bl2 được thực hiện trên môi trường bán rắn theo mục 2.3.3. Chúng tôi khảo sát hoạt độ enzym pectinase trong các điều kiện nhiệt độ nuôi cấy khác nhau (250C, 300C, 350C, 370C, 400C, 450C, 50 0C) với các điều kiện nuôi cấy khác như sau: - Khối lượng canh trường: 10g - Lượng giống cho vào canh trường: 106 tế bào/g canh trường - Độ ẩm 50-60% 620,310 543,419 0 100 200 300 400 500 600 700 3 4 5 6 7 8 9 Giá trị pH Ho ạt độ e nz im p ec tin as e( UI /g CT ) BL2 Bs4 - Cơ chất cảm ứng: cà rốt - Nguồn nitơ: cao nấm men 4% - pH: 6(Bl2), 7(Bs4) - Thời gian nuôi cấy: ở chủng Bl2 là 72h, ở chủng Bs4 là 96h Quá trình tách chiết enzym được thực hiện theo mục 2.3.4, sử dụng dung dịch enzym sau tách chiết như dịch enzym thô. Dựa vào công thức xác định hoạt độ ở mục 2.3.5, kết quả thu nhận được trình bày trong bảng 3.11 và đồ thị 3.5. Bảng 3.11: Hoạt độ enzym pectinase trong canh trường nuôi cấy hai chủng Bacillus Bl2 và Bs4 ở các điều kiện nhiệt độ nuôi cấy khác nhau. Chủng Bacillus Nhiệt độ (0C) OD0 trung bình ODt trung bình OD trung bình Hoạt độ pectinase(UI/g CT) 25 0,065 0,597 0,532 147,768 30 0,097 1,272 1,175 326,162 35 0,204 1,807 1,603 444,969 37 0,293 2,635 2,342 650,197 40 0,273 2,422 2,149 596,438 45 0,205 1,543 1,338 371,409 Bl2 50 0,13 0,757 0,627 174,046 25 0,042 0,518 0,476 132,130 30 0,083 1,050 0,967 268,425 35 0,121 1,319 1,198 332,639 37 0,205 1,928 1,723 478,186 40 0,252 2,343 2,091 580,523 45 0,213 2,103 1,890 524,728 Bs4 50 0,109 1,522 1,413 392,135 Đồ thị 3.5: Hoạt độ enzym pectinase trong canh trường nuôi cấy hai chủng Bacillus Bl2 và Bs4 ở các điều kiện nhiệt độ nuôi cấy khác nhau. Nhận xét: Đối với chủng Bl2, hoạt độ enzym pectinase tăng nhanh khi nhiệt độ nuôi cấy tăng từ 25-37 0C, và đạt cực đại tại nhiệt độ 37 0C với giá trị hoạt độ là 650,197 UI/g CT, sau đó khi nhiệt độ vượt quá 37 0C thì hoạt độ enzym pectinase cũng giảm nhanh. So với chủng Bl2, chủng Bs4 có biên độ nhiệt độ rộng hơn, có khả năng chịu nhiệt tốt hơn, nhiệt độ tối ưu tại 40 0C với giá trị hoạt độ là 580,523 UI/g CT, khi nhiệt độ tăng vượt qua giá trị tối ưu thì tốc độ giảm chậm hơn so với chủng Bl2. 3.7. TỐI ƯU HOÁ CÁC ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY CHO VIỆC THU NHẬN ENZYM PECTINASE TỪ HAI CHỦNG VI KHUẨN BL2(BACILLUS LICHENIFORMIS) VÀ BS4( BACILLUS SUBTILIS) Các kết quả đã khảo sát được tiến hành tối ưu hoá bằng quy hoạch thực nghiệm nhằm tìm ra điểm tối ưu nhất cho quá trình sinh tổng hợp enzym pectinase ở vi khuẩn Bl2(Bacillus licheniformis) và Bs4( Bacillus subtilis) khi các yếu tố nguồn nitơ, pH, nhiệt độ tương tác lẫn nhau. Từ các kết quả thu được tại các phần 3.3, 3.4, 3.5, các mức yếu tố của môi trường nuôi cấy được thiết lập tại bảng 3.12 3.7.1. Tối ưu hoá các điều kiện nuôi cấy cho việc thu nhận enzym pectinase từ chủng vi khuẩn Bl2(Bacillus licheniformis) Bảng 3.12: Các mức yếu tố của môi trường nuôi cấy Mức yếu tố Nhiệt độ(0C) pH Cao nấm 650,197 580,523 0 100 200 300 400 500 600 700 25 30 35 37 40 45 50 Nhiệt độ(C) Ho ạt độ e nz im p ec tin as e( IU /g CT ) BL2 Bs4 S2y 1,197 men(%) x1 x2 x3 Mức trên(+) 50 8 5 Mức dướ(-) 25 4 1 Mức gốc(0) 35,25 6 3 Điểm sao(+) 55,5 8,4 5,6 Điểm sao(-) 19,5 3,6 0,4 Bảng 3.13: Ma trận thực nghiệm của chủng Bl2 Biến mã hoá Thí nghiệm song song Thí nghiệm x1 x2 x3 Y1 Y2 Y Sy2 1 + + + 324,571 325,247 324,909 0,228 2 - + + 318,472 317,897 318,1845 0,165 3 + - + 274,319 275,686 275,0025 0,934 4 - - + 297,241 296,325 296,783 0,420 5 + + - 265,794 264,247 265,0205 1,197 6 - + - 242,768 243,725 243,2465 0,458 7 + - - 234,258 233,576 233,917 0,233 8 - - - 256,423 255,278 255,8505 0,656 9 + 0 0 357,425 356,354 356,8895 0,574 10 - 0 0 323,356 324,598 323,977 0,771 11 0 + 0 489,589 490,153 489,871 0,159 12 0 - 0 472,152 473,438 472,795 0,827 13 0 0 + 556,244 557,172 556,708 0,431 14 0 0 - 513,758 512,245 513,0015 1,145 15 0 0 0 670,451 671,281 670,866 0,344 Tính đồng nhất phương sai của thông số tối ưu được kiểm tra bằng cách áp dụng chuẩn Kohren G0 = = = 0,14 Chuẩn Kohren được tra ở mức nghĩa  = 0,05 và bậc tự do f = 1(tra bảng 6 phân vị phân bố Kohren với Gp-1 với p = 0,05) Gp = 0,471 G0 < Gp Như vậy là phương sai đồng nhất, tức là các thí nghiệm được tiến hành với cùng một sai số như nhau. Sau khi phân tích ANOVA, phương trình hồi quy được dùng như là một mô hình tiên đoán sản lượng pectinase thu được. Sản lượng pectinase có thể được tiên đoán từ mô hình sau: S2y max 1,54 0100 200 300 400 500 600 700 800 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Y thực nghiệm Y mô hình Y = -2366,84 + 80,8722x1 + 429,724x2 + 144,356x3 + 0,365761x1x2 + 1,65027x2x3 – 1,10283x12 – 36,9253x22 -23,3867x32 (1) Trong đó Y là hoạt độ pectinase( UI/g CT); x1, x2, x3 lần lượt là nhiệt độ, pH, tỉ lệ cao nấm men(%). Hệ số hồi quy(R2) tính được là 0,9947. Điều này thể hiện rằng có 99,47% số liệu thực nghiệm tương thích với số liệu tiên đoán theo mô hình. Thông thường, giá trị R2 lớn hơn 0,75 thể hiện mô hình tương thích với thực nghiệm. Giá trị R2 tiên đoán là 0,9947 phù hợp với R2 điều chỉnh là 0,9851. F tính = 103,99 lớn hơn rất nhiều so với F05(K1= 10, K2=13) = 2,67 nên hệ số tương quan kép thực sự tồn tại. Giá trị của hàm đáp ứng của mỗi thí nghiệm được tính toán từ mô hình tiên đoán và phù hợp 99,47% so với số liệu thực nghiệm. Kết quả được trình bày trong bảng 3.14. giá trị tiên đoán cao nhất ở các thí nghiệm đã được thực hiện theo mô hình là 686,759 (UI/g CT). Bảng 3.14: Hoạt độ pectinase theo mô hình Biến mã hoá Thí nghiệm x1 x2 x3 Y thực nghiệm Y mô hình 1 + + + 324,909 330,703 2 - + + 318,1845 310,0483 3 + - + 275,0025 278,0638 4 - - + 296,783 293,9852 5 + + - 265,0205 272,1452 6 - + - 243,2465 246,2935 7 + - - 233,917 245,9103 8 - - - 255,8505 256,6347 9 + 0 0 356,8895 339,0462 10 - 0 0 323,977 331,8963 11 0 + 0 489,871 484,7828 12 0 - 0 472,795 463,3542 13 0 0 + 556,708 560,1384 14 0 0 - 513,0015 497,1899 15 0 0 0 670,866 686,7582 Đồ thị 3.6: Sự tương thích giữa Y thực nghiệm và Y mô hình Nhận xét: Từ đồ thị ta thấy đường phân bố của Y thực nghiệm và Y mô hình bám sát nhau, thể hiện mức độ tin cậy cao của mô hình tiên đoán sản lượng pectinase (1) Từ mô hình hoạt độ của enzym pectinase , các điểm tối ưu được tìm bằng cách đạo hàm Y theo lần lượt các biến được một hệ phương trình bậc một 3 biến số: Y'(X) = 0 = 80,8722-2,20566x1+0,365761x2 Y'(X) = 0 = 429,724+0,365761x1-73,8506x2+1,65027x3 Y'(X) = 0 = 144,356+1,65027x2- 46,7734x3 Giải hệ phương trình thay vào công thức tính toán được sản lượng pectinase tối ưu đạt được (694,489UI/g CT về mặt lí thuyết với 99,47%) ở các giá trị của các yếu tố: cao nấm men(3,3%), pH(6,1), nhiệt độ(37,7 0C) 3.7.2. Tối ưu hoá các điều kiện nuôi cấy cho việc thu nhận enzym pectinase từ chủng vi khuẩn Bs4( Bacillus subtilis) Bảng 3.15: Các mức yếu tố của môi trường nuôi cấy Nhiệt độ(0C) pH Cao nấm men(%) Mức yếu tố x1 x2 x3 Mức trên(+) 50 8 5 Mức dướ(-) 25 4 1 Mức gốc(0) 35,25 6 3 Điểm sao(+) 55,5 8,4 5,6 Điểm sao(-) 19,5 3,6 0,4 Bảng 3.16: Ma trận thực nghiệm của chủng Bs4 Biến mã hoá Thí nghiệm song song Thí nghiệm x1 x2 x3 Y1 Y2 Y Sy2 1 + + + 389,697 388,795 389,246 0,406802 2 - + + 301,887 301,275 301,581 0,187272 3 + - + 264,203 264,147 264,175 0,001568 4 - - + 175,703 174,581 175,142 0,629442 5 + + - 353,669 355,245 354,457 1,241888 6 - + - 224,804 224,758 224,781 0,001058 7 + - - 230,959 229,531 230,245 1,019592 8 - - - 100,555 99,751 100,153 0,323208 S2y 9,86 9 + 0 0 400,379 401,123 400,751 0,276768 10 - 0 0 251,984 250,264 251,124 1,4792 11 0 + 0 524,287 524,271 524,279 0,000128 12 0 - 0 279,271 277,571 278,421 1,445 13 0 0 + 502,389 500,457 501,423 1,866312 14 0 0 - 452,412 451,124 451,768 0,829472 15 0 0 0 550,73 550,172 550,451 0,155682 Tính đồng nhất phương sai của thông số tối ưu được kiểm tra bằng cách áp dụng chuẩn Kohren G0 = = = 0,19 Chuẩn Kohren được tra ở mức nghĩa  = 0,05 và bậc tự do f = 1(tra bảng 6 phân vị phân bố Kohren với Gp-1 với p = 0,05) Gp = 0,471 G0 < Gp Như vậy là phương sai đồng nhất, tức là các thí nghiệm được tiến hành với cùng một sai số như nhau. Sau khi phân tích ANOVA, phương trình hồi quy được dùng như là một mô hình tiên đoán sản lượng pectinase thu được. Sản lượng pectinase có thể được tiên đoán từ mô hình sau: Y = -2431,01+ 69,93x1 + 437,83x2 + 127,74x3 – 0,08x1x2 + 0,08x2x3 – 0,39x1x3 -0,85x12 – 33,2x22 - 16,87x32 (2) Trong đó Y là hoạt độ pectinase( UI/g CT); x1, x2, x3 lần lượt là nhiệt độ, pH, tỉ lệ cao nấm men(%). Hệ số hồi quy(R2) tính được là 0,9892. Điều này thể hiện rằng có 98,92% số liệu thực nghiệm tương thích với số liệu tiên đoán theo mô hình. Thông thường, giá trị R2 lớn hơn 0,75 thể hiện mô hình tương thích với thực nghiệm. Giá trị R2 tiên đoán là 0,9892 phù hợp với R2 điều chỉnh là 0,9399( độ lệch 0,0493 < 0.2). F tính = 25,36 lớn hơn nhiều so với F05(K1= 10, K2=13) = 2,67 nên hệ số tương quan kép thực sự tồn tại Giá trị của hàm đáp ứng của mỗi thí nghiệm được tính toán từ mô hình tiên đoán và phù hợp 98,92% so với số liệu thực nghiệm. Kết quả được trình bày trong bảng 3.15. Giá trị tiên đoán cao nhất ở các thí nghiệm đã được thực hiện theo mô hình là 579,378UI/g CT. Bảng 3.17: Hoạt độ pectinase theo mô hình tối ưu ở chủng Bs4 Biến mã hoá Thí nghiệm x1 x2 x3 Y thực nghiệm Y mô hình 1 + + + 410,121 399,021 S2y max 1,87 0100 200 300 400 500 600 700 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Stt thí nghiệm Ho ạt độ e nz im p ec tin as e( U I/g C T) Y mô hình Y thực nghiệm 2 - + + 301,581 316,161 3 + - + 264,175 256,556 4 - - + 175,142 165,272 5 + + - 354,457 368,980 6 - + - 224,781 246,773 7 + - - 250,142 227,850 8 - - - 100,153 97,220 9 + 0 0 456,124 393,775 10 - 0 0 251,124 240,062 11 0 + 0 524,279 476,197 12 0 - 0 278,421 300,077 13 0 0 + 501,423 499,519 14 0 0 - 451,768 431,155 15 0 0 0 550,451 579,379 Đồ thị 3.7: Sự tương thích giữa Y thực nghiệm và Y mô hình tối ưu ở chủng Bs4 Nhận xét:Từ đồ thị ta thấy đường phân bố của Y thực nghiệm và Y mô hình bám sát nhau, thể hiện mức độ tin cậy của mô hình tiên đoán sản lượng pectinase Bs4 (2) Từ mô hình hoạt độ của enzym pectinase , các điểm tối ưu được tìm bằng cách đạo hàm Y theo lần lượt các biến được một hệ phương trình bậc một 3 biến số: Y'(X) = 0 = 66,93 – 1,7x1- 0,08x2 – 0,39x3 Y'(X) = 0 = 437,83 - 0,08x1 – 66,4x2 + 0,08x3 Y'(X) = 0 = 127,74-0,39x1 + 0,08x2 – 33,74x3 Giải hệ phương trình thay vào công thức tính toán được sản lượng pectinase tối ưu đạt được (616,653 UI/g CT về mặt lí thuyết với 98,71%) ở các giá trị của các yếu tố: cao nấm men(3,3%), pH(6,5), nhiệt độ(40,1 0C) 3.8. THỬ NGHIỆM MÔ HÌNH TỐI ƯU TRÊN ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY BÁN RẮN Thí nghiệm nhằm mục đích kiểm tra kết quả lí thuyết của tối ưu hoá. Từ kết quả tối ưu hoá trên, chúng tôi tiến hành nuôi cấy hai chủng vi khuẩn Bacillus ở điều kiện sau:  Chủng Bl2 (Bacillus licheniformis) - Khối lượng canh trường: 10g - Thời gian nuôi cấy: 72h - Lượng giống cho vào canh trường: 106 tế bào/g canh trường - Độ ẩm 50-60% - Cơ chất cảm ứng: cà rốt - Nguồn nitơ cao nấm men 3,3% - pH: 6,1 - Nhiệt độ: 37,7 0C  Chủng Bs4( Bacillus subtilis) - Khối lượng canh trường: 10g - Thời gian nuôi cấy: 96h - Lượng giống cho vào canh trường: 106 tế bào/g canh trường - Độ ẩm 50-60% - Cơ chất cảm ứng: cà rốt - Nguồn nitơ cao nấm men 3,3% - pH: 6,5 - Nhiệt độ: 40,1 0C Quá trình tách chiết enzym được thực hiện theo mục 2.3.4, sử dụng dung dịch enzym sau tách chiết như dịch enzym thô. Kết quả thu được trình bày trong bảng 3.18 Bảng 3.18: Hoạt độ pectinase của hai chủng Bs4 và Bl2 khi nuôi cấy trên môi trường tối ưu. Chủng Bacillus OD0 trung bình ODt trung bình OD trung bình Hoạt độ pectinase thực nghiệm (UI/g CT) Hoạt độ pectinase mô hình (UI/g CT) S2 Bl2 0,354 2,507 695,906 694,489 1,00 Bs4 0,313 2,228 618,552 616,653 1,80 Như vậy: Đối với chủng Bl2, sau khi tối ưu hoá hoạt độ enzym đạt được là 695,909 UI/g CT( gấp 1,07 lần so với trước khi tối ưu). Đối với chủng Bs4, sau khi tối ưu hoá hoạt độ enzym đạt được là 618,552 UI/g CT( gấp 1,06 lần so với trước khi tối ưu). Từ đây chúng tôi thấy được mô hình tối ưu là môt mô hình có ý nghĩa quan trọng gia tăng sản lượng sản phẩm sinh học trong lên men. 3.9. THU NHẬN PECTINASE THÔ TỪ CANH TRƯỜNG NUÔI CẤY HAI CHỦNG VI KHUẨN BACILLUS Tiến hành nuôi cấy hai chủng vi khuẩn Bl2 và Bs4 trên môi trường bán rắn theo mục 2.3.3, ở các điều kiện nuôi cấy tối ưu theo mục 3.7. Quá trình tách chiết enzym được thực hiện theo mục 2.3.4. Quá trình tủa enzym bằng cồn lạnh được thực hiện theo mục 2.3.7. Kết quả được trình bày trong bảng 3.24. Bảng 3.19: Kết quả thu nhận enzym thô Bl2 Bs4 Khối lượng canh trường(g) 150 150 Tổng hoạt tính(UI) 108 071,7 102 472,8 Tổng khối lượng trước khi sấy(g) 12,17 10,34 Tổng khối lượng sau khi sấy(g) 7,12 6,53 Tỉ lệ thu nhận chế phẩm pectinase/ canh trường (%) 4,75 4,35 Tổng hoạt tính(UI) 78 421,15 73 306,93 Hiệu suất(%) 72,56 71,54 Hiệu suất thu hồi pectinase thô ở chủng Bl2 đạt 72,56%, ở chủng Bs4 đạt 71,56% tổng hoạt tính. Có thể giải thích nguyên nhân làm cho hiệu suất thu hồi không cao là: i) Nguyên nhân từ thiết bị. Do hạn chế về thiết bị nên chúng tôi phải li tâm bằng máy li tâm thường ở nhiệt độ phòng với dung dịch kết tủa đã được làm lạnh trước. Sau khi li tâm, nhiệt độ tăng lên. Đấy có thể là một nguyên nhân gây biến đổi enzym trong quá trình li tâm làm giảm hoạt tính của tủa enzym. ii) Nguyên nhân từ hiệu suất thu hồi của phương pháp kết tủa bằng cồn. Do thời gian có hạn nên chúng tôi chỉ thực hiện tủa enzym ở tỉ lệ 3 cồn/1 dung dịch chiết enzym. Đây là tỉ lệ tham khảo từ các đề tài nghiên cứu thu nhận và tinh sạch enzym pectinase khác. Chúng tôi chưa nghiên cứu sâu về vấn đề này. Vì vậy kết quả này chưa phải là kết quả tối ưu để tủa petinase từ canh trường nuôi cấy Bl2 và Bs4. iii) Các enzym sau khi tủa hoặc tinh sạch có xu hướng kết tụ lại. Điều này ảnh hưởng rất nhiều đến hoạt tính ủa enzym do các trung tâm phản ứng bị vùi lấp vào bên trong và không phục hồi được sau khi hoà tan trở lại. 3.10. KHẢO SÁT MỘT VÀI ĐẶC ĐIỂM CỦA PECTINASE BS4 VÀ BL2 3.10.1. Khảo sát giá trị pH thích hợp cho hoạt động của enzym Thí nghiệm nhằm xác định pH tối ưu cho hoạt động của enzym. Tiến hành nuôi cấy các chủng vi khuẩn ở điều kiện nuôi cấy tối ưu như đã xác định ở trên. Quá trình tách chiết enzym được thực hiện theo mục 2.3.4, sử dụng dung dịch enzym sau tách chiết như dịch enzym thô. Các phản ứng enzym được tiến hành ở điều kiện: - Nhiệt độ 370 C - Nồng độ cơ chất: 1% - Thời gian phản ứng: 60 phút Tiến hành khảo sát ảnh hưởng pH đối với hoạt độ pectinase theo mục 2.3.9.1. Kết quả được trình bày ở bảng 3.19 và đồ thị 3.8 Bảng 3.20: Sự biến thiên hoạt độ pectinase của hai chủng Bacillus theo giá trị pH Chủng Bacillus pH OD0 trung bình ODt trung bình OD trung bình Hoạt độ pectinase (UI/g CT) 5 0,217 1,511 1,294 359,195 6 0,308 2,335 2,027 562,665 7 0,362 2,887 2,525 700,995 8 0,325 2,536 2,211 613,648 9 0,273 2,207 1,934 536,942 10 0,205 1,543 1,338 371,409 Bl2 11 0,176 1,013 0,837 232,339 5 0,103 0,997 0,894 248,068 6 0,212 1,658 1,446 401,388 Bs4 7 0,276 2,077 1,801 499,838 8 0,32 2,603 2,283 633,634 9 0,297 2,455 2,158 599,121 10 0,231 2,103 1,872 519,732 11 0,124 1,352 1,228 340,967 Đồ thị 3.8: Sự biến thiên hoạt độ pectinase của hai chủng Bacillus theo giá trị pH Nhận xét: Ở chủng Bl2, pH tối ưu ở pH 7 với giá trị hoạt độ enzym pectinase là: 700,995 UI/g CT. Đối với chủng Bl2, hoạt độ enzym đạt giá trị tối ưu ở pH 8 với giá trị hoạt độ là 633,634 UI/g CT, khi giá trị pH vượt 8 thì hoạt độ enzym giảm, đến pH 11 hoạt độ enzym chỉ còn 340,957 UI/g CT( bằng 54% so với pH tối ưu) chứng tỏ enzym petinase Bl2 là một enzym chịu kiềm. 3.10.2. Khảo sát nồng độ cơ chất thích hợp cho hoạt động của enzym Thí nghiệm nhằm xác định nồng độ cơ chất thích hợp cho hoạt động của enzym. Tiến hành nuôi cấy các chủng vi khuẩn ở điều kiện nuôi cấy tối ưu như đã xác định ở trên. Quá trình tách chiết enzym được thực hiện theo mục 2.3.4, sử dụng dung dịch enzym sau tách chiết như dịch enzym thô. Các phản ứng enzym được tiến hành ở điều kện: - Thời gian phản ứng: 60 phút, pH: 7( với Bl2), 8 (với Bs4), nhiệt độ: 370C Tiến hành khảo sát ảnh hưởng nồng độ cơ chất đối với hoạt độ pectinase theo mục 2.3.10.2. Kết quả được trình bày ở bảng 3.20 và đồ thị Bảng 3.21: Sự biến thiên hoạt độ pectinase theo nồng độ cơ chất Chủng Bacillus Nồng độ cơ chất(%) OD0 trung bình ODt trung bình OD trung bình Hoạt độ pectinase (UI/g CT) Bl2 0,5 0,271 1,675 1,404 389,729 700,995 633,634 0 100 200 300 400 500 600 700 800 5 6 7 8 9 10 11 pH Ho ạt độ e nz im p ec tin as e (U I/g C T) Bl2 Bs4 1 0,362 2,887 2,525 700,995 1,5 0,365 2,922 2,557 709,785 2 0,325 2,645 2,320 643,905 2,5 0,275 2,135 1,860 516,401 3 0,205 1,543 1,338 371,409 3,5 0,169 1,013 0,844 234,282 4 0,101 0,812 0,711 197,455 0,5 0,212 1,658 1,446 401,388 1 0,32 2,605 2,285 634,1892 1,5 0,297 2,377 2,080 577,2843 2 0,32 2,057 1,737 482,258 2,5 0,176 1,512 1,336 370,8536 3 0,111 1,207 1,096 304,233 Bs4 3,5 0,104 1,050 0,946 262,595 Đồ thị 3.9: Sự biến thiên hoạt độ pectinase theo nồng độ cơ chất Nhận xét: Ở chủng Bl2 , hoạt độ enzym pectinase tối ưu ở nồng độ cơ chất pectin 1,5% với giá trị hoạt độ là 709,785 UI/g CT; ở chủng Bs4, hoạt độ pectinase tối ưu ở nồng độ cơ chất pectin 1% với giá trị hoạt độ là 634,189 UI/g CT) 3.10.3. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt động của enzym Thí nghiệm nhằm xác định nhiệt độ thích hợp cho hoạt động của enzym. Tiến hành nuôi cấy các chủng vi khuẩn ở điều kiện nuôi cấy tối ưu như đã xác định ở trên. Quá trình tách chiết enzym được thực hiện theo mục 2.3.4, sử dụng dung dịch enzym sau tách chiết như dịch enzym thô. Các phản ứng enzym được tiến hành ở điều kện: 709,785 634,189 0 100 200 300 400 500 600 700 800 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 Nồng độ cơ chất(%) Ho ạt độ e nz im p ec tin as e( UI /g C T) Bl2 Bs4 720,333 683,507 0 100 200 300 400 500 600 700 800 30 35 40 45 50 55 60 65 70 Nhiệt độ(0C) H oạ t đ ộ e nz im p ec tin as e( U I/g C T) Bl2 Bs4 - Thời gian phản ứng: 60 phút - pH: 7( với Bl2), 8 (với Bs4) - Nồng độ cơ chất: 1,5% với chủng Bl2, 1% với chủng Bs4 Tiến hành khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đối với hoạt độ pectinase theo mục 2.3.10.3. Kết quả được trình bày ở bảng 3.21 và đồ thị 3.10 Bảng 3.22: Sự biến thiên hoạt độ pectinase theo nhiệt độ Chủng Bacillus Nhiệt độ (0C) OD0 trung bình ODt trung bình OD trung bình Hoạt độ pectinase (UI/g CT) 30 0,214 1,038 0,824 228,823 35 0,236 1,494 1,258 349,202 40 0,35 2,727 2,377 659,912 45 0,365 2,936 2,571 713,671 50 0,372 2,967 2,595 720,333 55 0,289 2,273 1,984 550,636 60 0,254 1,801 1,547 429,424 65 0,221 1,577 1,356 376,498 Bl2 70 0,199 1,132 0,933 258,894 30 0,185 0,755 0,570 158,223 35 0,214 1,277 1,063 294,980 40 0,269 2,033 1,764 489,752 45 0,328 2,610 2,282 633,542 50 0,339 2,715 2,376 659,542 55 0,345 2,807 2,462 683,507 60 0,245 1,954 1,709 474,485 65 0,186 1,572 1,386 384,733 Bs4 70 0,115 0,927 0,812 225,492 Đồ thị 3.10: Sự biến thiên hoạt độ pectinase theo nhiệt độ Nhận xét: Nhiệt độ tối ưu cho hoạt độ của enzym pectinase ở chủng Bl2 là 500C, lúc đó hoạt độ enzym đạt được là 720,333 UI/g CT. Nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của enzym pectinase Bs4 là 55 0 C với giá trị hoạt độ của enzym là 683,507 UI/g CT. Như vậy pectinase Bs4 là enzym có khả năng chịu nhiệt tốt hơn pectinase Bl2. 3.10.4. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian phản ứng lên lượng D- galaturonic tạo thành Thí nghiệm nhằm xác định thời gian phản ứng của enzym pectinase hai chủng Bacillus để tạo ra lượng D- galaturonic nhiều nhất. Tiến hành nuôi cấy các chủng vi khuẩn ở điều kiện nuôi cấy tối ưu như đã xác định ở trên. Quá trình tách chiết enzym được thực hiện theo mục 2.3.4, sử dụng dung dịch enzym sau tách chiết như dịch enzym thô. Các phản ứng enzym được tiến hành ở điều kện: - pH: 7( với Bl2), 8 (với Bs4) - Nồng độ cơ chất: 1,5% với chủng Bl2, 1% với chủng Bs4 - Nhiệt độ: 500C( với chủng Bl2), 550C( với chủng Bs4) Tiến hành khảo sát ảnh hưởng thời gian phản ứng đối với hoạt độ pectinase theo mục 2.3.10.4. Kết quả được trình bày ở bảng 3.22 và đồ thị 3.1 Bảng 3.23: Sự biến thiên hoạt độ pectinase theo thời gian phản ứng Chủng Bacillus Thời gian (phút) OD0 trung bình ODt trung bình OD trung bình Hoạt độ pectinase (UI/g CT) 10 0,214 1,038 0,824 228,823 20 0,236 1,494 1,258 349,202 30 0,35 2,727 2,377 659,912 40 0,365 2,936 2,571 713,671 50 0,372 2,967 2,595 720,333 60 0,289 2,273 1,984 550,636 70 0,254 1,801 1,547 429,424 80 0,221 1,577 1,356 376,498 Bl2 90 0,199 1,132 0,933 258,894 Đồ thị 3.11: Sự biến thiên hoạt độ pectinase theo thời gian Nhận xét: Ở cả 2 chủng Bl2 và Bs4, hoạt độ enzym pectinase đều đạt giá trị cực đại tại 60 p 3.9.5. Khảo sát ảnh hưởng của một số ion kim loại lên hoạt độ của enzym pectinase Thí nghiệm nhằm xác định khảo sát ảnh hưởng của một số ion kim loại lên hoạt độ của enzym pectinase. Tiến hành nuôi cấy các chủng vi khuẩn ở điều kiện nuôi cấy tối ưu như đã xác định ở trên. Quá trình tách chiết enzym được thực hiện theo mục 2.3.4, sử dụng dung dịch enzym sau tách chiết như dịch enzym thô. Các phản ứng enzym được tiến hành ở điều kện: - pH: 7( với Bl2), 8 (với Bs4) - Nồng độ cơ chất: 1,5% với chủng Bl2, 1% với chủng Bs4 - Nhiệt độ: 500C( với chủng Bl2), 550C( với chủng Bs4) - Thời gian phản ứng: 60 phút Tiến hành khảo sát ảnh hưởng một số ion kim loại đối với hoạt độ pectinase theo mục 2.3.10.5. Kết quả được trình bày ở bảng 3.23 Bảng 3.24: Ảnh hưởng hưởng một số ion kim loại đối với hoạt độ pectinase 10 0,185 0,755 0,570 158,223 20 0,214 1,277 1,063 294,980 30 0,269 2,033 1,764 489,752 40 0,328 2,610 2,282 633,542 50 0,339 2,715 2,376 659,542 60 0,345 2,807 2,462 683,507 70 0,245 1,954 1,709 474,485 80 0,186 1,572 1,386 384,733 Bs4 90 0,115 0,927 0,812 225,492 719,778 684,340 0 100 200 300 400 500 600 700 800 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Thời gian(phút) H oạ t đ ộ e nz im p ec tin as e( U I/g C T) Bl2 Bs4 Chủng Bacillus Ion kim loại OD0 trung bình ODt trung bình OD trung bình Hoạt độ pectinase (UI/g CT) Tỷ lệ % Không bổ sung 0,37 2,962 2,592 719,408 100,00 Mg2+ 0,387 3,217 2,830 785,566 109,20 Ca2+ 0,365 3,078 2,713 753,088 104,68 Mn2+ 0,254 1,751 1,497 415,637 57,77 Bl2 Zn2+ 0,201 1,276 1,075 298,404 41,48 Không bổ sung 0,342 2,805 2,463 683,692 100,00 Mg2+ 0,343 2,896 2,553 708,767 103,67 Ca2+ 0,351 2,997 2,646 734,490 107,43 Mn2+ 0,235 1,604 1,369 379,921 55,57 Bs4 Zn2+ 0,267 1,757 1,490 413,602 60,49 Nhận xét: Kết quả cho thấy Mg2+ và Ca2+ có tác dụng làm tăng hoạt tính enzym pectinase của cả 2 chủng Bl2 và Bs4. Mn2+ và Zn2+ có tác dụng ức chế hai enzym này. Chương 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1. KẾT LUẬN Qua các kết quả thu được, chúng tôi rút ra được một số kết luận sau: 1. Cả sáu chủng Bacillus tiến hành thí nghiệm chọn lọc đều có khả năng tổng hợp pectinase, nhưng mạnh nhất là hai chủng  Chủng Bl2 : Bacillus licheniformis  Chủng Bs4: Bacillus subtilis 2. Khi bổ sung chất cảm ứng vào môi trường nuôi cấy hai chủng vi khuẩn Bacillus licheniformis và Bacillus subtilis thì hoạt độ enzym tăng rõ rệt. Chứng tỏ enzym pectinase là enzym cảm ứng. 3. Các nguyên liệu cảm ứng khác nhau sẽ gây ra hiệu quả cảm ứng sinh tổng hợp pectinase khác nhau. 4. Với chất cảm ứng pectin, nồng độ 3% là thích hợp nhất cho việc sinh tổng hợp enzym pectinase của hai chủng vi khuẩn Bacillus licheniformis và Bacillus subtilis. 5. Cà rốt là nguyên liệu cảm ứng thích hợp cho việc sinh tổng hợp pectinase của vi khuẩn Bacillus licheniformis và Bacillus subtilis. 6. Đã tối ưu hoá các điều kiện nuôi cấy (nhiệt độ, pH, tỉ lệ cao nấm men) cho việc sinh tổng hợp enzym pectinase của hai chủng vi khuẩn :  Chủng Bl2 : Bacillus licheniformis: - Nguồn nitơ cao nấm men 3,3% - pH: 6,1 - Nhiệt độ: 37,7 0C  Chủng Bs4( Bacillus subtilis) - Nguồn nitơ cao nấm men 3,3% - pH: 6,5 - Nhiệt độ: 40,1 0C 7. Xác định được điều kiện hoạt động tối ưu của enzym pectinase ở hai chủng vi khuẩn Bacillus:  Chủng Bl2 : Bacillus licheniformis: - pH: 7 - Nồng độ cơ chất: 1,5% - Nhiệt độ: 500C - Thời gian phản ứng: 60phút  Chủng Bs4: Bacillus subtilis - pH: 8 - Nồng độ cơ chất: 1% - Nhiệt độ: 550C - Thời gian phản ứng: 60phút 8. Ion Mg2+ và Ca2+ có tác dụng làm tăng hoạt tính, ngược lại, Mn2+ và Zn2+ có tác dụng ức chế enzym pectinase của cả 2 chủng vi khuẩn Bacillus licheniformis và Bacillus subtilis 9. Hiệu suất thu nhận của enzym pectinase từ hai chủng vi khuẩn là: Bacillus licheniformis là 72,56%, Bacillus subtilis là 71,54% 10. Trong hai chủng vi khuẩn Bacillus được chọn lọc thí nghiệm thì Bacillus licheniformis có hoạt độ pectinase cao hơn Bacillus subtilis. Hoạt độ cao nhất xác định được ở chủng Bacillus licheniformis ở các thí nghiệm đã được tiến hành là 720,333 UI/g CT (gấp 1,05 lần hoạt độ pectinase của vi khuẩn Bacillus subtilis: 683,507 UI/g CT). Tuy nhiên pectinase của Bacillus subtilis lại có khả năng chịu kiềm và chịu nhiệt tốt hơn pectinase của Bacillus licheniformis. 4.2. ĐỀ NGHỊ Từ những kết quả nghiên cứu đạt được ở trên , để làm tăng hiệu quả ứng dụng của đề tài này, chúng tôi đề nghị tiếp tục nghiên cứu thêm các hướng sau: 1. Nghiên cứu thêm sự ảnh hưởng của các nguyên liệu cảm ứng khác nhất là các phế phụ liệu của nông nghiệp và công nghiệp thực phẩm để sinh tổng hợp enzym pectinase của hai chủng vi khuẩn trên, nhằm tận dụng nguồn phế phụ liệu công nông nghiệp và nâng cao giá trị sử dụng của các phế phụ liệu này. 2. Tinh sạch, xác định thành phần, khối lượng phân tử hệ enzym pectinase của hai chủng vi khuẩn này. 3. Nghiên cứu thêm về hệ enzym hydrolase của hai chủng vi khuẩn này. TÀI LIỆU THAM KHẢO  TIẾNG VIỆT [1] Nguyễn Hữu Chấn (1996), Enzym và xúc tác sinh học, Nxb Y Học, Hà Nội. [2] Phạm Thị Ánh Hồng(2003), kĩ thuật sinh hóa, Nxb đại học quốc gia TP.HCM. [3] Trương Phước Thiên Hoàng (2007), Khảo sát hoạt tính một số hệ enzym thủy phân amylase, cellulase, pectinase thu từ ba chủng Trichoderma phân lập từ các loại đất khác nhau thuộc khu vực Miền Đông Nam Bộ. Luận văn Thạc sĩ Sinh [4] Nguyễn Đình Lạc, Trần Văn Sỹ, Võ Thị Thứ và ctv, 1990. Nghiên cứu kĩ thuật sản xuất baxitraxin phục vụ chăn nuôi. Đề tài cấp nhà nước. mã số 52D – 01 – 16. Chương trình Công nghệ sinh học. [5] Lương Đức Phẩm, Tăng Thị Chính, Trần Đình Mẫn.1995. Nghiên cứu thu nhận - amylase chịu nhiệt theo phương pháp bề mặt với chủng Bacillus. Tạp chí Khoa Học Và Công Nghệ, 1:15-20. [6] Lê Hồng Phú (2003), Nghiên cứu sinh tổng hợp enzym pectinase và cellulase từ Aspergillus niger và ứng dụng trong sản xuất phân hữu cơ, Luận án thạc sĩ Khoa Sinh Học, Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên TP. HCM. [7] Lê Thị Hồng Nga(2005), Nghiên cứu sự sinh tổng hợp cảm ứng pectinase và cellulase của một số chủng nấm mốc, Luận án thạc sĩ Khoa Sinh Học, Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên TP. HCM. [8] Nguyễn Đức Lượng (chủ biên), Phan Thị Huyền, Nguyễn Ánh Tuyết (2006), Thí nghiệm công nghệ sinh học (tập 2- thí nghiệm vi sinh vật học). NXB Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh [9] Nguyễn Đức Lượng(2002), Công nghệ vi sinh, tập 2, Nxb đại học quốc gía TP. HCM. [10] Đặng Thị Thu (2002), Công nghệ enzym, Nxb Khoa Học Và Kỹ Thuật, Hà Nội. [11] Lương Đức Phẩm, Hồ Sưởng (1978), vi sinh vật tổng hợp, Nxb Khoa Học và Kỹ Thuật, Hà Nội. [12] Đồng Thị Thanh Thu (1998), Giáo trình sinh hóa cơ bản, Tủ sách Đại Học Khoa Học Tự Nhiên TP.HCM [13] Nguyễn Quang Tâm(2002), Nghiên cứu một số enzim pectinase hòa tan và enzim pectinase cố định thu nhận từ các chủng nấm mốc, Luận văn Thạc Sĩ Khoa Học Sinh Học, Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên Tp. HCM [14] Lê Đức Ngọc(1998), xử lí số liệu và kế hoạch hóa thực nghiệm, Đại học Khoa Học Tự Nhiên. Đại học Quốc gia Hà Nội. [15] Lâm Thị Kim Châu, Nguyễn Thượng Lệnh, Văn Đức Chính (1997), Thực tập lớn sinh hóa, Nxb Đại học Quốc gia TP. HCM. [16] Lê Ngọc Tú, Nguyễn Chúc (1975), Men và công nghệ thực phẩm, Nxb Khoa Học Và Kĩ Thuật, Hà Nội [17] Lê Ngọc Tú (1982), Enzym vi sinh vật, tập 1, Nxb Khoa Học Và Kỹ Thuật, Hà Nội.  TIẾNG ANH [18] Aguillar, G.; Huitron, C. (1987), “ Stimulation of production of extracellular pectinolytic activities of Aspergillus sp.. by galacturonic acid and glucose additions”, Enz. Microbiol. Technol., 9, pp. 690-696. [19] Bulla J.A, Costilow R, Sappe E.S.1978. Biology of Bacillus popilliae. Adv. Appl. Microbiol. 23: 1- 18. [20] Bai, Z.H.; Zhang, H.X.; Qi, H.Y. Peng, X.W. (2004), “ pectinase production by Aspergillus niger using wastewater in solid state fermentation for eliciting plant disease resistance”, Bioresource Technology, 95, pp. 49-52. [21] Blandino, A.; Dravillas, K.; Cantero, D.; Pandiella, S>S; Webb, C. (2001), “Utilisation of whole wheat flour for the production of extracellular pectinase by fungal strains”, Process Biochemistry, 37, pp. 497-503. [22] Castilho, L.R.; Medronho, R>A.; Alves, T.L.M. (2000), “ Prodution and extraction of pectinase obtained by solid state fermentation of agroindustrial residues with Aspergillus niger”, Bioresource Technology, 71, pp. 45-50. [23] Couri, S.; Terzi, S.D.C; Pinto, D.A.S (2000), “ Hydrolytic enzyme production in solid state fermentation by Aspergillus niger3T5B8”, Process Biochemistry, 36, pp. 255-261. [24] Dênis Silva (2002), “Pectinase production by Penicillium viridicatum RFC3 by solid state fermentation using agricultural waste and agro-inductrial byproducts” 33,pp. 318-324. [25] Droby, S.;Wisniewski,M.E; Cohen,L.; Weiss, B.; Touitou, D.; Eilam, Y.; Chaulutz, E(1997), “ Influence of CaCl2 on Penicillium digicatum, Grapefruit Peel tissue, and Biocontrol Activity of Pichia guilliermondii”, phytopathology, 87, pp.310-315. [26] Bourret R.B, Borkovich K. A, Simon M. I. 1991. Signal transduction pathways involving protein phosphoylation in prokaryotes. Annu. Rev. Biochem. 60: 401-422. [27] Guevara, M.A.; Gonzalez-Jen, M.T.; Estevez P. (1997), “Multiple forms of pectic lyases and polygalacturonase from Fusarium oxysporum f.sp redicais lycopersici: Regulation of their synthesis by galacturonic acid”, Canadian J. Microbiol., 43, pp.245-253. [28] Meadow N. D, Fox D. K, Roseman. S. 1990. The bacterial phosphoenolpyruvate glucose phosphotransferase system. Anmu. Rev. Biochem. 59: 497-592. [29] Baumann P, Clark A. M, Baumann. L, Broadwell H. A. 1991. Bacillus sphaericus as a mosquito pathogen. Properties of the organisms and its toxins Microbiol. Rev.55: 425-436 [30] Kashyap, D.R.; Vohra P.K., Chopra, S.; Tewari,R.(2001), “Application of pectinase in the commercial sector: a review”, Bioresource Technology, 77,pp. 512-227. [31] Leone, G.; Heuvel, J.; Van Den Heuvel J. (1987), “Regulation by carbohidrates of the sequential in vitro production of pectic enzymes by Botrytis cinerea”, Canadial J. Bot.,6,pp. 2133-2141. [32] Lisbeth Olsson, Kim P. Hansen (2003), “influence of the carbon source on production of cellulase, hemicellulase and pectinase by Trichoderma reesei Rut C-30”, Enzym and Microbial Technology, 33, pp. 612-619. [33] Aronson A. I and Fitz J. 1976. Structure and morphogenesis of the bacterial spore coat. Bacteriol. Rev. 40: 360-402. [34] Maldonado, M.C.; Saad, A.M.S.; Callieri, D.A.S. (1989), “Regulatory aspects of the synthesis of polygalacturonase and pectinesterase by Aspergillus niger:, Si. Aliments, 9, pp. 101-110. [35] Edwards D.L, Payner J, Soares G. G. 1990. Novel isolates of Bacillus thuringiensis having activity against Nematodes. U.S. Patent 4: 734-948 [36] Stanier J. Y, Ingraham. J. L, Wheellis M. L, Paninter D, R. 1990. General Microbiology, Macmilan Education Ltd. Fith adition: 475-486. [37] Maria, T.F.S.; José L.F.L (2000), “Carbon sources effect on Pectinase production from Aspergillus japonicus 586”, Brazilian Journal of Microbiology, 31(4). [38] Matsuzaki, H., K. Yamane, K. Yamaguchi, Y.Nagata, and B. Maruo. 1974. Hybrid a-amylases produced by transformants of Bacillus subtilis. I. Purification and characterization of extracellular a-amylases produced by the parental strains and transformants. Biochim. Biophys. Acta 356:235- 247. [39] Octavio L.; Jesús Aguirre (1999), “Pectinase production by a diploid construct from two Aspergillus niger overproducing mutants”, Enzym and Microbial Technology, 25, pp. 103-108. [40] Shinke, R., H. Nishira, and N. Mugibayashi. 1974. Isolation of -amylase producing microorganisms. Agr. Biol. Chem. 38:665-666.. [41] Peter H. von Hippel (2004), “Completing the view of transcriptional Regulation”, Science, 35,pp.350-352. [42] Gordon R. E, Hayner W. C, Pang N. H.C.1973. The genus Bacillus, United states Department of Agriculture. Washington. D.C. [43] Reid, I.; Ricard, M. (2000), “Pectinase in papermaking: solving retention problems in mechanical pulps bleached with hydrogen peroxide”, Enzym and Microbial Techolog, 26, pp.115-123. [44] Sathyanarayana, N.G; Panda, T. (2003), “Purification and biochemichal properties of microbial pectinase – a review”, Process biochemistry, 38, pp. 985-996. [45] Solis- Pereira, S.; Favela-Torres, E.; Viniegra-Gonzales, G.; Gutierrez-Rofas, M. (1993), “Effect of different carbon source on the synthesis of pectinase by Aspergillus niger in submergered and solid state fermentation”, Appl. Microbiol. Biothnol., 39, pp. 36-41. [46] Solis, S.; Flores, M.E.; Huitron, C (1997), “ Improvement of pectinase production by interspecific hybrids of Aspergillus Strain”, Lett. Appl. Microbiol,24,pp. 77-81. [47] Priest G.F.Fellow G. M, Tood. C. 1998. A Numerical classification of the genus Bacillus. J. Gen. Microbiol. 134: 1847-1882. [48] Taragano, V.; Sachez, V.E.; Pilosof, A.M.R. (1997), “Combined effect of water activity depression and glucose addition on pectinases and protease production by Aspergillus niger”, Biotechnol.Lett., 19,pp. 223-226. [49] Priest G.F. 1993. Genus Bacillus. In: Bacteriology 1: 368-397. Edited by Rehm H. J and Reed G in cooperation with puhler A and Stadler P. Weinherm. [50] Wang, G.;Michailides, T.J.;Bostock,R.M(1997), “ improved detection of polygalcturonase activity due to mucor piriformis with a modified dinitrosalicylic acid reagent” phytopathology, 87,pp. 161- 163.  INTERNET [51] [52] [53] [54] state-fermentation-conditions [55] [56] [57] [58] [59] [60] [61] [62] [62] [63] [64] [65] [66] [67] [68] [69] PHỤ LỤC 1. ĐỒ THỊ CHUẨN ACID GALACTURONIC ĐỂ XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ PECTINASE THEO PHƯƠNG PHÁP SO MÀU THUỐC THỬ DNS Bảng 1: Tương quan giữa giá trị OD575nm và nồng độ acid D-galacturonic (mg/ml) Ống nghiệm 0 1 2 3 4 5 Nồng độ mg/ml 0 1 2 3 4 5 OD575nm 0,003 0,140 0,295 0,431 0,582 0,724 OD575nm 0 0,137 0,292 0,429 0,579 0,721 Đồ thị 1: Tương quan giữa giá trị OD575nm và nồng độ acid D-galacturonic (mg/ml) 2. MỘT SỐ HÌNH ẢNH TRONG QUÁ TRÌNH THỰC HIỆN LUẬN VĂN 2.1. Vòng phân giải pectin bởi pectinase ở sáu chủng Bacillus y = 0,1441x R2 = 0,9999 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0 1 2 3 4 5 6 Nồng độ D-galacturonic(mg/ml) O D Hình 1: Sự phân giải pectin bởi pectinase B. aureus trên môi trường Czapeck-Dox pectin. Hình 2: Sự phân giải pectin bởi pectinase B. subtilis(BS1) trên môi trường Czapeck-Dox pectin. Hình 3: Sự phân giải pectin bởi pectinase B. subtilis(Bs3) trên môi trường Czapeck-Dox pectin. Hình 4: Sự phân giải pectin bởi pectinase B. licheniformis( Bl2) trên môi trường Czapeck-Dox pectin. Hình 5: Sự phân giải pectin bởi pectinase B. subtilis (BS4) trên môi trường Czapeck-Dox pectin. Hình 6: Sự phân giải pectin bởi pectinase B. subtilis (BS2) trên môi trường Czapeck-Dox pectin 2.2 Thu chế phẩm petinase thô từ canh trường nuôi cấy hai chủng Bacillus Hình 7: Tủa enzim ở chủng B. licheniformis (Bl2) bằng cồn Hình 8: Tủa enzim ở chủng B. subtilis (Bs4) bằng cồn Hình 9: Enzim sau khi sấy khô ở chủng B. licheniformis (Bl2) Hình 10: Enzim sau khi sấy khô ở chủng B. subtilis ( Bs4)