Luận văn Nghiên cứu sugarcane yellow leaf virus gây bệnh vàng lá trên mía (YLS) bằng kính hiển vi huỳnh quang và kỹ thuật RT-PCR

polymerase. Ngoài ra, ngƣời ta cũng có thể sử dụng một enzyme chịu nhiệt khác là Tth polymerase. Sau khi tạo đƣợc nguồn cDNA từ mRNA, cDNA này sẽ đƣợc tiếp tục khuếch đại thông qua phản ứng PCR nhƣ trình bày ở phần trên. Kĩ thuật RT-PCR cho phép nghiên cứu các mRNA tồn tại với hàm lƣợng rất thấp không thể phát hiện bằng các phƣơng pháp thông thƣờng nhƣ Northern blot (Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng, 1998). 29 Hình 2.13. Sơ đồ phản ứng RT-PCR Khuôn RNA Sự gắn primer vào RNA để tổng hợp cDNA (primer có thể là ngẫu nhiên, oligo-dT hay mồi chuyên biệt cho gene). cDNA đƣợc tổng hợp bắt đầu từ vị trí của primer nhờ enzyme reverse trascriptase. Sợi cDNA đƣợc tạo thành. Khuôn RNA đƣợc loại bỏ nhờ Rnase H. cDNA đƣợc sử dụng để thực hiện PCR. Sự gắn của primer với cDNA. Sợi bổ sung của cDNA đƣợc tổng hợp nhờ taq polymerase. cDNA sợi đôi đƣợc hình thành. Ba bƣớc biến tính, bắt cặp, kéo dài đƣợc lặp lại nhiều lần. 30 PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 3 năm 2006 đến tháng 6 năm 2006. Địa điểm lấy mẫu ­ Trung tâm Nghiên cứu Mía đƣờng An Phú, Bến Cát, Bình Dƣơng. ­ Xã Tân An, thị xã Thủ Dầu Một, Bình Dƣơng. ­ Xã Phú Lý, huyện Vĩnh Cửu, tỉnh Đồng Nai. ­ Xã Mỹ Thạnh Tây, huyện Đức Huệ, tỉnh Long An. Nơi thực hiện thí nghiệm: Trung Tâm Phân Tích Hóa Sinh và Trung tâm Công nghệ và Quản lý Tài nguyên và Môi trƣờng Trƣờng Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh. 3.2 Phƣơng pháp lấy mẫu Chúng tôi tiến hành lấy mẫu lá ở vị trí +2 (Hình 3.1). Mỗi mẫu lấy ở năm bụi khác nhau. Hình 3.1. Vị trí lá trên cây. Đối với tập đoàn giống mía gốc và giống mía mới nhập từ Thái Lan chúng tôi tiền hành lấy mỗi giống một mẫu. Đối với mía đƣợc nhân giống để sản xuất và mía nguyên liệu, số lƣợng mẫu đƣợc lấy tùy vào diện tích canh tác. Mẫu sau khi lấy đƣợc mã hóa, ghi nhãn và bảo quản cẩn thận (-200C) trong suốt quá trình phân tích. 31 3.3 Trang thiết bị và dụng cụ thí nghiệm 3.3.1 Máy móc, thiết bị - Máy cất nƣớc 1 lần, 2 lần (Anh). - Máy li tâm (Sigma, Hettich). - Tủ mát (nhiệt độ 2 - 8oC), tủ lạnh -20oC và -80oC (trữ hóa chất và mẫu) (Reetech, Brandt, Sanyo). - Tủ định ôn (cài đặt ở 37oC) (Memmert). - Bồn ủ nhiệt (Water bath) (Memmert). - Máy vortex (IKA Works). - Máy luân nhiệt (máy thực hiện phản ứng PCR) (Eppendorf). - Lò viba (Electrolux). - Cân phân tích. - Bộ nguồn và bồn điện di (Biorad). - Máy đọc gel (Biorad). - Kính hiển vi huỳnh quang (Olympus). - Kính hiển vi quang học (Olympus). - Máy chụp hình 4.0 (Olympus). - Màn hình Sony. 3.3.2 Dụng cụ - Cối, chày sứ dùng để nghiền mẫu. - Kéo. - Eppendorf 1,5 ml. - Eppendorf 0,2 ml. - Hộp đựng eppendorf. - Micropipette P1000. - Micropipette P100. - Đầu tip 1000 μl. - Đầu tip 100 μl. - Ống đong 20, 50, 100ml. - Khay đổ gel điện di. - Bồn chứa Ethium bromide (nhuộm gel). - Lame và lamelle. 32 3.4 Hóa chất 3.4.1 Hóa chất sử dụng trong RT- PCR Hóa chất dùng trong tách chiết RNA Sử dụng kit ly trích AurumTM Total RNA Mini Kit (Catalog #732-6820) do Bio Rad cung cấp gồm: - Dung dịch ly giải. - Dung dịch rửa nhẹ (5X). - Dung dịch rửa mạnh. - DNase I (ở dạng bột rắn, cần pha buffer trƣớc khi sử dụng). - Dung dịch pha loãng DNase. - Dung dịch pha loãng RNA. - β- mercaptoethanol 14,2 M (catalog #161-0710) (*). - Polyvinylpyrolidone- 40 (PVP), 2 % ( * ) . - Ethanol 100 % và 70 % (*). - Tris-base (pH 7,5, 10 mM) (*). - Nitơ lỏng (*). - NaOH 0,1M (*). - EDTA 1mM (*). - DEPC (Diethyl pyrocarbonate) (*). ( * ): Hóa chất đƣợc cung cấp riêng, không kèm theo kit. Hóa chất sử dụng tạo cDNA và PCR - Nƣớc không chứa nuclease. - iTaq buffer 10X (Biorad). - iTaq DNA polymerase (Biorad). - MgCl2 (50 mM) (Biorad). - dNTP mix (10 mM) (BioRad). - Primer: Hai primer YLS 462 và YLS 111 (trình tự primer đƣợc cung cấp bởi TS. M. Irey). YLS111: 5' - TCT CAC TTT CAC GGT TGA CG-3’ YLS462: 5' - GTC TCC ATT CCC TTT GTA CAG C-3’ 3.4.2 Hóa chất sử dụng trong điện di - Agarose. 33 - TAE 0,5X (Tris acetate 40 mM; EDTA 0,1 mM; pH 8). - Blue/Orange Loading dye 6X (Promega). - Ethidium bromide (nồng độ 5.10-3 % theo thể tích). - Ladder 100 bp (kích thƣớc 1000 bp), nồng độ gel tƣơng ứng là 1,5 %. 3.5 Phƣơng pháp quan sát bằng kính hiển vi huỳnh quang Gân lá và bản lá đƣợc cắt mỏng bằng dao lam mới. Sau đó, thiết vật đƣợc đặt trong một giọt nƣớc cất hai lần đã khử trùng trên lame. Đặt lamelle lên và quan sát các bó mạch libe ở các độ phóng đại 40X, 100X, 200X và 400X với ánh sáng đơn sắc màu xanh (blue) bƣớc sóng 510nm. Những bó mạch libe bị nhiễm virus sẽ phát huỳnh quang màu vàng xanh bởi ánh sáng kích thích 510nm. Những bó mạch bình thƣờng sẽ không phát huỳnh quang. 3.6 Phƣơng pháp phát hiện bằng kỹ thuật RT-PCR Kỹ thuật RT-PCR đƣợc thực hiện là hai bƣớc (two steps): gồm giai đoạn tổng hợp cDNA và giai đoạn khuếch đại cDNA. Virus đƣợc phát hiện dựa trên trình tự đoạn gene có kích thƣớc 352 bp mã hóa cho protein vỏ của virus ScYLV. Qui trình thực hiện gồm 3 giai đoạn: ­ Giai đoạn ly trích RNA đƣợc thực hiện bằng kit ly trích RNA. ­ Giai đoạn tổng hợp cDNA đƣợc thực hiện theo kit tổng hợp cDNA . ­ Phản ứng RT-PCR đƣợc thực hiện dựa trên protocol của TS. Michael Irey cung cấp. 3.6.1 Qui Trình Ly Trích RNA Quy trình gồm có 15 bƣớc nhƣ sau: 1. Cắt mẫu thành những miếng nhỏ (< 5 mm), nghiền mịn trong nitơ lỏng. Chú ý không để cho mẫu bị chảy nƣớc trong lúc nghiền. 2. Cho 60 mg mẫu đã nghiền vào tube 2 ml có nắp đậy (có sẵn trong kit). Hòa tan mẫu bằng dung dịch ly giải (lysis solution) (14µl PVP 2% + 700µl dung dịch ly giải cho mỗi mẫu). Tạo hỗn hợp dung dịch ly giải nhƣ sau: Hút 500 l -mercaptoethanol cho vào 50 ml dung dịch ly giải, hút 700 l dung dịch ly giải đã có - mercaptoethanol cho vào eppendorf mới, thêm 14 l PVP vào. 3. Cho 700 µl dịch ly trích mẫu (lysis solution) đã bỗ sung PVP 2% vào tube chứa mẫu và trộn đều bằng pipet từ 12 - 15 lần. 34 4. Ly tâm với tốc độ 13000 vòng trong 3 phút ở 4oC. Sau đó hút dịch nổi sang tube 2 ml (có trong kit). 5. Cho 700 µl ethanol 70% vào tube chứa dịch nổi, trộn đều bằng pipet cho đến khi dịch không còn phân lớp. 6. Cho dịch hòa tan RNA (elution solution) vào bể điều nhiệt ở 70oC (chuẩn bị cho bƣớc 15). Cho RNA binding column vào tube 2 ml không có nắp đậy. 7. Hút 700 µl dịch mẫu cho vào RNA binding column. Ly tâm ở tốc độ 12000 vòng trong 1 phút ở 4oC. Loại phần dịch bên dƣới ra khỏi tube (thực hiện nhiều lần cho đến khi hết mẫu thì thôi). 8. Cho 80 ml ethanol 100% vào 20 ml dịch rửa nhẹ (low stringency). 9. Cho 700 µl dịch rửa nhẹ (low stringency) đã bổ sung ethanol 100% vào RNA binding column. Ly tâm 12000 vòng trong 30 giây ở 4oC. Loại phần dịch bên dƣới. 10. Pha DNase I với 250 µl Tris base pH = 7,5, trộn đều. 11. Pha 5 µl DNase I với 75 µl dịch pha loãng DNase (DNase delution solution) cho một mẫu ly trích trong tube 1,5 ml. Cho 80 µl dung dịch DNase vào RNA binding column. Ủ 15 phút ở nhiệt độ phòng. Ly tâm 12000 vòng trong 30 giây ở 4oC. 12. Loại phần dịch bên dƣới. 13. Thêm 700 µl dịch rửa mạnh (high stringency wash solution) vào RNA binding column. Ly tâm 12000 vòng trong 30 giây ở 4oC. Loại phần dịch bên dƣới. 14. Thêm 700 µl dịch rửa nhẹ (low stringency wash solution) vào RNA binding column. Ly tâm 12000 vòng trong 30 giây ở 4oC. Loại phần dịch bên dƣới. Ly tâm tiếp 60 giây với tốc độ 12000 vòng ở 4oC để loại hoàn toàn dịch rửa. 15. Cho RNA binding column vào tube 1,5 ml (có trong kit) có nắp đậy. Cho 80 µl dịch hòa tan RNA (elution solution) đã ủ ở 70oC vào RNA binding column, giữ ở nhiệt độ phòng trong 60 giây. Ly tâm 12000 vòng trong 2 phút ở 4oC để thu RNA tổng số. 35 RNA đem ủ ở 4oC để dùng sau. 3.6.2 Qui trình thực hiện phản ứng RT-PCR theo protocol của TS. M. Irey 3.6.2.1 Bƣớc chẩn bị mẫu YLS 462 primer (60 uM stock) 0,25 μl H2O 0,25 μl Mẫu 1,00 μl Ủ trong 5 phút sau đó làm lạnh nhanh trong đá. Ly tâm nhẹ. 3.6.2.2 Bƣớc RT MgCl2 (25 mM) 2,0 μl PCR buffer10X 1,0 μl dGTP (10 mM) 1,0 μl dCTP (10 mM) 1,0 μl dATP (10 mM) 1,0 μl dTTP (10 mM) 1,0 μl H2O 0,5 μl Rnase inhibitor (20 U/μl) 0,5 μl (Perkin Elmer) MulV Reverse transcriptase (50 U/μl) 0,5 μl (Perkin Elmer) Tổng thể tích 8,5 μl và thêm vào 1,5 μl hỗn hợp mẫu và primer Chu trình nhiệt của phản ứng RT: 15 phút ở 420 C, 5 phút ở 990 C - 1 chu kỳ. 3.6.2.3 Bƣớc PCR MgCl2 (25 mM) 4,00 μl 10X PCR buffer 4,00 μl H2O 31,50 μl Amplitaq DNA polymerase (5 U/μl) 0,25 μl (Perkin Elmer) YLS 111 primer (60 uM stock) 0,25 μl Tổng thể tích 40,00 μl thêm vào tube phản ứng RT. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR: 94 0 C /1 phút, 540C /1 phút, 720C /20 phút – 1 chu kỳ. 94 0 C /1 phút, 540C /1 phút, 720C /2 phút -40 chu kỳ. 72 0 C 10 phút - 1 chu kỳ. 3.6.3 Qui trình RT-PCR chỉnh sửa 36 3.6.3.1 Qui trình tổng hợp cDNA Nƣớc không chứa nuclease 10 μl 5X iScript reaction mix 4 μl iScript reversetranscriptase 1 μl Mẫu RNA 5 μl Tổng thể tích phản ứng 20 μl Chu trình nhiệt của phản ứng: 25 0C /5 phút, 420C /30 phút, 850C /5 phút – 1 chu kỳ. Giữ ở 40C. 3.6.3.2 Qui trình PCR MgCl2 (50 mM) 2,00 μl 10X PCR buffer 5,00 μl dNTP (10mM) 1 μl H2O 39,50 μl cDNA mẫu 1 μl itaq DNA polymerase (5 U/μl) 0,25 μl (Biorad) YLS 462 primer (30 μM stock) 0,5 μl YLS 111 primer (30 μM stock) 0,5 μl Tổng thể tích 50,00 μl Chu trình nhiệt 94 0C /1 phút, 540C /1 phút, 720C /20 phút – 1 chu kỳ. 94 0C /1 phút, 540C /1 phút, 720C /2 phút - 40 chu kỳ. 72 0C 10 phút - 1 chu kỳ. 3.7 Phƣơng pháp xử lý số liệu Số liệu đƣợc xử lý bằng trắc nghiệm χ2 bởi phần mền Excel XP. 37 PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Các biểu hiện của triệu chứng vàng gân lá do ScYLV Các biểu hiện của triệu chứng vàng gân lá do ScYLV là vàng ở gân lá cả mặt trên và mặt dƣới (hình 4.1). Hình.4.1. Lá biểu hiện triệu chứng vàng gân lá (dƣới) và lá không biểu hiện triệu chứng vàng gân lá (trên). (A) mặt trên của lá, (B) mặt dƣới của lá. (Hình chụp tại xã Mỹ Thạnh Tây, Đức Huệ, Long An ngày 19/03/2006). Hình 4.2 Triệu chứng vàng gân lá bắt đầu từ lá thứ 3 (Hình chụp tại xã Phú Lý, Vĩnh Cửu, Đồng Nai ngày 25/03/2006). Triệu chứng vàng gân lá xuất hiện bắt đầu từ lá thứ 3 ( hình 4.2) và những lá già hơn trên toàn cây và xuất hiện những vết hoại tử trên lá (Hình 4.3). A B 38 Triệu chứng này biểu hiện làm cho toàn bộ cánh đồng chuyển thành màu vàng (hình 4.4). Hình 4.3. (A) cây biểu hiện triệu chứng vàng gân lá. (B) cây không có triệu chứng vàng gân lá. (Hình chụp tại Trung tâm Nghiên cứu Mía đƣờng An Phú ngày 14/03/2006). Hình 4.4. Cánh đồng có triệu chứng vàng gân lá (A). Cánh đồng khỏe mạnh (B) (Hình (A) chụp tại xã Mỹ Thạnh Tây ngày 19/03/2006, hình (B) chụp tại Trung tâm Nghiên cứu Mía đƣờng An Phú ngày 14/03/2006). A B A B 39 Đây là những triệu chứng đặc trƣng gây ra bởi ScYLV. Các triệu chứng này không giống với biểu hiện của sự thiếu dinh dƣỡng. Triệu chứng này giống nhau ở tất cả mọi nơi (Schenck, 2001). Các triệu chứng trên là cơ sở ban đầu giúp chẩn đoán tình trạng nhiễm virus trên đồng ruộng. 4.2 Kết quả chẩn đoán dựa vào triệu chứng 4.2.1 Tỷ lệ nhiễm bệnh theo giai đoạn sinh trƣởng Tỷ lệ nhiễm bệnh theo giai đoạn sinh trƣởng đƣợc trình bày ở Bảng 4.1 và Biểu đồ 4.1. Tỷ lệ biểu hiện triệu chứng vàng gân lá theo các giai đoạn sinh trƣởng có sự khác biệt lớn về phƣơng diện thống kê (P<<0.05). Tỷ lệ nhiễm bệnh gia tăng theo độ tuổi phát triển của cây. Kết quả này phù hợp với kết quả nghiên cứu của Hà Đình Tuấn (2004) cho rằng bệnh vàng gân lá phát sinh – phát triển tăng theo các giai đoạn sinh trƣởng của cây mía và tỷ lệ này tăng nhanh sau giai đoạn cây đẻ nhánh. Bảng 4.1. Tỷ lệ nhiễm bệnh theo giai đoạn sinh trƣởng Giai đoạn sinh trƣởng Không có triệu chứng (cây) Có triệu chứng (cây) Tỷ lệ nhiễm bệnh (%) Đẻ nhánh 51 25 32,89 Đầu vƣơn lóng 26 14 35,00 Giữa vƣơn lóng 4 8 66,67 Thu hoạch 9 31 77,50 Biểu đồ 4.1. Tỷ lệ nhiễm bệnh theo giai đoạn sinh trƣởng 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Đẻ nhánh Đầu vươn lóng Giữa vươn lóng Thu hoạch Tuổi Tỷ lệ (%) 40 Trong giai đoạn đẻ nhánh tỷ lệ nhiễm chỉ 32,89% nhƣng tới giai đoạn thu hoạch tỷ lệ này tăng lên tới 77,5%. Tuy nhiên, điều này không chứng tỏ rằng tỷ lệ nhiễm virus của cây ở giai đoạn đẻ nhánh là thấp. Trong quá trình điều tra cho thấy mía thƣờng đƣợc tái sinh từ gốc của vụ trƣớc. Do đó, virus sẽ đƣợc truyền từ gốc mía sang cây con. Tỷ lệ nhiễm bệnh trong giai đoạn đẻ nhánh thấp có thể là do giai đoạn này sự biểu hiện triệu chứng thấp. Kết quả chúng tôi thu đƣợc phù hợp với kết quả của Comstock và cộng sự (2003), Parmessur và cộng sự (2002) và Schenck (2001) cho rằng triệu chứng vàng gân lá biểu hiện rõ ràng và nhiều nhất ở giai đoạn cây trƣởng thành. 4.2.2 Tỷ lệ nhiễm bệnh theo địa phƣơng Tỷ lệ nhiễm bệnh theo địa phƣơng đƣợc trình bày ở Bảng 4.1 và biểu đồ 4.2. Tỷ lệ biểu hiện triệu chứng vàng gân lá ở các vùng có sự khác biệt lớn (P<<0,05). Qua Bảng 4.2 và biểu đồ 4.2 chúng tôi nhận thấy tỷ lệ nhiễm bệnh vàng gân lá cao nhất ở cánh đồng Mỹ Thạnh Tây, Đức Huệ, Long An (77,5%). Sau đó là Tân An, Thủ Dầu Một (75%), An Phú (58,33%), Phú Lý, Vĩnh Cửu, Đồng Nai (35,56%), tập đoàn giống gốc tại Trung tâm Nghiên cứu Mía đƣờng An Phú (29,03%), giống mới nhập từ Thái Lan (25,00%). Giống Thái Lan mới nhập có biểu hiện triệu chứng thấp là do giống này đã đƣợc kiểm dịch nghiêm ngặt và đƣợc trồng xung quanh nhà kính, cách biệt với các giống khác và đƣợc chăm sóc tốt. Tập đoàn giống gốc tại Trung tâm Nghiên cứu Mía đƣờng An Phú biểu hiện triệu chứng thấp do giống ở đây đƣợc chăm sóc tốt. Mặt khác, mía tại đây đang trong giai đoạn đẻ nhánh nên triệu chứng cũng biểu hiện thấp. Bảng 4.2. Tỷ lệ nhiễm bệnh vàng gân lá theo địa phƣơng Nguồn gốc Không có triệu chứng (cây) Có triệu chứng (cây) Tỷ lệ nhiễm bệnh (%) Thái Lan 21 7 25,00 An Phú 5 7 58,33 Giống gốc 22 9 29,03 Tân An 4 8 66,67 Mỹ Thạnh 9 31 77,50 Phú Lý 29 16 35,56 41 Biểu đồ 4.2. Tỷ lệ nhiễm bệnh giữa các địa phƣơng 25.00 58.33 29.03 66.67 77.50 35.56 0.00 10.00 20.00 30.00 40.00 50.00 60.00 70.00 80.00 90.00 Thái Lan An Phú Giống gốc Tân An Mỹ Thạnh Phú Lý Vùng Tỷ lệ (%) Ở Phú Lý tỷ lệ có triệu chứng vàng gân lá cao hơn ở giống Thái Lan và tập đoàn giống gốc tại Trung tâm Nghiên cứu Mía đƣờng An Phú mặc dù chúng cùng giai đoạn sinh trƣởng. Điều này có thể giải thích là do ở Phú Lý điều kiện chăm sóc không tốt. Hơn nữa, mía ở đây đƣợc tái sinh từ gốc của các vụ trƣớc nên nguy cơ truyền virus từ gốc sang cây con là rất cao. Điều này cũng làm cho tỷ lệ vàng gân lá ở đây cao hơn. Mặt khác, đất ở đây khô cứng có thể làm cây bị stress nên tỷ lệ vàng gân lá biểu hiện cao. Tỷ lệ triệu chứng vàng gân lá ở các mẫu từ Mỹ Thạnh Tây cao nhất là do mía ở đây đang trong giai đoạn thu hoạch. Đây là giai đoạn mà triệu chứng vàng gân lá biểu hiện cao nhất. Tỷ lệ vàng gân lá ở An Phú và Tân An cao cũng đƣợc giải thích tƣơng tự ở Mỹ Thạnh Tây. Trung tâm Nghiên cứu Mía đƣờng An Phú là nơi tạo giống và cung cấp giống cho nhiều vùng sản xuất mía đƣờng khác trong cả nƣớc. Tuy nhiên, tập đoàn giống gốc tại đây đã xuất hiện triệu chứng vàng gân lá điều đó đồng nghĩa với việc đây có thể là nơi truyền bệnh sang các vùng khác qua con đƣờng giống. Qua điều tra cho thấy giống mới nhập từ Thái Lan mặc dù đã qua kiểm soát chặt chẽ song vẫn có sự hiện diện của triệu chứng vàng gân lá. Ở đây chúng tôi không thể khẳng định triệu chứng vàng gân lá trên tập đoàn giống này là do nhiễm virus 42 trƣớc khi nhập nội hay sau khi trồng tại Trung tâm Nghiên cứu Mía đƣờng An Phú bởi vì giống này đƣợc nhập không có sự kiểm soát ScYLV. 4.2.3 Tỷ lệ nhiễm bệnh theo nguồn gốc giống Tỷ lệ nhiễm bệnh theo giống đƣợc trình bày ở Bảng 4.3 và biểu đồ 4.3. Tỷ lệ biểu hiện triệu chứng giữa các giống có sự khác biệt lớn (P<<0,05). Toàn bộ mẫu lấy từ giống R570 đƣợc nhập từ Pháp và giống Việt Nam gốc Mỹ DLM 24 đều có triệu chứng vàng gân lá (100%). Trong khi đó mẫu lấy từ giống RB 72454 nhập từ Braxin thì không có biểu hiện triệu chứng. Ngoài ra các giống khác đều có biểu hiện triệu chứng vàng gân lá. Trên các giống R570 và DLM 24 tỷ lệ nhiễm cao có thể là do các giống này mẫn cảm với ScYLV. Giống Thái Lan tỷ lệ nhiễm là 42,55%, trong số này tỷ lệ nhiễm rơi vào các giống nhập năm 1992, giống này đã đƣợc sản xuất đại trà trên các cánh đồng mía thƣơng mại ở nƣớc ta. Trong các giống mới nhập nội tỷ lệ nhiễm thấp hơn so với giống đang sản xuất đại trà (Bảng 4.2). Bảng 4.3. Tỷ lệ nhiễm bệnh theo giống Nguồn gốc Không có triệu chứng (cây) Có triệu chứng (cây) Tỷ lệ nhiễm bệnh (%) Thái Lan 27 20 42,55 Ấn Độ 1 1 50,00 Việt Nam 6 22 78,57 Braxin 1 0 0,00 Cuba 35 12 25,53 Pháp 0 2 100,00 Australia 4 0 0,00 Hawaii 9 6 40,00 gốc Mỹ 0 1 100,00 Đài Loan 8 13 61,90 43 Biểu đồ 4.3 Tỷ lệ nhiễm bệnh theo nguồn gốc giống 42,55 50,00 78,57 0,00 25,53 100,00 0,00 40,00 100,00 61,90 0,00 20,00 40,00 60,00 80,00 100,00 120,00 Th ái La n Ấn Đ ộ Vi ệt Na m Br ax in Cu ba Ph áp Au str ali a Ha wa ii gố c M ỹ Đà i L oa n Nguồn gốc Tỷ lệ (%) Trên giống Comus nhập từ Australia chúng tôi không ghi nhận thấy triệu chứng vàng gân lá. Kết quả này phù hợp với kết quả trong nghiên cứu của Hà Đình Tuấn (2004). Có thể là do trên giống này có khả năng kháng lại ScYLV nên mặc dù giống này đƣợc trồng cạnh cánh đồng giống R570 (100% vàng gân lá) mà giống này vẫn không có biểu hiện triệu chứng. 4.3 Quan sát mạch dẫn bằng kính hiển vi huỳnh quang Chúng tôi tiến hành kiểm tra trên 150 mẫu gân lá bằng kính hiển vi huỳnh quang. Kết quả cho thấy chỉ những mẫu nào có biểu hiện triệu chứng của bệnh vàng gân lá thì bó mạch libe mới có khả năng tự phát huỳnh quang khi bị kích thích bởi ánh sáng xanh ở bƣớc sóng 510nm (Hình 4.5). Sự tự phát huỳnh quang của mạch libe có liên quan đến triệu chứng vàng gân lá (P = 0,379>0,05). Đối với những mẫu không có triệu chứng thì bó mạch libe không có sự tự phát huỳnh quang và không có khác biệt khi quan sát bởi kính hiển vi huỳnh quang và kính hiển vi quang học (Hình 4.5 và 4.6). Những hợp chất phenol có vai trò quan trọng trong quá trình tiêu diệt ký sinh gây bệnh của cây trồng. Phenol có vai trò tham gia vào quá trình suberin và lignin hóa để hình thành các mô cơ giới là một trong những nhân tố cản trở sự phát triển của ký sinh (Trần Kim Đồng và cộng sự, 1991). Sự phát huỳnh quang trên các bó mạch libe có thể là do sự tích tụ các hợp chất phenol trong các bó mạch khi bị virus tấn công. Sự phát huỳnh quang trong những bó 44 mạch libe cũng chứng tỏ rằng có sự rối loạn trong quá trình biến dƣỡng dẫn tới sự tích lũy hợp chất phenol (Vega, 1997). Tuy nhiên, hợp chất phenol bao gồm lignan, lignin, tanin, … để khẳng định hợp chất phenol nào có khả năng phát huỳnh quang thì cần phải nghiên cứu thêm. Đối với những lá có phản ứng chết sự tích tụ hợp chất phenol vẫn xảy ra. Tuy nhiên, khi quan sát chúng dƣới kính hiển vi huỳnh quang chúng tôi nhận thấy xung quanh bó mạch và vách các tế bào đều phát huỳnh quang nhƣng trong bó mạch libe không có sự phát huỳnh quang (Hình 4.7).. Hình 4.5 Các bó mạch của gân lá đƣợc kiểm tra bởi kính hiển vi huỳnh quang B A 45 (A) Cây mía có triệu chứng vàng gân lá bó mạch libe có chất phát huỳnh quang màu vàng xanh. (B) Cây mía bình thƣờng mạch libe bình thƣờng. Độ phóng đại 200X. (Hình chụp tại Trung tâm Công nghệ và Quản lý Tài nguyên và Môi trƣờng ngày 01/08/2006). Hình 4.6. Các bó mạch gân lá đƣợc quan sát bằng kính hiển vi quang học (100X) (Hình chụp tại Trung tâm Công nghệ và Quản lý Tài nguyên và Môi trƣờng ngày 01/08/2006). Hình 4.7. Sự phát huỳnh quang của tế bào do có phản ứng chết (200X) (Hình chụp tại Trung tâm Công nghệ và Quản lý Tài nguyên và Môi trƣờng ngày 01/08/2006). Sự tự phát huỳnh quang cũng xảy ra tƣơng tự đối với các virus khác chỉ tồn tại trong mạch libe nhƣ luteovirus, closterovirus và mycoplasma (Vega, 1997). Sự tự phát huỳnh quang xảy ra không giúp chúng tôi khẳng định chính xác rằng có sự hiện diện 46 của ScYLV, nhƣng kết quả này bƣớc đầu giúp chẩn đoán có sự hiện diện của ScYLV, giúp chúng tôi khẳng định đƣợc các mẫu trên có sự tấn công của virus. Để khẳng định chính xác sự hiện diện của ScYLV cần có những chẩn đoán về mặt phân tử bằng các kỹ thuật công nghệ sinh học nhƣ RT-PCR, ELISA, kính hiển vi điện tử, … Có thể sử dụng kính hiển vi huỳnh quang để chẩn đoán sự tấn công của ScYLV. 4.4 Kết quả RT-PCR dựa theo qui trình của M. Irey Chúng tôi tiến hành thay đổi qui trình do M. Irey cung cấp cho phù hợp với điều kiện của phòng thí nghiệm. Kết quả thu đƣợc ở Hình 4.8 cho thấy khi thực hiện theo qui trình chỉnh sửa chúng tôi vẫn thu đƣợc sản phẩm mong muốn (352 bp) và đây là sản phẩm duy nhất. Điều này cho thấy qui trình phản ứng RT-PCR do chúng tôi chỉnh sửa có thể sử dụng để phát hiện ScYLV. Hai primer YLS111 và YLS462 đƣợc thiết kế bởi M. Irey để khuếch đại protein vỏ của virus vàng gân lá (ScYLV) không những cho phép phát hiện ScYLV ở các nƣớc khác (Florida, Hawaii, Brazil, Colombia, Taiwan, Mauritius và Mexico) mà còn có thể phát hiện đƣợc ScYLV xuất hiện tại Việt Nam. Hình 4.8. Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR (M: thang chuẩn kích thƣớc1kb, 1: sản phẩm PCR). 4.5 Kết Quả RT-PCR Sau khi ổn định qui trình cho phù hợp với phòng thí nghiệm chúng tôi tiến hành kiển tra đối với 9 mẫu đại diện. Kết quả ở Hình 4.9 cho thấy có 4 mẫu đƣợc kiểm tra bằng kỹ thuật RT-PCR cho kết quả dƣơng tính với cặp mồi YLS111 và YLS462. Các giống K84-200, ROC16, R570, DLM24 đều cho kết quả RT-PCR dƣơng tính. Đồng thời các mẫu này cũng đều có biểu hiện rõ ràng của bệnh vàng gân lá do ScYLV. Các giống Comus, ROC26, C2217, Ja6420, RB72454 không có biểu hiện triệu chứng vàng gân lá và âm tính với phản ứng RT-PCR. Điều này chứng tỏ rằng các 352bp M 1 47 triệu chứng vàng gân lá đã nêu ở mục 4.1 là các triệu chứng đặc trƣng cho bệnh vàng gân lá do ScYLV gây ra. Hình 4.9. Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR (Giếng 1: K84-200; giếng 2: R570; giếng 3: Comus; giếng 4: RB72454; giếng 5: ROC16; giếng 6: ROC26; giếng 7: C2217; giếng 8: DLM24; giếng 9: Ja6420; M: thang chuẩn kích thƣớc 1kb). Các giống âm tính có thể mang đặc tính kháng với ScYLV hoặc có thể là chƣa nhiễm với ScYLV tại thời điểm đƣợc kiểm tra. Khả năng các giống này chƣa nhiễm là rất thấp vì các giống này đƣợc trồng cạnh các giống đang nhiễm nên chúng dễ dàng bị nhiễm. Song khi đƣợc kiểm tra kết quả đều âm tính với các mẫu này. Điều này cho thấy có thể giả thiết các giống này mang đặc tính kháng là nhiều hơn. Kết quả RT-PCR này cũng là một trong những bằng chứng đầu tiên về mặt phân tử chứng tỏ ScYLV đã hiện diện tại Việt Nam. 352 bp 1 2 3 4 5 M 6 7 8 9 48 PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Tỷ lệ nhiễm bệnh vàng gân lá theo giai đoạn sinh trƣởng: Đẻ nhánh 32,89% Đầu vƣơn lóng 35,00% Giữa vƣơn lóng 66,67% Thu hoạch 77,50% Tỷ lệ nhiễm bệnh vàng gân lá theo nguồn gốc giống: Thái Lan 42,55% Ấn Độ 50,00% Việt Nam 78,57% Braxin 0,00% Cuba 25,53% Pháp 100,00% Australia 0,00% Hawaii 40,00% Việt Nam gốc Mỹ 100,00% Đài Loan 61,90% Tỷ lệ nhiễm bệnh vàng gân lá theo địa phƣơng: Giống mới nhập từ Thái Lan 25,00% An Phú 58,33% Tập đoàn giống gốc 29,03% Tân An 66,67% Mỹ Thạnh 77,50% Phú Lý 35,56% Kính hiển vi huỳnh quang có thể phát hiện những bó mạch libe bị tấn công bởi virus khi chúng bị kích thích bởi ánh sáng xanh (blue) ở bƣớc sóng 510nm. Có thể sử dụng kính hiển vi huỳnh quang để chẩn đoán sự nhiễm của virus. Qui trình RT-PCR chúng tôi thực hiện là qui trình có thể đƣợc sử dụng để kiểm tra sự hiện diện của virus ScYLV. 49 Kết quả RT-PCR cho thấy các giống K84-200, ROC16, R570, DLM24 đều nhiễm với ScYLV. Các giống Comus, ROC26, C2217, Ja6420, RB72454 không phát hiện có nhiễm virus. Đây là bằng chứng đầu tiên về mặt phân tử chứng tỏ đã có sự hiện diện tại Việt Nam. 5.2 Đề nghị Đánh giá sự hiện diện của ScYLV ở diện rộng hơn bằng các kỹ thuật RT-PCR TBIA hoặc ELISA. Áp dụng qui trình RT-PCR chúng tôi thực hiện để chẩn đoán ScYLV. Nghiên cứu về hợp chất phenol có khả năng phát huỳnh quang tích tụ trong bó mạch libe của cây khi bị virus tấn công. Nghiên cứu sâu hơn về các giống chƣa phát hiện bệnh để tìm tính kháng. Giải trình tự sản phẩm RT-PCR để khẳng định và so sánh trình tự gene của ScYLV ở Việt Nam với nƣớc khác. 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 1. Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang, 2004. Di truyền phân tử. Nhà xuất bản Nông Nghiệp Tp HCM. Trang 270-282. 2. Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng, 1998. Sinh học phân tử. Nhà xuất bản giáo dục. Trang 190-204. 3. Trần Kim Đồng, Nguyễn Quang Phổ, Lê Thị Hoa, 1991. Giáo trình sinh lý cây trồng. Nhà xuất bản đại học và giáo dục chuyên nghiệp, Hà Nội, 1991. Trang 190- 204. 4. Nguyễn Thị Lang, Bùi Chí Bửu, 2005. Sinh học phân tử giới thiệu phương pháp và ứng dụng. Nhà xuất bản Nông Nghiệp tp HCM. Trang 87-96, 107-119. 5. Nguyễn Thị Lang, 2002. Phương pháp cơ bản trong nghiên cứu công nghệ sinh học. Nhà xuất bản Nông Nghiệp Tp HCM. Trang 38-46, 114-130, 160-166. 6. Vũ Triệu Mân, 2003. Chẩn đoán nhanh bệnh hại thực vật. Nhà xuất bản Nông Nghiệp Hà Nội. Trang 37-43, 56-95. 7. Vũ Triệu Mân, Lê Lƣơng Tề, 1998. Giáo trình bệnh cây nông nghiệp. Nhà xuất bản Nông Nghiệp Hà Nội. Trang 17-21, 220-232. 8. Trần Văn Sỏi, 2003. Cây mía. Nhà xuất bản Nghệ An. Trang 7-26. 9. Hà Đình Tuấn, 2004. Điều tra thành phần bệnh hại mía trên một số giống mía mới nhập nội và khảo sát diễn biến bệnh hại quan trọng ở vùng mía nguyên liệu miền Đông Nam Bộ. Luận văn thạc sĩ ngành nông học đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh. TÀI LIỆU TIẾNG NƢỚC NGOÀI 10. Ahmad Y Abu, M Royer, L Costet, J-H Daugrois, J-M Lett, J.I Victoria and P Rott, 2006. Genotyping of Sugarcane yellow leaf virus in Colombia, Guadeloupe and Reunion. VIIIth ISSCT Pathology Workshop Petit-Bourg, Guadeloupe (FWI) 23 - 27 January 2006 Programme and Abstracts. 11. Henrik H Albert, Tichaona Mangwende, Ming-Li Wang, T. Erik Mirkov, 2003. Functional Analysis Of The P0 Protein Of Sugarcane Yellow Leaf Virus: A Suppressor Of Posttranscriptional Gene Silencing. Plant & Animal Genomes XIV Conference. Workshop: Intl. Consortium for Sugarcane Biotech. (ICSB) January 14-18, 2006. Town & Country Convention Center, San Diego, CA. 51 12. S. M. Aljanabi, Y. Parmessur, Y. Moutia, S. Saumtally and A. Dookun, 2001. Further evidence of the association of a phytoplasma and a virus with yellow leaf syndrome in sugarcane. Plant Pathology 50, p 628±636. 13. Angel S. J.C, Guzmán R. M. L, Angel S. F, Victoria K. J. I, 2006. Studies on the Sugarcane yellow leaf virus (SCYLV) in Colombia. VIIIth ISSCT Pathology Workshop Petit-Bourg, Guadeloupe (FWI) 23 - 27 January 2006 Programme and Abstracts. 14. Kathryn S. Braithwaite, 2003. New virus and virus – like diseases of sugarcane – an overview. Sugarcane pathology. Volume II: virus and phytoplasma diseases. Sugarcane Pathology: Virus and Phytoplasma Diseases v. 2 (G.P. b, R.E. Ford, M.Tǒsic and D.S. Teakle). Science Publishers, Inc: p 3-24. 15. Chatenet M., Delage C.,. Ripolles M, Irey M., Lockhart B. E. L, and Rott P., 2001. Detection of Sugarcane yellow leaf virus in quarantine and production of virus-free sugarcane by apical meristem culture. Plant Dis. 85: p1177-1180. 16. Comstock J. C. and. Gilbert R. A. Sugarcane Yellow Leaf Disease. University of Florida, IFAS extension. SS-AGR-256. 17. Comstock J. C. and Miller J. D., 2003. Incidence and spread of sugarcane yellow leaf virus in sugarcane clones in the cp-cultivar development program at Canal Point. Journal American Society of Sugarcane Technologists, Vol. 23, 2003, p71- 78. 18. Comstock J. C., Sood S., and McCorkle K., 2005. Characterization of Sugarcane Populations for Disease Reactions for Use in Molecular Marker Research. Agricultural absracts 2005 annual meeting. Journal American Society Sugar Cane Technologists, Vol. 25, 2005. [Abstracts]. 19. Comstock Jack C., Chaparro Jose X., Tai Peter Y. P., Serge Edme, Katherine McCorkle, Jim D. Miller, 2004. The Association Of Microsatellite Markers With Resistance To Sugarcane Yellow Leaf Virus. Workshop: Intl. Consortium for Sugarcane Biotech (ICSB). Plant & Animal Genomes XII Conference January 10- 14, 2004. Town & Country Convention Center San Diego, CA. 20. Cronjé C.P.R., 2004. Sugarcane viruses in sub-Saharan Africa. Plant virology in sub-Saharan Africa, p 492-497. 21. Cu Ramon, Manjunath K. L.,. Petersen Y,. Hiebert E and Davis M. J., 2004. Development of a Serological Diagnostic Probe to Detect the Sugarcane Yellow Leaf Luteovirus (SCYLV) Using Phage Display Technology. Journal American Society Sugar Cane Technologists, Vol. 24, 2004. [Abstracts]. 52 22. Edon Carine, Vaillant Jean, Sauvion Nicolas and Daugrois J.H., 2006. Spatiotemporal evolution of plant infection by SCYLV in a disease free plot. Toward modeling virus spread in tropical conditions. VIIIth ISSCT Pathology Workshop Petit-Bourg, Guadeloupe (FWI) 23 - 27 January 2006 Programme and Abstracts. 23. Garcés Freddy, Reyna Medina and Eloy Orellana, 2006. Transmission of Sugarcane yellow leaf virus and Sugarcane mosaic virus in Ecuador. VIIIth ISSCT Pathology Workshop Petit-Bourg, Guadeloupe (FWI) 23 - 27 January 2006 Programme and Abstracts. 24. Gaur R.K., Rao G.P., Maneesha Singh and Axel T. Lehrer, 2003. Sequence analysis of the entire RNA genome of sugarcane yellow leaf luteovirus of an Indian isolate BSPP Presidential Meeting 2003 (15 th – 18th December 2003) Plant Pathogen Genomics - From Sequence To Application Jubilee Campus, University of Nottingham, UK. 25. Goldstein C., Wang M-L. and Albert H., 2002. Production of recombinant protein in sugarcane and rice. Hawaii Agriculture Research center Annual report 2001- 2002. p10-11. 26. M.C. Gonçalves, M.M. Klerks,, M. Verbeek, J.Vega and J.F.J.M. van den Heuvel, 2002. The use of molecular beacons combined with NASBA for the sensitive detection of Sugarcane yellow leaf virus. European Journal of Plant Pathology 108: p401–407, 2002. Kluwer Academic Publishers. Printed in the Netherlands. 27. Lockhart Ben E., Cronjié C. Pieter R., Rott P., Bailey Roger A., Comstock Jack C., Barry J. Croft, A. Salem Saumtally, 2000. Yellow leaf syndrome. A guide to sugarcane diseases. CIRAD/ISSCT 28. McAllister C. D., Hoy J. W., and Reagan T. E., 2006. Temporal increase and spatial distribution of yellow leaf and sugarcane aphid infestations VIIIth ISSCT Pathology Workshop Petit-Bourg, Guadeloupe (FWI) 23 - 27 January 2006 Programme and Abstracts. 29. Moonan F., Molina J., and Mirkov T. E., 2000. Sugarcane yellow leaf virus: An emerging virus that has evolved by recombination between luteoviral and poleroviral ancestors. Virology 269: p156-171. Academic Press. 30. Parmessur Y., Aljanabi S., Saumtally S. and Dookun-Saumtally A., 2002. Sugarcane yellow leaf virus and sugarcane yellows phytoplasma: elimination by tissue culture. Plant Pathology. Volume 51 Page 561-566. 31. M. Paola Rangel, Lorena Gomez, Jorge I. Victoria, Fernando Angel, 2005. Transgenic plants of CC 84-75 resistant to the virus associated with the sugarcane yellow leaf disease. Silver jubilee congress Guatemala january 30 - february 4, 2005 abstracts of papers. International Society of Sugar Cane Technology. 53 32. Rassabya L.,. Girard J.-C, Lemaire O., Costet L., Irey M. S., Kodja H.,. Lockhart B. E. L and Rott P., 2004. Spread of Sugarcane yellow leaf virus in sugarcane plants and fields on the island of Réunion. Plant Pathology. Volume 53 Page 117-125. 1. Sambrook J. and Russell D. W, 2001. Molecular Cloning- A laboratory manual. Volume 1. Third edition. CSHL Press, New York. p 7.1 – 7.88. 33. Scagliusi Sandra Mansur and Lockhart B. E. L., 2000. Transmission, characterization, and serology of a luteovirus associated with yellow leaf syndrome of sugarcane. Phytopathology 90: p120-124. 34. Schenck S., Lehrer A.T., Wu K.K., 2001. Yellow Leaf Syndrome. Hawaii Agriculture Research Center, Pathology Report 68 February 2001. 35. Schenck Susan, 2001. Sugarcane yellow leaf syndrome: History and current concepts. Sugarcane pathology. Volume II: virus and phytoplasma diseases. Sugarcane Pathology: Virus and Phytoplasma Diseases v. 2 (G.P. Rao, R.E. Ford, M.Tǒsic and D.S. Teakle). Science Publishers, Inc: p24-35. 36. Smith Grant R., Borg Zara, Lockhart Ben E. L., Braithwaite Kathryn S. and Gibbs Mark J., 2000. Sugarcane yellow leaf virus: a novel member of the Luteoviridae that probably arose by inter-species recombination. Journal of General Virology (2000), 81, p1865–1869. Printed in Great Britain. 37. Vega J., Scagliusi S. M. M., Ulian E. C, 1997. Sugarcane yellow leaf disease in Brazil: evidence of the association with a luteovirus. Plant Disease Vol 81No. 1 p21 - 26. 38. Viswanathan R and Balamuralikrishnan M, 2004. Detection of sugarcane yellow leaf virus, the causal agent of yellow leaf syndrome in sugarcane by DAS-ELISA. Archives of Phytopathology and Plant Protection. Volume 37, Number 3 / August 2004, p169 – 176. Publisher: Taylor & Francis. [Abstract]. 39. Wang M-L., Schenck S. and Albert H., 2006. Antibody to a short peptide sequence detected Sugarcane yellow leaf virus isolates from several sources. VIIIth ISSCT Pathology Workshop Petit-Bourg, Guadeloupe (FWI) 23 - 27 January 2006 Programme and Abstracts. 40. Wang M-L., Ancheta S., Clayton J., Goldstein C. and Albert H., 2003. Production of a biologically active pharmaceutical protein in sugarcane and rice. Hawaii Agriculture Research center Annual report 2003. p.12. 41. Zhu Y. J., Osterman G., Moritomo C., McCafferty H., Agabayani R., Lehrer A., Schenck S. and Moore P., 2003. Developing Transgenic Sugarcane for ScYLV Resistance. Hawaii Agriculture Research center Annual report 2003. p. 9. 54 ĐỊA CHỈ TRÊN WEB 42. www.ento.csiro.au 43. www.ento.okstate.edu 44. www.ipgri.cgiar.org/Publications/pdf/818.pdf 45. www.ipgri.cgiar.org/Publications/pdf/336.pdf 46. %20June%2003.pdf 47. 48. 49. 50. 51. http//:ipm_ncsu_edu-AG295-pics-corn_leaf_aphid_gif.htm 1 PHỤ LỤC Phụ lục 1 : Danh sách các giống điều tra Kí hiệu Giống Triệu chứng (YLS) RT- PCR Sự phát huỳnh quang Nguồn gốc Tuổi TL1 KU00-15-8 - -- - Thái Lan Đầu vƣơn lóng TL2 KU00-1-92 + -- - Thái Lan Đầu vƣơn lóng TL3 K92-51-56 - -- - Thái Lan Đầu vƣơn lóng TL4 K95-1-61 + -- + Thái Lan Đầu vƣơn lóng TL5 Uthong94- 2483 - -- - Thái Lan Đầu vƣơn lóng TL6 K95-1-56 + -- + Thái Lan Đầu vƣơn lóng TL7 KU98-009 - -- - Thái Lan Đầu vƣơn lóng TL8 K90-50 + -- + Thái Lan Đầu vƣơn lóng TL9 Uthong483 - -- - Thái Lan Đầu vƣơn lóng TL10 Uthong60-1 - -- - Thái Lan Đầu vƣơn lóng TL11 Uthong2 + -- + Thái Lan Đầu vƣơn lóng TL12 KU60-2 + -- + Thái Lan Đầu vƣơn lóng TL13 K95-84 - -- - Thái Lan Đầu vƣơn lóng TL14 KU00-1-61 - -- - Thái Lan Đầu vƣơn lóng TL15 K93-236 - -- - Thái Lan Đầu vƣơn lóng TL16 Uthong3 - -- - Thái Lan Đầu vƣơn lóng TL17 K84-92 - -- - Thái Lan Đầu vƣơn lóng TL18 LK11 - -- - Thái Lan Đầu vƣơn lóng TL19 KU207 - -- - Thái Lan Đầu vƣơn lóng TL20 K9087 - -- - Thái Lan Đầu vƣơn lóng TL21 K93-219 - -- - Thái Lan Đầu vƣơn lóng TL22 K95-32 - -- - Thái Lan Đầu vƣơn lóng TL23 K88-200 - -- - Thái Lan Đầu vƣơn lóng TL24 K9045 - -- - Thái Lan Đầu vƣơn lóng TL25 K95238 - -- - Thái Lan Đầu vƣơn lóng TL26 KU603 + -- + Thái Lan Đầu vƣơn lóng TL27 Uthong95156 - -- - Thái Lan Đầu vƣơn lóng TL28 K8865 - -- - Thái Lan Đầu vƣơn lóng VSX1 K84-200 + -- + Thái Lan Đầu vƣơn lóng VSX2 Co62170 + -- + Ấn Độ Đầu vƣơn lóng VSX3 ROC26 - - - Ấn Độ Đầu vƣơn lóng VSX4 DLM24 + + + gốc Mỹ Đầu vƣơn lóng VSX5 VN844137 - -- - Việt Nam Đầu vƣơn lóng VSX6 VN841427 - -- - Việt Nam Đầu vƣơn lóng 2 VSX7 VN84422 + -- + Việt Nam Đầu vƣơn lóng VSX8 K84-200 + + + Thái Lan Đầu vƣơn lóng VSX9 RB72454 - - - Braxin Đầu vƣơn lóng VSX10 K8865 + -- + Thái Lan Đầu vƣơn lóng VSX11 My55-14 - -- - Cuba Đầu vƣơn lóng VSX12 K8865 + -- + Thái Lan Đầu vƣơn lóng G1 C876 - -- - Cuba Đẻ nhánh G2 C2217 - - - Cuba Đẻ nhánh G3 C8651 - -- - Cuba Đẻ nhánh G4 C8756 - -- - Cuba Đẻ nhánh G5 C14148 - -- - Cuba Đẻ nhánh G6 C14262 - -- - Cuba Đẻ nhánh G7 C17272 - -- - Cuba Đẻ nhánh G8 C18768 - -- - Cuba Đẻ nhánh G9 C20859 - -- - Cuba Đẻ nhánh G10 C23651 - -- - Cuba Đẻ nhánh G11 C28863 - -- - Cuba Đẻ nhánh G12 C29073 - -- - Cuba Đẻ nhánh G13 C32368 + -- - Cuba Đẻ nhánh G14 C33464 - -- - Cuba Đẻ nhánh G15 C37472 + -- - Cuba Đẻ nhánh G16 C69347 + -- + Cuba Đẻ nhánh G17 C81967 - -- - Cuba Đẻ nhánh G18 C6675 - -- - Cuba Đẻ nhánh G19 C306275 - -- - Cuba Đẻ nhánh G20 My645 + -- - Cuba Đẻ nhánh G21 My5369 - -- - Cuba Đẻ nhánh G22 MY5464 + -- - Cuba Đẻ nhánh G23 MY5465 + -- - Cuba Đẻ nhánh G24 My5715 - -- - Cuba Đẻ nhánh G25 My53174 - -- - Cuba Đẻ nhánh G26 My54129 - -- - Cuba Đẻ nhánh G27 Ja605 - -- - Cuba Đẻ nhánh G28 Ja6411 + -- - Cuba Đẻ nhánh G29 Ja6416 + -- - Cuba Đẻ nhánh G30 Ja6419 + -- - Cuba Đẻ nhánh G31 Ja6420 - - - Cuba Đẻ nhánh BD1 R570 + + + Pháp Giữa vƣơn lóng BD2 R570 + -- + Pháp Giữa vƣơn lóng BD3 ROC16 + -- + Đài Loan Giữa vƣơn lóng BD4 ROC16 + + + Đài Loan Giữa vƣơn lóng BD5 ROC16 + -- + Đài Loan Giữa vƣơn lóng 3 BD6 ROC16 + -- + Đài Loan Giữa vƣơn lóng BD7 ROC16 + -- + Đài Loan Giữa vƣơn lóng BD8 ROC16 + -- + Đài Loan Giữa vƣơn lóng BD9 Commus + - + Australia Giữa vƣơn lóng BD10 Commus - -- - Australia Giữa vƣơn lóng BD11 Commus - -- - Australia Giữa vƣơn lóng BD12 Commus - -- - Australia Giữa vƣơn lóng LA1 K84-200 + -- + Thái Lan Thu hoạch LA2 K84-200 + -- + Thái Lan Thu hoạch LA3 K84-200 - -- - Thái Lan Thu hoạch LA4 K84-200 + -- + Thái Lan Thu hoạch LA5 K84-200 + -- + Thái Lan Thu hoạch LA6 K84-200 - -- - Thái Lan Thu hoạch LA7 K84-200 - -- - Thái Lan Thu hoạch LA8 K84-200 - -- - Thái Lan Thu hoạch LA9 K84-200 + -- + Thái Lan Thu hoạch LA10 K84-200 + -- + Thái Lan Thu hoạch LA11 K84-200 + -- + Thái Lan Thu hoạch LA12 K84-200 - -- - Thái Lan Thu hoạch LA13 K84-200 + -- + Thái Lan Thu hoạch LA14 K84-200 + -- + Thái Lan Thu hoạch LA15 K84-200 + -- + Thái Lan Thu hoạch LA16 VN84-422 + -- + Việt Nam Thu hoạch LA17 VN84-422 + -- + Việt Nam Thu hoạch LA18 VN84-422 + -- + Việt Nam Thu hoạch LA19 VN84-422 + -- + Việt Nam Thu hoạch LA20 VN84-422 + -- + Việt Nam Thu hoạch LA21 VN84-422 + -- + Việt Nam Thu hoạch LA22 VN84-422 - -- - Việt Nam Thu hoạch LA23 VN84-422 - -- - Việt Nam Thu hoạch LA24 VN84-422 + -- + Việt Nam Thu hoạch LA25 VN84-422 - -- - Việt Nam Thu hoạch LA26 VN84-422 + -- + Việt Nam Thu hoạch LA27 VN84-422 + -- + Việt Nam Thu hoạch LA28 VN84-422 + -- + Việt Nam Thu hoạch LA29 VN84-422 + -- + Việt Nam Thu hoạch LA30 VN84-422 - -- - Việt Nam Thu hoạch LA31 VN84-422 + -- + Việt Nam Thu hoạch LA32 VN84-422 + -- + Việt Nam Thu hoạch LA33 VN84-422 + -- + Việt Nam Thu hoạch LA34 VN84-422 + -- + Việt Nam Thu hoạch LA35 VN84-422 + -- + Việt Nam Thu hoạch 4 LA36 VN84-422 + -- + Việt Nam Thu hoạch LA37 VN84-422 + -- + Việt Nam Thu hoạch LA38 VN84-422 + -- + Việt Nam Thu hoạch LA39 VN84-422 + -- + Việt Nam Thu hoạch LA40 VN84-422 + -- + Việt Nam Thu hoạch DN1 My55-14 + -- + Cuba Đẻ nhánh DN2 My55-14 + -- + Cuba Đẻ nhánh DN3 My55-14 - -- - Cuba Đẻ nhánh DN4 My55-14 - -- - Cuba Đẻ nhánh DN5 My55-14 - -- - Cuba Đẻ nhánh DN6 My55-14 - -- - Cuba Đẻ nhánh DN7 My55-14 - -- - Cuba Đẻ nhánh DN8 My55-14 - -- - Cuba Đẻ nhánh DN9 My55-14 - -- - Cuba Đẻ nhánh DN10 My55-14 - -- - Cuba Đẻ nhánh DN11 My55-14 - -- - Cuba Đẻ nhánh DN12 My55-14 - -- - Cuba Đẻ nhánh DN13 My55-14 + -- + Cuba Đẻ nhánh DN14 My55-14 - -- - Cuba Đẻ nhánh DN15 My55-14 - -- - Cuba Đẻ nhánh DN16 H39-3633 + -- + Hawaii Đẻ nhánh DN17 H39-3633 - -- - Hawaii Đẻ nhánh DN18 H39-3633 - -- - Hawaii Đẻ nhánh DN19 H39-3633 - -- - Hawaii Đẻ nhánh DN20 H39-3633 - -- - Hawaii Đẻ nhánh DN21 H39-3633 + -- + Hawaii Đẻ nhánh DN22 H39-3633 - -- - Hawaii Đẻ nhánh DN23 H39-3633 - -- - Hawaii Đẻ nhánh DN24 H39-3633 + -- + Hawaii Đẻ nhánh DN25 H39-3633 - -- - Hawaii Đẻ nhánh DN26 H39-3633 + -- + Hawaii Đẻ nhánh DN27 H39-3633 - -- - Hawaii Đẻ nhánh DN28 H39-3633 + -- + Hawaii Đẻ nhánh DN29 H39-3633 + -- + Hawaii Đẻ nhánh DN30 H39-3633 - -- - Hawaii Đẻ nhánh DN31 ROC16 - -- - Đài Loan Đẻ nhánh DN32 ROC16 - -- - Đài Loan Đẻ nhánh DN33 ROC16 - -- - Đài Loan Đẻ nhánh DN34 ROC16 + -- + Đài Loan Đẻ nhánh DN35 ROC16 - -- - Đài Loan Đẻ nhánh DN36 ROC16 + -- + Đài Loan Đẻ nhánh DN37 ROC16 + -- + Đài Loan Đẻ nhánh 5 DN38 ROC16 - -- - Đài Loan Đẻ nhánh DN39 ROC16 - -- - Đài Loan Đẻ nhánh DN40 ROC16 - -- - Đài Loan Đẻ nhánh DN41 ROC16 + -- + Đài Loan Đẻ nhánh DN42 ROC16 + -- + Đài Loan Đẻ nhánh DN43 ROC16 + -- + Đài Loan Đẻ nhánh DN44 ROC16 + -- + Đài Loan Đẻ nhánh DN45 ROC16 - -- - Đài Loan Đẻ nhánh Kí hiệu Giống Triệu chứng (YLS) RT- PCR Sự phát huỳnh quang Nguồn gốc Tuổi TL1 KU00-15-8 - -- - Thái Lan Đầu vƣơn lóng TL2 KU00-1-92 + -- - Thái Lan Đầu vƣơn lóng TL3 K92-51-56 - -- - Thái Lan Đầu vƣơn lóng TL4 K95-1-61 + -- + Thái Lan Đầu vƣơn lóng TL5 Uthong94- 2483 - -- - Thái Lan Đầu vƣơn lóng TL6 K95-1-56 + -- + Thái Lan Đầu vƣơn lóng TL7 KU98-009 - -- - Thái Lan Đầu vƣơn lóng TL8 K90-50 + -- + Thái Lan Đầu vƣơn lóng TL9 Uthong483 - -- - Thái Lan Đầu vƣơn lóng TL10 Uthong60-1 - -- - Thái Lan Đầu vƣơn lóng TL11 Uthong2 + -- + Thái Lan Đầu vƣơn lóng TL12 KU60-2 + -- + Thái Lan Đầu vƣơn lóng TL13 K95-84 - -- - Thái Lan Đầu vƣơn lóng TL14 KU00-1-61 - -- - Thái Lan Đầu vƣơn lóng TL15 K93-236 - -- - Thái Lan Đầu vƣơn lóng TL16 Uthong3 - -- - Thái Lan Đầu vƣơn lóng TL17 K84-92 - -- - Thái Lan Đầu vƣơn lóng TL18 LK11 - -- - Thái Lan Đầu vƣơn lóng TL19 KU207 - -- - Thái Lan Đầu vƣơn lóng TL20 K9087 - -- - Thái Lan Đầu vƣơn lóng TL21 K93-219 - -- - Thái Lan Đầu vƣơn lóng TL22 K95-32 - -- - Thái Lan Đầu vƣơn lóng TL23 K88-200 - -- - Thái Lan Đầu vƣơn lóng TL24 K9045 - -- - Thái Lan Đầu vƣơn lóng TL25 K95238 - -- - Thái Lan Đầu vƣơn lóng 6 TL26 KU603 + -- + Thái Lan Đầu vƣơn lóng TL27 Uthong95156 - -- - Thái Lan Đầu vƣơn lóng TL28 K8865 - -- - Thái Lan Đầu vƣơn lóng VSX1 K84-200 + -- + Thái Lan Đầu vƣơn lóng VSX2 Co62170 + -- + Ấn Độ Đầu vƣơn lóng VSX3 ROC26 - - - Ấn Độ Đầu vƣơn lóng VSX4 DLM24 + + + gốc Mỹ Đầu vƣơn lóng VSX5 VN844137 - -- - Việt Nam Đầu vƣơn lóng VSX6 VN841427 - -- - Việt Nam Đầu vƣơn lóng VSX7 VN84422 + -- + Việt Nam Đầu vƣơn lóng VSX8 K84-200 + + + Thái Lan Đầu vƣơn lóng VSX9 RB72454 - - - Braxin Đầu vƣơn lóng VSX10 K8865 + -- + Thái Lan Đầu vƣơn lóng VSX11 My55-14 - -- - Cuba Đầu vƣơn lóng VSX12 K8865 + -- + Thái Lan Đầu vƣơn lóng G1 C876 - -- - Cuba Đẻ nhánh G2 C2217 - - - Cuba Đẻ nhánh G3 C8651 - -- - Cuba Đẻ nhánh G4 C8756 - -- - Cuba Đẻ nhánh G5 C14148 - -- - Cuba Đẻ nhánh G6 C14262 - -- - Cuba Đẻ nhánh G7 C17272 - -- - Cuba Đẻ nhánh G8 C18768 - -- - Cuba Đẻ nhánh G9 C20859 - -- - Cuba Đẻ nhánh G10 C23651 - -- - Cuba Đẻ nhánh G11 C28863 - -- - Cuba Đẻ nhánh G12 C29073 - -- - Cuba Đẻ nhánh G13 C32368 + -- - Cuba Đẻ nhánh G14 C33464 - -- - Cuba Đẻ nhánh G15 C37472 + -- - Cuba Đẻ nhánh G16 C69347 + -- + Cuba Đẻ nhánh G17 C81967 - -- - Cuba Đẻ nhánh G18 C6675 - -- - Cuba Đẻ nhánh G19 C306275 - -- - Cuba Đẻ nhánh G20 My645 + -- - Cuba Đẻ nhánh G21 My5369 - -- - Cuba Đẻ nhánh G22 MY5464 + -- - Cuba Đẻ nhánh G23 MY5465 + -- - Cuba Đẻ nhánh G24 My5715 - -- - Cuba Đẻ nhánh G25 My53174 - -- - Cuba Đẻ nhánh G26 My54129 - -- - Cuba Đẻ nhánh G27 Ja605 - -- - Cuba Đẻ nhánh 7 G28 Ja6411 + -- - Cuba Đẻ nhánh G29 Ja6416 + -- - Cuba Đẻ nhánh G30 Ja6419 + -- - Cuba Đẻ nhánh G31 Ja6420 - - - Cuba Đẻ nhánh BD1 R570 + + + Pháp Giữa vƣơn lóng BD2 R570 + -- + Pháp Giữa vƣơn lóng BD3 ROC16 + -- + Đài Loan Giữa vƣơn lóng BD4 ROC16 + + + Đài Loan Giữa vƣơn lóng BD5 ROC16 + -- + Đài Loan Giữa vƣơn lóng BD6 ROC16 + -- + Đài Loan Giữa vƣơn lóng BD7 ROC16 + -- + Đài Loan Giữa vƣơn lóng BD8 ROC16 + -- + Đài Loan Giữa vƣơn lóng BD9 Commus + - + Australia Giữa vƣơn lóng BD10 Commus - -- - Australia Giữa vƣơn lóng BD11 Commus - -- - Australia Giữa vƣơn lóng BD12 Commus - -- - Australia Giữa vƣơn lóng LA1 K84-200 + -- + Thái Lan Thu hoạch LA2 K84-200 + -- + Thái Lan Thu hoạch LA3 K84-200 - -- - Thái Lan Thu hoạch LA4 K84-200 + -- + Thái Lan Thu hoạch LA5 K84-200 + -- + Thái Lan Thu hoạch LA6 K84-200 - -- - Thái Lan Thu hoạch LA7 K84-200 - -- - Thái Lan Thu hoạch LA8 K84-200 - -- - Thái Lan Thu hoạch LA9 K84-200 + -- + Thái Lan Thu hoạch LA10 K84-200 + -- + Thái Lan Thu hoạch LA11 K84-200 + -- + Thái Lan Thu hoạch LA12 K84-200 - -- - Thái Lan Thu hoạch LA13 K84-200 + -- + Thái Lan Thu hoạch LA14 K84-200 + -- + Thái Lan Thu hoạch LA15 K84-200 + -- + Thái Lan Thu hoạch LA16 VN84-422 + -- + Việt Nam Thu hoạch LA17 VN84-422 + -- + Việt Nam Thu hoạch LA18 VN84-422 + -- + Việt Nam Thu hoạch LA19 VN84-422 + -- + Việt Nam Thu hoạch LA20 VN84-422 + -- + Việt Nam Thu hoạch LA21 VN84-422 + -- + Việt Nam Thu hoạch LA22 VN84-422 - -- - Việt Nam Thu hoạch LA23 VN84-422 - -- - Việt Nam Thu hoạch LA24 VN84-422 + -- + Việt Nam Thu hoạch LA25 VN84-422 - -- - Việt Nam Thu hoạch LA26 VN84-422 + -- + Việt Nam Thu hoạch 8 LA27 VN84-422 + -- + Việt Nam Thu hoạch LA28 VN84-422 + -- + Việt Nam Thu hoạch LA29 VN84-422 + -- + Việt Nam Thu hoạch LA30 VN84-422 - -- - Việt Nam Thu hoạch LA31 VN84-422 + -- + Việt Nam Thu hoạch LA32 VN84-422 + -- + Việt Nam Thu hoạch LA33 VN84-422 + -- + Việt Nam Thu hoạch LA34 VN84-422 + -- + Việt Nam Thu hoạch LA35 VN84-422 + -- + Việt Nam Thu hoạch LA36 VN84-422 + -- + Việt Nam Thu hoạch LA37 VN84-422 + -- + Việt Nam Thu hoạch LA38 VN84-422 + -- + Việt Nam Thu hoạch LA39 VN84-422 + -- + Việt Nam Thu hoạch LA40 VN84-422 + -- + Việt Nam Thu hoạch DN1 My55-14 + -- + Cuba Đẻ nhánh DN2 My55-14 + -- + Cuba Đẻ nhánh DN3 My55-14 - -- - Cuba Đẻ nhánh DN4 My55-14 - -- - Cuba Đẻ nhánh DN5 My55-14 - -- - Cuba Đẻ nhánh DN6 My55-14 - -- - Cuba Đẻ nhánh DN7 My55-14 - -- - Cuba Đẻ nhánh DN8 My55-14 - -- - Cuba Đẻ nhánh DN9 My55-14 - -- - Cuba Đẻ nhánh DN10 My55-14 - -- - Cuba Đẻ nhánh DN11 My55-14 - -- - Cuba Đẻ nhánh DN12 My55-14 - -- - Cuba Đẻ nhánh DN13 My55-14 + -- + Cuba Đẻ nhánh DN14 My55-14 - -- - Cuba Đẻ nhánh DN15 My55-14 - -- - Cuba Đẻ nhánh DN16 H39-3633 + -- + Hawaii Đẻ nhánh DN17 H39-3633 - -- - Hawaii Đẻ nhánh DN18 H39-3633 - -- - Hawaii Đẻ nhánh DN19 H39-3633 - -- - Hawaii Đẻ nhánh DN20 H39-3633 - -- - Hawaii Đẻ nhánh DN21 H39-3633 + -- + Hawaii Đẻ nhánh DN22 H39-3633 - -- - Hawaii Đẻ nhánh DN23 H39-3633 - -- - Hawaii Đẻ nhánh DN24 H39-3633 + -- + Hawaii Đẻ nhánh DN25 H39-3633 - -- - Hawaii Đẻ nhánh DN26 H39-3633 + -- + Hawaii Đẻ nhánh DN27 H39-3633 - -- - Hawaii Đẻ nhánh DN28 H39-3633 + -- + Hawaii Đẻ nhánh 9 DN29 H39-3633 + -- + Hawaii Đẻ nhánh DN30 H39-3633 - -- - Hawaii Đẻ nhánh DN31 ROC16 - -- - Đài Loan Đẻ nhánh DN32 ROC16 - -- - Đài Loan Đẻ nhánh DN33 ROC16 - -- - Đài Loan Đẻ nhánh DN34 ROC16 + -- + Đài Loan Đẻ nhánh DN35 ROC16 - -- - Đài Loan Đẻ nhánh DN36 ROC16 + -- + Đài Loan Đẻ nhánh DN37 ROC16 + -- + Đài Loan Đẻ nhánh DN38 ROC16 - -- - Đài Loan Đẻ nhánh DN39 ROC16 - -- - Đài Loan Đẻ nhánh DN40 ROC16 - -- - Đài Loan Đẻ nhánh DN41 ROC16 + -- + Đài Loan Đẻ nhánh DN42 ROC16 + -- + Đài Loan Đẻ nhánh DN43 ROC16 + -- + Đài Loan Đẻ nhánh DN44 ROC16 + -- + Đài Loan Đẻ nhánh DN45 ROC16 - -- - Đài Loan Đẻ nhánh Ghi chú: (-): âm tính; (+) dƣơng tính; (--) không khảo sát. Phụ lục 2: PHIẾU ĐIỀU TRA NÔNG DÂN Ngày điều tra…….../03/2006 1. Mã số mẫu:……………………………………… 2. Họ tên chủ ruộng .......................................................................................... 3. Nơi chốn:…….. Ấp:...................................................................................... 4. Giống cây:………………………………………………………………… 5. Giai đoạn sinh trƣởng: …………………………………… 6. Tổng diện tích canh tác: (ha). Số cây:……………… cây 7. Loại đất:…………………………………… 8. Mức độ khô hạn vào mùa khô khô khô vừa rất khô không khô 9. Tƣới tiêu: có không Nguồn nƣớc: nƣớc giếng nƣớc máy 10. Khả năng giữ nƣớc của đất: tốt trung bình kém 11. Kỹ thuật canh tác: + khoảng cách trồng (m): .................................................................. + Vƣờn trồng thuần hay trồng xen Xen với cây gì: ................................................................................. 12. Tình hình sử dụng phân bón: Có không ………………………………………………………………………………… Có sử dụng chất kích thích sinh trƣởng không: có không Loại gì: .............................................................................................. 10 13. Sâu bệnh gây hại trên cây ..………………..........…………………………………………………………… 14. Bệnh có thƣờng xảy ra không?............................................................................. 15. Sử dụng thuốc bảo vệ thực vật: có không …………………………………………………………………………………………. 16. Năng suất:………………………………… 17. Triệu chứng