Luận văn Nghiên cứu thành phần hoá học cây xuyên tâm thảo (canscora lucidissima) họ long đởm (gentianaceae) ở cao bằng

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC CÂY XUYÊN TÂM THẢO (CANSCORA LUCIDISSIMA) HỌ LONG ĐỞM (GENTIANACEAE) Ở CAO BẰNG LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HOÁ HỌC MỞ ĐẦU Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới, gió mùa, mưa thuận, gió hoà nên hệ thực vật rất phong phú và đa dạng với nhiều loài thực vật là những loại dược liệu quí. Từ thời xa xưa, trước khi sự ra đời của thuốc tây cha ông ta đã biết sử dụng nhiều loại cây cỏ trong tự nhiên làm thuốc chữa bệnh, rất nhiều loại bệnh tật đã được chữa khỏi nhờ các loại cây cỏ. N hững thực vật này đóng vai trò hết sức quan trọng trong đời sống hàng ngày của con người. Từ nhiều thế kỷ nay những hợp chất thiên nhiên được phân lập từ cây cỏ đã được ứng dụng rộng rãi trong rất nhiều ngành như ngành công nghiệp, nông nghiệp, chúng được dùng để sản xuất thuốc chữa bệnh, thuốc bảo vệ thực vật, làm nguyên liệu cho ngành công nghiệp thực phẩm và mỹ phẩm . Ngày nay công nghệ tổng hợp hoá dược đã phát triển mạnh mẽ, tạo ra các biệt dược khác nhau sử dụng trong công tác phòng, chữa bệnh. Điều đó đã góp phần làm tăng tuổi thọ con người, nhưng không vì thế mà việc sử dụng các loại cây cỏ trong chữa bệnh giảm đi, mà nhu cầu sử dụng chúng theo cách cổ truyền hay từ các hợp chất nguồn gốc tự nhiên có xu hướng ngày càng tăng đã chiếm một vị trí quan trọng trong nền y học. T rong chúng có chứa những biệt dược rất khó tổng hợp, đã được khoa học hiện đại soi sáng. Mặt khác việc dùng thuốc nam trong chữa bệnh hầu như không gây ra tác dụng phụ. Việc sử dụng các thảo dược dù chỉ là một loại dược liệu nhưng lại là hỗn hợp của nhiều hợp chất khác nhau và trong mọi trường hợp hầu hết đều chưa xác định rõ hoạt chất của từng chất. Vì vậy, những bài thuốc sử dụng thảo dược là đối tượng để cho các nhà khoa học nghiên cứu một cách đầy đủ về bản chất các hoạt chất có trong cây cỏ thiên nhiên. Từ đó định hướng cho việc nghiên cứu, chiết xuất để tìm ra các loại thuốc mới hay bằng con đường tổng hợp để tạo ra những chất có hoạt chất trong việc chữa trị nhiều loại bệnh. Chính vì vậy việc nghiên cứu thành phần hóa học từ những cây cỏ thiên nhiên có một ý nghĩa khoa học và thực tiễn cao. Nghiên cứu cây thuốc giúp cho chúng ta hiểu rõ về thành phần, cấu trúc hóa học, hoạt tính sinh học và tác dụng dược lí của cây thuốc. Trên cơ sở các nghiên cứu đó có thể tạo ra chất mới có hoạt tính sinh học cao có vai trò và là một tiềm năng to lớn trong sự nghiệp bảo vệ sức khoẻ và phòng chống các loại bệnh tật phục vụ cho nhân dân. Cây xuyên tâm thảo có tên khoa học là Canscora lucidissima thuộc họ Long đởm (Gentianaceae) là loại thực vật mọc hoang ở Việt Nam, từ lâu cây đã được sử dụng trong y học dân gian để chữa trị một số bệnh như ho do phế nhiệt, viêm gan, đau ngực, đau dạ dày, thanh nhiệt, đòn ngã ứ máu, chữa bệnh tim. Đây là bài thuốc độc vị khá độc đáo. Mặc dù vậy ở nước ta mới chỉ có một số tài liệu giới thiệu tác dụng của cây xuyên tâm thảo, còn những hiểu biết về thành phần hoá học và những hoạt tính sinh học của chúng hầu như chưa có công trình nào nghiên cứu và thực vật này cũng chưa có tên trong các sách cây thuốc ở Việt Nam. Vì vậy, chúng tôi chọn cây xuyên tâm thảo làm đối tượng nghiên cứu, với mục đích nhằm góp phần làm rõ thêm những hiểu biết về thành phần hoá học cũng như hoạt tính sinh học của cây. Từ đó tạo thuận lợi cho việc sử dụng cây làm dược liệu trong chữa bệnh và làm tăng thêm kho tàng tri thức về cây thuốc cổ truyền Việt Nam với đề tài “Nghiên cứu thành phần hoá học cây xuyên tâm thảo (Canscora lucidissima) họ Long đởm (Gentianaceae) ở Cao Bằng”. MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU . 1 CHưƠNG I: TỔNG QUAN CÁC THỰC VẬT CHI CANSCORA VÀ THÀNH PHẦN HOÁ HỌC CỦA NÓ . 3 1.1. Khái quát vÒ các thực vật chi Canscora . 3 1.2. Đặc điểm sinh trưởng và phát triển của cây xuyên tâm thảo (Canscora lucidissima Hand- Mazz) 4 1.3. Những nghiên cứu hoá thực vật chi canscora 5 1.3.1. Các hợp chất có khung flavonoit . 6 1.3.2. Các hợp chất khung steroit 6 I.3.3. Các hợp chất có khung triterpenoit 8 1.3.4. Các hợp chất khung xanthon . 9 1.3.5. Một số hợp chất khác 14 1.4. Nghiên cứu hoá thực vật loài Canscora lucidissima 15 1.5. Tình hình nghiên cứu ứng dụng các thực vật chi Canscora . 16 1.6. Những nghiên cứu và ứng dụng cây xuyên tâm thảo trong nước 18 CHưƠNG 2: PHẦN THỰC NGHIỆM . 19 2.1. Đối tượng nghiên cứu 19 2.1.1.Thu mẫu cây, xác định tên khoa học và phương pháp xử lý mẫu. 19 2.1.2. Phương pháp phân lập các hợp chất từ các dịch chiết cây xuyên tâm thảo . 20 2.1.3. Phương pháp khảo sát và xác định cấu trúc hoá học các hợp chất 20 2.2. Dụng cụ, hoá chất và thiết bị nghiên cứu . 21 2.2.1. Dụng cụ, hoá chất . 21 2.2.2. Thiết bị nghiên cứu . 22 2.3.1. Thu nhận các dịch chiết 22 2.3.2. Khảo sát định tính các dịch chiết 24 2.3.3. Thử hoạt tính sinh học 27 2.4. Phân lập và tinh chế các chất . 29 2.4.1. Cặn dịch chiết n-hexan của cây xuyên tâm thảo (C. H) . 30 2.4.2. Cặn chiết etylaxetat (CE) 32 CHưƠNG 3: THẢO LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU . 34 3.1. Nguyên tắc chung 34 3.2. Phân tích định tính và phát hiện các nhóm chất trong các dịch chiết khác nhau . 34 3.3. Phân lập và nhận dạng các chất có trong các dịch chiết khác nhau của cây xuyên tâm thảo . 35 3.3.1. Ancol no mạch dài nonacosan-1-ol (CH.1) . 35 3.3.2. β-Sitosterol hay stigmast-5-en-3-ol (C29H50O) (CH.2) 36 3.3.3. 1-Hiđroxy-3,7,8-trimethoxy xanthon (CH.3) 38 3.3.4. 1-Hiđroxy-3,5-đimethoxy xanthon (CH.4) 47 3.3.5. 1,7-Đihiđroxy-3-methoxy xanthon (E1) 52 3.3.6. 1,7-Đihiđroxy-3,6-đimethoxy xanthon (E2) 59 3.4. Thử hoạt tính sinh học . 65 KẾT LUẬN . 66 PHỤ LỤC 72

pdf139 trang | Chia sẻ: banmai | Lượt xem: 2185 | Lượt tải: 4download
Bạn đang xem trước 20 trang tài liệu Luận văn Nghiên cứu thành phần hoá học cây xuyên tâm thảo (canscora lucidissima) họ long đởm (gentianaceae) ở cao bằng, để xem tài liệu hoàn chỉnh bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
ản mỏng hay dùng trong phân tích đều phải sử dụng loại tinh khiết phân tích (PA). Sắc kí cột được tiến hành trên cột với chất hấp phụ silicagel Merck 60 pha thường có cỡ hạt 70 - 230 mesh (0,040 – 0,063 mm) Sắc kí lớp mỏng dùng tấm mỏng đế nhôm DC - Alufolien Kiesegel 60 F254 Art.5554 tráng sẵn, độ dày 0,2mm được sử dụng để xác định sơ bộ số thành phần có trong các dịch chiết, các phân đoạn chạy cột và kiểm tra sơ bộ độ sạch của sản phẩm thu được. Các hệ dung môi triển khai SKLM: STT Hệ dung môi Tỷ lệ thể tích Kí hiệu 1 n-Hexan - EtOAc (9:1) hệ A 2 n-Hexan - EtOAc (4 : 1) hệ B 3 n-Hexan - EtOAc (1 : 1) hệ C 4 Clorofom - MeOH (9 : 1) hệ D 5 Clorofom - MeOH (5 :1) hệ E Các sắc ký lớp mỏng (SKLM) được soi dưới đèn tử ngoại ở bước sóng = 254 nm – 365 nm, phun thuốc thử vanilin 1% - H2SO4 5% trong dung dịch etanol, sấy ở trên 100oC hoặc thử bằng hơi iođ, amoniac, sau đó quan sát màu để phát hiện các hợp chất. Các giá trị Rf trong hệ dung môi triển khai theo biểu thức: Chiều dài di chuyển chất thử Rf = Chiều dài di chuyển của dung môi Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 22 2.2.2. Thiết bị nghiên cứu - Nhiệt độ nóng chảy đo trên kính hiển vi Boetus hoặc trên máy Electrothermal IA-9200 (Viện Hoá học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt nam). - Phổ hồng ngoại ghi trên máy IMPACT - 410 (khoa Hoá trường Đại học sư phạm Thái Nguyên) dưới dạng viên nén KBr. - Phổ 1H-NMR và 13C-NMR ghi trên máy Bruker 500MHz AVANCE, chuẩn nội TMS, dung môi CDCl3, DMSO. - Phổ ESI-MS (Phổ khối với đầu dò MSD (LC-MSD-Trap-SL) sử dụng mode ESI và đầu dò DAD (Viện Khoa học và Công nghệ Việt nam) 2.3. Thu nhận các dịch chiết từ cây xuyên tâm thảo 2.3.1. Thu nhận các dịch chiết Mẫu cây tươi mới thu hái được sấy khô đem nghiền nhỏ rồi ngâm kiệt với metanol ở nhiệt độ phòng cho đến khi nhạt màu. Dịch chiết được cất loại dung môi bằng thiết bị cất quay ở nhiệt độ 50-600C dưới áp suất thấp. Cặn dịch chiết metanol sau khi thêm nước được chiết lần lượt với n-hexan, etylaxetat, n-butanol, metanol. Các dịch chiết phân đoạn, được làm khô bằng Na2SO4 khan, sau đó cất đến hết hoàn toàn dung môi ở áp suất giảm, thu được các cặn chiết tương ứng. Việc thu nhận các dịch chiết và phân lập các chất từ cây xuyên tâm thảo được tiến hành theo sơ đồ 2.1 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 23 Sơ đồ 2.1: Sơ đồ ngâm chiết và phân lập các chất từ cây xuyên tâm thảo ( Canscora lucidissima Hand - Mazz ) Mẫu khô nghiền nhỏ Cặn n- hexan (C.H) Cặn tổng metanol CH.1 Etylaxetat 1. MeOH 2. Cất loại dung môi dưới áp suất giảm + H2O Lắc chiết phân đoạn n-hexan Sắc kí cột Sắc kí cột n-butanol Cặn Etylaxetat (C.E) Cặn n- butanol (C.B) CH.2 CH.3 CH.4 E1 E2 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 24 Các phân đoạn dịch chiết nói trên được làm khan bằng Na2SO4, lọc rồi cất kiệt dung môi bằng thiết bị cất quay ở nhiệt độ 600C dưới áp suất giảm, cặn được sấy khô và cân đến khối lượng không đổi. Như vậy từ cây xuyên tâm thảo sẽ có 3 loại cặn chiết được ký hiệu là: C. H C. E C. B C.H: Cặn chiết n- hexan C.E: Cặn chiết etylaxetat C.B: Cặn chiết n -butanol của cây xuyên tâm thảo. Kết quả thu nhận các dịch chiết từ cây xuyên tâm thảo được nêu trong bảng 2.1 Bảng 2.1. Khối lƣợng các cặn chiết thu đƣợc từ các phân đoạn cây xuyên tâm thảo Mẫu thu vào tháng 10/2009 Khối lượng mẫu khô (g) Khối lượng cặn chiết thu được (g) C. H C. E C. B Toàn bộ phần trên mặt đất của cây 850 15,0 18,0 10 2.3.2. Khảo sát định tính các dịch chiết 2.3.2.1. Phát hiện các hợp chất steroit Lấy 0,01g cặn của các phân đoạn, thêm 2ml dung dịch NaOH 10% đun cách thuỷ đến khô. Hoà tan cặn trong 3ml clorofom - lấy dịch clorofom để làm phản ứng định tính các steroit và thuốc thử Lieberman - Bourchardt (gồm hỗn hợp 1ml anhyđric acetic + 1ml clorofom để lạnh ở 00C, sau đó cho thêm 1 giọt H2SO4 (đậm đặc). Lấy 1ml dịch clorofom rồi thêm 1 giọt thuốc thử, dung dịch xuất hiện màu xanh trong 1 thời gian là phản ứng dương tính. 2.3.2.2. Phát hiện các ancaloit Lấy 0.01g cặn các phân đoạn, thêm 5ml HCl, khuấy đều, lọc qua giấy lọc, lấy vào 3 ống nghiệm, mỗi ống 1ml nước lọc axit. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 25 Ống (1): 1 - 2 giọt dung dịch thuốc thử Wagner, nếu có nhiều kết tủa là phản ứng dương tính. Ống (2): 1 - 2 giọt thuốc thử Dragendorf, nếu xuất hiện màu da cam là phản ứng dương tính. Ống (3): 3 - 5 giọt thuốc thử Mayer, nếu xuất hiện tủa trắng là phản ứng dương tính. 2.3.2.3. Phát hiện các flavonoit Lấy 0,01g cặn của các phân đoạn, thêm 10ml metanol, đun nóng cho tan và lọc qua giấy lọc. Lấy 2ml nước lọc vào ống nghiệm, thêm một ít bột magiê (Mg) hoặc Zn, sau đó cho vào 5 giọt HCl đậm đặc, đun trong bình cách thuỷ vài phút. Dung dịch xuất hiện màu đỏ, hoặc màu hồng là phản ứng dương tính với các flavonoit. 2.3.2.4. Phát hiện các cumarin Dịch để thử định tính được chuẩn bị như mục 2.3.2.1. Lấy vào 2 ống nghiệm, mỗi ống 2ml dịch thử cho vào một trong 2 ống đó 0,5ml dung dịch NaOH 10%. Đun cách thuỷ cả hai ống trên đến sôi, để nguội rồi mỗi ống cho thêm 4ml nước cất. Nếu chất lỏng ở ống có kiềm trong hơn ở ống không kiềm có thể xem là phản ứng dương tính, nếu đem axit hoá ống có kiềm bằng một vài giọt HCl đậm đặc sẽ làm cho dịch đang trong xuất hiện vẩn đục và có thể tạo ra tủa là phản ứng dương tính. Ngoài ra có thể làm phản ứng điazo hoá với axit sulfanilic trong môi trường axit, nếu cho màu da cam đến cam nhạt, sẽ là dương tính cho cumarin. 2.3.2.5. Định tính các glycozit tim Chuẩn bị dịch thử định tính cũng làm như mục 2.3.2.1. Phản ứng Keller - Kilian: Thuốc thử gồm 2 dung dịch. Dung dịch 1: 100ml axit axetic loãng + 1ml FeCl3 5% Dung dịch 2: 100ml axit H2SO4 đậm đặc + 1ml FeCl3 5% Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 26 Cách tiến hành: lấy 0,01g cặn các dịch chiết cho vào ống nghiệm thêm vào 1ml dung dịch 1, lắc đều cho tan hết, nghiêng ống nghiệm và cho từ từ 1ml dung dịch 2 theo thành ống nghiệm, quan sát sự xuất hiện của màu đỏ hay nâu đỏ, giữa hai lớp chất lỏng. Nếu không xuất hiện màu là phản ứng âm tính với các glycosit tim. 2.3.2.6. Định tính các saponin Chuẩn bị dịch thử như ở mục 2.3.2.1. lấy 2 ống nghiệm mỗi ống cho 2ml dịch thử. Ống 1 cho 1ml HCl loãng, ống 2 cho 1 ml NaOH loãng rồi bịt miệng ống nghiệm, lắc trong vòng 5 phút theo chiều dọc, quan sát sự xuất hiện và mức độ bền vững của bọt. Nếu bọt cao quá 3 - 4 cm và bền trên 15 phút là phản ứng dương tính. 2.3.2.7. Định tính các đường khử . Lấy 0.01g cặn các phân đoạn, hoà tan trong cồn, dung dịch thu được đem trộn với dung dịch thuốc thử Felinh theo tỉ lệ 1-1, đun sôi 2-3 phút. Nếu có kết tủa da cam của Cu2O thì chứng tỏ có mặt của đường. Kết quả phân tích định tính các nhóm chất trong cây xuyên tâm thảo được nêu trong bảng 2.2. Bảng 2.2 . Kết quả định tính các nhóm chất trong cây xuyên tâm thảo STT Nhóm chất Thuốc thử Hiện tượng Toàn cây 1 Steroit Lieberman-Bourchard Màu xanh vàng + 2 Ancaloit Dragendorff Vàng da cam - 3 Flavonoit Zn(Mg) + HCl Dung dịch nhạt màu dẫn đến màu đỏ nhạt + 4 Poliphenol (FeCl3+K3[Fe(CN)6])1% Xanh thẫm + 5 Cumarin Axit và kiềm Có kết tủa + 6 Glycozit tim FeCl3 trong CH3COOH + H2SO4đ Vàng nâu rõ + 7 Saponin Phản ứng tạo bọt Bọt bền trong NaOH _ 8 Đường khử Felinh Cho kết tủa màu đỏ gạch + Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 27 Chú giải : + : Phản ứng dương tính. - : Phản ứng âm tính. 2.3.3. Thử hoạt tính sinh học Thử hoạt tính vi sinh vật kiểm định theo phương pháp khuyếch tán trên giếng thạch, sử dụng khoang giấy lọc tẩm chất thử theo nồng độ tiêu chuẩn của bộ môn Vi sinh trường Đại học Y Thái Nguyên. Các chủng vi sinh vật thử gồm đại diện các nhóm:  Vi khuẩn: Gr (-) Escherichia coli (thực khuẩn đường ruột).  Vi khuẩn: Gr (+) Staphylococcus auresu (tụ cầu vàng).  Vi khuẩn: Salmonella spp (thương hàn).  Vi khuẩn: Shigella spp (lỵ trực khuẩn). Vi khuẩn: Streptococcus pyogenes (liên cầu). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 28 Hình 2.1: Đƣờng kính vùng ức chế xung quanh giếng thạch (mm) theo phƣơng pháp khuyếch tán trên giếng thạch Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 29 Bảng 2.3. Kết quả thử hoạt tính sinh học của dịch chiết thô từ cây xuyên tâm thảo Dịch chiết Đường kính vùng ức chế xung quanh giếng thạch Escherichia coli. Staphylococcus auresu Salmonella spp Shigella spp Strepto coccus pyogenes ĐK (mm) Hoạt tính ĐK (mm) Hoạt tính ĐK (mm) Hoạt tính ĐK (mm) Hoạt tính ĐK (mm) Hoạt tính Cặn Tổng 18 + 22 + 17 + 20 + 19 + Ghi chú: ĐK : Đường kính Dấu (+): là phản ứng có hoạt tính Dấu (-) : là phản ứng không có hoạt tính 2.4. Phân lập và tinh chế các chất Các dịch chiết từ cây xuyên tâm thảo đều là những hỗn hợp phức tạp chứa các hợp chất khác nhau. Để phân lập từng chất ra khỏi hỗn hợp đã sử dụng các phương pháp sắc kí cột, chất hấp phụ dùng là silicagel Merck 60 pha thường có cỡ hạt 0,040 – 0,063 mm, các hệ dung môi rửa giải thích hợp và thường phải lặp lại nhiều lần. Việc tinh chế các chất thường dùng phuơng pháp kết tinh lại trong dung môi hoặc hệ dung môi thích hợp. Nhờ cách làm đó đã thu được các đơn chất có độ tinh khiết cao, đáp ứng các yêu cầu để khảo sát tính chất hoá lý và xác định quang phổ của chúng. Phân lập và tinh chế các chất từ cây xuyên tâm thảo được thực hiện theo sơ đồ 2.1. Bằng phương pháp phân lập trên, từ dịch chiết bằng n-hexan của cây xuyên tâm thảo chúng tôi đã thu được 4 hợp chất sạch dùng để xác định Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 30 cấu trúc hoá học bao gồm: 1ancol no mạch dài, 1steroit và 2 xanthon. Từ dịch chiết etylaxetat phân lập được 2 xanthon sạch. 2.4.1. Cặn dịch chiết n-hexan của cây xuyên tâm thảo (C. H) Lấy 5g cặn chiết n-hexan đem tách trên cột silicagel pha thường có cỡ hạt 0,040 - 0,063 mm, rửa giải cột bằng hệ dung môi clorofom: n-hexan theo tỷ lệ tăng dần độ phân cực từ 0 -100% clorofom. Dịch rửa giải thoát ra từ cột được thu ở những khoảng cách nhỏ (5÷10 ml/ phân đoạn). Kiểm tra cặn thu được bằng sắc ký lớp mỏng và hiện màu bằng đèn tử ngoại ở bước sóng = 254 nm -365 nm, phun thuốc thử vanilin 1 % - H2SO4 10% trong dung dịch etanol, sấy 5 phút trên 100oC hoặc thử bằng hơi iod, hơi amoniac, sau đó quan sát màu. Các phân đoạn giống nhau được dồn lại rồi đem cất loại dung môi thu được 4 chất sạch bao gồm 1ancol no mạch dài (CH.1), 1 steroit (CH.2) và 2 xanthon (CH.3, CH.4). 2.4.1.1. Ancol no mạch dài nonacosan-1-ol (CH.1) Rửa giải cột bằng hệ dung môi n-hexan : clorofom theo tỉ lệ (8:2) thu được tinh thể rắn, không màu, có khối lượng 7 mg, Rf A= 0,8, nhiệt độ nóng chảy 84÷850C. Phổ FT-IR (KBr), νmax (cm -1): 3288,77 (rộng); 2914,58; 2849,00 và 1467,97. Phổ 1H-NMR (500 MHz, CDCl3 & MeOD),  (ppm): 3,57 (2H, t); 1,54 (2H, t); 0,88 (3H, t); 1,26 đến 1,3 ( 52H, m). 2.4.1.2.  - Sitosterol (CH.2) Tiếp tục rửa giải cột bằng hệ dung môi n-hexan:clorofom theo tỉ lệ (7: 3) thu được tinh thể hình kim, không màu, có khối lượng 10 mg, Rf B = 0,55 và nhiệt độ nóng chảy 138 ÷ 1400C. Phổ 1H-NMR (500 MHz, CDCl3);  (ppm): 0,68 (3H, s, Me-18); 1,01 (3H, s, 19-Me); 2 cụm doublet H tại 0,81 và 0,88 (23H, d, J 7,7Hz, Me-26 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 31 và Me-27); 0,83 (3H, t, 7.32 Hz, Me-29); 0,92 (3H, d, J 10 Hz, Me-21); 3,6 (1H, m, H-3); 5,4 (1H, d, J= 5Hz, H-6). Phổ 13C-NMR (125 MHz, CDCl3);  (ppm): 140,78 (s, C-5); 121,73 (d, C-6); 71,84 (d, C-3); 56,8 (d, C-14); 56,10 (d, C-17); 50,17 (d, C-9); 45,87 (d, C-24); 42,35 (s, C-13); 42,32 (t, C-4); 39,81 (t, C-12); 37,28 (t, C-1); 36,52 (s, C-10); 36,16 (d, C-20); 31,68 (d, C-8); 31,93 (t, C-7); 33,91 (t, C-2); 29,2 (d, C-25); 28,26 (t, C-16); 26,14 (t, C-23); 24,31 (t, C-15); 21,11 (t, C-11); 18,8 (q, C-26); 19,41 (q, C-19); 19,05 (q, C-27); 18,80 (q, C-21); 11,88 (q, C-29); 11,99 (q, C-18); 23.1 (t, C-28). 2.4.1.3. 1-Hiđroxy-3,7,8-trimethoxy xanthon (CH.3) Tiếp tục rửa giải cột bằng hệ dung môi n-hexan: clorofom theo tỉ lệ (6:4) thu được khối rắn những tinh thể màu vàng nhạt. Khối chất rắn này tiếp tục được tinh chế lại trên cột silicagel cỡ hạt nhỏ 0,040 – 0,063mm, rửa giải cột bằng hệ dung môi n-hexan: clorofom theo tỉ lệ (6:4) thu được những tinh thể hình kim, màu vàng nhạt, có khối lượng 25 mg, RfC = 0,84, nóng chảy ở 148÷149 0 C. Phổ FT-IR (KBr); νmax (cm -1): 3084,61 yếu; 2951,53; 2841,58; 1661,15; 1601,35; 1489,48. PHổ 1H- NMR (500MHz, CDCl3); (ppm): 3.86 (3H, s); 3,91 (3H, s); 3,99 (3H, s); 6,28 (1H, d, J=1,28); 6,30 (1H, d, J=1,69); 7,13 (1H, d, J =9,19); 7,32 (1H, t) và 13,23 (1- OH). Phổ 13C-NMR (125MHz, CDCl3); (δ ppm): 163,79 (C-1); 96,84 (C-2, CH); 166,37 (C-3); 91,97(C-4); 148,86 (C-5); 112,7 (C-6); 149,24 (C-7); 148,86 (C-8); 181,12 (C-9); 104,40(C-10); 157,09 (C-11); 150,96 (C-12); 115,70 (C-13); 55,14 (3- OCH3); 57,13 (7-OCH3) và 61,72 (8-OCH3). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 32 2.4.1.4. 1-Hiđroxy-3,5-đimethoxy xanthon (CH.4) Tiếp tục rửa giải cột bằng hệ dung môi n-hexan: clorofom theo tỉ lệ (5:5) thu được tinh thể màu vàng. Tinh thể này, tách lặp lại trên cột silicagel, hệ dung môi rửa giải n-hexan: clorofom theo tỉ lệ (1:1), thu được những tinh thể hình kim, màu vàng nhạt, có khối lượng 35 mg, Rf C = 0,82, nóng chảy ở 173 ÷ 174 0 C. Phổ FT-IR (KBr); νmax (cm -1): 3084,61; 2976,60 yếu; 1661,15; 1576,28; 1497,20 mạnh. PHổ 1H- NMR (500MHz, CDCl3); (ppm): 3,83 (3H, d); 3,94 (3H, s); 6,25(1H, d, J =1,25); 6,40 (1H, d, J = 2,13) ; 7,11 (1H, d, J = 7,91); 7,19(1H, t); 7,67(1H, m) và 12,73 (1H, s). Phổ 13C-NMR (125MHz, CDCl3); (δ ppm): 163,07 (C-1); 97,35 (C-2); 166,50 (C-3); 92,48(C-4); 148,06 (C-5); 115,39 (C-6); 116,38 (C-7); 123,33 (C-8); 180,46 (C-9); 103,67 (C-10); 157,33 (C-11); 145,99 (C-12); 121,22 (C-13); 55, 68 (3- OCH3) và 56,18 (5-OCH3). 2.4.2. Cặn chiết etylaxetat (CE) Lấy 8 g cặn thô EtOAc tách trên cột silicagel pha thường có cỡ hạt 0,040 – 0,063 mm. Rửa giải cột bằng hệ dung môi metanol-clorofom với tỉ lệ tăng dần theo độ phân cực (0-100% metanol), dịch rửa giải thoát ra từ cột được thu ở những khoảng cách nhỏ (510ml/phân đoạn). Kiểm tra cặn thu được bằng sắc ký lớp mỏng và hiện màu bằng đèn tử ngoại ở bước sóng  = 254 nm – 365 nm, phun thuốc thử vanilin 1% - H2SO4 10% trong dung dịch etanol, hơ nóng 5 phút trên 100oC hoặc hơ bằng hơi iod, hơi amoniac, sau đó quan sát màu. Các phân đoạn giống nhau được dồn lại rồi đem cất loại dung môi, thu được 2 xanthon kí hiệu E1 và E2. 2.4.2.1. 1,7-Đihyđroxy-3-methoxy xanthon (E1) Rửa giải cột bằng hệ dung môi metanol - clorofom theo tỷ lệ 2:98 thu được chất rắn, màu vàng, có khối lượng 50mg. Lượng chất rắn này tiếp tục Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 33 được tinh chế lại trên cột silicagel với hệ dung môi rửa giải là n-hexan : EtOAc theo tỷ lệ (1:1) thu được chất rắn vô định hình, màu vàng, khối lượng 10 mg, RfC= 0,72 và có nhiệt độ nóng chảy ở 273 0 C ÷ 275 0 C. Phổ FT-IR (KBr); νmax (cm -1 ): 3363,95 vân tù; 3102,47; 1667,83; 1573,19 và 1502,83. PHổ 1H- NMR (500MHz, DMSO); (ppm): 3,89 (3H, s); 6,38 (dd, j=3,3; 2,3); 6,63 (dd, j=3,3; 2,3); 7,26 (t, j=6,40; 7,7); 7,32 (dd, j=1,57; 1,57); 7,56 (dd, j=1,57; 1,66) và 12,85 (1H, s). Phổ 13C-NMR (125MHz, DMSO); (δ ppm): 162,49 (C-1); 97,02 ; (C- 2); 166,45 (C-3); 92,65 (C-4); 124,2 (C-5); 120,7 (C-6); 144,9 (C-7); 114,5 (C8); 180,41 (C-9); 102,96 (C-10); 157,08 (C-11); 146,21(C-12); 120,86 (C- 13) và 56,10 (3- OCH3 ). 2.4.2.2. 1,7-Đihiđroxy-3,6-đimethoxy xanthon (E2) Thay đổi hệ dung môi rửa giải cột metanol - clorfom theo tỷ lệ 5:95 thu được khối chất rắn, vô định hình. Khối chất rắn này lại tinh chế trên cột silicagel, hệ dung môi rửa giải cột là metanol-clorofom theo tỷ lệ 2-98 thu được 13 mg chất rắn màu, màu vàng nâu, nóng chảy ở 237÷2400C, có Rf C = 0,66. Phổ FT-IR (KBr); νmax(cm -1 ): 3307,33; 3244,36; 1663,18; 1604,40 và 1566,07. PHổ 1H- NMR (500MHz, CDCl3); (ppm): 3,87 (3H, s); 3,94 (3H, s); 6,37 (1H, d, J=2,2); 6,55 (1H, d, J=2,2);7,13 (1H, s) và 7,39 (1H, s). Phổ 13C-NMR (125MHz, DMSO); (δppm): 162,34 (C-1); 96,62 (C-2); 165,67 (C-3); 92,34 (C-4); 100,04 (C-5); 155,26 (C-6); 144,4 (C-7); 107,44 (C-8); 179,13 (C-9); 102,53 (C-10); 157,17 (C-11); 150,92 (C-12); 112,57 (C-13); 55,96 (3- OCH3) và 56,32 (6- OCH3) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 34 CHƢƠNG 3 THẢO LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Nguyên tắc chung Để phân lập được các hợp chất trong bất kỳ một loại thực vật nào phải không làm ảnh hưởng tới thành phần hoá học có trong nó. Vì thế trước khi ngâm chiết bằng dung môi hữu cơ, mẫu thực vật phải được diệt men ngay sau khi thu mẫu và sấy khô ở điều kiện thích hợp. Về nguyên tắc việc ngâm chiết mẫu thực vật có thể tiến hành theo hai cách phổ biến sau. Cách 1: Chiết và phân lập các hợp chất từ mẫu thực vật bằng các loại dung môi có độ phân cực tăng dần: Ete dầu hỏa hoặc n-hexan, clorofom, etylaxetat, metanol hoặc etanol vv... Như vậy sẽ thu được các cặn chiết chứa các chất có độ phân cực tương tự nhau. Cách 2: Chiết cặn tổng bằng các ancol hay hệ dung môi ancol : nước, sau đó sàng lọc các hợp chất bằng các loại dung môi có độ phân cực tăng dần như phương pháp 1 để thu được các dịch chiết có chứa các hợp chất có độ phân cực tương đối giống nhau. Việc chiết mẫu thực vật xuyên tâm thảo được thực hiện theo cách 2 (sơ đồ 2.1) 3.2. Phân tích định tính và phát hiện các nhóm chất trong các dịch chiết khác nhau Dùng các thuốc thử đặc hiệu để phát hiện các nhóm hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh lý cao trong thực vật [3]. Kết quả xác định thành phần định tính một số nhóm chất cơ bản trong cây xuyên tâm thảo đã nêu ra ở bảng 2.2. Từ kết quả chỉ ra ở bảng này có thể nhận thấy trong cây xuyên tâm Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 35 thảo có các chất cho phản ứng dương tính với các nhóm chất steroit, glicozit tim, đường khử, cumarin, polyphenol và flavonoit. 3.3. Phân lập và nhận dạng các chất có trong các dịch chiết khác nhau của cây xuyên tâm thảo Các dịch chiết thu được từ cây xuyên tâm thảo là hỗn hợp phức tạp của nhiều hợp chất hữu cơ. Việc tách riêng các chất ra khỏi hỗn hợp được thực hiện trên cột silicagel pha thường với các hệ dung môi rửa giải thích hợp và thường phải lặp lại một vài lần để thu được chúng ở dạng tinh khiết, đáp ứng yêu cầu xác định cấu trúc hóa học. Việc phân lập các chất có trong các dịch chiết khác nhau của cây xuyên tâm thảo được thực hiện theo sơ đồ 2.1, dựa v. Các chất sạch có thể dùng để xác định cấu trúc hoá học bao gồm: Ancol no mạch dài, steroit và các xanthon. 3.3.1. Ancol no mạch dài nonacosan-1-ol (CH.1) Tiến hành rửa giải cột sắc kí đối với cặn thô n-hexan thu được 7 mg chất rắn vô định hình, màu trắng, khối lượng 7 mg, RfA= 0,8, nóng chảy 84÷85 0C, tan tốt trong n-hexan. Phổ IR cho biết chất CH.1 có vân đặc trưng cho nhóm OH ở 3288,77cm -1; vân đặc trưng cho liên kết C-H no ở 2914,85 và 2849,00 cm-1 mạnh. Chứng tỏ trong phân tử CH.1 có chứa nhóm OH, CH no. Trong phổ 1H-NMR của chất này cho thấy tín hiệu triplet ứng với 3 proton H ở 0.88 ppm đặc trưng của nhóm CH3, tín hiệu singlet của nhóm OH nằm trong vùng 7,42 ppm, ngoài ra còn có tín hiệu 3.57ppm ở dạng triplet đặc trưng cho 2 proton của nhóm CH2 có liên kết với OH, phát hiện 2 proton cho tín hiệu ở 1,54 ppm đó là proton của nhóm CH2 ở vị trí bên cạnh nhóm CH2OH. Trên đường tích phân của phổ 1H-NMR cho thấy tín hiệu của 52 proton của các nhóm CH2 cho các tín hiệu ở vùng từ 1,2-1,3 ppm. Như vậy ancol mạch Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 36 dài có 59 proton liên kết với cacbon, trên phổ không thấy xuất hiện các proton liên kết với cacbon chưa no. Từ kết quả phân tích các phổ chúng tôi đề nghị công thức cấu tạo của chất CH.1 là nonacosan-1-ol (C29H59OH) OH Nonacosan-1-ol 3.3.2. β-Sitosterol hay stigmast-5-en-3-ol (C29H50O) (CH.2) Tiếp tục rửa giải sắc kí cột bằng hệ dung môi n-hexan:clorofom tỉ lệ (7: 3) thu được chất tinh khiết CH.2. Chất CH.2 là chất rắn, màu trắng kết tinh lại cho tinh thể hình kim (trong n-hexan), có khối lượng 10 mg, RfB = 0,55, nóng chảy ở 138÷140 0C. Khi trộn lẫn với β-sitosterol trong phòng thí nghiệm nhiệt độ nóng chảy không thay đổi. Phổ IR, 1H-NMR và 13C-NMR cho thấy trong phân tử chỉ có một nhóm OH tại vị trí C-3. Phổ 1H-NMR cho δH-3α 3,6 ppm và δC-3 (71,84 ppm). Thấy có một vân đôi C=C (phổ IR có vân hấp thụ 1650 cm-1 yếu; phổ 1H- NM có δH 5,4 (1H, J = 5 Hz); phổ 13 C-NMR có δC 140,78 ppm và 121,73 ppm). So sánh các số liệu phổ và các hằng số vật lí của chất CH.2 hoàn toàn phù hợp với β-Sitosterol. (Độ dịch chuyển hoá học của các nguyên tử cacbon chất CH.2 được nêu trong bảng 3.1). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 37 Bảng 3.1. Số liệu phổ 13 C-NMR của chất CH.2 phân lập từ cây xuyên tâm thảo và phổ β-sitosterol [17] Chất CH.2 β-Sitosterol [17] Vị trí C 13C-NMR (δC ppm) Vị trí C 13 C-NMR (δC ppm) 1 37,28 1 37,2 2 33,91 2 31,6 3 71,84 3 71,7 4 42,32 4 42,3 5 140,78 5 140,7 6 121,73 6 121,7 7 31,93 7 31,9 8 31,68 8 31,9 9 50,17 9 50,1 10 36,52 10 36,5 11 21,11 11 21,2 12 39,81 12 39,8 13 42,35 13 42,3 14 56,8 14 56,7 15 24,3 15 24,3 16 28,3 16 28,2 17 56,1 7 56,1 18 11,99 18 11,9 19 19,41 19 19,4 20 36,2 20 36,1 21 18,8 21 18,9 22 33,93 22 34,0 23 26,14 23 26,1 24 45,87 24 45,8 25 29,2 25 29,2 26 18,8 26 19,8 27 19,05 27 19,5 28 23,10 28 23,0 29 11,88 29 12,0 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 38 Dựa trên phân tích các số liệu phổ FT-IR, DEPT, NMR và tài liệu [17] hợp chất CH.2 hoàn toàn phù hợp với cấu trúc của chất β-sitosterol. Me Me Me HO Me Me Me 3 5 810 12 14 15 17 20 22 23 24 25 28 26 27 29 21 18 19 β-Sitosterol 3.3.3. 1-Hiđroxy-3,7,8-trimethoxy xanthon (CH.3) Chất CH.3 là những tinh thể màu vàng nhạt, Rf C= 0,84, nóng chảy ở 148÷149 0 C, có khối lượng 25 mg, tách được từ dịch chiết n-hexan, phân lập bằng sắc kí cột silicagen, rửa giải cột bằng hệ dung môi n-hexan:clorofom theo tỉ lệ (6:4). Phân tích phổ FT-IR cho vân hấp thụ tại 3084,61cm-1 đặc trưng cho liên kết CH thơm; 1661,15 cm-1 mạnh đặc trưng cho sự có mặt của nhóm cacbonyl (C=O);1601,35 và 1489,48 cm -1 đặc trưng cho dao động liên kết C=C thơm. Chứng tỏ trong phân tử của chất CH.3 có nhóm cacbonyl (C=O), nhân benzen. Phân tích phổ 13C-NMR (hình 3.2) và phổ DEPT (hình 3.3) cho biết trong phân tử CH.3 có 16 nguyên tử cacbon trong đó có ba nhóm CH3, bốn nhóm CH và chín nguyên tử cacbon bậc bốn. Phân tích phổ 1H-NMR (hình 3.1) cho biết phân tử CH.3 có 14 proton, cho thấy tín hiệu của một proton δH ở 13,23 ppm phân tử có nhóm OH nhưng đứng gần nhóm C=O nên tạo liên kết hiđro nội phân tử. Phổ IR cũng cho các thông tin phù hợp với nhận định này. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 39 Phổ 13C-NMR trong vùng trường yếu có một tín hiệu δC ở 181,12 ppm đó là tín hiệu cộng hưởng của cacbon bậc bốn (cacbon ở nhóm C=O). Nguyên tử cacbon bậc bốn liên kết với nhóm hiđroxyl cho cộng hưởng ở 163,79 ppm điều này cho phép kết luận nhóm OH liên kết với cacbon thuộc vòng benzen. Mặt khác trên phổ HMBC (hình 3.5) cho thấy có tương tác xa của proton này với C1, C2, C10. Ba nhóm CH3 đều cho cộng hưởng trong vùng trường mạnh với (δC 61,72 ppm; δH 3,99 ppm), (δC 57,12 ppm; δH 3,91 ppm) và (δC 55,14 ppm; δH 3,86 ppm) điều này chứng tỏ 3 nhóm CH3 này đều thuộc các nhóm OCH3 liên kết với cacbon vòng benzen. Bốn proton còn lại đều cộng hưởng ở δH từ 6,28 đến 7,30 ppm điều đó chứng tỏ chúng đều là hiđro của các vòng thơm A và C, các nguyên tử cacbon liên kết với các nguyên tử hiđro này cho các tín hiệu δC ở 91,97; 96,84; 112,70; 120,42 ppm, điều đó một lần nữa chúng tỏ các nhóm CH đều thuộc vòng thơm A, C. Tám nguyên tử cacbon bậc 4 cho các tín hiệu ở các píc δC 163,78 (C-1); 166,37 (C-3); 149,24 (C7); 148,86 (C-8); 104,03 (C-10); 157,09 (C-11); 150,96 (C-12) và 115,70 (C-13) ppm. Độ dịch chuyển hoá học của các nguyên tử cacbon, hiđro và các tương tác xa của chất CH.3 được nêu trong bảng 3.2. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 40 Bảng 3.2. Số liệu phổ NMR và các tƣơng tác xa trong CH.3 Vị trí δC (ppm) δH(ppm), J(Hz) Cn (13CNMR/ DEPT) H→C (HMBC) 1 163,79 - C - 2 96,84 6,28 (1H, d, J=1,28) CH 1, 3, 4, 10, 11 3 166,37 - - - 4 91.97 6,30 (1H, d, J=1,69) CH 1, 2, 3, 10, 11 5 112,7 7,13 (1H, d, J =9,19) CH 6, 7, 8, 12, 13 6 120,42 7,32 (1H, t) CH 5, 7, 8, 12, 13 7 149,24 - - - 8 148,86 - - - 9 181,12 - - - 10 104,4 - - - 11 157,1 - - - 12 150,96 - - - 13 115,7 - - - 3-OCH3 55,14 3,86 (3H) CH3 3 7-OCH3 57,13 3,91 (3H) CH3 7 8-OCH3 61,7 3,99 (3H) CH3 8 1-OH 13,23 - 1, 2, 10 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 41 Từ những thông tin thu được trên phổ hồng ngoại IR, phổ 1H-NMR, 13 C-NMR, DEPT, HMBC, HSQC và tài liêu [6], [7], [25] cho phép chúng tôi quy kết cho hợp chất CH.3 là 1-hiđroxy-3,7,8-trimethoxy xanthon (C16H14O6). O OOH H3CO 1 3 5 7 9 10 11 12 13 4 2 6 OCH3 OCH3 A B C 8 1-Hiđroxy-3,7,8-trimethoxy xanthon Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 42 Hình 3.1. Phổ 1 H-NMR của 1-hiđroxy-3,7,8-trimethoxy xanthon Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 43 Hình 3.2. Phổ 1 3 C-NMR của 1-hiđroxy-3,7,8-trimethoxy xanthon Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 44 Hình 3.3. Phổ DEPT của 1-hiđroxy-3,7,8-trimethoxyxanthon Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 45 Hình 3.4. Phổ HSQC của 1-hidroxy-3,7,8-trimethoxyxanthon Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 46 Hình 3.5. Phổ HMBC của 1-hidroxy-3,7,8-trimethoxyxanthon Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 47 3.3.4. 1-Hiđroxy-3,5-đimethoxy xanthon (CH.4) Chất CH.4 là chất rắn, màu vàng nhạt thu được từ dịch chiết n-hexan của cây xuyên tâm thảo, được phân lập bằng sắc kí cột với chất hấp phụ silicagel, hệ dung môi rửa giải là n-hexan:clorofom theo tỉ lệ (1:1), có khối lượng 35mg, nhiệt độ nóng chảy ở 173÷1740C và RfC = 0,82. Phân tích phổ 1H-NMR (hình 3.6), 13C-NMR (hình 3.7) và phổ IR của nó có dạng tương tự như các phổ tương ứng của chất CH.3. Phân tích phổ 13C-NMR và phổ DEPT (hình 3.8) cho biết phân tử CH.4 có 15 nguyên tử cacbon. Phổ DEPT cho thấy hợp chất CH.4 có 2 nhóm CH3, 5 nhóm metin (CH) và 8 nguyên tử cacbon bậc bốn. Như vậy chất CH.4 ít hơn hợp chất CH.3 một nhóm OCH3 và 1 nguyên tử cacbon bậc bốn, nhưng nhiều hơn hợp chất CH.3 một nhóm metin (CH). Như vậy công thức phân tử của chất CH.4 là C15H12O5. Trên cơ sở phân tích các phổ có thể suy ra cấu trúc phân tử của hợp chất CH.4 tương tự CH.3, nhưng ở vòng C chỉ có một nhóm methoxy (-OCH3) liên kết với cacbon C-5 còn ở vị trí C-6, C-7, C-8 không có nhóm thế. Các nguyên tử hiđro ở các vị trí này lần lượt cộng hưởng ở các δH bằng 7,11; 7,19 và 7,67ppm còn C-6, C-7, C-8 có δC lần lượt là 115,4; 123,3 và 116,4 ppm. (các số liệu phổ NMR và các tương tác xa được trình bày ở bảng 3.3) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 48 Bảng 3.3. Số liệu phổ NMR và các tƣơng tác xa của 1-hiđroxy-3,5- đimethoxyxanthon (CH.4) Vị trí δC (ppm) δH(ppm), J(Hz) Cn (13C-NMR/ DEPT) H→C (HMBC) 1 163,07 - C - 2 97,35 6,25(1H, d, J =1,25) CH 1, 3, 4, 10, 11 3 166,5 - C - 4 92,48 6,40 (1H, d, J = 2,13) CH 1, 2, 3, 10, 11 5 148,1 - C - 6 115,4 7,11 (1H, d, J = 7,91) CH 5, 7, 8, 12, 13 7 123,3 7,19 (1H, t) CH 5, 6, 8, 12, 13 8 116,4 7,67 (1H, m) CH 5, 6, 7, 12, 13 9 180,5 - C - 10 103,7 - C - 11 157,3 - C - 12 146,0 - C - 13 121,2 - C - 3-OCH3 55,7 3,82 (3H) CH3 1 5-OCH3 56,18 3,94 (3H) CH3 5 1-OH - 12,74 - 1, 2, 10 Từ các lập luận trên, để thỏa mãn với các đặc trưng về phổ NMR cho phép quy kết công thức cấu tạo của hợp chất CH.4 là 1-hiđroxy-3,5-đimethoxy xanthon. O OOH H3CO OCH3 1 3 5 7 8 9 10 11 12 13 4 2 6 A B C 1-Hiđroxy-3,5-đimethoxy xanthon Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 49 Hình 3.6. Phổ 1 H-NMR của 1-hiđroxy-3,5-đimethoxy xanthon Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 50 Hình 3.7. Phổ 1 3 C-NMR của 1-hiđroxy-3,5-đimethoxy xanthon Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 51 Hình 3.8. Phổ DEPT của 1-hiđroxy-3,5-đimethoxy xanthon Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 52 3.3.5. 1,7-Đihiđroxy-3-methoxy xanthon (E1) Chất E1 là chất rắn màu vàng, thu được từ dịch chiết etylaxetat của cây xuyên tâm thảo sau khi phân lập nhiều lần bằng các phương pháp sắc kí cột, hệ dung môi rửa giải metanol - clorofom tỉ lệ (2:98), có khối lượng 10 mg, Rf C= 0,72, nóng chảy ở 273 ÷ 275 0 C. Phổ IR cho vân hấp thụ ở 3363,95 cm-1 đặc trưng cho nhóm OH tham gia liên kết hiđro giữa các phân tử, 1667,83 cm-1 cường độ mạnh đặc trưng cho nhóm C=O có liên kết hiđro nội phân tử, tại 1573,19 và 1502,83 cm -1 nói lên sự có mặt của các vòng thơm trong phân tử E1 (hình 3.9). Phổ 13C-NMR (hình 3.11) của nó xuất hiện 14 nguyên tử cacbon, trong đó ở vùng trường yếu xuất hiện 1 nguyên tử cacbon với δC ở 180,41 ppm đặc trưng đối với cacbon trong liên kết C=O. Trong vùng trường trung bình xuất hiện 12 píc đặc trưng cho 2 vòng thơm A, C và ở vùng trường mạnh có 1 píc ở 56,01 ppm đặc trưng cho cacbon trong nhóm OCH3. Phân tích phổ DEPT (hình 3.12) cho biết phân tử E1 có 14 nguyên tử cacbon trong đó có 5 nhóm CH, một nhóm CH3 và tám nguyên tử cacbon bậc 4. Trên phổ 1H-NMR (hình 3.10) cho biết phân tử có một proton cho tín hiệu mạnh ở 12,85 ppm cho phép quy kết đó là hiđro của nhóm OH đã tham gia liên kết hiđro nội phân tử với nhóm C=O, proton này cho tương tác xa với C-1, C-2, C-10 (hình 3.13). Năm tín hiệu ứng với 5 proton liên kết với các nguyên tử cacbon của vòng thơm ở các độ chuyển dịch hoá học δH ở 6,38; 6,63; 7,26; 7,32 và 7,56 ppm. Từ các dữ kiện trên cho phép xây dựng công thức phân tử của nó là C14H10O5. số liệu về phổ NMR và các tương tác xa của chất E1 được nêu ra ở bảng 3.4. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 53 Bảng 3.4. Số liệu phổ NMR, DEPT và tƣơng tác xa của 1,7- đihyđroxy-3- methoxy xanthon (E1) Vị trí δC (ppm) δH (ppm) Cn ( 13 C- NMR/ DEPT) H→C (HMBC) 1 162,5 - C - 2 97,0 6,63 (dd, j=3,3; 2,3) CH 1, 3, 4, 10, 11 3 166,5 - C - 4 92,65 6,38 (dd, j=3,3; 2,3) CH 1, 2, 3, 10, 11 5 124,2 7,26 (t, j=6,40; 7,7) CH 6, 7, 8, 12, 13 6 120,7 7,32 (dd, j=1,57; 1,57) CH 5, 7, 8, 12, 13 7 144,9 - C - 8 114,5 7,56 (dd, j=1,57; 1,66)- CH 5, 6, 7, 9,12, 13 9 180,4 C - 10 102,9 - C - 11 157,1 - C - 12 146,2 - C - 13 120,9 - C - 3-OCH3 56,1 3,89 (3H, s) CH3 3 1-OH - 12,85 - 1, 2, 10 7-OH - 11,05 - 7,8 Trên cơ sở số liệu thực nghiệm về các phổ NMR, DEPT, HSQC (hình 3.15), HMBC (hình 3.16) và tài liệu [6], [31] chúng tôi quy kết chất E1 là 1,7- đihiđroxy-3-methoxy xanthon. O OOH H3CO OH A CB 1,7-Đihiđroxy-3-methoxy xanthon Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 54 Hình 3.9. Phổ IR của 1,7-Đihiđroxy-3-methoxy xanthon Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 55 Hình 3.10. Phổ 1 H-NMR của 1,7-đihiđroxy-3-methoxyxanthon Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 56 Hình 3.11. Phổ 13 C-NMR của 1,7-đihiđroxy-3-methoxy xanthon Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 57 Hình 3.12. Phổ DEPT của 1,7-đihiđroxy-3-methoxy xanthon Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 58 Hình 3.13. Phổ HMBC của 1,7-đihiđroxy-3-methoxy xanthon Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 59 3.3.6. 1,7-Đihiđroxy-3,6-đimethoxy xanthon (E2) Chất E2 được phân lập được từ cặn chiết etylaxetat, hệ dung môi rửa giải là metanol - clorofom tỉ lệ là 5-95, chất rắn, màu vàng, có khối lượng 13 mg, nóng chảy ở 237÷2400C, Rf C = 0,66. Phổ FT-IR cho vân hấp thụ mạnh ở 3307,33 cm-1 đặc trưng cho nhóm OH tham gia vào liên kết hiđro giữa các phân tử; 1663,18 cm-1 đặc trưng cho dao động của nhóm C=O; 1604,40 và 1566,07 cm -1 đặc trưng cho dao động của các vòng thơm. Phổ 1H-NMR (hình 3.14) cho biết hợp chất E2 chỉ có 4 nguyên tử hiđro liên kết trực tiếp với cacbon của vòng thơm ở các độ chuyển dịch hoá học δH lần lượt là 7,39; 7,31; 6,55 và 6,37 ppm. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR (hình 3.15) của chất E2 cho biết chất này có 15 nguyên tử cacbon. Ở vùng trường yếu có δC ở 179,13 ppm đặc trưng cho cộng hưởng của cacbon trong nhóm C=O. Ở vùng trường trung bình có 12 tín hiệu của cacbon, tương ứng với cộng hưởng của 12 nguyên tử cacbon thuộc các vòng thơm A và C, còn ở vùng trường mạnh có tín hiệu của 2 nguyên tử cacbon có δC là 55,96 ppm và 56,32 ppm đặc trưng cho 2 cacbon thuộc nhóm OCH3. Phổ DEPT (hình 3.16) cho biết phân tử E2 có 15 nguyên tử cacbon trong đó có 2 nhóm CH3, 4 nhóm CH và chín nguyên tử cacbon bậc 4. Các số liệu về phổ NMR, DEPT và các tương tác xa của chất E2 được nêu ra ở bảng 3.4. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 60 Bảng 3.5. Số liệu phổ NMR, DEPT và các tƣơng tác xa của 1,7-đihyđroxy- 3,6-đimethoxy xanthon Vị trí δC (ppm) δH (ppm), J (Hz) Cn ( 13 C-NMR/ DEPT) H→C (HMBC) 1 162,34 - C - 2 96,62 6,37 (1H, d, J=2,25) CH 1, 3, 4, 10, 11 3 165,67 - C - 4 92,34 6,55 (1H, d, J=2,21) CH 1, 2, 3, 10, 11 5 100,0 7,13 (1H, s) CH 6, 7, 8, 12, 13 6 155,3 - C - 7 144,4 - C - 8 107,4 7,39 (1H, s) CH 5, 6, 7,9, 12, 13 9 179,1 - C - 10 102,5 - C - 11 157,2 - C - 12 150,9 - C - 13 112,6 - C - 3-OCH3 56,0 3,87 (3H) CH3 3 6-OCH3 56,3 3,94 (3H) CH3 6 1-OH - 12,85 - 1, 2, 10 Kết hợp các phương pháp phổ NMR, phổ MS, phổ IR, DEPT, HSQC , HMBC (hình 3.17) và tài liệu [6], [30] chúng tôi xây dựng cấu trúc của chất E2 là 1,7- đihiđroxy-3,6-đimethoxy xanthon. O OOH H3CO OH OCH3 A B C 1,7- Đihiđroxy-3,6-đimethoxy xanthon Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 61 Hình 3.14. Phổ 1 H-NMR của 1,7-đihyđroxy-3,6-đimethoxy xanthon Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 62 Hình 3.15. Phổ 13 C-NMR của 1,7- đihiđroxy-3,6-đimethoxy xanthon Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 63 Hình 3.16. Phổ DEPT của 1,7-đihyđroxy-3,6-đimethoxy xanthon Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 64 Hình 3.17. Phổ HMBC của 1,7-đihyđroxy-3,6-đimethoxy xanthon Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 65 3.4. Thử hoạt tính sinh học Cặn chiết chất tổng số được chiết, tách bằng dung môi metanol. Sau khi làm khô kiệt, loại bỏ hoàn toàn dung môi được gửi tới phòng thí nghiệm vi sinh trường Đại học Y khoa Thái Nguyên để thử tác dụng sinh học của chúng. Kết quả được nêu ở bảng 2.3 và hình 2.1 cho thấy cặn tổng thu được từ dịch chiết cây xuyên tâm thảo có tác dụng kháng khuẩn với các vi khuẩn khuẩn Staphylococcusauresu (tụ cầu vàng), Escherichia coli (thực khuẩn đường ruột), Salmonella spp (thương hàn), Shigella spp (lỵ trực khuẩn), Streptococcus pyogenes (liên cầu). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 66 KẾT LUẬN 1. Nghiên cứu sàng lọc hoá thực vật của cây xuyên tâm thảo đã phát hiện thấy nhiều nhóm hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học cao đó là steroit, đường khử, các flavonoit, các chất polyphenol, glycozit tim và các chất xanthon. 2. Từ cây xuyên tâm thảo thu hoạch ở tỉnh Cao Bằng lần đầu tiên đã phân lập được 6 chất và dựa vào các đặc trưng hoá lý, các số liệu phổ ESI- MS, NMR, FT-IR, HSQC, HMBC đã nhận dạng được cấu trúc của 6 hợp chất hữu cơ thuộc các nhóm ancol no mạch dài, steroit, xanthon 3. Phân tích các phổ IR, MS, NMR, DEPT, HSQC và HMBC các chất tinh khiết được tách ra nói trên đã nhận dạng được chúng là: Nonacosan-1-ol (CH1); β-sitosterol (CH-2); 1-hiđroxy-3,7,8-trimethoxy xanthon (CH-3); 1-hiđroxy- 3,5-đimethoxy xanthon (CH-4); 1,7-đihiđroxy-3-methoxy xanthon (E-1) và 1,7- đihiđroxy-3,6-đimethoxy xanthon (E-2). Trong đó các chất E-1, E-2 là chất lần đầu phân lập được từ thực vật Canscora lucidissima ở tỉnh Cao Bằng. 4. Từ dịch chiết tổng của cây xuyên tâm thảo có tác dụng kháng các khuẩn Staphylococcusauresu (tụ cầu vàng), E.coli (thực khuẩn đường ruột), Salmonella spp (thương hàn), Shigella spp (lỵ trực khuẩn), Streptococcus pyogenes (liên cầu). KIẾN NGHỊ Cây xuyên tâm thảo là một cây thuốc quý, có nhiều tác dụng trong y học. Vì vậy tôi đề nghị với các cấp có thẩm quyền tiếp tục cho nghiên cứu một cách sâu rộng hơn về cây xuyên tâm thảo nhằm phục vụ tốt trong đời sống nhân dân. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 67 CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN Phạm văn Thỉnh – Hoàng Thị Yên "Các xanthon phân lập từ cây xuyên tâm thảo (Canscora lucidissima)” Tạp chí Khoa học công nghệ Đại học Thái Nguyên trang 77-81, tập 70, số 80, 2010 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 68 TÀI LIỆU THAM KHẢO I. Tiếng việt 1. Nguyễn Tiến Bân (2002), Danh mục thực vật Việt Nam, NXB Nông nghiệp, Hà Nội. 2. Phạm Hoàng Hộ (2003), “Cây cỏ Việt Nam” NXB Trẻ Tp HCM 3. Nguyễn Văn Đàn (1997), Các phương pháp nghiên cứu cây thuốc, Nxb Y-Dược, TP Hồ Chí Minh . 4. Nguyễn Thị Hương Giang, Đào Văn Phan, "Nghiên cứu cơ chế hạ glucose máu của mangiferin chiết xuất từ cây tri mẫu ( anemarrhena asphodeloides Bunge)", 2004/Tập 30/Số 4 trang 8-14 5. Ngô Đức Trọng (2008), luận văn thạc sĩ “Nghiên cứu hoá học và nhận dạng một số nhóm chất trong cây chó đẻ răng cưa Phyllathus urinaria L.,Euphorbiaceae”, II. Tài liệu tiếng Anh 6. Chapman & Hall/CRC, DNP on CD – ROM, 1982-2006. 7. R. K. Chudhljri and S. Ghosal “ Xanthones of Canscora decussata Schult”.Phytochemistry 1971, 10, pp 2425- 2432. 8. Shibnath Ghosal and Ratan Kumar Chaudhuiu, “New tetraoxygenated xanthones of Canscora decussata Schult”. Phytochemistry 1973, 12, pp 2035-2038 9. Shibnath Ghosal, Ratan K. chaudhuri and Amar Nath. “Lanostane triterpenes of Canscora decussata”. Phytochemistry 1973, 12, pp 1763-1766. 10 Ghosal S, Chaudhuri RK, Nath A. “Chemical constituents of the roots of Canscora decussata”. Part II. J.Chem Soc 1971; 48; 589-592 11. Shibnath Ghosal and Kanika Biswas.“Two new 1,3,5,6,7- pentaoxygenated xanthones from Canscora decussata”. Phytochemistry 1979, 18, pp1029- 1031. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 69 12. Shibnath Ghosal, Rama Ballava P.S. Chauhan, Kanika Biswas and Ratan K. Chaudhuri. "New1,3,5-trioxygenated xanthones in Canscora decussata". Phytochemistry 1976,15, pp 1041-1043 13. Ghosal S, Singh AK, Chaudhuri RK. “Chemical constituents of Gentianaceae XX: Natural occurrence of (-) loliolide in Canscora decussata”. J Pharm Sci 1976; 65; 1549-1551 14. Ghosal, S. et al., J . Pharm. Sci., 1973, 62, 137-138 15. Ghosal, S. et al., J. Indian Chem. Soc, 1971, 48, 589 16 Bhattacharya SK, Ghosal S, Chaudhuri RK, Sanyal AK. C. decussata (Gentianaceae) Xanthones 3 Pharmacological Studies. J Pharm. Sci 1972; 61;1838-1849. 17. Goat J.L., Akihisa T. (1997), “Analysis of steroit frest ed”, Phytochemistry, pp.324. 18. Ghosal S, Chaudhuri RK, Nath A. “Chemical constituents of Gentianaceae IV New Xanthone of Canscora decussata”. J Pharm Sci 1973; 62;137-139. 19. Ghosal S, Biswas K, Chaudhuri RK. “Chemical constituents of Gentianaceae part 22, structure of new 1, 3, 5-tri and 1, 3, 5, 6, 7-penta oxygenated xanthones Canscora decussata Schult”. J Pharm Sci 1977;14;1597-1605 20. Babita Madan, B.C.Mandal, Sarvesh Kumar and B. Shosh, "Canscora decussata (Roxb.) Schult. (Gentianaceae) inhibits LPS-induced expression of ICAM-1 and E-selectin on endothelial cells and carageenan-induced paw-edema in rats". Journal of Ethnopharmacology, 2003; 89; pp 211-216 21. Kanamori, H. et al., Chem. Pharm. Bull., 1984; 32; 2290 22. Ho Ting Nung ( 1988), "Flora seipublicae popularis sinacae", tập 2. Saence press. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 70 23. He Q, HeL, Xu, Deng B. " Effect of xanthone from Canscora lucidissima on cultured myocytes anoxia-reoxygenation injuries", Zhong Yao Cai 2000, Jul;23(7):399-401 24. He Q, He Q, Xu S, Peng B. " Mechanism of Canscora lucidissima xanthones against arrhythmia induced by myocardial ischemia-reperfusion in rats" Zhongguo Zhong Yao Za Zhi 1998 Sep;23(9):556-557 25. Hong.D, “trihyđroxyxanthone in plant canscora decussata”. Phytochemistry, 2004, Vol.60, pp 2293-2300 26 Ghosal S, Biswas K, Chaudhuri RK. “Chemical constituents of Gentianaceae XXIV: Anti-mycobacterium tuberculosis activity of naturally occurring xanthones and synthetic analogs” J Pharm Sci 1978; 67; 721-722. 27 Madan B, Mandal BC, Kumar S, Ghosh B. Canscora decussata (Roxb.) Schult. (Gentianaceae) inhibits LPS-induced expression of ICAM-1 and E-selectin on endothelial cells and carageenan-induced paw-edema in rats. J. Ethnopharma 2003;89;211-216. 28 Neeraj K. Sethiya , Alok Nahata , V. K. Dixit "Simultaneous spectrofluorimetric determination of scopoletin and mangiferin in a methanolic extract of Canscora decussata Schult". Asian journal of traditional medicines 2008 3 (6); pp 224-229 29. Yang Dong Mei, Shi Bo Xu "Journal of Guangdong University of Pharmacy". 2001; 3; vol.19 30 Devendra K, Bhardwaj, Rakeesh K, Jain and Chander K.Mehta. "1-Hidroxy-3,7-dimethoxy-6-acetoxyxanthone,1 new xanthone from Lawsonia inermis" Phytochemistry, 1978, Vol.17, pp 1400- 1410 31 Yukinobu Ikeya, Ko Sugama, Minoru and Hiroshi Mitsuhashi "Two xanthones from Polygala tenuifolia" Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 71 Phytochemistry, 1991, Vol.30, No.6, pp 2061- 2065 III. Các trang web 32. http:/www.freshpatents.com/Pharmaceutical-canscora-diffusa- containing- composition-dt20080814ptan20080193567.php 33. Magiferin - Thuốc biệt dược điều trị bệnh da liễu 34. Sinh học Việt Nam, go=page&name=Pag es1&pid=76 35. Thầy thuốc của bạn, 36. Trung tâm dữ liệu thực vật Việt Nam. htpp//www.botanyvn.com/cnt.asp?param=edir&list=species&fl=C&pg=7 35. Vietgle-Tri thức việt-Canscora decussata. 36. Vietgle-Tri thức việt-Canscora diffusa. 39. Vietgle -Tri thức việt-Canscora. 40. Vietgle -Tri thức việt-Canscora lucidissima. 41. Ứng dụng của Mangiferin trong mỹ phẩm. ferin&stemming=on, ngày 03/5/2008 42. Ứng dụng của các xanthon. 41. Y học cổ truyền Tuệ Tĩnh Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 72 PHỤ LỤC I. Phổ chất Nonacosan-1-ol C 29H59OH (CH-1) Phổ IR ........................................................................ Phổ 1H-NMR ...................................................................... 73 84 II. Phổ chất chất -Sitosterol (CH-2) C 29H50O (CH-2) Phổ 1H-NMR ....................................................................... Phổ 13C-NMR ..................................................................... Phổ DEPT ........................................................................... 76 79 81 III. Phổ chất 1-hiđroxy-3,7,8-trimethoxy xanthon (CH.3) Phổ IR .............................................................................................. Phổ 1H-NMR ...................................................................... Phổ 13C-NMR ..................................................................... Phổ DEPT ............................................................................ Phổ HSQC ........................................................................... Phổ HMBC 83 84 87 90 91 93 IV Phổ chất 1-hiđroxy-3,5,-đimethoxy xanthon (CH.4) Phổ IR .............................................................................................. Phổ 1H-NMR ...................................................................... Phổ 13C-NMR ..................................................................... Phổ DEPT ............................................................................ 95 96 99 102 V Phổ chất 1,7-đihiđroxy-3-methoxy xanthon (E1) Phổ 1H-NMR ...................................................................... Phổ 13C-NMR ...................................................................... Phổ DEPT ............................................................................ Phổ HSQC ........................................................................... Phổ HMBC .................................................................................... 104 107 110 112 114 VI Phổ chất 1,7-đihiđroxy-3,6-đimethoxy xanthon (E2) Phổ IR ......................................................................................... Phổ 1H-NMR ...................................................................... Phổ 13C-NMR ...................................................................... Phổ DEPT ............................................................................ Phổ HSQC ........................................................................... Phổ HMBC .................................................................................... 116 117 120 123 125 127 VII. Kết quả thử hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết tổng từ cây xuyên tâm thảo 130 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 73 I. Phổ chất nonacosan-1-ol (C29H59OH) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 74 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 75 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 76 II. Phổ chất β-Sitosterol hay stigmast-5-en-3-ol (C29H50O) (CH.2) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 77 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 78 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 79 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 80 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 81 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 82 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 83 III. Phổ chất 1-hiđroxy-3,7,8-trihiđroxy xanthon (CH.3) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 84 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 85 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 86 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 87 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 88 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 89 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 90 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 91 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 92 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 93 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 94 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 95 IV. Phổ chất 1-hiđroxy-3,5-đihiđroxy xanthon (CH.4) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 96 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 97 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 98 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 99 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 100 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 101 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 102 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 103 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 104 V. Phổ chất 1,7- đihiđroxy-3-methoxyxanthon Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 105 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 106 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 107 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 108 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 109 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 110 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 111 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 112 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 113 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 114 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 115 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 116 VI. Phổ chất 1,7-đihiđroxy-3,6-đimethoxy xanthon (E2) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 117 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 118 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 119 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 120 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 121 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 122 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 123 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 124 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 125 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 126 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 127 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 128 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 129 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 130

Các file đính kèm theo tài liệu này:

  • pdfLV2010_SP_HoangthiYen.pdf
Tài liệu liên quan