Luận văn Nghiên cứu thành phần hóa học của cây bán hạ ba thùy (typhonium trilobatum, araceae)

, [29], [30]. Đối với hỗn hợp của ancol và axetat ta sẽ nhận được 2 tín hiệu cho mỗi nguyên tử C1 -3, còn hỗn hợp của axít, este và glyceroleste sẽ có 4 tín hiệu cho mỗi nguyên tử C1 -3. O’connor và các cộng sự đã sử dụng sự khác nhau giữa các độ dịch chuyển hoá học này để nghiên cứu quá trình phản ứng với xúc tác enzym giữa axít và ancol. Tiến trình phản ứng được theo dõi thông qua sự giảm tín hiệu của độ dịch chuyển hoá học 61,1 ppm (tín hiệu của C -1 ancol) và sự tăng tín hiệu của độ dịch chuyển hoá học 64,3 ppm (tín hiệu của C -1 este) [45]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 29 Bảng 1.10. Độ dịch chuyển hóa học ( ppm) của các nguyên tử C1 -3 trong phổ 13C-NMR của một số lớp chất mạch dài [26]. Hợp chất (C-1) (C-2) (C-3) Axit cacboxylic 180,62 34,25 24,8 Metyleste 174,05 34,17 25,12 Este mạch dài Acyl 173,94 34,48 25,06 Ankyl 64,39 28,70 25,98 Glyceroleste 173,27 34,07 24,90 172,86 34,24 24,94 Amit 176,37 36,02 25,57 Nitril 119,82 25,43 17,14 Ancol 63,01 32,81 25,78 Axetat* 64,64 28,67 25,97 * Độ dịch chuyển hoá học cho 2 nguyên tử C của nhóm CH3BCO là: 171, 14 và 20,97 ppm. Bảng 1.11. Độ dịch chuyển hóa học ( ppm) của các nguyên tử C1 -3 từ phổ 13C-NMR của hỗn hợp axít palmitic, metyloleat và glycerol tri -oleat [26]. C Axit Metyleste Glyceroleste C-1 179,69 174,28 173,23 172,82 C-2 34,12 34,10 34,07 34,23 C-3 24,77 25,01 24,91 24,93 1.3.9 Glycerol este Glyceroleste có 5 loại sau đây: 1- và 2-monoaxyl; 1,2-diaxyl; 1,3-diaxyl và triacyleste. Những nguyên tử C của glycerol trong mỗi loại este cho những tín hiệu Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 30 đặc biệt trong phổ 13C-NMR của nó và người ta có thể sử dụng để xác định, định lượng các thành phần trong hỗn hợp [25], [38]. Bảng 1.12. Độ dịch chuyển hóa học ( ppm) của các nguyên tử C -glycerol trong phổ 13C-NMR của các axylglycerol [26]. O CDCl3 P CDCl3 S CDCl3 O và P CDCl3/CD3OD (2:1) 2-mono 72,12 74,97 74,70 75,36 1,2-di 72,83 72,25 72,06 72,40 1-mono 69,90 70,27 - 70,24 Tri 68,84 68,93 68,85 69,41 1,3-di 67,55 68,23 68,15 67,71 1-mono 64,64 65,04 - 65,58 1,3-di 64,73 65,04 64,96 65,36 1-mono 63,12 63,47 - 63,46 1,2-di 62,22 62,20 62,10 62,92 Tri 62,03 62,12 62,06 62,50 2-mono 61,02 62,05 60,90 61,06 1,2-di 60,74 61,58 61,37 60,82 Ghi chú: O = axit oleic; P = axit palmitic; S = Các axit no; Độ dịch chuyển hóa học của các nguyên tử C của glycerin là: C- 63,66; C- 72,78 ppm. Trong trường hợp của các glyceroleste “đối xứng” (2-monoacyl; 1,3-diacyl và triacyleste) nó cho chúng ta 2 tín hiệu với tỷ lệ píc 2:1, còn trong trường hợp glyceroleste “không đối xứng” (1-monoacyl và 1,2-diacyleste) nó cho ta 3 tín hiệu píc với tỷ lệ 1:1: 1. Trong dung dịch chloroform một vài tín hiệu này rất gần nhau và có khi trùng lên nhau, đặc biệt là trong trường hợp một tín hiệu có cường độ lớn Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 31 và một tín hiệu có cường độ nhỏ. Trong hỗn hợp dung dịch cloroform /metanol (2:1) chúng sẽ có độ phân giải tốt hơn [25], [26], (bảng 1.12). Rất nhiều dầu thực vật có chứa diacylglycerol và trong phổ 13 C-NMR của nó ta nhận thấy có 2 tín hiệu lớn của triacylglycerol và 2 tín hiệu nhỏ đi kèm của 1,3- diacylglycerol còn những tín hiệu của những isomer 1,2-diacylglycerol không thể nhận biết được trong phổ. Những diacylglycerol bền vững có thể là sản phẩm của sự isomer hoá, ví dụ: trong phổ 13C-NMR của dầu cọ có những tín hiệu ở 68,93 (cường độ píc 2,96), 68,35 (0,27), 65,05 (0,45) và 62,10 ppm (5,53) tương ứng vào khoảng 8,4% (mol) 1,3-diacylglycerol có trong dầu [26], [38], [60]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 32 CHƢƠNG 2. THỰC NGHIỆM Cây Bán hạ ba thùy (Typhonium trilobatum) còn có tên gọi là củ chóc, Lá ba chìa, Cây chóc chuột [4], là thực vật thân thảo, bụi (là một loại cỏ không có thân), có củ hình cầu, đường kính có thể to tới 2cm. Lá hình tim hay hình mác, hoặc chia ba thùy dài 4 đến 15cm, rộng 3,5 đến 9cm. Bông mo với phần hoa đực dài từ 5 đến 9mm, phần trần dài 17 đến 27mm. Quả mọng, hình trứng dài 6mm. Hình 2.1: Cây Bán hạ ba thùy (Typhonium trilobatum) Chúng mọc hoang ở những nơi đất ẩm hoặc được trồng làm cảnh, phân bố rộng khắp ở Việt Nam, Ấn Độ, Trung Quốc, Nhật Bản … Bán hạ ba thùy còn là một vị thuốc [5] dùng theo kinh nghiệm dân gian để chữa: Chống nôn (phụ nữ có thai hoặc trong trường hợp viêm dạ dày mãn tính), trị ho, tiêu đờm, chữa nhức đầu, đau dạ dày mãn tính v.v... nhưng ít có những nghiên cứu về dược lý cũng như thành phần hoá học của nó kể cả ở trong và ngoài nước. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 33 Nhiệm vụ của bản luận án này là phân lập các thành phần hoá học có trong cây Bán hạ và sử dụng các phương pháp phân tích vật lý, hoá học hiện đại để xác định cấu trúc hoá học của các chất sạch đã thu được. Hình 2.2: Hoa , thân , củ và rễ cây Bán hạ ba thùy (Typhonium trilobatum) 2.1. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu 2.1.1. Thu mẫu cây, xác định tên khoa học và phương pháp xử lý mẫu Nguyên liệu để nghiên cứu là thân, lá, rễ và củ khô của cây Bán hạ ba thùy, thu hái tại huyện Đông Triều, tỉnh Quảng Ninh tháng 7 năm 2007, được TS. Ninh Khắc Bản - Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh học – Viện KH&CN Việt Nam giám định tên khoa học là Typhonium trilobatum. Mẫu cây tươi thu hái về (củ được thái thành lát mỏng), đưa đi sấy ngay ở nhiệt độ 110 0 C khoảng 10 phút để diệt men. Sau đó sấy khô ở 50-60 0 C cho tới khi độ ẩm ≤ 10%. Mẫu khô thân được vò nhỏ, rễ và củ được nghiền nhỏ và được ngâm chiết kiệt nhiều lần bằng etanol 96% ở nhiệt độ phòng. Sau khi cất loại dung môi, cặn cô được chiết lần lượt bằng các loại dung môi có độ phân cực tăng dần: n-hexan, etylaxetat và metanol. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 34 Các dịch chiết được đuổi kiệt dung môi bằng thiết bị cô quay ở nhiệt độ ≤ 50 0 C dưới áp suất giảm. Các cặn thô được đưa lên các loại cột sắc ký khác nhau để phân lập các chất có trong từng phân đoạn và thường phải kết hợp nhiều phương pháp như: dùng hệ dung môi chạy cột có độ phân cực tăng dần để phân ly các chất có độ phân cực gần giống nhau, kết hợp với kết tinh phân đoạn và kết tinh lại trong hệ dung môi thích hợp để thu được các chất sạch. 2.1.2. Phương pháp phân lập các hợp chất từ các dịch chiết. Để phân lập được những hợp chất sạch từ các dịch cô khác nhau của cây Bán hạ đã phối hợp sử dụng các phương pháp sắc ký và kết tinh lại trong dung môi thích hợp. - Sắc ký lớp mỏng (SKLM) - Sắc ký cột Silicagel thường - Kết tinh phân đoạn và kết tinh lại 2.1.3. Phương pháp khảo sát và xác định cấu trúc hoá học các hợp chất. Các chất tinh khiết phân lập ra sẽ được xác định những hằng số vật lý đặc trưng: màu sắc, mùi vị, Rf, điểm nóng chảy, v.v.... Sau đó sẽ tiến hành ghi các loại phổ như: phổ tử ngoại (UV), phổ hồng ngoại (FT-IR), phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton ( 1 H-NMR), cacbon-13 ( 13 C-NMR), phổ DEPT, phổ HSQC, phổ HMBC với các kỹ thuật một chiều (1D-NMR) và 2 chiều (2D-NMR) tuỳ theo từng hợp chất. Các số liệu phổ thực nghiệm của các chất sạch được dùng để khẳng định cấu trúc hóa học của chúng. 2.2. Dụng cụ, hoá chất và thiết bị nghiên cứu 2.2.1. Dụng cụ và hoá chất Các loại dung môi dùng để ngâm chiết mẫu là các loại tinh khiết (pure), còn các loại dung môi dùng để chạy sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng hay dùng trong phân Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 35 tích là loại tinh khiết phân tích (PA). Loại Silicagel G60 của hãng hoá chất Merck được dùng để tráng ra các loại sắc ký lớp mỏng với các kích cỡ khác nhau trên tấm thuỷ tinh, và được hoạt hoá 4 giờ ở nhiệt độ 1100 C. Ngoài ra các tấm sắc ký lớp mỏng đế nhôm DC-Alufolien Kieselgel 60F254 Art.5554 cũng đã được sử dụng để xác định sơ bộ số thành phần có trong các dịch chiết, các phân đoạn chạy cột và kiểm tra sơ bộ độ sạch của sản phẩm thu được. Các hệ dung môi triển khai SKLM. 1. n-Hexan-etylaxetat (8:1) Hệ A 2. n-Hexan-etylaxetat (4:1) Hệ B 3. Chloroform-metanol (9:1) Hệ C 4. Chloroform-metanol (5:1) Hệ D 5. Chloroform-metanol (2:1) Hệ E Các tấm SKLM sau khi sấy khô được soi dưới đèn tử ngoại (UV- BIOBLOCK) ở bước sóng =254nm (365nm) rồi được phun thuốc thử vanilin 1% trong metanol/H2SO4 đặc và sấy trên 100 0C, để xác định các cấu tử. Các giá trị Rf trong hệ dung môi triển khai được biểu thị: RfA(B,C)x100. Sắc ký cột thường sử dụng silicagel Merck 60, cỡ hạt 230-400 mesh (0,040 - 0,063mm hoặc 0,1 - 0,16mm). 2.2.2. Thiết bị nghiên cứu - Nhiệt độ nóng chảy đo trên máy Boëtus (Đức) hoặc trên máy Electrothermal IA-9200. - Góc quay cực [ ]D đo trên máy Polartronic-D, chiều dài cuvet = 1cm. - Phổ hồng ngoại ghi trên máy IMPACT-410 (Viện Hoá học - Viện KH&CN Việt Nam) dạng viên nén KBr. - Phổ khối lượng ghi trên máy MS-Engine-5989-HP ion hoá bằng va chạm electron (EI-MS) 70eV và sử dụng ngân hàng dữ liệu DATABASE/WILLEY 250L hoặc trên thiết bị ESI-MS HP-1100 LS/MS Trap spectrometer. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 36 - Phổ GC/MS ghi trên máy HP-GC/MS Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. - Phổ 1 H-NMR và 13 C-NMR ghi trên máy Bruker 500MHz (Viện Hoá học – Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam ) nội chuẩn TMS, dung môi CDCl3, CDCl3/MeOD, pyridin-D5. 2.3. Các dịch chiết từ cây Bán hạ ba thùy (Typhonium trilobatum) 2.3.1 Các dịch chiết Thân, lá, rễ và củ cây Bán hạ ba thùy đã phơi khô, nghiền nhỏ được ngâm chiết kiệt bằng etanol ở nhiệt độ phòng cho đến khi thu được dịch không màu. Dịch chiết được cất loại hết dung môi ở áp suất giảm nhiệt độ < 50 0C đến dạng cao đặc khô, xác định khối lượng cặn thô, sau đó thêm nước vào cặn và lần lượt chiết với các loại dung môi có độ phân cực tăng dần: n-hexan, etylaxêtat, sau đó đuổi hết nước và chiết bằng metanol. Các dịch chiết nói trên được làm khan bằng Na2SO4, lọc và cất kiệt dung môi bằng cô quay dưới áp suất giảm ở nhiệt độ ≤ 500 C. Cặn được sấy khô và cân để xác định trọng lượng. Như vậy từ củ, rễ và thân lá cây Bán hạ ba thùy đã thu nhận được 3 phân đoạn là n-hexan, etylaxetat, metanol với các cặn tương ứng được tóm tắt trong bảng 2.1. Bảng 2.1 Khối lượng cặn chiết từng phân đoạn của cây Bán hạ ba thùy (Typhonium trilobatum) Mẫu chiết Dịch chiết Rễ, củ (RTt) 1700 gam Thân, lá (LTt) 450 gam n-hexan (H) RTtH: 19,7g LTtH: 8,6g Etyl axetat (E) RTtE: 15,4g LTtE: 8,8g Metanol (M) RTtM: 100g LTtM: 100g Quy trình ngâm chiết mẫu được tóm tắt theo sơ đồ 2.1. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 37 Sơ đồ 2.1 Qui trình ngâm chiết mẫu 2.4. Phân lập và tinh chế các chất từ cây Bán hạ ba thùy (Typhonium trilobatum) 2.4.1. Dịch chiết n-hexan Từ 19,7 g cặn dịch n-hexan của củ, rễ cây Bán hạ ba thùy (Kí hiệu RTtH), được tiến hành phân lập các chất trên sắc kí cột silicagel. Hệ dung môi rửa giải là n–hexan/ etylaxetat với tỷ lệ theo độ tăng dần của dung môi etylaxetat (EtOAc) từ 0-100%, kiểm tra các phân đoạn bằng sắc kí lớp mỏng, các phân đoạn giống nhau đem gộp lại và cất loại dung môi đã thu được hỗn hợp các axit béo được xác định Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 38 trên máy GC/MS (được so sánh với phổ chuẩn với độ trùng lặp ≥ 98% cao). 2.4.1.1. Các axit béo Các axit béo trong dịch hexan của Typhonium trilobatum được tiến hành phân tích trên máy GC/MS với ngân hàng dữ liệu phổ của các axit béo đã biết được trình bày ở bảng 2.2. Bảng 2.2 Các axit béo trong dịch n-hexan của cây Bán hạ ba thùy Stt Tên axit Ký hiệu Độ trùng lặp (%) 1 Axit hexadecanoic (axit palmitic) RTtH1 99 2 Axit 11,14-octadecadienoic RTtH2 99 3 Axit 9,12-octadecadienoic RTtH3 99 4 Axit cis-linoleic RTtH4 99 5 Axit docosanoic RTtH5 98 2.4.1.2. Stigmast-5,22-dien-3-β-ol (RTtH6) Rửa giải cột với hệ dung môi n-hexan/etylaxetat (10:1), sau khi cất lại dung môi, cặn thu được kiểm tra bằng SKLM trong hệ A, kết tinh lại trong dung môi metanol thu dược 19mg tinh thể hình kim, không màu, không mùi. RfA 100 = 64, nóng chảy ở 155-157 0 C, [ ] 25 D = - 43 0 (c=0,05; CHCl3). Phổ FT-IR(KBr), νmax(cm -1 ): 3429,1(OH); 2864,9(C-H); 1642,5 và 1651,4(C=C) Phổ EI-MS m/z, (%): 412[M + ](7), 300(7), 255(11), 231(4), 213(8), 173(7), 145(20), 133(20), 83(49,3), 55(100), 43(90). Phổ 1H-NMR (500MHz, CDCl3), (ppm): 5,35 (1H, dd, J=5Hz và 2Hz, H6); 5,14 (1H, dd, J22,23=15 Hz, J22,20= 5Hz, H-22); 5,03 (1H, dd, J23,22=15 Hz, J23,24=5 Hz, H-23); 3,49 (1H, m, H-3). Phổ 13 C -NMR (125MHz, CDCl3), (ppm): 36,5 (t, C-1); 29,67 (t, C-2); Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 39 71,8 (d, C-3); 42,25 (t, C-4); 140,71 (s, C-5); 121,67 (d, C-6); 37,21 (t, C-7); 31,84 (d, C-8); 51,2 (d, C-9); 36,11 (s, C-10); 24,32 (t, C-11); 42,17 (t, C-12); 31,6 (s, C- 13); 56,83 (d, C-14); 25,38 (t, C-15); 31,6 (t, C-16); 55,9 (d, C-17); 12,01 (q, C-18); 18,95 (q, C-19); 40.47 (d, C-20); 21,03 (q, C-21); 138,3 (d, C-22); 129,3 (d, C-23); 50,01 (d, C-24); 33,9 (t, C-25); 21,19 (q, C-26); 19,79 (d, C-27); 28,89 (q, C-28); 12,22 (q, C-29). 2.4.1.2. -Sitosterol (RTtH7) Tiếp tục rửa cột với hệ dung môi n-hexan/etylaxêtat (5:1), sau khi cất loại dung môi, cặn thu được kiểm tra SKLM trong hệ B, kết tinh lại trong metanol thu được 17 mg chất rắn, tinh thể hình kim, không màu, hiệu suất 5,5.10 -3 %, RfB 100 = 43, nóng chảy ở 138-140 0C. Phổ FT-IR (KBr), νmax(cm -1 ): 343,15 (OH); 2983; 2932; 2868; 1647,2 (C=C); 1464; 1384; 1064, 804. Phổ EI-MS, m/z (%): 414 [M]+ (20), 413 [M-1]+ (41), 398 (28), 397 (100), 395 (32), 383 (11), 361 (11), 257 (3), 255 (6,3), 151 (5,6), 139 (11). Phổ 1H-NMR (500MHz, CDCl3), (ppm): 5,31 (1H, dd, J=5 Hz và 2 Hz, H- 6); 3,51 (1H, m, H-3); 0,84 (3H, d, J29-27 = 6,6Hz, H-29); 0,81 (3H, d, J28-27 = 6,6Hz, H-28); 0,92 (3H, d, J21-20 = 6,6Hz, H-21); 0,85 (3H, t, J26-25 = 7,1Hz, H-26); 0,68 (3H, s, H-19); 1,01 (3H, s, H-18). Phổ 13C-NMR (125MHz, CDCl3), (ppm): 37,3 (t, C-1); 31,7 (t, C-2); 71,8 (d, C-3); 42,3 (t, C-4); 140,6 (s, C-5); 121,6 (d, C-6); 31,9 (t, C-7); 33,9 (d, C-8); 50,2 (d, C-9); 36,5 (s, C-10); 21,1 (t, C-11); 39,8 (t, C-12); 37,8 (s, C-13); 56,8 (d, C-14); 24,3 (t, C-15); 28,3 ( t, C-16); 56,1 (d, C-17); 11,9 (q, C-18); 19,4 (q, C-19); 36,2 (d, C-20); 18,8 (q, C-21); 29,5 (t, C-22); 26,2 (t, C-23); 45,9 (d, C-24); 29,2 (d, C-25); 19,8 (q, C-26); 19,1 (q, C-27); 23,1 (t, C-28); 11,9 (q, C-29). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 40 2.4.2. Dịch chiết etylaxetat (RTtE) Từ 15,4 g cặn chiết etylaxêtat của củ, rễ cây Bán hạ ba thùy (Kí hiệu RTtE) cũng được tiến hành phân lập các chất trên sắc kí cột silicagel. Rửa giải cột sắc kí bằng hệ dung môi cloroform/metanol có tỷ lệ theo độ tăng dần của dung môi metanol từ 0-100%, kiểm tra các phân đoạn bằng SKLM, sau đó gộp các phân đoạn có thành phần giống nhau, đuổi hết dung môi và kết tinh phân đoạn đã thu được các chất sau. 2.4.2.1. Hợp chất terpen-glycozit (RTtE1) Rửa giải cột bằng hệ dung môi cloroform/metanol (95:5), sau khi kiểm tra bằng SKLM với hệ C cất loại dung môi, thu được cặn thô. Kết tinh lại trong MeOH thu được 20,5mg một chất rắn kết tinh vô định hình, không màu, RfC 100 = 50. Phổ 1 H-NMR (Pyridin-D6, 500MHz), (ppm): 0.65 - 2,35 tín hiệu thuộc các nguyên tử H của các nhóm CH3, CH2 và CH trong phần genin của phân tử glycozit; độ dịch chuyển hóa học trong khoảng 3,0-3,7 là tín hiệu các mguyên tử H của các nhóm CH2 và CH liên kết trực tiếp với O của phần đường và khung terpen ; 4,8 (d, H-1’phần đường ); 5-5,53 là tín hiệu các nguyên tử H của các liên kết olefin. Phổ 13C-NMR (Pyridin, 125MHz), (ppm): 11,8-57,0 là tín hiệu của các nguyên tử Cacbon thuộc các nhóm metyl, metylen, metin và nguyên tử cacbon bậc bốn; độ dịch chuyển hóa học từ 61,8-77,7 là tín hiệu của các nguyên tử cacbon thuộc phần đường và các cacbon trong khung tecpen có liên kết trực tiếp với oxi. Độ dịch chuyển hóa học ở 102,1 là tín hiệu của cacbon C1 thuộc phần đường. Còn tín hiệu các cacbon ở 121,6 và 123,1 thuộc các nguyên tử cacbon olefin. 2.4.2.2. 3-O- -D-glucopyranosyl-stigmasterol (RTtE2) Tiếp tục rửa giải cột bằng hệ dung môi CHCl3-MeOH (9:1), phân đoạn dịch được kiểm tra SKLM trong hệ C, sau khi cất loại dung môi, cặn được kết tinh lại trong hệ dung môi cloroform/metanol (2/1) thu được 25mg tinh thể hình kim, không màu, không mùi, có RfC 100 = 48, nóng chảy ở 289-290 0 C. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 41 Phổ 1H-NMR (CDCL3/MeOD, 500MHz, ), (ppm): 5,32 (1H, m,H-6); 4,3 (1H , d,C-1’ phần đường ); 0,95 (3H, s,C-19); 0,78; 0,81; 0,82 là tín hiệu thuộc 3 nhóm metyl ở các vị trí C-21, C-28, C-29 còn 0,89 là của 3 nguyên tử H của C-26 (t,C-26). Phổ 13C-NMR (CDCL3/MeOD, 500 MHz), (ppm ): 140,6(s,C-5); 137,(d, C-22); 128,7(d,C-23); 120,8(d C-6); 100,7 (d, C-1); 76,9 (d,C-3); 76,9(d, C-5’); 76,4(d, C-3); 73,2(d, C-2); 70,1(d, C-4’); 61,9(t, C-6’); 56,1 (d, C-14); 55,4(d, C- 17); 50,3(d, C-9); 49,5(d, C-24); 29,5(t,C-2); 38,22(t,C-7); 31,5 (d, C-8); 36,0(s,C- 10) ; 24,4(t,C-11); 38,2(t,C-12); 31,5(s,C-13); 25,6(t,C-15); 31,1(t,C-16); 15,0(q,C- 18); 18,6(q,C-19); 45,1(d,C-20); 20,8(q,C-21); 33,2(t,C-25); 20,5(q ,C-26); 19,3(d,C-27); 18,8(q,C-280; 11,7(q,C-29). 2.4.2.3. Typhotrilozit A (RTtE3) Sau khi thu được hợp chất RttE2, tiếp tục rửa giải cột bằng hệ dung môi CHCl3 - MeOH (9:1), dịch phân đoạn này được kiểm tra SKLM trong hệ D, sau khi cất loại dung môi, cặn được kết tinh lại trong hệ dung môi cloroform/metanol thu được 120mg chất màu xám, dạng tinh thể vô định hình Rf.D x100 = 37, có nhiệt độ nóng chảy 189-190 0 C. Phổ FT-IR (viên nén KBr), νmax(cm -1 ): 3380,35; 3365 (O-H hoặc N-H); 2917,06 và 2815 (các dao động hóa trị C-H); 1646,5 (C=O); 1622 (C=C); 1537,0 ( dao động CO-NH); 1464,3; 1087,8 và 651. Phổ 1H-NMR (CDCl3/MeOD, 500MHz, ); (ppm): Phần aminoancol : 0,87 (t, J=8,7Hz); 1,26 (br s); 5,35 (m); 5,25 (m); 3,85 (dd, J=3,2Hz, 4,5Hz); 3,9 (m); 3,7 (dd, J=6,0Hz, 12,8Hz); 3,85 (dd, J=6,1Hz, 12,5Hz); 7,35 (d, J=9,1Hz). Phần axit 2-hidroxicacboxylic: 0,89 (t, J=8,7Hz); 1,26 (brs); 2.2 (m); 2,0 (m); 3,3 (dd, J=8,0Hz, 3,7Hz); không xác định. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 42 Phần đường: 3,75 (dd, J=11,7Hz; 5,36Hz) và 3,6 (dd, J=11,6Hz; 2,15Hz); 3,3 (m); 3,2 (m); 3,25 (m); 3,2 (m); 4,2 (d, J=7,8Hz). Phổ 13C-NMR (CDCl3/MeOD-d6, 125MHz); (ppm,): Phần aminoancol : 13,2 (q, C27); 21,5-32,4 (t, C6-C26); 128,9 (d, C5 ); 130,9 (d, C4 ); 71,8 (d, C3 ); 52,1 (d, C2); 68,2 (t, C1). Phần axit 2-hidroxicacboxylic: 13,2 (q, C23’) ; 22,5-32,4 (C4’-C22’); 128-131 (d, CH olefin) ; 34,3 (t, C3’) ; 71,9 (d, C2’) ;: 175,2 (s, C1’). Phần đường: 61,1 (t, C6’’) ; 76,1 (d, C5’’) ; 69,6 (d, C4’’) ; 75,9 (d, C3’’) ; 73,2 (d, C2’’) ; 102,8 (d, C1’’). Thủy phân typhotrilozit A: Cho 80mg typhtrilozit A, 50ml metanol, 5ml HCl 1M vào bình cầu 100ml. Sau đó đun hồi lưu 18 h, sau khi phản ứng kết thúc (kiểm tra bằng SKLM), dịch phản ứng được đưa vào phễu chiết 500ml, thêm 300ml nước cất, lắc đều. Hỗn hợp dịch được chiết với 3x100ml n-hexan, gộp các dịch chiết n-hexan, rửa bằng nước cất đến pH = 7, tiếp theo được làm khan bằng Na2SO4, đuổi hết dung môi thu được chất rắn trắng thuộc lớp chất axit 2- hydroxicarboxylic. Dịch nước còn lại được trung hòa bằng NH4OH (dd NH3 28%) đến pH = 7-8, sau đó chiết với 3x100ml clorofoc, gộp các dịch chiết, rửa bằng nước cất đến pH = 7, làm khan bằng Na2SO4, cô khô thu được chất lỏng màu nâu là hợp chất aminoancol. Hợp chất metyl-2-hidroxicacboxylat (RTtE3.1) (metyl-2-idroxitricosadienoat) C24H44O3: Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 43 Phổ EI- MS m/ z (%): 380 [M]+ (39 ,3), 442 (100) , 328 (25,0) , 300 (8,0 ), 272 (5,0 ), 124 (2,0) Phổ 1H-NMR (CDCl3, 500 MHz); (ppm): 4,06 (H, t, H-2), 3,79 (3H, s, CH3-O), 0,89 (3H, t, 8,7); 5,2-5,65 (m, H-olefin). Phổ 13 C-NMR (CDCl3, 125MHz); (ppm,): 179,7 (C-1’); 127,9;128,1; 130,1 và 130,2 (C-olefin); 70,4 (C-2’); 56,0 (CH3-O); 34,7 (C-3’); 21,4-30,9 (C-metilen); 14,4 (C-23’). Hợp chất aminoancol (RTtE3.2)C27H53NO2.HCl: Phổ EI-MS m/z (%): 460,1 [M+H]+ (Tính ra được công thức C27H53NO2: 423,1). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 44 CHƢƠNG 3. THẢO LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Nguyên tắc chung Để phân lập được các hợp chất trong bất kỳ một thực vật nào mà không làm ảnh hưởng tới thành phần hoá học có trong nó thì trước khi ngâm chiết bằng dung môi hữu cơ, mẫu thực vật phải được đưa đi khử men ngay sau khi thu mẫu và sấy khô ở điều kiện thích hợp. Về nguyên tắc việc ngâm chiết mẫu thực vật có thể tiến hành theo 2 cách phổ biến sau. 1. Chiết và phân lập các hợp chất từ mẫu thực vật bằng các loại dung môi có độ phân cực tăng dần: ete dầu hoả hoặc n-hexan, cloroform, etylaxêtat, metanol hoặc etanol v.v.... 2. Chiết tổng bằng các ancol (metanol, etanol) hay hệ dung môi ancol/nước. Sau đó tách loại các hợp chất bằng các loại dung môi có độ phân cực tăng dần như phương pháp 1 để thu được các dịch chiết có chứa các hợp chất có độ phân cực tương đối giống nhau. Việc chiết mẫu thực vật Bán hạ ba thùy (Typhonium trilobatum) được thực hiện theo phương án 2 (Sơ đồ 2.1). 3.2. Phân lập và nhận dạng các hợp chất có trong các dịch chiết khác nhau của cây Bán hạ ba thùy Các dịch chiết từ cây Bán hạ ba thùy (Typhonium trilobatum) đều là những hỗn hợp phức tạp chứa các hợp chất khác nhau. Để phân lập từng chất ra khỏi hỗn hợp, đã sử dụng các phương pháp sắc ký cột như: Cột nhồi silicagel, với các hệ dung môi rửa giải thích hợp và thường phải lặp lại nhiều lần. Việc tinh chế các chất thường dùng phương pháp kết tinh lại trong dung môi hoặc hệ dung môi thích hợp. Nhờ đó sẽ thu được các đơn chất có độ tinh khiết cao, đáp ứng các nhu cầu để khảo sát tính chất hóa lý và quang phổ của chúng. Đó là những yếu tố quan trọng trong Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 45 quá trình nhận dạng và xác định cấu trúc hóa học của các chất đã phân lập được từ các đối tượng nghiên cứu nói trên. Việc phân lập các thành phần hóa học từ thân rễ cây Bán hạ ba thùy được thực hiện như sơ đồ 2.1 và đã thu được các hợp chất sạch gồm các nhóm chất: Axit béo cacboxylic, sterol, glucozit, terpenoit và cerebrozit. 3.2.1. Axit cacboxylic Từ các dịch chiết n-hexan của cây Bán hạ ba thùy (Typhonium trilobatum) đã thu được một hỗn hợp các axit béo. Đó là các hợp chất tương đối đơn giản, dễ dàng nhận biết bằng những hằng số vật lý đặc trưng, các phổ GC-MS có so sánh với các phổ chuẩn trong thư viện phổ của máy phân tích GC/MS (Nist 98.1) với độ trùng lặp cao (xem phần thực nghiệm và phần phụ lục). 3.2.2. Các hợp chất sterol Những chất có khung steran được tìm thấy trong các dịch chiết của cây Bán hạ ba thùy thường là các sterol C29 với bộ khung 3 -ol 5 -pregnan hoặc dẫn xuất của nó, trong đó mạch nhánh có cấu hình và cấu dạng khác nhau. Dựa vào các hằng số lý hoá và đặc tính quang phổ của các chất đã phân lập được, so sánh với số liệu phổ của các chất chuẩn, đã chỉ ra những chất dưới đây: 3.2.2.1. Stigmast-5,22-dien-24R-3β-ol (RTtH6) Cặn thô màu trắng thu được kết tinh lại trong dung môi n-hexan cho tinh thể hình kim, không màu, không mùi. Nóng chảy ở 155-1570C, [ ]25D = - 43 0 (c=0,05; CHCl3). Trong phổ EI-MS có thể thấy pic ion phân tử [M] + ở 412 m/z, các phổ 1 H-NMR, 13 C-NMR và FT-IR khẳng định sự có mặt của nhóm hydroxyl (OH) H-3 = 3,49 ppm và C-3 = 71,8 ppm và max = 3406cm -1, có 3 proton thuộc nhóm metin (CH) của 2 nối đôi không liên hợp (FT-IR: 1621cm-1), 1H-NMR: H-6 = 5,33ppm, dd, J=5Hz và 2Hz; H-22 = 5,11 ppm, dd, J=15Hz và 5Hz; H-22 = 5,03 ppm; dd, J=15Hz và 5Hz; 13 C-NMR: C-5 = 140,7 ppm, C-6 = 121,6 ppm, C-22 = 138,3 ppm, C-23 = 129,2 ppm. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 46 Các số liệu về phổ 1H-NMR và 13C-NMR của nó hoàn toàn phù hợp với phổ của stigmast-5,22-dien-24R-3β-ol. Bảng 3.1. Số liệu phổ 13 C-NMR (CDCl3, 125Mhz) của một số phytosterol trong cây Bán hạ ba thùy (Typhonium trilobatum) STT Stigmasterol (ppm) -Sitosterol (ppm) 1 36.5 t 37.3 t 2 29.1 t 31.7 t 3 71.7 d 71.8 d 4 42.2 t 42.3 t 5 140.7 s 140.8 s 6 121.7 d 121.7 d 7 37.2 t 31.9 t 8 31.8 d 31.9 d 9 51.2 d 50.2 d 10 36.1 s 36.5 s 11 24.3 t 21.1 t 12 42.2 t 39.8 t 13 39.7 s 42.3 s 14 56.8 d 56.8 d 15 25.4 t 24.3 t 16 29.7 t 28.3 t 17 56.0 d 56.1 d 18 11.8 q 11.9 q 19 19.4 q 19.4 q 20 40.5 d 36.2 d 21 18.8 q 18.8 q 22 138.3 d 33.9 t 23 129.2 d 26.1 t Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 47 STT Stigmasterol (ppm) -Sitosterol (ppm) 24 50.1 d 45.9 d 25 31.6 d 29.2 d 26 21.2 q 19.1 q 27 21.0 q 19.4 d 28 18.9 t 23.13 t 29 12.0 q 11.9 q 3.2.2.2. -sitosterol (RTtH7) Là những tinh thể hình kim không màu cũng thu được từ dịch chiết n-hexan của cây Bán hạ, điểm nóng chảy 138-1400C. Khi trộn lẫn với chất chuẩn có nhiệt độ nóng chảy không thay đổi. Trong phổ EI-MS, quan sát thấy pic phân tử [M]+ của nó là 414, từ các phổ FT-IR, 1 H-NMR và 13 C-NMR có thể khẳng định sự có mặt của nhóm hydroxi (OH) : max = 3426 cm -1 (rộng, mạnh), H-3 = 3,53 ppm và C-3 = 71,7 ppm, một nối đôi C=C : max = 1651cm -1 (yếu), H-6 = 5,35 ppm (d), J=5Hz, C-5 = 140,7 ppm và C-6 = 121,7 ppm. Các số liệu về phổ FT-IR, MS, NMR và các hằng số vật lý của hợp chất này hoàn toàn phù hợp với -sitosterol. Độ dịch chuyển hoá học các nguyên tử C của nó được nêu trong bảng 3.1. 3.2.2.3. 3-O- -D-glucopyranosyl-stigmasterol (RTtE2) Chất rắn vô định hình, không tan trong cloroform, metanol, dễ tan trong hỗn hợp dung môi cloroform / metanol, nóng chảy ở 289-2900C. Phổ 13 C-NMR cũng cho biết có 35 tín hiệu của cacbon, trong đó có 7 tín hiệu của phần đường nằm trong vùng từ 61,9 ppm đến 100,7 ppm. Thêm vào đó là xuất hiện tín hiệu của nối đôi nằm ở C 137,5 ppm và 128,7 ppm. Các số liệu ở phổ 1 H-NMR cho biết, cũng phù hợp với các tín hiệu của phổ 13C-NMR. Chất này đem thuỷ phân trong axit loãng thu được stigmasterol, các phổ 1H-NMR và 13C-NMR Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 48 của sản phẩm thủy phân không còn những tín hiệu của gốc đường. Điều này cũng đã chứng tỏ chất rắn thu nhận được ở dạng vô định hình có điểm nóng chảy 296 - 298 0 C là 3-O- -D-glucopyranosyl-stigmasterol. 3.2.3. Hợp chất terpen-glycozit (RTtE1) Phổ 1H-NMR (CDCl3/MeOD-d6, 500MHz), (ppm): 0,65-2,35 là tín hiệu các nguyên tử H của các nhóm CH3, CH2 và CH trong mạch các bon; 3,95-4.85 là tín hiệu các mguyên tử H của các nhóm CH2và CH liên kết trực tiếp với O của phần đường và khung terpen ; 4,85 (d, H-1’phần đường ); 5-5,53 là tín hiệu các nguyên tử H của các liên kết olefin. Phổ 13 C-NMR (CDCl3/MeOD-d6, 125MHz) : (ppm): 11,8-57 là tín hiệu các nguyên tử C trong khung terpen, 61,8-77,7 là tín hiệu các nguyên tử C liên kết trực tiếp với O của phần đường và khung genin, 102,1 (C-1’ phần đường ), 121,6 và 123 tín hiệu các nguyên tử C olefin. (Xem phổ 1H-NMR và 13C-NMR & DEPT phần phụ lục). Qua phân tích các số liệu phổ NMR của hợp chất RTtE1, có thể khẳng định nó là một hợp chất terpen-glucozit. Để xác định được cấu trúc hóa học chính xác của RTtE1 cần có những nghiên cứu tiếp theo (Cần thực hiện nghiên cứu với khối lượng mẫu lớn hơn để thu được khối lượng RTtE1 đủ cho việc ghi các loại phổ cần thiết tiếp theo như: FT-IR, UV-VIS, MS phân giải cao) và một số phổ NMR 1chiều và 2 chiều...). 3.2.4. Hợp chất Typhotrilozit A (RTtE3) Cerebrozit hay glycosphingolipit (GSL), sphingosin, ceramit là nhóm hợp chất thiên nhiên lần đầu tiên phân lập được từ dịch chiết mô não và được mô tả vào nửa sau của thế kỷ 20. Đó là các amit hợp bởi một axít béo với aminoancol đều có Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 49 mạch cácbon dài với kích thước khác nhau, có mức độ no hóa và hydroxyl hóa cũng khác nhau, chúng có cấu trúc tổng quát như sau. R2 NH R1 HO OH O 1 2 3 1' 2' Trong cơ thể người có tới 40% lượng ceramit tập trung ở da với chức năng chủ yếu là hình thành rào cản ngăn nước thoát ra khỏi cơ thể. Những chất này cũng tham gia vào hệ miễn dịch của cơ thể với vai trò như là những kháng thể liên kết những tế bào khối u cũng như trong miễn dịch trị liệu ở những dạng ung thư cá biệt. Người ta cũng đã biết các cerebrozit có hoạt tính chống lở loét (anti-ulcerogenic), bảo vệ gan (hepatoprotective), ức chế enzym và kháng khuẩn cao. Gần đây đã phát hiện thấy các cerebrozit trong nấm, trong cây Aralia elata, loài bán hạ Trung Quốc (Typhonium giganteum), loài bán hạ Việt Nam (Typhonium blumei), Penilla ternata, Kỷ tử (Lycium chinense), tỏi (Allium sativum), đậu nành (Glycine max), trong động vật không xương sống như đỉa, cua biển, vi sinh vật biển, trong sao biển, bọt biển, hải sâm, san hô mềm (Xem phần tổng quan, Mục 1.2.4.2.). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 50 Từ dịch chiết etylaxetat củ, rễ của cây Bán hạ ba thùy (Typhonium trilobatum) đã thu được một hợp chất rắn kết tinh dạng vô định hình (0,021g/800g=0,003%), màu xám, có điểm nóng chảy 189-190 0 C, không tan trong nước, tan ít trong metanol, nhưng tan rất tốt trong hệ dung môi CHCl3/MeOH (tỷ lệ 2:1 v/v). Trong phổ FT-IR (KBr), quan sát thấy các hấp thụ đặc trưng ở tần số 3380,35; và 3365 cm -1 là dao động của các liên kết O-H hoặc N-H, ở 2917,06 và 2815 cm -1 là dao động của các liên kết hóa trị C-H; tại 1646,5 cm -1 (rất mạnh) là dao động của liên kết C=O amit bậc I; ở 1622 cm-1 là dao động của liên kết olefin (C=C), ở 1537,0 cm-1 là dao động biến dạng của liên kết NH amit; còn tại 1087,8 cm -1 là dao động của liên kết C-O-C và ở 651 cm-1 là dao động biến dạng của liên kết C-H (trang 51). Qua việc phân tích các số liệu phổ 1 H-NMR (trang 52), 13 C-NMR, DEPT- 135, DEPT-90 (trang 53), HSQC (trang 55) và HMBC (trang 56) của nó, có thể thấy hợp chất này có chỉ chứa một gốc đường -D-glucopyranoza, có nguyên tử H- 1'' ở H 4,2 ppm (1H, d, JH-1"-H-2" 7,8Hz), và phần genin là một gốc ceramit. Từ các phổ DEPT-90 và DEPT-135 cho biết, trong toàn bộ phân tử RTtE3 có 15 nhóm CH (các nguyên tử C có độ dịch chuyển hóa học C ở: 53,1; 69,6; 71,8; 71,9; 73,2; 75,9; 76,1; 102,8; 128,9; 128 - 131 ppm), trong đó có 5 nhóm metin (CH) là thuộc của phần đường -D-glucozơ, 7 nhóm metin (CH) là thuộc của các C olefin, 3 nhóm metin còn lại trong phần genin, thì 1 thuộc nhóm CH liên kết trực tiếp với N có C ở 53,1 ppm, 2 nhóm metin kia thuộc phần genin liên kết trực tiếp với oxi. Ngoài ra, phổ DEPT-135 của nó còn cho biết thêm, trong RTtE3 còn có 2 nhóm metylen (CH2) liên kết trực tiếp với O, một C-6’ ở 61,1 ppm (C-6’’) là nhóm CH2 thuộc phần đường, còn một tại C-1 ở 68,2 ppm (C-1) là nhóm CH2 thuộc nhánh aminoancol trong phần genin. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 51 Hình 3.1 Phổ FT-IR của typhotrilozit A Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 52 Hình 3.2 Phổ 1H-NMR của typhotrilozit A Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 53 Hình 3.3 Phổ 13C-DEPT của typhotrlozit A Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 54 Hình 3.4 Phổ 1H-1H-COSY của typhotrilozit A Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 55 Hình 3.5 Phổ HSQC của typhotrilozit A Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 56 Hình 3.6 Phổ HMBC của typhotrilozit A Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 57 Trong phổ 1H-NMR, có thể quan sát thấy độ dịch chuyển hóa học ( H) của một nguyên tử Ha ở 7,35 ppm (d, JHa-H2 =9,1Hz) đây là tín hiệu của nguyên tử Ha (NH) thuộc amit bậc 1, rất phù hợp với dao động hóa trị của liên kết CO amit ở tần số max=1646,5 và 1537 cm -1 trong phổ FT-IR, đồng thời cũng quan sát thấy có sự tương tác xa giữa nguyên tử Ha (NH) trong nhóm amit này với nguyên tử C-1’ trong nhóm carbonyl có C ở 175,2 ppm và với nguyên tử C-2 trong nhóm metin (CH) cận kề. Theo phổ HMQC của chất (RTtE3), thì một nguyên tử H có H ở 4,2 ppm, d, JH-H = 7,8 Hz có thể khẳng định đây là H-1" thuộc phần đường -D- glucozơ, có thể quan sát thấy tương tác xa giữa nó và nguyên tử C-1 của gốc aminoancol trong phần genin và C-2" trong phần đường. Các độ dịch chuyển hóa học ( H) của các nguyên tử H thuộc các nhóm metin trong phần đường có H nằm trong khoảng 3,2 – 3,75 ppm. Một nguyên tử H có H ở 3,9 ppm thuộc nhóm metin (CH), đây là nguyên tử H-2, cũng có thể quan sát thấy tương tác xa của nó với các nguyên tử C-1 và C-3 trong phổ HMBC. Còn nguyên tử H có H ở 3,85 ppm, chính là H-3 trong phần aminoancol và cũng có thể quan sát thấy tương tác xa giữa nguyên tử H này với các nguyên tử C-2 và C-4 trong phổ HMBC. Trong phổ 1 H-NMR và HSQC của RTtE3 còn cho thấy các nguyên tử H có H ở 0,87 ppm, đây là các nguyên tử H của 2 nhóm metyl (CH3) trong phần genin. Ngoài ra, nguyên tử H có H ở 3,70 và 3,85ppm, chính là các nguyên tử H-1a,b mà trong phổ HMBC cũng có thể quan sát thấy tương tác xa với C-1" trong phần đường có C-1’ ở 102,8 ppm và với C-2 (53,1 ppm) trong phần genin, và còn rất nhiều pic nằm trong khoảng 1,25- 2,5 ppm trong phổ 1H-NMR là thuộc về các nguyên tử H thuộc các nhóm metylen (CH2) trong phần genin của phân tử RTtE3. Những nguyên tử H có độ dịch chuyển hóa học nằm trong khoảng 5,25 – 5,35 ppm là thuộc các nguyên tử H của các nhóm metin (CH) trong các liên kết olefin, có từ 3-4 liên kết olefin trong phần genin. Tương tác xa giữa các nguyên tử H olefin này với các nguyên tử C trong phần genin của RTtE3 cũng có thể quan sát Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 58 thấy trong phổ HMBC của nó (Xem các phổ của RTtE3 ở các trang 51, 52, 53, 54, 55, 56 ). Những độ dịch chuyển hoá học đáng chú ý của typhtrilozit A được liệt kê ở bảng 3.2. Bảng 3.2. Độ dịch chuyển hóa học của Typhotrilozit A (CD3OD/CDCl3) C C a,b H a,c (J, Hz) 1H-1H COSY HMBC (H ↔ C) Phần aminoancol NH - 7.35 d (9.1) H-2 C-1, 2, 3, 1′, 2′ 1a 1b 68.2 t 3.85 dd (6.1, 12.5) 3.70 dd (6.0, 12.8) H-1b, 2 H-1a, 2 C-2, 3 C-2, 3 2 53.1 d 3.9 m H-1a, 1b, 3, NH C-1’, 3, 4 3 71.8 d 3.85 dd, (3.2, 4.5) H-2, H-4 C-1, 2, 4 4 130.9 d 5.25 m H-3, 5a, 5b C-2, 3 5 128.9 d 5.35 m H-4, 6 C-3,4,6 6- 26 21.5 -32.4 t 1.26 br s 27 13.2 q 0.87 t (8.7) H-13 Phần axit 2-hidroxicacboxylic 1′ 175.2 s - 2′ 71.9 d 3.30 dd, (8.0, 3.7) H-3′a, 3′b C-1′, 3′ 3′a 3′b 34.3 t 2.00 m 2.20 m H-2′, 4′ H-2′, 4′ C-1′, 2′ C-1′, 2′ 4′-22′ 22.5-32.4 t; 128-131 1.26 br s 23′ 13.2 q 0.89 t (8.7) H-25′ Phần đường 1′’ 102.8 d 4.2 d (7.8) H2’’ C2’’ 2′’ 73.2 d 3.2 m H1’’,3’’ C1’’,3’’ 3′’ 75.9 d 3.25 m 4′’ 69.6 d 3.2 m 5’′ 76.1 d 3.3 m 6’’ 61.1 t 3.6 dd, (11.6; 2.15) 3.75 dd, (11.7; 5.36) H5’’ C5’’ Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 59 Hợp chất RTtE3 được thủy phân bằng axit HCl 1M trong metanol, thu được một este metyl- 2-hidrocacboxylat (RTtE3.1). Phổ EIS/MS của nó cho pic phân tử là 380 (M+) phù hợp với công thức phân tử C24H44O3. Phổ 1 H-NMR cho biết một số độ dịch chuyển hóa học đặc trưng của một số nguyên tử H như: 4,06 (H, t, H-2), 3,79 (3H, s, CH3-O), 0,89 (3H, t, 8,7); 5,2-5,65 (m, H-olefin). Còn từ phổ 13C-NMR của nó có thể khẳng định được một số nguyên tử C có độ dịch chuyển hóa học như sau: 179,7 (C-1’); 127,9;128,1; 130,1 và 130,2 (C-olefin); 70,4 (C-2’); 56,0 (CH3-O); 34,7 (C-3’); 21,4-30,9 (C- metilen); 14,4 (C-23’). Ngoài ra, còn thu được một aminoancol (RTtE3.2) mà từ phổ EIS/MS của nó cho pic phân tử là 459 (M+) (xem phần phụ lục). Qua các phân tích tổng hợp các số liệu phổ của RTtE3 như trên, có thể khẳng định chất RTtE3 là một cerebrozit, chúng tôi đặt tên cho nó là typho trilozit A, và có thể đây là một chất mới lần đầu tiên phân lập được từ cây Bán hạ ba thùy. Công thức của hợp chất này có dạng sau. R2 NH R1O OH O 1 2 3 1' 2' O H HO H HO H H OHH OH R 1'' 2'' 3'' 4'' 5'' 6'' Do thời gian và khối lượng mẫu thực nghiệm còn ít, vì vậy để xác định cấu trúc hóa học hoàn thiện của cerebrozit này cần làm thực nghiệm với khối lượng mẫu nhiều hơn (khoảng 4-5kg) để thu được khối lượng chất RTtE3 đủ cho làm các thực nghiệm hóa lý (đo thêm các loại phổ như NMR, HR-FAB/MS và các loại phổ khác ..., tiến hành thực hiện các phản ứng hóa học như acyl hóa, thủy phân giáng vị để thu được các thành phần xây dựng lên phân tử RTtE3 như phần đường, phần genin gồm nhánh aminoancol và nhánh axit béo) nhằm thu thập các thông tin đầy đủ và cần thiết cho việc nhận dạng hợp chất typhotrilozit A. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 60 KẾT LUẬN 1. Lần đầu tiên, cây Bán hạ ba thùy (Typhonium trilobatum) mọc hoang dại ở Việt Nam được nghiên cứu sàng lọc hoá thực vật. Đã xác định được tên khoa học và phương pháp ngâm chiết hợp lý. 2. Từ thân, lá và rễ cây Bán hạ ba thùy (Typhonium trilobatum), đã phân lập được các lớp chất gồm: các axit béo no và không no, các hợp chất phytosterol, terpen- glycozit và cerebrozit. 3. Đã xác định được cấu trúc hóa học của 5 axit béo (axit palmitic, axit 11,14- octadecadienoic, axit 9,12-octadecadienoic, axit cis-linoleic, axit docosanoic), ba hợp chất phytosterol và glycozit của chúng ( -sitosterol, stigmasterol, 3-O- -D- glucopyranosyl-stigmasterol), khẳng định được một hợp chất tecpen-glycozit (RTtE1). 4. Lần đầu tiên 1 hợp chất cerebrozit (Typhotrilozit A) được phân lập từ cây Bán hạ ba thùy (Typhonium trilobatum), cấu trúc hóa học cơ bản của nó đã được khẳng định bằng các hằng số vật lý và các số liệu phổ hiện đại như: IR, MS, NMR với các kỹ thuật phổ 1D và 2D. Để khẳng định cấu trúc chính xác của nó cần có những nghiên cứu tiếp theo (vị trí các liên kết đôi, cấu hình tuyệt đối R,S, ... của phân tử). Đây là lớp chất có nhiều hoạt tính sinh học lý thú đóng vai trò quan trọng cho sự sống. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 61 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN 1. Nguyễn Quyết Tiến, Phạm Thị Hồng Minh, Nguyễn Ngọc Tuấn, Phạm Hoàng Ngọc, Phạm Quốc Long, Lành Thị Ngọc, Nguyễn Khắc Hồng . Primary Results on the Chemical Composition of Typhonium trilobatum, 30 th anniversary of the Institute of Chemistry, Vietnam Academy of Science and Technology, VAST-Proceedings, 9/2008. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 62 TÀI LIỆU THAM KHẢO A. Tiếng Việt 1. 1900 loài cây có ích ở Việt Nam, NXB thế giới, Hà Nội, tr. 251-257, (9/1993). 2. Khổng Thị Bình, Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cây Bán hạ (Typhonium blumei, Araceae), họ Ráy, Luận văn thạc sĩ hóa học, Đại học Sư phạm Thái Nguyên, (2007). 3. Võ Văn Chi, Từ điển cây thuốc Việt Nam, NXB Y học, Tr. 969, (1999). 4. Trần Đình Đại, Khái quát về hệ thực vật Việt Nam, Hội thảo Việt - Đức về hoá học và các hợp chất thiên nhiên, tr. 17-27, Hà Nội (1998). 5. Phạm Hoàng Hộ, Cây cỏ Việt Nam, NXB trẻ, (1999). 6. Đỗ Tất Lợi, Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nxb. Y học, tr. 44-47, (2001). 7. Lê Hữu Trác, Hải thượng y tôn tâm lĩnh. Hội YHDT T.P Hồ Chí Minh, Hội YHDT Tây Ninh , Tập VI. 1989 8. Tuệ Tĩnh, Hồng nghĩa giác tư y thư . Nxb. Y học, 1978 9. Nguyễn Quyết Tiến, Phạm Hoàng Ngọc , Trần Vân Hiền, Một số kết quả nghiên cứu về thành phần hoá học của cây Ráy (Alocasia macrorrhiza (L.) Schott.) mọc hoang ở Việt Nam, Tuyển tập các kết quả nghiên cứu khoa học viện Hoá học, tr. 22-25, (2001). 10. Nguyễn Quyết Tiến, Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cây Ráy (Alocasia macrorrhiza (L.) Schott, Arceae), Luận án tiến sĩ hóa học , Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, (2005). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 63 B. Tiếng Anh 11. Achebach H.; Gross J.; Domingez X. A.; Cano G.; Lignan, neolignan and norneolignans from Karameria cystisoides, Phytochemistry, 26, p.1159-1166, (1987). 12. Achebach H.; Utz W.; Lozano B.; Touche’ E. M. G.; Moreno S.; Lignan and neolignan from Karameria parifolia, Phytochemistry, 43, p.1093-1095, (1996). 13. Bus I.; Sies I. And Lie Ken Jie; 13 C-NMR of methyl, methylene, and carbonyl carbon atoms of methylalkenoates and alkynoates, Chem. Phys. Lipids., 18, p.130-144, (1977). 14. Bus I.; Sies I. And Lie Ken Jie, M. S. F.; 13 C-NMR of double and triple bond carbon atoms of unsaterated faty acid methylesters, Chem. Phys. Lipids, 17, p.501-518, (1976). 15. (a), Chan T. Y. K.; Chan L. Y.; Tam L. S. A.; Critchley J. A. J. H.; Neurotoxicity following the ingestion of chinese medicinal plant, Alocasia macrorrhiza., H. E. Toxicology, 14(9), p. 727-728, (1976). (b), Chen J. H., Cui G. Y.; Lin J. Y. Tan R. X.; Pinelloside and antimicrobial cerebrosides from Pinellia ternata (Thumb) Breit (Araceae). Phytochemistry., 64, 903-906, (2003). 16. Chow W. S.; Qian Luping; Good child D. J.; Anderson J. M.; Photosynthetic acclimation of Alocasia macrorrhiza (L.) G. Don to growth irradiance : Structure, function and composition of chloroplast., C.A., 109, 146500d, (1988). 17. Della G. M.; Molinaro A.; Monaco P.; Previtera L.; Dihydrobenzofuran neolignan from Arum italiacum, Heterocycles, 38, p.1099-1101, (1994). 18. Della G. M.; et. Al.; Neolignans from Arum italiacum, Phytochemistry, 35, p.777-779, (1994). 19. Della G. M.; Fiorentino A.; Monilaro A.; Monaco P.; Previtera L. Hydroperoxysterols in Arum italiacum, Nat. Prod. Lett., 5(1), p.7-14, (1994). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 64 20. Della G. M.; Fiorentino A.; Monilaro A.; Monaco P.; Previtera L.; Steroidal 5,6-epoxides from Arum italiacum, Nat. Prod. Lett., 2(1), p.27-32, (1993). 21. Della G. M.; Monilaro A.; Monaco P.; Previtera L.; Studies on aquatic plants, J. Nat. Prod., 53(6), p.1430-1435, (1990). 22. Della G. M.; Monilaro A.; Monaco P.; Previtera L.; Two new lignan glucosides from Arum italiacum, Heterocycles 36(9), p.2081-2086, (1993). 23. Dictionary of Natural Products (CD-ROM), Version 15.1, (August 2006). 24. Fox M. G.; French J. C.; Systematic occurence of sterols in latex of Araceae : Subfamily Colocasioideae, Am. J. Bot ., 75(1), (1998). 25. Gunstone F. D.; 13 C-NMR studies of mono-, di- and triacylglycerols leading to qualitative and semiquantatitave information about mixtures of these glycerolesters, Chem. Phys. Lipids, 58, p.219-224, (1991). 26. Gunstone F. D.; High resolution 13 C-NMR a technique for the study of lipid structure and composition. Prog. Lipid Res., 33(1/2), p.19-28, (1994). 27. Gunstone F. D.; High resolution 13 C-NMR spectra of long chain acids methylester, glycerolesters, Wax esters, nitriles, amides, alkohols and acetates, Chem. Phys. Lipids, 66, p.189-193, (1990). 28. Gunstone F. D.; Information on the composition of fats from their high resolution 13 C-NMR spectra, J. Am. Oil Chem. Soc., 70, p.361-366, (1993). 29. Gunstone F. D.; The 13 C-NMR spectra of six oil containing petroselinic acid and of aquilegia oil and meadowfoam oil, which contain 5 acids. Chem., Phys. Lipids, 58, p.159-167, (1991). 30. Gunstone F. D.; The composition of hydrogenated fats by high resolution 13 C- NMR spectroscopy, J. Am. Oil Chem. Soc., 70, p.965-970, (1993). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 65 31. Gunstone F. D.; The study of natural epoxy oil and epoxidized vegetable oils by 13 C-NMR spectroscopy, J. Am. Chem. Soc., 70, p.1139-1144, (1993). 32. Hong Jie Zhang; Pamela A. Tamez; Vu Dinh Hoang; Ghee Teng Tan; Nguyen Van Hung; Le Thi Xuan; Le Mai Huong; Nguyen Manh Cuong; Do Thi Thao; D. Doel Soejarto; Harry H. S. Fong and John M. Pezzuto.; Antimalarial compounds from Rhaphidophora decursiva, J. Nat. Prod., 64(6), p.772-777, (2001). 33. Jaroszewski J. M. et. Al.; Ring cleavage of phennols in higher plants: Bisoynthesis of triglochinin, Phytochemistry, 20, p.819, (1981). 34. Jung J. H.; Lee H.; Kang S. S.; Diacylglycerylgalactosides from Arisaema amurense, Phytochemistry, 42(2), p. 447-452, (1996). 35. Kato T.; Frei B.; Heindrich U.; Sticher O.; Antibacterial hydroperoxysterols from Xanthosoma robustum, Phytochemistry, 41(4), p. 1191-1195, (1996). 36. Lie Ken Jie M. S. F.; and Wong C. F.; Synthesis and NMR properties of positional isomers of methyl allenic fatty ester, Chem. Phys. Lipids, 61, p.243-254, (1992). 37. Mallet J. F.; Gaydou E. M. and Archarlis. A.; Quantitative high resolution 13 C- NMR of the olefinic and carbonyl carbons of edible vegetable oils, J. Am. Chem. Soc., 67, p.607-610, (1990). 38. Mazur A. W.; Hiler G. D.; Lee S. S. C.; Armstrong M. P. and Wendel J. D.; Regio- and stereoselective enzymatic esterification of glycerol and its derivatives, Chem. Phys. Lipids, 60(2), p.189-199, (1991). 39. Mehaoui Ahmed; Bodo Bernard; Irnigaine and N-methylirnigaine, two new piperidinol alkaloids from tubers of Arisarum vulgare, Nat. Prod. Lett., 7(2), p.101-108, (1995). 40. Mehaoui Ahmed; Jossang Akino; Bodo Bernard; Antibiotic and antifungal pyrrolidine alkaloids from Arisarum vulgare, Nat. Prod. Lett., 2(3), p.237-242, (1993). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 66 41. Mehaoui Ahmed; Jossang Akino; Bodo Bernard; Structure of irniine, a pirrolidine alkaloid from Arisarum vulgare, J. Nat. Prod., 55(7), p. 950-952, (1992). 42. Naoki Asai, Nobuhiro Fusetani, Shigeki Matsynagaa and Jun Sasakib; Sex pheromones of the hair crab Erimacrus isenbeckii. Part 1: Isolation and structures of novel ceramides, Tetrahedron, 56, 9895-9899, (2000). 43. Naofi Noda, Ryuichirro Tanaka, Kazushige Tsdino, Machiko Miura, Kazumoto Miyahara, and Junko Hayakawab; Two amphoteric galactocerebrosides possessing a tri-unsaturated long-chain base from the Leech (Hirudo nipponica), Chem. Pharm. Bull. 43(4), 567-570, (1995). 44. Nuzillard J. M.; Massiot G.; Logic for structure determination, J. Am. Oil Chem. Soc., 47(22),p.3655- 3664, (1991). 45. O’connor G. J.; Petrocevic S. F.; Coddington J. M. and Standley R. A. ; J. Am. Chem. Soc., 69, p.295-300, (1992). 46. Qin W. J.; et. al.; Elucidation of the structure of pedatisectine A, CA., 105, 94501a, (1986). 47. Qi J., Ojika M., Sakagami Y.; Termitromycesphins A-D, Novel neuritogenic cerebrosides from the edible Chinese mushroom Termitomyces albuminocusi. Tetrahedron, 56, 5835-5841, (2000). 48. Qin W. J.; et. al.; Study on the chemical constituents of Penilla pedate (Penilla pedatisecta), CA., 102, 109744f, (1985). 49. Qin W. J.; Ma L.; Wen Y.; Yang Lan; Chemical constituens of Pinellia pedate (Pinellia pedtisecta), C.A., 122, 298789m, (1995). 50. Rohr M.; Naegeli P.; Daly J. J.; New sesquiterpenoids of sweet flag oil (Acorus calamus), Phytochemistry, 18(2), p.279-281, (1979). 51. R. X. Tan and J.H. Chen; The cerebrosides, Nat. Prod. Rep., 20, 509-534, (2003). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 67 52. Sam Sik Kang, Ju Sun Kim, Yong Nan Xu, and Young Hee Kim; Isolation of a new cerebroside from the root bark of Aralia elata, J. Nat. Prod, 62, 1059-1060, (1999). 53. Saxena D. B.; Phenylindane from Acorus calamus., Phytochemistry, 25(2), p.553-555, (1986). 54. Shu Y. Z.; Recent natural products based drug development : A pharmaceutical industry perspective, J. Nat. Prod., 61, p. 1054-1071, (1998). 55. Sung T. V.; Kutschabsky L.; Porzel A.; Steglich W. and Adam G.; Sesquiterpenes from the roots of Homalomena aromatica., Phytochemistry, 31, p.1659-1661, (1992). 56. Thomas Kolter and Konrad Sandhoff; Sphingolipids - Their metobolic pathways and the pathobiochemistry of neurodegenerative diseases, Angew. Chem. Int. Ed, 38, 1532-1568, (1999). 57. Xuesong Chen, Yu-Lin Wua, and Dihua Chenb; Structure determination and synthesis of a new cerebroside isolated from the traditional chinese medcine Typhonium giganteum Engl,. Tetrahedron Letter, 43, 3529-3532, (2002). 58. Ward R. S.; Lignan, neolignan and related compounds, Nat. Prod. Rep., p.1-28, (1993). 59. Wollenberg K. F.; Quantitative high resolution 13 C-NMR of the olefinic and carbonyl carbons of edible vegetable oils, J. Am. Oil Chem. Soc., 67(8), p.487- 494, (1990). 60. Wollenberg K. F.; Quantitative triacylglycerol analysis of whole vegetable seed by 1 H and 13 C-NMR magic angle sample spinning NMR spectroscopy, J. Am. Oil chem. Soc., 68, p. 391-400, (1991). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 68 PHỤ LỤC 1. Các Axit cacboxylic 1.1. Axit béo (RTtH1-5) 1.1.1. Kết quả phân tích các axit béo trên máy GC/MS 2. Các hợp chất sterol 2.1. Stigmast-5,22-dien-3β-ol (RTtH6) 2.1.1. Phổ hồng ngoại FT-IR 2.1.2. Phổ khối lượng EI-MS 2.1.3. Phổ 1H-NMR 2.1.4. Phổ 13C-NMR 2.2.  -Sitosterol (RTtH7) 2.2.1. Phổ hồng ngoại FT-IR 2.2.2. Phổ khối lượng EI-MS 2.2.3. Phổ 1H-NMR 2.2.4. Phổ 13C-NMR và APT 2.3. 3-O--D-glucopyranosyl-β-stigmasterol (RTtE2) 2.3.1. Phổ 1 H-NMR 2.3.2. Phổ 13 C-NMR và DEPT 3. Hợp chất terpen-glucozit (RTtE1) 3.1. Phổ 1H-NMR 3.2. Phổ 13C-NMR và DEPT 4. Hợp chất typhotrilozitA (RTtE3) 4.1.Hợp chất metyl-2-hidroxicacboxylat (RTtE3.1) 4.1.1. Phổ LC/MS của RTtE3.1 4.1.2. Phổ 1H-NMR của RTtE3.1 4.1.3. Phổ 13C-NMR của RTtE3.1 4.2. Hợp chất aminoancol (RTtE3.2) 4.2.1. Phổ LC/MS của RTtE3.2