Luận văn Nghiên cứu thu hồi sinh khối của chủng vi khuẩn lactic Lc.TL6 và ứng dụng trong quá trình muối chua các sản phẩm rau quả

cứu về vai trò cụ thể của các cation trong các quá trình chuyển hoá, còn có ít nghiên cứu về vai trò tổng thể của các kim loại trong dinh dưỡng vi khuẩn lactic. Tuy nhiên, người ta cũng đã chứng minh được rằng, ion Fe 3+ , Mg 2+ , Mo 4+ , Se 4+, có thể ảnh hưởng đến dinh dưỡng của các cầu khuẩn lactic, hay các ion Mg 2+ , Mn 2+ , Fe 2+ có ảnh hưởng đến phát triển của trực khuẩn, đặc biệt là Mg 2+. Riêng đối với Lactobacillus, các ion Mg2+, Mn2+, Fe2+ có ảnh hưởng thuận lợi đến khả năng phát triển và sinh axit lactic của chúng (Ledesma, 1976). I.4.2. Một số yếu tố ảnh hƣởng tới quá trình trao đổi chất I.4.2.1. Ảnh hƣởng của oxy Nói chung các vi khuẩn lactic chịu được môi trường giàu oxy, nhưng một vài loài (sống trong đường tiêu hóa của động vật) là yếm khí nghiêm ngặt. Khi có mặt của oxy các loài này không có khả năng photphoryl hóa, tổng hợp cytochrom, Đồ án tốt nghiệp Cao Hoàng Lan 18 tổng hợp enzim. Một số tác giả lại cho rằng nhờ vào flavo-protein oxy hóa hay peroxi hóa, các loài yếm khí nghiêm ngặt cũng có thể thực hiện quá trình photphoryl hóa khi có mặt của oxy nhưng không quá nhiều. Các loài vi khuẩn có phản ứng khác nhau với độ hiếu khí của môi trường thậm chí còn đối nghịch nhau. Trong điều kiện yếm khí nghiêm ngặt chỉ có trực khuẩn lên men dị hình bắt đầu phát triển còn trực khuẩn lên men dị hình sinh trưởng giảm 10%, lên men giảm 23%. Các cầu khuẩn lên men dị hình, lên men arabinoza đạt tối ưu trong sinh trưởng ở điều kiện yếm khí, còn các loài không sử dụng được pentoza thì phát triển kém trong điều kiện này. I.4.2.2. Ảnh hƣởng của nhiệt độ [14], [17] Người ta phân chia vi khuẩn thành ba nhóm theo giới hạn nhiệt độ phát triển của chúng (Desmazeaud và Roissanrt, 1994) - Nhóm ưa lạnh là những vi sinh vật phát triển ở nhiệt độ dưới 7-10oC. - Nhóm ưa ấm là những vi sinh vật mà nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển của chúng là trên nhiệt độ môi trường (20 oC) và dưới nhiệt độ cơ thể con người (37 oC). Lactobacillus thuộc nhóm này. - Nhóm ưa nhiệt là những vi sinh vật mà nhiệt độ phát triển tối thích cử chúng trên 40 o C. Đối với vi khuẩn lactic nhiệt độ giới hạn của chúng là từ 5-55 oC, nhiệt độ tối ưu nằm trong khoảng 20-45 oC. Còn đối với thực khuẩn thể nhiệt độ này chỉ khoảng 30-37 o C. I.4.2.3. Ảnh hƣởng của pH [17] Hoạt động của vi khuẩn lactic chịu tác động mạnh của pH. Nếu pH không thích hợp vi khuẩn lactic có thể bị ức chế, phát triển kém, hay bị tiêu diệt. Chính vì vậy trong quá trình lên men lactic, khi axit lactic tích lũy đủ lớn thì ức chế luôn cả hoạt động của vi khuẩn lactic (pH<3,8) [1]. Nói chung quá trình lên men sẽ dừng lại khi pH đạt giá trị 4,0. Các loài vi khuẩn lactic khác nhau thì pH thích hợp khác nhau, dao động trong khoảng từ 4,5-6,5. Sự liên quan giữa pH đến hiệu suất lên men của vi khuẩn lactic còn là vấn đề mà các nhà khoa học đang tiếp tục nghiên cứu. Theo Giraud và cộng sự (1991) đối với vi khuẩn Lactobacillus plantarum A6, sự giảm pH sẽ làm giảm sự chuyển hóa cơ chất. Đồ án tốt nghiệp Cao Hoàng Lan 19 I.4.2.4. Ảnh hƣởng của áp suất thẩm thấu. Màng tế bào của vi khuẩn Gram dương là màng bán thấm nên nồng độ muối có ảnh hường rất lớn đến khả năng phát triển của tế bào. Nếu trong môi trường có nồng độ muối lớn tế bào sẽ bị mất nước, chịu trạng thái khô sinh lí, co nguyên sinh chất và sẽ bị chết nếu kéo dài. Ngược lại nếu nồng độ muối trong môi trường thấp, nước sẽ xâm nhập vào trong tế bào làm áp lực tăng lên. Vi khuẩn lactic có thể bị ức chế nếu nồng độ muối > 5%, tuy nhiên một số loài có khả năng chịu được nồng độ muối cao hơn. Có thể tăng khả năng chịu áp suất thẩm thấu của vi khuẩn lactic nếu bổ sung ion K+, gluxit hoặc axit amin. Đồ án tốt nghiệp Cao Hoàng Lan 20 PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu - hoá chất - thiết bị nghiên cứu 2.1.1. Nguyên liệu  Chủng giống vi khuẩn : Một chủng vi khuẩn lactic thuần khiết Lactobacillus lactis của Viện Thực Phẩm và hai chủng vi khuẩn lactic phân lập được từ nước dưa muối tự nhiên.  Nguyên liệu đầu : Giống rau cải bẹ Đông Dư được trồng ở xã Chiến Thắng, huyện Văn Giang, tỉnh Hưng Yên. Đây là giống cải bẹ có nguồn gốc từ xã Đông Dư, huyện Gia Lâm chuyên dùng để muối dưa và được trồng phổ biến ở phía bờ Bắc sông Hồng. Các loại nguyên liệu khác như cà pháo, cải thảo, dưa chuột... được mua từ chợ Bách Khoa. 2.1.2. Hoá chất Các hoá chất được sử dụng trong nghiên cứu gồm:  Các loại đường: Glucoza, saccharoza, maltoza, raffinoza, lactoza, galactoza, mannitol, Pháp  Cao thịt (Extrait de viande) - Biokar Dianogstique, Pháp  Cao men ( Extrait de levure) - Biokar Dianogstique, Pháp  CH3COONa (REACHIM, Liên Xô cũ)  KH2PO4 (Trung Quốc)  MgSO4.7H2O (Reanal, Hungary)  MnSO4.4H2O (Trung Quốc)  Pepton (Trung Quốc)  Thạch (Việt Nam)  Tween 80 (Merck, CHLB Đức)  Bromocresol tía (Trung Quốc) Đồ án tốt nghiệp Cao Hoàng Lan 21 2.1.3 Thiết bị  Kính hiển vi quang học OLYPIUS Model CHD Nhật Bản  Máy đo pH (744 pH Meter),  METROHM, Thuỵ Sỹ  Cân điện tử PB 303, METTRER TOLEDO, Thuỵ Sỹ  Cân điện tử SPB 54, SCALTEC, Canada  Micropipette Model P220, GILSON, Pháp  Tủ ấm Liên Xô  Máy đo OD 6300, JENWAY, Anh  Nồi hấp 3850M, Tuttnauer, Đức  Máy ly tâm 2.1.4. Môi trƣờng nuôi cấy  Môi trường MRS (Deman, Rogosa, Sharpe, 1960), g/l: Glucoza 20 ; pepton 10 ; cao nấm men 8 ; cao thịt 10 ; CH3COONa 2 ; K2HPO4 2 ; (NH4)2CO3 2 ; MgSO4.7H2O 0,2 ; MnSO4.4H2O 0,04 ; thạch 14 ; Tween 80 1ml ; nước cất 1000ml. Thanh trùng ở 1210C trong 20 phút, pH = 6 - 6,2. 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1 Nội dung và trình tự nghiên cứu 1. Đánh giá chất lượng nguyên liệu rau cải bẹ Cải được rửa sau hai lần nước, để ráo và xay bằng máy xay (lượng cải được xay có tỉ lệ đồng đều giữa lá, bẹ và ngọn). Lấy cải đã xay làm mẫu để phân tích các chỉ tiêu: a/ Xác định thành phần hoá lí  Hàm lượng chất hoà tan  Hàm lượng nước trong nguyên liệu  Hàm lượng đường tổng số  Hàm lượng axit hữu cơ tổng số  Hàm lượng vitamin C  Hàm lượng muối Đồ án tốt nghiệp Cao Hoàng Lan 22 b/ Xác định thành phần vi sinh  Kiểm tra tổng số vi sinh vật hiếu khí  Kiểm tra tổng số nấm men, nấm mốc 2. Phân lập và chọn chủng a/ Tiến hành muối dưa tự nhiên, lấy nước dưa vừa muối để phân lập chủng vi khuẩn lactic. b/ Nghiên cứu các đặc điểm hình thái học và tế bào học của hai chủng phân lập được và đối chứng với các đặc điểm của chủng Lb. lactis  Quan sát khuẩn lạc  Soi tiêu bản sống  Nhuộm tiêu bản  Xác định khả năng di động  Xác định hoạt tính catalaza  Xác định khả năng lên men các nguồn đường khác nhau  Nhuộm Gram Các đặc điểm sinh lí, sinh hoá  Kiểu hô hấp  Nhiệt độ phát triển  Khả năng chịu mặn  Khả năng phát triển ở các pH khác nhau c/ Khảo sát khả năng chịu mặn của ba chủng : sử dụng các chủng này để muối chua rau cải bẹ, đánh giá cảm quan sản phẩm. Chọn chủng thích hợp cho quá trình muối chua các sản phẩm rau quả dựa vào kết quả thu được từ các nghiên cứu trên. 3. Nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy thích hợp để sản xuất sinh khối vi khuẩn.  Khảo sát ảnh hưởng của chế độ nuôi cấy tĩnh và động đến khả năng tạo sinh khối lactic.  Khảo sát ảnh hưởng của chế độ duy trì pH trong quá trình nuôi cấy đến khả năng tạo sinh khối lactic.  Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ đường và nồng độ nitơ trong môi trường nuôi cấy đến khả năng tạo sinh khối lactic. Đồ án tốt nghiệp Cao Hoàng Lan 23 2.2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.2.1. Phƣơng pháp vi sinh vật 1. Xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí [7] Xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí nhằm đánh giá chất lượng nguyên liệu về mặt vi sinh vật học. Nguyên tắc: Nuôi cấy một lượng sản phẩm nhất định trên môi trường đặc trong hộp petri. Sau một thời gian nuôi cấy nhất định, mỗi tế bào sẽ phát triển thành một khuẩn lạc tương ứng. Từ số khuẩn lạc trong hộp thạch tính được số vi sinh vật hiếu khí có trong mẫu cần phân tích. Tiến hành : Sử dụng một lượng rau cải đã nghiền nhỏ, pha loãng, sau đó dùng micropipet lấy 0,1 ml để nuôi cấy trên môi trường thạch dinh dưỡng đựng trong hộp petri ở nhiệt độ 30  10C trong điều kiện hiếu khí, thời gian 24 - 72h. Đếm tất cả số khuẩn lạc mọc trên đó. Môi trường nuôi cấy, g/l: Pepton 5 Thạch 15 Cao men 2,5 Nước 1000ml Glucoza 4 Tổng số vi sinh vật hiếu khí được tính theo công thức sau: C N = ( n1 + 0,1 n2) d C : Tổng số khuẩn lạc đếm được trên tất cả các đĩa Số khuẩn lạc đếm được trong một đĩa phải nhân với hệ số 10 (quy cho 1 ml canh trường). n1 : Số đĩa đếm ở nồng độ pha loãng thứ nhất n2 : Số đĩa đếm được ở nồng độ pha loãng thứ hai d : Hệ số pha loãng của đĩa đếm thứ nhất Đồ án tốt nghiệp Cao Hoàng Lan 24 2. Xác định khả năng di động [6] Khả năng chuyển động của vi khuẩn lactic được nghiên cứu trên môi trường bán lỏng có thành phần như sau, g/l: Pepton 5 Thạch 15 Cao men 8 Tween80 0,5ml Cao thịt 5 Kali xitrat 1 MnSO4.4H2O 0,04 Bromocresol tía1,6% 2,8ml Thanh trùng trong nồi hấp áp lực ở 1210C trong 20 phút, pH của môi trường là 6,5. Nhỏ một giọt dịch có chủng nghiên cứu vào chính giữa hộp petri (không giàn đều bằng que gạt). Sau một thời gian phát triển, nếu vi khuẩn có khả năng chuyển động thì axit hữu cơ sinh ra sẽ khuếch tán đều về các phía và làm thay đổi màu của chất chỉ thị trên bề mặt hộp Petri. Nếu vi khuẩn không có khả năng chuyển động thì sự thay đổi màu chất chỉ thị chỉ được quan sát thấy ở xung quanh giọt chất lỏng nhỏ vào. 3. Nhuộm màu Gram [12] Việc nhuộm màu Gram được tiến hành với những tế bào còn non, thường là các giống nuôi cấy một ngày đêm. Thao tác nhuộm được tiến hành như sau: Nhỏ một giọt huyền phù vi khuẩn lên trên phiến kính, dàn đều. Làm khô vết bôi trong không khí và cố định trên ngọn lửa. Nhuộm vết bôi bằng tím gentian trong 1 - 2 phút, sau đó đổ thuốc nhuộm đi, xử lí bằng dung dịch Lugol trong 1 - 2 phút cho đến khi thẫm lại. Đổ dung dịch Lugol đi rồi khử màu bằng etanol 96% trong 0,5 - 1,0 phút. Rửa sạch tiêu bản bằng nước sau đó nhuộm bổ sung bằng dung dịch fuchsin. Đợi tiêu bản khô thì quan sát bằng vật kính dầu có độ phóng đại 1000 lần. Vi khuẩn Gram (+) bắt màu tím, vi khuẩn Gram (-) bắt màu đỏ. 4. Xác định khả năng tạo catalaza [14] Catalaza là một enzyme xúc tác phản ứng phân huỷ H2O2 thành nước và oxy không khí. Tất cả các vi khuẩn hiếu khí đều có hoạt tính catalaza. Sự có mặt của enzyme này rất quan trọng đối với sự phát triển của vi khuẩn lactic. H2O2 mất đi được nhận biết bởi sự tạo ra bọt oxy trên bề mặt của các khuẩn lạc. 5. Xác định khả năng lên men các nguồn đường [8] Sử dụng môi trường nuôi cấy có thành phần như sau, g/l : Đồ án tốt nghiệp Cao Hoàng Lan 25 NH4H2PO4 1 Bromocresol tía (1,6%) 1 ml KCl 0,2 Đường (*) 10 MgSO4 0,2 Agar 15 (*) : Glucoza, saccharoza, maltoza, dextrine, raffinoza, galactoza, lactoza, manitol Thanh trùng môi trường ở 1210C trong 21 phút, pH của môi trường từ 6,8 – 7. Nuôi cấy vi khuẩn được bảo quản trong ống thạch nghiêng MRS trong môi trường trên trong 7 ngày ở 300C. Nếu vi khuẩn chuyển hoá đường thành axit và làm giảm pH của môi trường, màu của chỉ thị sẽ chuyển sang vàng. 2.2.2.2. Phƣơng pháp hoá lý 1. Xác định hàm lượng chất hoà tan Hàm lượng chất hoà tan được xác định bằng chiết quang kế (Refractometer). Dịch rau, quả sau khi lọc ép được khuấy đều và lấy 1 - 2 giọt nhỏ vào chiết quang kế, đọc chỉ số trên chiết quang kế, đơn vị đo là 0Bx ở 200C. 2. Xác định hàm lượng nước trong nguyên liệu theo phương pháp sấy Nguyên tắc: nguyên liệu được sấy đến trọng lượng không đổi.Căn cứ vào khối lượng nguyên liệu trước và sau khi sấy, tính được hàm lượng nước trong nguyên liệu. Tiến hành: Lấy một chén nhôm hoặc sứ đem sấy ở 1050C đến trọng lượng không đổi, đặt chén trong bình làm khô đến khi nguội và cân chén (chính xác đến 0,001g). Sau đó cho vào chén 10g mẫu, sấy sơ bộ ở 500C trong 1giờ sau đó sấy ở 105oC. Sau khoảng 3 h lấy ra cho vào bình hút ẩm và cân, rồi lại đặt trong tủ sấy tiếp khoảng 30 phút rồi lại đặt trong bình hút ẩm và cân. Đến khi sai số giữa hai lần cân không quá 0,001g thì xem như quá trình sấy kết thúc. Tính kết quả: X: Hàm lượng nước có trong nguyên liệu (%) G1: Trọng lượng chén và mẫu trước khi sấy (g) G2: Trọng lượng chén và mẫu sau khi sấy (g) G: Trọng lượng chén không (g) 3. Xác định hàm lượng đường tổng số theo phương pháp Graxianop [6] 100* G1G 2G1GX    Đồ án tốt nghiệp Cao Hoàng Lan 26 Cơ sở của phương pháp : phương pháp dựa trên phản ứng: 2K3Fe(CN)6 + KOH 2 K4Fe(CN)6 + H2O + O Tiếp theo oxy nguên tử sẽ oxy hóa đường tạo thành axit saccaric: CH2OH(CHOH)4CHO + O COOH(CHOH)4COOH Đồ án tốt nghiệp Cao Hoàng Lan 27 Phản ứng tổng là: 4K3Fe(CN)6 + 4 KOH + CH2OH(CHOH)4CHO 4 K4Fe(CN)6 + COOH(CHOH)4COOH + H2O Tiến hành : - Chuẩn bị dịch đường đem phân tích: Cân 50 gam mẫu đã nghiền nhỏ cho vào một bình định mức 250 ml, thêm nước cất tới 3/4 bình rồi đun cách thủy ở 70--80oC trong thời gian 30--45 phút, trong thời gian đun thỉnh thoảng lắc mạnh để chất hòa tan được hòa tan hoàn toàn. Sau đó làm nguội và thêm nước cất tới vạch định mức rồi đem lọc. Sau khi lọc xong lấy 100 ml dịch lọc cho vào bình định mức 250 ml, thêm vào 5--7 ml axit HCl đặc rồi thủy phân ở 75--80oC trong 5 phút. Thủy phân xong đem trung hòa axit dư bằng dung dịch NaOH 30%, rồi thêm nước cất tới vạch định mức ta được dịch đường. - Xác định đường: Lấy 20ml Ferixianua kali 1% và 5ml KOH 2,5N cho vào bình tam giác, nhỏ thêm vài giọt xanh metylen, lắc đều, đun sôi trong 1 - 2 phút. Sau đó dùng dung dịch đường để chuẩn tới khi màu xanh metylen chuyển sang vàng rơm. Tính kết quả: D: Hàm lượng đường trong mẫu (g/l) V: Số ml dịch đường tiêu hao khi chuẩn hết 20 ml dung dịch Ferixianua kali 1% a: Lượng glucoza tương ứng với 20 ml dung dịch Ferixianua kali 1% 4. Xác định hàm lượng axit tổng số bằng phương pháp trung hòa [6] Nguyên tắc: Cơ sở của phương pháp là dựa trên phản ứng trung hòa giữa axit và kiềm. Từ lượng kiềm tiêu hao, tính được lượng axit tổng số có trong mẫu. Tiến hành - Cân 5 - 10g mẫu, nghiền nhỏ bằng cối sứ, thêm vào khoảng 50ml nước cất và đun cách thuỷ ở nhiệt độ 700C -80oơtrong 30-45 phút. Sau đó làm nguội tới nhiệt độ thường rồi định mức đến thể tích 100ml bằng nước cất rồi đem lọc. 100* V a D  Đồ án tốt nghiệp Cao Hoàng Lan 28 - Lấy 50 ml nước cất nóng cho vào một bình tam giác 250 ml, thêm vài giọt phenolphtalein rồi dùng NaOH 0,1N đến màu hồng nhạt.Sau đó cho vào bình tam giác 20 ml dịch lọc rồi dùng dung dịch NaOH 0,1 N chuẩn đến màu tương tự. Đồ án tốt nghiệp Cao Hoàng Lan 29 Tính kết quả: X: Lượng axit hữu cơ hoà tan trong mẫu (%) a: Lượng NaOH 0,1N dùng để chuẩn độ (ml) k: Lượng axit tương ứng với 1ml NaOH 0,1N V: Thể tích mẫu pha loãng (ml) v: Lượng dung dịch lấy để chuẩn độ (ml) g: Khối lượng mẫu (g) 5. Xác định hàm lượng Vitamin C [6] Hàm lượng vitamin C được xác định bằng phương pháp chuẩn độ Iod 0,01N. Cân 5 - 10 g nguyên liệu cho vào cối sứ nghiền nhỏ, cho vào khoảng 50ml HCL 2% và để trong bóng tối 10 phút để lượng axit ascocbic có trong nguyên liệu được hoà tan hoàn toàn. Sau đó định mức đến 100ml bằng nước cất và đem lọc. Lấy 20 ml dịch lọc, thêm vào vài giọt tinh bột 0,5%, lắc nhẹ rồi chuẩn độ bằng I2 0,01N tới khi bắt đầu xuất hiện màu xanh lam. Tính kết quả: X: Lượng Vitamin C có trong nguyên liệu (mg%) a: Lượng dung dịch I2 0,01 N dùng để chuẩn độ (ml) V: Thể tích mẫu pha loãng (ml) 0,00088: Lượng Vitamin C tương đương với 1ml I2 0,01N v: Lượng dung dịch đem chuẩn độ (ml) g: Khối lượng mẫu (g) 6. Xác định hàm lượng muối [6] Nguyên tắc: phương pháp dựa trên phản ứng sau: AgNO3 + NaCl = AgCl + NaNO3 Khi phản ứng kết thúc thì lượng AgNO3 dư sẽ phản ứng với kali cromat và cho kết tủa màu đỏ gạch. Nhờ đó ta nhận biết được điểm tương đương rõ nét hơn. 2AgNO3 + K2CrO4 = Ag2CrO4 + AgNO3 a . k .V X = x 100 v . g a . 0,00088 . V. 100 X = x 1000 v . g Đồ án tốt nghiệp Cao Hoàng Lan 30 Tiến hành : Cân 5 - 10g mẫu, nghiền kỹ bằng cối sứ, định mức lên 100ml bằng nước cất nóng, lắc đều và đem lọc. Lấy 10ml dịch lọc cho vào bình tam giác, thêm vài giọt kali cromat10% sau đó đem chuẩn độ bằng AgNO3 0,1N đến khi dung dịch có màu đỏ gạch. Tính kết quả: X: Hàm lượng muối ăn (%) A: Thể tích AgNO3 dùng chuẩn độ (ml) 0,00584: Lượng muối ăn ứng với 1ml AgNO3 0,1N V: Dung tích bình định mức (ml) v: Thể tích dung dịch đem chuẩn độ (ml) g: Khối lượng mẫu (g) 7. Xác định axit lactic - Phân tích định tính: Lấy vào ống nghiệm 5 - 7ml dịch cần nghiên cứu, thêm 1ml H2SO4 10% và vài giọt KMnO4 2%. Trên miệng ống đặt một miếng giấy lọc có tẩm dung dịch AgNO3 pha trong NH4OH (1 - 2ml dung dịch AgNO3 10%, thêm vài giọt NH4OH). Đun sôi ống nghiệm. Giấy lọc sẽ đen nếu trong dịch nghiên cứu có axit lactic. - Phân tích định lượng:  Phương pháp chuẩn độ: Trong trường hợp không yêu cầu độ chính xác cao có thể định lượng axit lactic bằng cách dùng NaOH 0,1N để chuẩn độ, chất chỉ thị là phenolphtalein.  Phương pháp đường chuẩn: Dùng nước dưa muối sau 2 ngày để pha loãng axit lactic tinh khiết 86% thành các nồng độ từ 1 đến 5%. Sử dụng NaOH 0,1N chuẩn 10ml axit lactic ở các nồng độ trên và vẽ thành đồ thị quan hệ giữa số ml NaOH 0,1N dùng để chuẩn 10ml axit lactic có nồng độ khác nhau. Khi chuẩn axit lactic trong dưa, từ số ml NaOH chuẩn 10ml nước dưa, dựa vào đồ thị và phương trình hồi qui ta suy ra số g axit lactic có trong dưa. Đồ thị được trình bày ở phần phụ lục. a . 0,00584 . V X = x 100 v . g Đồ án tốt nghiệp Cao Hoàng Lan 31 PHẦN 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn thích hợp sử dụng cho quá trình lên men lactic các sản phẩm rau quả Như đã nói ở phần tổng quan, các sản phẩm muối chua hiện nay ở nước ta chủ yếu được làm theo phương pháp thủ công, lên men tự nhiên, cho chất lượng không đồng đều, thời gian lên men dài, thời gian bảo quản lại ngắn. Trong khi đó trên thế giới, đặc biệt là một số nước châu Á các sản phẩm rau quả muối chua chủ yếu được sản xuất ở quy mô công nghiệp. Trong quá trình sản xuất, để tăng chất lượng sản phẩm người ta đã sử dụng chủng vi sinh vật lên men lactic thuần khiết. Sản phẩm không những có chất lượng tốt, ổn định mà còn có thể bảo quản trong thời gian dài. Do vậy, một trong các mục tiêu nghiên cứu của chúng tôi là tìm ra chủng vi khuẩn lactic thuần khiết, thích hợp cho quá trình muối chua các sản phẩm rau quả. 3.1.1. Đặc điểm hình thái, sinh lý, hoá sinh của các chủng vi khuẩn phân lập Sử dụng môi trường MRS thạch để phân lập vi khuẩn lactic có trong mẫu nước dưa muối chua tự nhiên sau 48 giờ. Từ các khuẩn lạc riêng rẽ, chúng tôi đã phân lập được một số chủng vi khuẩn sau đó chọn ra hai chủng vi khuẩn có khả năng phát triển tốt nhất để tiếp tục nghiên cứu, ký hiệu là chủng TL5 và TL6. Xác định một số đặc điểm hình thái, sinh lý và hoá sinh của hai chủng này và so sánh với chủng Lactobacillus lactis, kết quả thu được trình bày ở các bảng 1, 2 và 3. Đồ án tốt nghiệp Cao Hoàng Lan 32 Bảng 1 : Đặc điểm hình thái của các chủng nghiên cứu Đặc điểm TL5 TL6 Lb.lactis Đặc điểm khuẩn lạc Tròn, trắng đục, bề mặt nhăn, khô, mép răng cưa Tròn, trắng sữa, bề mặt nhẵn bóng Tròn, trắng đục, bề mặt nhẵn bóng, Hình dáng vi khuẩn, cách sắp xếp tế bào Hình cầu, xếp đơn, đôi hoặc chuỗi Hình cầu, xếp đơn đôi Hình que mảnh, xếp đơn đôi Sinh trưởng trên môi trường MRS lỏng Sinh trưởng tốt, có cặn, không đục Sinh trưởng tốt, đục, có cặn Sinh trưởng tốt, đục, có cặn Nhuộm Gram + + + Kiểu hô hấp Kỵ khí không bắt buộc Kỵ khí không bắt buộc Kỵ khí không bắt buộc Khả năng di độmg Không Không Không Khả năng tạo bào tử Không Không Không Bảng 2 : Đặc điểm sinh lý và hoá sinh của các chủng nghiên cứu Đặc điểm TL5 TL6 Lb.lactis Phát triển ở 150C ở 370C ở 450C  + -  + - - + - Phát triển ở pH = 3,5 pH = 5 pH = 6 pH = 7 pH = 8 pH = 9,5 - + + +  - - + + +  - -  + +  - Catalaza - - - Hiếu khí / Yếm khí Yếm khí tuỳ tiện Yếm khí tuỳ tiện Yếm khí tuỳ tiện Sinh axit lactic từ lên men : Glucoza Saccharoza Galactoza Lactoza Maltoza Raffinoza Mannitol + v + + v - v + + + + + - v + + + v + v + Nhuộm Gram + + + + : hơn 90% đường được lên men - : ít hơn 10% đường được lên men  : có phản ứng nhưng yếu, xảy ra muộn v : nhiều hơn 10% và ít hơn 90% đường được lên men Đồ án tốt nghiệp Cao Hoàng Lan 33 Hình 1a : Khuẩn lạc của chủng TL5 Hình 1b : Hình thái tế bào của chủng TL5, x 1000 Đồ án tốt nghiệp Cao Hoàng Lan 34 Hình 2a : Khuẩn lạc của chủng Lb.lactis Hình 2b : Hình thái tế bào của chủng Lb.lactis, x 1000 Đồ án tốt nghiệp Cao Hoàng Lan 35 Hình 3a : Khuẩn lạc của chủng TL6 Hình 3b : Hình thái tế bào của chủng TL6, x 1000 Đồ án tốt nghiệp Cao Hoàng Lan 36 Hình 3c : Hình thái tế bào của chủng TL6, x 10000 Hình 3d : Hình thái tế bào của chủng TL6, x 15000 Đồ án tốt nghiệp Cao Hoàng Lan 37 Bảng 3 : Hiệu suất lên men lactic của các chủng vi khuẩn nghiên cứu Chủng Axit lactic tạo thành, g/l Hiệu suất lên men lactic, % TL5 18,02 90,1 TL6 18,86 94,3 Lb.lactis 16,90 84,5 Qua bảng 1, 2 ta thấy hai chủng phân lập được từ nước dưa có các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hoá giống như các đặc điểm của nhóm vi khuẩn lactic theo khoá phân loại của BERGEY [18]. Vì vậy có thể kết luận sơ bộ là hai chủng TL5, TL6 là vi khuẩn lactic, gram âm, không tạo bào tử, yếm khí tuỳ tiện, không có hoạt tính catalaza. Mặt khác bảng 3 cho thấy hiệu suất lên men lactic của cảba chủng đều lớn hơn 80%, do đó chúng là vi khuẩn lactic lên men đồng hình. Dựa trên các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hoá thu được, hai chủng vi khuẩn lactic phân lập được có thể thuộc nhóm Lactococcus. Vì vậy chúng tôi tạm đặt tên cho hai chủng này là : - Chủng TL5 : Lactococcus sp.TL5 (Lc.TL5) - Chủng TL6 : Lactococcus sp.TL6 (Lc.TL6) 3.1.2. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến khả năng phát triển của các chủng phân lập Ba chủng vi khuẩn lactic được nuôi cấy trên môi trường MRS lỏng ở các nhiệt độ nuôi cấy khác nhau. Đo giá trị OD620 để đánh giá khả năng phát triển của chúng theo thời gian. Kết quả thu được được trình bày ở bảng 4 và hình 4a, 4b và 4c. Đồ án tốt nghiệp Cao Hoàng Lan 38 Bảng 4 : Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến khả năng phát triển của ba chủng vi khuẩn (OD620) Thời gian, h Mật độ quang, OD620 Lc.TL5 Lc.TL6 Lb.lactis 25 0 C 30 0 C 37 0 C 25 0 C 30 0 C 37 0 C 25 0 C 30 0 C 37 0 C 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 6 0,224 0,398 0,390 0,242 0,516 0,703 0,117 0,348 0,356 12 0,635 1,404 1,160 0,728 1,424 1,512 0,632 0,948 0,747 18 1,103 1,840 1,670 1,201 1,896 1,870 0,921 1,414 1,304 24 1,494 2,130 2,050 1,648 2,200 2,080 1,162 1,800 1,714 30 1,650 2,110 1,990 1,661 2,180 2,080 1,419 1,830 1,706 36 1,678 2,050 1,930 1,692 2,120 2,010 1,574 1,790 1,697 42 1,694 1,980 1,840 1,685 2,080 1,900 1,584 1,749 1,650 48 1,680 1,895 1,750 1,683 2,040 1,853 1,576 1,704 1,590 Đồ án tốt nghiệp Cao Hoàng Lan 39 Hình 4a. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của chủng Lc.TL5 Hình 4b. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của chủng Lc.TL6 Hình 4c. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của chủng Lb.lactis 0 0.5 1 1.5 2 2.5 0 6 12 18 24 30 36 42 48 Thêi gian, h O D 6 2 0 250C 300C 370C 0 0.5 1 1.5 2 2.5 0 6 12 18 24 30 36 42 48Thêi gian, h O D 62 0 250C 300C 370C 0 0.5 1 1.5 2 2.5 0 6 12 18 24 30 36 42 48 Th?i gian, h O D 6 2 0 250C 300C 370C Đồ án tốt nghiệp Cao Hoàng Lan 40 Dựa trên các kết quả thu được, có thể kết luận là ba chủng lactic có nhiệt độ phát triển thích hợp từ 23 – 370C ; chúng không phát triển hoặc phát triển yếu ở 15 0 C và 45 0 C. Nhìn chung, ba chủng vi khuẩn lactic này phát triển tốt nhất ở 300C. Mật độ tế bào của chúng đạt cực đại sau 18 – 24 giờ nuôi cấy và chúng tiếp tục phát triển khá ổn định sau giờ thứ 24. Mật độ tế bào của chúng giảm ít ở 370C. Chúng phát triển chậm ở 230C, mật độ tế bào chỉ đạt cực đại sau giờ nuôi cấy thứ 30 -36. Trong ba chủng trên, chủng Lc.TL6 có mật độ tế bào lớn nhất. 3.1.3. Ảnh hƣởng của nồng độ muối đến khả năng phát triển của ba chủng vi khuẩn lactic Muối đóng một vai trò quan trọng trong quá trình lên men lactic. Nó tạo ra cho sản phẩm cuối cùng một hương vị rất đặc biệt, ngoài ra, ở nồng độ muối tương đối cao (5-7%), đa số các vi sinh vật có hại đều bị ức chế. Bởi vì mục đích của nghiên cứu này là tuyển chọn được chủng vi khuẩn lactic thích hợp cho quá trình lên men các sản phẩm rau quả, do đó chúng tôi đã tiến hành các thí nghiệm để kiểm tra khả năng thích nghi của các chủng vi khuẩn trong môi trường có nồng độ NaCl cao. Ba chủng vi khuẩn được nuôi cấy trong môi trường MRS có chứa NaCl, nồng độ từ 5 đến 10%. Khả năng phát triển của các chủng vi khuẩn được đánh giá bằng giá trị mật độ quang OD620. Lượng axit lactic sinh ra được đo bằng thể tích NaOH 0,1N dùng để chuẩn 100 ml môi trường nuôi cấy. Kết quả được trình bày ở đồ thị 5a, 5b, 5c, 6a, 6b, 6c và trong bảng 5 đến 10 (phụ lục). Có thể nhận thấy là ba chủng vi khuẩn lactic này có thể chịu được nồng độ NaCl khá cao. Giá trị mật độ quang thu được thay đổi không đáng kể trong khoảng nồng độ muối từ 5 đến 7%. Khi nồng độ NaCl tăng lên 8%, khả năng phát triển giảm nhưng không đáng kể. Ở nồng độ NaCl 10%, ba chủng vi khuẩn này gần như bị ức chế hoàn toàn. Lượng axit lactic sinh ra trong quá trình lên men của ba chủng có thể coi là tương đương nhau và có thể đạt tới 8% ở nồng độ NaCl 5%. Đồ án tốt nghiệp Cao Hoàng Lan 41 0 0 . 2 0 . 4 0 . 6 0 . 8 1 1. 2 0 6 12 18 2 4 3 0 3 6 4 2 4 8 Th?i gian h O D 6 2 0 5% 6% 7% 8% 10% Hình 5a. Ảnh hưởng của nồng độ NaCl đến sự phát triển của Lc.TL5 0 0.5 1 1.5 2 0 6 12 18 24 30 36 42 48 Thêi gian h O D 6 2 0 5% 6% 7% 8% 10% Hình 5b. Ảnh hưởng của nồng độ NaCl đến sự phát triển của Lc.TL6 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 0 6 12 18 24 30 36 42 48 Thêi gian, h O D 6 2 0 5% 6% 7% 8% 10% Hình 5c. Ảnh hưởng của nồng độ NaCl đến sự phát triển của Lb.lactis Đồ án tốt nghiệp Cao Hoàng Lan 42 0 10 20 30 40 50 60 0 6 12 18 24 30 36 42 48 Thêi gian, h N a O H 0 .1 N , m l/ 1 0 0 m l 5% 6% 7% 8% 10% Hình 6a. Ảnh hưởng của nồng độ NaCl đến khả năng sinh axit lactic của chủng Lc.TL5 0 10 20 30 40 50 60 0 6 12 18 24 30 36 42 48 Thêi gian, h N a O H 0 .1 N , m l/ 1 0 0 m l 5% 6% 7% 8% 10% Hình 6b. Ảnh hưởng của nồng độ NaCl đến khả năng sinh axit lactic của chủng Lc.TL6 0 10 20 30 40 50 60 0 6 12 18 24 30 36 42 48 Thêi gian, h N a O H 0 .1 N , m l/ 1 0 0 m l 5% 6% 7% 8% 10% Hình 6c. Ảnh hưởng của nồng độ NaCl đến khả năng sinh axit lactic của chủng Lb.lactis Đồ án tốt nghiệp Cao Hoàng Lan 43 Do có muối trong môi trường nuôi cấy, vi khuẩn cần có một khoảng thời gian nhất định để có thể thích nghi với môi trường. Mật độ tế bào vì vậy chỉ đạt cực đại sau 36 – 48 giờ nuôi cấy. Trong ba chủng vi khuẩn, chủng Lc.TL6 có khả năng phát triển tốt nhất trong môi trường có nồng độ NaCl từ 7-8% và hàm lượng axit lactic sinh ra cũng lớn nhất. Chủng này có khả năng là chủng vi khuẩn thích hợp nhất cho quá trình lên men lactic các sản phẩm rau quả. 3.1.4. Khả năng lên men lactic các sản phẩm rau quả của các chủng vi khuẩn Sử dụng ba chủng vi khuẩn nói trên để muối chua các sản phẩm rau quả để kiểm tra khả năng lên men lactic. Chọn nguyên liệu là rau cải bẹ, công thức muối như sau: đường cho thêm vào là 2%, muối 6%, tỷ lệ giữa nước và nguyên liệu là 1:1, tỉ lệ tiếp giống 2% so với nguyên liệu. Tiến hành muối 4 mẫu : một mẫu muối tự nhiên (mẫu kiểm chứng) và ba mẫu muối có bổ sung ba chủng vi khuẩn lactic trên. Theo dõi quá trình lên men trong 72 giờ, hàng ngày đều xác định hàm lượng axit lactic tạo thành (bằng phương pháp chuẩn độ NaOH) và những thay đổi cảm quan của dưa cũng như nước dưa. Kết quả được trình bày ở đồ thị 7 và bảng 11 (phụ lục). Đồ thị 7 : Khả năng sinh axit lactic của ba chủng vi khuẩn trong quá trình lên men 0 10 20 30 40 0 24 48 72 96 Thêi gian, h N a O H 0 ,1 N ,m l/ 1 0 0 m l KiÓm chøng +Lc.TL5 + Lc.TL6 + Lb. lactis Đồ án tốt nghiệp Cao Hoàng Lan 44 Bảng 12 : Những thay đổi cảm quan trong quá trình muối dƣa Thời gian, giờ Chủng vi khuẩn Các giá trị cảm quan Màu sắc Mùi vị Trạng thái dưa Độ sánh nước dưa Dưa Nước dưa Dưa Nước dưa 24 Lc. LT5 Xanh, hơi vàng Hơi vàng, đục Hăng, không thơm Chua, không thơm Dòn Không sánh Lc. LT6 Xanh, hơi vàng Hơi vàng, đục Thơm, hăng Chua, thơm Dòn Không sánh Lb.lacti s Xanh, hơi vàng Hơi vàng, đục Thơm, hăng Thơm, hơi chua Dòn Không sánh Lên men tự nhiên Xanh Xanh xỉn, trong Hăng cay, không chua Hăng, Không chua Dòn Không sánh 48 Lc. LT5 Vàng sáng Vàng, hơi đục Chua, không thơm Chua, không thơm Dòn Không sánh Lc. LT6 Vàng sáng Vàng, đục Thơm, chua Chua, thơm Dòn Sánh, không nhớt Lb.lacti s Vàng sáng Vàng, đục Hơi chua, thơm Thơm, hơi chua Dòn Không sánh Lên men tự nhiên Xanh, hơi vàng Vàng, đục Hăng cay, hơi chua Hăng, hơi chua Dòn Không sánh, nhớt 72 Lc. LT5 Vàng Vàng, đục Chua, không thơm Chua, không thơm Kém dòn Sánh, không nhớt Lc. LT6 Vàng sáng Vàng, đục Chua, rất thơm Chua, thơm Dòn Sánh không nhớt Lb.lacti s Vàng Vàng đục Chua, thơm Chua, thơm Dòn Sánh, nhớt Lên men tự nhiên Vàng xỉn Vàng đục, có váng Chua, không thơm Chua, không thơm Kém dòn Sánh, nhớt, có váng Đồ thị 7 cho thấy việc bổ sung chủng vi khuẩn lactic thuần khiết đã đẩy nhanh quá trình lên men : các mẫu dưa muối có bổ sung chủng vi khuẩn thuần khiết đều có hàm lượng axit lactic tạo thành lớn hơn nhiều so với mẫu muối tự nhiên không bổ sung chủng, có thể đạt tới gấp đôi (đối với mẫu có bổ sung chủng Lc.TL6). Hơn nữa, qua các thay đổi cảm quan trong quá trình lên men, có thể kết luận là giá trị cảm quan của sản phẩm cuối cùng cũng được cải thiện khi muối chua Đồ án tốt nghiệp Cao Hoàng Lan 45 có bổ sung chủng vi khuẩn thuần khiết. Sau ngày muối thứ nhất, các mẫu dưa có sự thay đổi cảm quan không rõ rệt, dưa vẫn còn xanh, chưa chua. Sang đến ngày thứ hai đã có sự biến đổi, đối với mẫu muối có bổ sung chủng vi khuẩn thuần khiết, dưa đã chuyển sang trạng thái vàng sáng, dưa vàng đều, đã đạt được độ chua dịu của sản phẩm, nước dưa sánh nhưng không nhớt, trong khi đó mẫu lên men tự nhiên dưa vẫn còn xanh. Mẫu có bổ sung chủng Lc.TL5 cho dưa sản phẩm không có mùi thơm đặc trưng. Mẫu có bổ sung chủng Lc.TL6 có hàm lượng axit lactic tạo thành nhiều nhất đồng thời dưa có chất lượng cảm quan tốt nhất. Do đó chúng tôi đi đến kết luận chọn chủng Lc.TL6 là chủng thích hợp nhất cho quá trình muối chua rau cải bẹ nói riêng và các sản phẩm rau quả nói chung. 3.2. Nghiên cứu các điều kiện thích hợp của môi trƣờng nuôi cấy để tạo sinh khối vi khuẩn Lc.TL6. Môi trường MRS dùng để nuôi cấy vi khuẩn là môi trường có sử dụng các hoá chất đắt tiền như : pepton, cao men, cao thịt, do đó không phù hợp với quá trình sản xuất và thu hồi sinh khối ở quy mô lớn. Vì vậy, chúng tôi đã quyết định dùng môi trường dịch thuỷ phân nấm men bia (men sữa) làm môi trường thay thế cho môi trường MRS, để thay thế cho các hoá chất đắt tiền kể trên, ngoài ra thành phần cũng như hàm lượng các chất có trong môi trường MRS được giữ nguyên. Từ đây về sau chúng tôi đều tiến hành nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tạo sinh khối vi khuẩn Lc.TL6 trên môi trường dịch thuỷ phân nấm men này. 3.2.1. Ảnh hƣởng của chế độ thông khí Khi nghiên cứu ảnh hưởng của lượng oxy tới tốc độ tăng trưởng của chủng Lc.TL6, chúng tôi tiến hành nuôi cấy ở hai chế độ nuôi khác nhau : chế độ nuôi cấy tĩnh và chế độ nuôi cấy lắc (tốc độ lắc là 200 vòng/phút). Kết quả được trình bày ở đồ thị 8 và bảng 13 (phụ lục). 0 1 2 3 4 0 6 12 18 24 30 36 Thêi gian, h O D 6 2 0 nu«i cÊy l¾c nu«i cÊy tÜnh Đồ thị 8 : Ảnh hưởng của chế độ thông khí đến Đồ án tốt nghiệp Cao Hoàng Lan 46 khả năng phát triển của chủng TL6 So sánh kết quả nghiên cứu ở hai chế độ trên cho thấy : mật độ tế bào (được đo thông qua giá trị OD 620) của chủng Lc.TL6 trong trường hợp nuôi cấy lắc có tăng so với nuôi cấy tĩnh nhưng không đáng kể, tuy nhiên xét về mặt kỹ thuật và kinh tế đây lại là một ưu điểm khi nuôi cấy ở quy mô lớn. 3.2.2. Ảnh hƣởng của chế độ duy trì pH Trong quá trình sinh trưởng, vi khuẩn lactic tiêu thụ cơ chất và sinh ra một lượng lớn axit lactic cũng như các axit khác, làm giảm pH của môi trường nuôi cấy. Để nghiên cứu ảnh hưởng của pH trong suốt quá trình nuôi cấy tới khả năng phát triển sinh khối của chủng Lc.TL6, chúng tôi đã theo dõi quá trình nuôi cấy trong 36 giờ, cứ sau 3 giờ nuôi cấy lại chỉnh pH tới 6,2 là pH ban đầu của dịch nuôi cấy. 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 0 6 12 18 24 30 36Thêi gian (h) O D 6 2 0 Kh«ng ®iÒu chØnh pH § iÒu chØnh pH Đồ thị 9 : Ảnh hưởng của chế độ duy trì pH đến khả năng phát triển của chủng Lc.TL6 Đồ án tốt nghiệp Cao Hoàng Lan 47 6,2 5,9 4,9 4,64 5,5 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 33 36 Thêi gian, h pH Hình 10 : Biến thiên pH trong quá trình nuôi cấy Từ đồ thị ta thấy : khi duy trì pH ở 6,2, khả năng phát triển của chủng Lc.TL6 ở mọi thời điểm đều cao hơn so với môi trường nuôi cấy không duy trì pH. Như vậy, để tăng khả năng phát triển sinh khối, chúng ta nên nuôi cấy trên chế độ duy trì pH, cứ sau 3 giờ nuôi cấy lại đưa pH của môi trường về pH 6,2 là pH thích hợp cho sự phát triển của vi khuẩn. 3.2.3. Ảnh hƣởng của hàm lƣợng đƣờng và hàm lƣợng nitơ trong dịch nuôi cấy Hàm lượng nitơ tổng có trong dịch thuỷ phân nấm men là 10 g/l (được xác định nhờ phương pháp Kenđan). Ta biết rằng vi khuẩn lactic có nhu cầu về dinh dưỡng rất cao, tuy nhiên ở đây ta coi hàm lượng đường và hàm lượng nitơ trong dịch nuôi cấy là hai yếu tố chính ảnh hưởng đến quá trình tạo thành sinh khối. Để hiểu rõ hơn ảnh hưởng của từng yếu tố, ma trận thực nghiệm Box-Wilson được chọn cho nghiên cứu này. Với mỗi yếu tố, chọn khoảng xác định từ –1 đến +1. Giá trị –1 ứng với thành phần môi trường ở mức thấp nhất. Giá trị +1 được chọn có giá trị khá lớn để xem xét rõ hơn mức ảnh hưởng của từng yếu tố và giữa hai yếu tố với nhau đến khả năng sinh trưởng của chủng Lc.TL6. Giá trị 0 là giá trị trung bình. Ma trận đáp ứng được mục đích nghiên cứu của chúng tôi là xác định được ảnh hưởng của từng yếu tố và mối liên kết bậc một giữa hai yếu tố với nhau. Đồ án tốt nghiệp Cao Hoàng Lan 48 Dựa theo một số tài liệu tham khảo, chúng tôi chọn nồng độ đường trong dịch nuôi cấy biến thiên trong khoảng từ 20 đến 80 g/l. Nồng độ nitơ được chọn biến thiên trong khoảng từ 2 đến 8 g/l. Do có hai yếu tố ảnh hưởng nên số thí nghiệm tiến hành (đối với ma trận đầy đủ) là : N = 2 2 = 4, ngoài ra thêm một thí nghiệm nữa đối với giá trị 0. Bảng 15 : Kết quả thí nghiệm theo ma trận Box-Wilson Số thí nghiệm X1 X2 X1 X2 Y1 Y’1 Y2 Y’2 1 - - 20 2 3,5 3,5 16 16,5 2 - + 20 8 3,75 4,0 17 18 3 + - 80 2 7,75 7,75 44 48 4 + + 80 8 7,5 7,5 51 50 5 0 0 50 5 6,5 6,5 33 30,5 Trong đó: X1: Hàm lượng đường trong dịch nuôi câý, g/l X2: Hàm lượng nitơ trong dịch nuôi cấy, g/l Y1: Lượng sinh khối tạo thành, g/l Y2: Lượng axit lactic tạo thành, g/l Dùng phần mềm NEMROD để tính toán các hệ số hồi quy, ta thu được phương trình hồi quy có dạng như sau : Y1 = 12,9 + 0,84 X1 + 5,99 X2 + 0,64 X1X2 Y2 = 6,2+ 0,3 X1 + 3,8 X2 + 0,07 X1X2 Tất cả các hệ số hồi quy của phương trình đều có nghĩa. Từ phương trình thực nghiệm thu được, có thể nhận thấy rằng hàm lượng nitơ là nhân tố ảnh hưởng lớn nhất đến lượng sinh khối vi khuẩn tạo ra, đồng thời ảnh hưởng này là ảnh hưởng dương. Ngược lại, hàm lượng nitơ lại không có ảnh hưởng đáng kể đến lượng đường sót. Để tìm ra điểm tối ưu, chọn bước nhảy 0,5 g/l đối với nồng độ nitơ trong môi trường nuôi cấy và 5 g/l đối với nồng độ đường trong môi trường nuôi cấy. Thành lập ma trận thực nghiệm ảo, thí nghiệm đầu tiên được thực hiện tại mức 0 của các biến. Các giá trị của các biến trong các thí nghiệm sau được xác định theo phương trình sau : xj i = xj i-1 + j (j : bước nhảy của các biến) Bảng 16 : Ma trận thực nghiệm ảo Số thí nghiệm X1 X2 Y1 Y3 6 50 5 16,9 65,4 7 55 5,5 20 70,2 8 60 6 22,8 73,5 9 65 6,5 23,1 68,8 10 70 7 23,6 65,1 Đồ án tốt nghiệp Cao Hoàng Lan 49 Y3 : hiệu suất thu hồi sinh khối, % (xác định theo nồng độ đường ban đầu) Nồng độ nitơ và nồng độ đường càng tăng thì lượng sinh khối tạo ra càng nhiều, tuy nhiên khi nồng độ nitơ và nồng độ đường đạt đến một mức độ nào đó thì hiệu suất thu hồi sinh khối vi khuẩn lại giảm. Vì vậy điểm tối ưu hoá ở đây là : nồng độ nitơ 6 g/l ; nồng độ đường 60 g/l. 3.2.4. Động học của quá trình tạo sinh khối vi khuẩn Lc.TL6 Để khẳng định các kết quả thu được, chúng tôi đã nuôi cấy chủng Lc.TL6 trong 48 giờ và ở các điều kiện nuôi cấy tối ưu đã tìm ra ở trên : duy trì pH, nồng độ đường trong dịch nuôi cấy là 60 g/l, nồng độ nitơ 6 g/l. Theo dõi quá trình tạo sinh khối vi khuẩn. Các kết quả thu được được trình bày trong đồ thị 11 và bảng 17 (phụ lục). Đồ án tốt nghiệp Cao Hoàng Lan 50 0 10 20 30 40 50 60 0 6 12 18 24 30 36 42 48 Thêi gian, h L - î n g s in h k h è i t¹ o t h µ n h , g l/ L - î n g ® - ê n g s ã t, g /l Sinh khèi § - êng khö Hình 11 : Biến thiên của lượng đường và lượng sinh khối tạo ra trong quá trình phát triển của chủng Lc.TL6 Hình 11 biểu diễn sự giảm của hàm lượng đường và sự tăng của hàm lượng sinh khối của chủng Lc.TL6 trong quá trình lên men. Lượng sinh khối sinh ra đạt cực đại sau 24 giờ nuôi cấy và có thể đạt được 24 g/l. Điều này khẳng định rằng điểm tối ưu tìm ra là thích hợp. Sinh khối vi khuẩn thu được được ly tâm và thu hồi dưới dạng sữa men vi khuẩn để sử dụng trong quá trình muối chua các sản phẩm rau quả. 3.3. Sử dụng sinh khối vi khuẩn trong quá trình muối chua các sản phẩm rau quả khác nhau 3.3.1. Xác định tỷ lệ tiếp giống thích hợp Quá trình lên men lactic trong rau quả muối chua là kết quả hoạt động của hệ vi sinh vật bao gồm chủ yếu là vi khuẩn và nấm men. Ngoài những vi khuẩn lactic phát triển còn có những vi sinh vật lạ khác cũng phát triển như vi khuẩn axetic, vi khuẩn butiric, vi khuẩn gây thối và một số loại nấm mốc. Để tạo ra sản phẩm muối chua có chất lượng tốt cần tạo điều kiện cho vi khuẩn lactic hoạt động mạnh và ức chế các vi sinh vật lạ. Mục đích của việc đưa chủng vi khuẩn lactic vào quá trình muối chua rau quả là làm tăng hàm lượng vi khuẩn lactic trong môi trường lên men do đó chúng sẽ phát triển mạnh, lượng axit lactic tạo thành nhiều, pH môi trường giảm nhanh do đó ức chế được các vi sinh vật khác. Nếu hàm lượng vi khuẩn bổ sung vào ít thì quá trình lên men lactic diễn ra chậm, lượng axit tạo thành ít nên kéo dài thời gian lên men, nhưng nếu lượng tế bào vi khuẩn đưa vào nhiều quá có thể ảnh hưởng tới quá trình lên men mặt khác không đảm bảo vấn đề kinh tế khi sản xuất ở quy mô công nghiệp. Do đó cần tìm ra nồng độ tế bào vi khuẩn bổ sung thích hợp. Theo như tham khảo một số những nghiên cứu trước cho thấy rằng trong quá trình muối Đồ án tốt nghiệp Cao Hoàng Lan 51 chua rau quả thì nồng độ tiếp giống thích hợp là 2 – 4% đối với 2.108 - 4.108 tế bào/1g nguyên liệu. Do đó chúng tôi chọn nồng độ tiếp giống 0,04-1% để tiến hành thí nghiệm. Kết quả thu được ở đồ thị 12. 0 10 20 30 40 50 0 24 48 72 96Thêi gian (h) m l N a O H 0 ,1 N /1 0 0 m l 0% 0,04% 0,06% 0,08% 0,1% Hình 12 : Ảnh hưởng của tỷ lệ tiếp giống đến hàm lượng axit lactic sinh ra Có thể nhận thấy là lượng axit lactic sinh ra ở các mẫu có tỷ lệ tiếp giống cao lớn hơn so với các mẫu có tỷ lệ tiếp giống thấp. Đối với các mẫu có tỷ lệ tiếp giống 0,06%, 0,08%, 0,1%, lượng axit lactic sinh ra đạt cực đại sau 72 giờ, sau đó ổn định hoặc giảm đôi chút. Đối với các mẫu còn lại, lượng axit lactic giảm từ từ. Hai mẫu có tỷ lệ tiếp giống 0,08% và 0,1% có hàm lượng axit lactic sinh ra gần như nhau. Như vậy có thể kết luận là tỷ lệ tiếp giống 0,08% là thích hợp nhất đối với quá trình muối chua rau quả nói chung. 3.3.2. Sử dụng sinh khối vi khuẩn trong quá trình muối chua các loại rau quả 3.3.2.1. Xác định một vài thành phần hoá học của các nguyên liệu đầu Các nguyên liệu đầu như : cà chua, cải bẹ, su hào, dưa chuột, cải thảo đều được mua về và xác định các tính chất hoá học. Kết quả được trình bày ở bảng 18. Bảng 18 : Thành phần hoá học của nguyên liệu đầu Loại nguyên liệu Hàm lượng chất khô 0Bx Nước % Gluxit % Axit % Muối % Vitamin C mg % pH Cải bẹ 3,2 3,8 94  95 1,1 1,5 0,15  0,16 0,15  0,19 14 16 5,4  6 Su hào 3,5  4 92,4 2,5  3 0,11  0,15 0,17  0,2 31  40 6 Cải thảo 3  3,3 95 2  3 0,11  0,13 0,05  0,1 20  30 5,4  6 Cà chua 7  8 90  2,5 0,45  0,5 0,14  0,17 37 40 4,2 Đồ án tốt nghiệp Cao Hoàng Lan 52 92 2,9 4,3 Dưa chuột 3,2 3,5 95  96 1,8 2 0,11  0,15 0,04  0,05 30 35 5,5  6 Lượng nước trong các loại rau củ đều rất lớn, từ 90 – 96% trong khi hàm lượng đường và axit lại thấp (<3%). Nói chung pH của các loại rau quả đều là pH axit yếu, từ 5,4 – 6 trừ pH của cà chua. 3.3.2.2. Sử dụng sữa men vi khuẩn trong quá trình muối chua các loại rau quả khác nhau Sau khi đã ứng dụng quy trình muối chua đối với rau cải bẹ, như đã trình bày ở phần trước, chúng tôi tiếp tục ứng dụng quy trình chế biến này với các nguyên liệu khác và có sử dụng chủng vi khuẩn thuần khiết Lc.TL6 trong quá trình lên men, với tỷ lệ tiếp giống là 0,08%. Quá trình lên men được dừng lại khi sản phẩm cuối cùng đạt được độ axit cần thiết (0,5%). Kết quả thu được được trình bày ở bảng 9 và bảng 10. Bảng 9 : Thời gian cần thiết để muối chua các nguyên liệu rau quả khác nhau Nguyên liệu Thời gian, ngày Cải bẹ Dưa chuột Cà chua Su hào Cải thảo Muối chua tự nhiên 4 5 - 6 15 -17 7 - 8 4 -5 Muối chua có bổ sung chủng vi khuẩn thuần khiết 2 3 - 4 8 - 9 4 - 5 3 Bảng 10 : Nhận xét cảm quan các sản phẩm thu đƣợc Đồ án tốt nghiệp Cao Hoàng Lan 53 Nguyên liệu Giá trị cảm quan Sản phẩm Dịch Màu sắc Mùi vị Trạng thái Cải bẹ Muối chua tự nhiên Xanh, hơi vàng Chua, không thơm Ít diòn Sánh, nhớt, có cặn Bổ sung chủng vi khuẩn Vàng đều Chua dịu, thơm Dòn Sánh, không nhớt Dưa chuột Muối chua tự nhiên Xanh, hơi vàng Chua, thơm Ít diòn Nhớt Bổ sung chủng vi khuẩn Vàng đều Chua, thơm Dòn Không nhớt Su hào Muối chua tự nhiên Hơi vàng Chua, thơm Dòn Nhớt, có cặn Bổ sung chủng vi khuẩn Vàng sáng, đều Chua, thơm Dòn Sánh Cải thảo Muối chua tự nhiên Vàng nhạt Chua, không thơm Dòn Không sánh, có cặn Bổ sung chủng vi khuẩn Vàng đều Chua, thơm Dòn Sánh, không nhớt Cà chua Muối chua tự nhiên Xanh Chua Nhớt Bổ sung chủng vi khuẩn Vàng cam, đều Chua, thơm Dòn Sánh, không nhớt Đồ án tốt nghiệp Cao Hoàng Lan 54 Qua các kết quả thu được, có thể nhận thấy là việc bổ sung chủng vi khuẩn thuần khiết vào trong quá trình lên men lactic đã rút ngắn thời gian lên men, đặc biệt là đỗi với các nguyên liệu dạng củ như su hào, cà chua thì việc giảm thời gian lên men đóng vai trò rất quan trọng trong chế biến ở quy mô công nghiệp. Sản phẩm cuối cùng thu được đều có chất lượng tốt và đồng đều hơn : màu sắc đẹp, vị chua dịu, giòn, thơm đặc trưng và dịch lên men sánh nhưng không bị nhớt và cặn. Đồ án tốt nghiệp Cao Hoàng Lan 55 KẾT LUẬN  Hai chủng vi khuẩn lactic đã được phân lập từ nước dưa muối tự nhiên, trong đó chủng vi khuẩn Lc.TL6 là chủng vi khuẩn thích hợp nhất cho quá trình muối chua các sản phẩm rau quả khác nhau.  Các điều kiện nuôi cấy thích hợp cho quá trình tạo sinh khối vi khuẩn chủng Lc.TL6 đã được xác định :  Hàm lượng đường trong dịch nuôi cấy : 60 g/l  Hàm lượng nitơ trong dịch nuôi cấy : 6 g/l  Duy trì pH trong quá trình nuôi cấy Sinh khối vi khuẩn được sử dụng trong quá trình muối chua các nguyên liệu rau quả khác nhau dưới dạng sữa men, với tỷ lệ tiếp giống là 0,08%. Sản phẩm cuối cùng thu được đều có chất lượng đồng đều, màu sắc đẹp, giòn, chua dịu đồng thời thời gian bảo quản lại lâu hơn so với các mẫu muối chua theo phương pháp lên men truyền thống. Triển vọng và đề nghị  Xác định tên khoa học chính xác của chủng Lc.TL6  Nâng cao hiệu suất thu hồi sinh khối và nghiên cứu sử dụng và bảo quản sinh khối bằng phương pháp đông khô.  Ứng dụng chế phẩm này ở quy mô công nghiệp trong quá trình lên men lactic các sản phẩm rau quả khác nhau. Đồ án tốt nghiệp Cao Hoàng Lan 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty Vi sinh vật học Nhà xuất bản Giáo dục, 1997. 2. Nguyễn Văn Thoa, Nguyễn Vân Tiếp, Quách Đính Kỹ thuật bảo quản và chế biến rau quả Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, 1986 3. Quách Đính, Nguyễn Vân Tiếp, Nguyễn Văn Thoa Công nghệ sau thu hoạch và chế biến rau quả Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, 1996 4. Từ Giấy, Hà Huy Khôi, Bùi Minh Đức Bảng thành phần dinh dưỡng thực phẩm Việt Nam Nhà xuất bản Y học, 2000 5. Nguyễn Đình Thƣởng Tài liệu thí nghiệm Bộ môn lên men, trường Đại học Công nghiệp nhẹ, 1976 6. Lê Thanh Mai Các phương pháp kiểm tra vi sinh vật thực phẩm Bộ môn Công nghệ Sinh học-Thực phẩm, Viện Công nghệ Sinh học-Công nghệ Thực phẩm, trường Đại học Bách Khoa Hà nội 7. Nguyễn Lân Dũng Thực tập vi sinh vật học Nhà xuất bản Đại học và Trung học chuyên nghiệp, 1983 8. Lê Thanh Mai Đồ án tốt nghiệp Cao Hoàng Lan 57 Công nghệ sản xuất nấm men bánh mỳ Bộ môn Công nghệ Sinh học-Thực phẩm, Viện Công nghệ Sinh học-Công nghệ Thực phẩm, trường Đại học Bách Khoa Hà nội 9. Vũ Hồng Thắng Vai trò của nhóm vi khuẩn lactic trong quá trình chế biến nem chua Luận văn tốt nghiệp cao học, trường Đại học Bách Khoa Hà nội, 1998 10. Nguyễn Thị Hiền Microbiologie industrielle, tome 1, 2 Filière Technologie alimentaire, IPH 11. Trần Thị Xuân Sâm Biochimie travaux pratiques Filière Technologie alimentaire, IPH 12. Lê Ngọc Tú Biochimie alimentaire Filière Technologie alimentaire, IPH 13. Lại Quốc Phong L’optimisation de la fermentation des bactériocines de souche bactérienne lactique Tn143 isolée à partir des produits fermentés Mémoire de fin d’études, Filière Technologie alimentaire, IPH, 1999 14. Võ Nhân Hậu Recherche d’application les bactộries lactiques à la production du chou à larges pộtioles salộs Mémoire de fin d’études, Filière Technologie alimentaire, IPH, 2001 15. C.M.Bourgeois, J.-F.Mescle et J.Zucca Microbiologie alimentaire Tome 1 : Aspect microbiologique de la sộcuritộ et de la qualitộ des aliments Technique et Documentation, 1996 Đồ án tốt nghiệp Cao Hoàng Lan 58 16. C.M.Bourgeois, J.-P.Larpent Microbiologie alimentaire Tome 2 : Aliments fermentộs et fermentation des aliments Technique et Documentation, 1996 17. H. de Roissart, F.M.Luquet Bactộries lactiques, volume 1 Lorica, 1994 18. BERGEY’S MANUAL  OF SYSTEMATIC BACTERIOLOGY, 19. Volume 2 WILLIAM & WILKIN, Baltimore-London-Los Angeles_Sydney, 1986 20. Pierre Renault Que peut apporter la modification gộnộtique des bactộries lactiques 21. Laura Brandt Pickled to perfection 22. Mike Battcock, Sue Azam Ali Fermented fruis and vegetables. A global perspective FAO Agricultural services Bulletin No 134 23. La fermentation Bio Lacto 24. Yali Friedman Lactic Acid Bacteria as Food Preservatives International Journal of Food Microbiology, 1996 25. J.Elguero, M.Espada, D.Mathieu, R.Phan Tan Luu Plan d’expộriences 26. Jean-Claude Rouvevran Đồ án tốt nghiệp Cao Hoàng Lan 59 Le guide de la thốse. Le guide du mộmoire Maisonneuve & Larose, 1999 Đồ án tốt nghiệp Cao Hoàng Lan 60 Remerciements Je voudrais exprimer ma profonde reconnaissance à l’Institut de Biotechnologie et Technologie alimentaire, Institut Polytechnique de Hanoi, pour avoir favorisé mes études universitaires. Je tiens à remercier nos professeurs pour leur enseignement dévoué et leur aide efficace tout au long de la formation et de la réalisation de mon travail de recherche, et en particulier, le professeur Le Thanh Mai qui m’a beaucoup aidée et qui m’a apporté de précieux conseils dans la recherche de documentation et des idées ainsi que dans la rédaction. Mes respectueux remerciements vont aussi à l’AUF pour leur soutient au cours de mes cinqs années universitaires. Enfin, mes remerciements scincères sont destinés à ma famille, à tous mes amis pour leur sentiment et leur encouragement. Đồ án tốt nghiệp Cao Hoàng Lan 61 Đồ án tốt nghiệp Cao Hoàng Lan 62