Luận văn Nghiên cứu thu nhận enzyme từ phế liệu cá

Loïc Trích ly Keát tuûa Ly taâm laáy tuûa Cheá phaåm enzyme thoâ Xaùc ñònh hoaït tính enzyme 3 Töï phaân THUYEÁT MINH QUY TRÌNH: Noäi taïng caù tra: noäi taïng caù tra ñöôïc thu töø nhaø maùy cheá bieán thuûy saûn ñöôïc baûo quaûn laïnh ñoâng tröôùc khi ñem trích ly ñeå thu nhaän enzyme (-20oC). Thôøi gian baûo quaûn noäi taïng caøng ngaén caøng toát ñeå traùnh hieän töôïng enzyme bò bieán tính. Xöû lyù: loaïi boû maät ra khoûi noäi taïng caù tra. Xay maãu: cho noäi taïng vaøo xay ôû maùy xay thòt. Trong quaù trình xay caàn giöõ laïnh ñeå traùnh bieán tính enzyme. Trích ly enzyme: phoái troän nguyeân lieäu ñaõ xay vôùi dung moâi (nöôùc hoaëc dung dòch Na2CO3, HCl). Trong quaù trình naøy enzyme trong noäi taïng seõ hoøa tan vaø khuyeách taùn vaøo dung moâi. Töï phaân: ñeå thu nhaän enzyme noäi baøo. Loïc ñeå thu dòch chöùa enzyme: muïc ñích loaïi boû taïp chaát khoâng tan coù trong dòch enzyme. Keát tuûa: ñeå tinh saïch enzyme, chuùng ta boå sung caùc dung moâi höõu cô (ethanol) vôùi tyû leä thích hôïp vaøo dòch enzyme thoâ. Khi ñoù keát tuûa seõ xuaát hieän trong hoãn hôïp. Quaù trình keát tuûa caàn giöõ ôû nhieät ñoä 200C. Ly taâm thu nhaän protein ñaõ keát tuûa: hoãn hôïp ñöôïc ly taâm ôû 4oC vôùi vaän toác 3500 voøng/phuùt trong thôøi gian 10 phuùt nhaèm muïc ñích thu nhaän phaàn keát tuûa. Phöông phaùp xaùc ñònh haøm löôïng protein Ñònh löôïng protein hoøa tan theo phöông phaùp Lowry [5] Nguyeân taéc: Haàu heát protein ñeàu chöùa tyrosin vaø tryptophan. Tyû leä cuûa nhöõng axit amin naøy trong phaân töû tuøy thuoäc vaøo loaïi protein, vì vaäy nhöõng protein cuøng moät loaïi vôùi nhau thì tyû leä caùc axit amin naøy trong phaân töû cuûa chuùng nhö nhau. Khi cho protein taùc duïng vôùi thuoác thöû Folin seõ taïo thaønh moät phöùc chaát coù maøu. Cöôøng ñoä maøu saéc cuûa maãu thí nghieäm tyû leä vôùi haøm löôïng tyrosin vaø tryptophan (cuõng nhö haøm löôïng protein coù trong maãu. Treân nguyeân taéc naøy, ta coù theå duøng phöông phaùp so maøu ñeå xaùc ñònh haøm löôïng protein tan. Hoùa chaát: Dung dòch albumin 0,1%. Dung dòch A (ddA): 20 g Na2CO3 vaø 0,5 g Na-K Tartrat trong 1 lít NaOH 0,1N. Dung dòch B (ddB): 1 g CuSO4 .5H2O trong 1 lít nöôùc. Dung dòch C (ddC): 45 ml ddA + 5 ml dd B ñeå 24 h trong tuû maùt. Thuoác thöû Folin. Caùch tieán haønh: Dòch enzyme: 5 ml enzyme ñònh möùc leân 100 ml baèng nöôùc caát. OÁng M1: 0,2 ml maãu + 2 ml dd C, ñeå 10 phuùt roài theâm 2 ml Folin ñaõ pha loaõng 3 laàn. Ñeå 30 phuùt so maøu ôû 750 nm.. OÁng M2 : 0,2 ml nöôùc caát + 2 ml dung dòch C, ñeå 10 phuùt roài theâm 0,2 ml Folin ñaõ pha loaõng 3 laàn. Ñeå 30 phuùt so maøu ôû 750 nm. Xaây döïng ñöôøng chuaån Albumin: OÁng soá 0 1 2 3 4 5 Noàng ño protein (µg/ml) 0 100 200 300 400 500 Dd Albumin 0,1% (ml) 0 1 2 3 4 5 Nöôùc caát (ml) 10 9 8 7 6 5 Maät ñoä quang Tính toaùn keát quaû: Veõ ñoà thò vaø xaùc ñònh phöông trình ñöôøng chuaån albumin. Xaùc ñònh maät ñoä quang cuûa oáng maãu. Xaùc ñònh µmol protein tan cuûa oáng maãu töø phöông trình ñöôøng chuaån albumin. Xaùc ñònh noàng ñoä protein tan cuûa dòch chöùa enzyme. Noàng ñoä protein (CP) trong dòch enzyme ñöôïc tính theo coâng thöùc: Vôùi a : noàng ñoä protein trong dòch enzyme phaân tích (µg/ml). n : heä soá pha loaõng. C : noàng ñoä protein trong dòch enzyme phaân tích (mg/ml). Phöông phaùp xaùc ñònh hoaït tính enzyme Hoaït tính enzyme amylase [2, 4] Nguyeân taéc: Phöông phaùp naøy döïa treân cô sôû enzyme amylase thuûy phaân tinh boät tôùi caùc dextrin coù phaân töû löôïng khaùc nhau tuøy möùc ñoä thuûy phaân. Saûn phaåm thuûy phaân seõ coù maøu khaùc nhau vôùi I2. Baèng caùch ño maät ñoä quang cuûa dung dòch thuûy phaân seõ tính ñöôïc hoaït tính enzyme. Hoaït tính enzyme amylase ñöôïc bieåu thò laø soá µg tinh boät ñöôïc thuûy phaân do 1 ml dòch enzyme, trong 1 phuùt ôû 35oC, pH 7.2. Hoùa chaát vaø dòch chieát enzyme: Dung dòch ñeäm photphat pH 7,2. Dung dòch HCl 0,1 N. Dung dòch iot goác: Hoøa tan 0,25 g iot vaø 2,5 g KI vôùi 1 löôïng nhoû nöôùc caát. Laéc nheï ñeå hoãn hôïp hoøa tan hoaøn toaøn, sau ñoù chuyeån dung dòch sang bình ñònh möùc 100 ml, boå sung nöôùc caát ñeán vaïch möùc. Baûo quaûn dung dòch trong bình maøu naâu ôû choå toái trong thôøi gian 1 thaùng. Dung dòch iot phaân tích: Pha loaõng 2 ml dung dòch iot goác vôùi dung dòch HCl 0,1 N trong bình ñònh möùc dung tích 100ml. Tröôùc khi söû duïng caàn kieåm tra maät ñoä quang cuûa noù treân maùy so maøu quang ñieän ôû böôùc soùng l = 453 nm vôùi chieàu daøy cuvet 1mm. Maät ñoä quang cuûa dung dòch phaûi coù giaù trò 0,160 (±0.001). Neáu coù sai leäch veà maät ñoä quang phaûi hieäu chænh baèng caùch theâm 1 vaøi gioït axit HCl hoaëc dung dòch iot goác. Dung dòch tinh boät 1%: Hoøa tan 1 gam tinh boät (theo chaát khoâ tuyeät ñoái) vôùi 50 ml nöôùc caát trong bình ñònh möùc 100ml, laéc ñeàu. Ñaët vaøo beáp caùch thuûy ñang soâi, laéc lieân tuïc cho ñeán khi tinh boät tan hoaøn toaøn. Sau ñoù laøm nguoäi bình vaø boå sung 10ml dung dòch ñeäm phophat 7,2. Boå sung nöôùc caát ñeán vaïch möùc, laéc ñeàu. Dung dòch ñöôïc chuaån bò trong ngaøy söû duïng. Dòch enzyme pha loaõng: laáy 10 ml dòch chöùa enzyme, boå sung 2,5 ml ñeäm phophat 7,2 ; 12,5 ml dung dòch NaCl 0,1N. Giöõ hoãn hôïp ôû nhieät ñoä 35oC trong thôøi gian moät giôø. Caùch tieán haønh: Cho vaøo oáng nghieäm 5 ml dung dòch tinh boät 1%, ñaët vaøo beå ñieàu nhieät coù nhieät ñoä 35 oC trong 10 phuùt ñeå oån ñònh. Boå sung vaøo 10 ml dòch enzyme pha loaõng. Laéc ñeàu. Laáy töø oáng nghieäm 0,1 ml hoãn hôïp phaûn öùng cho vaøo oáng nghieäm khaùc chöùa 10ml dung dòch iot phaân tích, laéc ñeàu. Ñeå 15 phuùt, ño cöôøng ñoä maøu cuûa dung dòch ôû böôùc soùng l = 656nm so vôùi nöôùc caát, ta ñöôïc giaù trò D1. Sau 4 tieáng phaûn öùng, tieán haønh ño maät ñoä quang töông töï nhö treân ta coù ñöôïc giaù trò D2. Tính toaùn keát quaû: HTA : soá ñôn vò hoaït tính trong 1 ml dòch enzyme t : thôøi gian phaûn öùng (giôø); D1 : maät ñoä quang ban ñaàu; D2 : maät ñoä quang sau 4 giôø phaûn öùng; C : löôïng tinh boät ban ñaàu tham gia phaûn öùng (mg). V : theå tích dòch enzyme. Hoaït tính enzyme protease [1] Xaùc ñònh baèng phöông phaùp Anson caûi tieán. Nguyeân taéc: Hoaït tính enzyme protease ñöôïc bieåu thò laø soá µg tyrosin, sinh ra do söï thuûy phaân albumin cuûa enzyme coù trong 1 ml dòch, trong 1 phuùt ôû 45oC, pH 7.2. Hoùa chaát vaø dòch chieát enzyme: Dung dòch cô chaát protein 2%: 2g albumin + 36 g ure + 8ml dung dòch NaOH 1N + 40ml nöôùc caát, hoaø tan. Boå sung 10 ml dung dòch ñeäm photphat pH 7.2; chænh veà pH 7.2 baèng HCl 2 N. Ñònh möùc thaønh 100ml. Baûo quaûn trong tuû laïnh. Dòch enzyme pha loaõng: 5 ml maãu, 2.5 ml dung dòch ñeäm photphat pH 7.2 sau ñoù ñònh möùc thaønh 25 ml. (Heä soá pha loaõng n = 5). Caùch tieán haønh: Laáy 2 oáng nghieäm vaø tieán haønh nhö sau:( Moãi thí nghieäm laëp laïi 2 laàn) OÁng maãu (ml) OÁng khoâng (ml) Dung dòch albumin 2% trong ñeäm phophat 2 2 Ñeå ôû 45oC trong 5 phuùt Dung dòch axit tricloacetic 10% 0 4 Dòch enzyme pha loaõng 0,4 0 Laéc ñeàu, ñeå ôû 45oC trong 10 phuùt Dung dòch axit tricloacetic 10% 4 0 Dòch enzyme pha loaõng 0 0,4 Laéc ñeàu moãi oáng vaø ñeå laéng trong khoaûng 10 phuùt ôû nhieät ñoä phoøng, ñem loïc. Huùt vaøo caùc oáng nghieäm khaùc moãi oáng 2 ml dòch loïc, 4 ml dung dòch NaOH 0,5 N vaø 1 ml thuoác thöû Folin pha loaõng 6 laàn. Laéc kyõ. Ñeå 15 phuùt phaûn öùng. Sau ñoù ño maät ñoä quang cuûa dung dòch ôù böôùc soùng 620 nm. Xaây döïng ñöôøng chuaån tyrosin. Pha dung dòch tyrosin 100 µg/ml: Laáy 0,1 g tyrosin ñònh möùc leân 1000 ml Pha caùc dung dòch tyrosin chuaån coù noàng ñoä 0, 5, 10, 15, 20 µg/ml Dung dòch tyrosin chuaån (µg/ml) 0 5 10 15 20 Dung dòch tyrosin 100 µg/ml (ml) 0 5 10 15 20 Nöôùc caát (ml) 100 95 90 85 80 Tính toaùn keát quaû: Veõ ñoà thò vaø xaùc ñònh phöông trình ñöôøng chuaån tyrosin. Xaùc ñònh cheânh leäch maät ñoä quang giöõa dung dòch trong oáng maãu vaø oáng khoâng. Xaùc ñònh noàng ñoä tyrosin cuûa oáng maãu töø phöông trình ñöôøng chuaån tyrosin. Xaùc ñònh hoaït tính cuûa enzyme protease. Coâng thöùc tính: HTP : hoaït tính enzyme protease trong dòch chöùa enzyme. C : noàng ñoä tyrosin cuûa dung dòch trong oáng maãu. Vt : toång theå tích cuûa dung dòch trong oáng maãu. VE : theå tích cuûa dòch enzyme pha loaõng. t : thôøi gian phaûn öùng.(phuùt) n : heä soá pha loaõng. Hoaït tính enzyme lipase Xaùc ñònh baèng phöông phaùp chuaån ñoä, theo phöông phaùp cuûa Cherry-Crandall. [31, 16, 24] Nguyeân taéc: Hoaït tính enzyme lipase ñöôïc bieåu thò laø soá µmol axit beùo, sinh ra do söï thuûy phaân chaát beùo cuûa enzyme lipase coù trong 1 ml dòch, trong 1 giôø ôû 40oC, pH 8.0, coù söû duïng chaát nhuõ hoùa laø gum arabic. Hoaù chaát: Nhuõ töông daàu: cho 100 ml nöôùc caát vaøo erlen 250ml, boå sung 7g gum arabic. Hoaø troän cho ñeán khi tan hoaøn toaøn. Cho töø töø 100 ml daàu phoäng vaøo, sau ñoù ñem ñi ñoàng hoùa cô hoïc trong 10 phuùt. Baûo quaûn trong tuû laïnh, traùnh laïnh ñoâng vaø nôi nhieät ñoä cao. Laéc kyõ tröôùc khi söû duïng. Khoâng söû duïng neáu nhö heä nhuõ töông bò taùch pha sau khi laéc. Chaát chæ thò: hoøa tan 1g thylmolphthalein vaø 0,5 g phenolphthalein trong coàn 95% vaø ñònh möùc leân 100 ml baèng coàn 95%. Ñeäm Tris, pH 8.0: troän 25 ml dung dòch Tris (hydroxymethyl aminomethane) 0,2M (2,43g/100ml) vôùi 25 ml HCl 0,1N. Ñònh möùc leân 100 ml baèng nöôùc caát. Kieåm tra laïi pH, vaø ñieàu chænh veà pH 8,0. Coàn 95%. Dung dòch NaOH chuaån 0,1N. Caùch tieán haønh: (chuaån bò 2 maãu thí nghieäm, 2 maãu traéng) Maãu thí nghieäm Maãu traéng Dung dòch ñeäm pH 8 (ml) 2 2 Nhuõ töông daàu (ml) 6 6 Dòch chieát enzyme (ml) 6 6 Coàn 95% (ml) 0 6 UÛ 20 giôø ôû 40oC Coàn 95% (ml) 6 0 Nöôùc caát (ml) 20 20 Chaát chæ thò (gioït) 8 8 Löôïng NaOH 0,1N chuaån ñoä (ml) Chuaån ñoä ñeán giaù trò pH 10,5. (Dung dòch coù maøu tím) Tính toaùn keát quaû: Coâng thöùc tính hoaït tính lipase (HTL): V = V2 – V1 laø theå tích NaOH 0,1 N duøng ñieàu chænh (ml). V1 laø theå tích NaOH söû duïng trong bình kieåm chöùng (ml). V2 laø theå tích NaOH söû duïng trong bình thí nghieäm (ml). N laø noàng ñoä ñöông löôïng cuûa NaOH (N) Vmaãu laø theå tích cuûa dòch chieát enzyme (ml). t laø thôøi gian enzyme xuùc taùc thuûy phaân (h). Hoaït tính rieâng cuûa enzyme HTA : Hoaït tính enzyme amylase. HTRA : Hoaït tính rieâng enzyme amylase. HTP : Hoaït tính enzyme protease. HTRP : Hoaït tính rieâng enzyme protease. HTL : Hoaït tính enzyme lipase. HTRL : Hoaït tính rieâng enzyme lipase. CP : Noàng ñoä protein trong dòch chöùa enzyme. Keát quaû vaø baøn luaän Xaây döïng ñöôøng chuaån Caàn thieát xaây döïng ñöôøng chuaån protein tan ñeå xaùc ñònh haøm löôïng protein tan trong dòch enzyme pha loaõng. Vôùi chaát chuaån laø dung dòch albumin, xaây döïng ñöôøng chuaån vôùi caùc noàng ñoä laàn löôït laø 0, 100, 200, 300, 400, 500 (µg/ml). Bảng 4.1. Xaây döïng ñöôøng chuaån protein. Noàng ñoä protein tan (µg/ml) Maät ñoä quang ôû böôùc soùng 750 nm (A) L1 L2 L3 Trung bình 0 0,000 0,000 0,000 0,000 100 0,173 0,177 0,179 0,176 200 0,322 0,330 0,318 0,323 300 0,419 0,423 0,425 0,422 400 0,552 0,556 0,548 0,552 500 0,655 0,676 0,678 0,670 Noàng ñoä protein tan (µg/ml) Maät ñoä quang (A) Hình 4.1. Ñöôøng chuaån protein. Ñöôøng chuaån tyrosin ñeå hoã trôï cho vieäc xaùc ñònh hoaït tính enzyme protease theo phöông phaùp Anson caûi tieán. Noàng ñoä cuûa dung dòch tyrosin laàn löôït laø: 0; 5; 10; 15; 20 (µg/ml). Bảng 4.2. Xaây döïng ñöôøng chuaån tyrosin. Noàng ñoä tyrosin (µg/ml) Maät ñoä quang ôû böôùc soùng 620 nm (A) L1 L2 L3 Trung bình 0 0,000 0,000 0,000 0,000 5 0,063 0,064 0,071 0,066 10 0,110 0,117 0,120 0,116 15 0,205 0,207 0,208 0,207 20 0,265 0,268 0,267 0,267 Maät ñoä quang (A) Noàng ñoä tyrosin (µg/ml) Hình 4.2. Ñöôøng chuaån tyrosin. So saùnh maãu coù maät vaø khoâng coù maät Thaønh phaàn trong maät goàm coù axit maät vaø muoái maät. Chuùng coù nhöõng tính chaát sau: Caùc axit maät ñeàu khoâng toàn taïi döôùi daïng töï do trong dòch maät maø chuùng lieân keát vôùi glyxin hoaëc taurin taïo thaønh caùc muoái maät. Caùc muoái maät ña soá ñeàu toàn taïi ôû daïng muoái natri maø trong ñoù glyxin hay taurin coù nhoùm amin taïo thaønh lieân keát gioáng lieân keát peptit vôùi axit maät. Caùc muoái maät thöôøng gaëp nhö: glycocholat natri, hay taurocholat natri. Caùc axit maät coù nhoùm coù cöïc vaø nhoùm khoâng cöïc neân deã xen vaøo caùc haït lipid laøm giaûm söùc caêng maët ngoaøi laøm cho caùc haït lipid taùch ra thaønh caùc haït nhoû döôùi daïng nhuõ töông beàn vöõng. Döôùi daïng nhuõ töông lipid coù toång dieän tích beà maët raát lôùn ñeå enzyme lipase tieáp xuùc vaø taùc duïng. ÔÛ daïng caáu truùc khoâng gian taát caû caùc nhoùm coù cöïc vaø khoâng cöïc cuûa muoái maät ñeàu ôû cuøng moät phía töông öùng. Caùc phaân töû naøy naèm ôû maët phaúng ranh giôùi giöõa hai pha loûng vaø môõ ñeå taïo thaønh traïng thaùi nhuõ töông beàn. Do vaäy, khaûo saùt söï aûnh höôûng cuûa maät ñeán hoaït tính cuûa caùc enzyme laø caàn thieát. Chuùng toâi tieán haønh so saùnh hoaït tính enzyme ôû maãu boû maät (BM) vaø maãu coøn maät (M). Noäi taïng caù tra ñöôïc raõ ñoâng, moät phaàn loaïi boû maät vaø moät phaàn khoâng loaïi boû maät. Nguyeân lieäu noäi taïng caù sau khi ñöôïc xöû lyù, ñöôïc ñem ñi xay (muïc ñích phaù vôõ caùc teá baøo), trích ly vôùi nöôùc caát trong 3 giôø (ñaây cuõng laø khoaûng thôøi gian xaûy ra söï töï phaân ôû nguyeân lieäu, muïc ñích trích ly nhöõng enzyme noäi baøo), ôû nhieät ñoä thöôøng (300C) vôùi tyû leä nguyeân lieäu vaø nöôùc caát (theo khoái löôïng) laø 1 : 5. Tieáp theo, maãu ñöôïc ñem ñi loïc vaûi 2 laàn, moät laàn ñeå loaïi boû nhöõng thaønh phaàn khoâng tan coù khoái löôïng rieâng lôùn hôn dòch trích ly (phaàn baõ), vaø laàn thöù hai ñeå loaïi nhöõng phaàn coù khoái löôïng rieâng nheï hôn (phaàn môõ caù, vaø daàu caù). Chuùng toâi khoâng söû duïng phöông phaùp ly taâm ñeå thu dòch sau trích ly, vì theo khaûo saùt thöïc nghieäm söû duïng phöông phaùp ly taâm khoâng coù hieäu quaû do maãu taùch laøm 4 lôùp gaây khoù khaên cho vieäc thu nhaän dòch trích ly. 4 3 2 1 Hình 4.3. Söï taùch lôùp cuûa maãu sau trích ly thöïc hieän quaù trình ly taâm (1-lôùp baõ, 2-lôùp dòch trích ly, 3-lôùp môõ, 4-lôùp daàu). Caùc maãu noäi taïng coøn maät (M1, M2, M3) vaø maãu boû maät (BM1, BM2, BM3) sau khi trích ly vaø loïc laàn löôït seõ ñöôïc xaùc ñònh noàng ñoä protein , hoaït tính caùc enzyme amylase, protease, lipase, vaø hoaït tính rieâng cuûa caùc enzym amylase, protease, lipase. NOÀNG ÑOÄ PROTEIN TRONG DÒCH TRÍCH LY TÖØ NOÄI TAÏNG CAÙ TRA. Dòch trích ly ñöôïc pha loaõng vaø xaùc ñònh noàng ñoä protein trong dòch trích pha loaõng, töø ñoù coù ñöôïc noàng ñoä protein trong dòch trích ly. Bảng 4.3. Noàng ñoä protein trong dòch trích ly cuûa maãu coù maät (M) vaø maãu boû maät (BM). Maãu Maät ñoä quang ôû böôùc soùng 750 nm (A) Noàng ñoä protein trong dòch trích pha loaõng (µg /ml) Noàng ñoä protein trong dòch trích ly (mg /ml) L1 L2 L3 TB M1 0,403 0,380 0,400 0,394 282,5 5,649 5,757 M2 0,410 0,413 0,403 0,408 292,6 5,852 M3 0,408 0,425 0,375 0,403 288,4 5,769 BM1 0,425 0,415 0,398 0,413 295,6 5,912 6,012 BM2 0,470 0,458 0,425 0,451 323,1 6,461 BM3 0,385 0,395 0,405 0,395 283,1 5,661 Noàng ñoä protein (mg/ml) Hình 4.4. Noàng ñoä protein trong maãu M vaø maãu BM. Noàng ñoä protein trong hai maãu cheânh leäch nhau khoâng nhieàu (khoaûng 4%). Noàng ñoä protein trong dòch trích ly töø maãu M (5,757 mg/ml) thaáp hôn trong dòch trích ly töø maãu BM (6,012 mg/ml) do trong maät khoâng coù protein tan. Söï coù maët cuûa maät laøm giaûm phaàn traêm protein trong nguyeân lieäu neân laøm giaûm noàng ñoä protein trong maãu coøn maät. HOAÏT TÍNH CUÛA CAÙC ENZYME TRONG DÒCH TRÍCH LY TÖØ NOÄI TAÏNG CAÙ TRA Hoaït tính enzyme amylase Bảng 4.4. Hoaït tính enzyme amylase trong noäi taïng caù, so saùnh giöõa maãu M vaø maãu BM. Maãu Maät ñoä quang ôû böôùc soùng 656 nm (A) Löôïng tinh boät thuûy phaân (mg) Hoaït tính amylase trong dòch trích ly (µg/phuùt, ml) Tröôùc phaûn öùng Sau phaûn öùng L1 L2 TB L1 L2 TB M1 0,174 0,176 0,175 0,144 0,144 0,144 8,857 8,849 9,218 8,654 0,163 0,165 0,164 0,135 0,135 0,135 8,841 M2 0,179 0,185 0,182 0,152 0,151 0,152 8,379 7,810 8,135 0,182 0,184 0,183 0,158 0,155 0,157 7,240 M3 0,182 0,188 0,185 0,148 0,148 0,148 10,000 8,264 8,608 0,178 0,182 0,180 0,153 0,160 0,157 6,528 BM1 0,165 0,171 0,168 0,135 0,134 0,135 9,970 9,852 10,263 9,777 0,170 0,169 0,170 0,136 0,137 0,137 9,735 BM2 0,182 0,183 0,183 0,151 0,149 0,150 8,904 9,517 9,914 0,189 0,196 0,193 0,153 0,154 0,154 10,130 BM3 0,178 0,181 0,180 0,143 0,143 0,143 10,167 8,787 9,153 0,177 0,174 0,176 0,151 0,148 0,150 7,407 Hoaït tính enzyme amylase Hình 4.5. So saùnh hoaït tính enzyme amylase cuûa maãu M, vaø maãu BM. Hoaït tính cuûa amylase trong maãu khoâng coù maät cao hôn trong maãu coù maät (khoaûng 11,5%) vì trong maät khoâng coù amylase, vaø söï tham gia cuûa maät khoâng laøm taêng hoaït tính enzyme. Hoaït tính enzyme protease Bảng 4.5. Hoaït tính enzyme protease trong noäi taïng caù, so saùnh giöõa maãu M vaø maãu BM. Maãu Maät ñoä quang ôû böôùc soùng 620 nm (A) Hoaït tính protease kieàm L1 L2 TB Dòch pha loaõng (µg tyrosin/ml) Dòch trích ly (µg tyrosin/phuùt.ml) M1 0,042 0,055 0,049 3,657 29,26 28,45 M2 0,043 0,035 0,039 2,941 23,53 M3 0,056 0,052 0,054 4,072 32,57 BM1 0,043 0,047 0,045 3,393 27,15 27,35 BM2 0,042 0,037 0,040 2,978 23,83 BM3 0,045 0,058 0,052 3,883 31,07 Hoaït tính enzyme protease Hình 4.6. So saùnh hoaït tính enzyme protease cuûa maãu M, vaø maãu BM. Keát quaû cho thaáy söï coù maët cuûa maät laøm taêng hoaït tính cuûa enzyme protease neân maãu coù maät coù hoaït tính protease cao hôn so vôùi maãu khoâng coù maät (khoaûng 3,9%). Hoaït tính enzyme lipase Bảng 4.6. Hoaït tính enzyme lipase trong noäi taïng caù, so saùnh giöõa maãu M vaø maãu BM. Maãu Löôïng NaOH 0,1 N (ml) Löôïng axit beùo 0,1 N (ml) Hoaït tính lipase trong dòch trích ly (µmol /h. ml) Maãu phaûn öùng TB Maãu traéng TB M1 7,636 7,507 7,572 5,770 5,680 5,725 1,847 1,5388 1,5382 M2 7,345 8,669 8,007 5,671 6,424 6,048 1,960 1,6329 M3 7,507 8,656 8,082 6,366 6,334 6,350 1,732 1,4429 BM1 9,541 8,818 9,180 7,509 7,202 7,356 1,824 1,5200 1,5300 BM2 9,335 8,632 8,983 7,360 6,954 7,157 1,826 1,5217 BM3 9,158 8,475 8,817 7,211 6,706 6,959 1,858 1,5483 Hoaït tính enzyme lipase Hình 4.7. So saùnh hoaït tính enzyme lipase cuûa maãu M, vaø maãu BM. Söï coù maët cuûa maät laøm taêng hoaït tính cuûa enzyme lipase (khoaûng 0,53%). Hoaït tính rieâng cuûa enzyme Bảng 4.7. Hoaït tính rieâng cuûa caùc enzyme trong noäi taïng caù, so saùnh giöõa maãu M vaø maãu BM. Maãu Hoaït tính Hoaït tính rieâng Amylase (µg/ phuùt.ml) Protease (µg/ phuùt.ml) Lipase (µmol/ h.ml) Protein tan (mg/ ml) Amylase (µg/ phuùt. mg) Protease (µg/ phuùt.mg) Lipase (µmol/ h.mg) M 8,654 28,45 1,5382 5,757 1,503 4,943 0,267 BM 9,777 27,35 1,5300 6,012 1,626 4,549 0,255 Hoaït tính rieâng enzyme amylase Hình A Hoaït tính rieâng enzyme protease Hình B Hoaït tính rieâng enzyme lipase Hình C Hình 4.8. So saùnh hoaït tính rieâng enzyme cuûa maãu M, vaø maãu BM. Hình A, B. C laàn löôït laø hoaït tính rieâng cuûa enzyme amylase, protease, lipase. Keát quaû treân cho thaáy khi so saùnh giöõa maãu noäi taïng coù maät vaø khoâng coù maät thì caû hai ñeàu coù theå hieän hoaït tính cuûa amylase nhöng ôû maãu boû maät cao hôn. Vì trong maät khoâng chöùa enzyme amylase, söï tham gia cuûa maät laøm giaûm hoaït tính rieâng cuûa enzyme amylase (7,6%). Tuy nhieân, vieäc thu nhaän enzyme amylase töø nguoàn goác ñoäng vaät khoâng phaûi laø moät öu theá. Enzyme naøy chuû yeáu ñöôïc nghieân cöùu vaø thu nhaän nhieàu töø nguoàn goác thöïc vaät, vaø vi sinh vaät vì ñoäng vaät khoâng coù khaû naêng tích luõy moät löôïng lôùn enzyme naøy. Veà enzyme protease, trong maãu nguyeân lieäu noäi taïng khoâng coù daï daøy neân khoâng khaûo saùt enzyme pepsin (coù trong daï daøy) maø chæ khaûo saùt enzyme protease kieàm, keát quaû cho thaáy trong maãu coøn maät hoaït tính rieâng cao hôn so vôùi maãu boû maät khoaûng 8%. Duø vaäy hoaït tính protease kieàm trong tröôøng hôïp naøy cuõng khoâng ñöôïc choïn laøm thoâng soá ñeå toái öu bôûi vì hoaït tính cuûa enzyme protease khi so vôùi nhöõng loaøi caù khaùc thì thaáp hôn haún. ÔÛ 350C, hoaït tính protease kieàm ôû caù coù theå ñaït ñöôïc laø 70, 130, 175 µg tyrosin/ phuùt.mg protein tan. [19] Hình 4.9. Söï thay ñoåi hoaït tính protease kieàm ôû moät soá loaøi caù [19] Hoaït tính lipase cuûa noäi taïng caù tra cao hôn so vôùi nhöõng loaøi caù khaùc, ñieàu naøy giaûi thích vì sao caù tra coù löôïng môõ khaù nhieàu. Chính vì vaäy chuùng toâi löïa choïn phöông aùn thu nhaän enzyme tieâu hoùa vaø toái öu thoâng soá hoaït tính lipase. So saùnh giöõa hai maãu coù maät vaø boû maät thì hoaït tính rieâng lipase ôû maãu coù maät cao hôn so vôùi maãu khoâng coù maät. Ngoaøi ra söû duïng maãu coù maät coù öu ñieåm laø quaù trình xöû lyù nguyeân lieäu ñôn giaûn hôn. Löïa choïn maãu coù maät ñeå toái öu quaù trình trích ly. Toái öu quaù trình trích ly Khaûo saùt thôøi gian trích ly Noäi taïng caù tra sau khi raõ ñoâng ñöôïc ñem xay vaø trích ly vôùi tyû leä nguyeân lieäu vaø nöôùc caát laø 1 : 5 (veà khoái löôïng), ôû nhieät ñoä 300C, vôùi thôøi gian trích ly thay ñoåi laàn löôït laø 1h, 2h, 3h, 4h. Hoãn hôïp ñöôïc ñem ñi loïc vaûi 2 laàn ñeå thu dòch trích ly. Dòch trích naøy ñöôïc xaùc ñònh noàng ñoä protein tan, hoaït tính enzyme lipase vaø hoaït tính rieâng cuûa enzyme lipase. Bảng 4.8. Söï thay ñoåi noàng ñoä protein theo thôøi gian trích ly (t). Thôøi gian (h) Maät ñoä quang ôû böôùc soùng 750nm (A) Noàng ñoä protein trong dòch trích pha loaõng (µg /ml) Noàng ñoä protein trong dòch trích ly (mg /ml) L1 L2 L3 TB 1 0,104 0,098 0,102 0,101 72,62 1,452 2 0,101 0,103 0,106 0,103 74,05 1,481 3 0,103 0,102 0,107 0,104 74,53 1,491 4 0,105 0,102 0,109 0,105 75,48 1,510 Thôøi gian (h) Noàng ñoä protein Bảng 4.9. Söï thay ñoåi hoaït tính lipase (HTL) theo thôøi gian trích ly. Thôøi gian (h) Löôïng NaOH 0,1 N (ml) Löôïng axit beùo 0,1 N (ml) Hoaït tính lipase trong dòch trích ly (µmol /h. ml) Maãu phaûn öùng TB Maãu traéng TB 1 8,000 8,325 8,163 6,230 6,230 6,230 1,933 1,610 2 7,765 8,305 8,035 6,000 6,000 6,000 2,035 1,696 3 9,410 9,480 9,445 6,690 6,690 6,690 2,755 2,296 4 9,385 9,155 9,270 6,615 6,725 6,670 2,600 2,167 Hoaït tính lipase Thôøi gian (h) Bảng 4.10. Söï thay ñoåi hoaït tính rieâng lipase (HTRL) theo thôøi gian trích ly. Thôøi gian (h) HTL Noàng ñoä protein trong dòch trích ly (mg /ml) HTRL 1 1,610 1,452 1,1089 2 1,696 1,481 1,1451 3 2,296 1,491 1,5403 4 2,167 1,510 1,4352 Hoaït tính rieâng lipase lipaselipase Thôøi gian trích ly (h) Hình 4.10. AÛnh höôûng cuûa thôøi gian trích ly ñeán hoaït tính rieâng enzyme lipase. Noàng ñoä protein trong caùc maãu trích ly taêng khoâng ñaùng keå khi thôøi gian trích ly taêng. Trong khi hoaït tính lipase taêng daàn ñeán thôøi gian trích ly laø 3h, sau ñoù giaûm. Khi thôøi gian trích ly taêng thì löôïng protein, vaø enzyme lipase trích ly vaøo dung moâi taêng, khi keùo daøi thôøi gian trích ly quaù giôùi haïn thì löôïng protein phi lipase taêng. Ñieàu naøy daãn ñeán keát quaû laø hoaït tính rieâng cuûa lipase trong dòch trích ly vôùi thôøi gian laø 3 giôø cho hoaït tính rieâng lipase cao nhaát. Sôû dó nghieân cöùu trích ly ôû thôøi gian laø 1-4 tieáng laø taïo ñieàu kieän töï phaân ñeå trích ly caùc enzyme trong heä tieâu hoùa cuûa caù tra. Khaûo saùt tyû leä dung moâi trích ly Noäi taïng caù tra sau khi raõ ñoâng ñöôïc ñem xay vaø trích ly vôùi tyû leä nguyeân lieäu vaø nöôùc caát laø thay ñoåi laàn löôït laø 1 : 1; 1 : 2; 1 : 3; 1 : 4; 1 : 5 (veà khoái löôïng), ôû nhieät ñoä 300C, vôùi thôøi gian trích ly laø 3h. Hoãn hôïp ñöôïc ñem ñi loïc vaûi 2 laàn ñeå thu dòch trích ly. Dòch trích naøy ñöôïc xaùc ñònh noàng ñoä protein tan, hoaït tính enzyme lipase vaø hoaït tính rieâng cuûa enzyme lipase. Bảng 4.11. Söï thay ñoåi noàng ñoä protein theo tyû leä noäi taïng vaø dung moâi trích ly. TL Maät ñoä quang ôû böôùc soùng 750nm (A) Noàng ñoä protein trong dòch trích pha loaõng (µg /ml) Noàng ñoä protein trong dòch trích ly (mg /ml) L1 L2 L3 TB 1:1 0,337 0,362 0,342 0,347 248,66 4,973 1:2 0,217 0,231 0,237 0,228 163,63 3,273 1:3 0,16 0,169 0,162 0,164 117,28 2,346 1:4 0,134 0,135 0,125 0,131 94,11 1,882 1:5 0,103 0,112 0,112 0,109 78,11 1,562 Tyû leä nguyeân lieäu vaø dung moâi trích ly Noàng ñoä protein Tyû leä nguyeân lieäu vaø dung moâi trích ly Bảng 4.12. Söï thay ñoåi hoaït tính lipase theo tyû leä noäi taïng vaø dung moâi trích ly. TL Löôïng NaOH 0,1 N (ml) Löôïng axit beùo 0,1 N (ml) Hoaït tính lipase trong dòch trích ly (µmol /h. ml) Maãu phaûn öùng TB Maãu traéng TB 1:1 28,850 28,540 28,695 20,620 20,630 20,625 8,070 6,725 1:2 23,550 23,555 23,553 15,840 15,700 15,770 7,783 6,485 1:3 22,500 20,000 21,250 12,550 12,405 12,478 8,773 7,310 1:4 15,000 17,000 16,000 12,000 10,000 11,000 5,000 4,167 1:5 9,280 9,325 9,303 7,860 7,870 7,865 1,438 1,198 Tyû leä nguyeân lieäu vaø dung moâi trích ly Hoaït tính lipase lipaselipase Bảng 4.13. Söï thay ñoåi hoaït tính rieâng lipase theo tyû leä noäi taïng vaø dung moâi trích ly. TL HTL Noàng ñoä protein trong dòch trích ly (mg /ml) HTRL 1:1 6,725 4,973 1,3522 1:2 6,485 3,273 1,9818 1:3 7,310 2,346 3,1165 1:4 4,167 1,882 2,2136 1:5 1,198 1,562 0,7668 Hoaït tính rieâng lipase lipaselipase Tyû leä nguyeân lieäu vaø dung moâi trích ly Hình 4.11. AÛnh höôûng cuûa tyû leä noäi taïng vaø dung moâi trích ly ñeán hoaït tính rieâng enzyme lipase. Khi löôïng dung moâi trích ly taêng thì toång löôïng protein tan trong dòch trích ly taêng. (Noàng ñoä protein trong dòch trích ly giaûm do pha loaõng). Vôùi löôïng dung moâi trích ly thaáp thì khoâng ñuû ñeå trích ly lipase, coøn vôùi löôïng dung moâi cao thì lipase trích ly vaøo dung moâi nhieàu hôn. Nhöng khi löôïng dung moâi vöôït quaù giôùi haïn thì chæ coù haøm löôïng protein phi lipase taêng. Keát quaû cho thaáy ôû tyû leä nguyeân lieäu vaø dung moâi laø 1:3 thì dòch trích coù hoaït tính rieâng cuûa lipase laø cao nhaát. Khaûo saùt pH dung moâi trích ly Noäi taïng caù tra sau khi raõ ñoâng ñöôïc ñem xay vaø trích ly vôùi tyû leä nguyeân lieäu vaø dung moâi laø 1 : 3 (veà khoái löôïng), pH dung moâi thay ñoåi laàn löôït laø 4; 5; 6; 7; 8; 9; pH 4 vaø 5 ñöôïc ñieàu chænh baèng dung dòch HCl, pH 6; 7; 8; 9 ñöôïc ñieàu chænh baèng dung dòch Na2CO3, ôû nhieät ñoä 300C, vôùi thôøi gian trích ly laø 3h. Hoãn hôïp ñöôïc ñem ñi loïc vaûi 2 laàn ñeå thu dòch trích ly. Dòch trích naøy ñöôïc xaùc ñònh noàng ñoä protein tan, hoaït tính enzyme lipase vaø hoaït tính rieâng cuûa enzyme lipase. Bảng 4.14. Söï thay ñoåi noàng ñoä protein theo pH dung moâi trích ly. pH Maät ñoä quang ôû böôùc soùng 750nm (A) Noàng ñoä protein trong dòch trích pha loaõng (µg /ml) Noàng ñoä protein trong dòch trích ly (mg /ml) L1 L2 L3 TB 4 0,168 0,160 0,157 0,162 115,85 2,317 5 0,169 0,159 0,166 0,165 118,00 2,360 6 0,168 0,168 0,171 0,169 121,11 2,422 7 0,163 0,162 0,163 0,163 116,57 2,331 8 0,169 0,166 0,171 0,169 120,87 2,417 9 0,165 0,154 0,156 0,158 113,46 2,269 Nöôùc caát 0,16 0,169 0,162 0,164 117,28 2,346 pH dung moâi trích ly Noàng ñoä protein Bảng 4.15. Söï thay ñoåi hoaït tính lipase theo pH dung moâi trích ly. pH Löôïng NaOH 0,1 N (ml) Löôïng axit beùo 0,1 N (ml) Hoaït tính lipase trong dòch trích ly (µmol /h. ml) Maãu phaûn öùng TB Maãu traéng TB 4 12,290 12,270 12,280 10,000 10,000 10,000 2,280 1,900 5 12,355 13,270 12,813 10,280 10,365 10,323 2,490 2,075 6 13,055 13,065 13,060 10,500 10,500 10,500 2,560 2,133 7 16,600 16,250 16,425 11,000 11,000 11,000 5,425 4,521 8 17,250 17,250 17,250 11,000 11,000 11,000 6,250 5,208 9 18,000 18,000 18,000 11,250 11,250 11,250 6,750 5,625 Nöôùc caát 16,750 16,000 16,375 11,100 11,250 11,175 5,200 4,333 pH dung moâi trích ly Hoaït tính lipase lipaselipase Bảng 4.16. Söï thay ñoåi hoaït tính rieâng lipase theo pH dung moâi trích ly. pH HTL Noàng ñoä protein trong dòch trích ly (mg /ml) HTRL 4 1,900 2,317 0,8200 5 2,075 2,360 0,8792 6 2,133 2,422 0,8808 7 4,521 2,331 1,9391 8 5,208 2,417 2,1546 9 5,625 2,269 2,4788 Nöôùc caát 4,333 2,346 1,8474 Hoaït tính rieâng lipase pH dung moâi trích ly Hình 4.12. AÛnh höôûng cuûa pH dung moâi trích ly ñeán hoaït tính rieâng enzyme lipase. ÔÛ nhöõng giaù trò pH khaùc nhau thì noàng ñoä protein thay ñoåi khoâng ñaùng keå trong khi hoaït tính lipase ñaït ñöôïc cao nhaát khi söû duïng dung dòch Na2CO3 pH 9. Do vaäy, giaù trò pH thích hôïp ñeå thu dòch trích ly coù hoaït tính rieâng enzyme lipase cao nhaát laø pH 9. Giaù trò pH caøng cao thì löôïng Na2CO3 trong dòch trích ly caøng nhieàu, aûnh höôûng ñeán ñoä saïch cuûa cheá phaåm enzyme, neân khoâng khaûo saùt ôû nhöõng giaù trò pH lôùn hôn 9, vaø laáy giaù trò pH naøy ñeå khaûo saùt aûnh höôûng cuûa nhieät ñoä trích ly ñeán hoaït tính enzyme lipase. Khaûo saùt nhieät ñoä trích ly. Noäi taïng caù tra sau khi raõ ñoâng ñöôïc ñem xay vaø trích ly vôùi tyû leä nguyeân lieäu vaø dung dòch Na2CO3 pH 9 laø 1 : 3 (theo khoái löôïng), ôû nhieät ñoä 300C, vôùi thôøi gian trích ly laø 3h. Hoãn hôïp ñöôïc ñem ñi loïc vaûi 2 laàn ñeå thu dòch chöùa enzyme. Dòch chöùa naøy ñöôïc xaùc ñònh noàng ñoä protein tan, hoaït tính enzyme lipase vaø hoaït tính rieâng cuûa enzyme lipase. Bảng 4.17. Söï thay ñoåi noàng ñoä protein theo nhieät ñoä trích ly (T). T (0C) Maät ñoä quang ôû böôùc soùng 750nm (A) Noàng ñoä protein trong dòch trích pha loaõng (µg /ml) Noàng ñoä protein trong dòch trích ly (mg /ml) L1 L2 L3 TB 20 0,164 0,158 0,150 0,157 112,75 2,255 30 0,178 0,179 0,186 0,181 129,71 2,594 40 0,219 0,208 0,217 0,215 153,83 3,077 50 0,301 0,291 0,315 0,302 216,65 4,333 60 0,293 0,317 0,301 0,304 217,61 4,352 Nhieät ñoä dung moâi trích ly (0C) Noàng ñoä protein Bảng 4.18. Söï thay ñoåi hoaït tính lipase theo nhieät ñoä trích ly. T (0C) Löôïng NaOH 0,1 N (ml) Löôïng axit beùo 0,1 N (ml) Hoaït tính lipase trong dòch trích ly (µmol /h. ml) Maãu phaûn öùng TB Maãu traéng TB 20 20,000 10,000 15,000 15,000 10,000 12,500 2,500 2,083 30 18,250 17,525 17,888 12,000 12,000 12,000 5,888 4,906 40 28,750 25,760 27,255 22,500 22,500 22,500 4,755 3,963 50 13,500 13,500 13,500 12,500 12,500 12,500 1,000 0,833 60 14,850 15,750 15,300 14,500 15,500 15,000 0,300 0,250 Nhieät ñoä dung moâi trích ly (0C) Hoaït tính lipase Bảng 4.19. Söï thay ñoåi hoaït tính rieâng lipase theo nhieät ñoä trích ly. T (0C) HTL Noàng ñoä protein trong dòch trích ly (mg /ml) HTRL 20 2,083 2,255 0,9239 30 4,906 2,594 1,8913 40 3,963 3,077 1,2879 50 0,833 4,333 0,1923 60 0,250 4,352 0,0574 Hoaït tính rieâng lipase lipaselipase Nhieät ñoä dung moâi trích ly (0C) Hình 4.13. AÛnh höôûng cuûa nhieät ñoä trích ly ñeán hoaït tính rieâng enzyme. Noàng ñoä protein trong dòch trích ly taêng daàn khi nhieät ñoä taêng trong khoaûng 20 -600C do söï khuyeách taùn protein tan dieãn ra nhanh khi taêng nhieät ñoä. ÔÛ nhieät ñoä thaáp, quaù trình khuyeách taùn dieãn ra chaäm, neân löôïng enzyme trong dòch trích ly thaáp, neân hoaït tính enzyme lipase thaáp. Nhieät ñoä caøng cao thì quaù trình trích dieãn ra nhanh hôn, deã daøng hôn. Tuy nhieân nhieät ñoä cao gaây bieán tính enzyme lipase daãn ñeán laøm giaûm hoaït tính enzyme. Nhieät ñoä thích hôïp ñeå thu hoaït tính enzyme cao nhaát laø 300C. Ñaây laø nhieät ñoä thoâng thöôøng vôùi khí haäu ôû Vieät Nam. Vôùi giaù trò nhieät ñoä naøy thì quaù trình trích ly khoâng caàn tieâu toán naêng löôïng ñeå gia nhieät hay laøm laïnh hoãn hôïp trích ly. Toái öu quaù trình trích ly Hoaït tính rieâng cuûa enzyme lipase thay ñoåi ít khi pH thay ñoåi trong khoaûng pH töø 7 ñeán 9. Vì vaäy khoâng caàn thay ñoåi pH trong quaù trình trích ly. Hoaït tính rieâng lipase bò aûnh höôûng nhieàu bôûi caùc yeáu toá coøn laïi nhö thôøi gian trích ly, nhieät ñoä trích ly, tyû leä dung moâi trích ly. AÛnh höôûng nhieàu nhaát laø nhieät ñoä trích ly caàn thay ñoåi nhieät ñoä xung quanh taâm nhieät ñoä 300C ñeå khaûo saùt. Veà thöïc teá, nhieät ñoä thoâng thöôøng trong caùc phoøng thí nghieäm taïi Vieät Nam dao ñoäng xung quanh nhieät ñoä 300C, Döïa vaøo ñieàu naøy vaø öu ñieåm khi söû duïng nhieät ñoä trích ly 300C laø khoâng toán keùm veà maët naêng löôïng ñeå gia nhieät hoaëc laøm laïnh trong suoát quaù trình trích ly. Toái öu quaù trình trích ly ñeå thu dòch trích coù hoaït tính rieâng cuûa lipase cao nhaát: Choïn 2 yeáu toá coá ñònh laø nhieät ñoä vaø pH cuûa dung moâi trích ly, toâi laàn löôït tieán haønh thí nghieäm ôû nhieät ñoä 30oC vaø pH dung moâi laø 9. Hai yeáu toá thay ñoåi laø thôøi gian trích ly (t) vaø tyû leä dung moâi trích ly vaø noäi taïng (TL dm/nt) Yeáu toá x1 laø thôøi gian trích ly coù taâm laø 3h, möùc treân laø 3,5h, möùc döôùi laø 2,5h. Yeáu toá x2 laø tyû leä dung moâi trích ly vaø noäi taïng (theo khoái löôïng) taïi taâm laø 3; möùc treân laø 3,5; möùc döôùi laø 2,5. Bảng 4.20. Boá trí quy hoaïch thöïc nghieäm. STT x0 x1 x2 x1x2 y 1 + + + + y1 2 + - + - y2 3 + + - - y3 4 + - - + y4 Caùc maãu trích ly ñöôïc xaùc ñònh noàng ñoä protein, hoaït tính lipase vaø hoaït tính rieâng lipase. Bảng 4.21. Noàng ñoä protein. t (h) TL dm /nt Maät ñoä quang ôû böôùc soùng 750 nm (A) Noàng ñoä protein trong dòch trích pha loaõng (µg /ml) Noàng ñoä protein trong dòch trích ly (mg /ml) L1 L2 L3 TB 3,5 3,5 0,137 0,133 0,156 0,142 101,76 2,035 2,5 3,5 0,140 0,148 0,148 0,145 104,15 2,083 3,5 2,5 0,184 0,183 0,177 0,181 129,94 2,599 2,5 2,5 0,177 0,181 0,162 0,173 124,21 2,484 3 3 0,155 0,161 0,167 0,161 115,37 2,307 3 3 0,161 0,167 0,160 0,163 116,57 2,331 Bảng 4.22. Hoaït tính lipase. t (h) TL dm /nt Löôïng NaOH 0,1 N (ml) Löôïng axit beùo 0,1 N (ml) HTL trong dòch trích ly (µmol /h. ml) Maãu phaûn öùng TB Maãu traéng TB 3,5 3,5 11,00 11,49 11,245 10,00 10,00 10,00 1,245 1,038 2,5 3,5 12,00 12,00 12,00 10,00 10,00 10,00 2,000 1,667 3,5 2,5 15,00 15,00 15,00 12,50 12,50 12,50 2,500 2,083 2,5 2,5 17,50 17,50 17,50 13,25 13,25 13,25 4,250 3,542 3 3 15,99 16,03 16,01 12,50 12,50 12,50 3,510 2,925 3 3 16,00 15,985 15,993 12,50 12,50 12,50 3,493 2,910 Bảng 4.23. Hoaït tính rieâng lipase. t (h) TL dm/nt HTL Noàng ñoä protein trong dòch trích ly (mg /ml) HTRL 3,5 3,5 1,038 2,035 0,5098 2,5 3,5 1,667 2,083 0,8002 3,5 2,5 2,083 2,599 0,8016 2,5 2,5 3,542 2,484 1,4257 3 3 2,925 2,307 1,2676 3 3 2,910 2,331 1,2484 Toái öu hoaït tính rieâng cuûa enzyme lipase ta coù: Bảng 4.24. Ma traän quy hoaïch thöïc nghieäm STT x0 x1 x2 x1x2 y 1 + + + + 0,5098 2 + - + - 0,8002 3 + + - - 0,8016 4 + - - + 1,4257 Vì khoâng laøm thí nghieäm song song neân ñeå xaùc ñònh phöông sai taùi hieän toâi laøm theâm 2 thí nghieäm ôû taâm phöông aùn. Þ Þ Þ Bảng 4.25. YÙ nghóa cuûa caùc heä soá ñöôïc kieåm ñònh theo tieâu chuaån t. x0 x1 x2 x1x2 Heä soá PTHQ 0,8843 -0,2286 -0,2293 0,08342 129,978 33,6 33,708 12,2609 Tra baûng tp(f) vôùi p = 0,05 ; f=1 thì t0.05(1) = 12,71 Vì t13 < tp(f) neân loaïi heä soá b12 ra khoûi phöông trình hoài quy vaøphöông trình coù daïng: (*) Söï töông thích cuûa phöông trình hoài quy vôùi thöïc nghieäm ñöôïc kieåm ñònh theo tieâu chuaån Fisher: STT x0 x1 x2 y (y -)2 1 + + + 0,5098 0,42637 0,006958 2 + - + 0,8002 0,88357 0,006958 3 + + - 0,8016 0,88504 0,006958 4 + - - 1,4257 1,34224 0,006958 Þ F = 150,3293136 Tra baûng F1-p (f1,f2) vôùi p = 0,05; f1 = 1; f2 =1. F0.95(1,1) = 161,4 F < F1-p (f1,f2) Þ PTHQ töông thích vôùi thöïc nghieäm Töø (*) ta coù phöông trình hoài quy laø: HTRL = 3,6317 – 0,4572t – 0,4586p Vôùi HTRL : laø hoaït tính rieâng lipase. t : thôøi gian trích ly. p : tyû leä giöõa dung moâi trích ly vaø noäi taïng. Hình 4.14. AÛnh höôûng cuûa thôøi gian trích ly, tyû leä dung moâi trích ly vaø noäi taïng leân hoaït tính enzyme lipase. Vôùi nhieät ñoä trích ly laø 300C, söû duïng dung moâi trích ly laø dung dòch Na2CO3 pH 9, trong khoaûng thôøi gian trích ly töø 2,5 ñeán 3h, tyû leä dung moâi vaø nguyeân lieäu töø 2,5 ñeán 3,5 thì hoaït tính enzyme lipase cao nhaát ôû dòch trích ly vôùi thôøi gian laø 2,5 h vaø tyû leä nguyeân lieäu vaø dung moâi laø 1 : 2,5. Khaûo saùt quaù trình keát tuûa thu enzyme thoâ Noäi taïng caù tra sau khi raõ ñoâng ñöôïc ñem xay vaø trích ly vôùi tyû leä nguyeân lieäu vaø dung dòch Na2CO3 pH 9 laø 1 : 2,5 (veà khoái löôïng), ôû nhieät ñoä 300C, vôùi thôøi gian trích ly laø 2,5 h. Hoãn hôïp ñöôïc ñem ñi loïc vaûi 2 laàn ñeå thu dòch trích ly. Sau ñoù ñöôïc ñem ñi keát tuûa baèng ethanol vôùi caùc tyû leä dòch trích ly vaø ethanol (dt/ Et) laàn löôït laø 10 : 90; 20 : 80; 30 : 70; 40 : 60; 50 : 50; 60 : 40 ñeå thu enzyme thoâ. Dung moâi keát tuûa vaø dòch trích ly ñöôïc laøm laïnh ñeán 200C sau ñoù hoøa vaøo nhau theo caùc tyû leä nhö treân giöõ ôû nhieät ñoä 200C, sau ñoù khuaáy trong 15 phuùt, vaø ñeå laéng keát tuûa trong 30 phuùt vaø ñem ly taâm vôùi toác ñoä voøng laø 3500 voøng/ phuùt ôû 40C trong 10 phuùt. Tuûa ñöôïc pha loaõng veà theå tích dòch trích ly tröôùc keát tuûa vaø ñöôïc xaùc ñònh noàng ñoä protein tan, hoaït tính enzyme lipase vaø hoaït tính rieâng cuûa enzyme lipase, xaùc ñònh hieäu suaát thu hoài vaø ñoä tinh saïch cuûa moãi maãu. Bảng 4.26. Söï thay ñoåi noàng ñoä protein theo tyû leä dòch trích ly vaø ethanol. Tyû leä dt/Et (v/v) Maät ñoä quang ôû böôùc soùng 750nm (A) Noàng ñoä protein trong dòch chöùa enzyme pha loaõng (µg /ml) Noàng ñoä protein trong dòch chöùa enzyme (mg /ml) L1 L2 L3 TB 100 : 0 0,237 0,236 0,238 0,237 169,84 3,397 10 : 90 0,055 0,054 0,055 0,055 39,17 0,783 20 : 80 0,039 0,038 0,037 0,038 27,23 0,545 30 : 70 0,031 0,033 0,033 0,032 23,17 0,463 40 : 60 0,029 0,032 0,031 0,031 21,98 0,440 50 : 50 0,022 0,015 0,021 0,019 13,85 0,277 60 : 40 0,014 0,011 0,012 0,012 8,84 0,177 Tyû leä dòch trích ly vaø ethanol Noàng ñoä protein Hình 4.15. AÛnh höôûng cuûa tyû leä dòch trích ly vaø ethanol leân noàng ñoä protein tan. Bảng 4.27. Söï thay ñoåi hoaït tính lipase theo tyû leä dòch trích ly vaø ethanol. Tyû leä dt/Et (v/v) Löôïng NaOH 0,1 N (ml) Löôïng axit beùo 0,1 N (ml) HTL trong dòch chöùa enzyme (µmol /h. ml) Maãu phaûn öùng TB Maãu traéng TB 100 : 0 20,00 20,00 20,00 17,50 17,50 17,50 2,50 2,083 10 : 90 6,50 6,50 6,50 5,25 5,25 5,25 1,25 1,042 20 : 80 6,00 6,00 6,00 5,00 5,00 5,00 1,00 0,833 30 : 70 7,00 7,00 7,00 6,00 6,00 6,00 1,00 0,833 40 : 60 7,00 7,00 7,00 6,00 6,00 6,00 1,00 0,833 50 : 50 10,00 11,00 10,50 7,50 8,50 8,00 2,50 2,083 60 : 40 9,50 9,00 9,25 7,50 8,50 8,00 1,250 1,042 Tyû leä dòch trích ly vaø ethanol Hoaït tính lipase lipaselipase Hình 4.16. AÛnh höôûng cuûa tyû leä dòch trích ly vaø ethanol leân hoaït tính cuûa enzyme lipase. Bảng 4.28. Söï thay ñoåi hoaït tính rieâng lipase theo tyû leä dòch trích ly vaø ethanol. Tyû leä dt/Et (v/v) HTL Noàng ñoä protein trong dòch chöùa enzyme (mg /ml) HTRL Hieäu suaát (%) Ñoä tinh saïch 100 : 0 2,083 3,397 0,6133 100 1,00 10 : 90 1,042 0,783 1,3295 50 2,17 20 : 80 0,833 0,545 1,5301 40 2,49 30 : 70 0,833 0,463 1,7983 40 2,93 40 : 60 0,833 0,440 1,8960 40 3,09 50 : 50 2,083 0,277 7,5187 100 12,26 60 : 40 1,042 0,177 5,8930 50 9,61 Hoaït tính rieâng lipase lipaselipase Tyû leä dòch trích ly enzyme vaø dung moâi Hình 4.17. AÛnh höôûng cuûa tyû leä dòch trích ly vaø ethanol leân hoaït tính rieâng cuûa enzyme lipase. Duøng dung moâi keát tuûa laø ethanol coù öu ñieåm laø thu nhaän ñöôïc enzyme thoâ daïng keát tuûa vaø khoâng phaûi tieán haønh nhöõng coâng ñoaïn xöû lyù phöùc taïp khaùc ñeå taùch loaïi dung moâi, cheá phaåm vaãn coù theå söû duïng cho muïc ñích thöïc phaåm. Keát quaû nghieân cöùu cho thaáy khi söû duïng tyû leä dòch enzyme vaø ethanol vôùi tyû leä 50 : 50 thì hoaït tính rieâng cuûa enzyme lipase laø cao nhaát. Khi löôïng ethanol taêng leân daãn ñeán hieän töôïng voâ hoaït enzyme, coøn noàng ñoä ethanol thaáp thì khoâng ñuû ñeå keát tuûa toaøn boä enzyme. Khi söû duïng tyû leä dòch enzyme vaø ethanol vôùi tyû leä 50 : 50 thì hieäu suaát thu hoài laø cao nhaát 100%, vaø tuûa thu ñöôïc coù hoaït tính rieâng cao nhaát, ñoä saïch laø gaáp 12,26 laàn so vôùi dòch trích ly. Söï giaûm hoaït tính cuûa enzyme theo thôøi gian Nguyeân lieäu noäi taïng caù tra ñeå thu ñöôïc hoaït tính cao nhaát caàn phaûi tieán haønh thu hoài ngay sau khi gieát moå caù. Khi caù coøn soáng, noäi taïng töï saûn sinh enzyme tieâu hoùa cung caáp cho cô theå, vaø khi caù cheát thì quaù trình naøy ngöøng haún, enzyme töï tieâu laãn nhau, vaø söï bieán tính cuûa protein vaø enzyme laøm giaûm haún hoaït tính cuûa enzyme. Baûo quaûn laïnh ñoâng ôû -200C chæ laø phöông phaùp laøm haïn cheá söï giaûm hoaït tính enzyme, caùc phaûn öùng vaãn dieãn ra maëc duø yeáu vaãn laøm giaûm hoaït tính enzyme. Töø nhöõng soá lieäu trong quaù trình khaûo saùt thu nhaän ôû treân, ta thaáy hoaït tính enzyme giaûm ñaùng keå. Khi trích ly enzyme töø noäi taïng caù tra baèng nöôùc caát vôùi tyû leä nguyeân lieäu vaø dung moâi laø 1 : 5 (veà khoái löôïng), thôøi gian 3h, vaø nhieät ñoä 300C. Hoaït tính rieâng cuûa enzyme lipase thu ñöôïc laø 1,5403 (µmol /h. mg), sau 2 ngaøy hoaït tính rieâng laø 0,7668 (µmol /h. mg). Ngaøy Hoaït tính rieâng (µmol /h. mg) Vaãn giöõ nguyeân nhieät ñoä vaø thôøi gian cuûa quaù trình trích ly töông öùng laø 300C vaø 3h, tyû leä nguyeân lieäu vaø dung moâi trích ly (nöôùc caát) laø 1 : 3, hoaït tính rieâng cuûa enzyme lipase laø 3,1165 (µmol /h. mg), sau 2 ngaøy hoaït tính rieâng giaûm coøn 1,8074 (µmol /h. mg). Hoaït tính rieâng (µmol /h. mg) Ngaøy Duøng dung moâi trích ly laø dung dòch Na2CO3 pH 9, tyû leä nguyeân lieäu vaø dung moâi trích ly theo khoái löôïng laø 1 : 3, nhieät ñoä laø 300C, hoaït tính rieâng cuûa enzyme ban ñaàu laø 2,4788 (µmol /h. mg), sau 2 ngaøy hoaït tính rieâng coøn laïi laø 1,8913 (µmol /h. mg), 2 ngaøy tieáp theo hoaït tính laø 1,258 (µmol /h. mg). Hoaït tính rieâng (µmol /h. mg) Ngaøy Hoaït tính rieâng coøn laïi (%) Choïn hoaït tính rieâng cho ngaøy ban ñaàu laø 100 %, laàn löôït quy ñoåi giaù trò hoaït tính cuûa nhöõng ngaøy coøn laïi. Ngaøy Hoaït tính rieâng lipase coøn laïi (%) Caùc soá lieäu cho thaáy hoaït tính giaûm nhanh trong nhöõng ngaøy ñaàu, vaø nhöõng ngaøy sau hoaït tính giaûm chaäm daàn. Söï thay ñoåi hoaït tính coù theå bieãu dieãn baèng haøm soá muõ nhö sau: (vôùi y laø hoaït tính rieâng lipase, x laø ngaøy baûo quaûn). Keát luaän vaø kieán nghò Keát luaän Töø caùc keát quaû nghieân cöùu cho thaáy: 1- ÔÛ noäi taïng caù tra enzyme lipase coù hoaït tính cao. Quaù trình trích ly thu nhaän enzyme töø noäi taïng caù tra laø toái öu khi trích ly noäi taïng caù baèng dung dòch Na2CO3 pH 9, vôùi tyû leä noäi taïng vaø dung moâi laø 1 : 2,5; ôû nhieät ñoä 300C; thôøi gian trích ly laø 2,5 h. 2 - Söû duïng ethanol laøm taùc nhaân keát tuûa vôùi tyû leä 50 : 50 (v/v) nhaän ñöôïc keát tuûa coù hoaït tính rieâng cuûa lipase cao nhaát, hieäu suaát thu hoài töø dòch trích ly 100% vaø ñoä tinh saïch so vôùi dòch trích ly cao hôn 12,26 laàn. 3 - Vieäc thu nhaän enzyme töø noäi taïng caàn tieán haønh trong thôøi gian sôùm nhaát coù theå, vì hoaït tính enzyme thay ñoåi ñaùng keå trong quaù trình baûo quaûn, keå caû baûo quaûn laïnh ñoâng. Kieán nghò Do haïn cheá veà thôøi gian neân chuùng toâi chöa khaûo saùt heát caùc quaù trình sau trích ly. Chuùng toâi coù moät soá kieán nghò sau: Khaûo saùt theâm caùc chaát keát tuûa khaùc ñeå thu hoài tuûa enzyme. Khaûo saùt theâm aûnh höôûng cuûa caùc yeáu toá leân hoaït tính rieâng enzyme trong quaù trình keát tuûa nhö thôøi gian keát tuûa, nhieät ñoä keát tuûa, tyû leä dung moâi keát tuûa. Toái öu quaù trình keát tuûa. Khaûo saùt quaù trình tinh saïch tuûa. Saáy thaêng hoa ñeå thu cheá phaåm enzyme daïng boät khoâ ñeå taêng thôøi gian baûo quaûn. Toái öu quaù trình saáy. TAØI LIEÄU THAM KHAÛO Traàn Bích Lam, Toân Nöõ Minh Nguyeät, Ñinh Traàn Nhaät Thu, Thí nghieäm hoaù sinh thöïc phaåm, Nhaø xuaát baûn ñaïi hoïc quoác gia TPHCM, 2004. Döông Taán Loäc, Nhöõng Ñieàu Caàn Bieát Veà Kyõ Thuaät Saûn Xuaát Gioáng Vaø Nuoâi Caù Tra Xuaát Khaåu. Nguyeãn Ñöùc Löôïng vaø nhöõng ngöôøi khaùc, Coâng ngheä enzym, nhaø xuaát baûn ñaïi hoïc quoác gia TPHCM, 2004. Leâ Thanh Mai vaø nhöõng ngöôøi khaùc, Caùc phöông phaùp phaân tích ngaønh coâng ngheä leân men, nhaø xuaát baûn khoa hoïc vaø kyõ thuaät Haø Noäi, 2005. Traàn Quoác Hieàn, Nghieân cöùu thu nhaän enzyme protease coù trong phuï phaåm cuûa ngaønh cheá bieán thuûy saûn, Luaän vaên thaïc só, 2005. Nguyeãn Thaïch Minh, Saûn xuaát maltodextrin coù DE: 15-17 töø tinh boät khoai myø baèng enzyme vaø öùng duïng ñeå saûn xuaát moät soá saûn phaåm hoøa tan, Luaän vaên thaïc só, 2002. Nguyeãn Thò Thaûo Minh, Nghieân cöùu coá ñònh enzyme a-amylase, Luaän vaên thaïc só, 2003. Alarcon, F.J., Studies on digestive enzyme in fish: Characterization and practical applications, ciheam - options mediterraneennes. Archer, M., Watson, R., Denton, J.W., Fish Waste Production in the United Kingdom_The Quantities Produced and Opportunities for Better Utilisation,The Sea Fish Industry Authority Seafish Technology, 2001. Bayliss, L.E. Digestion in the plaice (Pleuronectes platessa). Journal of the Marine Biological Association of the United Kingdom, 20 (1), 1935, p 73-91. Beisson, F., et al, Methods for lipase detection and assay: a critical review, Eur.J.Lipid Sei. Technol ,2002, 133-135 Bengt Persson et al, Structural features of lipoprotein lipase , Eur.J.Biochem. 179, 1989, p.39-45 Bernfield, P., Amylase A and B, In: Colowick and N.O. Kaplan (Editors), Methods in Enzymeology, 1955,Vol. I. Academic Press, NewYork, NY, p. 149-157. Bruce, D.S.,Jeffrey R.H., Triacylglycerol lipase activities in tissues of Antarctic fishes – Polar Biol vol 25, 2002, p.517-522. Carlsen, B., The nutrition digest of essential nutrients, a concise reference for nutritional groups, the human digestive system, vitamins, minerals, enzymes, essential fatty acids, amino sugars and amino acids, 2005, p.170. Chesley L.C., The concentrations of proteases, amylase, and lipase in certain marine fishes, the Department of Zoology, Duke University, Durham, N. C., and the U. S. Bureau of Fisheries, Woods Hole, Mass. Chesley, L. C., The Iodine and Copper Reduction Methods for the Determination of Amylase. 1934. Chesley, L. C., The Validity of the Viscometric and Wohlgemuth Methods for the Quantitative Determination of Amylase. Jour. Blot. Chem., 1931, p 92-171. Chesley, L.C., The influence of temperature upon the amylases of cold - and warm blooded animals. Johnson, W. A., A proposed method for the routine valuation of diastase preparations. Jour. Am. Chem. Soc., 1908, 30: 798. Little, E.L., Caldwell, M.L., A study of the action of pancreatic amylase, The journal of biological chemistry, 1941. Little, E.L., Caldwell, M.L., A study of the action of pancreatic amylase, The journal of biological chemistry, 1942. Love, M.R - The chemical biology of fishes - Academic Press, London, U.K., p. 1 – 39, 1970. MacDonald, R. P., Lefave, R. O., Serum Lipase Determination with an Olive Oil Substrate Using a Three-Hour Incubation Period, 1961. McCroskey R, Chang T, David H, Winn E, p-Nitrophenylglycosides as. substrates for measurement of amylase in serum and urine, 1982. Melo, J.F.B, Moraes, G., Induction of digestive enzymes in the brazilian catfish (Pseudoplatystoma Coruscans). Mukundan, M.K., Antony, P.D., Nair, M.R., A Review on Autolysis in fish, Fisheries Research, vol 4 (1986) 259-269. Robinson, E.H., A practical guide to nutrition, feeds, and feeding of catfish, Thad Cochran National Warmwater Aquaculture Center, 2001. Street, H.V. and Close, J.R., Determination of amylase activity. in biological fluids. Clin. Chim. Acta, 1956, 256-268. Thierry de Laborde de Monpezat et al, A Flourimetric Method for Measuring Lipase activity Based on Umbelliferyl Esters – vol 62 , 1989, p.1640-1644. Ul-Haq, I., Idrees, S., Rajoka, M.I., Production of lipases by Rhizopus oligosporous by solid-state fermentation, Process Biochemistry, vol 37, 2002, 637-641. Uys, W., Hecht, T., Assays on the digestive enzymes of sharptooth catfish, Clarias gariepinus (Pisces: Clariidae), Alquacultutre, Vol 63, 1987, 301-313. Walter, H.E., Proteinase : methods in with hemoglobin, casein and azocoll as substates. In H.U.Bergmeyer (Editor), Methods of Enzymeatic Analysis, Vol. V. Verlag Chemie, Weinheim, pp. 270 - 277. Young, D. S., Effects of Drugs on Clinical Laboratory Tests, 3rd Edition AACC Press, 1990. Żółtowska, K., Purification and characterization of α-amylases from the intestine and muscle of Ascaris suum (Nematoda). Acta Biochem, 2001, Vol. 48, 763-774.