Luận văn Nghiên cứu thu nhận lipase trên bã đậu nành bằng phương pháp nuôi cấy bề mặt từ chủng Rhizopus

oäc toác ñoä sinh tröôûng, tính chaát cô chaát vaø loaïi thieát bò vaø caùch vaän haønh cuûa noù. Neáu hôïp chaát polymer trong cô chaát bò thuûy phaân laø hôïp chaát taïo neân caáu truùc cuûa cô chaát thì tính chaát cô chaát seõ bò thay ñoåi. Kích thöôùc khoái haït giaûm daãn ñeán theå tích canh tröôøng giaûm. Ñieàu naøy aûnh höôûng tröïc tieáp ñeán caùc quaù trình vaän chuyeån maø ñaõ ñöôïc ñeà caäp ôû treân. Giai ñoaïn cuoái cuûa quaù trình. Vi sinh vaät tieáp tuïc chòu ñöïng ñieàu kieän khoâng thuaän lôïi ñeå phaùt trieån: nhieät ñoä cao, löôïng O2 thaáp, thieáu chaát dinh döôõng. Haäu quaû laø naám sôïi seõ bò öùc cheá khoâng theå hình thaønh baøo töû, teá baøo seõ thoaùi hoùa daãn ñeán töû vong. Nhieät löôïng seõ giaûm vaø nhieät ñoä toaøn boä khoái canh tröôøng giaûm. Giai ñoaïn naøy khaù quan troïng neáu saûn phaåm muoán thu nhaän laø baøo töû hoaëc saûn phaåm trao ñoåi chaát baäc hai. Nhöng ñoái vôùi nhöõng saûn phaåm khaùc, phaûi thu nhaän taïi thôøi ñieåm tröôùc giai ñoaïn cuoái. Phuï thuoäc vaøo töøng quaù trình cuï theå, giai ñoaïn naøy coù theå ngaén chæ vaøi giôø, hoaëc keùo daøi vaøi ngaøy ñeán vaøi tuaàn nhö trong thu nhaän saûn phaåm trao ñoåi baäc hai. 2.2.7. Phaân loaïi thieát bò leân men sinh hoïc Thieát bò leân men sinh hoïc söû duïng trong phöông phaùp nuoâi caáy beà maët raát ña daïng vaø phong phuù. Döïa vaøo caùch thöùc ñaûo troän vaø suïc khí, caùc thieát bò leân men ñöôïc chia thaønh boán nhoùm chính (Hình 2.12): Nhoùm 1. Loaïi thieát bò khoâng ñaûo troän vaø khoâng suïc khí tröïc tieáp vaøo trong canh tröôøng. Loaïi thieát bò naøy thöôøng söû duïng nhöõng khay leân men (tray) ñöôïc ñaët beân trong buoàng nuoâi caáy (chamber), xeáp thaønh töøng taàng vaø coù khoaûng troáng giöõa caùc taàng. Khoâng khí coù nhieät ñoä vaø ñoä aåm thích hôïp ñöôïc thoåi vaøo trong buoàng vaø tuaàn hoaøn treân beà maët caùc khay. Caùc khay ñöôïc laøm baèng goã, tre, kim loaïi hoaëc nhöïa. Beà maët cuûa khay ñeå hôû vaø ñaùy coù ñuïc loã ñeå gia taêng söï khueách taùn oxi vaøo trong canh tröôøng. Nhoùm 2. Loaïi thieát bò leân men khoâng ñaûo troän nhöng suïc khí cöôõng böùc vaøo canh tröôøng. Thieát bò söû duïng coät ñeäm (packed bed) daïng hình truï hoaëc hình hoäp chöõ nhaät ñaët theo höôùng thaúng ñöùng. Ñaùy coät ñöôïc ñuïc loã ñeå khoâng khí suïc tröïc tieáp vaøo beân trong canh tröôøng. Nhoùm 3. Loaïi thieát bò thöïc hieän söï ñaûo troän giaùn ñoaïn hoaëc lieân tuïc. Thieát bò ñöôïc caáu taïo bôûi 1 troáng hình truï, ñaët naèm ngang. Canh tröôøng chieám ½ theå tích cuûa troáng. Khoâng khí chæ ñöôïc thoåi treân beà maët canh tröôøng. Nhoùm 4. Loaïi thieát bò thöïc hieän keát hôïp caû hai yeáu toá ñaûo troän vaø suïc khí cöôõng böùc vaøo canh tröôøng. Loaïi thieát bò naøy ñöôïc phaân thaønh hai nhoùm nhoû: ñaûo troän giaùn tieáp vaø lieân tuïc. Caùc thieát bò thuoäc nhoùm naøy bao goàm thieát bò daïng taàng soâi (air-solid fluidized bed), troáng (rocking drum) vaø boàn khuaáy troän (stirred bed). Hình 2.12 – Phaân loaïi thieát bò leân men sinh hoïc baèng phöông phaùp nuoâi caáy beà maët 2.2.8. Caùc nghieân cöùu öùng duïng phöông phaùp beà maët ñeå thu nhaän lipase Phöông phaùp nuoâi caáy beà maët ñöôïc öùng duïng khaù phoå bieán trong vieäc thu nhaän moät soá loaïi enzyme. Trong ñoù, lipase laø loaïi enzyme ñöôïc xem laø coù tieàm naêng khi aùp duïng phöông phaùp nuoâi caáy naøy treân moâi tröôøng baõ raén noâng nghieäp. Moät soá nghieân cöùu treân moâi tröôøng raén ñöôïc toång hôïp trong baûng 2.3. Baûng 2.3 – Caùc öùng duïng phöông phaùp nuoâi caáy beà maët ñeå thu nhaän lipase Taùc giaû Gioáng VSV Moâi tröôøng raén Ñieàu kieän nuoâi caáy Hoaït tính lipase Ikram ul-Haq et al., 2001 [21] Rhizopus oligosporous Boät quaû haïnh xay 30oC 48 giôø 48 U/g J. Cordova et al., 1997 [22] Rhizopus rhizopodiformis Hoãn hôïp baõ olive : cuû caûi ñöôøng (1:1) 24 giôø 79,6 U/g Rhizomucor pusillus 20,24 U/g Alessandro D’ Annibale et al., 2006 [23] Penicillium citrinum NRRL 1841 Baõ khoâ daàu olive 188 giôø 1230 U/dm3 J.A. Rodriguez et al., 2006 [24] Rhizopus homothallicus (IRDI 3a) Baõ mía 12 giôø 826 U/g Luciana A.I. de Azeredo et al., 2007 [25] Penicillium restrictum Baõ caây coï cao ôû Brazil (babassu cake) 30oC 63 giôø 17,4 U/g Andreas K. Gombert et al., 1999 [26] Penicillium restrictum Baõ caây coï cao ôû Brazil (babassu cake) 24 giôø 30,3 U/g Nutan D. Mahadik et al., 2002 [27] Aspergillus niger Boät caùm mì 30oC 120 giôø 630 U/g Taùc giaû Gioáng VSV Moâi tröôøng raén Ñieàu kieän nuoâi caáy Hoaït tính lipase Nilkamal Mahanta et al., 2007 [28] Pseudomonas aeruginosa Baõ haït Jatropha curcas (Jatropha curcas seed cake) 120 giôø 1084 U/g N.R. Kamini et al., 1997 [29] Aspergillus niger Baùnh daàu gingelly 72 giôø 363 U/g Chöông 3 Phöông phaùp nghieân cöùu 3.1. NGUYEÂN LIEÄU 3.1.1. Nguoàn gioáng vi sinh vaät Chuûng naám moác Rhizopus sp. ñöôïc phaân laäp töø Phoøng thí nghieäm Vi sinh, khoa Kyõ thuaät Hoùa hoïc, tröôøng Ñaïi hoïc Baùch Khoa vaø ñöôïc xaùc ñònh coù khaû naêng sinh toång hôïp lipase [3], ñöôïc nuoâi caáy treân oáng thaïch nghieâng taïi 30oC trong 7 ngaøy vaø giöõ gioáng taïi 4oC. Moâi tröôøng nuoâi caáy laø moâi tröôøng thaïch dòch nha vaø moâi tröôøng giöõ gioáng laø moâi tröôøng khoai taây – caø roát agar (Baûng 3.1). Baûng 3.1 – Thaønh phaàn moâi tröôøng khoai taây – caø roát agar Thaønh phaàn Haøm löôïng Khoai taây 20 g Caø roát 20 g Agar 20 g Nöôùc caát 1000 mL 3.1.2. Chuaån bò löôïng gioáng caáy Baøo töû sau 7 ngaøy nuoâi caáy treân oáng thaïch nghieâng ñöôïc tieán haønh ñöa vaøo nghieân cöùu. Laáy 10 mL nöôùc caát voâ khuaån cho vaøo oáng gioáng, laéc ñeàu treân maùy laéc oáng nghieäm ñeå taùch lôùp baøo töû treân maët thaïch, sau ñoù chuyeån dòch baøo töû sang oáng nghieäm ñöïng nöôùc caát ban ñaàu. Tröôùc khi laáy gioáng ñeå caáy vaøo moâi tröôøng khaûo saùt, caàn laéc kyõ oáng dòch baøo töû ñeå baøo töû ñöôïc phaân boá ñeàu trong oáng nghieäm. 3.1.3. Thaønh phaàn moâi tröôøng 3.1.3.1. Baõ ñaäu naønh Baõ ñaäu naønh söû duïng trong nghieân cöùu laø nguoàn pheá lieäu trong coâng nghieäp saûn xuaát söõa ñaäu naønh ñaõ qua quaù trình nghieàn vaø saáy ñeán ñoä aåm 6%. 3.1.3.2. Baõ mía Mía sau khi eùp kieät nöôùc ñöôïc ñöa vaøo quy trình xöû lyù: röûa saïch baõ mía ba laàn baèng nöôùc caát, saáy taïi nhieät ñoä 80oC trong hai ngaøy, sau ñoù ñem nghieàn vaø caét nhoû baõ mía. Phaàn mía ñöôïc söû duïng trong nghieân cöùu coù kích thöôùc töø 1 – 2 mm [24]. Hình 3.1 - Quy trình xöû lyù baõ mía 3.1.3.3. Thaønh phaàn boå sung Nguoàn chaát caûm öùng khaûo saùt: daàu ñaäu naønh vaø daàu döøa. Nguoàn nitô: (NH4)2SO4 Nguoàn khoaùng: KH2PO4, FeSO4, CuSO4, MgSO4, MnSO4 Töø nguoàn nitô vaø khoaùng, pha thaønh dung dòch boå sung caùc thaønh phaàn khaûo saùt vaøo moâi tröôøng nghieân cöùu vôùi haøm löôïng nhö trong baûng 3.2. Baûng 3.2 – Thaønh phaàn dung dòch boå sung Thaønh phaàn Haøm löôïng (NH4)2SO4 4 g KH2PO4 2 g MgSO4.7H2O 0,6 g MnSO4.7H2O 0,2 g FeSO4.7H2O 0,1 g CuSO4.5H2O 0,1 g Nöôùc caát 100 mL 3.1.4. Thieát bò vaø Hoùa chaát Baûng 3.3 – Thieát bò söû duïng trong nghieân cöùu Thieát bò Muïc ñích söû duïng Thoâng soá kyõ thuaät Caân 4 soá leû Caân chính xaùc hoùa chaát, moâi tröôøng Caân 2 soá leû Caân hoùa chaát, moâi tröôøng Maùy ño pH Ño pH Noài haáp tieät truøng Tieät truøng moâi tröôøng, duïng cuï 121oC, 20 phuùt Maùy laéc ngang Trích ly enzyme Trích ly: 300 voøng/phuùt Phaûn öùng: 250 voøng/phuùt Beå ñieàu nhieät Xaùc ñònh hoaït tính enzyme Nhieät ñoä: 40,45,50,55oC Tuû caáy Caáy gioáng vaøo moâi tröôøng Maùy chuaån ñoä Xaùc ñònh hoaït tính enzyme Maùy khuaáy töø Troän dung dòch chuaån ñoä Maùy ñoàng hoùa cô Ñoàng hoùa tributyrin - gum Maùy laéc oáng nghieäm Phaân phoái ñeàu baøo töû Maùy xaùc ñònh ñoä aåm Xaùc ñònh ñoä aåm moâi tröôøng Nhieät ñoä saáy: 110oC Baûng 3.4 – Hoùa chaát söû duïng trong nghieân cöùu Teân hoùa chaát Muïc ñích söû duïng Nguoàn goác Tributyrin Xaùc ñònh hoaït tính enzyme Merck - Ñöùc Gum arabic Xaùc ñònh hoaït tính enzyme Merck - Ñöùc NaOH Xaùc ñònh hoaït tính enzyme Pha dung dòch ñeäm Vieät Nam n-Hexan Taùch chaát beùo trong dòch chieát enzyme Trung Quoác Acetone Voâ hoaït enzyme Vieät Nam Coàn tuyeät ñoái Voâ hoaït enzyme Vieät Nam KH2PO4 Thaønh phaàn moâi tröôøng Pha dung dòch ñeäm Vieät Nam FeSO4 Thaønh phaàn moâi tröôøng Vieät Nam CuSO4 Thaønh phaàn moâi tröôøng Vieät Nam MgSO4 Thaønh phaàn moâi tröôøng Vieät Nam MnSO4 Thaønh phaàn moâi tröôøng Vieät Nam (NH4)2SO4 Thaønh phaàn moâi tröôøng Vieät Nam Peptone Thaønh phaàn moâi tröôøng Trung Quoác Chaát chieát naám men Thaønh phaàn moâi tröôøng Trung Quoác 3.2. PHÖÔNG PHAÙP NGHIEÂN CÖÙU Chuûng naám moác Rhizopus sp. ñaõ ñöôïc xaùc ñònh laø thích hôïp cho vieäc nuoâi caáy sinh toång hôïp lipase treân moâi tröôøng baõ ñaäu naønh [3]. Trong voøng 42 giôø, lipase thu nhaän coù hoaït tính 53,843 IU/g khoái löôïng moâi tröôøng. Keát quaû naøy cho thaáy moâi tröôøng baõ ñaäu naønh raát coù trieån voïng trong öùng duïng saûn xuaát lipase theo quy moâ coâng nghieäp. Vì vaäy, trong baøi nghieân cöùu naøy, chuùng toâi ñaõ chuyeån ñoåi moâ hình nuoâi caáy töø bình Erlen 250 mL sang söû duïng bao tieät truøng PP vôùi muïc ñích naâng cao hoaït tính lipase thu nhaän ñöôïc. Noäi dung nghieân cöùu bao goàm: Khaûo saùt aûnh höôûng cuûa thôøi gian ñeán hoaït tính lipase thu nhaän treân moâi tröôøng baõ ñaäu naønh trong hai moâ hình nghieân cöùu: Erlen vaø bao PP. Khaûo saùt aûnh höôûng cuûa vieäc boå sung baõ mía ñeán hoaït tính lipase. Khaûo saùt aûnh höôûng cuûa ñoä aåm moâi tröôøng ñeán hoaït tính lipase. Khaûo saùt aûnh höôûng loaïi chaát caûm öùng vaø haøm löôïng ñeán hoaït tính lipase. Xaùc ñònh thôøi gian nuoâi caáy thích hôïp ñeå thu nhaän lipase. Xaùc ñònh ñieàu kieän phaûn öùng toái öu cho lipase thu nhaän ñöôïc. 3.2.1. Moâ hình nuoâi caáy trong bao tieät truøng PP Trong moâ hình naøy, chuùng toâi söû duïng loaïi bao PP coù kích thöôùc 16,5 x 27,5 cm ñeå tieán haønh nuoâi caáy naám moác treân moâi tröôøng baõ ñaäu naønh. Bao PP coù khaû naêng chòu ñöôïc nhieät ñoä tieät truøng laø 121oC vaø khoâng bò bieán daïng sau khi haáp. Caùc thaønh phaàn vaø ñieàu kieän nuoâi caáy hoaøn toaøn töông töï nhö trong moâ hình söû duïng erlen (Baûng 3.5). Chuùng toâi tieán haønh nghieân cöùu song song hai loaïi moâ hình treân theo thôøi gian. Baét ñaàu laáy maãu ñem phaân tích taïi thôøi ñieåm 30 giôø, sau ñoù khoaûng 12 giôø chuùng toâi laáy maãu moät laàn. Moãi maãu bao goàm bình erlen vaø bao PP nuoâi caáy theo thôøi gian töông öùng. Baûng 3.5 – Thaønh phaàn nuoâi caáy trong erlen vaø bao PP Thaønh phaàn Haøm löôïng Baõ ñaäu naønh 10 g Dung dòch boå sung 10 mL Dòch baøo töû 1 mL Chuaån bò thí nghieäm nhö sau: Löôïng gioáng caáy: ñöôïc chuaån bò nhö trong phaàn 3.1.2. Tieán haønh kieåm tra laïi soá löôïng baøo töû trong 1mL dòch baøo töû baèng caùch pha loaõng vôùi nöôùc caát voâ khuaån vaø ñeám tröïc tieáp döôùi kính hieån vi. Sau khi coù keát quaû, tính toaùn löôïng nöôùc caát voâ khuaån cho vaøo sao cho 1mL dòch baøo töû chöùa khoaûng 107 baøo töû. Caân chính xaùc khoái löôïng baõ ñaäu naønh laø 10g, cho vaøo erlen 250mL vaø bao PP cuøng vôùi 10mL dung dòch boå sung, troän ñeàu hoãn hôïp. Laøm nuùt boâng ñaäy kín mieäng bình erlen vaø bao PP. Haáp tieät truøng 121oC trong 20 phuùt. Laøm nguoäi moâi tröôøng ñeán nhieät ñoä phoøng. Tieán haønh caáy gioáng vaøo moâi tröôøng vaø thöïc hieän trong tuû caáy (söû duïng pipet voâ khuaån caáy 1mL dòch baøo töû ñöôïc chuaån bò nhö treân vaøo moâi tröôøng), sau ñoù troän ñeàu. Nuoâi ôû nhieät ñoä thöôøng 30oC trong tuû aám. Töø keát quaû phaân tích hoaït tính lipase, chuùng toâi seõ so saùnh khaû naêng söû duïng cuûa hai loaïi moâ hình naøy vaø choïn ra moâ hình vaø thôøi gian thích hôïp cho vieäc khaûo saùt yeáu toá tieáp theo. 3.2.2. Khaûo saùt aûnh höôûng cuûa vieäc boå sung baõ mía ñeán hoaït tính lipase Trong thí nghieäm naøy, chuùng toâi thay ñoåi thaønh phaàn moâi tröôøng nuoâi caáy baèng caùch boå sung baõ mía theo phaàn traêm khoái löôïng baõ ñaäu naønh (30, 40, 50%). Tieán haønh song song maãu ñoái chöùng, khoâng boå sung baõ mía, khoái löôïng baõ ñaäu naønh laø 10g. Böôùc chuaån bò thí nghieäm thöïc hieän nhö treân. Thôøi gian nuoâi caáy laø thôøi gian toái öu trong phaàn khaûo saùt 3.2.1. Baûng 3.6 – Thaønh phaàn nuoâi caáy trong bao PP khi khaûo saùt aûnh höôûng cuûa baõ mía Thaønh phaàn Haøm löôïng Baõ ñaäu naønh 7 g Baõ mía 2,1 ; 2,8 ; 3,5 g Dung dòch boå sung 10 mL Dòch baøo töû 1 mL Nöôùc caát (*) 3,3 ; 5,4 ; 7,5 mL (*): löôïng nöôùc caát boå sung tính toaùn döïa treân ñoä aåm ban ñaàu cuûa baõ ñaäu naønh vaø baõ mía sao cho ñoä aåm cuûa moâi tröôøng nuoâi caáy laø nhö nhau. Töø keát quaû phaân tích, chuùng toâi seõ ñaùnh giaù aûnh höôûng vieäc boå sung baõ mía vaø haøm löôïng toái öu ñoái vôùi hoaït tính lipase ñeå tieáp tuïc khaûo saùt yeáu toá tieáp theo. 3.2.3. Khaûo saùt aûnh höôûng cuûa ñoä aåm moâi tröôøng ñeán hoaït tính lipase Keát hôïp caùc yeáu toá khaûo saùt ôû phaàn treân, chuùng toâi tieán haønh nghieân cöùu söï aûnh höôûng cuûa ñoä aåm ñeán hoaït tính lipase sinh toång hôïp treân moâi tröôøng naønh mía. Coá ñònh theå tích dung dòch boå sung (10mL), ñoä aåm moâi tröôøng thay ñoåi phuï thuoäc vaøo löôïng nöôùc caát theâm vaøo. Caùc giaù trò ñoä aåm khaûo saùt laø ñoä aåm sau khi tieät truøng. Xaùc ñònh ñoä aåm moâi tröôøng baèng phöông phaùp saáy ñeán khoái löôïng khoâng ñoåi ôû nhieät ñoä 110oC. 3.2.4. Khaûo saùt aûnh höôûng cuûa chaát caûm öùng ñeán hoaït tính lipase Caùc loaïi chaát caûm öùng boå sung vaøo moâi tröôøng goàm coù daàu naønh vaø daàu meø. Haøm löôïng caùc loaïi daàu chieám 1,5% khoái löôïng moâi tröôøng. Tieán haønh maãu khoâng boå sung daàu ñeå ñoái chöùng. Caùc böôùc chuaån bò thöïc hieän nhö treân. Sau khi choïn ñöôïc loaïi chaát caûm öùng boå sung phuø hôïp, tieán haønh khaûo saùt aûnh höôûng cuûa haøm löôïng chaát caûm öùng ñoái vôùi hoaït tính lipase thu nhaän. Caùc giaù trò khaûo saùt: 0,5 ; 1,0 ; 1,5 ; 2,0 ; 2,5 ; 3,0%. 3.2.5. Xaùc ñònh thôøi gian nuoâi caáy thích hôïp ñeå thu nhaän lipase Sau khi ñaõ xaùc ñònh caùc thaønh phaàn toái öu cuûa moâi tröôøng, chuùng toâi tieán haønh kieåm tra thôøi gian nuoâi caáy ñeå thu nhaän lipase coù hoaït tính cao nhaát. Baét ñaàu laáy maãu taïi thôøi ñeåm 30 giôø, khoaûng caùch moãi laàn laø 12 giôø. 3.2.6. Xaùc ñònh ñieàu kieän phaûn öùng toái öu cho lipase Khaûo saùt hoaït tính cuûa dòch enzyme thoâ trong ñieàu kieän phaûn öùng nhieät ñoä vaø pH khaùc nhau. Caùc giaù trò khaûo saùt: pH: 7,0 ; 7,5 ; 8,0 ; 8,5 ; 9,0. Nhieät ñoä: 35, 40, 45, 50, 55oC. Maãu ñoái chöùng coù giaù trò pH 7 vaø nhieät ñoä 35oC. 3.3. PHÖÔNG PHAÙP PHAÂN TÍCH 3.3.1. Xaùc ñònh hoaït tính lipase baèng phöông phaùp chuaån ñoä acid – base [30] Phöông phaùp naøy caên cöù vaøo löôïng acid töï do taïo thaønh trong dòch thuûy phaân triglyceride. Dung dòch cô chaát phaûn öùng laø heä nhuõ töông 10% tributyrin, boå sung 10% gum arabic, ñoàng hoùa baèng thieát bò ñoàng hoùa cô trong 10 phuùt. Chuaån bò dòch enzyme thoâ: sau khoaûng thôøi gian nuoâi caáy, cho vaøo erlen hoaëc bao PP chöùa canh tröôøng vi sinh vaät chính xaùc 100mL nöôùc caát, neáu thaønh phaàn moâi tröôøng coù baõ mía thì duøng chính xaùc 200mL nöôùc caát. Ñaùnh tôi canh tröôøng, ñoå toaøn boä hoãn hôïp vaøo erlen vaø ñöa leân maùy laéc 300 voøng/phuùt trong 2 giôø. Sau ñoù ly taâm vôùi toác ñoä 3000 voøng/phuùt trong 15 phuùt, thu laáy dòch trong enzyme thoâ. Chuaån bò dung dòch phaûn öùng: söû duïng erlen 100mL, laàn löôït cho vaøo bình caùc theå tích nhö sau: 5mL dung dòch ñeäm phosphate pH = 7; 5mL dung dòch enzyme thoâ; 5mL dung dòch cô chaát. Tieán haønh phaûn öùng: laéc ñeàu hoãn hôïp, phaûn öùng trong 1 giôø ôû nhieät ñoä phoøng (35oC). Sau ñoù, theâm vaøo 10mL dung dòch acetone : coàn tuyeät ñoái (1:1) ñeå döøng phaûn öùng. Ñoå toaøn boä dung dòch sau phaûn öùng vaøo becher 100mL, cho theâm 25mL nöôùc caát roài tieán haønh chuaån ñoä baèng maùy chuaån ñoä töï ñoäng. Caøi ñaët giaù trò pH töông ñöông (End point) 9,25 ñeå döøng quaù trình chuaån ñoä. Thöïc hieän song song maãu ñoái chöùng: töông töï nhö treân nhöng cho vaøo 10mL dung dòch acetone – coàn tuyeät ñoái (1:1) ñeå voâ hoaït enzyme tröôùc khi cho dung dòch cô chaát ñeå phaûn öùng. Trong ñieàu kieän naøy, phaûn öùng thuûy phaân do enzyme phaûn öùng seõ khoâng xaûy ra. 3.3.2. Coâng thöùc tính hoaït tính lipase [21] Ñoái vôùi lipase, moät ñôn vò hoaït ñoä IU laø löôïng enzyme caàn thieát ñeå xuùc taùc taïo thaønh 1 micromole acid beùo trong 1 phuùt ôû caùc ñieàu kieän xaùc ñònh. Hoaït tính xuùc taùc cuûa lipase laø soá ñôn vò hoaït ñoä coù trong 1g chaát khoâ moâi tröôøng nuoâi caáy vi sinh vaät ñeå thu nhaän enzyme. Moâi tröôøng söû duïng laø baõ ñaäu naønh ñaõ saáy khoâ, neân coâng thöùc hoaït tính lipase ñöôïc bieåu dieãn nhö sau: Hoaït tính lipase (IU/g) = ( DV x N x 1000 x v1) / ( v2 x t x m) Trong ñoù: DV : hieäu soá mL dung dòch NaOH chuaån ñoä maãu so vôùi maãu traéng. N : noàng ñoä ñöông löôïng dung dòch NaOH 0,1N trong chuaån ñoä. 1000 : heä soá quy ñoåi ñôn vò. v1 : soá mL nöôùc caát duøng ñeå trích ly maãu canh tröôøng raén. v2 : soá mL dòch enzyme thoâ ñem phaûn öùng. t : thôøi gian phaûn öùng tính baèng phuùt. m : soá g moâi tröôøng baõ ñaäu naønh ñem nuoâi caáy. 3.3.3. Phöông phaùp xöû lyù thoáng keâ Ñoä laëp laïi caùc maãu thí nghieäm laø ba laàn. Xöû lyù baèng phaàn meàm STATGRAPHICS Plus 3.0. Theå hieän caùc kyù töï (a, b, c, …) beân caïnh keát quaû xöû lyù. Caùc giaù trò coù kyù töï gioáng nhau nghóa laø caùc giaù trò ñoù khoâng coù söï khaùc bieät veà yù nghóa. Ngöôïc laïi, caùc giaù trò coù kyù töï khaùc nhau laø caùc giaù trò coù söï khaùc bieät veà yù nghóa vôùi ñoä tin caäy 95%. Chöông 4 Keát quaû vaø Baøn luaän 4.1. Khaûo saùt khaû naêng sinh toång hôïp lipase treân moâi tröôøng baõ ñaäu naønh Döïa vaøo keát quaû nghieân cöùu tröôùc ñaây [3], chuùng toâi ñaõ choïn ñöôïc chuûng naám moác Rhizopus sp. coù khaû naêng sinh toång hôïp lipase hoaït tính cao treân moâi tröôøng baõ ñaäu naønh. Thaønh phaàn boå sung vaøo moâi tröôøng vaø ñieàu kieän nuoâi caáy ñaõ ñöôïc xaùc ñònh laø toái öu cho moâ hình erlen (Baûng 4.1). Tuy nhieân, nhö chuùng toâi ñaùnh giaù, hoaït tính cuûa lipase thu nhaän töø baõ ñaäu naønh vaãn coù theå taêng leân. Vì theá, chuùng toâi ñaõ tieán haønh nghieân cöùu moät loaïi moâ hình môùi: thay theá bình erlen baèng nhöõng bao PP ñeå nuoâi caáy. Muïc ñích cuûa loaïi moâ hình naøy laø taêng khaû naêng söû duïng cô chaát (baõ ñaäu naønh) vaø taïo ñieàu kieän nuoâi caáy toát hôn ñoái vôùi naám sôïi. Hôn theá nöõa, moâ hình bao PP chuùng toâi söû duïng laø böôùc ñaàu tieân trong vieäc nghieân cöùu phaùt trieån moâ hình nuoâi caáy thaønh quy moâ coâng nghieäp [31]. Baûng 4.1 – Thaønh phaàn moâi tröôøng vaø ñieàu kieän nuoâi caáy toái öu trong moâ hình erlen ñaõ khaûo saùt [3] Thaønh phaàn moâi tröôøng Haøm löôïng Ñieàu kieän nuoâi caáy Thoâng soá Baõ ñaäu naønh 10g Ñoä aåm ban ñaàu 53% Daàu ñaäu naønh 0,15g Nhieät ñoä nuoâi caáy 30oC Dung dòch boå sung 10mL Thôøi gian 42 giôø Dòch baøo töû 1mL Chuùng toâi tieán haønh nuoâi caáy cuøng moät luùc hai loaïi moâ hình bao PP vaø bình erlen vaø theo doõi hoaït tính lipase thay ñoåi theo thôøi gian. Thaønh phaàn moâi tröôøng nhö trong baûng 3.5. Baét ñaàu laáy maãu phaân tích taïi thôøi ñieåm 30 giôø. Keát quaû khaûo saùt theå hieän trong baûng 4.2. Baûng 4.2 – Hoaït tính lipase theo thôøi gian khi nuoâi treân moâi tröôøng baõ ñaäu naønh trong bao tieät truøng PP vaø erlen Bao tieät truøng PP Erlen(*) Thôøi gian, giôø IU/g Thôøi gian, giôø IU/g 30 27,264 ± 0,921 30 21,246 ± 0,344 38 31,751 ± 1,317 42 29,220 ± 0,173 47 25,661 ± 0,908 48 22,025 ± 0,528 60 21,928 ± 0,401 66 23,094 ± 0,017 72 27,254 ± 1,143 72 21,584 ± 0,388 87 37,023 ± 1,234 84 18,324 ± 0,199 96 25,282 ± 0,550 Caùc giaù trò trong baûng theå hieän giaù trò trung bình ± ñoä leäch chuaån cuûa 3 maãu ñoäc laäp. (*) Caùc giaù trò trong baûng theå hieän giaù trò trung bình ± ñoä leäch chuaån cuûa 2 maãu ñoäc laäp. Hình 4.1 – Hoaït tính lipase theo thôøi gian khi nuoâi treân moâi tröôøng baõ ñaäu naønh trong bao tieät truøng PP vaø Erlen Döïa vaøo ñoà thò, ta nhaän thaáy quy luaät bieán ñoåi hoaït tính lipase theo thôøi gian trong hai loaïi moâ hình laø gioáng nhau. Trong khoaûng töø 38 ñeán 42 giôø, lipase thu nhaän coù hoaït tính cao nhaát. Sau khoaûng thôøi gian naøy, hoaït tính enzyme baét ñaàu giaûm daàn. Tuy nhieân, neáu keùo daøi thôøi gian nuoâi caáy ñeán 60 giôø thì hoaït tính enzyme taêng trôû laïi nhöng sau ñoù tieáp tuïc giaûm maïnh. Ñöôøng cong hoaït tính lipase moâ hình bao PP naèm treân so vôùi ñöôøng cong moâ hình erlen. Ñieàu naøy cho thaáy khaû naêng öùng duïng bao PP ñeå nuoâi caáy laø coù trieån voïng. Nhìn vaøo ñoà thò, chuùng toâi taïm thôøi chia thôøi gian nuoâi caáy thaønh ba giai ñoaïn: giai ñoaïn I laø giai ñoaïn ñaït giaù trò hoaït tính lipase cöïc ñaïi (töø 0 ñeán 38 – 42 giôø nuoâi caáy), giai ñoaïn II laø giai ñoaïn hoaït tính baét ñaàu giaûm daàn (Erlen: töø 42 ñeán 50 giôø, bao PP: töø 38 ñeán 60 giôø), vaø giai ñoaïn III laø giai ñoaïn hoaït tính taêng trôû laïi vaø cho ñeán khi keát thuùc thôøi gian khaûo saùt. Trong giai ñoaïn I, hai loaïi moâ hình ñeàu ñaït hoaït tính lipase cao taïi thôøi ñieåm 38 – 42 giôø. Tuy nhieân, lipase thu nhaän töø moâ hình bao PP (31,751 IU/g) cho hoaït tính cao hôn moâ hình bình erlen (29,220 IU/g). Nguyeân nhaân laø do khaû naêng söû duïng beà maët cô chaát trong bao toát hôn trong erlen vì beà daøy canh tröôøng nuoâi caáy nhoû hôn 1cm vaø dieän tích canh tröôøng chieám 2/3 dieän tích cuûa bao. Trong khi ñoù, canh tröôøng nuoâi caáy trong bình erlen coù beà daøy töø 2 ñeán 3cm neân naám sôïi khoâng theå taän duïng phaàn cô chaát naèm ôû ñaùy bình. Moâ hình nuoâi caáy trong erlen vaø bao PP ñeàu thuoäc nhoùm 1 theo khoùa phaân loaïi caùc thieát bò leân men beà maët (2.2.7). Canh tröôøng hoaøn toaøn khoâng ñöôïc ñaûo troän vaø suïc khí. Söï khueách taùn khoâng khí xuyeân qua nuùt boâng laø khoâng ñaùng keå. Vì vaäy, chuùng toâi xem moâ hình nuoâi caáy laø moät heä kín. Neáu xeùt theo khía caïnh vó moâ, heä nuoâi caáy beà maët ñöôïc chia laøm 3 pha nhö sau: canh tröôøng, phaàn khoâng gian treân beà maët canh tröôøng vaø thaønh bình erlen hay bao PP. Chuùng toâi giaû thieát raèng phaàn khoâng gian treân beà maët canh tröôøng cuûa hai loaïi moâ hình laø nhö nhau. Do ñoù, chuùng toâi xeùt ñeán hai yeáu toá coøn laïi. Ñoái vôùi bao PP, söï truyeàn nhieät vaø chuyeån khoái qua lôùp voû bao laø hieäu quaû hôn so vôùi thaønh thuûy tinh bình erlen [31]. Ñoái vôùi canh tröôøng, khi phaân tích vi moâ, canh tröôøng ñöôïc chia thaønh 3 pha: haït cô chaát, lôùp sinh khoái bao quanh beà maët vaø khoâng gian xung quanh haït [19]. Chính yeáu toá dieän tích beà maët cô chaát ñöôïc söû duïng nhieàu trong moâ hình bao PP ñaõ laøm cho hoaït tính lipase taêng. Tuy nhieân, söï khueách taùn O2 vaøo beân trong haït raát haïn cheá do moâi tröôøng nuoâi caáy khoâng tôi xoáp. Ñieàu naøy laøm yeáu ñi söï sinh tröôûng phaàn khuaån ti dinh döôõng cuûa naám sôïi. Ñaây chính laø boä phaän tröïc tieáp sinh toång hôïp enzyme chuyeån hoùa cô chaát beân trong haït. Keát quaû laø hoaït tính lipase thu nhaän töø bao PP cao hôn töø erlen nhöng khoâng ñaùng keå. Lipase thu nhaän trong giai ñoaïn I coù hoaït tính cao nhaát bôûi vì ñaây laø giai ñoaïn xaûy ra quaù trình thích nghi vaø sinh tröôûng cuûa naám moác. Khi ñöôïc caáy vaøo moâi tröôøng baõ ñaäu naønh, baøo töû naám moác seõ baùm treân beà maët haït vaø phaùt trieån taïo thaønh hai boä phaän: khuaån ti khí sinh vaø khuaån ti dinh döôõng. Ñoä aåm thích hôïp vaø chaát dinh döôõng saün coù treân beà maët haït taïo ñieàu kieän thuaän lôïi cho khuaån ti khí sinh phaùt trieån maïnh. Khoâng nhöõng taïo thaønh lôùp sinh khoái bao xung quanh haït, khuaån ti khí sinh coøn phaùt trieån vöôn ra vuøng khoâng gian xung quanh. Ngöôïc laïi, phaàn khuaån ti dinh döôõng thì phaùt trieån vaø caém saâu vaøo beân trong haït. Löôïng O2 khueách taùn vaøo trong haït seõ giuùp cho söï phaùt trieån cuûa phaàn khuaån ti naøy, sinh toång hôïp löôïng enzyme caàn thieát ñeå thuûy phaân cô chaát, taïo thaønh chaát dinh döôõng cung caáp cho söï phaùt trieån cuûa heä sôïi. Trong 24 giôø ñaàu laø giai ñoaïn thích nghi, toång hôïp heä enzyme vaø chöa hình thaønh heä sôïi treân beà maët canh tröôøng. Töø 24 ñeán 36 giôø, heä sôïi baét ñaàu phaùt trieån vaø lan roäng treân khaép beà maët canh tröôøng. Taïi thôøi ñieåm 42 giôø, heä sôïi daøy ñaëc lieân keát caùc haït cô chaát taïo thaønh moät khoái canh tröôøng raén. Giai ñoaïn II laø giai ñoaïn hoaït tính lipase baét ñaàu giaûm. Giai ñoaïn naøy töông öùng vôùi pha oån ñònh cuûa naám moác. Hoaït tính lipase giaûm coù theå do löôïng O2 beân trong haït giaûm maïnh vaø söï khueách taùn O2 töø ngoaøi vaøo trong khoâng ñuû cho söï phaùt trieån tieáp tuïc cuûa khuaån ti dinh döôõng do bò ngaên caûn bôûi lôùp sinh khoái daøy ñaëc. Moät nguyeân nhaân khaùc coù theå gaây neân hieän töôïng naøy laø do trong quaù trình sinh tröôûng, nhieät cuûa quaù trình trao ñoåi chaát taêng maïnh daãn ñeán öùc cheá sinh toång hôïp enzyme. Döïa vaøo ñoà thò, ta nhaän thaáy ñoä doác cuûa ñöôøng cong thuoäc moâ hình erlen trong giai ñoaïn giaûm hoaït tính naøy doác hôn so vôùi moâ hình bao PP. Ñieàu naøy chöùng toû lipase bò öùc cheá vaø giaûm hoaït tính maïnh do nhieät cuïc boä khoâng ñöôïc giaûi toûa trong moâ hình erlen. Moät laàn nöõa chính yeáu toá beà daøy canh tröôøng vaø hieäu quaû cuûa söï truyeàn nhieät ñaõ gaây caûn trôû cho moâ hình erlen. Ngöôïc laïi, öu ñieåm hôn moâ hình erlen, dieän tích canh tröôøng trong bao PP ñöôïc traûi roäng treân 2/3 dieän tích cuûa bao taïo ñieàu kieän thuaän lôïi cho söï khueách taùn O2 vaøo beân trong haït vaø taêng hieäu quaû truyeàn nhieät. Vì vaäy, söï giaûm hoaït tính lipase trong bao keùo daøi ñeán 60 giôø. Cuoái giai ñoaïn II, baøo töû ñaõ baét ñaàu hình thaønh trong bao PP, nhöng moâ hình erlen thì khoâng thaáy xuaát hieän baøo töû. Ñaàu giai ñoaïn III laø quaù trình hình thaønh baøo töû cuûa naám moác. Quaù trình naøy phuï thuoäc vaøo ñieàu kieän hieän taïi cuûa moâ hình. Haøm löôïng O2, nguoàn dinh döôõng, ñoä aåm vaø nhieät ñoä laø yeáu toá quyeát ñònh. Ñoái vôùi moâ hình bao PP, trong quaù trình hình thaønh heä sôïi, caùc sôïi naám ñöôïc phaân boá roäng khaép beà maët canh tröôøng. Hieäu quaû söû duïng nguoàn cô chaát cao hôn so vôùi moâ hình erlen. Do ñoù, naám moác vaãn coù khaû naêngï sinh toång hôïp enzyme khi lan roäng tôùi nhöõng vò trí coù ñieàu kieän thuaän lôïi. Ñieàu naøy laøm cho ñöôøng cong hoaït tính moâ hình bao PP taêng leân trong giai ñoaïn naøy. Tuy nhieân, ñoái vôùi moâ hình erlen, hieän töôïng naøy khoâng xaûy ra. Cuoái giai ñoaïn III laø giai ñoaïn thoaùi hoùa daãn ñeán töû vong. Ñieàu kieän phaùt trieån raát khaéc nghieät. Löôïng O2 gaàn nhö khoâng ñuû trong lôùp sinh khoái bao quanh beà maët haït cô chaát, chaát dinh döôõng caïn kieät, nhieät ñoä taêng cao laøm khoâ beà maët cô chaát. Do ñoù, heä sôïi ngöøng phaùt trieån vaø suy vong daàn daàn. Quan saùt moâ hình erlen, ta nhaän thaáy thaäm chí baøo töû khoâng theå hình thaønh trong giai ñoaïn naøy. Sau khi phaân tích nhöõng keát quaû khaûo saùt, chuùng toâi quyeát ñònh choïn moâ hình bao tieät truøng PP thay theá cho moâ hình erlen. Coâng vieäc tieáp theo cuûa chuùng toâi laø phaùt huy nhöõng öu ñieåm vaø haïn cheá nhöõng khuyeát ñieåm cuûa loaïi moâ hình môùi naøy. Khoaûng thôøi gian 42 giôø ñöôïc choïn laø thôøi gian thích hôïp cho vieäc thu nhaän lipase treân moâi tröôøng baõ ñaäu naønh vaø ñöôïc aùp duïng ñeå khaûo saùt caùc yeáu toá tieáp theo. 4.2. Khaûo saùt aûnh höôûng cuûa vieäc boå sung baõ mía ñeán hoaït tính lipase Trong pha thích nghi cuûa naám moác, khuaån ti dinh döôõng seõ phaùt trieån vaø caém saâu vaøo beân trong haït cô chaát. Phaàn khuaån ti naøy seõ sinh toång hôïp lipase ñeå thuûy phaân nguoàn cô chaát laø löôïng daàu soùt trong haït baõ ñaäu naønh. Neáu löôïng O2 khueách taùn vaøo trong haït ñuû cung caáp cho söï phaùt trieån cuûa khuaån ti thì löôïng enzyme toång hôïp ñöôïc seõ nhieàu hôn. Vì vaäy ñeå taêng khaû naêng söû duïng cô chaát cuõng nhö taêng söï khueách taùn O2, ñoä tôi xoáp cuûa moâi tröôøng, chuùng toâi khaûo saùt vieäc boå sung baõ mía vaøo moâi tröôøng vôùi haøm löôïng khaùc nhau. Thaønh phaàn moâi tröôøng vaø haøm löôïng baõ mía boå sung nhö trong baûng 3.6, nuoâi caáy canh tröôøng trong bao PP, sau 42 giôø, laáy maãu ñeå phaân tích hoaït tính lipase. Keát quaû khaûo saùt ñöôïc theå hieän trong baûng 4.3. Baûng 4.3 – Aûnh höôûng haøm löôïng baõ mía ñeán hoaït tính lipase Baõ mía,% IU/g 0 31,751 ± 1,317d 30 43,310 ± 0,113c 40 52,470 ± 0,316b 50 63,654 ± 2,778a Caùc giaù trò trong baûng theå hieän giaù trò trung bình ± ñoä leäch chuaån cuûa 3 maãu ñoäc laäp. Caùc kyù töï khaùc nhau bieåu thò söï khaùc nhau coù yù nghóa (P<0,05). Hình 4.2 – Khaûo saùt söï aûnh höôûng haøm löôïng baõ mía ñeán hoaït tính lipase Khi taêng haøm löôïng mía boå sung vaøo moâi tröôøng, hoaït tính lipase taêng tuyeán tính vaø ñaït giaù trò 63,654 IU/g vôùi löôïng mía boå sung laø 50% khoái löôïng baõ ñaäu naønh. Haøm löôïng mía boå sung khaùc nhau ñeàu coù yù nghóa thoáng keâ. Ñieàu naøy chöùng minh raèng ñoä tôi xoáp cuûa moâi tröôøng coù aûnh höôûng quan troïng ñoái vôùi phöông phaùp nuoâi caáy beà maët. Moâ hình chuùng toâi nuoâi caáy khoâng ñaûo troän vaø suïc khí vaøo beân trong canh tröôøng. Vì theá boå sung löôïng mía seõ laøm taêng vuøng khoâng gian xung quanh beà maët cô chaát haït ñaäu naønh, daãn ñeán taêng söï khueách taùn haøm löôïng O2 vaøo beân trong haït cô chaát. Ngoaøi ra, löôïng mía boå sung coøn giuùp phaân boá ñeàu baõ ñaäu naønh beân trong canh tröôøng, taêng khaû naêng söû duïng cô chaát cuûa naám sôïi. Beân caïnh vieäc söû duïng baõ mía, chuùng toâi coøn söû duïng nhöõng nguoàn nguyeân lieäu phoái troän khaùc ñeå so saùnh khaû naêng aûnh höôûng cuûa chuùng ñoái vôùi hoaït tính lipase. Chuùng toâi ñaõ söû duïng traáu [3] vaø moät soá moâi tröôøng khaùc nhö baép, caùm mì, caùm gaïo, baõ döøa, baõ ñaäu phoäng ñeå troän vaøo moâi tröôøng baõ ñaäu naønh nhöng keát quaû khoâng khaû quan (keát quaû khaûo saùt nhöõng loaïi moâi tröôøng treân chuùng toâi khoâng ñöa vaøo baøi nghieân cöùu naøy). Vì vaäy, vieäc söû duïng baõ mía ñaõ ñöa ñeán cho chuùng toâi moät keát quaû raát toát. Vaø chuùng toâi xem ñaây laø thaønh phaàn thích hôïp ñeå phoái troän chung vôùi moâi tröôøng baõ ñaäu naønh. Moät ñieàu chuùng toâi löu yù laø khi boå sung baõ mía vôùi haøm löôïng 50% baõ ñaäu naønh thì theå tích canh tröôøng trong bao PP taêng leân gaáp 4 laàn so vôùi canh tröôøng chæ coù baõ ñaäu naønh. Neáu chuùng toâi taêng tæ leä baõ mía nghieân cöùu leân 60, 70% thì theå tích bao PP khoâng ñuû ñeå phaàn khoâng gian treân beà maët canh tröôøng laø nhö nhau trong caùc ñieàu kieän khaûo saùt ôû phaàn treân. Vì vaäy, ñeå ñôn giaûn hoùa vieäc nghieân cöùu, chuùng toâi döøng haøm löôïng baõ mía ôû möùc 50%, laáy keát quaû naøy ñeå khaûo saùt caùc yeáu toá tieáp theo. Sau khi coù thaønh phaàn vaø ñieàu kieän nuoâi caáy toái öu, chuùng toâi seõ naâng caáp moâ hình nghieân cöùu (scale-up) ñeå ñöa vaøo quy moâ lôùn hôn. 4.3. Khaûo saùt aûnh höôûng cuûa ñoä aåm moâi tröôøng ñeán hoaït tính lipase Ñoä aåm laø moät yeáu toá quan troïng aûnh höôûng ñeán khaû naêng sinh toång hôïp enzyme cuûa naám moác treân moâi tröôøng nuoâi caáy beà maët. Löôïng aåm boå sung vaøo moâi tröôøng seõ taäp trung chuû yeáu treân beà maët haït cô chaát. Nhôø vaøo löôïng aåm naøy maø baøo töû cuûa naám moác coù theå phaùt trieån taïo thaønh heä sôïi treân beà maët canh tröôøng. Ngoaøi ra, löôïng aåm töï do naøy coøn coù theå khueách taùn vaøo beân trong haït cô chaát, hoøa tan chaát dinh döôõng ñeå deã daøng vaän chuyeån vaøo trong teá baøo khuaån ti; xuùc taùc cho phaûn öùng thuûy phaân cuûa enzyme vaø laøm giaûm löôïng nhieät sinh ra trong quaù trình trao ñoåi chaát cuûa heä sôïi. Trong phaàn naøy, chuùng toâi khaûo saùt aûnh höôûng cuûa ñoä aåm moâi tröôøng ñeán hoaït tính lipase. Thaønh phaàn moâi tröôøng bao goàm baõ mía vaø baõ ñaäu naønh (tæ leä 1:2). Coá ñònh theå tích dung dòch boå sung vaø dòch baøo töû caáy vaøo moâi tröôøng, chuùng toâi boå sung nöôùc caát ñeå laøm thay ñoåi ñoä aåm moâi tröôøng (Baûng 4.4). Ñoä aåm cuûa moâi tröôøng ñöôïc xaùc ñònh ngay sau khi haáp tieät truøng moâi tröôøng. Thôøi gian nuoâi caáy laø 42 giôø, sau ñoù tieán haønh laáy maãu phaân tích. Baûng 4.4 – Thaønh phaàn nuoâi caáy trong bao PP khi khaûo saùt aûnh höôûng cuûa ñoä aåm Thaønh phaàn Haøm löôïng Baõ ñaäu naønh 7 g Baõ mía 3,5 g Dung dòch boå sung 10 mL Dòch baøo töû 1 mL Nöôùc caát 5 ; 10 mL Keát quaû khaûo saùt ñöôïc theå hieän trong baûng 4.5. Baûng 4.5 – Aûnh höôûng ñoä aåm ñeán hoaït tính lipase Ñoä aåm,% IU/g 38,90* 39,206 ± 0,372c 51,84** 63,146 ± 0,621a 60,09 55,114 ± 0,693b 65,73 55,460 ± 1,021b (*): khoâng theâm nöôùc caát; dung dòch boå sung 5mL, haøm löôïng khoaùng vaø nitô khoâng thay ñoåi. (**): khoâng theâm nöôùc caát;dung dòch boå sung 10mL,haøm löôïng khoaùng vaø nitô khoâng thay ñoåi. Caùc giaù trò trong baûng theå hieän giaù trò trung bình ± ñoä leäch chuaån cuûa 3 maãu ñoäc laäp. Caùc kyù töï khaùc nhau bieåu thò söï khaùc nhau coù yù nghóa (P<0,05). Hình 4.3 – Aûnh höôûng ñoä aåm ñeán hoaït tính lipase thu nhaän treân moâi tröôøng baõ ñaäu naønh boå sung baõ mía Khi boå sung nöôùc caát vaøo moâi tröôøng vôùi haøm löôïng 5, 10mL thì ñoä aåm cuûa moâi tröôøng töông öùng laø 60 vaø 66%. Ñoái vôùi hai maãu coøn laïi, chuùng toâi phaûi thay ñoåi theå tích dung dòch boå sung ñeå laøm thay ñoåi ñoä aåm cuûa moâi tröôøng nhöng caùc yeáu toá coøn laïi phaûi coá ñònh. Trong ñoù coù moät maãu chuùng toâi khoâng theâm nöôùc caát ñeå laøm maãu ñoái chöùng. Ñoä aåm cuûa maãu naøy laø 52%. Ñoái vôùi 5mL dòch boå sung, ñoä aåm moâi tröôøng laø 39%. Döïa vaøo keát quaû naøy, ta nhaän thaáy hoaït tính lipase cao nhaát khi thu nhaän treân moâi tröôøng coù ñoä aåm 52%. Ñaây laø ñoä aåm toái öu cho söï phaùt trieån cuûa naám moác treân canh tröôøng naønh mía. Neáu ñoä aåm moâi tröôøng taêng cao thì seõ laøm keát dính caùc haït cô chaát trong canh tröôøng, daãn ñeán giaûm söï khueách taùn khoâng khí treân beà maët canh tröôøng vaøo trong vuøng khoâng gian giöõa nhöõng haït cô chaát. Löôïng O2 seõ khoâng ñöôïc cung caáp ñaày ñuû, toác ñoä sinh tröôûng giaûm vaø hoaït tính enzyme seõ giaûm. Neáu ñoä aåm moâi tröôøng quaù thaáp, baøo töû khoâng theå phaùt trieån treân beà maët haït cô chaát daãn ñeán hoaït tính enzyme giaûm ñi ñaùng keå. Vì ñoä aåm aûnh höôûng quan troïng ñeán söï phaùt trieån cuûa naám moác trong giai ñoaïn ñaàu cuûa quaù trình nuoâi caáy beà maët neân chuùng toâi phaûi xaùc ñònh tröôùc khi khaûo saùt caùc yeáu toá khaùc. Neáu khoâng, vieäc khaûo saùt aûnh höôûng cuûa caùc yeáu toá sau seõ khoâng coøn khaùch quan. Keát thuùc giai ñoaïn naøy, chuùng toâi ñaõ xaùc ñònh ñöôïc thaønh phaàn moâi tröôøng nuoâi caáy nhö sau: baõ ñaäu naønh 7g; baõ mía 3,5g; dung dòch boå sung 10mL; löôïng gioáng caáy vaøo moâi tröôøng 1mL vaø ñieàu kieän nuoâi caáy laø 30oC, 42 giôø, ñoä aåm ban ñaàu laø 52%. Hoaït tính lipase ñaït ñöôïc 63,146 IU/g. 4.4. Khaûo saùt aûnh höôûng vieäc boå sung chaát caûm öùng ñeán hoaït tính lipase Lipase laø moät loaïi enzyme caûm öùng. Loaïi enzyme naøy chæ toàn taïi vôùi moät löôïng cô baûn töông ñoái ít. Vieäc toång hôïp enzyme chæ ñöôïc thöïc hieän khi coù nhu caàu söû duïng. Khi ñoù, löôïng enzyme seõ taêng moät caùch ñoät ngoät. Tuy nhieân, ñeå toång hôïp ñöôïc lipase, ñoøi hoûi trong moâi tröôøng phaûi coù chaát caûm öùng töông öùng. ÔÛ ñaây, chaát caûm öùng chính laø cô chaát daàu triglyceride chòu söï thuûy phaân cuûa loaïi enzyme naøy. Ngoaøi ra, ñoái vôùi phöông phaùp leân men beà maët, quaù trình sinh toång hôïp lipase coøn lieân quan ñeán söï tieáp xuùc giöõa phaàn khuaån ti dinh döôõng vôùi cô chaát daàu beân trong haït. Neáu söï tieáp xuùc naøy khoâng hieäu quaû thì löôïng enzyme toång hôïp ñöôïc khoâng ñaùng keå. Vì vaäy chuùng toâi tieán haønh khaûo saùt aûnh höôûng cuûa vieäc boå sung chaát caûm öùng vaøo moâi tröôøng naønh mía. Chuùng toâi khaûo saùt hai loaïi chaát caûm öùng laø daàu naønh vaø daàu döøa. Ñaây laø hai loaïi daàu khaù phoå bieán vaø deã tìm. Söï khaùc bieät giöõa hai loaïi daàu naøy laø ñoä daøi maïch carbon cuûa phaân töû acid beùo vaø möùc ñoä khoâng no cuûa chuùng. Daàu naønh chuû yeáu laø haøm löôïng acid linoleic (C18:2), trong khi ñoù daàu döøa chuû yeáu laø haøm löôïng acid lauric (C12:0). Söï khaùc nhau nhö vaäy coù theå döï ñoaùn tính ñaëc hieäu veà cô chaát cuûa lipase thu nhaän ñöôïc. Thaønh phaàn moâi tröôøng nhö trong baûng 4.6, haøm löôïng daàu khaûo saùt laø 1,5% khoái löôïng moâi tröôøng, nuoâi caáy trong 42 giôø, sau ñoù ñem maãu ñi phaân tích. Baûng 4.6 – Thaønh phaàn nuoâi caáy trong bao PP khi khaûo saùt aûnh höôûng cuûa chaát caûm öùng Thaønh phaàn Haøm löôïng Baõ ñaäu naønh 7 g Baõ mía 3,5 g Dung dòch boå sung 10 mL Haøm löôïng daàu 0,15 g Dòch baøo töû 1 mL Keát quaû khaûo saùt ñöôïc theå hieän trong baûng 4.7. Baûng 4.7 – Aûnh höôûng cuûa vieäc boå sung chaát caûm öùng ñeán hoaït tính lipase thu nhaän töø moâi tröôøng baõ ñaäu naønh keát hôïp baõ mía Loaïi daàu IU/g Ñoái chöùng 63,146 ± 0,621c Daàu naønh 70,635 ± 1,793b Daàu döøa 81,076 ± 2,332a Caùc giaù trò trong baûng theå hieän giaù trò trung bình ± ñoä leäch chuaån cuûa 3 maãu ñoäc laäp. Caùc kyù töï khaùc nhau bieåu thò söï khaùc nhau coù yù nghóa (P<0,05). Hình 4.4 – Aûnh höôûng cuûa vieäc boå sung chaát caûm öùng ñeán hoaït tính lipase thu nhaän töø moâi tröôøng baõ ñaäu naønh keát hôïp baõ mía Keát quaû phaân tích hoaït tính lipase cho thaáy 3 maãu khaùc nhau coù yù nghóa vaø daàu döøa laøm taêng hoaït tính cuûa enzyme nhieàu nhaát (81,076 IU/g). Khi boå sung daàu vaøo canh tröôøng nuoâi caáy, caùc phaân töû daàu beùo seõ phaân boá treân beà maët haït cô chaát vaø moät phaàn khueách taùn vaøo beân trong haït, laøm taêng khaû naêng tieáp xuùc vôùi khuaån ti dinh döôõng. Do ñoù, khaû naêng sinh toång hôïp lipase taêng maïnh. Vieäc söû duïng daàu döøa hieäu quaû hôn daàu naønh cho thaáy lipase coù tính ñaëc hieäu vôùi cô chaát. Beân caïnh ñoù, khi so saùnh vôùi maãu ñoái chöùng, chuùng toâi nhaän thaáy naám moác söû duïng haøm löôïng daàu trong baõ ñaäu naønh raát coøn haïn cheá. Nguyeân nhaân laø do khuaån ti dinh döôõng chæ coù theå söû duïng löôïng daàu ôû gaàn saùt beà maët haït. 4.5. Khaûo saùt thôøi gian nuoâi caáy ñeå thu nhaän lipase coù hoaït tính cao Vieäc boå sung baõ mía vaø daàu döøa coù theå aûnh höôûng ñeán toác ñoä sinh tröôûng cuûa naám moác. Vì vaäy, chuùng toâi khaûo saùt laïi thôøi gian nuoâi caáy ñeå choïn ra thôøi ñieåm thích hôïp ñeå thu nhaän lipase coù hoaït tính cao. Thaønh phaàn moâi tröôøng nuoâi caáy vaø keát quaû phaân tích hoaït tính lipase ñöôïc theå hieän trong baûng 4.8 vaø 4.9. Baûng 4.8 – Thaønh phaàn moâi tröôøng trong bao PP khi khaûo saùt thôøi gian nuoâi caáy Thaønh phaàn Haøm löôïng Baõ ñaäu naønh 7 g Baõ mía 3,5 g Dung dòch boå sung 10 mL Haøm löôïng daàu döøa 0,15 g Dòch baøo töû 1 mL Baûng 4.9– Hoaït tính lipase theo thôøi gian khi nuoâi treân moâi tröôøng baõ ñaäu naønh vaø baõ mía coù boå sung daàu döøa Thôøi gian, giôø IU/g 30 46,180 ± 1,157 42 81,076 ± 2,332 60 61,200 ± 3,564 72 66,365 ± 0,899 84 55,035 ± 3,742 96 55,105 ± 0,348 Caùc giaù trò trong baûng theå hieän giaù trò trung bình ± ñoä leäch chuaån cuûa 3 maãu ñoäc laäp. Hình 4.5 – Hoaït tính lipase theo thôøi gian khi nuoâi treân moâi tröôøng baõ ñaäu naønh vaø baõ mía coù boå sung daàu döøa Keát quaû phaân tích cho thaáy quy luaät bieán ñoåi hoaït tính lipase hoaøn toaøn töông ñoàng vôùi quy luaät chung maø chuùng toâi ñaõ ñeà caäp trong phaàn 4.1. Hoaït tính lipase taêng hôn gaáp ñoâi khi boå sung baõ mía vaø daàu döøa vaøo canh tröôøng taïi thôøi ñieåm 42 giôø. Ñaây laø thôøi gian toái öu ñeå nuoâi caáy chuûng naám moác Rhizopus treân moâi tröôøng naønh mía coù boå sung daàu döøa ñeå thu nhaän lipase (81,076 IU/g). Hình 4.6 – So saùnh hoaït tính lipase theo thôøi gian khi nuoâi trong ñieàu kieän khaûo saùt 4.6. Khaûo saùt haøm löôïng daàu döøa boå sung vaøo moâi tröôøng Sau khi ñaõ xaùc ñònh ñöôïc thôøi gian nuoâi caáy toái öu treân moâi tröôøng naønh mía, chuùng toâi tieáp tuïc khaûo saùt haøm löôïng daàu döøa toái öu cho hoaït tính lipase. Caùc giaù trò khaûo saùt bao goàm 0,5 ; 1,0 ; 1,5 ; 2,0 ; 2,5 ; 3,0% khoái löôïng moâi tröôøng. Tieán haønh song song moät maãu khoâng boå sung daàu ñeå ñoái chöùng. Thôøi gian nuoâi caáy laø 42 giôø. Keát quaû phaân tích theå hieän trong baûng 4.10. Baûng 4.10 – AÛnh höôûng haøm löôïng daàu döøa ñeán hoaït tính lipase Daàu döøa, % IU/g 0 63,146 0,5 116,762 1,0 101,571 1,5 81,076 2,0 106.095 2,5 105.857 3,0 116.762 Hình 4.7 – Aûnh höôûng haøm löôïng daàu döøa ñeán hoaït tính lipase Vieäc boå sung daàu döøa seõ laøm taêng khaû naêng sinh toång hôïp lipase. Nhöng haøm löôïng daàu quaù nhieàu treân beà maët haït cô chaát seõ gaây caûn trôû cho söï khueách taùn O2 vaøo beân trong haït, daãn ñeán vieäc laøm giaûm löôïng enzyme toång hôïp ñöôïc. Tuy nhieân, ñoái vôùi moâi tröôøng naønh mía chuùng toâi ñang khaûo saùt thì haøm löôïng mía chieám ñeán 50% khoái löôïng baõ ñaäu naønh neân theå tích moâi tröôøng taêng ñaùng keå. Do ñoù, aûnh höôûng cuûa haøm löôïng daàu döøa boå sung khaùc nhau laø khoâng roõ reät. Döïa vaøo ñoà thò, ta thaáy raèng hoaït tính lipase cao nhaát töông öùng vôùi haøm löôïng daàu döøa laø 0,5 vaø 3%. Vì vaäy chuùng toâi löïa choïn haøm löôïng daàu döøa ñeå boå sung vaøo moâi tröôøng naønh mía laø 0,5%. 4.7. Xaùc ñònh nhieät ñoä vaø pH toái öu cho phaûn öùng cuûa lipase Dòch enzyme thoâ cuûa maãu daàu döøa (baûng 4.7) coù hoaït tính luùc khaûo saùt laø 81,076 IU/g. Chuùng toâi tieán haønh xaùc ñònh pH vaø nhieät ñoä toái öu cho phaûn öùng cuûa enzyme trong maãu naøy. Ñeå xaùc ñònh pH toái öu, chuùng toâi thay ñoåi giaù trò pH cuûa dung dòch ñeäm boå sung vaøo hoãn hôïp phaûn öùng (3.3.1). Maãu ñoái chöùng coù pH = 7, nhieät ñoä phaûn öùng laø 35oC. Keát quaû khaûo saùt cho thaáy enzyme lipase coù pH toái öu laø 8,5. Hình 4.8 – Xaùc ñònh pH vaø nhieät ñoä toái öu cho phaûn öùng cuûa enzyme Ñeå xaùc ñònh nhieät ñoä phaûn öùng toái öu, chuùng toâi söû duïng giaù trò pH cuûa dung dòch ñeäm boå sung vaøo hoãn hôïp phaûn öùng laø 8,5. Söû duïng beå ñieàu nhieät, caùc maãu ñöôïc tieán haønh phaûn öùng taïi caùc nhieät ñoä khaùc nhau. Maãu ñoái chöùng coù nhieät ñoä phaûn öùng laø 35oC. Döïa vaøo ñoà thò, enzyme lipase coù nhieät ñoä toái öu laø 45oC. Chöông 5 Keát luaän vaø Ñeà nghò 5.1. KEÁT LUAÄN Vieäc thay ñoåi moâ hình nuoâi caáy baèng erlen sang moâ hình nuoâi caáy baèng bao PP ñaõ laøm taêng hoaït tính lipase thu nhaän ñöôïc töø chuûng naám moác Rhizopus sp. Beân caïnh ñoù, vieäc boå sung baõ mía vaø daàu döøa coøn laøm cho lipase ñaït hoaït tính cöïc ñaïi 116,762 IU/g chaát khoâ baõ ñaäu naønh chæ sau 42 giôø nuoâi caáy. Caùc keát quaû khaûo saùt ñöôïc nhö sau: Chuûng naám moác thích hôïp cho vieäc nuoâi caáy sinh toång hôïp lipase: Rhizopus sp. Thaønh phaàn moâi tröôøng vaø ñieàu kieän nuoâi caáy toái öu trong moâ hình bao PP: Thaønh phaàn moâi tröôøng Haøm löôïng Ñieàu kieän nuoâi caáy Thoâng soá Baõ ñaäu naønh 7g Ñoä aåm ban ñaàu 52% Baõ mía 3,5g Nhieät ñoä nuoâi caáy 30oC Daàu döøa 0,05g Thôøi gian 42 giôø Dung dòch boå sung 10mL Dòch baøo töû 1mL Thaønh phaàn dung dòch boå sung (trong 100mL nöôùc caát): Thaønh phaàn Haøm löôïng (NH4)2SO4 4 g KH2PO4 2 g MgSO4.7H2O 0,6 g MnSO4.7H2O 0,2 g FeSO4.7H2O 0,1 g CuSO4.5H2O 0,1 g pH phaûn öùng toái öu: 8,5. Nhieät ñoä phaûn öùng toái öu: 45oC. 5.2. ÑEÀ NGHÒ Do nhöõng haïn cheá veà maët thôøi gian vaø kinh phí, chuùng toâi vaãn chöa theå khaûo saùt ñöôïc moät soá caùc yeáu toá nhö sau: AÛnh höôûng cuûa nguoàn nitô ñeán khaû naêng sinh toång hôïp lipase. AÛnh höôûng cuûa thaønh phaàn vaø haøm löôïng dung dòch khoaùng boå sung ñeán khaû naêng sinh toång hôïp lipase. Nghieân cöùu naâng caáp quy moâ moâ hình: taêng khoái löôïng canh tröôøng. Nghieân cöùu caùc ñieàu kieän toái öu trong quy trình thu nhaän cheá phaåm lipase. Nghieân cöùu tinh saïch vaø baûo quaûn cheá phaåm. Nghieân cöùu öùng duïng cheá phaåm. TAØI LIEÄU THAM KHAÛO [1] Nguyeãn Laân Duõng (chuû bieân), Vi sinh vaät hoïc, NXB Giaùo Duïc, 2003, 520. [2] Leâ Vaên Vieät Maãn, Laïi Mai Höông, Thí nghieäm vi sinh vaät hoïc thöïc phaåm, NXB Ñaïi hoïc Quoác gia TpHCM, 2006, 152. [3] Traàn Thò Thieäp, Nghieân cöùu thu nhaän enzyme lipase töø naám moác, Luaän vaên Toát nghieäp Ñaïi hoïc, Ñaïi hoïc Baùch Khoa Tp.HCM, 2007. [4] Hjorth A., Carriere E., Cudrey C., A structural domain (the lid) found in pancreatic lipases is absent in the guinea pig (phospholipase) lipase, Biochemistry, 32, 1993. [5] Weete J.D., Microbial Lipases, Food Lipids: Chemistry, Nutrition and Biotechnology, Marcel Dekker, Inc, USA, 2002. [6] Dugi K.A., Dechek H.L., Tally G.D., Brewer H.B., Santamaria-Fojo S., Human lipoprotein lipase: The loop covering the catalytic site is essential for interaction with substrates, J. Biol. Chem., 267:25086, 1992. [7] Clark S.B., Laboda H.L., Triolein-phosphatidylcholine cholesterol emulsions as substrates for lipoprotein and hepatic lipases, Lipids, 26:28, 1991. [8] Baba T., Downs D., Jackson K.W., Tang J., Wang C.S., Structure of human milk activated lipase, Biochemistry, 30:500, 1991. [9] Mukherjee K.D., Mills M.J., Lipases from plants, Lipases, Cambridge University Press, Cambridge, 1994, 49. [10] Sharma R., Chisti Y., Chand Banerjee U., Production, purification, characterization, and applications of lipases, Biotechnology Advances, 19, 2001, 627 – 662. [11] Scherer, L.J., Rossi, J.J., Approaches for the sequence-specific knockdown of mRNA, Nature Biotechnol., 21, 2003, 1457 – 1465. [12] Enfors, S.O., Control of proteolysis in fermentation of recombinant proteins, Trends Biotechnol., 10, 1992, 310 – 315. [13] Wickner, S., Maurizi, M.R., Gottesman, S., Posttranslational quality control: folding, refolding, and degrading proteins, Science, 286, 1999, 1888 – 1893. [14] Henge, R., Bukau, B., Proteolysis in prokaryotes: protein quality control and regulatory principles, Mol. Microbiol., 49, 2003, 1541 – 1462. [15] Mitraki, A., Fane, B., Haase-Petigell, C., Sturtevant, J., King, J., Global suppression of protein folding defects and inclusion body formation, Science, 290, 1991, 54 – 58. [16] Jones, H.E., Holland, I.B., Campbell, A.K., Direct measurement of free Ca2+ shows different regulation of Ca2+ between the periplasm and the cytosol of Escherichia coli, Cell Calcium, 32, 2002, 183 – 192. [17] Wong D.W.S., Food Enzymes: Structure and Mechanism, Chapman & Hall, New York, 1995, 37 – 84. [18] Maruyama T., M. Nakajima, S. Ichikawa, H. Nabetani, S. Furusaki, M. Seki, Oil – Water Interfacial Activation of Lipase for Interesterification of Triglyceride and Fatty Acid, J. American Oil Chemist’s Society, Vol. 77, no. 11, 2000, 1121 – 1126. [19] David A. Mitchell, Nadia Krieger, Marin Berovic, Solid-State Fermentation Bioreactors: Fundamentals of Design and Operation, Springer Berlin Heidelberg, New York, 2006. [20] Susana R. Couto, M Aùngeles Sanromaùn, Application of solid-state fermentation to food industry – A review, Journal of Food Engineering, 76, 2006, 291 – 302. [21] Ikram ul-Haq, Shumaila Idrees, M. Ibrahim Rajoka, Production of lipases by Rhizopus oligosporous by solid-state fermentation, Process Biochemistry, 37, 2002, 637 – 641. [22] J. Cordova, M. Nemmaoui, M. Ismaili-Alaoui, A. Morin, S. Roussos, M. Raimbault, B. Benjilali, Lipase production by solid state fermentation of olive cake and sugar cane bagasse, Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 5, 1998, 75 – 78. [23] Alessandro D’Annibale, V. Brozzoli, S. Crognale, A.M. Gallo, F. Federici, M. Petruccioli, Optimisation by response surface methodology of fungal lipase production on olive mill wastewater, Journal of Chemical Technology and Biotechnology, 81, 2006, 1586 – 1593. [24] J.A. Rodriguez, J.C. Mateos, J. Nungaray, V. G., T.B., S. Roussos, J. Cordova, J.Bratti, Improving lipase production by nutrient source modification using Rhizopus homothallicus cultured in solid state fermentation, Process Biochemistry, 41, 2006, 2264 – 2269. [25] Luciana A.I., Patrícia M.G., Geraldo S.A., Leda R.C., Denise M.G., Production and Regulation of Lipase Activity from Penicillium restrictum in Submerged and Solid-State Fermentation, Current Microbiology, 54, 2007, 361 – 365. [26] Andreas K.G., Annette L.P., Leda R.C., Denise M.G., Lipase production by Penicillium restrictum in solid-state fermentation using babassu oil cake as substrate, Process Biochemistry, 35, 1999, 85 – 90. [27] Nutan D.M., Ulka S.P., K.B., Jayant M.K., Digambar V.G., Production of acidic lipase by Aspergillus niger in solid-state fermentation, Process Biochemistry, 38, 2002, 715 – 721. [28] Nilkamal M., Anshu G., S.K. Khare, Production of protease and lipase by solvent tolerant Pseudomonas aeruginosa PseA in solid-state fermentation using Jatropha curcas seed cake as substrate, Bioresource Technology, 2007. [29] N.R. Kamini, J.G.S. Mala, R. Puvanakrishnan, Lipase production from Aspergillus niger by solid-state fermentation using gingelly oil cake, Process Biochemistry, 33, 1997, 505 – 511. [30] Freùdeùric Beisson, Ali Tiss, Claude Rivieøre, Robert Verger, Methods for lipase detection and assay: a critical review, Eur. J. Lipid Sci. Technol., 2000, 133 – 153. [31] Rajagopalan S., Modak JM, Modeling of heat and mass transfer for solid state fermentation process in tray bioreactor, Bioprocess Eng., 13, 1995, 161.