Luận văn Nghiên cứu thu nhận, tinh sạch và xác định tính chất của chitinase từ mủ cây cao su hevea brasiliensis

baép, khoai taây, ñaäu Haø Lan, ñaäu naønh, cuû töø … vaø ñaëc bieät moät soá loaøi taûo bieån cuõng laø nguoàn cung caáp enzyme chitinase. Chitinase thöïc vaät toàn taïi chuû yeáu ôû caùc moâ nhaát ñònh hoaëc cô quan sinh saûn nhö haït gioáng, cuû, hoa vaø ñöôïc caûm öùng bôûi coân truøng vaø caùc taùc nhaân gaây haïi treân thöïc vaät. Beân trong teá baøo thöïc vaät, chitinase naèm trong khoâng baøo cuøng vôùi caùc enzyme choáng beänh khaùc. Ví duï caùc endochitinase mang tính base trong laù ñaäu taäp trung trong khoâng baøo vaø coù chöùa haàu heát caùc hoaït tính chitinase noäi baøo. Nhôø vaäy, khoâng baøo thöïc vaät ñöôïc xem töông töï nhö tieâu theå ôû ñoäng vaät. Bôûi vì baûn thaân thöïc vaät khoâng coù chöùa cô chaát cuûa nhöõng enzyme phaân giaûi nhö chitinase vaø β-1,3-glucanase, söï toàn taïi cuûa nhöõng enzyme naøy cho thaáy chuùng coù vai troø khaùng khuaån, khaùng naám kyù sinh gaây beänh vaø caû coân truøng. Caùc protein khaùng khuaån (pathogenesis-related protein) khaùc nhau ñöôïc phaân laäp töø thöïc vaät bao goàm thionin, protein baát hoaït ribosome, defensin, Nguyeãn Quang Nhaân - 11 - Phaàn I: Toång quan taøi lieäu β-1,3-glucanase vaø chitinase.nsLTP vaø caùc enzyme phaân giaûi nhö Nhieàu chitinase, gioáng nhö caùc protein khaùc ñoùng vai troø baûo veä, coù theå chòu ñöôïc caùc protease ngoaïi baøo, hoaëc mang tính acid hoaëc mang tính base (thoâng thöôøng caùc protein mang tính acid ñöôïc tieát vaøo apoplast hoaëc moâi tröôøng ngoaïi baøo, trong khi daïng base thöôøng taäp trung noäi baøo trong caùc khoâng baøo). Trình töï cuûa caùc chitinase acid gioáng vôùi caùc chitinase base, chæ khaùc ôû choã chuùng khoâng coù vuøng ñaàu N hevein. Xeùt veà ñaëc tính phaân caét, chitinase thöïc vaät thöôøng laø endochitinase phaân caét ngaãu nhieân. Moät soá chitinase thöïc vaät coù hoaït tính lysozyme caét lieân keát β- 1,4 giöõa acid N-acetylmuramic vaø caùc goác N-acetylglucosamine trong peptidoglycan. Ví duï nhö chitinase phaân laäp töø ñu ñuû, Rubus hispidus vaø Parthenocissus quinquefolia. • Chitinase ñoäng vaät Töø moät soá ñoäng vaät nguyeân sinh vaø töø caùc moâ, tuyeán khaùc nhau trong heä tieâu hoùa cuûa nhieàu loaøi ñoäng vaät khoâng xöông: ruoät khoang, giun troøn, thaân meàm, chaân ñoát (ví duï trong dòch ruoät cuûa oác seân Helix aspersa), ta coù theå thu nhaän ñöôïc enzyme chitinase. Ñoái vôùi ñoäng vaät coù xöông soáng, enzyme chitinase ñöôïc tieát ra töø tuyeán tuïy vaø dòch daï daøy cuûa caùc loaøi caù, löôõng cö, boø saùt aên saâu boï, trong dung dòch daï daøy cuûa nhöõng loaøi chim, thuù aên saâu boï. Ngoaøi ra, enzyme chitinase coøn ñöôïc thu nhaän töø dòch bieåu bì cuûa giun troøn trong suoát quaù trình phaùt trieån vaø dòch tieát bieåu bì cuûa caùc loaøi chaân ñoát vaøo thôøi ñieåm thay voû, loät da. Enzyme chitinase giuùp coân truøng tieâu hoùa maøng ngoaøi (cuticle) trong quaù trình bieán thaùi hay loät xaùc. Nguyeãn Quang Nhaân - 12 - Phaàn I: Toång quan taøi lieäu I.1.2.3. Caùc ñaëc tính cô baûn cuûa enzyme chitinase • Troïng löôïng phaân töû Enzyme chitinase tìm thaáy ôû thöïc vaät baäc cao vaø taûo bieån coù troïng löôïng phaân töû khoaûng 25-40kDa [23]. Moät soá chitinase coù troïng löôïng phaân töû khoaûng 40-90kDa. Enzyme chitinase cuûa caùc loaøi thaân meàm, chaân ñoát, ñoäng vaät coù xöông (caù, löôõng cö, thuù) coù troïng löôïng phaân töû cao hôn, khoaûng 120kDa. Troïng löôïng phaân töû cuûa enzyme chitinase thu nhaän töø naám vaø vi khuaån coù khoaûng bieán ñoåi roäng, töø 30 ñeán 120kDa. Moät soá enzyme chitinase coù troïng löôïng phaân töû thaáp coù theå ñöôïc taïo ra töø moät enzyme lôùn hôn baèng caùch phaân caét moät phaàn protein. • Ñieåm ñaúng ñieän - Phoå haáp thu - Haèng soá Michaelis Enzyme chitinase coù giaù trò pI thay ñoåi roäng: 3,0-10,0 ôû thöïc vaät baäc cao vaø taûo, 4,7-9,3 ôû coân truøng, giaùp xaùc, thaân meàm vaø caù, 3,5-8,8 ôû vi sinh vaät. Heä soá haáp thu E280mg/ml=1,24; phoå haáp thu chæ laø böôùc soùng ñôn 280μm. Haèng soá Michaelis: 0,010-0,011 (g/100ml). • Aûnh höôûng cuûa nhieät ñoä Nhìn chung, nhieät ñoä toái öu cho enzyme chitinase ôû vi sinh vaät hoaït ñoäng laø 40oC, ngoaïi tröø Aspergillus niger toång hôïp enzyme chitinase hoaït ñoäng treân cô chaát laø glycol chitin coù nhieät ñoä toái thích laø 50oC. Tuy nhieân, tuøy theo nguoàn goác thu nhaän maø enzyme chitinase coù theå coù nhöõng nhieät ñoä toái öu khaùc nhau. Thí duï, nhieät ñoä toái öu cuûa chitinase töø khoai taây ngoït laø 25oC [12]. ÔÛ caùc enzyme töø cuû töø Diosscorea opposita THUNB nhieät ñoä toái öu laø 45-70oC [5]. Caùc enzyme chitinase thöïc vaät thuoäc nhoùm III vaø caùc chitinase töø Bacillus licheniformis phaân laäp trong suoái nöôùc noùng cho thaáy coù khaû naêng chòu ñöïng nhieät ñoä cao ñeán 80oC. Maët khaùc, chitinase töø coân truøng (taèm…) khoâng oån ñònh ôû Nguyeãn Quang Nhaân - 13 - Phaàn I: Toång quan taøi lieäu nhieät ñoä 40oC vì coân truøng phaùt trieån ôû nhieät ñoä 25oC. Do ñoù, nhieät ñoä toái öu cuûa enzyme chitinase coân truøng khoâng cao. • Aûnh höôûng cuûa pH Giaù trò toái öu cuûa enzyme chitinase töø 4-9 ñoái vôùi caùc chitinase ôû thöïc vaät baäc cao vaø taûo, enzyme chitinase ôû ñoäng vaät coù vuù laø 4,8-7,5 vaø ôû vi sinh vaät laø 3,5-8,0. Theo caùc nhaø khoa hoïc, pH toái thích cuûa enzyme chitinase coù theå coù söï phuï thuoäc vaøo cô chaát ñöôïc söû duïng. Ña soá caùc enzyme chitinase ñaõ ñöôïc nghieân cöùu coù pH toái thích khoaûng 5,0 khi cô chaát laø chitin, enzyme chitinase cuûa Streptomyces grieus coù pH toái thích khoaûng 6,3, giaù trò naøy ôû khoai taây ngoït Ipomoea batatas laø 5,0 [12]. ÔÛ caùc enzyme töø cuû töø Diosscorea opposita THUNB pH toái öu laø 3,5-4,0 [5]. Tuøy muïc ñích phaân tích, nhöõng cô chaát hoøa tan nhö glycol chitin vaø N-acetyl-chitooligosaccharide ñöôïc söû duïng thay theá cho chitin. pH toái öu cuûa enzyme chitinase khi cô chaát laø glycol chitin thuoäc khoaûng pH kieàm yeáu. Hoaït tính enzyme chitinase seõ nhanh choùng bò öùc cheá ôû pH<4,5, ngoaïi tröø chitinase trong daï daøy cuûa ñoäng vaät coù xöông soáng vaãn hoaït ñoäng ôû pH 3,0. • Chaát taêng hoaït – chaát öùc cheá - Allosamidin Allosamidin laø moät pseudotrisaccharide goàm 2 ñôn vò N-acetylallosamin gaén vôùi nhau nhôø lieân keát β-1,4 vaø moät nhoùm allosamizoline. Nhoùm allosamizoline töông töï nhö chaát trung gian phaûn öùng oxocarbonium, caáu taïo bao goàm 1 cyclopentane vaø moät voøng aminooxazoline. Veà caáu taïo, allose chæ khaùc glucose ôû C3 trong ñoù nhoùm hydroxyl naèm thaúng trong allose vaø naèm ngang trong glucose. Allosamidin laø chaát öùc cheá chitinase ñaàu tieân ñöôïc phaân laäp töø khuaån ty cuûa Streptomyces sp. No.1713. Allosamidin vaø nhöõng daãn xuaát cuûa noù öùc cheá Nguyeãn Quang Nhaân - 14 - Phaàn I: Toång quan taøi lieäu enzyme chitinase ñöôïc toång hôïp töø taèm, toâm he vaø moät soá vi sinh vaät (Piromyces communis, Streptomyces sp vaø Streptomyces olivaceoviridis). Ngoaøi ra, allosamidin cuõng ñöôïc phaùt hieän coù khaû naêng gaén keát vôùi caùc enzyme chitinase thöïc vaät nhö hevamine vaø öùc cheá caùc enzyme chitinase thöïc vaät (ña soá thuoäc hoï Glycohydrolase 18). Ñieån hình noù öùc cheá chitinase H ôû caây cuû caûi vôùi ID 50 (lieàu löôïng 50% chaát öùc cheá laø 44,7μM). Noùi chung, allosamidin öùc cheá maïnh chitinase hoï 18 vaø khoâng öùc cheá protein loøng traéng tröùng gaø hay lysozyme ngöôøi. Veà cô cheá öùc cheá, allosamidine öùc cheá chitinase theo cô cheá caïnh tranh nhoùm allosamizoline gaén vaøo taâm cuûa trung taâm hoaït ñoäng chitinase, giaû laøm chaát trung gian phaûn öùng oxocarbonium naèm giöõa C1 cuûa N-acetyl-D-glucosamin vaø oxy carbonyl cuûa nhoùm N-acetyl ôû C2 trong quaù trình thuûy giaûi. Trong ñoù ñieän tích döông ôû C1 ñöôïc oån ñònh baèng oxy carbonyl cuûa nhoùm N-acetyl ôû C2. Allosamidin khaù ñaét vaø khoù toång hôïp. Maëc duø caùc oligomer carbohydrate vaø nhöõng daãn xuaát cuûa chuùng coù theå duøng ñeå thieát keá chaát öùc cheá glycoside hydrolase, chuùng thöôøng khoù toång hôïp vaø quaù lôùn ñeå ñi qua maøng teá baøo. - Caùc ion kim loaïi Caùc ion kim loaïi Hg2+, Ag+ laø nhöõng chaát öùc cheá. Ñoái vôùi ion Cu+, coù 2 daïng enzyme chitinase: moät bò öùc cheá vaø moät ñöôïc taêng cöôøng nhôø Cu2+ ñöôïc tìm thaáy ôû moät soá loaøi caù vaø vi sinh vaät nhö Pseudomonas aeruginosa. - Caùc chaát khaùc Dipeptide CI-4 [cyclo-(L-Arg-D-Pro)] laø moät saûn phaåm töï nhieân ñöôïc toång hôïp töø vi khuaån nöôùc maën Pseudomonas IZ208. CI-4 öùc cheá vieäc phaân taùch teá baøo Saccharomyce cerevisiae vaø ngaên caûn söï taïo khuaån ty cuûa naám beänh Candida albicans ôû ngöôøi. Veà cô cheá, CI-4 öùc cheá chitinase hoï 18 vì chuùng coù caáu truùc gioáng chaát trung gian phaûn öùng. Caùc chaát öùc cheá chitinase hoï 18 coù aûnh Nguyeãn Quang Nhaân - 15 - Phaàn I: Toång quan taøi lieäu höôûng ñeán chu trình soáng cuûa nhieàu loaïi naám vaø ngaên caûn söï truyeàn kí sinh truøng soát reùt (Plasmodium falciparum) töø vaät chuû ñeán coân truøng. 2 peptide öùc cheá glycoside hydrolase khaùc laø argifin vaø argadin coù theå öùc cheá chitinase ôû noàng ñoä nano hay micro mole. Caùc peptide naøy gaén tröïc tieáp leân caùc goác ôû taâm hoaït ñoäng cuûa enzyme vaø chieám caùc vò trí -1, +1 vaø +2. maëc duø nhöõng chaát öùc cheá naøy laø peptide nhöng chuùng coù nhieàu nhaùnh beân baát thöôøng nhö acetyl hay voøng thôm. Ngöôïc laïi, huyeát thanh albumin coù vai troø laøm taêng hoaït ñoäng cuûa enzyme chitinase nhöng söï aûnh höôûng naøy chæ roõ raøng sau 2-3 giôø ñaàu cuûa phaûn öùng. • Söï oån ñònh Enzyme chitinase thoâ hoaëc tinh saïch oån ñònh trong traïng thaùi ñoâng laïnh khoaûng 2 naêm. Söï oån ñònh cuûa enzyme chitinase seõ cao hôn khi coù maët cuûa cô chaát laø chitin. Chuùng bò khöû hoaït tính nhanh choùng ôû 37oC trong tröôøng hôïp khoâng coù maët chitin. Chu kyø baùn huûy ôû 37oC laø 40 ngaøy vaø ôû 5oC laø 230 ngaøy. Enzyme chitinase baát hoaït bôûi oxygen, haèng soá baát hoaït ôû 20oC laø k=0,145/h. I.1.2.4. Caùc loaïi cô chaát cuûa enzyme chitinase • Chitin Cô chaát chuû yeáu cuûa enzyme chitinase laø chitin. ÔÛ lôùp voû coân truøng vaø giaùp xaùc, chitin ñöôïc gaén keát vôùi protein. Trong moät vaøi tröôøng hôïp, lôùp bieåu bì naøy ñöôïc laøm cöùng bôûi caùc lieân keát cheùo vôùi polysaccharide khaùc (cellulose, mannan, glucan…). Ngoaøi ra, chitin cuõng coù caáu truùc lieân heä vôùi murein, caáu truùc polymer hieän dieän ôû vaùch teá baøo vi khuaån. Nguyeãn Quang Nhaân - 16 - Phaàn I: Toång quan taøi lieäu • Caùc daãn xuaát cuûa chitin Enzyme chitinase coù theå taùc ñoäng leân moät soá daãn xuaát cuûa chitin nhö glycol-chitin, carboxymethylchitin, chitosan, chitinsulfate, 4-methylumbellferyl- tri N-acetylchitotrioside (MUC-phaùt huyønh quang). Enzyme chitinase khoâng hoaït ñoäng treân caùc cô chaát: chitin nitrat, cellulose, hyaluronic acid, alginic acid hoaëc mucin. I.1.2.5. Cô cheá taùc ñoäng cuûa caùc loaïi enzyme chitinase Endochitinase phaân caét ngaãu nhieân trong noäi maïch cuûa chitin vaø chitooligomer, saûn phaåm taïo thaønh laø moät hoãn hôïp caùc polymer coù troïng löôïng phaân töû khaùc nhau, nhöng chieám ña soá laø caùc diacetylchitobiose (GlcNAc)2 do hoaït tính endochitinase khoâng theå phaân caét theâm ñöôïc nöõa. Haàu heát chitinase thuoäc loaïi naøy. Chitin 1,4-chitobiosidase phaân caét chitin vaø chitooligomer ôû möùc truøng hôïp lôùn hôn hay baèng 3 [(GlcNAc)n vôùi n≥3] töø ñaàu khoâng khöû vaø chæ phoùng thích diacetylchitobiose (GlcNAc)2. β-N-acetylhexosaminidase phaân caét caùc chitooligomer hay chitin moät caùch lieân tuïc töø ñaàu khoâng khöû vaø chæ phoùng thích caùc ñôn phaân N-acetylglucosamin. Ngoaøi ra, ñeå khaûo saùt kieåu phaân caét, ngöôøi ta söû duïng N-acetyl- chitooligosaccharide laøm cô chaát. Caùc oligosaccharide thöôøng ñöôïc thuûy phaân beân trong treân moät vaøi vò trí xaùc ñònh hoaëc moät caùch ngaãu nhieân. Moät soá enzyme chitinase coù khaû naêng thuûy phaân trisaccharide, moät soá khaùc thì khoâng. Cuõng coù 2 daïng chitinase thuûy phaân pentasaccharide: moät phaân caét beân trong taïo disaccharide vaø trisaccharide, moät phaân caét beân ngoaøi taïo caùc monosaccharide vaø tetrasaccharide. Toùm laïi, chitinase thöïc chaát laø enzyme caét ngaãu nhieân. Nguyeãn Quang Nhaân - 17 - Phaàn I: Toång quan taøi lieäu I.1.2.6. ÖÙng duïng cuûa chitinase • Trong noâng nghieäp Enzyme chitinase öùc cheá naám, coân truøng vaø chaân ñoát bao goàm nhieàu loaïi saâu beänh gaây haïi. Naám chöùa chitin bò öùc cheá bôûi enzyme chitinase bao goàm Fusarium, Gliocladium, Rhizotonia, Trichoderma, Ustilago, Erysiphe, Botrytis, Sclerotium vaø Alternaria. Coân truøng chöùa chitin bò kìm haõm bôûi chitinase goàm Lepidoptera: Trichoplusia (saâu caûi), Pieris rapae (aáu truøng caây caûi), saâu treân raâu baép, böôùm ñeâm, aáu truøng voû troøn hoàng, saâu thuoác laù … Lôùp Coleoptera bao goàm boï caùnh cöùng khoai taây Colorado, boï voøi voi voû troøn, boï caùnh cöùng ñaäu Mexico vaø aáu truøng soáng ôû reã baép. Homoptera bao goàm reäp caây boâng caûi, reäp caây khoai taây, reäp ñoû California. Thysanoptera bao goàm boï tró ôû cuû haønh, Orthoptera bao goàm chaâu chaáu, Hemiptera bao goàm boï xít ôû luùa. Ngöôøi ta coù theå söû duïng chitinase nhö moät taùc nhaân ñieàu chænh sinh hoïc an toaøn vaø deã phaân huûy thay cho thuoác tröø saâu hoùa hoïc [14]. ÔÛ ñaây vieäc öùc cheá baèng enzyme chitinase tinh saïch ñöôïc thöïc hieän baèng caùch cho enzyme tieáp xuùc vôùi naám hay coân truøng. Enzyme chitinase tinh khieát coù theå ñöôïc söû duïng nhö moät dung dòch vaø coù noàng ñoä xaùc ñònh (50-100ppm) vaø ñöôïc öùng duïng trong thuoác xòt [14] hay moät dòch ñaëc chitinase tinh khieát cuøng hieän dieän vôùi chaát mang gaén vôùi noù (methyl cellulose, gum Arabic) ñöôïc duøng nhö laø moät loaïi thuoác boät. • Trong y döôïc - Toång hôïp chitooligosaccharide Hieän nay hoaït tính sinh hoïc cuûa caùc chitooligosaccharide ngaøy caøng ñöôïc nghieân cöùu saâu. Trong y hoïc, ngöôøi ta söû duïng caùc oligomer chitohexaose vaø chitoheptaose laøm taùc nhaân khaùng ung thö. Enzyme chitinase cuûa Vibrio alginolyticus phaân caét huyeàn phuø chitin thaønh chitopentaose vaø chitotriose. Nguyeãn Quang Nhaân - 18 - Phaàn I: Toång quan taøi lieäu Enzyme N,N’-diacetylchitobiase ñöôïc söû duïng roäng raõi laøm nguyeân lieäu khôûi ñaàu cho sinh toång hôïp caùc hôïp chaát coù hoaït tính sinh hoïc. Chitinase thu nhaän töø S. griseus coù khaû naêng thuûy phaân chitin huyeàn phuø thaønh chitobiose tieáp tuïc ñöôïc caûi bieán hoùa hoïc thaønh moät daãn xuaát disaccharide môùi 2-acetamido-2-deoxy-D- allopyranose. Ñaây laø chaát trung gian ñeå toång hôïp neân chaát öùc cheá enzyme. Ngöôïc laïi, coù theå söû duïng chitinase cuûa Bacillus ñeå toång hôïp chitobiose nhôø söï keát noái N-acetyl-D-glucosamine vôùi daãn xuaát ñöôøng oxazolin. - Chaån ñoaùn caùc beänh truyeàn nhieãm do vi naám baèng enzyme chitinase Caùc loaøi vi naám chính lieân quan ñeán caùc beänh cô hoäi ôû caùc beänh nhaân AIDS laø Candidosis, Cryptococcosis (naám men), Histoplasmosis, Coccidioimycosis (naám löôõng hình). Nhöõng nguoàn khaùng nguyeân cuûa naám (manna cuûa Candidosis, glucuronoxylomanan trong naám men) coù theå hoaït ñoäng nhö laø moät nhaân toá ngaên chaën teá baøo T trong söï phaùt trieån cuûa AIDS. Moät löôïng nhoû khaùng nguyeân cuûa naám coù theå kích thích phaûn öùng mieãn dòch nhöng söï thöøa thaûi khaùng nguyeân coù theå gaây ra taùc ñoäng ngöôïc leân tính mieãn dòch cuûa teá baøo. Do ñoù, ñieàu caàn thieát laø vieäc ñieàu trò phaûi ñöôïc tieán haønh moät caùch nhanh choùng vaø coù hieäu quaû tröôùc khi nhöõng tình traïng treân coù ñieàu kieän lan roäng. Nhieàu phöông phaùp chaån ñoaùn beänh naám ñöôïc ñeà xuaát nhö ELISA, söï ngöng keát khaùng theå, maãu doø phaân töû … ñeå phaùt hieän ñaëc hieäu caùc naám gaây beänh trong caùc dòch cô theå nhöng giaù thaønh quaù cao. Nhöõng baát lôïi chung trong haàu heát caùc phöông phaùp hieän söû duïng laø khoù aùp duïng ñoái vôùi caùc maãu dòch cô theå bôûi vì khoù coá ñònh ñöôïc caùc maãu naøy. Caùc phöông phaùp nhuoäm nhö GMS (Grocott methenamine AgNO3 staining), calcofluor/cellufour, India Ink, lectin label, rylus BSU ñöôïc duøng nhuoäm coá ñònh caùc tieâu baûn naám nhöng khoâng coù tính ñaëc hieäu cao vaø caàn söû duïng caùc thieát bò ñaét tieàn. Nguyeãn Quang Nhaân - 19 - Phaàn I: Toång quan taøi lieäu Chitin hieän dieän nhieàu trong vaùch haàu heát caùc naám gaây beänh, ít nhaát laø moät giai ñoaïn trong chu trình soáng cuûa naám hay ôû naám men thì hieän dieän trong nhöõng veát choài. Do ñoù caàn moät phöông phaùp nhuoäm chitin ñaëc bieät cho naám, taïo cô sôû xaây döïng moät phöông phaùp chaån ñoaùn nhanh choùng, hieäu quaû caùc loaøi naám gaây beänh. Hieän nay, caùc nhaø khoa hoïc ñaõ ñeà xuaát moät phöông phaùp chaån ñoaùn môùi caùc beänh truyeàn nhieãm do naám baèng caùch söû duïng enzyme chitinase ñaõ ñöôïc phaân laäp taïo doøng töø Vibrio parahemolyticus (ñaët teân laø chitinase VP1), noù keát hôïp chaët cheõ vôùi chitin vaø coù theå söû duïng nhö moät maãu doø trong vieäc chaån ñoaùn vôùi ñoä nhaïy cao ñeå nhaän dieän moät caùch ñaëc hieäu caùc vaùch teá baøo naám hay nhöõng veát choài naám men trong nhöõng laùt caét maãu moâ beänh. - Cheá phaåm thuoác môùi: enzyme chitinase vaø caùc döôïc chaát khaùng naám Hieän nay, caùc nhaø khoa hoïc ñeà nghò söû duïng chitinase vôùi caùc taùc nhaân khaùng naám coù theå chaáp nhaän khaùc nhaèm boå trôï cho hoaït ñoäng noäi sinh cuûa chitinase. Caùc taùc nhaân ñoù bao goàm: - Amphotericin B vaø nhöõng phöùc chaát coù caáu truùc töông töï nystatin vaø pyramycin - 5-fluorocytosin vaø caùc daãn xuaát azol nhö fluconazol, ketoconazol, itraconazol, miconazol… - Allylamine-thiocarbamate nhö tolnaftat, terbinafin… - Griseofulvin, acid undecylenic, bezoic… Enzyme chitinase coù theå phaùt huy hieäu quaû cuûa caùc taùc nhaân khaùng naám ôû lieàu löôïng khoâng gaây taùc duïng phuï cho beänh nhaân. Ngoaøi ra, vieäc keát hôïp giöõa enzyme chitinase vaø laminarinase ñöôïc ghi nhaän laø höõu hieäu hôn trong vieäc taán coâng vaøo vaùch teá baøo naám (so vôùi chæ duøng enzyme chitinase). Nguyeãn Quang Nhaân - 20 - Phaàn I: Toång quan taøi lieäu Ngöôøi ta ñaõ ñeà nghò phöông thöùc ñieàu trò beänh naám bao goàm chitinase vaø moät dòch pha loaõng hay theå mang vaø cuõng coù theå bao goàm caùc taùc nhaân khaùng naám khaùc. Lieàu löôïng ñöôïc chæ ñònh ñuû ñeå boå trôï cho hoaït ñoäng cuûa chitinase noäi sinh. Nhöõng phöông thuoác höõu hieäu töø 1μg/kg-100mg/kg troïng löôïng cô theå vaø khoaûng 0,1-20mg chitinase/kg theå troïng cô theå. Caùc thaønh phaàn cuûa phöông phaùp ñieàu trò coù theå ñöôïc ñieàu khieån baèng caùc höôùng khaùc nhau tuøy thuoäc vaøo beänh truyeàn nhieãm naøo ñöôïc ñieàu trò, bao goàm: ñi qua döôùi da, trong cô, trong tónh maïch, trong phoåi, ñònh khu, baèng ñöôøng mieäng hay ñieàu khieån thuoác ñieàu trò trong aâm ñaïo… Caùc nhaø khoa hoïc ñaõ thöû nghieäm hoaït tính khaùng naám cuûa enzyme chitinase taùi toå hôïp trong cô theå chuoät vaø thoû bò nhieãm caùc loaïi naám khaùc nhau thuoäc nhoùm Aspergillus, Candida … Hieäu quaû cuûa söï ñieàu trò vôí taùc nhaân khaùng naám ñöôïc öôùc löôïng treân 3 ñieåm: - Giaûm tæ leä cheát. - Giaûm soá löôïng teá baøo naám ñöôïc nuoâi caáy töø caùc cô quan - Giaûm möùc ñoä löu thoâng khaùng nguyeân naám I.2. CAÂY CAO SU HEVEA BRASILIENSIS VAØ CHITINASE TRONG MUÛ CAO SU I.2.1. Caây cao su Trong thieân nhieân coù raát nhieàu caây cao su thuoäc nhieàu loaïi thöïc vaät khaùc nhau (chöa keå coù loaïi caây cho ra chaát töông töï cao su nhö caây gutta-percha vaø balata). Noùi chung caây cao su treân theá giôùi thuoäc vaøo 5 hoï thöïc vaät sau: Euphorbiaceae, Moraceae, Apocynaceae, Asclepiadaceae vaø Composeae. Chuùng thích hôïp vôùi khí haäu vuøng nhieät ñôùi, ñaëc bieät laø mieàn Baéc Nam Myõ, Nguyeãn Quang Nhaân - 21 - Phaàn I: Toång quan taøi lieäu Brasil, Trung Myõ, chaâu Phi töø Maroc ñeán Madagasca, Sri Lanka, mieàn Nam Aán, Vieät Nam, Laøo vaø Campuchia, Thaùi Lan, Malaysia vaø Indonesia [4]. Trong soá nhöõng loaïi caây cao su, ñaëc bieät loaïi ñöôïc öa chuoäng nhaát laø caây Hevea brasiliensis, cung caáp khoaûng 95-97% cao su thieân nhieân treân theá giôùi. Nhöõng ñoàn ñieàn troàng vôùi gioáng caûi thieän, gioáng seedling (caây troàng hoät, cho latex ít hôn caây thaùp vaø saûn xuaát muoän hôn, nhöng khi caïo muû voû caây deã laønh veát thöông hôn) vaø nhaát laø gioáng tuyeån nhaân gheùp naêng suaát thoâng thöôøng ñaït ñöôïc töø 1 taán ñeán 1,5 taán cao su/hecta/naêm. Vieäc söû duïng caùc caây gioáng môùi coù theå taêng naêng suaát vöôït leân treân 2 taán cao su khoâ/hecta/naêm. Vieän khaûo cöùu cao su Vieät Nam cho bieát ñaõ trao ñoåi kyõ thuaät veà gioáng caây vôùi nhieàu vieän khaûo cöùu cao su quoác teá vaø ñaõ nhaäp ñöôïc nhöõng gioáng maø naêng suaát ôû vöôøn thí nghieäm cuûa vieän ñaït ñeán 3 taán/hecta/naêm [4]. Moät caây cao su Hevea brasiliensis coù kích thöôùc lôùn ñöôïc xöû lyù thích hôïp coù theå chòu ñöôïc treân 20 laàn caïo muû trong muøa thu hoaïch, cung caáp tôùi 10 lít latex öùng vôùi 3kg cao su khoâ. Qua naêng suaát keå treân, ta thaáy loaïi cao su naøy boû xa naêng suaát ñaït ñöôïc vôùi nhöõng caây cao su khaùc (Ficus, Manihot, Puntomia, Guayule hay Kok-saghyz) naêng suaát cuûa chuùng chæ vaøo khoaûng vaøi kg cao su/hecta/naêm [4]. Ngoaøi ra, caùc caây cao su loaïi khaùc coù caùc ñaëc tính khoâng toát khi so saùnh vôùi Hevea brasiliensis nhö khoù troàng, keùm chòu ñöïng caïo muû, chaát löôïng cao su khoâng toát, khoâng tinh khieát, khoù chieát ruùt cao su... Nguyeãn Quang Nhaân - 22 - Phaàn I: Toång quan taøi lieäu • Hevea brasiliensis Phaân loaïi: Giôùi : Plantae Ngaønh : Magnoliophyta Lôùp : Magnoliopsida Boä : Malpighiales Hoï : Euphorbiaceae Hoï phuï : Crotonoideae Toäc : Micrandreae Toäc phuï : Heveinae Gioáng : Hevea Loaøi : Hevea brasiliensis [28] Hình 1.3 : Caây cao su Hevea brasiliensis Nguyeãn Quang Nhaân - 23 - Phaàn I: Toång quan taøi lieäu Hevea brasiliensis laø moät loaïi caây cao su (Paraù rubber tree, rubber tree) to lôùn, cao töø 20 meùt ñeán 40 meùt, coù nguoàn goác töø löu vöïc soâng Amazone vaø chi löu (Nam Myõ) ôû traïng thaùi ngaãu sinh [4]. Cuõng nhö caùc loaïi khaùc thuoäc gioáng Hevea, caây Hevea brasiliensis coù hoa ñôn tính, maøu vaøng, khoâng caùnh, hình chuoâng nhoû, taäp trung thaønh chuøm. Laù daøi töø 20cm ñeán 30cm, thuoäc laù keùp 3. Ñaây laø caây ñôn tính ñoàng chu, coù traùi laø hoät nang coù 3 ngaên, moãi ngaên chöùa 1 hoät. Luùc chín, traùi noå phoùng thích hoät. Hoät troøn, daøi töø 2cm ñeán 3,5cm coù maøu naâu saäm. Nhaân hoät giaøu chaát beùo (ta trích goïi laø daàu hoät cao su), do ñoù hoät maát khaû naêng naåy choài nhanh [4]. Hoa ñöïc goàm 10 bao phaán xeáp thaønh 2 haøng doïc ñeàu ñaën (treân cuoáng nhò), noù cuõng coù 36 nhieãm saéc theå nhö caùc loaïi Hevea khaùc. Moãi naêm caây thay laù moät laàn, thay hoaøn toaøn hoaëc thay daàn (ta goïi laø muøa thay laù). Caây beùn reã cuøng moät löôït vôùi reã truï vaø reã ngang. Reã truï coù theå ñi saâu xuoáng 5m ñeán 6m, chæ ngöng phaùt trieån khi gaëp lôùp ñaát cöùng hay lôùp nöôùc thöôøng tröïc. Voû caây nhaün vaø ñeàu, goã meàm vaø gioøn [4]. Heä thoáng nhöïa muû (latex) caây naøy thuoäc loaïi maïch nhaùnh, do caùc teá baøo daøi taïo thaønh, naèm noái vaø vaùch chung töï tieâu, ñöôøng kính maïch latex khoaûng 20μm ñeán 50μm. Nhöõng maïch naøy naèm trong nhu moâ cuûa caây, khoâng thaáy coù trong moäc. Trong voû thaân vaø nhaùnh, chuùng hôïp thaønh kieåu hình truï hoaëc kieåu “voû khoaùc” keát hôïp. Caùc “voû khoaùc” cuûa maïch latex töông giao vôùi nhau vaø ñaëc bieät coù nhieàu trong keát caáu libe gaàn moâ môùi sinh hoaëc noùi chung ôû caùc libe - moäc. Voû caây daøy 8mm ñeán 18mm ñoái vôùi nhöõng caây tröôûng thaønh, gaàn ngoaïi bieân coù nhöõng teá baøo raén laïi nhieàu hay ít tuøy theo tuoåi. Sau khi caïo muû, voû caây taùi sinh laïi deã daøng [4]. Nguyeãn Quang Nhaân - 24 - Phaàn I: Toång quan taøi lieäu Taïi chaâu Myõ, Hevea brasiliensis sinh tröôûng töï nhieân thaønh röøng, caây thöôøng bò beänh chaùy laù traàm troïng do loaïi Dothidella ulei gaây ra. Beänh naøy haàu nhö khoâng gaëp taïi caùc nöôùc Vieãn Ñoâng [4]. Veà phöông dieän sinh thaùi, caây chæ thích hôïp vôùi khí haäu vuøng xích ñôùi hay nhieät ñôùi. Caây ñoøi hoûi nhieät ñoä trung bình laø 25oC, löôïng möa toái thieåu laø 1.500mm moãi naêm vaø coù theå chòu haïn ñöôïc nhieàu thaùng trong muøa khoâ. Caây meàm vaø gioøn do ñoù coù theå bò gaõy khi gaëp gioù maïnh. Maëc duø caây cao su ít ñoøi hoûi chaát löôïng ñaát nhöng thích hôïp nhaát vôùi ñaát ñai phì nhieâu, saâu, deã thoaùt nöôùc, hôi chua (pH töø 4 ñeán 4,5) vaø giaøu muøn [4]. Duø cho caùc loaïi nhöïa deûo, cao su toång hôïp ñang phaùt trieån maïnh khaép theá giôùi, cao su thieân nhieân vaãn laø moät loaïi nguyeân lieäu quan troïng. Hevea brasiliensis cung caáp haàu heát toång löôïng cao su thieân nhieân treân thò tröôøng theá giôùi [4]. Haàu heát gioáng cao su troàng hieän nay ôû nöôùc ta vaø caùc nöôùc khaùc chính laø caây cao su Hevea brasiliensis naøy. I.2.2. Muû cao su • Nguoàn goác latex vaø heä thoáng maïch latex Muû caây cao su (latex) ñöôïc taïo ra töø nhöõng teá baøo soáng chuyeân bieät (laticifer, teá baøo caây chöùa nhöïa muû [17]) coù trong nhu moâ caây, ñaëc bieät laø trong vuøng taïo laäp libe voû. Caùc teá baøo taïo latex ñöôïc moät lôùp nguyeân sinh chaát moûng bao phuû, bao caû moät khoâng baøo lôùn laø nôi maø nguyeân sinh chaát tieát ra latex [4]. Nhö vaäy latex ñöôïc taïo ra taïi choã töø nöôùc vaø muoái khoaùng do reã haáp thuï, khoâng phaûi töø quang toång hôïp cuûa laù. Coù 5 loaïi teá baøo chöùa nhöïa muû ñöôïc phaân loaïi döïa theo caùc giai ñoaïn phaùt trieån hoaëc caùc vò trí khaùc nhau trong caây: thöù nhaát laø caùc maïch coù trong cuoáng laù ôû thôøi kyø ñaàu tröôùc söï dung hôïp cuûa caùc teá baøo laticifer. Chuùng gioáng vôùi teá baøo chaát cuûa caùc teá baøo nhu moâ soáng ngoaïi tröø söï Nguyeãn Quang Nhaân - 25 - Phaàn I: Toång quan taøi lieäu coù maët cuûa caùc nhieàu phaàn töû cao su. Loaïi thöù hai laø maïch töø libe thöù caáp ôû thaân xanh, coù chöùa caùc haït cao su. Ñöôøng kính maïch töø 100-5000Å. ÔÛ ñaây, caùc haït lutoid noåi baät vaø chöùa caùc vi sôïi. Loaïi maïch naøy coù chöùa ty theå vaø ñoâi khi coù caùc phöùc hôïp Frey-Wyssling, theå golgi vaø luïc laïp. Loaïi maïch thöù ba coù trong libe thöù caáp ôû thaân caây tröôûng thaønh, ôû phaàn beân trong cuûa voû, caùch phaàn moäc 1mm. Chöùa caùc haït cao su kích thöôùc nhoû 50Å-2μm. Caùc haït lutoid toàn taïi nhöng khoâng chöùa caùc vi sôïi. Ngoaøi ra coøn coù ty theå. Loaïi thöù tö laø maïch latex khi ñaõ chòu söï caïo muû vaø chöùa raát nhieàu haït cao su. Lutoid vaø caùc phöùc hôïp Frey- Wyssling coù maët thöôøng xuyeân, ñoâi khi coù caùc ty theå, maïng löôùi noäi chaát, raát hieám khi coù nhaân teá baøo. Loaïi cuoái cuøng coù ôû caùc maïch laõo hoùa ôû voû ngoaøi. ÔÛ loaïi naøy caùc haït cao su kích thöôùc khaù lôùn vaø khoâng quan saùt roõ caùc baøo quan [31]. Toaøn boä latex trong caây taïo thaønh moät maïng löôùi hay heä thoáng [17]. Tuøy theo loaïi caây cao su, heä thoáng latex ñöôïc taïo töø teá baøo coâ laäp hoaëc töø maïch. Trong tröôøng hôïp thöù nhaát nhö loaïi Parthenium argentatum (guayule), teá baøo latex naèm raûi raùc khoâng töông thoâng vôùi nhau trong cô quan caây. Trong tröôøng hôïp sau, maïch latex ñöôïc taïo bôûi caùc teá baøo coù kích thöôùc lôùn trong nhu moâ nhöng khoâng töông giao vôùi nhau hoaëc töø maïng teá baøo daøi naèm noái tieáp coù vaùch chung töï tieâu. Loaïi maïch latex thöù nhaát thöôøng coù ña soá ôû loaïi caây cao su. Loaïi maïch thöù hai laø loaïi maïch nhaùnh hoaëc maïch tieáp hôïp chæ coù ôû gioáng Hevea vaø Manihot (hoï Euphorbiaceae) vaø ôû caùc caây thuoäc hoï Composeùes coù hoa hình caùnh laù (Pissenlit, scorsoneøre) [4]. Ngoaøi thaân caây, caùc cô quan khaùc cuûa caây cuõng ñeàu coù chöùa latex. ÔÛ Hevea brasiliensis, heä thoáng latex laø heä thoáng kín coù daïng maïch phaân nhaùnh vaø töông giao vôùi nhau [4], gioáng nhö heä tuaàn hoaøn trong caây. Khi muoán thu hoaïch cao su, caàn phaûi thöïc hieän raïch caïo moät ñöôøng treân voû thaân caây nhaèm Nguyeãn Quang Nhaân - 26 - Phaàn I: Toång quan taøi lieäu caét ñöùt caùc maïch latex, laøm toån thöông caùc teá baøo chöùa nhöïa muû ñeå cho latex cao su tieát, chaûy ra ngoaøi. Phöông phaùp thu hoaïch naøy, ñöôïc goïi laø phöông phaùp “caïo muû”, ñöôïc aùp duïng vaøo caây cao su Hevea brasiliensis vì latex cuûa caây naøy coù ñoä nhôùt thaáp vaø do caây cao su naøy laïi coù khaû naêng taùi taïo latex nhanh choùng vaø coù theå khai thaùc ñöôïc suoát caû naêm [4]. Phöông phaùp “caïo muû” naøy hieän ñang ñöôïc aùp duïng taïi nöôùc ta. • Chöùc naêng latex Latex laø moät chaát loûng mang tính ñoäng hoïc tham döï vaøo hoaït tính sinh lyù thöïc vaät. Heä thoáng latex ñöôïc xem laø moät nôi maø caây duøng ñeå tröõ nöôùc vaø nhieàu chaát khaùc, seõ ñem ra duøng vaøo nhöõng luùc hoaït ñoäng sinh lyù maïnh nhaát [4]. • Caáu taïo vaø ñaëc tính latex Latex laø moät chaát loûng phöùc taïp coù baûn chaát laø teá baøo chaát cuûa teá baøo caây chöùa nhöïa muû. Thaønh phaàn, haøm löôïng caùc thaønh phaàn vaø tính chaát latex khaùc bieät nhau tuøy theo loaïi caây, tuøy theo caùc ñieàu kieän veà khí haäu, hoaït tính sinh lyù vaø hieän traïng soáng cuûa caây cao su. Caùc phaân tích latex töø nhieàu loaïi caây cao su khaùc nhau chæ ñöa ra nhöõng con soá phoûng chöøng veà thaønh phaàn latex: cao su chieám töø 30-40% [17, 31], nöôùc töø 52-70%, protein chieám 2-3%, acid beùo vaø daãn xuaát 1-2%, glucid vaø heterosid khoaûng 1%, khoaùng chaát töø 0,3-0,7%. Nhieàu daïng cao su treân thò tröôøng ñeàu coù chöùa nhieàu hoaëc ít löôïng chaát caáu taïo latex phuï hoaëc coù chöùa nhöõng chaát bieán ñoåi cuûa chuùng vaø coù theå chuùng coù tính lieân heä maät thieát vôùi tính chaát cuûa cao su thoâ hay latex ñöôïc baûo quaûn. Trò soá pH cuûa latex coù aûnh höôûng quan troïng tôùi ñoä oån ñònh latex. Latex töôi vöøa chaûy khoûi caây cao su coù pH baèng hoaëc hôi thaáp hôn 7. Neáu ñeå trong vaøi giôø pH seõ haï xuoáng gaàn 6 do hoaït tính cuûa vi khuaån vaø latex seõ bò ñoâng laïi [4]. Trong latex ngöôøi ta tìm thaáy raát nhieàu loaïi vi khuaån (ít nhaát 27 loaïi). Chuùng xaâm nhaäp vaøo latex trong luùc caïo muû hay sau khi caïo muû. Vi khuaån tham gia Nguyeãn Quang Nhaân - 27 - Phaàn I: Toång quan taøi lieäu ñoâng ñaëc latex coù theå do caùc enzyme chuùng tieát ra hoaëc chuùng tröïc tieáp laøm haï thaáp pH latex. Ôû Vieät Nam, ngöôøi ta thöôøng duøng ammoniac ñeå choáng ñoâng ñaëc muû do noù coù taùc duïng nhö chaát saùt truøng vaø chaát kieàm giuùp naâng cao pH laøm cho latex khoâng bò aûnh höôûng bôûi ñieåm ñaúng ñieän cuûa noù [4]. Ngoaøi ra, noù coøn laøm hoøa tan phaàn vaøng chöùa lutoid vaø gaây ra söï hydracid hoùa khôûi ñaàu ôû protein vaø lipid. Tröôùc khi taùc duïng vôùi ammoniac, caùc lutoid phoái hôïp vôùi tæ leä lôùn chaát caáu taïo voâ cô neân coù tæ troïng hôi cao hôn tæ troïng cuûa latex. Döôùi taùc duïng cuûa ammoniac, theå naøy bò phaân giaûi, noù töï keát tuûa thaønh moät phöùc hôïp phosphate ammoniac magnesium loâi keùo protein theo vaø caùc phaàn töû giöõ laïi saéc toá vaøng giaøu protein vaø lipid [4]. Hình 1.4: Hình chuïp muû cao su döôùi kính hieån vi ñieän töû. RP:haït cao su, FW:phaàn töû Frey-Wyssling, L:haït lutoid, LVW:thaønh maïch muû Nguyeãn Quang Nhaân - 28 - Phaàn I: Toång quan taøi lieäu Toùm laïi, caáu taïo latex goàm coù 4 phaàn chính: caùc tieåu caàu cao su, caùc theå lutoid, caùc phaàn töû Frey-Wyssling naèm trong moät dòch loûng. Khi ly taâm, muû cao su chia thaønh 2 phaàn ñoaïn, moät ôû treân vaø moät ôû döôùi, giöõa 2 phaân ñoaïn naøy laø moät lôùp dòch loûng. Caùc haït cao su taïo thaønh moät lôùp kem traéng naèm ôû treân cuøng cuûa phaân ñoaïn treân, caùc phaàn töû Frey-Wyssling coù maøu vaøng naèm chuû yeáu ôû phaàn döôùi cuûa phaân ñoaïn treân. Caùc haït lutoid coù maøu vaøng nhaït vaø naèm ôû phaân ñoaïn döôùi cuøng cuûa pheùp ly taâm [13, 31]. - Caùc tieåu caàu cao su Caùc tieåu caàu cao su coù baûn chaát laø polyisoprene, coù kích thöôùc thay ñoåi töø 50Å ñeán 30000Å (3μm) ñöôøng kính, ñoâi khi leân ñeán 5-6μm, trung bình khoaûng 1000Å. ÔÛ caây cao su non, caùc haït cao su thöôøng coù daïng hình caàu, trong khi ôû caây tröôûng thaønh, chuùng thöôøng coù daïng quaû leâ vaø kích thöôùc to hôn. Trong moät soá tröôøng hôïp, hình daïng haït cao su laø ñaëc ñieåm ñaëc tröng cuûa töøng gioáng [31]. Caùc tieåu caàu naøy coù theå töï lieân keát vôùi nhau taïo ra phaàn töû môùi coù kích thöôùc lôùn hôn vaø coù daïng hình khoâng ñeàu nhö hình quaû leâ hay hình quaû taï. Nhöõng tieåu caàu cao su naøy ñöôïc moät lôùp cöïc moûng protein vaø lipid bao phuû beân ngoaøi, daøy khoaûng 100Å, mang ñieän tích aâm [31], ñaûm baûo ñöôïc ñoä oån ñònh cô lyù cuûa latex vaø tính phaân taùn oån ñònh cuûa caùc tieåu caàu cao su. Maïch ñaïi phaân töû cao su ñöôïc caáu taïo töø caùc maéc xích isoprene ñoàng phaân cis lieân keát vôùi nhau ôû vò trí 1,4. Ngoaøi ñoàng phaân cis-1,4, trong cao su coù khoaûng 2% maéc xích lieân keát vôùi nhau ôû vò trí 3,4. Cao su cuûa caây Gutapertra ñöôïc hình thaønh töø polymer cuûa isoprene ñoàng phaân trans-1,4. Maïch isoprene ñöôïc taïo ra qua caùc phaûn öùng khöû vaø ngöng tuï lieân tieáp baét ñaàu töø moät hydrocacbon coù 5 nguyeân töû carbon, chuyeån hoùa chaát cuûa acid β-methylcrotonic. Acid naøy do söï hoùa hôïp cuûa acid acetic vaø acetone. Trong tröôøng hôïp cuûa caây cao su Hevea brasiliensis, haøm löôïng cao su trong latex thay ñoåi töø 50% ñeán 60% trong maïch tuøy theo muøa vaø traïng thaùi sinh lyù Nguyeãn Quang Nhaân - 29 - Phaàn I: Toång quan taøi lieäu cuûa caây. Latex thu qua loái caïo muû coù noàng ñoä thaáp hôn töø 30% ñeán 40%. Nhöõng chaát caáu taïo latex phi cao su cuûa caây Hevea brasiliensis ôû daïng dung dòch hay daïng nhuõ töông chæ chieám 5% trong toång troïng löôïng khoái latex nhöng chuùng laïi coù aûnh höôûng tôùi cô lyù tính vaø hoùa tính cuûa cao su. Ngöôïc laïi, latex cuûa ña soá caây cao su khaùc coù chöùa nhieàu chaát khaùc vôùi tyû leä lôùn, ñaëc bieät laø lipid vaø nhöïa maø ñoâi khi ta caàn phaûi loaïi boû ñeå coù theå duøng ñöôïc (tröôøng hôïp cuûa Parthenium agentatum hay guayule). - Phöùc hôïp Frey-Wyssling Khaûo saùt latex tieát ra töø caây cao su qua kính hieån vi, Frey-Wyssling thaáy roõ coù söï hieän dieän cuûa vaøi tieåu caàu thuoäc veà nhöïa vaø coù maøu vaøng töôi, ngoaøi caùc phaàn töû cao su ra. Caùc tieåu caàu naøy hieän dieän vôùi soá löôïng raát nhoû, chuùng coù daïng hình caàu vaø noùi chung to hôn caùc phaàn töû cao su. Chuùng ñöôïc goïi laø caùc phaàn töû Frey-Wyssling [4]. Ñöôøng kính cuûa moãi haït nhoû naøy khoaûng 3-6μm vaø ñöôïc boïc bôûi moät lôùp maøng ñoâi. Caùc phöùc hôïp naøy coù vai troø raát quan troïng trong caùc hoaït ñoäng trao ñoåi chaát [31]. - Theå lutoid Moät ñieåm ñaëc bieät quan troïng qua caùc coâng cuoäc tìm caùch phaân tích caùc phaàn töû maøu vaøng cuûa Frey-Wyssling laø qua pheùp ly taâm, chöùng minh ñöôïc latex töôi vôùi ñieàu kieän khoâng bò pha loaõng hay taùc duïng vôùi ammoniac coù chöùa caùc phaàn töû ôû traïng thaùi lô löûng khaùc bieät vôùi caùc phaàn töû cao su, hôi naëng hôn nöôùc vaø qua ly taâm (2000voøng/phuùt) thu ñöôïc döôùi daïng khoái gioáng nhö chaát keo maøu vaøng nhieàu hay ít, thöôøng chieám töø 20%-30% theå tích ban ñaàu cuûa latex. Nhöõng phaàn töû naøy ñöôïc goïi laø lutoid. Ñieàu ñaùng chuù yù laø phaàn lutoid chæ phaân ly ñöôïc qua pheùp ly taâm vôùi ñieàu kieän laø latex khoâng bò pha loaõng hay cho ammoniac vaøo. Caùc lutoid ôû traïng thaùi löûng lô töï keát tuï daàn khi latex ñöôïc giöõ trong vaøi giôø vaø döôùi kính hieån vi daïng cuûa chuùng thay ñoåi daàn daàn. Phaân ñoaïn theå lutoid chöùa Nguyeãn Quang Nhaân - 30 - Phaàn I: Toång quan taøi lieäu chuû yeáu laø lutoid, ngoaøi ra coøn coù caùc baøo quan khaùc nhö ti theå, ribosome vaø caùc haït cao su tyû troïng cao. Caùc tieåu caàu cao su cuûa phaàn vaøng coù kích thöôùc nhoû hôn caùc tieåu caàu cao su cuûa phaàn traéng. Nguyeân thuûy lutoid khoâng coù chöùa caùc haït töû cao su, nhöng do xu höôùng keát tuï maïnh neân noù bò keùo theo. Cao su ôû phaàn vaøng chæ chieám khoaûng 3% toång cao su [4]. Veà nguoàn goác, lutoid hieän dieän nhö nhöõng theå nhaát ñònh trong nguyeân sinh chaát, doïc theo maøng teá baøo cuõng nhö trong khoâng baøo, chieám khoaûng 10-20% theå tích muû. Lutoid laø nhöõng baøo quan coù maøng bao boïc, thöôøng coù kích thöôùc lôùn hôn caùc tieåu caàu cao su. Chuùng coù ñöôøng kính töø 2-5μm ñöôïc boïc baèng moät maøng daøy khoaûng 80Å [31], coù pH beân trong thaáp [4, 13], thaønh phaàn caáu taïo raát phöùc taïp vôùi haøm löôïng nöôùc raát cao, khoaûng 75-85% [4]. Ngoaøi ra coøn coù muoái, lectin, caùc chaát tan trong acetone nhö phospholipid, caùc protein khaùng beänh vaø nhieàu enzyme thuûy phaân khaùc nhau, töông ñöông vôùi lysozyme ôû ñoäng vaät [13]. Veà chöùc naêng, theå lutoid ñöôïc xem laø haøng raøo phoøng veä ñaàu tieân cuûa caây choáng laïi naám beänh. Khi caây bò toån thöông, muû cao su chaûy ra, trong ñoù caùc theå lutoid vôõ ra phoùng thích caùc protein khaùng khuaån vaø gaây ñoâng tuï muû baèng söï trung hoøa ñieän tích nhôø töông taùc giöõa giöõa caùc haït cao su tích ñieän aâm vaø caùc protein ñieän tích döông töø lutoid. Veà caáu truùc, lutoid goàm coù 2 loaïi caáu truùc daïng sôïi. Loaïi thöù nhaát goïi laø vi sôïi (microfibril) laø ñaëc tính cuûa maïch muû ôû caùc moâ non. Caùc vi sôïi naøy phaân boá töï do trong phaàn dòch cuûa lutoid, chuùng thöôøng keát hôïp thaønh töøng boù, moãi boù coù ñöôøng kính 450-500Å, moãi vi sôïi daøi nhieàu micromeùt vaø ñöôøng kính 70-80Å. Moãi vi sôïi ñöôïc xoaén chaët lieân tuïc quanh moät truïc roãng. Ñöôøng kính cuûa xoaén khoaûng 125Å, vaø truïc roãng ñöôøng kính khoaûng 30Å. Caùc vi sôïi naøy khoâng coù maët trong moâ hoaëc muû cuûa caây tröôûng thaønh. Ngöôøi ta cho raèng caùc vi sôïi tan raõ khi caùc haït lutoid tröôûng thaønh hoaëc caùc lutoid chöùa vi sôïi bò tan raõ theo tuoåi cuûa Nguyeãn Quang Nhaân - 31 - Phaàn I: Toång quan taøi lieäu moâ vaø bò thay theá bôûi caùc lutoid khoâng coù chöùa vi sôïi. Caùc vi sôïi naøy khoâng cho thaáy vai troø gì trong söï sinh toång hôïp cao su. Loaïi caáu truùc thöù hai cuûa lutoid ñöôïc tìm thaáy ôû caùc caây tröôûng thaønh maëc duø thænh thoaûng chuùng vaãn ñöôïc thaáy ôû moâ non, ñöôïc goïi laø vi xoaén (microhelix) vì chuùng coù hình daïng nhö nhöõng loø xo. Caùc vi xoaén naøy daøi khoaûng 1μm, ñöôøng kính voøng xoaén khoaûng 200Å, chieàu roäng cuûa moãi sôïi khoaûng 50Å, khoaûng caùch giöõa caùc voøng xoaén khoaûng 300Å [31]. Veà thaønh phaàn, caùc protein chính trong theå lutoid bao goàm hevein (M, 5000 – protein chieám phaàn lôùn nhaát trong phaân ñoaïn theå lutoid, coù theå gaén vôùi chitin, giaøu cysteine, coù tính acid vaø tham gia trong söï ñoâng tuï muû), tieàn chaát cuûa noù laø prohevein (M, 20000), ñoaïn ñaàu C cuûa tieàn chaát naøy (M, 14000) vaø caùc enzyme: hevamine (endochitinase) vaø β-1,3-glucanase (EC 3.2.1.39). Caùc protein naøy coù raát ít ôû caùc thaønh phaàn khaùc cuûa caây nhö laù, thaân, reã. ÔÛ caùc moâ naøy, chitinase/lysozyme vaø nhieàu enzyme khaùc taêng leân nhanh choùng khi caây tieáp xuùc vôùi noàng ñoä taêng cao cuûa hormone thöïc vaät ethylene, vi khuaån, virus, naám hay moät soá stress sinh hoïc hay voâ sinh [17]. Vì theá chuùng ñöôïc xeáp vaøo loaïi caùc protein phoøng veä (defense) hay khaùng beänh (pathogenesis-related protein). Nhöõng protein khaùng beänh cuõng ñöôïc tìm thaáy trong caây khoûe maïnh vaø chuùng taùc ñoäng hôïp löïc. Hevamine vaø glucanase laø caùc protein chính trong quaù trình ñoâng tuï muû. Söï ñoâng tuï khaùc nhau ôû caùc doøng cao su khaùc nhau laø do söï sai khaùc trong thaønh phaàn cuûa hai enzyme naøy. Hevamine vaø glucanase cuõng coù theå phaù vôõ thaønh teá baøo naám vaø öùc cheá söï phaùt trieån cuûa naám. Glucanase töø phaân ñoaïn theå lutoid coù theå phaân giaûi moâ seïo vaø ñieàu naøy giaûi thích cho vieäc caùc gioáng cao su coù thaønh phaàn glucanase cao taïo nhieàu muû hôn caùc gioáng ít glucanase. Nghieân cöùu trình töï cuûa hai peptide CNBr cuûa glucanase cho thaáy glucanase ôû Hevea Nguyeãn Quang Nhaân - 32 - Phaàn I: Toång quan taøi lieäu brasiliensis gioáng vôùi glucanase töø caùc thöïc vaät khaùc vaø moät peptide ñaàu C lieân quan trong ñònh höôùng khoâng baøo bò caét bôùt. • ÖÙng duïng cuûa latex Ngöôøi ta nhaän thaáy muû cao su coù theå phaân caét chitin. Muû cao su coù caû 2 hoaït tính endochitinase (hevamine) vaø exochitinase (chitobiosidase). Muû cao su chöùa 6mg/ml protein vaø hoaït tính chitinase laø 18mU/mg. Tæ leä enzyme/chitin toái öu laø 0,22mU/mg vaø noàng ñoä cô chaát toái öu laø 60mg/ml. Khoaûng pH toái öu laø 2-4 vaø nhieät ñoä toái öu laø 45oC. Trong caùc ñieàu kieän toái öu naøy, (GlcNAc)2 vaø GlcNAc ñöôïc taïo ra vôùi tyû leä mole xaáp xæ 2:1. Söï phaân giaûi 300mg chitin vôùi 64mU enzyme muû cao su trong 8 ngaøy döôùi caùc ñieàu kieän toái öu taïo 39mg GlcNAc vaø 108mg (GlcNAc)2. Ñeå thu nhaän hoaøn toaøn GlcNAc töø serum muû cao su, serum caàn phaûi coù caû 2 hoaït tính chitinase (EC 3.2.1.14) vaø β-N- acetylglucosaminidase (EC 3.2.1.52). Khi troän enzyme töø muû vôùi pectinase töø Aspergillus niger (An) coù hoaït tính β-N-acetylhexosaminidase cao vôùi tæ leä pectinase An/muû cao su = 1,5 thì taïo ra chuû yeáu monomer GlcNAc vôùi tæ leä 50% [15]. Toùm laïi, serum cao su ñaày tieàm naêng trôû thaønh nguoàn enzyme phaân caét chitin toát, giaù reû khi chuùng bò xem laø löôïng saûn phaåm thaûi khoång loà töø caùc nhaø maùy cao su. I.2.3. Hevamine • Phaân loaïi Coù 2 loaïi hevamine laø hevamine A chieám ña soá vaø hevamine B [20]. Caû 2 loaïi coù cuøng troïng löôïng phaân töû. Hevamine B khaùc hevamine A do söï thay theá leucine baèng arginine ôû vò trí 270 naèm ôû ñaàu C cuûa phaân töû [13, 20, 21]. Caùc doøng caây cao su khaùc nhau coù thaønh phaàn caùc enzyme naøy khaùc nhau. Nguyeãn Quang Nhaân - 33 - Phaàn I: Toång quan taøi lieäu • Caáu taïo Hevamine gồm 273 gốc acid amin, coù khoái löôïng phaân töû 29kDa, pHop=4,0 [21]. Tinh theå hevamine thu ñöôïc khi duøng NaCl laøm taùc nhaân tuûa coù daïng que ñôn, vôùi caùc chieàu 0,2mm x 0,2mm x 0,5mm. Tinh theå hevamine thuoäc loaïi orthorhombic space group P212121 vôùi caùc chieàu laø a=82,3Å, b=58,1Å, c=52,5Å. Tinh theå laøm nhieãu xaï tôùi ñoä phaân giaûi ít nhaát laø 2,0Å. Theå tích tinh theå treân moãi ñôn vò khoái löôïng laø Vm=2,2Å3/Da. Caùc tinh theå protein coù giaù trò naøy ñaëc tröng naèm trong khoaûng 1,6-3,6. Hevamine B coù tinh theå cuøng hình daïng, nhoùm khoâng gian vaø kích thöôùc caùc chieàu cuûa tinh theå vôùi hevamine A [20]. Hevamine ñöôïc xeáp vaøo hoï glycohydrolase 18 [7] hoaëc lôùp III chitinase vaø khoâng coù söï töông ñoàng veà trình töï hay caáu truùc vôùi hoï 19 glycohydrolase hay lôùp chitinase I, II vaø IV. Trình töï cuûa hevamine coù 60% gioáng vôùi chitinase ngoaïi baøo töø döa chuoät vaø 95% gioáng vôùi trình töï ñaàu N cuûa chitinase/lysozyme töø Parthenocissus quinquefolia (cuõng coù pH toái öu thaáp gioáng hevamine) [13]. Söï khaùc nhau veà vò trí trong teá baøo, tính tích ñieän vaø trình töï giöõa hevamine vaø Hình 1.5: Caáu truùc cuûa hevamine [25] Nguyeãn Quang Nhaân - 34 - Phaàn I: Toång quan taøi lieäu chitinase döa chuoät töông töï söï khaùc nhau giöõa chitinase lôùp I vaø lôùp II ôû thuoác laù vaø caùc loaøi thöïc vaät khaùc [13]. Trình töï hevamine A [29]: 10 20 30 40 50 60 MAKRTQAILL LLLAISLIMS SSHVDGGGIA IYWGQNGNEG TLTQTCSTRK YSYVNIAFLN 70 80 90 100 110 120 KFGNGQTPQI NLAGHCNPAA GGCTIVSNGI RSCQIQGIKV MLSLGGGIGS YTLASQADAK 130 140 150 160 170 180 NVADYLWNNF LGGKSSSRPL GDAVLDGIDF DIEHGSTLYW DDLARYLSAY SKQGKKVYLT 190 200 210 220 230 240 AAPQCPFPDR YLGTALNTGL FDYVWVQFYN NPPCQYSSGN INNIINSWNR WTTSINAGKI 250 260 270 280 290 300 FLGLPAAPEA AGSGYVPPDV LISRILPEIK KSPKYGGVML WSKFYDDKNG YSSSILDSVL 310 FLHSEECMTV L Hình 1.6: Caáu truùc baäc 2 cuûa hevamine A [29] Hevamine coù caáu truùc (α-β)8 barrel (TIM barrel) gioáng vôùi caùc chitinase hoï 18 [23], trong ñoù 2 vuøng baûo toàn goàm caùc goác töø 73-80 vaø 119-127 töông öùng vôùi caùc goác taïo neân nhaùnh β thöù 3 vaø 4 cuûa caáu truùc barrel. Caáu truùc barrel naøy quan troïng trong vieäc oån ñònh caáu truùc cuoän. Nghieân cöùu gaén tinh theå chitotriose cho thaáy vò trí raõnh gaén cô chaát (cleft) ñöôïc taïo thaønh töø voøng ôû ñaàu C cuûa sôïi β barrel vaø ñöôïc baûo toàn cao trong hoï chitinase 18 ôû thöïc vaät vaø naám. Raõnh naøy cuûa hevamine coù 6 vò trí töø A ñeán F (ñoâi khi ñaët teân laø töø -4 ñeán +2) [7]. Goác acid glutamic xuùc taùc Glu127 naèm treân trình töï baûo toàn thöù 2 ôû gaàn vò trí D vaø E (-1 vaø +1) vaø laø 1 vò trí tuyeät vôøi thích hôïp cho proton tôùi goác oxy cuûa ñöôøng [9]. Nhö vaäy, Glu127 ñoùng vai troø laø chaát cho proton. Caùc nghieân cöùu ngaâm Nguyeãn Quang Nhaân - 35 - Phaàn I: Toång quan taøi lieäu (soaking) vôùi chitotetraose vaø vôùi allosamidin cuõng nhö caáu truùc ôû pH 2.0 cuûa hevamine cho thaáy cô cheá xuùc taùc coù theå bao goàm caùc goác Glu127, Asp125 vaø Tyr183 [9]. Chitotriose chæ gaén ôû vò trí töø A ñeán C, trong khi söï phaân caét dieãn ra ôû giöõa vò trí D vaø E. 3 vò trí ñaàu coù aùi löïc cao nhaát ñoái vôùi cô chaát, do ñoù caùc ñoaïn chitin ngaén khoâng theå gaén ôû vò trí giöõa D vaø E neân khoâng theå bò phaân caét. Allosamidin laø chaát öùc cheá chitinase neân cuõng öùc cheá hevamine. Allosamidin gaén vaøo caùc vò trí B, C vaø D. 2 goác N-acetylallosamine gaén vaøo vò trí B vaø C töông töï nhö N-acetylglucosamine. Goác allosamizoline gaén ôû vò trí D nôi chaát trung gian phaûn öùng ñöôïc taïo thaønh. Hình 1.7: Caáu truùc TIM barrel ôû hevamine [25] • Ñaëc tính phaân caét Hevamine ñoùng vai troø chính trong khaû naêng phaân caét chitin cuûa muû cao su vaø tham gia ñoùng maïch nhöïa muû, laøm ngöøng doøng chaûy muû. Hevamine caét ngaãu nhieân caùc lieân keát β-1,4 giöõa caùc N-acetyl-D- glucosamin trong chitin vaø chitodextrin (hoaït tính endo-chitinase). Tuy nhieân, hevamine khoâng caét caùc ñoaïn chitin ngaén hôn 5 ñôn vò (chitopentaose, penta- nag) vaø caùc chitopentaose naøy khi bò phaân caét cho ra chuû yeáu laø chitotetraose vaø N-acetylglucosamin [7]. Söï phaân caét cuûa polysaccharide veà nguyeân taéc coù theå cho ra 2 saûn phaåm khaùc nhau trong ñoù nguyeân töû oxy anomer ôû vò trí C1 coù lieân keát thaúng ñöùng hay naèm ngang (taïo ra caáu hình α hay β ôû C1). Nhö caùc goác N- acetylglucosamin trong chitin, moät saûn phaåm coù nhoùm hydroxyl naèm theo truïc thaúng ôû C1 caàn cô cheá xuùc taùc ñaûo caáu hình, trong khi nhoùm hydroxyl naèm ngang Nguyeãn Quang Nhaân - 36 - Phaàn I: Toång quan taøi lieäu caàn cô cheá giöõ nguyeân caáu hình. Cô cheá phaân caét glycoside maø khoâng thay ñoåi caáu hình bao goàm 2 carboxylate. Moät carboxylate cho proton tôùi nguyeân töû oxy cuûa lieân keát β-(1,4)-glycoside vaø söï caét ñöùt cuûa aglycon ñöôïc xuùc taùc bôûi goác thöù 2. Goác thöù 2 naøy taïo ra chaát ñöôøng trung gian ñoàng hoùa trò hoaëc cho söï oån ñònh caëp ion tôùi chaát trung gian ion oxocarbonium. Sau khi aglycon bò khueách taùn ñi, moät phaân töû nöôùc xen vaøo vò trí hoaït ñoäng vaø thöïc hieän söï thay theá thöù 2 ôû C1 carbohydrate. Hevamine töông töï caùc chitinase vi khuaån hoï glycohydrolase 18 cuõng xuùc taùc giöõ nguyeân caáu hình maø khoâng caàn söï coù maët cuûa caùc carboxylate oån ñònh ôû vò trí hoaït ñoäng. Ngoaøi ra, caùc enzyme töø Hevea brasiliensis coøn coù theå laøm trong hoaøn toaøn theå vaån (suspension) cuûa thaønh teá baøo vi khuaån. Nhö vaäy, hevamine coøn caét lieân keát β-1,4 giöõa caùc goác N-acetylmuramic acid vaø N-acetylglucosamin trong peptidoglycan ôû thaønh teá baøo vi khuaån, töông töï nhö hoaït tính cuûa moät lysozyme. Coù 3 loaïi chitinase/lysozyme ñöôïc phaân laäp töø Hevea brasiliensis: loaïi coù hoaït tính chitinase nhöng khoâng coù hoaït tính lysozyme, loaïi coù hoaït tính chitinase vôùi hoaït tính lysozyme thaáp vaø loaïi coù hoaït tính chitinase cao, hoaït tính lysozyme raát cao. Khoâng tìm thaáy protein chæ coù hoaït tính lysozyme trong muû cao su Hevea brasiliensis [17]. Söï giaûm maïnh hoaït tính chitinase vaø lysozyme ôû caùc enzyme Hevea brasiliensis khi ñöôïc taùch rieâng cho thaáy caùc enzyme naøy hoaït ñoäng phoái hôïp treân chitin vaø thaønh teá baøo vi khuaån [17]. Chöùc naêng chitinase/ lysozyme trong thöïc vaät giuùp chuùng coù ñöôïc heä thoáng phoøng veä toång quaùt, khoâng chuyeân bieät choáng laïi söï taán coâng cuûa vi khuaån vaø coân truøng, naám. Tuy nhieân, vieäc coi nhö hevamine coù hoaït tính lysozyme cuõng khoâng hoaøn toaøn chính xaùc, bôûi leõ hevamine caét lieân keát giöõa C-1 cuûa N-acetyl-β-D-glucosamin (NAG) vaø C-4 cuûa N-acetyl-β-D-muramic acid (NAM), trong luùc lysozyme caét lieân keát giöõa C-4 cuûa N-acetyl-β-D-glucosamin vaø C-1 cuûa N-acetyl-β-D-muramic acid [8]. Nguyeãn Quang Nhaân