Luận văn Nghiên cứu tính đa dạng di truyền của một số giống ngô (zea mays l.)

phân biệt các giống hay các loài khác nhau. Raina và cs (2001) đã sử dụng chỉ thị RAPD – SSR để phân tích sự đa dạng hệ gen và xác định mối quan hệ họ hàng giữa các giống lạc trồng và lạc dại [45]. Kỹ thuật RAPD được sử dụng rộng rãi trong những năm gần đây để phân tích di truyền hệ thống sinh học. Nó là phương pháp hiệu quả trong việc Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 22 xác định kiểu gen, phân tích quần thể và nguồn gốc loài, nghiên cứu di truyền và lập bản đồ di truyền. 1.2.3. Tình hình nghiên cứu sự đa dạng di truyền của ngô bằng kỹ thuật RAPD Vasconcelos M.J.V.D và cs (2008) sử dụng kỹ thuật RAPD với 47 mồi ngẫu nhiên đã nhân được 221 băng DNA trong đó có 130 băng biểu hiện đa hình [50]. Souza S.G.H.D. và cs (2008) xác định quan hệ di truyền của 16 dòng ngô lai với sử dụng 22 mồi RAPD khuếch đại được 265 băng DNA và 16 cặp mồi SSR khuếch đại được 75 băng DNA, 16 dòng ngô được chia thành 3 nhóm [47]. Okumus A. (2007), 17 giống ngô của Turkey được sử dụng nghiên cứu với 14 mồi RAPD thu được 125 băng đa hình (chiếm 89%), hệ số sai khác giữa các giống ngô từ 0,08-0,2 [42]. Abdel - Mawgood A.L. và cs (2006) đã sử dụng một số các chỉ thị phân tử RAPD, SSR, 18S rRNA gen …để kiểm tra các dòng ngô, trong đó có ba giống ngô tự nhiên (L1, L2, L3) và hai giống lai F1 bắt nguồn từ họ H1 và H2. Hai trong 5 mồi RAPD sử dụng nghiên cứu biểu hiện tính đa hình, một trong những mồi cho đa hình đã xác định được con lai H2 từ hai dòng thuần. Đối với 18S rRNA thì không phát hiện được các băng đa hình [22]. Asif M. và cs (2006) đã tiến hành phân tích DNA cho 6 giống ngô lai bằng cách sử dụng các mồi ngẫu nhiên để khuếch đại đa hình DNA bằng kỹ thuật RAPD. Tác giả đã sử dụng 40 mồi ngẫu nhiên, trong đó có OPR – 03, OPR – 11 và OPR- 06 đã cho đa hình. Kết quả đã kiểm tra được 3 trong rất nhiều giống ngô lai và cũng phân biệt được nguồn gốc của một số giống ngô lai. Tác giả đã kết luận RAPD là một công cụ hữu hiệu để phát hiện sự tinh khiết của giống lai nhằm nâng cao hiệu quả trong trồng trọt và chăn nuôi [25]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 23 Valdemar P. C. và cs (2004) nghiên cứu khoảng cách di truyền của 81 giống ngô trong đó có 79 thuộc vùng bắc Châu Âu và 2 giống cải tiến. Sử dụng kỹ thuật RAPD với 32 mồi được khuếch đại, cao nhất là 255 chỉ thị mà có 184 băng DNA (chiếm khoảng 72,2%) là đa hình. Dựa trên những chỉ thị RAPD, việc lập một phả hệ sử dụng phương pháp UPGMA. Tỷ lệ kiểu di truyền tương tự nhau từ 0,78 đến 0,91. Nhóm số liệu phân tử tập hợp thành 2 nhóm chính, mà màu sắc hạt có tương quan với nhau [40]. Naureen Z. và cs (2005) nghiên cứu đa hình của 30 chủng vi khuẩn ở rễ ngô nhằm chọn tạo giống ngô cho năng suất cao và tách dòng vi khuẩn rhizo rễ ngô. Các tác giả đã sử dụng 30 mồi oligonucleotide, kết quả sự đa dạng di truyền đạt mức đáng kể với khoảng cách di truyền 2 – 16% [41]. Amorime. P. và cs (2003) đã sử dụng các chỉ thị phân tử RAPD và SSR để chọn lọc 13 giống ngô đường. Trong đó, sử dụng 50 mồi RAPD tạo được 104 băng (chiếm 72,2%), còn sự phân tích SSR đánh giá 7 locus với 42 alen đạt giá trị PEC từ 0,5 đến 0,89. Ước tính sự tương đồng di truyền đối với mồi RAPD là 0,79, còn chỉ thị SSR là 0,49 [24]. Osipova E.S. và cs (2001) nghiên cứu sự khác nhau di truyền học giữa dòng ngô A188 và dòng soma bắt nguồn từ A188, được đánh giá qua sự phân tích của kỹ thuật RAPD. Sử dụng 15 mồi trong số 17 mồi decanucleotie, từng mồi cho sự khuếch đại đạt từ 2 – 17 phân đoạn dài 200 – 2000 bp. Mô hình RAPD không khác giữa những các cá thể của dòng A188, biểu hiện tính đồng nhất về di truyền học cao. Sự khác nhau giữa dòng ban đầu và dòng soma cao từ 64 – 72%. Căn cứ vào sự phân ly di truyền dòng soma chia làm 2 nhóm. Sự phân biệt những nhóm dòng soma này phù hợp với nguồn gốc của chúng [43]. Bauer I (2005) nghiên cứu đặc tính trưởng thành sớm của ngô lai thu được bằng cách đánh dấu protein và RAPD. Khi sử dụng mồi RAPD cho thấy tỉ lệ đa hình cao hơn đánh dấu protein [26]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 24 Ở Việt Nam, Bùi Mạnh Cường và cs (2002) đã tiến hành nghiên cứu sự đa hình di truyền của một số giống ngô và xác định được một số cặp lai ưu tú có khả năng cho ưu thế lai cao [5]. Ngô Hữu Tình và cs (2002), nghiên cứu khoảng cách di truyền của các cặp lai và nhóm ưu thế lai ở một giống ngô, kết quả tuyển được 7/28 cặp lai cho năng suất cao[19]. Ngô Việt Anh (2005) đã sử dụng kỹ thuật RAPD với 5 mồi ngẫu nhiên đã nhận được 150 phân đoạn DNA được nhân bản ngẫu nhiên từ hệ gen của 7 giống ngô nếp địa phương. Cả 5 mồi sử dụng trong nghiên cứu đều biểu hiện tính đa dạng và có 16 phân đoạn DNA đa hình chiếm 51,6% [1]. 1.3. NHẬN XÉT CHUNG Trong những năm gần đây phương hướng sản xuất ngô ở nước ta là cần tăng cường diện tích trồng ngô lai năng xuất cao trên cơ sở ứng dụng các thành tựu khoa học kỹ thuật nhằm tăng năng suất để đạt và vượt mức trung bình của thế giới. Tuy nhiên, trong thực tế sản xuất ngô Việt Nam vẫn phải nhập nội rất nhiều các giống ngô mà vẫn có những mùa bị thất thu do giống không đảm bảo chất lượng. Vì vậy, việc nghiên cứu hóa sinh hạt ngô nhằm tìm ra các giống ngô có năng suất cao, chất lượng tốt và ổn định là góp phần chọn được các giống có năng suất và chất lượng ổn định. Những công trình đánh giá sự di truyền của cây ngô ở nước ta còn ít. Sự đa dạng di truyền sẽ chỉ ra được mức độ sai khác giữa các giống ngô nghiên cứu ở mức độ phân tử đồng thời giải thích được tính đa dạng nguồn gen của cây ngô. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 25 Chƣơng 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 2.1.1. Vật liệu thực vật Sử dụng 14 giống ngô làm vật liệu nghiên cứu. Nguồn gốc, đặc điểm nơi thu mẫu được trình bày ở bảng 2.1. Bảng 2.1. Danh sách 14 giống ngô nghiên cứu STT Giống Nguồn gốc Đặc điểm nơi thu mẫu 1 TL Trà Lĩnh – Cao Bằng Địa hình cao 2 VN Lâu Thượng – Võ Nhai Địa hình cao 3 CB Phục Hoà – Cao Bằng Địa hình cao 4 SLO Bản Lầm – Sơn La Địa hình cao 5 T26 Sông Bằng – Cao Bằng Địa hình cao 6 SL Bản Đen – Sơn La Địa hình cao 7 SLV Bản Cóc – Sơn La Địa hình cao 8 TQ Hàm Yên – Tuyên Quang Địa hình cao 9 ÔL Phú Lương – Thái Nguyên Địa hình cao 10 ĐP Phú Bình – Thái Nguyên Trung du 11 LC Than Uyên – Lai Châu Địa hình cao 12 SLT Bản Cóc – Sơn La Địa hình cao 13 YB Văn Chấn – Yên Bái Địa hình cao 14 T4 Quyết Thắng – Thái Nguyên Trung du 2.1.2. Hoá chất Sử dụng các loại hoá chất tinh khiết nhập từ các nước Mỹ, Trung Quốc, Đức, Anh, Thụy Điển như: Tris, EDTA, CTAB, taq – polymerase, agarose, buffer PCR, MgCl2, dNTPs, NaCl, sorbitol, NaH2PO4.2H2O… và các hoá chất thông dụng khác. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 26 2.1.3. Thiết bị Nồi hấp khử trùng (Sturdy - Tai Wan); Lò vi sóng (Sharp); Máy soi gen tia UV (Weatea - USA); Nguồn điện di DNA (USA); Máy li tâm (Hettich – Germary); Máy lắc nhuộm DNA (UK); Cân điện tử; Máy khuấy trộn Vortex; Máy đo pH (Mettler Toledo); Bể ổn nhiệt; Tủ sấy (Memmert); Tủ cấy vô trùng; Tủ lạnh sâu -20oC, -80oC (Sanyo, Nhật Bản); Máy PCR (Applied Biosystems- Mỹ); Máy quang phổ (Thermo Electron). Và một số thiết bị khác như: ống eppendorf, đầu côn, pipet man, ống PCR… 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1. Phƣơng pháp hóa sinh 2.2.1.1 Xác định hàm lƣợng lipid Hàm lượng lipid được xác định trên hệ thống bán tự động Soxhlet của hãng Gerhardt, gồm có: bình cầu, trụ chiết, ống sinh hàn. Dựa vào tính chất hoà tan của dung môi hữu cơ để chiết lipid, dung môi hữu cơ được sử dụng là petroleum ether. 2.2.1.2 Xác định hàm lƣợng protein Hàm lượng protein được xác định theo phương pháp Kjeldahl. Nguyên lý: mẫu được vô cơ hóa bằng H2SO4 98% kết hợp với chất xúc tác để chuyển nitơ hữu cơ thành (NH4)2SO4 rồi dùng NaOH để đẩy NH3 ra khỏi muối amoni. NH3 sau khi được giải phóng ra sẽ được cuốn đi bằng dòng hơi nước nóng. Sau khi được làm nguội sẽ hấp thụ vào dung dịch H3BO3 ở trong bình hứng tạo ra muối borat amon có màu xanh trong. Để xác định được lượng amoniac giải phóng ra trong quá trình chưng cất ta đem đi chuẩn độ bằng dung dịch H2SO4 0,1N đến khi dung dịch chuyển sang màu tím nhạt. Từ lượng H2SO4 0,1N tiêu tốn trong quá trình chuẩn độ sẽ tính được lượng protein có trong mẫu. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 27 2.2.1.3. Xác định hàm lƣợng đƣờng tan - Xác định hàm lượng đường theo phương pháp Bertrand được mô tả trong tài liệu của Phạm Thị Trân Châu và cs [4]. - Nguyên tắc: Đường trực tiếp khử oxi của hydroxit đồng ở môi trường kiềm mạnh làm cho nó bị kết tủa dưới dạng đồng hóa trị 1 (Cu2O) có màu đỏ gạch. Số lượng đồng hóa trị 1 tương ứng với số lượng đường khử theo phương trình phản ứng: RCHO + 2Cu(OH)2 → RCOOH + Cu2O + 2H2O Cu +1 + Fe 3+ + H2SO4 → 2CuSO4 + H2O + 2FeSO4 FeSO4 có tính khử oxi tác dụng với KMnO4 do đó dùng KMnO4 để chuẩn độ. Từ số ml KMnO4 0,1N dùng để chuẩn độ sẽ xác định được hàm lượng đường khử. 2.2.2. Phƣơng pháp sinh học phân tử 2.2.2.1. Phƣơng pháp tách DNA từ lá non của ngô - Quy trình tách chiết và làm sạch DNA tổng số từ lá ngô theo phương pháp của Gawel và cs [31]. Quy trình tách chiết DNA tổng số đƣợc thực hiện theo các bƣớc sau: - Lấy khoảng 200g lá ngô non đã để lạnh ở -850C ở nghiền nhanh trong cối chày sứ có chứa nitơ lỏng. - Bổ sung 0,8ml đệm rửa, li tâm 15 phút, 12000 vòng/ phút, loại bỏ dịch nổi. Bước này làm 2 lần. - Thêm 700µl đệm tách, mix nhẹ, ủ 650C trong 2h, sau đó lấy ra để ở nhiệt độ phòng 5 phút. - Thêm 600µl cloroform:isoamyl alcohol (24:1 ), trộn đều 20 phút - Li tâm 15 phút, 12000 vòng/phút. Hút cẩn thận 500µl dịch trong sang ống eppendorf 1,5 ml mới ( bỏ tủa). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 28 - Thêm 600µl isopropanol, lắc nhẹ, đặt lên đá (để tủ lạnh qua đêm), chờ có dịch tủa trắng. - Li tâm 5 phút, 13000 vòng/ phút, bỏ dịch, úp xuống giấy cho khô. - Bổ sung 300µl cồn 70%, búng nhẹ. Li tâm 5 phút, 13000 vòng/ phút, loại bỏ cồn (thực hiện 2 lần). - Làm khô DNA. - Hòa tan DNA trong 50 µl nước khử ion. - Kiểm tra chất lượng DNA thu được thông qua điện di trên gel agarose 0,8%. - Xác định hàm lượng và độ tinh sạch của DNA trên máy quang phổ và pha loãng về nồng độ sử dụng 10ng/µl. 2.2.2.2. Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng và độ tinh sạch DNA tổng số * Phương pháp quang phổ hấp thụ Kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch của DNA trên máy quang phổ ở bước sóng  = 260 nm và  = 280 nm. Hàm lượng và độ sạch của DNA trong dung dịch tách chiết được tính theo công thức: Hàm lượng DNA (ng/l) = OD260×50× hệ số pha loãng. Độ sạch DNA = OD260/OD280. Trong đó: OD260: chỉ số đo được ở bước sóng 260 nm OD280: chỉ số đo được ở bước sóng 280 nm Nếu độ sạch DNA = 1,8 - 2,0 thì mẫu được coi là sạch. * Phương pháp điện di DNA tổng số trên gel agarose - Pha agarose 0,8% trong TAE 1X, đun nóng cho tan agarose trong lò vi sóng, để nguội khoảng 60oC; Đổ bản gel và đợi cho khô (khoảng 1 giờ) sau đó tháo lược. - Lấy 5 µl mẫu DNA tách được trộn với 2 µl dye 6X, tra mẫu vào giếng điện di. - Chạy điện di với điện thế 80V trong 30 phút. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 29 - Lấy bản gel nhuộm ethidium bromide 0,5 µl/ml trong 10 phút, rửa lại bằng nước. - Soi bản gel trên máy soi gen tia UV, chụp ảnh. 2.2.2.3. Phản ứng RAPD Phản ứng RAPD được tiến hành với các mồi ngẫu nhiên theo phương pháp của Foolad và cs (1990) [29]. - Sử dụng 10 mồi ngẫu nhiên được tổng hợp tại hãng Invitrogen, mỗi mồi dài 10 nucleotide, thông tin về trình tự các mồi sử dụng được trình bày trong bảng 2.2 Phản ứng RAPD được thực hiện trong 20 µl dung dịch với thành phần trong bảng 2.3. Tiến hành nhân bản DNA trong máy PCR với chu trình nhiệt của phản ứng RAPD là 1 chu kì 94oC trong 3 phút; 45 chu kì với nhiệt độ (92 o C trong 30 giây, 36 o C trong 45 giây, 72 o C trong 1 phút); 1 chu kì 72 o C trong 10 phút; lưu giữ ở 4oC. Bảng 2.2. Trình tự các nucleotide của 10 mồi RAPD sử dụng trong nghiên cứu STT Tên mồi Trình tự nucleotide 1 M1 5’ AACCGACGGG 3’ 2 M2 5’ GGGGGTCGTT 3’ 3 M3 5’ TACCACCCCG 3’ 4 M4 5’ GGCGGACTGT 3’ 5 M5 5’ TCGGCGATAG 3’ 6 M6 5’ GTGTCTCAGG 3’ 7 M8 5’ GGAAGTCGCC 3’ 8 M9 5’ CCTCCAGTGT 3’ 9 RA159 5’ GTCCACACGG 3’ 10 UBC23 5’ CCCGCCTTCC 3’ Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 30 Bảng 2.3. Thành phần phản ứng RAPD STT Thành phần Thể tích (l) 1 H2O khử ion 11,7 2 Buffer PCR 2,0 3 MgCl2 (25 mM) 2,0 4 dNTP (2,5 mM) 1,2 5 Primer (10 mM) 1,6 6 DNA (10 ng/µl ) 1,0 7 Taq-polymerase 0,5 Tổng 20,0 Điện di sản phẩm RAPD Pha agarose 2% trong TAE 1X. Chạy điện di với hiệu điện thế 100V trong 90 phút. Nhuộm bản gel bằng ethidium bromide 0,5 µg/ml trong 15 phút, rửa sạch bằng nước, soi gel trên đèn UV và chụp ảnh. Phân tích số liệu RAPD Dựa trên sự xuất hiện hay không xuất hiện của các phân đoạn DNA khi điện di sản phẩm RAPD của các giống ngô nếp với các đoạn mồi ngẫu nhiên để làm cơ sở cho sự phân tích số liệu theo quy ước: Số 1: xuất hiện phân đoạn DNA, số 0: không xuất hiện các phân đoạn DNA. Các số liệu này được xử lý trên máy vi tính theo chương trình NTSYSpc version 2.0 để xác định quan hệ di truyền của các giống ngô ở mức độ phân tử. 2.2.2.4. Phƣơng pháp xử lý kết quả và tính toán số liệu Mỗi thí nghiệm được nhắc lại 3 lần. Sử dụng toán thống kê để xác định trị số thống kê như trung bình mẫu ( x ), phương sai (2), độ lệch chuẩn (), và sai số trung bình mẫu ( x S ), với n ≤ 30, α = 0,05. Các số liệu được xử lý trên máy vi tính bằng chương trình Excel [21]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 31 Chƣơng 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, HÓA SINH HẠT CỦA CÁC GIỐNG NGÔ NGHIÊN CỨU 3.1.1. Đặc điểm hình thái của 14 giống ngô nghiên cứu Hình thái và khối lượng hạt là những đặc tính quan trọng trong chọn giống ngô vì nó liên quan đến chất lượng và năng suất. Kết quả nghiên cứu hình thái và khối lượng 100 hạt được trình bày ở bảng 3.1 và hình 3.1 Bảng 3.1. Đặc điểm hình thái và khối lượng hạt của 14 giống ngô nếp địa phương STT Giống Hình thái hạt Khối lƣợng 100 hạt (g) Màu vỏ hạt 1 TL Hạt nhỏ, góc cạnh 16,09 ± 0,001 Trắng ngà 2 VN Hạt tròn, mẩy 16,72 ± 0,002 Trắng vàng, tím 3 CB Hạt tròn, mẩy 20,45 ± 0,003 Trắng ngà 4 SLO Hạt tròn, mẩy 21,21 ± 0,002 Trắng ngà 5 T26 Hạt dẹt, mẩy 28,88 ± 0,003 Vàng 6 SL Hạt dẹt, mẩy 25,50 ± 0,003 Trắng ngà 7 SLV Hạt tròn, mẩy 26,81 ± 0,004 Trắng đục 8 TQ Hạt tròn, mẩy 23,42 ± 0,001 Trắng đục 9 ÔL Hạt nhỏ, dẹt, dài 17,19 ± 0,002 Trắng ngà 10 ĐP Hạt nhỏ, tròn, mẩy 19,63 ± 0,001 Trắng đục, tím 11 LC Hạt tròn, mẩy 24,50 ± 0,001 Trắng đục 12 SLT Hạt nhỏ, dẹt, dài 23,35 ± 0,001 Trắng đục, tím 13 YB Hạt tròn, mẩy 27,42 ± 0,004 Trắng ngà 14 T4 Hạt nhỏ, dẹt 25,46 ± 0,003 Trắng ngà, vàng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 32 Tính trạng màu sắc hạt do kiểu gen quy định, ít chịu ảnh hưởng của môi trường. Vỏ bao quanh hạt ngô đó là một màng mỏng, nhẵn có màu trắng, vàng hay tím tuỳ từng giống. Màu sắc vỏ ngô cũng là một chỉ tiêu quan trọng để phân loại các thứ trong loài phụ. Kết quả ở bảng 3.1 cho thấy, khối lượng 100 hạt của 14 giống ngô dao động trong khoảng 16,09 g đến 28,88 g, cao nhất là giống T26, thấp nhất là giống TL. Khối lượng của hạt phụ thuộc vào kiểu gen từng giống. Thứ tự các giống ngô từ cao xuống thấp xếp theo khối lượng 100 hạt là: T26 > YB > SLV > SL > T4> LC > TQ > SLT > SLO > CB > ĐP > ÔL > VN > TL. Tính trạng khối lượng hạt phụ thuộc vào kiểu gen từng giống. Tuy nhiên, khối lượng 100 hạt có thể bị thay đổi nếu chịu tác động xấu của môi trường ở những giai đoạn nhất định. Hình 3.1. Hình dạng hạt của 14 giống ngô Ký hiệu: 1.TL; 2.VN; 3.CB; 4.SLO; 5.T26; 6. SL; 7.SLV; 8.TQ; 9.ÔL; 10.ĐP; 11.LC; 12.SLT; 13.YB; 14.T4. 3.1.2. Hàm lƣợng protein, lipid, đƣờng của 14 giống ngô nghiên cứu Để đánh giá chất lượng hạt của 14 giống ngô nghiên cứu, chúng tôi xác định hàm lượng protein, lipid, đường trong hạt của các giống ngô, kết quả phân tích được thể hiện trong bảng 3.2. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 33 Bảng 3.2. Hàm lượng protein, lipid, đường trong hạt của 14 giống ngô STT Giống Protein (%) Lipid (%) Đƣờng (%) 1 TL 9,67±0,001 4,51±0,01 7,21±0,01 2 VN 10,93±0,001 4,72±0,06 6,14±0,02 3 CB 11,24±0,002 5,05±0,05 6,22±0,02 4 SLO 10,25±0,001 4,45±0,02 6,45±0,05 5 T26 11,15±0,003 4,78±0,01 6,65±0,03 6 SL 10,55±0,003 4,56±0,04 5,76±0,03 7 SLV 12,25±0,001 4,64±0,05 6,34±0,04 8 TQ 11,39±0,004 4,50±0,06 6,41±0,01 9 ÔL 10,45±0,001 5,15±0,02 6,25±0,02 10 ĐP 11,64±0,002 4,05±0,01 6,62±0,04 11 LC 7,09±0,001 3,75±0,05 8,50±0,05 12 SLT 8,25±0,003 3,87±0,04 6,80±0,01 13 YB 8,61±0,002 3,93±0,03 5,51±0,03 14 T4 7,50±0,001 3,80±0,03 5,70±0,01 Bảng 3.2 cho thấy, hàm lượng protein của 14 giống ngô dao động trong khoảng 7,09-12,25%. Giống SLV có hàm lượng protein cao nhất, còn giống LC có hàm lượng protein thấp nhất. Thứ tự các giống ngô từ cao xuống thấp xếp theo hàm lượng protein là: SLV > ĐP > TQ > CB > T26 > VN > SL > OOL > Slo > TL > YB > SLT > T4 > LC. Hàm lượng protein mà chúng tôi xác định theo phương pháp Kendal có thấp hơn so với xác định bằng phương pháp của Lowry. Ngô Việt Anh (2005) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 34 đã xác định hàm lượng protein tan của 8 giống ngô nếp theo Lowry, hàm lượng protein dao động trong khoảng 10,5%-14,11% [1]. Hàm lượng protein trung bình của các giống ngô thấp hơn so với một số cây trồng như đậu tương, đậu xanh, lạc. Ở đậu xanh, hàm lượng protein chiếm khoảng 24%, ở đậu tương chiếm khoảng 30-45%, ở lạc khoảng 26%. Kết quả phân tích hàm lượng lipid của các giống ngô cho thấy, hàm lượng lipid trong hạt dao động trong khoảng 3,75-5,15%. Giống ÔL có hàm lượng lipid cao nhất, còn giống LC có hàm lượng lipid thấp nhất. Thứ tự các giống ngô từ cao xuống thấp xếp theo hàm lượng lipid là: ÔL > CB > T26 > VN > SLV > SL > TL > TQ > Slo > ĐP > YB > SLT > T4 > LC. Hàm lượng lipid của ngô cao hơn ở đậu xanh nhưng thấp hơn so với đậu tương và lạc. Lipid trong hạt đậu tương chiếm khoảng 19-25%, ở đậu xanh chiếm khoảng 1,3%, ở lạc chiếm khoảng 49%. Hàm lượng lipid liên quan đến bảo quản hạt giống, những giống có hàm lượng lipid cao sẽ khó bảo quản. Lipid trong hạt ngô chứa khoảng 50% acid linoleic, đây là acid béo quan trọng cần thiết cho người và động vật vì động vật không tự tổng hợp được acid này. Hàm lượng đường được xác định theo phương pháp Bertrand. Kết quả cho thấy, hàm lượng đường trong hạt của các giống ngô nghiên cứu cũng khá cao, dao động từ 5,51-8,50%. Giống LC có hàm lượng đường cao nhất, còn giống YB có hàm lượng đường thấp nhất. Thứ tự các giống ngô từ cao xuống thấp xếp theo hàm lượng đường là: LC > TL > SLT > T26 > ĐP > Slo > TQ > SLV > L > CB > VN > SL > T4 > YB. Đường đóng vai trò quan trọng trong việc điều chỉnh áp suất thẩm thấu trong dịch bào khi cây gặp điều kiện ngoại cảnh bất lợi. Hàm lượng đường trong hạt của 14 giống ngô phân tích cao hơn so với hàm lượng đường trung bình ở ngô (3,5%). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 35 3.2. PHÂN TÍCH TÍNH ĐA HÌNH DNA BẰNG KỸ THUẬT RAPD Công nghệ sinh học đang có nhiều đóng góp có giá trị sản xuất nông nghiệp đặc biệt trong lĩnh vực chọn giống cây trồng với việc sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử với mục đích phân tích quan hệ di truyền và đánh giá hệ gen của thực vật thì RAPD là một kỹ thuật khá thuận lợi và có hiệu quả. Trong nghiên cứu này, chúng tôi trình bày kết quả ứng dụng RAPD vào việc phân tích tính đa hình DNA của 14 giống ngô nếp địa phương. 3.2.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số từ lá ngô Điều quan tâm hàng đầu của kỹ thuật tách chiết acid nucleic là thu nhận các phân tử ở trạng thái nguyên vẹn không bị phân huỷ bởi các tác nhân cơ học hoặc bị đứt gãy, đó là điều kiện đầu tiên quyết định cho sự thành công của quá trình nghiên cứu. Kết quả đo phổ hấp thụ DNA ở bước sóng 260nm và 280nm được thể hiện trong bảng 3.3. Kết quả cho thấy, tỷ số A260/A280 dao động trong khoảng 1,8-2,0, chứng tỏ DNA tổng số thu được đảm bảo cho việc thực hiện kỹ thuật RAPD. Để kiểm tra chất lượng DNA tổng số, chúng tôi tiến hành điện di trên gel agarose, kết quả được thể hiện ở hình 3.2. Hình 3.2. Hình ảnh điện di DNA tổng số của 14 giống ngô Ký hiệu: 1.TL; 2.VN; 3.CB; 4.SLO; 5.T26; 6.SL; 7.SLV; 8.TQ; 9.ÔL; 10.ĐP; 11.LC; 12.SLT; 13.YB; 14.T4. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 36 Kết quả kiểm tra cho thấy DNA của các mẫu thu được không bị đứt gãy và sạch (hình 3.2). Khi đo OD ở bước sóng 260 nm thì chỉ có một đỉnh hấp thụ duy nhất là 260 nm (hình 3.3) Bảng 3.3. Phổ hấp thụ DNA ở bước sóng 260nm và 280nm Tên mẫu A260 A280 A260/A280 TL 0,018 0,0100 1,80 VN 0,015 0,0080 1,88 CB 0,016 0,0084 1,90 SLO 0,015 0,0079 1,89 T26 0,018 0,0090 2,00 SL 0,017 0,0090 1,88 SLV 0,013 0,0070 1,86 TQ 0,014 0,0070 2,00 ÔL 0,018 0,0090 2,00 ĐP 0,016 0,0085 1,88 LC 0,015 0,0078 1,92 SLT 0,016 0,0081 1,98 YB 0,015 0,0079 1,99 T4 0,017 0,0088 1,93 Như vậy, các mẫu DNA thu được đều có độ tinh sạch cao, có thể sử dụng cho các thí nghiệm phân tích DNA tiếp theo. Sau khi tách chiết và tinh sạch DNA tổng số chúng tôi đã tiến hành pha loãng hàm lượng DNA về hàm lượng 10 ng/l để phục vụ cho nghiên cứu đa hình DNA. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 37 Hình 3.3. Phổ hấp thụ DNA của giống SLV đo ở bước sóng 260 nm 3.2.2. Kết quả nghiên cứu đa hình DNA bằng kỹ thuật RAPD Để phân tích mối quan hệ di truyền của 14 giống ngô địa phương chúng tôi sử dụng 10 mồi ngẫu nhiên có độ dài 10 nucleotide với kí hiệu M1, M2, M3, M4, M5, M6, M8, M9, RA159, UBC23. Tổng số băng xuất hiện đối với mỗi mồi ở từng giống ngô được thống kê và sử lý kết quả. Kết quả cho thấy, trong 10 mồi nghiên cứu thì mồi M4 xuất hiện nhiều phân đoạn DNA được nhân bản (13 phân đoạn) với kích thước quan sát từ 0,22-1,70kb, nhiều nhất là ở giống LC xuất hiện 12 băng DNA được nhân bản. Tuy nhiên, cũng có một số mồi khuếch đại được rất ít băng, đó là mồi M1, M2, M5: Mồi M1 nhân bản được một băng DNA rõ nét ở hai giống YB và T4, mồi M2 nhân bản được một băng DNA rõ nét ở giống SLV, mồi M5 nhân bản được một băng DNA ở giống TQ và ÔL (Bảng 3.4) Bảng 3.4 cho thấy, tổng số phân đoạn DNA được nhân bản ở từng giống với 10 mồi ngẫu nhiên dao động từ 41 đến 55 phân đoạn, trong đó giống LC có tổng số băng được nhân bản với 10 mồi nhiều nhất (55 băng), giống TL có số băng DNA được nhân bản với 10 mồi ít nhất (41 băng). Tổng số phân đoạn DNA được nhân bản ngẫu nhiên thu được từ 14 giống ngô với 10 mồi là 674. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 38 Bảng 3.4. Số phân đoạn DNA xuất hiện ở từng giống ngô nghiên cứu Mồi Giống M1 M2 M3 M4 M5 M6 M8 M9 RA159 UBC23 Tổng TL 3 2 4 7 4 8 4 2 5 2 41 VN 2 2 5 8 6 9 4 2 7 3 48 CB 3 2 4 9 4 9 4 3 9 4 51 SLO 2 2 4 11 6 9 4 2 7 3 50 T26 3 2 3 8 3 9 4 2 9 7 50 SL 3 2 3 9 6 9 4 2 8 7 53 SLV 2 1 3 8 5 9 4 3 7 7 49 TQ 3 3 4 10 1 10 4 2 5 5 47 ÔL 3 2 4 8 1 9 4 2 4 6 43 ĐP 3 2 4 8 2 10 4 3 2 7 45 LC 3 3 4 12 5 9 4 3 7 5 55 SLT 3 2 4 7 5 9 4 2 7 5 48 YB 1 2 4 7 4 10 4 2 8 3 45 T4 1 2 5 11 5 9 4 2 5 5 49 Tổng 35 29 55 123 114 256 112 64 90 69 674 Dưới đây là kết quả phân tích RAPD của từng mồi khi điện di sản phẩm RAPD trên gen agarose 2%. Mồi M1 Kết quả điện di sản phẩm RAPD của 14 giống ngô nếp với mồi M1 được thể hiện ở hình 3.4. Kết quả cho thấy, đây là mồi có số phân đoạn DNA được nhân bản ngẫu nhiên ít nhất dao động từ 1 đến 3 phân đoạn. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 39 Hình 3.4. Hình ảnh điện di sản phẩm RAPD với mồi M1 của 14 giống ngô Ký hiệu: M: Marker Smart 1.TL; 2.VN; 3.CB; 4.SLO; 5.T26; 6.SL; 7.SLV; 8.TQ; 9.ÔL; 10.ĐP; 11.LC; 12.SLT; 13.YB; 14.T4. Kích thước các phân đoạn có chiều dài ước tính khoảng 0,7 kb đến 1,4 kb. Trong đó giống TL, CB, T26, SL, TQ, ÔL, ĐP, LC, SLT có số phân đoạn là 3, giống VN, SLO, SLV có 2 phân đoạn, còn giống YB, T4 chỉ có 1 phân đoạn được nhân bản. Tính đa hình được thể hiện ở sự xuất hiện hay không xuất hiện các phân đoạn DNA được nhân bản ngẫu nhiên khi so sánh giữa các giống với nhau. Tại vị trí 1,40 kb chỉ có ba giống SLT, YB, T4 không có đoạn DNA được nhân bản, các giống còn lại đều xuất hiện phân đoạn DNA. Tại kích thước 1,20 kb có năm giống VN, SLO, SLV, YB, T4 không xuất hiện phân đoạn DNA, các giống còn lại đều xuất hiện phân đoạn. Ở vị trí 0,8kb chỉ có hai giống YB, T4 không phân đoạn còn lại đều phân đoạn. Ở kích thước 0,7 kb ba giống SLT, YB, T4 được phân đoạn, các giống còn lại đều mất phân đoạn này. Như vậy, với mồi M1 số phân đoạn DNA được nhân bản ở 14 giống ngô nếp địa phương thể hiện sự sai khác trong cấu trúc DNA giữa các giống ngô nếp tại bốn vị trí 1,40 kb, 1,20 kb, 0,8 kb, 0,7 kb. 1,4 kb 1,2 kb 0,8 kb 1 M 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 40 Mồi M2 Kết quả điện di sản phẩm RAPD của 14 giống ngô nếp với mồi M2 được thể hiện ở hình 3.5. Kết quả cho thấy, số phân đoạn DNA xuất hiện khi được nhân bản ngẫu nhiên là 3 phân đoạn. Ở kích thước khoảng 0,75kb, tất cả các giống đều xuất hiện băng này. Chỉ có hai giống TQ và LC xuất hiện băng DNA ở kích thước khoảng 1,2kb. Ở kích thước 1,5kb, giống SLV không xuất hiện băng DNA được khuếch đại, các giống còn lại đều xuất hiện băng này. Hình 3.5. Hình ảnh điện di sản phẩm RAPD với mồi M2 của 14 giống ngô Ký hiệu: M: Marker 1kb 1.TL; 2.VN; 3.CB; 4.SLO; 5.T26; 6.SL; 7.SLV; 8.TQ; 9.ÔL; 10.ĐP; 11.LC; 12.SLT; 13.YB; 14.T4. Mồi M3 Mồi M3 khuếch đại được 5 phân đoạn với kích thước từ 0,5-2,0kb. Ở kích thước 0,7kb, 1,0kb và 1,2kb, tất cả các giống ngô nghiên cứu đều xuất hiện. Mồi M4 Kết quả điện di sản phẩm RAPD với mồi RA40 của 14 giống ngô ở hình 3.6 cho thấy, có từ 7 đến 12 phân đoạn có kích thước tương ứng khoảng 0,22 kb đến 1,7 kb. Giống LC có số phân đoạn DNA được nhân bản nhiều nhất 12 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 2.0 kb 1.5 kb 1.0 kb 0.75 kb 0.5 kb 0.25 kb Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 41 phân đoạn. Giống SLO, T4 có số phân đoạn DNA được nhân bản 11 phân đoạn. Ba giống TL, SLT, YB có số phân đoạn DNA ít nhất là 7 phân đoạn. Đặc biệt, ở vị trí 0,32kb và 0,80kb chỉ có giống T4 xuất hiện phân đoạn DNA được nhân bản, các giống còn lại đều không thấy xuất hiện. Ở kích thước 1,49 kb đến 1,70 kb hai giống SLT, YB không xuất hiện phân đoạn DNA, các giống còn lại đều xuất hiện. Tại kích thước 0,63 kb giống TL không xuất hiện phân đoạn DNA, các giống còn lại đều xuất hiện phân đoạn. DNA được nhân bản kích thước 0,60 kb thì các giống CB, SLO, SL, LC, SLT, YB đều xuất hiện phân đoạn DNA, các giống còn lại mất phân đoạn này. Ở vị trí 0,32 kb chỉ có giống LC xuất hiện phân đoạn DNA, các giống còn lại đều không xuất hiện phân đoạn DNA. Kích thước khoảng từ 0,22 kb đến 0,24 kb có các giống SLO, TQ, LC, T4 đều có phân đoạn DNA, 12 giống ngô còn lại đều không có phân đoạn này. Tại vị trí 1,25 kb, 1,10 kb, 1,0 kb, 0,72 kb, 0,46 kb tất cả các giống đều có phân đoạn DNA. Như vậy, với mồi M4 có 13 kích thước (0,22 kb, 0,24 kb, 0,32 kb, 0,60 kb, 0,63kb, 0,80 kb, 1,49 kb, 1,70 kb) thể hiện tính đa hình và có 5 kích thước (1,25 kb, 1,10 kb, 1,0 kb, 0,72 kb, 0,46 kb) không biểu hiện tính đa hình. M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Hình 3.6. Hình ảnh điện di sản phẩm RAPD với mồi M4 của 14 giống ngô Ký hiệu: M: Marker Smart; 1.TL; 2.VN; 3.CB; 4.SLO; 5.T26; 6.SL; 7.SLV; 8.TQ; 9.ÔL; 10.ĐP; 11.LC; 12.SLT; 13.YB; 14.T4. 1.5 kb 1.0 kb 0.2 kb 0.6 kb 0.8 kb 0.4 kb Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 42 Mồi M5 Mồi M5 khuếch đại được 6 phân đoạn với kích thước từ 0,27-1,2kb. Ở tất cả các kích thước xuất hiện đều biểu hiện tính đa hình. Mồi M6 Mồi M6 khuếch đại được 10 phân đoạn với kích thước từ 0,2-2,0kb. Biểu hiện đa hình của các giống ngô nghiên cứu thể hiện ở hai băng kích thước 0,2kb và 0,25kb. Ở 8 kích thước còn lại (0,5kb; 0,7kb; 0,9kb; 1,0kb; 1,2kb; 1,4kb; 1,5kb; 2,0kb) không biểu hiện đa hình. M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Hình 3.7. Hình ảnh điện di sản phẩm RAPD với mồi M6 của 14 giống ngô Ký hiệu: M: Marker 1kb 1.TL; 2.VN; 3.CB; 4.SLO; 5.T26; 6.SL; 7.SLV; 8.TQ; 9.ÔL; 10.ĐP; 11.LC; 12.SLT; 13.YB; 14.T4. Mồi 8 Mồi M8 khuếch đại được 4 phân đoạn với kích thước từ 0,6-1,5kb. Các giống ngô nghiên cứu đều xuất hiện các băng DNA được nhân bản. Như vậy, mồi M8 không biểu hiện đa hình. 1.0 kb 2.0 kb 1.5 kb 0.75 kb 0.5 kb 0.25 kb Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 43 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Hình 3.8. Hình ảnh điện di sản phẩm RAPD với mồi M8 của 14 giống ngô Ký hiệu: M: Marker 100bp; 1.TL; 2.VN; 3.CB; 4.SLO; 5.T26; 6.SL; 7.SLV; 8.TQ; 9.ÔL; 10.ĐP; 11.LC; 12.SLT; 13.YB; 14.T4. Mồi 9 Hình 3.9 cho thấy, mồi M9 khuếch đại được 3 phân đoạn với kích thước từ 0,4-0,6kb. Chỉ có kích thước 0,6kb biểu hiện đa hình, còn ở kích thước 0,4kb và 0,5kb không biểu hiện đa hình (tất cả các giống ngô đều xuất hiện 2 băng này). M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Hình 3.9. Hình ảnh điện di sản phẩm RAPD với mồi M9 của 14 giống ngô Ký hiệu: M: Marker 100bp 1.TL; 2.VN; 3.CB; 4.SLO; 5.T26; 6.SL; 7.SLV; 8.TQ; 9.ÔL; 10.ĐP; 11.LC; 12.SLT; 13.YB; 14.T4. 1.2 kb 0.9 kb 0.6 kb 0.5 bk 0.4 kb 0.6 kp 0.5 kb Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 44 Mồi RA159 Kết quả phân tích điện di sản phẩm RAPD của 14 giống ngô nếp với mồi RA159 được thể hiện qua bảng 3.4 và hình 3.10. Kết quả cho thấy, xuất hiện từ 2 đến 9 phân đoạn DNA có kích thước tương ứng khoảng 0,21 kb đến 1,50 kb. Bốn giống VN, CB, T26, SL xuất hiện phân đoạn DNA ở vị trí 1,50 kb. Ở ba kích thước 0,7 kb, 1,0 kb và 1,20 kb giống ĐP không xuất hiện phân đoạn DNA, các giống còn lại đều xuất hiện phân đoạn. Giống VN, CB, T26, LC, SLT, YB xuất hiện phân đoạn được nhân bản ngẫu nhiên ở kích thước 0,8 kb. Còn ở kích thước 0,56 kb chỉ có giống ÔL không phân đoạn, các giống còn lại đều xuất hiện phân đoạn. Ở vị trí 0,54 kb 6 giống CB, SLO, T26, SL, SLV,YB đều phân đoạn DNA, các giống còn lại không phân đoạn. Tại kích thước 0,36 kb các giống TL, VN, TQ, ÔL, ĐP, T4 mất phân đoạn. Kích thước 0,21 kb tất cả các giống đều phân đoạn DNA. M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Hình 3.10. Hình ảnh điện di sản phẩm RAPD với mồi RA159 của 14 giống ngô Ký hiệu: M: Maker Smart 1.TL; 2.VN; 3.CB; 4.SLO; 5.T26; 6.SL; 7.SLV; 8.TQ; 9.ÔL; 10.ĐP; 11.LC; 12.SLT; 13.YB; 14.T4. Như vậy với mồi RA159 có 9 kích thước trong đó có 8 kích thước (1,5 kb, 1,2 kb, 1,0 kb, 0,8 kb, 0,7 kb, 0,56 b, 0,54 kb, 0,36 kb) thể hiện tính đa hình và chỉ có kích thước 0,21 kb không biểu hiện tính đa hình. 1.5 kb 0.6 kb 2.0 kb 0.2 kb 0.4 kb 0.8 kb 1.0 kb Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 45 Mồi UBC23 Phân tích điện di sản phẩm RAPD của 14 giống ngô nghiên cứu với mồi UBC23 (hình 3.11) cho thấy, xuất hiện từ 2 đến 7 phân đoạn DNA được nhân bản ngẫu nhiên. Các phân đoạn DNA có kích thước ước tính khoảng từ 0,19 kb đến 0,64 kb. Trong đó bốn giống T26, SL, SLV, ĐP xuất hiện 7 phân đoạn DNA và giống TL xuất hiện phân đoạn DNA thấp nhất (chỉ có 2 phân đoạn). Các giống T26, SLV, ÔL, ĐP xuất hiện phân đoạn DNA được nhân bản ngẫu nhiên tại kích thước 0,64 kb. Từ kích thước 0,48 kb đến 0,60 kb tất cả các giống đều xuất hiện phân đoạn DNA. Ở kích thước 0,4 các giống ngô nghiên cứu đều xuất hiện phân đoạn DNA (trừ giống TL). Tại vị trí 0,38 kb 9 giống ngô (TL, VN, CB, SLO,TQ, LC, SLT, YB, T4) mất phân đoạn DNA. Còn ở vị trí 0,36 kb 7 giống ngô (T26, SL, SLV, TQ, LC, SLT, T4) đều xuất hiện phân đoạn DNA, các giống ngô còn lại mất phân đoạn này. Ở vị trí 0,30 kb các giống đều mất phân đoạn DNA trừ giống LC, SLT, T4. Kích thước 0,24 kb chỉ có hai giống SL, ĐP xuất hiện phân đoạn DNA được nhân bản, các giống còn lại đều không xuất hiện phân đoạn. Các giống đều mất phân đoạn DNA tại vị trí 0,21 kb trừ giống ÔL. Hai giống CB, SL có phân đoạn DNA được nhân bản ngẫu nhiên, các giống ngô còn lại đều không phân đoạn DNA ở vị trí 0,20 kb. Tại vị trí 0,19 kb các giống đều không xuất hiện phân đoạn DNA được nhân bản ngẫu nhiên trừ bốn giống T26, SLV,TQ, ĐP đều xuất hiện phân đoạn DNA được nhân bản ngẫu nhiên. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 46 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Hình 3.11. Hình ảnh điện di sản phẩm RAPD với mồi UBC23 của 14 giống ngô Ký hiệu: M: Marker Smart; 1.TL; 2.VN; 3.CB; 4.SLO; 5.T26; 6.SL; 7.SLV; 8.TQ; 9.ÔL; 10.ĐP; 11.LC; 12.SLT; 13.YB; 14.T4. Như vậy, khi sử dụng mồi UBC23 tính đa hình biểu hiện ở các kích thước (0,64 kb, 0,4 kb, 0,38 kb, 0,36, 0,3 kb, 0,24 kb, 0,21 kb, 0,2 kb, 0,19 kb), còn 2 kích thước 0,60 kb và 0,48 kb không biểu hiện tính đa hình. Tỷ lệ đa hình của các phân đoạn DNA xuất hiện Với 140 phản ứng PCR được thực hiện chúng tôi đã điện di sản phẩm và thu được 674 phân đoạn DNA trong 68 loại phân đoạn DNA từ 14 giống ngô địa phương. Kích thước các phân đoạn DNA được nhân bản trong khoảng từ 0,2kb-2,0kb. Số lượng các phân đoạn tương ứng với mỗi mồi nằm trong khoảng 3-13 băng, trong đó mồi M2 và M9 nhân bản được ít nhất (3 phân đoạn) còn mồi M4 nhân được nhiều nhất (13 phân đoạn). Qua phân tích điện di sản phẩm RAPD với 10 mồi ngẫu nhiên của 14 giống ngô nếp địa phương nhận thấy có 9 mồi biểu hiện đa hình, 1 mồi không biểu hiện đa hình (mồi M8), tỷ lệ % đa hình được thể hiện ở bảng 3.5. Bảng 3.5 cho thấy, mồi M1 và mồi M5 có số phân đoạn đa hình cao nhất (100%) sau đó là mồi RA159 với tỷ lệ đa hình chiếm 88,89%. Mồi M8 không biểu hiện sự đa hình vì các băng DNA nhân bản được đều có mặt ở tất cả các mẫu ngô nghiên cứu. 0.6 kb 0.2 kb 0.4 kb 0.8 kb Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 47 Ngô Việt Anh (2005) sử dụng 5 mồi nghiên cứu đa hình của 8 giống ngô cho thấy tỷ lệ đa hình đạt từ 33,3% đến 80% [1]. Như vậy, so với kết quả đó thì tỷ lệ phân đoạn đa hình của 14 giống ngô mà chúng tôi nghiên cứu cao hơn. Bảng 3.5. Tỷ lệ phân đoạn đa hình khi sử dụng 10 mồi RAPD Mồi Phân đoạn DNA đƣợc nhân bản Phân đoạn đa hình Tỷ lệ % phân đoạn đa hình M1 4 4 100 M2 3 2 66,67 M3 5 3 60 M4 13 8 61,54 M5 6 6 100 M6 10 2 20 M8 4 0 0 M9 3 1 33,33 RA159 9 8 88,89 UBC23 11 9 81,82 Mối quan hệ di truyền giữa các giống ngô dựa trên phân tích RAPD Dựa trên sự xuất hiện hay không xuất hiện các phân đoạn DNA của các giống khi điện di sản phẩm RAPD, chúng tôi xác định hệ số đa dạng di truyền của các giống ngô nếp ở mức độ phân tử. Các số liệu được tính toán và phân tích theo chương trình NTSYSpc version 2.0 (Applied Biostatistics Inc., USA., 1998) (theo quy ước 1 = xuất hiện; 0 = không xuất hiện). Kết quả nhận được hệ số tương đồng di truyền giữa các giống ngô nếp thể hiện ở (bảng 3.6) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 48 Bảng 3.6. Hệ số tương đồng di truyền của 14 giống ngô nếp Giống TL VN CB SLo T26 SL SLV TQ ÔL ĐP LC SLT YB T4 TL 1,00 VN 0,85 1,00 CB 0,84 0,87 1,00 Slo 0,84 0,87 0,85 1,00 T26 0,89 0,81 0,85 0,79 1,00 SL 0,79 0,82 0,87 0,87 0,87 1,00 SLV 0,78 0,81 0,82 0,82 0,88 0,84 1,00 TQ 0,82 0,76 0,75 0,81 0,84 0,77 0,78 1,00 ÔL 0,87 0,81 0,79 0,79 0,85 0,78 0,79 0,84 1,00 ĐP 0,81 0,75 0,77 0,74 0,79 0,75 0,79 0,81 0,85 1,00 LC 0,75 0,81 0,82 0,85 0,74 0,78 0,76 0,78 0,71 0,68 1,00 SLT 0,97 0,82 0,84 0,81 0,78 0,79 0,78 0,74 0,75 0,69 0,84 1,00 YB 0,75 0,81 0,82 0,82 0,74 0,75 0,77 0,69 0,71 0,68 0,76 0,90 1,00 T4 0,74 0,82 0,72 0,84 0,72 0,74 0,75 0,79 0,75 0,69 0,78 0,82 0,78 1,00 Hệ số tương đồng di truyền phản ánh quan hệ di truyền của các giống ngô với nhau. Hai giống ngô càng gần nhau về mặt di truyền thì hệ số tương đồng giữa chúng càng lớn và ngược lại hai giống có hệ số tương đồng di truyền thấp thì mối quan hệ di truyền của chúng càng xa nhau. Bảng 3.6 thể hiện hệ số tương đồng di truyền của từng cặp giống. Kết quả cho thấy, hệ số di truyền của 14 giống ngô dao động trong khoảng 0,68 đến 0,90. Trong đó, hai giống SLT và YB có hệ số đồng dạng lớn nhất là 0,90, còn các cặp giống: LC và ĐP, ĐP và YB có hệ số tương đồng nhỏ nhất là 0,68. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 49 Sau khi phân tích hệ số đồng dạng chúng tôi đã xây dựng sơ đồ hình cây (hình 3.12) để chỉ ra sự sai khác di truyền của các giống ngô. Mức độ khác nhau được biểu hiện bằng hệ số sai khác giữa các giống. Các giống có hệ số di truyền cao được xếp vào một nhóm, giữa các nhóm lại có liên kết với nhau. Hình 3.12. Biểu đồ mô tả quan hệ di truyền của 14 giống ngô Phân tích hình 3.12 cho thấy, 14 giống ngô được chia làm 2 nhóm chính: - Nhóm I: gồm các giống TL, ÔL, TQ, ĐP, VN, CB, SLo, SL, T26, SLV - Nhóm II: LC, SLT, YB, T4 Hai nhóm ngô có sự sai khác di truyền từ 10% đến 23% (tức tỷ lệ tương đồng di truyền là 77% đến 90%). - Nhóm chính I lại chia làm hai nhóm phụ. Nhóm phụ thứ nhất gồm 4 giống (TL, ÔL, TQ, ĐP); nhóm phụ thứ hai gồm 6 giống (VN, CB, SL, T26, SLV) với khoảng cách di truyền là 20,5% ( 100% - 79,5%). I II Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 50 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 1. KẾT LUẬN 1.1. Khối lượng 100 hạt của các giống ngô dao động từ 16,09 g đến 28,88 g. Trong đó, giống T26 có khối lượng hạt cao nhất (28,88g), thấp nhất là giống TL (16,09g). 1.2. Đánh giá chất lượng hạt cho thấy, hàm lượng protein, lipid và đường tương đối cao. Hàm lượng protein trong hạt của 14 giống ngô dao động trong khoảng 7,09-12,25%, hàm lượng lipid trong khoảng 3,75-5,15% , hàm lượng đường trong khoảng 5,51-8,50%. 1.3. Bằng kỹ thuật RAPD với việc sử dụng 10 mồi ngẫu nhiên đã nhận được 674 phân đoạn DNA được nhân bản ngẫu nhiên từ hệ gen của 14 giống ngô nếp địa phương. Trong số 10 mồi ngẫu nhiên sử dụng có 9 mồi biểu hiện tính đa hình. 1.4. Hệ số sai khác di truyền giữa các giống ngô dao động từ 10% đến 32%. 14 giống ngô được chia làm hai nhóm chính với khoảng cách di truyền từ 10% đến 23%. 2. ĐỀ NGHỊ Kết hợp một số kỹ thuật phân tích quan hệ di truyền khác như SSR, AFLP,… để xác định mối quan hệ di truyền giữa các giống ngô để kết quả tin cậy hơn. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 51 CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN 1. Nguyễn Vũ Thanh Thanh, Trần Thị Ngọc Diệp, Mẫn Thị Hoa, Chu Hoàng Mậu (2009), “Nghiên cứu sự đa đạng di truyền phân tử của một số giống ngô ( Zea mays L.) bằng kỹ thuật RAPD”, Tạp chí khoa học & công nghệ Thái Nguyên, tập 59, số 10, tr 76-80. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 1. Ngô Việt Anh (2005), Nghiên cứu đặc điểm hình thái, hóa sinh hạt, khả năng chịu hạn và tính đa dạng di truyền của một số giống ngô nếp địa phương, luận văn thạc sĩ sinh học. 2. Lê Đức Biên, Nguyễn Đình Huyền, Cung Đình Lượng, (1986). Cơ sở sinh lý thực vật, NXB Nông nghiệp Hà Nội. 3. Lê Trần Bình và CS, (1997), Công nghệ sinh học trong cải tiến giống cây trồng, NXB nông nghiệp 4. Phạm Thị Trân Châu, Nguyễn Thị Hiền, Phùng Gia Tường (1998), Thực hành hóa sinh, NXB Giáo dục 5. Bùi Mạnh Cường, Trần Hồng Uy, Ngô Hữu Tình, Lê Quý Kha, Nguyễn Thị Thanh (2002), “Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của một số dòng ngô đường bằng kỹ thuật RAPD – markers” , Tạp chí di truyền và ứng dụng, tr. 16 – 22. 6. Trịnh Đình Đạt (2007), Công nghệ sinh học tập bốn, NXB giáo dục. 7. Trương Văn Đích, (2005), Kĩ thuật trồng giống ngô năng suất cao, NXB Nông nghiệp Hà Nội, tr. 26. 8. Cao Đắc Điểm (1988). Cây ngô, NXB Nông nghiệp, Hà Nội. 9. Nguyễn Xuân Hiển và CS, (1972). Một số kết quả nghiên cứu về cây ngô, NXB khoa học kỹ thuật Hà Nội. 10. Võ Thương Lan và cộng sự (1999), “Nghiên cứu tính đa dạng của một số li rong câu ở vùng ven biển miền nam Việt Nam bằng kĩ thuật RAPD – PCR”, Báo cáo khoa học hội nghị toàn quốc, tr. 1321-1327. 11. Lê Đình Lương, Quyền Đình Thi (2002), Kỹ thuật di truyền và ứng dụng, NXB Đại học Quốc Gia, Hà Nội. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 53 12. Nguyễn Đức Lương, Dương Văn Sơn, Lương Văn Hinh (2000), Giáo trình cây ngô, NXB nông nghiệp. 13. Nguyễn Đức Lương, Dương Văn Sơn, Lương Văn Hinh (2002), Giáo trình cây lương thực (dành cho cao học), NXB Nông nghiệp, Hà Nội. 14. Chu Hoàng Mậu, Nông Thị Man, Lê Xuân Đắc, Đinh Thị Phòng, Lê Trần Bình (2002) “Đánh giá genome của một số dòng đậu tương đột biến bằng kĩ thuật phân tích đa hình của ADN được nhân bản ngẫu nhiên”, Tạp chí sinh học 22, tr.21-27. 15. Đinh Thị Phòng (2001), Nghiên cứu khả năng chịu hạn và chọn dòng chịu hạn ở lúa bằng công nghệ tế bào thực vật, Luận án tiến sĩ sinh học, Viện công nghệ sinh học Hà Nội. 16. Nguyễn Thị Tâm (2003), Nghiên cứu khả năng chịu cóng và chọn dòng chịu nóng ở lúa bằng công nghệ tế bào thực vật, Luận án tiến sỹ sinh học, Viện Công nghệ Sinh học, Hà Nội. 17. Nguyễn Vũ Thanh Thanh (2003), Nghiên cứu thành phần hóa sinh hạt và tính đa dạng di truyền của một số giống đậu xanh có khả năng chịu hạn khác nhau, Luận văn thạc sĩ Sinh học, Trường Đại học Sư Phạm- Đại học Thái Nguyên, tr 48- 67. 18. Ngô Hữu Tình (2003), Cây ngô. NXB Nghệ An. 19. Ngô Hữu Tình, Bùi Mạnh Cường, Ngô Minh Tâm (2002), “Xác định khoảng cách di truyền - nhóm ưu thế lai - cặp lai năng suất cao bằng chỉ thị RAPD” , Tạp chí nông nghiệp và phát triển nông thôn, số 4, tr. 289 - 291. 20. Ngô Hữu Tình, Trần Hồng Uy, Võ Đình Long, Bùi Mạnh Cường, Lê Quý Kha, Nguyễn Thế Hùng, (1997). Cây ngô, nguồn gốc đa dạng di truyền và phát triển. NXB Nông nghiệp, Hà Nội. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 54 21. Nguyễn Hải Tuất, Ngô Kim Khôi (1996), Xử lý thống kê kết quả nghiên cứu thực nghiệm trong nông lâm ngư nghiệp trên máy vi tính, NXB Nông Nghiệp, Hà Nội. TÀI LIỆU TIẾNG ANH 22. Abdel – Mawgood A.L., Ahmed M.M.M, Aliba (2006) Application of molecular markers for hybrid maize (Zea mays L.) identification, International journal of food, agriculture and environment ISSN 1459- 0255 n o 2, pp. 176-178. 23. Afzal M. A., Muynul Haque M., and Shanmugasumdaram S. (2004), Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) Analyusis of selected mungbean [Vigna radiata (L.) Wilczek] cultivars”, Asian Journal of Sciences, 3 (1), pp. 20-24. 24. Amorime. P.; De Souza Almeida C. C.; Melo Sereno M. J. C.; Bered F.; Marbosa J. F., (2003), “Genetic variability in sweet corn using molecular markers”, Maydia (Maydica) ISSN 0025-6153 Coden Mydcah, 1(3), pp. 177-181. 25. Asif M., Rahman M.U.R, Zafar Y., (2006), “Genotyping analysis of six maise (Zea mays L.) hybrid using DNA fingerprinting technology pak”. J. Bot, 38 (5): 1425 – 1430. 26. Bauer I., S. Mladenović Drinić, M. Filipović, Konstanti-nov (2005): “Genetic characterization of early maturing maize hybrids (Zea mays L.) obtained by protein and RAPD markers”. Genetika, Vol. 37, No. 3, 235-243. 27. Burow M.D., Jesubatham A.M. (2006), “PeanutMap: an online genome database for comparative molecular maps of peanut’’ BMC Bioinformatics. 28. Chen Y., Wang D., Arelli P., Ebrahimi M., Nelson R.L., (2006), “Molecular marker diversity of SCN-resistant sources in soybean’’, Genome; 49, 8; ProQuest Central. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 55 29. Foolad, Arusekar, Rodriguer (1995), Application of polymerase Chain Reation (PCR) to plant genome analysis. In: Tissue and organ culture, Fundamenatal methodsSpringer Verlag, Berlin, Heidelerg, 281–289. 30. Garcia A.A.F, Benchimol L.L, Barbosa A.M.M, Geraldi I.O, Souza Jr C.L, Souza A.P.D, (2004), “Comparison of RAPD, RFLP, AFLP and SSR markers for diversity studies in tropical maize inbred lines’’, Genet. Mol. Biol., 27 (4). 31. Gawel DNA Jarret, (1991). Genomic DNA Isolation. 32. Hartings H, Berardo N, Mazzinelli GF, Valoti P, Verderio A, Motto M., (2008), “Assessment of genetic diversity and relationships among maize (Zea mays L.) Italian landraces by morphological traits and AFLP profiling”, Theor Appl Genet, 117(6):831-842. 33. Ignjatovie-Micie D., Corie T., Kovacevic D., Markovie K., Lazic-Jancic V., (2003) RFLP and RAPD analysis of maize (Zea mays L.) local populations for identification of variability and duplicate accession, Maydica: 153-159. 34. Innis M. A., Gelfand D. H., Sninsky J. J, White T. J. (1990) “PCR protocol: Aguile to methods and ampilication”. Academic Press, pp. 482. 35. Legesse BW, Myburg AA, Pixley KV, Botha AM. (2007), “Genetic diversity of African maize inbred lines revealed by SSR markers”, Hereditas,144(1):10-17 36. Miranda Oliveira K, Rios Laborda P, Augusto F Garcia A, Zagatto Paterniani ME, de Souza AP. (2004), “Evaluating genetic relationships between tropical maize inbred lines by means of AFLP profiling”, Hereditas. , 140(1):24-33. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 56 37. Moretti A, Mulé G, Ritieni A, Láday M, Stubnya V, Hornok L, Logrieco A., (2008), “Cryptic subspecies and beauvericin production by Fusarium subglutinans from Europe”, Int J Food Microbiol. 127(3):312-315 38. Moretzsohn M.C., Hopkins M.S., Mitchell S.E., Kresovich S, Valls J.F., Ferreira M.E. (2004), “Genetic diversity of peanut (Arachis hypogaea L.) and its wild relatives based on the analysis of hypervariable regions of the genome”, BMC Plant Biol, 14, 4(1). 39. Muthusamy S., Kanagarajan S., Ponnusamy S.(2008), “Efficiency of RAPD and ISSR markers system in accessing genetic variation of rice bean (Vigna umbellata) landraces”, Electronic Journal of Biotechnology, 11(3). 40. Nanjo T., Kobayashi M., Yoshiba Y., Sanda Y., Wada K., Tsukaya H., Kakubari Y., Yamaguchi – Shinozaki K., (2000) “Biological funtions of proline in morphogenesis and osmotolerance revealed in antiense transgenic Arabidopsis thaliana” – articles/sgu2000-011.htm. 41. Naureen Z., Yasmin S., Hameed S., Malik K.A., Hafeez F.Y. (2005), “Characterization and screening of bacteria from rhizosphere of maize grown in Indonesian and Pakistani soils”, Journal Basic Microbiol, 45(6): 447-459. 42. Okumus A., (2007), “Genetic variation and relationship between Turkish flint maize landraces by RAPD marker”, American Journal of Agricultural and Biological Sciences, 2(2): 49-53. 43. Osipova E.S., Koveza O.V., Troitskij A.V., Dolgikh Y.I.,Shamina Z.B., Gostimskij S.A, (2003), Russian Journal of Genetics, Volume 39, pp. 1412-1419(8). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 57 44. Qilun Yao, Kecheng Yang, Guangtang Pan and Tingzhao Rong (2007), Genetic Diversity of Maize (Zea mays L.) Landraces from Southwest China Based on SSR, Genetic Diversity of Maize (Zea mays L.) Landraces from Southwest China Based on SSR, 34(9), 851-860. 45. Raina S.N.V, Kojima T., Ogihara Y., Singh K.P., Devarumath R.M., (2001), “RAPD and ISSR figerprints as useful genetic markers for analysis of genetic diversity, varietal identification, and phylogenetic relationships in peanut (Arachis hypogaea L.) cultirs and wild species”, Genome, 44(5), 763-72. 46. Sharopova N, McMullen MD, Schultz L, Schroeder S, Sanchez-Villeda H, Gardiner J, Bergstrom D, Houchins K, Melia-Hancock S, Musket T, Duru N, Polacco M, Edwards K, Ruff T, Register JC, Brouwer C, Thompson R, Velasco R, Chin E, Lee M, Woodman-Clikeman W, Long MJ, Liscum E, Cone K, Davis G, Coe EH Jr.(2002) “Development and mapping of SSR markers for maize”, Plant Mol Biol. 48(5-6):463-481. 47. Souza1 S.G. H. D, Carpentieri P.V, Claudete de Fátima Ruas C. F, Paula C. V, Ruas M. P and Carlos G. A (2008) “Comparative Analysis of Genetic Diversity Among the Maize Inbred Lines (Zea mays L.) Obtained by RAPD and SSR Markers”, Brazilan archives of biology and tachnology, Vol.51, n. 1 : pp.183-192) 48. Thomas Lübberstedt, Albrecht E. Melchinger, Christina Dußle, Marnik Vuylsteke, Martin Kuiper, (2000), “Relationships among Early European Maize Inbreds”, Crop Science 40:783-791. 49. Valdemar P. Carvalho; Claudete F. Ruas; Josué M. Ferreira ;Rosangela M.P. Moreira; Paulo M. Ruas (2004) “Genetic diversity among maize (Zea mays L.) landraces assessed by RAPD markers”, Genet. Mol. Biol. Vol.27 No 2 Sao Paulo 1415-4757. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 58 50. Vasconcelos M.J.V.D, Antunes M.S., Barbosa S.M., Carvalho C.H.S.D, (2008), “RAPD analysis of callus regenerated and seed grownplants of maize (Zea mays L.)”, Revista brasileira de milho e sorgo, 7(2), pp. 93-104. 51. Welsh J., McClelland M. (1990), "Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primer", Nucl Acids Res,18, pp 7213 - 7218. 52. William J. G. K., Kubelik A. E., Levak K. J., Rafalski J. A., Tingey S. V., (1990), “DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic merers”, Nucleic Acids Res, 18, pp. 6531-6535. 53. Zhu J., Keappler S.M., Lynch J.P., (2005), “Mapping of QTLs for lateral root branching and lengtj in maize (Zea mays L.) under diferentical photphorus supply”, Theor Appl Genet, pp. 8-15.