Luận văn Nghiên cứu tinh sạch pectinase từ nấm sợi aspergillus awamori và xác định tính chất của chế phẩm

, deã vôõ [17]. Hình 3.2: Khaûo saùt theå tích ruùt chitosan ñeå taïo maøng Keát quaû nghieân cöùu coá ñònh urease treân maøng chitosan cuûa Krajewska vaø coäng söï (1990) keát luaän raèng ñoä daøy maøng tính toaùn ñöôïc laø 0,08-0,09mm [17]. 3.1.3 Aûnh höôûng cuûa noàng ñoä glutaraldehyde. Nhö chuùng toâi ñaõ ñeà caäp ôû treân, lieân keát giöõa chaát mang vaø enzyme thoâng qua caàu noái laø GA. Vì vaäy, trong thí nghieäm naøy chuùng toâi khaûo saùt aûnh höôûng cuûa noàng ñoä GA ñeán khaû naêng coá ñònh enzyme urease leân maøng chitosan. Hình 3.3: Khaûo saùt aûnh höôûng cuûa noàng doä GA Keát quaû thí nghieäm trong hình 3.3 cho thaáy khi taêng noàng ñoä GA, hoaït tính enzyme urease coá ñònh taêng vaø ñaït cöïc ñaïi taïi noàng ñoä 0.01%. Sau ñoù neáu noàng ñoä GA tieáp tuïc taêng, hoaït tính cuûa enzyme coá ñònh seõ giaûm. Ñieàu naøy coù theå ñöôïc giaûi thích nhö sau: Do GA laø taùc nhaân gaén keát enzyme leân chaát mang neân khi noàng ñoä GA taêng, soá löôïng enzyme lieân keát vôùi chaát mang cuõng taêng, daãn ñeán hoaït tính enzyme coá ñònh taêng. ÔÛ noàng ñoä GA thaáp (nhoû hôn 0.01%), lieân keát coäng hoùa trò ñaõ ñöôïc hình thaønh nhöng chöa nhieàu. Do ñoù, löôïng enzyme coá ñònh leân maøng chöa cao, hoaït tính cuûa enzyme coá ñònh coù taêng nhöng chöa ñaït cöïc ñaïi. Khi noàng ñoä GA quaù cao (lôùn hôn 0.01%), hoaït tính cuûa enzyme coá ñònh giaûm laø do lieân keát ngang giöõa GA vaø maøng quaù chaët, phaù vôõ caáu truùc cuûa maøng, luùc ñoù maøng seõ raát gioøn, deã vôõ [17]. Maët khaùc, soá löôïng lieân keát cuûa 2 nhoùm –NH2 treân maøng vaø 2 nhoùm –CHO cuûa GA cuõng taêng, laøm cho löôïng GA duøng ñeå lieân keát vôùi enzyme seõ giaûm. Ñieàu naøy ñoàng nghóa vôùi vieäc khaû naêng gaén keát enzyme leân maøng laø khoâng toát. Keát quaû nghieân cöùu cuûa chuùng toâi cuõng phuø hôïp vôùi nghieân cöùu coá ñònh urease treân maøng chitosan cuûa Krajewska vaø coäng söï (1990). Keát quaû nghieân cöùu treân cuõng cho thaáy noàng ñoä GA toái öu cho vieäc coá ñònh enzyme urease leân maøng chitosan laø 0.01% [17]. 3.1.4 AÛnh höôûng cuûa thôøi gian ngaâm maøng trong dung dòch glutaraldehyde. Trong nghieân cöùu naøy, chuùng toâi ñaõ tieán haønh khaûo saùt aûnh höôûng cuûa thôøi gian ngaâm maøng trong dung dòch GA ñeán hieäu quaû cuûa quaù trình coá ñònh enzyme urease leân chaát mang chitosan vôùi caùc giaù trò laø 0.5 giôø, 1 giôø, 1.5 giôø vaø 2 giôø. Keát quaû thí nghieäm trong hình 3.4 cho thaáy khi taêng thôøi gian ngaâm maøng chitosan trong dung dòch GA, hoaït tính cuûa enzyme urease taêng daàn vaø ñaït cöïc ñaïi khi thôøi gian ngaâm laø 1.5 giôø. Tieáp theo, neáu tieáp tuïc taêng thôøi gian ngaâm maøng trong GA, hoaït tính enzyme laïi giaûm. Nguyeân nhaân cuûa hieän töôïng treân coù theå ñöôïc giaûi thích laø neáu thôøi gian ngaâm trong dung dòch GA caøng ngaén, soá löôïng lieân keát taïo thaønh giöõa GA vaø nhoùm –NH2 treân maøng chitosan caøng ít, daãn ñeán khaû naêng taïo lieân keát vôùi enzyme khoâng cao, laøm hoaït tính cuûa enzyme coá ñònh seõ thaáp. Ngöôïc laïi, neáu ngaâm maøng trong thôøi gian quaù daøi, seõ daãn ñeán hieän töôïng taïo lieân keát ngang giöõa GA vaø maøng quaù chaët, laøm maøng gioøn, deã vôõ, hieäu suaát coá ñònh cuõng khoâng cao [17]. Nghieân cöùu cuûa Krajewska vaø coäng söï (1990) khi coá ñònh enzyme urease leân maøng chitosan cuõng cho keát quaû töông töï cuûa chuùng toâi. Keát quaû nghieân cöùu cho thaáy thôøi gian toái thích ngaâm maøng trong dung dòch GA laø 1,5 giôø [17]. Hình 3.4: Khaûo saùt aûnh höôûng cuûa thôøi gian ngaâm maøng trong dung dòch GA 3.1.5 AÛnh höôûng cuûa pH cuûa dung dòch enzyme urease Nhieàu keát quaû nghieân cöùu cho thaáy pH cuûa dung dòch enzyme urease duøng ñeå coá ñònh coù aûnh höôûng raát lôùn ñeán khaû naêng gaén keát enzyme treân maøng chitosan [4]. Hình 3.5: AÛnh höôûng cuûa pH cuûa dung dòch enzyme urease ñeán hoaït tính cuûa enzyme urease coá ñònh. Chính vì vaäy, muïc ñích cuûa nghieân cöùu naøy laø khaûo saùt aûnh höôûng cuûa pH ñeán quaù trình coá ñònh enzyme urease leân maøng chitosan, xaùc ñònh pH toát nhaát ñeå coá ñònh enzyme. Töø ñoù, chuùng toâi ñaõ choïn ba dung dòch enzyme coù pH khaùc nhau ñeå khaûo saùt: pH=5,2; pH=5,6 vaø pH=7,4. Keát quaû nghieân cöùu cho thaáy ôû dung dòch enzyme coù pH=5.6, hoaït tính cuûa enzyme urease coá ñònh cao hôn haún so vôùi nhöõng maøng ñöôïc xöû lyù ôû dung dòch enzyme coù pH=5,2 vaø pH=7,4. Enzyme urease ñöôïc coá ñònh trong dung dòch enzyme coù pH=5.2 coù hoaït tính raát thaáp. Nhö chuùng ta ñaõ bieát, phaûn öùng taïo lieân keát giöõa maøng chitosan vaø urease xaûy ra theo cô cheá nhö sau: Ch-NH2 + OHC-(CH2)3-CHO è Ch-N=CH-(CH2)3-CHO + H2O (a) Chitosan Glutaraldehyde Ch-N=CH-(CH2)3-CHO + H2N-E è Ch-N=CH-(CH2)3 –CH=N-E + H2O (b) Chitosan ñaõ xöû lyù baèng GA Enzyme Trong ñoù phaûn öùng (a) khoâng phuï thuoäc vaøo pH. Ngöôïc laïi phaûn öùng (b) laïi phuï thuoäc raát nhieàu vaøo pH. Hoaït tính enzyme coá ñònh seõ lôùn nhaát neáu maøng ñöôïc ngaâm vaøo dung dòch enzyme coù pH thaáp hôn. Ñieàu ñoù laø vì pH acid seõ taïo thuaän lôïi cho phaûn öùng giöõa nhoùm amino vaø nhoùm aldehyde, ñoàng thôøi ôû pH acid naøy, chitosan toàn taïi ôû daïng gel, giuùp cho nhieàu phaân töû urease lieân keát vaøo maøng thoâng qua con ñöôøng haáp thuï hay nhoát gel [17]. Tuy nhieân, neáu pH quaù thaáp, haàu heát caùc nhoùm amino ñeàu tích ñieän döông. Ñieàu naøy gaây khoù khaên cho phaûn öùng giöõa nhoùm amino cuûa enzyme vaø nhoùm aldehyde cuûa GA, khi ñoù hieäu suaát coá ñònh khoâng cao daãn ñeán hoaït tính cuûa enzyme coá ñònh cuõng thaáp. Maët khaùc, Sumner vaø Hand ñaõ xaùc ñònh ñieåm ñaúng ñieän cuûa urease naèm trong khoaûng pH=5.0-5.1. Taïi ñieåm ñaúng ñieän, ñoä hoøa tan cuûa urease cöïc nhoû [77]. Do ñoù, hieäu suaát coá ñònh enzyme cuõng thaáp neân hoaït tính enzyme coá ñònh cuõng khoâng cao. Keát quaû thí nghieäm cuûa chuùng toâi cuõng töông töï vôùi nhöõng nghieân cöùu cuûa nhieàu taùc giaû khi nghieân cöùu veà quaù trình coá ñònh urease: Krajewska vaø coäng söï (1990) nghieân cöùu veà enzyme urease coá ñònh treân maøng chitosan, dung dòch enzyme coù pH =5.3 seõ laø toái öu cho vieäc coá ñònh enzyme [17]. Anita vaø coäng söï (1997) cho raèng dung dòch enzyme urease coù pH =6.0 laø toát nhaát khi coá ñònh enzyme urease treân nylon [10]. 3.1.6 Aûnh höôûng cuûa thôøi gian ngaâm Hieäu quaû cuûa phöông phaùp coá ñònh phuï thuoäc vaøo löôïng enzyme taïo ñöôïc lieân keát ñoàng hoùa trò thoâng qua glutaraldehyde vôùi chaát mang vaø löôïng enzyme lieân keát naøy phuï thuoäc vaøo thôøi gian nhuùng oáng thuûy tinh vaøo dung dòch enzyme urease. Keát quaû thí nghieäm trong hình 3.6 cho thaáy neáu taêng thôøi gian ngaâm maøng trong dung dòch enzyme, hoaït tính cuûa enzyme caøng taêng vaø ñaït toát nhaát ôû 24 giôø. Neáu tieáp tuïc taêng thôøi gian ngaâm, hoaït tính cuûa enzyme vaãn khoâng taêng. Veà nguyeân taéc, neáu thôøi gian ngaâm maøng trong dung dòch enzyme caøng laâu thì soá lieân keát giöõa enzyme vaø maøng ñöôïc hình thaønh caøng nhieàu. Ñeán moät luùc naøo ñoù, maøng seõ baõo hoøa enzyme, hoaït tính khoâng taêng nöõa. Ñieàu naøy coù theå giaûi thích nhö sau: Sau khi ñaõ lieân keát vôùi maøng, soá nhoùm -CHO coøn laïi cuûa glutaraldehyde seõ lieân keát vôùi nhöõng nhoùm –NH2 cuûa enzyme. Sau moät khoaûng thôøi gian ngaâm maøng trong dung dòch enzyme, soá nhoùm -CHO cuûa glutaraldehyde seõ khoâng coøn töï do nöõa. Chính vì vaäy neáu thôøi gian ngaâm caøng daøi, cuõng khoâng theå taïo theâm lieân keát giöõa enzyme vaø maøng. Hình 3.6 : Khaûo saùt aûnh höôûng cuûa thôøi gian coá ñònh urease 3.2 Xaùc ñònh hieäu suaát coá ñònh urease treân maøng chitosan baèng lieân keát coäng hoùa trò. Khi coá ñònh enzyme treân moät chaát mang xaùc ñònh, seõ coù moät phaàn nhoû enzyme khoâng coá ñònh ñöôïc leân chaát mang trong quaù trình coá ñònh. Hoaït tính cuûa urease ñöôïc coá ñònh treân chaát mang caøng lôùn thì hieäu quaû coá ñònh cuûa phöông phaùp ñoù seõ caøng cao vaø trieån voïng öùng duïng cuûa phöông phaùp ñoù seõ caøng khaû quan. Chuùng toâi xaùc ñònh hieäu suaát coá ñònh urease döïa treân tæ soá hoaït tính cuûa urease coá ñònh treân maøng vaø hoaït tính cuûa urease töï do ban ñaàu tröôùc khi coá ñònh. Khi coá ñònh enzyme urease treân maøng chitosan baèng lieân keát coäng hoùa trò, hieäu suaát coá ñònh enzyme laø 56,48%. Khi so saùnh hieäu suaát coá ñònh enzyme urease treân maøng chitosan vôùi hieäu suaát coá ñònh enzyme urease treân nhieàu loaïi chaát mang khaùc nhö nylon (hieäu suaát coá ñònh laø 12.11% (Anita vaø coäng söï,1997)) [10] thì hieäu suaát coá ñònh enzyme treân maøng chitosan laø khaù cao. 3.3 Khaûo saùt tính chaát cuûa enzyme urease coá ñònh treân maøng chitosan baèng lieân keát coäng hoùa trò 3.3.1 Khaûo saùt tính chaát ñoäng hoïc cuûa enzyme urease coá ñònh treân maøng chitosan baèng lieân keát coäng hoùa trò Veà maët lyù thuyeát, theo phöông trình ñoäng hoïc Michaelis-Menten, trong moät giôùi haïn noàng ñoä xaùc ñònh, khi taêng noàng ñoä cô chaát thì vaän toác phaûn öùng enzyme seõ taêng, vöôït qua giôùi haïn noàng ñoä ñoù vaän toác phaûn öùng enzyme taêng theâm khoâng ñaùng keå. Hình 3.7: Ñoà thò bieåu dieãn söï bieán ñoåi vaän toác thuûy phaân cuûa urease coá ñònh vaø urease töï do khi thay ñoåi noàng ñoä cô chaát urea Keát quaû thí nghieäm cho thaáy khi taêng noàng ñoä cô chaát trong dung dòch thì vaän toác phaûn öùng thuûy phaân urea baèng enzyme urease coá ñònh vaø enzyme urease töï do ñeàu taêng. Vaän toác phaûn öùng thuûy phaân urea bôûi enzyme urease coá ñònh ñaït giaù trò cöïc ñaïi taïi noàng ñoä urea laø 2.5% (töông ñöông vôùi noàng ñoä urea laø 2.5g/100ml nöôùc). Vaän toác phaûn öùng thuûy phaân bôûi enzyme töï do ñaït cöïc ñaïi taïi noàng ñoä urea laø 2% (töông ñöông vôùi noàng ñoä urea laø 2g/100ml nöôùc). Khi noàng ñoä urea trong dung dòch phaûn öùng lôùn hôn nhöõng giaù trò treân, vaän toác phaûn öùng baét ñaàu giaûm. Hieän töôïng vaän toác phaûn öùng enzyme giaûm khi noàng ñoä cô chaát quaù cao ñöôïc giaûi thích do khi thöøa cô chaát, caùc phaân töû cô chaát coù theå keát hôïp vôùi phöùc enzyme-cô chaát, taïo phöùc chaát khoâng hoaït ñoäng, laøm giaûm hoaït tính cuûa enzyme [15]. Hình 3.8: Ñoà thò bieåu dieãn moái quan heä giöõa 1/V vaø 1/[S] cuûa urease coá ñònh vaø urease töï do. Baûng 3.1: Caùc thoâng soá ñoäng hoïc cuûa urease coá ñònh vaø urease töï do: Urease Vmax (µmol/mg.phuùt) Km (mmol) Coá ñònh 0.446 263.6 Töï do 1.009 88.2 Töø keát quaû thöïc nghieäm thu ñöôïc, chuùng toâi tieán haønh tính toaùn xaùc ñònh giaù trò caùc thoâng soá ñoäng hoïc cuûa phaûn öùng enzyme nhö Km vaø Vmax. Keát quaû thí nghieäm trong baûng 3.1 cho thaáy Km cuûa urease coá ñònh lôùn hôn gaáp 3 laàn so vôùi Km cuûa urease töï do nghóa laø urease töï do coù aùi löïc vôùi cô chaát cao hôn urease coá ñònh. Ñoàng thôøi trong tröôøng hôïp thuûy phaân ure baèng enzyme coá ñònh, vaän toác phaûn öùng ñaït giaù trò cöïc ñaïi thaáp hôn hai laàn so vôùi trong tröôøng hôïp söû duïng enzyme töï do. Nguyeân nhaân cuûa hieän töôïng naøy coù theå laø: Enzyme urease bò thay ñoåi caáu truùc phaân töû khi coá ñònh vaøo maøng, vì vaäy khaû naêng phaân töû cô chaát tieáp caän vôùi trung taâm hoaït ñoäng cuûa enzyme coá ñònh gaëp nhieàu khoù khaên daãn ñeán aùi löïc giöõa cô chaát vaø enzyme giaûm, nghóa laø Km taêng [17]. Do enzyme laø moät protein, coù chöùa nhöõng goác öa nöôùc, keát hôïp vôùi caùc phaân töû nöôùc taïo ra nhöõng lôùp hydrat bao xung quanh nhöõng phaân töû enzyme coá ñònh, daãn ñeán keát quaû laø seõ gaây caûn trôû cho söï tieáp xuùc giöõa enzyme vaø cô chaát. Khi ñoù Km cuõng seõ taêng [17]. Khi enzyme urease bò coá ñònh leân chaát mang, caùc phaân töû cô chaát phaûi maát moät khoaûng thôøi gian ñeå di chuyeån töø moâi tröôøng beân ngoaøi vaøo beân trong maøng ñeå tieáp xuùc vôùi enzyme. Trong khi ñoù, neáu söû duïng enzyme urease töï do ñeå thuûy phaân, caùc phaân töû enzyme ñöôïc phaân boá ñeàu trong dung dòch vaø khaû naêng tieáp xuùc tröïc tieáp vôùi cô chaát cao hôn so vôùi enzyme coá ñònh. Chính vì vaäy maø vaän toác cöïc ñaïi cuûa phaûn öùng thuûy phaân ure trong tröôøng hôïp söû duïng enzyme coá ñònh thaáp hôn trong tröôøng hôïp söû duïng enzyme töï do. Keát quaû thí nghieäm cuûa chuùng toâi töông töï nhö keát quaû nghieân cöùu cuûa nhieàu taùc giaû khaùc nhö: Krajewska vaø coäng söï (1990) nghieân cöùu coá ñònh urease treân chitosan cho thaáy: Km cuûa urease coá ñònh vaø urease töï do laàn löôït laø: 26.4 vaø 5.04 mmol/l, Vmax cuûa urease coá ñònh nhoû hôn 1.5 laàn so vôùi urease töï do [17]. Nghieân cöùu cuûa Hatayama vaø coäng söï (1995) coá ñònh urease baèng phöông phaùp nhoát trong heä sôïi toång hôïp töø cellulose acetate vaø TiO2 cuõng cho thaáy Km cuûa urease coá ñònh coù giaù trò laø 8.10-1mol/lit, cao hôn nhieàu so vôùi Km cuûa urease töï do (coù giaù trò 9,4.10-4 mol/lit), trong khi ñoù, Vmax cuûa urease coá ñònh laø 7,2 .10-5 mol/phuùt/g, thaáp hôn urease töï do (2,7.10-3 mol/phuùt/g) [40]. Nghieân cöùu coá ñònh urease treân caùc chaát mang khaùc nhau nhö hoãn hôïp chitosan – alginate vaø hoãn hôïp poly(acrylamide-co-acrylic acid)/k-carrageenan cuûa Kara vaø coäng söï (2006) cho thaáy: Km cuûa enzyme coá ñònh lôùn hôn enzyme töï do (4.3 mmol vaø 3.30 mmol cuûa enzyme coá ñònh so vôùi 3.03 mmol cuûa enzyme töï do), trong khi ñoù Vmax cuûa enzyme töï do laø 0.0182 mM/phuùt lôùn hôn enzyme coá ñònh laàn löôït laø 0.0104 vaø 0.0099 mM/phuùt [34 ]. 3.3.2 Khaûo saùt aûnh höôûng cuûa nhieät ñoä ñeán enzyme urease coá ñònh treân maøng chitosan baèng lieân keát coäng hoùa trò Cuõng nhö enzyme töï do, nhieät ñoä laø moät yeáu toá aûnh höôûng raát lôùn ñeán hoaït tính cuûa enzyme urease coá ñònh. Nhôø lieân keát vôùi chaát mang maø urease coá ñònh coù khaû naêng chòu ñöôïc nhieät ñoä cao toát hôn so vôùi urease töï do. Keát quaû thí nghieäm trong hình 3.10 cho thaáy khi taêng nhieät ñoä, hoaït tính cuûa enzyme urease coá ñònh taêng vaø ñaït cöïc ñaïi taïi 650C. Trong khi ñoù, hoaït tính cuûa enzyme urease töï do ñaït cöïc ñaïi khi nhieät ñoä laø 600C. Nhö vaäy, nhieät ñoä toái thích cuûa enzyme urease coá ñònh cao hôn nhieät ñoä toái thích cuûa enzyme urease töï do. Neáu tieáp tuïc taêng nhieät ñoä, hoaït tính cuûa enzyme seõ giaûm. Hình 3.9 : Khaûo saùt aûnh höôûng cuûa nhieät ñoä ñeán enzyme coá ñònh vaø enzyme töï do. Nguyeân nhaân cuûa hieän töôïng treân coù theå ñöôïc giaûi thích nhö sau: Ñoái vôùi urease töï do hay urease coá ñònh, khi nhieät ñoä taêng, caùc phaân töû urease vaø cô chaát nhaän ñöôïc naêng löôïng hoaït hoùa cao hôn, do ñoù seõ chuyeån ñoäng nhieàu hôn, khaû naêng tieáp xuùc vôùi nhau toát hôn. Keát quaû laø khaû naêng phaûn öùng cuûa urease seõ cao, hieäu suaát thuûy phaân urea cuõng toát. Tuy nhieân, ñeán moät nhieät ñoä naøo ñoù, enzyme seõ bò bieán tính bôûi taùc duïng cuûa nhieät ñoä neân hoaït tính cuûa enzyme seõ giaûm. Noùi caùch khaùc, khi nhieät ñoä quaù cao, hoaït tính enzyme seõ khoâng taêng nöõa maø baét ñaàu giaûm. Hieän töôïng enzyme bò voâ hoaït bôûi nhieät ñoä cao ñöôïc giaûi thích laø khi taêng nhieät ñoä, caùc nguyeân töû trong phaân töû enzyme tích luõy naêng löôïng vaø baét ñaàu coù xu höôùng chuyeån ñoäng nhanh hôn. Ñeán moät luùc naøo ñoù khi caùc nguyeân töû naøy tích luõy ñuû naêng löôïng, chuùng seõ taùch rôøi ra khoûi phaân töû enzyme, laøm thay ñoåi caáu truùc phaân töû enzyme, laøm cho enzyme maát hoaït tính [15]. Hôn nöõa, ñoái vôùi enzyme töï do, döôùi taùc ñoäng cuûa nhieät ñoä cao, caùc phaân töû enzyme trong dung dòch chuyeån ñoäng nhieät hoãn loaïn, laøm taêng söï va chaïm cuûa caùc phaân töû enzyme vôùi nhau, laøm cho caùc nguyeân töû “hoaït ñoäng” trong phaân töû enzyme caøng deã bò taùch rôøi, hoaït tính cuûa enzyme seõ giaûm nhanh hôn [15]. Nhieät ñoä toái thích cuûa urease coá ñònh cao hôn nhieät ñoä toái thích cuûa urease töï do laø do urease coá ñònh ñöôïc giöõ chaët bôûi maøng neân urease coá ñònh caàn coù naêng löôïng hoaït hoùa cao hôn urease töï do ñeå thöïc hieän phaûn öùng thuûy phaân ure. Ñeå urease coá ñònh ñaït ñöôïc naêng löôïng hoaït hoùa lôùn hôn, caàn phaûi taêng nhieät ñoä cao hôn. [17]. Noùi caùch khaùc nhieät ñoä toái thích cuûa urease coá ñònh cao hôn nhieät ñoä toái thích cuûa urease töï do. Beân caïnh ñoù, vì urease ñöôïc coá ñònh neân urease ñaõ ñöôïc maøng baûo veä, khaû naêng bò bieán tính bôûi nhieät laø khoâng cao neân hieäu suaát thuûy phaân ure seõ toát hôn so vôùi tröôøng hôïp cuûa urease töï do. Khi so saùnh nhieät ñoä toái thích cuûa hai loaïi enzyme urease naøy, keát quaû nghieân cöùu cuûa chuùng toâi cuõng phuø hôïp vôùi caùc nghieân cöùu cuûa nhieàu taùc giaû khaùc nhö: Krajewska vaø coäng söï (1990) nghieân cöùu coá ñònh urease leân maøng chitosan thaáy raèng naêng löôïng hoaït hoùa cuûa urease töï do vaø urease coá ñònh laàn löôït laø 5.71 vaø 7.37 kcal/mol, nhieät ñoä toái thích cuûa urease töï do vaø urease coá ñònh laàn löôït laø 650C vaø 750C [17 ]. Kara vaø coäng söï (2006) nghieân cöùu coá ñònh urease treân caùc chaát mang khaùc nhau nhö hoãn hôïp chitosan – alginate vaø hoãn hôïp poly(acrylamide-co-acrylic acid)/k-carrageenan cuõng keát luaän raèng nhieät ñoä toái thích cuûa urease töï do vaø urease coá ñònh laàn löôït laø 550C vaø 600C [ 34]. Neáu taêng nhieät ñoä vöôït qua nhieät ñoä toái thích cuûa urease coá ñònh, hoaït tính cuûa urease seõ giaûm ñaùng keå, luùc naøy enzyme ñaõ bò bieán tính bôùi nhieät. 3.3.3 Khaûo saùt ñoä beàn nhieät cuûa enzyme urease coá ñònh treân maøng chitosan AÛnh höôûng cuûa nhieät ñoä ñeán hoaït tính cuûa enzyme coù theå theo 2 höôùng: hoaït hoùa vaø voâ hoaït enzyme. Khi taêng nhieät ñoä trong moät giôùi haïn nhaát ñònh, vaän toác phaûn öùng taêng theo hay noùi caùch khaùc laø taêng nhieät ñoä coù theå laøm taêng hoaït tính enzyme. Tuy nhieân, nhieät ñoä cao cuõng laøm hoaït tính enzyme giaûm ñi nhanh choùng. Trong nghieân cöùu naøy, chuùng toâi tieán haønh khaûo saùt khaû naêng beàn vôùi nhieät cuûa enzyme ôû nhieät ñoä laø 550C. Keát quaû thí nghieäm cho thaáy ñoái vôùi enzyme coá ñònh, sau 180 phuùt hoaït tính cuûa enzyme urease coá ñònh coøn 80% so vôùi giaù trò hoaït tính ban ñaàu. Trong khi ñoù, ôû enzyme urease töï do hoaït tính chæ coøn laïi 60%. Hình 3.10: Khaûo saùt ñoä beàn nhieät cuûa enzyme coá ñònh vaø enzyme töï do ôû 550C. Nhö vaäy keát quaû thí nghieäm cho thaáy khi coá ñònh enzyme urease treân maøng chitosan, ñoä beàn nhieät cuûa enzyme coá ñònh cao hôn haún so vôùi enzyme töï do. Urease ñöôïc coá ñònh neân urease ñaõ ñöôïc maøng baûo veä, khaû naêng bò bieán tính bôûi nhieät laø khoâng cao neân möùc ñoä giaûm hoaït tính seõ thaáp hôn so vôùi urease töï do [10]. Beân caïnh ñoù, chuùng toâi cuõng tieán haønh xaùc ñònh haèng soá toác ñoä voâ hoaït enzyme vaø thôøi gian baùn huûy t1/2. Keát quaû tính toaùn töø baûng 3.2 cho thaáy haèng soá toác ñoä voâ hoaït enzyme k cuûa enzyme urease coá ñònh laø 3.10-4 (phuùt)-1 vaø nhoû hôn 3 laàn so vôùi haèng soá toác ñoä voâ hoaït enzyme k cuûa enzyme urease töï do laø 9.10-4 (phuùt)-1. Thôøi gian “baùn huûy” t1/2 cuûa enzyme urease coá ñònh vaø enzyme urease töï do laàn löôït laø 2311 phuùt (38.5 giôø) vaø 771 phuùt (12.9 giôø). Ñieàu ñoù cho thaáy ñoä beàn nhieät cuûa enzyme urease coá ñònh cao hôn haún so vôùi enzyme urease töï do. Baûng 3.2: Keát quaû haèng soá toác ñoä voâ hoaït enzyme k vaø thôøi gian “baùn huûy” t1/2 cuûa enzyme urease coá ñònh vaø enzyme urease töï do ôû 550C. T1/2 (phuùt) K (phuùt)-1 Urease coá ñònh 2311 3.10-4 Urease töï do 771 9.10-4 Nghieân cöùu cuûa chuùng toâi cho keát quaû töông töï keát quaû cuûa caùc taùc giaû khaùc khi khaûo saùt ñoä beàn nhieät cuûa enzyme urease coá ñònh treân caùc chaát mang khaùc: Taùc giaû Krajewska vaø coäng söï (1990), nghieân cöùu coá ñònh urease treân maøng chitosan keát luaän raèng thôøi gian baùn huûy hoaït tính cuûa enzyme coá ñònh vaø enzyme töï do laàn löôït laø 250phuùt vaø 120phuùt [17]. Chen vaø Chiu (1999) nghieân cöùu coá ñònh enzyme urease treân haït chitosan vaø keát luaän raèng thôøi gian baùn huûy hoaït tính cuûa enzyme coá ñònh vaø enzyme töï do laàn löôït laø 175phuùt vaø 70phuùt [48]. 3.3.4 Khaûo saùt aûnh höôûng cuûa pH ñeán enzyme urease coá ñònh treân maøng chitosan baèng lieân keát coäng hoùa trò Trong nghieân cöùu naøy, chuùng toâi thöïc hieän thí nghieäm xaùc ñònh pH toái thích cho enzyme urease coá ñònh. Ñoàng thôøi cuõng tieán haønh maãu ñoái chöùng laø enzyme töï do. Hình 3.11 : Khaûo saùt aûnh höôûng cuûa pH ñeán enzyme coá ñònh vaø enzyme töï do Keát quaû thí nghieäm trong hình 3.9 cho thaáy pH toái thích cuûa enzyme coá ñònh laø pH 6.0, pH toái thích cuûa enzyme töï do laø pH 7.5. pH toái thích cuûa enzyme coá ñònh nhoû hôn pH toái thích cuûa enzyme töï do. Nguyeân nhaân cuûa hieän töôïng treân coù theå giaûi thích nhö sau. Trong cuøng moät dung dòch ñeäm phosphate, seõ coù hai pH aûnh höôûng ñeán hoaït tính cuûa urease coá ñònh. Ñoù laø pH ôû vuøng trung gian giöõa maøng chitosan vaø enzyme coá ñònh vaø pH cuûa dung dòch ñeäm phosphate. Chitosan laø moät polycation (pKa 6.5), mang ñieän tích döông, vì vaäy seõ coù nhieàu ion OH- xung quanh noù. Ñieàu naøy cho thaáy ôû vuøng trung gian giöõa maøng chitosan vaø enzyme coá ñònh seõ coù ít ion H+ hôn so vôùi trong dung dòch ñeäm phosphate, nghóa laø pH ôû vuøng naøy seõ cao hôn so vôùi trong dung dòch ñeäm phosphate [18,19]. Do ñoù, trong hai dung dòch ñeäm phosphate coù cuøng pH, hoaït tính cuûa enzyme coá ñònh seõ ñöôïc ño ôû pH thaáp hôn so vôùi enzyme töï do. Ñeå enzyme ñaït ñöôïc hoaït tính cao nhaát trong dung dòch ñeäm phosphate, pH toái thích cuûa enzyme urease coá ñònh seõ thaáp hôn pH toái thích cuûa enzyme urease töï do. Keát quaû nghieân cöùu cuûa Anita cuøng coäng söï (1997) cuõng phuø hôïp vôùi nhöõng thí nghieäm cuûa chuùng toâi, pH toái thích cuûa enzyme urease coá ñònh treân maøng chitosan cuõng laø 6.0 [10]. 3.3.5 Khaûo saùt khaû naêng taùi söû duïng cuûa ñeán enzyme urease coá ñònh treân maøng chitosan baèng lieân keát coäng hoùa trò Keát quaû thí nghieäm treân hình 3.18 cho thaáy, sau 5 laàn söû duïng, hoaït tính cuûa enzyme coá ñònh thay ñoåi khoâng ñaùng keå. Sau ñoù neâu tieáp thuïc söû duïng hoaït tính enzyme coá ñònh giaûm ñaùng keå. Sau khi söû duïng laàn thöù 6 vaø laàn thöù 7, hoaït tính enzyme coá ñònh coøn laïi laàn löôït laø 80% vaø 25% so vôùi ban ñaàu. Hình 3.12: Khaûo saùt khaû naêng taùi söû duïng cuûa maøng. Nguyeân nhaân coù theå ñöôïc giaûi thích nhö sau: Trong phaûn öùng coù xuùc taùc enzyme, nhôø söï taïo thaønh phöùc hôïp trung gian enzyme - cô chaát maø cô chaát ñöôïc hoaït hoùa. Khi cô chaát keát hôïp vôùi enzyme, do keát quaû cuûa söï cöïc hoùa, söï dòch chuyeån cuûa caùc electron vaø söï bieán daïng cuûa caùc lieân keát tham gia tröïc tieáp vaøo phaûn öùng daãn ñeán laøm thay ñoåi ñoäng naêng cuõng nhö theá naêng cuûa phaân töû cô chaát, keát quaû laøm cho phaân töû cô chaát trôû neân hoaït ñoäng hôn, nhôø ñoù tham gia phaûn öùng deã daøng hôn. Ñieàu ñoù nghóa laø khi coù söï keát hôïp giöõa enzyme – cô chaát, ñaõ hình thaønh caùc lieân keát trong quaù trình phaûn öùng nhö töông taùc tónh ñieän, lieân keát hydro, lieân keát Van der Waals [6]. Beân caïnh ñoù, tröôùc khi bieán ñoåi phöùc naøy thaønh saûn phaåm, ñaõ xaûy ra söï bieán ñoåi cô chaát daãn ñeán söï keùo caêng vaø phaù vôõ caùc lieân keát ñoàng hoùa trò tham gia phaûn öùng laøm aûnh höôûng maïnh ñeán caáu truùc phaân töû enzyme [4]. Nhö vaäy, sau nhieàu laàn söû duïng, caáu truùc cuûa enzyme coá ñònh seõ bò thay ñoåi, hoaït tính cuûa enzyme seõ giaûm. Keát quaû thí nghieäm cuûa chuùng toâi cuõng töông töï vôùi caùc nghieân cöùu cuûa nhieàu taùc giaû khaùc nhö: Krajewska vaø coäng söï (1990) nghieân cöùu coá ñònh urease treân chitosan, khaû naêng taùi söû duïng cuûa urease coá ñònh laø 9 laàn [17]. Keát quaû nghieân cöùu cuûa Anita vaø coäng söï (1997) veà urease coá ñònh treân nylon coù khaû naêng taùi söû suïng laø 5 laàn [10]. 3.3.6 Khaûo saùt ñoä beàn baûo quaûn ñeán enzyme urease coá ñònh treân maøng chitosan baèng lieân keát coäng hoùa trò Trong nghieân cöùu naøy, chuùng toâi tieán haønh khaûo saùt ñoä beàn baûo quaûn cuûa enzyme urease coá ñònh treân maøng chitosan trong nhieàu loaïi dung dòch baûo quaûn khaùc nhau nhö dung dòch ñeäm photphat coù boå sung EDTA 1mM, dung dòch ñeäm photphat khoâng boå sung EDTA, dung dòch muoái NiSO4 vaø oáng thuûy tinh coù chöùa enzyme coá ñònh ñeå khoâ. Maãu ñoái chöùng laø dung dòch enzyme töï do. Hình 3.13: Ñoä beàn baûo quaûn cuûa enzyme urease coá ñònh vaø urease töï do . Keát quaû thí nghieäm trong hình 3.17 cho thaáy sau 3 tuaàn baûo quaûn, möùc ñoä giaûm hoaït tính cuûa dung dòch khoâng boå sung EDTA thaáp nhaát, möùc ñoä giaûm nhieàu nhaát laø dung dòch NiSO4. Dung dòch coù boå sung EDTA maëc duø khoâng toát nhö dung dòch khoâng boå sung EDTA, nhöng coù khaû naêng baûo quaûn toát hôn so vôùi dung dòch enzyme töï do vaø oáng thuûy tinh coù chöùa enzyme coá ñònh ñeå khoâ. Nguyeân nhaân cuûa hieän töôïng naøy coù theå ñöôïc giaûi thích laø: Neáu baûo quaûn enzyme coá ñònh trong moâi tröôøng coù EDTA 1mM, ñieàu naøy cuõng toát. Vì khi ñoù, EDTA seõ “baét” nhöõng ion kim loaïi baèng caùch ion kim loaïi seõ keát hôïp vôùi hai nhoùm –COOH coøn laïi cuûa EDTA, töø ñoù seõ haïn cheá ñöôïc khaû naêng öùc cheá cuûa ion kim loaïi cho söï hoaït ñoäng cuûa enzyme. Coâng thöùc caáu taïo cuûa EDTA-Na2.2H2O Thöïc teá moät ñieàu raèng nöôùc caát chöa hoaøn toaøn loaïi boû ñöôïc taát caû caùc ion kim loaïi. Do ñoù ñeå ñaûm baûo ñoä tin caäy trong taát caû caùc khaûo saùt, chuùng toâi ñaõ baûo quaûn enzyme coá ñònh trong dung dòch coù chöùa EDTA 1mM. Rieâng ñoái vôùi vieäc baûo quaûn trong moâi tröôøng coù Ni2+, ôû ñaây khoâng phaûi dung dòch ñeäm phosphate, vì neáu laø dung dòch phosphate, Ni2+ seõ phaûn öùng vôùi caùc ion phosphate taïo keát tuûa, laøm aûnh höôûng ñaùng keå ñeán keát quaû cuûa thí nghieäm. Moâi tröôøng chæ laø nöôùc caát coù boå sung NiSO4. Neáu noàng ñoä Ni2+ thaáp, ñieàu naøy seõ hoã trôï cho söï hoaït hoùa trung taâm hoaït ñoäng cuûa enzyme cuõng laø Ni2+. Theá nhöng baûo quaûn urease coá ñònh trong moâi tröôøng coù noàng ñoä Ni2+ 1mM, seõ coù taùc duïng gaây öùc cheá enzyme. Keát quaû thí nghieäm cuûa chuùng toâi ñaõ chöùng minh ñieàu naøy laø coù cô sôû. Sau 3 tuaàn baûo quaûn, hoaït tính cuûa enzyme coá ñònh gaàn nhö laø maát hoaøn toaøn. Qua ñoà thò, ñoä beàn baûo quaûn cuûa enzyme cuõng ñaõ thay ñoåi. Sau 15 ngaøy, enzyme töï do ñaõ maát ñi 50% hoaït tính. Trong khi ñoù, enzyme coá ñònh ñöôïc baûo quaûn trong moâi tröôøng ñeäm coù hoaëc khoâng coù EDTA, chæ maát maát khoaûng 30-35% hoaït tính. Ñieàu naøy coù theå giaûi thích nhö sau: Trong quaù trình baûo quaûn enzyme, hoaït tính cuûa enzyme urease töï do vaø coá ñònh ñeàu giaûm daàn theo thôøi gian. Tuy nhieân, vieäc coá ñònh enzyme coù theå giuùp duy trì hoaït tính cuûa enzyme trong thôøi gian daøi hôn. Hieän töôïng giaûm daàn hoaït tính cuûa enzyme urease töï do theo thôøi gian laø do khi toàn taïi trong moâi tröôøng dung dòch, caùc phaân töû enzyme coù theå töông taùc vôùi nhau, phaù vôõ lieân keát yeáu giöõa caùc tieåu ñôn vò hình thaønh neân caáu truùc baäc 4 cuûa phaân töû protein, laøm cho caáu truùc baäc 4 cuûa phaân töû urease bò phaù huûy, enzyme bò voâ hoaït. Khi enzyme ñöôïc coá ñònh treân maøng chitosan, söï coù maët cuûa chaát mang ñaõ giuùp haïn cheá söï töông taùc giöõa caùc phaân töû enzyme vôùi nhau, do ñoù hoaït tính cuûa enzyme giöõ ñöôïc trong thôøi gian daøi hôn. Baûng 3.3: Keát quaû haèng soá toác ñoä voâ hoaït enzyme k vaø thôøi gian “baùn huûy” t1/2 cuûa enzyme urease coá ñònh trong caùc dung dòch baûo quaûn vaø enzyme urease töï do Dung dòch Khoâng EDTA Coù EDTA OÁng thuûy tinh chöùa enzyme coá ñònh ñeå khoâ NiSO4 Enzyme töï do t1/2 (ngaøy) 25.4 26.5 24.1 10.7 23.1 k (ngaøy)-1 2,73.10-2 2,62.10-2 2,88.10-2 6,49.10-2 3.10-2 Keát quaû tính toaùn töø ñoà thò cho thaáy haèng soá toác ñoä voâ hoaït enzyme k cuûa enzyme urease coá ñònh trong caùc dung dòch baûo quaûn (khoâng EDTA vaø coù EDTA), cuûa oáng thuûy tinh chöùa enzyme coá ñònh ñeå khoâ vaø enzyme töï do laø gaàn nhö nhau. Chæ coù tröôøng hôïp baûo quaûn enzyme coá ñònh trong dung dòch NiSO4 haèng soá toác ñoä voâ hoaït enzyme k raát cao, nghóa laø hoaït tính cuûa enzyme coá ñònh seõ giaûm nhanh choùng. Ñieàu naøy hoaøn toaøn phuø hôïp vôùi nhöõng phaân tích cuûa chuùng toâi ôû treân. Keát quaû nghieân cöùu cuûa chuùng toâi töông töï vôùi nhöõng keát luaän cuûa taùc giaû Krajewska vaø coäng söï (1990) khi nghieân cöùu coá ñònh enzyme urease treân chitosan, cho raèng neân baûo quaûn enzyme urease coá ñònh trong dung dòch ñeäm phosphate coù boå sung EDTA 1mM [17]. CHÖÔNG 4: KEÁT LUAÄN VAØ KIEÁN NGHÒ 4.1. Keát luaän Qua quaù trình nghieân cöùu, chuùng toâi thaáy raèng enzyme urease coá ñònh treân maøng chitosan coù moät soá tính chaát nhö sau: Km vaø Vmax cuûa enzyme urease coá ñònh treân maøng chitosan coù giaù trò laàn löôït laø 263.69mmol vaø 0.446 µmol/mg.phuùt. Km vaø Vmax cuûa enzyme urease töï do coù giaù trò laàn löôït laø 88.2 mmol vaø 1,009 µmol/mg.phuùt. Enzyme urease coá ñònh treân maøng chitosan coù hoaït tính thaáp hôn enzyme urease töï do. Tuy nhieân, enzyme urease coá ñònh treân maøng chitosan coù nhieàu öu ñieåm hôn enzyme urease töï do nhö: enzyme urease coá ñònh coù ñoä beàn nhieät cao hôn enzyme töï do, enzyme urease coá ñònh coù theå duy trì hoaït tính cuûa noù trong moät thôøi gian daøi hôn khi baûo quaûn trong nhöõng ñieàu kieän khaùc nhau, enzyme urease coá ñònh coù theå taùi söû duïng nhieàu laàn trong moät thôøi gian daøi. Keát quaû nghieân cöùu cuûa chuùng toâi cho thaáy vieäc öùng duïng enzyme urease coá ñònh treân maøng chitosan vaøo vieäc coá ñònh enzyme urease leân ñieän cöïc laø raát thuaän lôïi. 4.2. Kieán nghò Do haïn cheá veà maët thôøi gian neân trong phaàn nghieân cöùu cuûa chuùng toâi chöa khaûo saùt ñöôïc moät soá vaán ñeá lieân quan ñeán quaù trình coá ñònh enzyme urease coá ñònh treân maøng chitosan. Töø ñoù chuùng toâi ñöa ra moät soá kieán nghò sau: Nghieân cöùu caùc phöông phaùp laøm taêng hieäu suaát coá ñònh enzyme urease treân maøng chitosan. Khaûo saùt noàng ñoä urease toái thích cho coâng taùc coá ñònh. Nghieân cöùu vaø tieán haønh saûn xuaát ñieän cöïc sinh hoïc cuûa enzyme urease ôû qui moâ coâng nghieäp. Nghieân cöùu coá ñònh enzyme urease treân nhieàu loaïi chaát mang khaùc. ÖÙng duïng thöïc teá urease coá ñònh vaøo y hoïc, coâng ngheä sinh hoïc vaø sinh hoaït ñôøi soáng. TAØI LIEÄU THAM KHAÛO Nguyeãn Höõu Chaán. (1983). Enzyme vaø xuùc taùc sinh hoïc. NXB Y hoïc, Haø Noäi. Nguyeãn Thò Tuùy Ñoan. (2005). Nghieân cöùu thu nhaän urease töø ñaäu naønh. Luaän vaên ñaïi hoïc, Ñaïi hoïc baùch Khoa TP.HCM. Nguyeãn Thò Vieät Höông. (1999). Taùch chieát urease töø ñaäu naønh vaø öùng duïng ñeå xaùc ñònh urease trong beänh phaåm. Luaän vaên thaïc só ÑHKHTN TpHCM. Nguyeãn Ñöùc Löôïng. (2004). Coâng ngheä enzyme. NXB Ñaïi hoïc Quoác gia TP.HCM. Nguyeãn Tieán Thaéng. (1998). Giaùo trình sinh hoùa hieän ñaïi. NXB Giaùo duïc, Haø Noäi. Leâ Ngoïc Tuù. (2002). Hoùa Sinh Coâng Nghieäp. NXB Khoa hoïc vaø Kyõ thuaät, Haø Noäi. Nguyeãn Thò Caåm Vi. (2006). Nghieân cöùu thu nhaän, tinh saïch urease töø ñaäu naønh vaø xaùc ñònh caùc thoâng soá ñoäng hoïc cuûa enzyme urease. Luaän vaên thaïc só, Ñaïi hoïc baùch Khoa TP.HCM. A.A.Sedov, A.D.Virnik. (1977). Cellulose acetate fibre containing immobilized urease. J.Biol.Chem,4, 39-40. A.Anita, Sastry C.A. vaø Hashim M.A.. (1997). Immobilization of urease using Amberlite MB-1. Bioprocess Engineering, 17, 355-359. A.Anita, C.A.Sastry & M.A.Hashim. (1997). Urease immobilized on nylon: Preparation and properties. Biocatalysis and Biotransformation, 17, 141-145. A.A.Shul’ga, A.P.Soldatkin & A.V.El’skaya. (1994). Thin-film conductometric biosensors for glucose and urea determination. Biosensors & bioelectronics, 9, 217-223. A.P.Piedade, J.T.Guthrie and A.Kazlauciunas. (1995). Characterization of cellulose derivatives-relevance to sensor development. Cellulose , 2, 243-263. A.P.Soldatkin, V.Volotovsky, C.Martelet. (2000). Improvement of urease based biosensor characteristics using additional layers of charged polymers. Analytica Chimica Acta., 403, pp. 25-29. Aristippos Gennadios. et al. (2000). Protein-based films and coatings. International Book. Bailey James E., Ollis David F. (1986). Biochemical engineering fundamentals 2nd Edition, McGraw-Hill Book Company, United States of America, pp. 86-226. Baolong Liu, Renqi Hu. (1997). Studies on a potentiometric urea biosensor based on an ammonia electrode and urease, immobilized on aluminum oxide matrix. Analytica Chimica Acta., 341, pp. 161-169. Barbara Krajewska, Maciej Leszko & Wieslawa Zaborska. (1990). Urease immobilized on chitosan membrane: Preparation and properties. J.Chem.Tech.Biotechnol., 48, 337-350. Barbara Krajewska & Zofia Piwowarska. (2005). Free vs chitosan-immobilized urease: Microenvironmental effects on enzyme inhibitions. Biocatalysis and Biotransformation, 23, 225-232. Barbara Krajewska. (2000). Chitosan membrane-immobilized urease. Kinetic behavior in phosphate buffer in the pH range 5.76-8.19. Journal of Bioactive and compatible polymers, 15, 155-170. Barna Kovacs, Geza Nagy, Roland Dombi. (2003). Optical biosensor for urea with improved response time. Biosensors & Bioelectronics , 18, 111-118. Boris Lakard, Guillaume Herlem, Sophie Lakard. (2003). Urea potentiometric biosensor based on modified electrodes with urease immobilized on polyethylenimine films. Biosensors and Bioelectronics, 19, 1641-1648. B.D.Mac Craith et al. (1997). Optical chemical sensors based on sol-gel materials: Recent advances and critical issues. Journal of Sol-Gel Science and Technology, 8, 1053-1061. Catarina M.Silva et al. (2006). Microencapsulation of Hemoglobin in chitosan-coated alginate microspheres prepared by emulsifi cation/internal gelation. The AAPS Journal ,7 (4) Article 88, pp.903-914. Chirictian Eppelsheim, Ralph Aubeck. (1995). Comparison of potentiometric enzyme sensors for urea and penicilline-G: differential thick-film sensors versus classical electrodes. Journal of Membrane Science, 100, 131-137. Christine Stamm, Kurt Seiler and Wilhelm Simon. (1993). Enzymatic biosensor for urea based on an ammonium ion-selective bulk optode membrane. Analytica Chimica Acta., 282, 229-237. Claudio Airoldi, Oyrton A.C.Monteiro Junior. (2003). Copper adsorption and enzyme immobilization on organosilane-glutaraldehyde hybrids as support. Polymer bulletin, 50, 61-68 . Cristian Follmer, Rafael Real Guarra, German E.Wasserman. (2004). Jackbean, soybean and Bacillus pasteurii ureases, J.Biochem., 271, 1357-1363 C.M.Lai and M.A.Tabatabai. (1992). Kinetic parameters of immobilized urease. Soil Biol. Biochem., 24, 225-228. Deborah D.McCoy, Robert P.Hausinger. (1991). Characterization of urease from Sporosarcina ureae. Arch Microbiol., 157, 411-416. Dezhong Liu et al. (1996). Study on the urease activity in different plant seeds and clinical analysis of urea in human body fluids by a surface acoustic wave enzyme sensor system. J Anal Chem., 354, 114-117. D.Mahnin, S.Dumitru, and E.Chornet. (2003). Immobilization of Enzymes into a polyinoic hydrogel: Chitosan. Journal of Bioactive and compatible polimers, 18, 355-373. D.M.Ivnitskii and J.Rishpon. (1993). Biosensor based on direct detection of membrane potential induced by immobilized hydrolytic enzymes. Analytica Chimica Acta., 282, 517-525. E.Hab Taqieddin and Carolyn Lee. (2002). Perm-Selective chitosan-algenate hydrid microcapsules for enzyme immobilization Technology. The official journal ISPE, vol 22, pp.1-3. Filiz Kara-Gokhan Demirel-Hayrettin Tumturk. (2006). Immobilization of urease by using chitosan-alginate and poly(acrylamide-co-acrylic acid)/κ-carrageenan supports. Bioprocess Biosyst Eng., 29, 207–211. Filiz Kuralay, Haluk Ozyoruk, Attila Yildiz. (2006). Amperometric enzyme electrode for urea determination using immobilized urease in poly(vinylferrocenium) film. Sensors and Actuators B, 114, 500-506. Filiz Kuralay, Attila Yildiz. (2007). Inhibitive determination of Hg2+ ion by an amperometric urea biosensor using poly(vinylferrocenium) film. Enzyme and Microbial Technology, 40, 1156-1159. Fishbein W. (1969). Urease Catalysis. The journal of Biological Chemistry, 224, 1188-1193. Francesco Musiani et al. (2001). Structure-based computational study of the catalytic and inhibition mechanisms of urease. J Biol Inorg Chem., 6, 300-314. G.A.Zhylyak, S.V.Dzyadevich. (1995). Application of urease conductometric biosensor for heavy metal ion determination. Sensors and Actuators B, 21-25, 145-148. Hiroyuki Hatayama, Taku Swabe. ( 1995). Immobilization of urease on composite fibre by using a gel formation of Cellulose Acetate and Titanium Iso-Propoxide. Journal of Sol-Gel Science and Technology, 7, 13-17. Ioulia G. Mourzina et al. (2003). Immobilization of urease and cholinesterase on the surface of semiconductor transducer for the development of light-addressable potentiometric sensors. Microchim. Acta., 144, 41–50. Izumi Kubo, Isao Karube. (1986). Modified polimer for enzyme immobilization and characterization of immobilized urease, Analytical letters, 19(5&6), pp.667-680. John Murry. (1997). Cell and Enzyme Immobilisation, Microorganisms and Biotechnology, pp.215-222. John Frederick Barrett. (1935). CCXC.A modified Nessler’s reagent for the micro-determination of urea in Tungstic acid blood filtrate, pp.2442-2246. Joseph C. vaø Evelyn A. (1979). Comparions of soybean urease isolated from seed and tissue. The Journal of Biological Chemistry, 254, 1707–1715. Jose P. Joseph. (1984). A Miniature Enzyme Electrode Sensitive to Urea. Mikrochimica Acta., 2, 473-479. Julia M.C.S.Magalhaes, Adelio A.S.C.Machado. (1998). Urea potentiometric biosensor based on urease immobilized on chitosan membranes. Talanta,47,pp.183-191. J.P.Chen vaø S.H.Chiu. (1999). Preparation and characterization of urease immobilized onto porous chitosan beads for urea hydrolysis. Bioprocess Engineering, 21, pp.323-330. Katva Gabrovska et al. (2007). Poly(acrylonitrile)chitosan composite membranes for urease immobilization. Journal of Biotechnology, 129,pp.674-680. Kazumori Yamada, Mitsuo Hirata. (2006). Retention pf Activity of urease immobilized on grafted polumer films. Journal of Applied polymer science, vol.102, pp.4886-4896. K.Ravi Charan Reddy, Arvind M.Kayastha. (2006). Improved stability of urease upon coupling to alkylamine and arylamine glass and its analytical use. Enzymatic, 38,pp.104-112. L.M.Lechuga, G.Mier, A.Calle. (1994). Urea biosensor based on ammonia gas-sensitive Pt/GaAs. Sensors and Actuators , B 21, pp.205-208. L.P.Melnik, M.N.Molodenkov, O.A.Mashkov. (1976). Investigation of the possible use immobilized urease for decomposing urea in blood plasma, Sensors and Actuators, pp.312-315. Manayath Damodaran and Palghat Manuvadhyar Sivaramakrishnan. (1937). New sources of urease for determination of urea, Biosensors & bioelectronics,6, pp.85-91. Miroslav Stredansky, Andrea Pizzariello. (2000). Amperometric pH-sensing biosensor for urea, penicillin, and oxalacetate, Sensors and Actuators , pp.151-157. Mustafa Teke, Mustafa Kernal Sezgintuik, Azmi Telefoncu. (2007). A bio-imprinted urease biosensor: Improved thermal and operatical stabilities, Analytica Chimica Acta, pp.67-88. M.Battilotti, C.Colapicchioni, I.Giannini and F.Porcelli. (1989). Characterization of biosensors based on membranes containing a conducting polymer, Analytica Chimica Acta, 221, pp.157-161. M.H.Gil & P.Piedade, S.Alegret, J.Alonso. (1992). Covalent binding of urease on ammonium-selective potentiometric membranes, Biosensors & bioelectronics, 7, pp.645-652. M.L.Hamlaoui, K.Reybier. (2002). Development of a urea bisensor based on a polymeric membrane including zeolite, Biosensors & bioelectronics,9, pp. 39-45. M. Srinivasa Rao, M. Chellapandian,V. Krishnan. (I995). Immobilization of urease on gelatin - poly (HEMA) copolymer: Preparation and characterization Bioprocess Engineering 13, 211-214. Nilanjana Das, Prakash Prabhakar. (1997). Enzyme entrapped inside the reversed micelle in the fabrication of a new urea sensor, Biotechnol Bioeng,54, pp.329-332,. N.F.Olson and Richardson. (1974). Symposium: Immobilized enzymes in food processing and analysis. Journal of Food Science, 39, pp. 653-660. N.Tinkilic,O.Cubuk. (2002). Glucose and urea biosensors based on all solid-state PVC-NH2 membrane electrodes. Analytica Chimica Acta ,452, pp.29-34. O.A. Boubriak. (1995). Determination of urea in blood serum by a urease biosensorb based on an ion-sensitive field-effect transistor. Sensors and Actuators B, 26-27, 429-431. Pier Giorgio Pietta et al. (1997). Assay of urea by immobilized urease coupled to a differential pH-meter. Biotechnology and Bioinstrumentation, pp.257-264. P.Bertocci & D.Compagnone. (1996). Amperometric ammonium ion and urea determination with enzyme based probes. Biomaterials, pp.213-221 P.C.Pandey et al. (1999). A new solid state pH sensor and its application in the construction of all solid state urea biosensor, Biosensors & bioelectronics, 9, pp.89-95. Rachana Sahney et al. (2006). A comparative study of immobilization techniques for urease onglass-pH-electrode and its application in urea detection inblood serum. Analytica Chimica Acta., 578, 156-161. Rajesh, Vandana Bisht, Wataru Takashima. (2005). An Amperometric urea biosensor based on covalent immobilization of urease onto an electrochemically prepared copolymer poly(N-3-aminopropyl pyrrole-co-pyrrole) film. Biomaterials, 26, pp.3683-3690. Robert Koncki, Gerhard J.Mohr & Otto S.Wolfbeis. (1995). Enzyme biosensor for urea based on a novel pH bulk optode membrane. Biosensors & bioelectronics ,10, pp.653-659. Robert Koncki, Piotr Leszczyfiski. (1992). Urea sensors based on glass pH electrodes with physically immobilized urease. Analytica Chemica Acta, 257, pp.67-72. R.Ilanggovan, D.Daniel, C.Zachariah. (2006). Enzyme based biosensor for heavy metal ions determination. Analytica Chemica Acta,159, pp. 184-190. R.Schiiler, M.W.ittkampf and G.C.Chemnitius. (1999). Modified gas-permeable silicone rubber membranes for covalent immobilisation of enzymes and their use in biosensor development. Biomaterials,25, pp.654-662. Sang-Mok Lee and Won-Yong Lee. (2002). Determination of heavy metal ions using conductometric biosensors based on sol-gel-immobilixed urease, Chem.Soc,23,pp.1169-1173. Sevdalina Turmanova, Tzonka Godjevargova vaø Nastia Vasileva. (2005). Immobilization of urease on cation-exchange membranes prepared by radiation-initiated graft copolymerization of acrylic acid on polyethene thin films. Polymer Bulletin, 55, 467–475. Sibel Sungur, Murat Elçin vaø Ural Akbulut. (1992). Immobilization of urease into carboxymethylcellulose. Journal of Macromolecular Science A, 29, 251-265. Sumner J.B.. (1932). The isolation and crystallization of the enzyme urease, Ithaca, 316 – 325. S.Bolal Butt and Karl Cammann. (1992). Enzyme urea biosensor based on a modified potentiometric PVC-Nonactin membrane electrode for assay of urea in blood. Analytical letters, 25(9), pp.1597-1615. S.George et al. (1996). Flow rate dependent kinetics of urease immobilized onto diverse matrices,Bioprocess Engineering, 15, pp.311-315. S.Milardovic, I.Kruhak, vaø B.S.Grabaric. (1999). Urea determination in FIA mode by a newly designed urease-based biosensor. LRA, 11, 266–271. S.Rejikumar, Surekha Devi. (1998). Preparation and characterization of urease bound on crosslinked poly(vinyl alcohol). Journal of Molecular Catalysis B: Enzyme , 4, pp 61-66. S.Zamponi, B.Lo.Cicero, M.Mascini. (1996). Urea solid-state biosensor suitable for continuous dialysis control. Talanta , 43, pp.1373-1377. Tadeusz Krawczynski vel Krawczyk, Marek Trojanowicz. (2000). Inhibitive determination of mercury and other metal ions by potentiometric urea biosensor. Biosensors & bioelectronics, 15, pp.681-691. Thomas Jahns. (1995). Purification and properties of urease from Sporobolomyces roseus. Antonie van Leeuwenhoek ,68, pp.209-214 . Timothy D.Rhines and M..A.Arnold. (1999). Fiber-optic biosensor for urea based on sensing of ammonia gas. Analytica Chimica Acta 227, pp.387-396. Udo Klaus Schafer, Heinrich Kaltwasser. (1994). Urease from Staphylococcus saprophyticus: Purification, characterization and comparison to Staphylococcus xylosus urease. Arch Microbiol, 161, pp.393-399. U.Bilitewski, W.Drewes and R.D.Schimid. (1992). Thick film biosensors for urea, Project group biosensors, Braunschweig (FRG). Sensors and Actuators B,7, pp.321-326. Venkataraman Ranganathan and Ballapinni Nanjunda Sastri. (1936). Conductometric method for the micro-determination of urea. Biosensors & bioelectronics,26, pp.2135-2140. Viatcheslav Volotovsky, Namsoo Kim. (1997). Urease-based biosensor for mercuric ions determination. Sensors and Actuators B 42 , pp.233-237. Won-Yong Lee et al. (2000). Microfabricated Conductometric Urea BiosensorBased on Sol-Gel Immobilized Urease. Electroanalysis, 12, 78-82. Xiangfang Xie, Ahmad A. Suleiman and George G.Guilbault. (2007). A urea fiber optic biosensor based on absorption measurement. Biosensors & bioelectronics,8, pp. 728-735. Yingjie Qin and Joaquim M.S.Cabral. (2002). Review Properties and Applications of Urease. Biocatalysis and Biotransformation,20(1).pp.1-14. Yukitaka Yamamoto. (1995). Amperometric ammonium ion sensor and its application to biosensors. Biosensors & bioelectronics, pp.57-60. PHUÏ LUÏC Ñònh löôïng protein baèng phöông phaùp Bradford. Phöông phaùp döïa vaøo söï thay ñoåi maøu khi cho Coomassie Brilliant Blue-G250 lieân keát vôùi protein trong moâi tröôøng acid. Thuoác nhuoäm naøy seõ taïo caùc lieân keát vôùi protein, töông taùc vôùi caùc nhoùm mang ñieän döông treân phaân töû protein thaønh moät phöùc chaát coù maøu xanh, coù ñoä haáp thu cöïc ñaïi ôû böôùc soùng 595nm. Cöôøng ñoä maøu naøy tæ leä thuaän vôùi haøm löôïng protein, neân baèng phöông phaùp so maøu ta coù theå xaùc ñònh ñöôïc haøm löôïng protein. Hình 3.14: Minh hoïa phaûn öùng cuûa protein vaø Coomassie Brilliant Blue-G250 Hoùa chaát: Dung dòch protein : dung dòch albumin loøng traéng tröùng 0.1mg/ml. Dung dòch thuoác thöû Bradford goác coù thaønh phaàn nhö sau: Coomassie Brilliant Blue-G250: 105 mg. Ethanol 95% : 30ml. Acid phosphoric 85% : 60ml Coomassie Brilliant Blue-G250 ñöôïc hoøa tan trong ethanol, boå sung acid phosphoric, roài loïc. Sau ñoù ruùt ra 30ml töø hoãn hôïp treân cho vaøo bình ñònh möùc 500ml, theâm vaøo 425ml nöôùc caát, 15ml ethanol 95%, 30ml phosphoric acid 85%. Cho vaøo chai toái, giöõ ôû 40C. Dung dòch maãu enzyme urease ñeå xaùc ñònh haøm löôïng protein. Dung dòch ñeäm phosphate 1/15 M, pH 5.6 coù EDTA noàng ñoä 10 mM. Tieán haønh : Huùt 0.1ml dung dòch protein vaøo oáng nghieäm, sau ñoù boå sung theâm 1ml thuoác thöû Bradford, ñeå phaûn öùng trong 2 phuùt. Ño maät ñoä quang cuûa maãu thí nghieäm ODTN vaø maãu traéng ODT (nöôùc caát) ôû böôùc soùng 595nm treân maùy UV-Vis. Tính : ∆OD = ODTN – ODT Döïa vaøo ñöôøng chuaån albumin, suy ra haøm löôïng protein coù trong dung dòch. Döïng ñöôøng chuaån : Laáy 6 oáng nghieäm ñaùnh soá töø ñaùnh soá thöù töï töø 0 ñeán 5. Cho vaøo moãi oáng ngheäm caùc dung dòch theo trình töï sau: Baûng 3.4: Daõy oáng nghieäm ñeå thieát laäp ñöôøng chuaån protein OÁng nghieäm soá 0 1 2 3 4 5 Dung dòch albumin 0.1 mg/ml (μl) 0 40 80 120 160 200 Dung dòch ñeäm (μl) 400 360 320 280 240 200 Thuoác thöû Bradford (ml) 2 2 2 2 2 2 Löôïng protein (μg) 0 4 8 12 16 20 Ñeå maãu phaûn öùng trong 2 phuùt cho thuoác thöû baét maøu vaø oån ñònh, sau ñoù ño maät ñoä quang ôû böôùc soùng 595nm. Veõ ñöôøng chuaån protein vôùi truïc tung laø maät ñoä quang (A), truïc hoaønh laø haøm löôïng albumin. Xaùc ñònh haøm löôïng protein : Troän ñeàu maãu roài huùt 0.4 ml cho vaøo oáng nghieäm, boå sung 2 ml thuoác thöû Bradford, ñôïi 2 phuùt sau ñem ño ñoä haáp thu ôû böôùc soùng 595 nm. Maãu traéng: thay 0.4 ml dung dòch maãu baèng 0.4 ml dung dòch ñeäm phosphate. Döïa vaøo ñöôøng chuaån, ta tính ñöôïc löôïng protein trong maãu. Döïa vaøo phöông trình ñöôøng chuaån protein theo phöông phaùp Bradford y=ax+b, chuùng toâi xaùc ñònh haøm löôïng protein : P= µgPro/mg boät. Giaûi trình caùc keát quaû tính toaùn Trong pham vi luaän vaên, hieäu suaát coá ñònh enzyme urease vaø hoaït tính urease xaùc ñònh nhôø phöông phaùp Bradford vaø Nessler. Hình 3.15: Ñoà thò bieåu dieãn ñöôøng chuaån NH3 Phöông trình ñöôøng chuaån NH3: Y=0.0132x-0.0114 Hình 3.18: Ñoà thò bieåu dieãn ñöôøng chuaån protein. Phöông trình ñöôøng chuaån protein: Y=0.0135+0.0082 Hoaït tính enzyme urease töï do ban ñaàu: = 4.712 U/mgboät. Hoaït tính enzyme urease sau coá ñònh: =2.703 U/mgboät. Heä soá chuyeån ñoåi hoaït tính: Haøm löôïng protein coøn laïi trong dung dòch sau coá ñònh: = 6.567 µgprotein/mgboät Haøm löôïng protein coù trong dung dòch tröôùc coá ñònh: =9.716 µgprotein/mgboät. Haøm löôïng protein ñaõ ñöôïc coá ñònh leân maøng: P= P2 – P1 = 3.148 µgprotein/mgboät. Hieäu suaát coá ñònh urease: Baûng 3.5: Keát quaû xaùc ñònh vaän toác thuûy phaân ure cuûa urease töï do [S] mmol [V] (µmol/mg.phuùt) 1/[S] (mmol)-1 1/[V] (µmol/mg.phuùt)-1 41.67 0.314 0.024 3.181 83.33 0.552 0.012 1.812 166.67 0.655 0.006 1.527 250 0.710 0.004 1.408 333.33 0.764 0.003 1.309 Baûng 3.6: Keát quaû xaùc ñònh vaän toác thuûy phaân ure cuûa urease coá ñònh [S] mmol [V] (µmol/mg.phuùt) 1/[S] (mmol)-1 1/[V] (µmol/mg.phuùt)-1 83.33 0.108 0.012 9.223 166.67 0.163 0.006 6.151 250 0.222 0.004 4.499 333.33 0.258 0.003 3.871 Hình 3.17: Ñoà thò bieåu dieãn söï thay ñoåi haøm log(hoaït tính enzyme urease) theo thôøi gian cuûa enzyme urease töï do vaø urease coá ñònh treân maøng chitosan ôû 550C Hình 3.18: Ñoà thò bieåu dieãn söï thay ñoåi haøm log(hoaït tính urease) theo thôøi gian cuûa enzyme urease coá ñònh trong caùc dung dòch baûo quaûn vaø enzyme urease töï do.