Luận văn Nghiên cứu ứng dụng chế phẩm enzyme để sản xuất các gia vị tự nhiên từ sinh khối nấm men saccharomyces cereviae

aáp, treû em chaäm lôùn, deã maãn caûm vôùi beänh taät… Chaát löôïng protein ñöôïc ñaùnh giaù treân moät soá chæ tieâu sau: 1) PER (protein efficiency ratio) ñöôïc tính baèng tæ leä taêng troïng nhaän ñöôïc (g) thöû treân chuoät treân löôïng (g) protein söû duïng, theo coâng thöùc: 2) PV (biological valance): % nitô ñöôïc haáp thuï vaø coá ñònh trong cô theå chæ soá naøy phaûn aùnh caân baèng acid amin khoâng thay theá qua söï tieâu hoùa protein ñöôïc haáp thuï. 3) NPU (net protein utilisation): % protein (hoaëc nitô) ñöa vaøo ñöôïc coá ñònh trong cô theå Taêng troïng nhaän ñöôïc (g) PER= ---------------------------------------- Khoái löôïng protein söû duïng (g) Protein cô theå – Protein cô theå (vôùi cheá ñoä aên khoâng protein) NPU=------------------------------------------------------------------------- x 100% Protein ñöa vaøo Urea-N (cheá ñoä aên khoâng protein)+N caân baèng PV=------------------------------------------------------------- x 100% N ñöa vaøo Phần 1:Tổng quan tài lieäu CBHD Tiến sĩ Hoaøng Quoác Khaùnh Hoïc vieân Hoaøng Thuïy Phöông Linh 11 Baûng1.4 Giaù trò sinh hoïc cuûa moät soá protein thöïc phaåm Giaù trò sinh hoïcNguoàn Protein PV NPU PER Thieáu Acid amin Tröùng gaø 94 93 3,9 Söõa boø 84 81 3,1 Met Caù 76 80 3,5 Thr Thòt boø 74 67 2,3 Met Khoai taây 73 60 2,6 Met Ñaäu naønh 73 61 2,3 Met Gaïo 64 57 2,2 Lys, Tyr Ñaäu 58 38 1,5 Met Boät mì 52 57 0,6 Lys, Thr 1.1.9 Caùc nucleotide taïo höông vò * GMP Guanosine 5’monophosphate, coøn goïi laø 5'-guanidylic acid hoaëc guanylic acid vaø ñöôïc vieát taéc laø GMP, laø moät nucleotide ñöôïc tìm thaáy trong RNA. Noù laø ester cuûa phosphoric acid vôùi nucleoside guanosine. GMP chöùa nhoùm phosphate, ñöôøng pentose ribose, vaø nucleobase guanine. Guanosine monophosphate thöôøng ñöôïc saûn xuaát töø caù khoâ hoaëc thuûy saûn nöôùc ngoït phôi khoâ. Caùc loaïi muoái cuûa guanosine monophosphate nhö disodium guanylate (E627), dipotassium guanylate (E628) vaø calcium guanylate (E629), laø nhöõng chaát boå sung vaøo thöïc phaåm söû duïng nhö caùc chaát gia taêng muøi thôm. Noù thöôøng ñöôïc söû duïng ñeå gia taêng höông vò cuøng vôùi glutamic acid (monosodium Phần 1:Tổng quan tài lieäu CBHD Tiến sĩ Hoaøng Quoác Khaùnh Hoïc vieân Hoaøng Thuïy Phöông Linh 12 glutamate, MSG). Vì giaù thaønh hôi cao hôn moät chuùt, neân GMPõ ít ñöôïc söû duïng phoå bieán nhö glutamic acid. Disodium guanylate thöôøng ñöôïc theâm vaøo thöùc aên keát hôïp vôùi disodium inosinate; taïo thaønh phöùc disodium 5'-ribonucleotides. Disodium guanylate hay ñöôïc boå sung vaøo mì aên lieàn, vaåûy khoai taây, caùc loaïi snack, gaïo thôm, rau quaû ñoùng hoäp vaø nöôùc soup ñoùng hoäp. Hình 1.1 Caáu truùc phaân töû cuûa Guanosine Monophosphate * AMP Adenosine monophosphate (AMP), hay coøn goïi laø 5'-adenylic acid, laø nucleotide ñöôïc tìm thaáy trong RNA. Noù laø ester cuûa phosphoric acid vaø nucleoside adenosine. AMP chöùa moät phosphate, ñöôøng ribose, vaø nucleobase adenine. AMP coù theå ñöôïc taïo ra trong quaù trình sinh toång hôïp ATP bôûi enzyme adenylate kinase baèng caùch keát hôïp 2 phaân töû ADP : Phần 1:Tổng quan tài lieäu CBHD Tiến sĩ Hoaøng Quoác Khaùnh Hoïc vieân Hoaøng Thuïy Phöông Linh 13 2 ADP → ATP + AMP Hoaëc AMP coù theå ñöôïc saûn xuaát baèng caùch thuûy phaân moät lieân keát cao naêng cuûa ADP: ADP → AMP + Pi AMP cuõng coù theå ñöôïc taïo thaønh baèng phaûn öùng thuûy phaân ATP thaønh AMP vaø pyrophosphate: ATP → AMP + PPi Khi RNA bò phaân huûy trong caùc quaù trình soáng taïo caùc nucleoside monophosphates, trong ñoù coù adenosine monophosphate. AMP coù theå chuyeån hoùa thaønh IMP bôûi enzyme myoadenylate deaminase, giaûi phoùng moät nhoùm amonia. Trong quaù trình dò hoùa, adenosine monophosphate coù theå chuyeån hoùa thaønh uric acid vaø ñöôïc ñaøo thaûi ra khoûi cô theå. Hình 1.2 Caáu truùc phaân töû cuûa Adenosine Monophosphate Phần 1:Tổng quan tài lieäu CBHD Tiến sĩ Hoaøng Quoác Khaùnh Hoïc vieân Hoaøng Thuïy Phöông Linh 14 * IMP Inosine 5’ monophosphate (IMP) hay Inosinic acid laø moät nucleoside monophosphate. IMP laø moät thaønh phaàn quan troïng trong quaù trình trao ñoåi chaát. Noù laø ribonucleotide cuûa hypoxanthine vaø laø nucleotide ñaàu tieân ñöôïc taïo thaønh trong quaù trình sinh toång hôïp purine. IMP ñöôïc taïo thaønh baèng caùch deamin hoùa adenosine 5’monophosphate, vaø ñöôïc thuûy phaân thaønh inosine. Trong coâng nghieäp thöïc phaåm, inosinic acid vaø caùc hôïp chaát daãn xuaát cuûa noù nhö disodium inosinate ñöôïc söû duïng nhö caùc chaát gia taêng höông vò. Hình 1.3 Caáu truùc phaân töû cuûa Inosine Monophosphate 1.2 KHAÙI QUAÙT CHUNG VEÀ ENZYME [2] 1.2.1 Ñònh nghóa Trong caùc phaûn öùng hoùa hoïc, neáu ta cho theâm vaøo phaûn öùng moät chaát naøo ñoù phaûn öùng seõ xaûy ra vôùi toác ñoä taêng haøng chuïc laàn. Chaát cho theâm vaøo naøy ñöôïc goïi laø chaát xuùc taùc. Phần 1:Tổng quan tài lieäu CBHD Tiến sĩ Hoaøng Quoác Khaùnh Hoïc vieân Hoaøng Thuïy Phöông Linh 15 Chaát xuùc taùc hoùa hoïc coù hai ñaëc ñieåm quan troïng. 1- Laøm taêng phaûn öùng hoùa hoïc. 2- Baûn thaân chaát xuùc taùc khoâng coù söï thay ñoåi naøo sau phaûn öùng. Trong caùc phaûn öùng sinh hoïc (caùc phaûn öùng xaûy ra trong cô theå sinh vaät) cuõng coù chaát laøm taêng caùc phaûn öùng, chaát ñoù ñöôïc goïi laø enzyme. Chöõ enzyme ñöôïc baét nguoàn töø tieáng Hy Laïp coù nghóa laø chaát trong naáu men. Enzyme ñöôïc caùc cô theå sinh vaät sinh toång hôïp neân vaø tham gia caùc phaûn öùng hoùa hoïc trong cô theå. Enzyme laø moät chaát höõu cô, trong khi ñoù caùc chaát xuùc taùc hoùa hoïc thöôøng laø chaát voâ cô. Sau naøy, caùc nhaø khoa hoïc xaùc ñònh chuùng laø protein. Nhö vaäy enzyme laø moät protein coù khaû naêng tham gia xuùc taùc caùc phaûn öùng hoùa hoïc trong vaø ngoaøi cô theå. Ñieåm raát ñaëc bieät cuûa enzyme laø chuùng hoaït ñoäng trong ñieàu kieän nhieät ñoä oân hoøa gioáng nhö nhieät ñoä oân hoøa cuûa cô theå sinh vaät. Trong khi ñoù, caùc chaát hoùa hoïc caàn phaûi coù nhieät ñoä caàn thieát cho phaûn öùng. Nhieät ñoä caøng cao, toác ñoä phaûn öùng xuùc taùc hoùa hoïc caøng cao. Öu ñieåm cô baûn cuûa enzyme khi tham gia caùc phaûn öùng sinh hoùa coù theå toùm taét nhö sau: 1- Enzyme coù theå tham gia haøng loaït caùc phaûn öùng trong chuoãi phaûn öùng sinh hoùa ñeå giaûi phoùng hoaøn toaøn naêng löôïng hoùa hoïc coù trong vaät chaát. 2- Enzyme coù theå tham gia nhöõng phaûn öùng ñoäc laäp nhôø khaû naêng chuyeån hoùa raát cao. 3- Enzyme coù theå taïo ra nhöõng phaûn öùng daây chuyeàn. Khi coù saûn phaåm phaûn öùng ñaàu seõ laø nguyeân lieäu hay cô chaát cho nhöõng phaûn öùng tieáp theo. 4- Trong caùc phaûn öùng enzyme, söï tieâu hoa naêng löôïng thöôøng raát ít. Phần 1:Tổng quan tài lieäu CBHD Tiến sĩ Hoaøng Quoác Khaùnh Hoïc vieân Hoaøng Thuïy Phöông Linh 16 5- Enzyme luoân luoân ñöôïc toång hôïp trong teá baøo cuûa sinh vaät. Soá löôïng enzyme ñöôïc toång hôïp raát lôùn vaø luoân luoân töông öùng vôùi soá löôïng caùc phaûn öùng xaûy ra trong cô theå. Caùc phaûn öùng xaûy ra trong cô theå luoân luoân coù söï tham gia xuùc taùc bôûi enzyme. 6- Thoâng thöôøng enzyme khoâng bò maát ñi sau phaûn öùng. Ngaøy nay, caùc nhaø khoa hoïc ñaõ tìm ra treân 1.000 loaïi enzyme khaùc nhau coù trong teá baøo sinh vaät, soá löôïng naøy laø raát nhoû so vôùi soá löôïng coù thaät trong moãi teá baøo. Trong hôn 1.000 loaïi enzyme ñaõ bieát, loaøi ngöôøi môùi thu nhaän vaø keát tinh ñöôïc khoaûng 200 loaïi. 1.2.2 Caùc yeáu toá aûnh höôûng ñeán hoaït tính enzyme * AÛnh höôûng cuûa noàng ñoä cô chaát ñeán hoaït tính Enzyme Cô cheá taùc ñoäng cuûa enzyme vaøo cô chaát qua 3 giai ñoaïn: Giai ñoaïn 1: Enzyme töông taùc vôùi cô chaát taïo thaønh phöùc enzyme – cô chaát ES. Giai ñoaïn 2: Phöùc Enzyme – cô chaát seõ ñöôïc taùch ra. Giai ñoaïn 3: Enzyme seõ ñöôïc giaûi phoùng, cô chaát seõ chuyeån thaønh saûn phaåm . Nhö vaäy ôû giai ñoaïn ñaàu, neáu cô chaát coù noàng ñoä thaáp thì toác ñoä phaûn öùng enzyme seõ phuï thuoäc tuyeán tính vôùi noàng ñoä cô chaát. Trong giai ñoaïn ñaàu khi noàng ñoä cô chaát taêng, toác ñoä phaûn öùng seõ taêng. Nhöng khi toác ñoä phaûn öùng ñaït cöïc ñaïi, cho duø ta coù taêng noàng ñoä cô chaát, toác ñoä phaûn öùng cuõng seõ hoaøn toaøn khoâng coù khaû naêng taêng theo. * AÛnh höôûng cuûa nhieät ñoä ñeán hoaït tính enzyme Trong caùc phaûn öùng hoùa hoïc, nhieät ñoä caøng taêng, toác ñoä phaûn öùng xuùc taùc caøng taêng. Trong phaûn öùng sinh hoïc, nhieät ñoä taêng, khaû naêng xuùc taùc cuûa enzyme seõ taêng. Phần 1:Tổng quan tài lieäu CBHD Tiến sĩ Hoaøng Quoác Khaùnh Hoïc vieân Hoaøng Thuïy Phöông Linh 17 Nhöng khaû naêng taêng cuûa toác ñoä phaûn öùng coù moät giôùi haïn nhaát ñònh, quaù giôùi haïn nhieät ñoä ñoù, phaûn öùng enzyme seõ giaûm vaø giaûm raát nhanh. Hieän töôïng ñaëc bieät naøy ôû enzyme coù lieân quan ñeán baûn chaát hoùa hoïc cuûa enzyme. Caùc enzyme laø nhöõng protein, thöôøng khoâng beàn nhieät, tröôøng hôïp ta taêng nhieät ñoä trong giai ñoaïn ñaàu cuûa phaûn öùng enzyme seõ laøm taêng khaû naêng taïo caáu truùc khoâng gian cuûa enzyme cho phuø hôïp vôùi caáu truùc khoâng gian cuûa cô chaát. Khi vöôït quaù giôùi haïn veà nhieät ñoä, caáu truùc khoâng gian cuûa trung taâm hoaït ñoäng trong enzyme khoâng coøn phuø hôïp vôùi caáu truùc khoâng gian cuûa cô chaát nöõa, khi ñoù hoaït tính enzyme seõ maát daàn vaø ñi ñeán trieät tieâu. Vì vaäy, trong kyõ thuaät ngöôøi ta thöôøng duøng nhieät ñoä nhö moät bieän phaùp laøm taêng khaû naêng hoaït ñoäng cuûa enzyme. Bieän phaùp naøy thöôøng raát coù yù nghóa caû trong baûo quaûn vaø trong cheá bieán thöïc phaåm. * AÛnh höôûng cuûa pH ñeán hoaït tính enzyme Trong nhöõng thí nghieäm nghieân cöùu veà aûnh höôûng cuûa pH ñeán hoaït tính enzyme, caùc nhaø khoa hoïc cho thaáy hieän töôïng: neáu taêng hoaëc giaûm giaù trò pH tôùi moät ñieåm xaùc ñònh naøo ñoù, vaän toác phaûn öùng enzyme seõ taêng daàn vaø ñaït ñeán ñieåm cöïc ñaïi. Giaù trò pH, maø ôû ñoù vaän toác enzyme ñaït ñöôïc cöïc ñaïi goïi laø pH toái öu cho hoaït ñoäng cuûa enzyme. Vöôït quaù giôùi haïn pH naøy hoaït ñoäng cuûa enzyme seõ giaûm. Moãi moät loaïi enzyme coù khoaûng pH toái öu vaø ñieåm pH toái öu. Döïa vaøo tính chaát naøy, caùc nhaø khoa hoïc môùi phaân ra loaïi enzyme axit, enzyme trung tính vaø enzyme kieàm. pH coù aûnh höôûng raát lôùn ñeán traïng thaùi ion ñoäng cuûa protein, traïng thaùi ion hoaù cuûa cô chaát vaø phöùc chaát ES. Ñaëc tính naøy raát coù yù nghóa trong vieäc laøm taêng phaûn öùng enzyme, laøm giaûm hoaëc trieät tieâu phaûn öùng enzyme. Ñoàng thôøi, noù coøn Phần 1:Tổng quan tài lieäu CBHD Tiến sĩ Hoaøng Quoác Khaùnh Hoïc vieân Hoaøng Thuïy Phöông Linh 18 coù yù nghóa raát lôùn trong caùc quaù trình baûo quaûn vaø cheá bieán löông thöïc, thöïc phaåm cuõng nhö trong öùng duïng enzyme vaøo saûn xuaát caùc chaát taåy röûa, trong coâng nghieäp nheï vaø y hoïc. * AÛnh höôûng cuûa caùc chaát kieàm haõm ñeán hoaït tính enzyme Hoaït tính cuûa enzyme coù theå bò aûnh höôûng bôûi nhöõng chaát kìm haõm. Nhöõng chaát kìm haõm laø nhöõng chaát hoùa hoïc coù khaû naêng laøm giaûm hoaït tính hoaëc laøm ngöng hoaït tính cuûa enzyme. Caùc chaát kìm haõm (inhibitor) thöôøng laø nhöõng ion, caùc phaân töû voâ cô, höõu cô, vaø caû protein. Caùc chaát kìm haõm thöôøng tham gia vaøo quaù trình kieåm tra, ñieàu hoøa quaù trình trao ñoåi chaát trong cô theå soáng. caùc chaát kìm haõm ñöôïc chia laøm hai loaïi: - Nhoùm caùc chaát kìm haõm caïnh tranh : caùc chaát coù caáu truùc khoâng gian töông töï caáu truùc khoâng gian cuûa cô chaát. . Chuùng hoaùn vò trí cuûa cô chaát trong trung taâm hoaït ñoäng cuûa enzyme, keát quaû laø enzyme khoâng theå keát hôïp ñöôïc vôùi cô chaát ñeå taïo thaønh phöùc ES. Nhoùm caùc chaát kìm haõm khoâng caïnh tranh : caùc chaát keát hôïp vôùi enzyme khoâng phaûi ôû trung taâm hoaït ñoäng cuûa enzyme, maø laø ôû 1 vò trí ngoaøi trung taâm hoaït ñoäng cuûa enzyme, laøm thay ñoåi caáu truùc khoâng gian cuûa trung taâm hoaït ñoäng cuûa enzyme. Nhö vaäy chuùng seõ laøm giaûm toác ñoä phaûn öùng cuûa enzym. Ngöôøi ta coøn goïi vò trí naøy laø trung taâm kìm haõm cuûa enzym. Trong raát nhieàu tröôøng hôïp, saûn phaåm cuoái cuûa chuoãi phaûn öùng hay cuûa moät phaûn öùng thöôøng laø chaát kìm haõm khoâng caïnh tranh. Ngoaøi ra, coøn coù tröôøng hôïp chaát kìm haõm khoâng taùc ñoäng vaøo enzym maø taùc ñoäng vaøo phöùc chaát ES. Keát quaû laø phaûn öùng enzym seõ bò giaûm. * AÛnh höôûng cuûa caùc chaát hoaït hoùa ñeán hoaït tính enzyme Phần 1:Tổng quan tài lieäu CBHD Tiến sĩ Hoaøng Quoác Khaùnh Hoïc vieân Hoaøng Thuïy Phöông Linh 19 Caùc chaát hoaït hoùa (activator) laø nhöõng chaát laøm taêng khaû naêng xuùc taùc cuûa enzym. Caùc chaát hoaït hoùa coù baûn chaát hoùa hoïc khaùc nhau: caùc anion, caùc chaát höõu cô coù caáu truùc hoùa hoïc khaùc nhau. Khaû naêng laøm taêng hoaït tính enzym cuûa nhöõng chaát naøy coù moät giôùi haïn nhaát ñònh, vöôït quaù giôùi haïn naøy raát coù theå laïi laøm giaûm hoaït tính cuûa enzym. 1.3 CAÙC CHEÁ PHAÅM ENZYM NGHIEÂN CÖÙU ÖÙNG DUÏNG 1.3.1 Enzyme YL-NL Enzyme YL-NL coù theå thuûy phaân vaùch vaø maøng teá baøo naám men giaûi phoùng caùc chaát beân trong teá baøo, ñoàng thôøi noù coù chöùa moät löôïng protease trung tính, saûn xuaát bôûi söï leân men Bacillus subtilis, coù theå laøm phaân huûy teá baøo naám men baèng söï thuûy phaân caùc protein trong vaùch teá baøo naám men. Protease cuûa vi khuaån Bac.subtilis laø enzyme ngoaïi baøo vaø laø protease kim loaïi (Zn). Protease cuûa Bac.subtilis (BS-protease ) coù theå thuûy phaân lieân keát peptide trong ñoù nhoùm –NH-CH-R ñöôïc bao boïc bôûi caùc goác acid amin kî nöôùc laø alanine, valanine, iso leucine, norleucine, leucine hoaëc phenylalanine. Toác ñoä thuûy phaân cuûa enzyme gia taêng khi caùc goác alanine, serine, theonine hoaëc hitidine chöùa nhoùm –COOH taïo neân lieân keát peptid. Enzyme naøy cuõng thuûy phaân lieân keát peptide chöùa nhoùm –COOH cuûa proline. Ngoaøi ra Yl-NL coøn coù theå thuûy phaân moät soá lieân keát peptide khaùc. Protease cuûa Bac.subtilis bò öùc cheá ñaëc hieäu bôûi caùc taùc nhaân hoùa hoïc coù nhoùm sulfurhydryl hay caùc chaát nhö EDTA, O-phenantholine, dithiozene, Natrictomide hay ion photphate. Protease cuûa Bac.subtilis bò öùc cheá bôûi noàng ñoä cao caùc ion kim loaïi nhö Cu2+ , Ni2+ , Hg 2+ , Pl 2+, Cd 2+, Fe2+, Fe3+ (ôû noàng ñoä 1x10-4M). Keõm vaø moät soá kim loaïi khaùc coù taùc duïng giöõ oån ñònh hoaït tính BS-protease cao khoûi söï töï thuûy phaân. Phần 1:Tổng quan tài lieäu CBHD Tiến sĩ Hoaøng Quoác Khaùnh Hoïc vieân Hoaøng Thuïy Phöông Linh 20 BS-protease coù theå ñöôïc giöõ oån ñònh ôû khoaûng pH lôùn töø 5,5-10 trong vaøi giôø vôùi söï coù maët cuûa ion canxi. Nhieät ñoä toái öu cuûa BS-protease khoaûng 570C, pH toái öu : 6,5 – 7,5 (vôùi söï coù maët cuûa ion canxi). Vôùi cô chaát laø casein, thì BS-protease trung tính, coù hoaït tính ñaëc hieäu cao hôn papain, chymotrypsin, trypsin vaø chymopapain: 13600 ñôn vò hoaït tính so vôùi 2550, 1813, 1653 vaø 850. Protease ñöôïc taùch chieát töø vi khuaån Bac. amyloquifacens vaø Bac. thermolysin coù raát nhieàu ñaëc tính töông töï nhö BS- protease trung tính. YL-NL “Amano” laøm tan naám men bia, naám men baùnh mì, vaø naám men Torula. Khaû naêng thuûy phaân tuøy thuoäc vaøo töøng loaïi naám men. Baûng1.5 Hieäu quaû thuûy phaân cuûa enzyme YL-NL “Amano” Tæ leä thuûy phaân cuûa teá baøo naám men (%)YL-NL “Amano” (%w/w) Brewer’s yeast Baker’s yeast Torula yeast 0.0 14 15 27 0.1 52 40 70 0.3 63 44 78 0.5 72 56 80 1.0 80 67 81 2.0 82 74 87 Keát quaû naøy chöùng minh khaû naêng thuûy phaân cuûa enzyme YL-NL “Amano” tuøy thuoäc vaøo töøng loaïi naám men. Phần 1:Tổng quan tài lieäu CBHD Tiến sĩ Hoaøng Quoác Khaùnh Hoïc vieân Hoaøng Thuïy Phöông Linh 21 [16] [17] Hình 1.6 Caáu truùc Neutral protease [16] vaø vi khuaån Bacillus subtilis [17] 1.3.2 Enzyme RP-1G Enzyme RP-1G laø 5’phosphodiesterase ñöôïc saûn xuaát baèng leân men Penicilium citrinum. Noù coù theå thuûy phaân RNA cuûa teá baøo naám men thaønh caùc 5’Nucleotide, trong ñoù coù 5’GMP laø moät chaát gia taêng höông vò töï nhieân ñöôïc bieát ñeán nhieàu. Enzyme naøy coù theå hoaït ñoäng trong khoaûng pH 4 - 7, tuy nhieân hoaït ñoäng ôû pH toái öu laø 5 vaø nhieät ñoä toái öu laø 700C. [18] [19] Hình 1.7 Caáu truùc 5’phosphodiestease[18] saûn xuaát töø leân men Penicilium citrinum [19] Phần 1:Tổng quan tài lieäu CBHD Tiến sĩ Hoaøng Quoác Khaùnh Hoïc vieân Hoaøng Thuïy Phöông Linh 22 Hình 1.8 Hoaït ñoäng cuûa enzyme RP-1G taïo GMP [25] 1.3.3 Enzyme Umamizyme Umamizyme laø moät enzyme thuûy phaân protein, ñöôïc nghieân cöùu phaùt trieån giuùp quaù trình thuûy phaân protein taïo nhieàu acid amin, ñöôïc saûn xuaát bôûi quaù trình leân men gioáng Aspergillus oryzae choïn loïc. Khaùc vôùi proteinase toång hôïp töø caùc loaïi naám khaùc, Umamizyme coù hoaït tính peptidase maïnh, beân caïnh ñoù hoaït tính proteinase cuõng cao, söï keát hôïp naøy giuùp noù thuûy phaân ñöôïc nhieàu loaïi protein ôû noàng ñoä cao. [20] [21] Phần 1:Tổng quan tài lieäu CBHD Tiến sĩ Hoaøng Quoác Khaùnh Hoïc vieân Hoaøng Thuïy Phöông Linh 23 Hình 1.9 Caáu truùc peptidase [20] saûn xuaát bôûi naám moác Aspergillus oryzae [21] [26] Hình 1.10 Nguyeân taéc hoaït ñoäng cuûa peptidase trong Umamizyme 1.3.4 Enzyme Deamizyme 50000G Enzyme Deamizyme 50000G laø moät 5’-Adenylic Deaminase ñöôïc saûn xuaát bôûi quaù trình leân men naám moác Aspergillus melleus. Enzyme naøy coù hoaït tính 5’-Adenylic Deaminase maïnh, chuyeån hoùa 5’-Adenylic acid (AMP) thaønh chaát taêng höông thôm laø 5’Inosinic acid (IMP). Cuøng vôùi RP-1G noù thuûy phaân RNA thaønh caùc acid nucleotide, Deamizyme 50000G thöôøng ñöôïc söû duïng trong giai ñoaïn cuoái, thuûy phaân dòch cao naám men thaønh chaát taêng höông vò töï nhieân. [22] [23] Hình 1.11 Caáu truùc 5’-Adenylic Deaminase [22] vaø Aspergillus melleus [23] Phần 1:Tổng quan tài lieäu CBHD Tiến sĩ Hoaøng Quoác Khaùnh Hoïc vieân Hoaøng Thuïy Phöông Linh 24 Hình 1.12 Nguyeân taéc hoaït ñoäng cuûa AMP deaminase [27] 1.4 ÑAËC ÑIEÅM CHUNG CUÛA TEÁ BAØO NAÁM MEN 1.4.1 Hình thaùi vaø kích thöôùc teá baøo naám men Naám men laø vi sinh vaät ñieån hình cho nhoùm nhaân thaät. Tuøy loaïi naám men maø teá baøo coù hình caàu, hình tröùng, hình oval, hình elip, hình sao thoå, hình caùi lieàm, hình oáng, hình cung, hình tam giaùc, hình kim khoâng coù phaàn phuï, hình kim coù phaàn phuï, hình muõ löôõi trai, hình quaû leâ... Naám men thöôøng lôùn hôn gaáp 10 laàn so vôùi teá baøo vi khuaån. Loaïi naám men nhaø maùy saûn xuaát bia, röôïu thöôøng söû duïng laø Saccharomyces cerevisiae, coù kích thöôùc thay ñoåi trong khoaûng 2,5 – 10 μm x 4,5 – 21 μm do ñoù chuùng coù theå ñöôïc nhìn thaáy roõ döôùi kính hieån vi quang hoïc. Thaønh teá baøo naám men daøy khoaûng 25 nm ( chieám 25% khoái löôïng khoâ cuûa teá baøo). Trong vaùch teá baøo chöùa khoaûng 10% protein. Döôùi lôùp thaønh teá baøo laø lôùp maøng teá baøo. Laáy teá baøo traàn cuûa naám men roài ñöa vaøo trong moät dung dòch coù aùp suaát thaåm thaáu thaáp, li taâm ñeå laáy ra maøng teá baøo chaát, röûa vaø ly taâm laïi ñeå thuaàn khieát maøng, quan saùt döôùi kính hieån vi ñieän töû thaáy coù 3 taàng keát caáu khaùc nhau, caáu taïo chuû yeáu laø protein ( chieám 50% khoái löôïng khoâ), phaàn coøn laïi laø lipid ( 40%) vaø moät ít polysaccharide Phần 1:Tổng quan tài lieäu CBHD Tiến sĩ Hoaøng Quoác Khaùnh Hoïc vieân Hoaøng Thuïy Phöông Linh 25 Hinh 1.13 Caáu truùc voû teá baøo naám men 1.4.2 Thaønh phaàn hoùa hoïc cuûa teá baøo naám men Cuõng nhö caùc cô theå soáng khaùc, thaønh phaàn cô baûn vaø chuû yeáu cuûa teá baøo naám men laø nöôùc – khoaûng 75% khoái löôïng chung. Thaønh phaàn sinh khoái khoâ cuûa naám men thoâng thöôøng bao goàm (%): Chaát voâ cô 5 - 10 Cacbon 25 - 50 Nitô 4,8 - 12 Protein (N×6,25) 30 - 75 Lipit 2 - 5 Thaønh phaàn hoùa hoïc cuûa teá baøo naám men neáu tính theo caùc nguyeân toá caáu thaønh seõ laø (% theo trò soá trung bình ): C – 47, H – 65, O – 31, N -10, P – 1.6 ñeán 3.5. Haøm löôïng caùc nguyeân toá khoâng phaûi ña löôïng Ca – 0.3 ñeán 0.8, K – 9.5 ñeán 2.5, Mg - 0.1 ñeán 0.4, Na – 0.06 ñeán 0.2, S – 0.2 . Caùc nguyeân toá vi löôïng (mg/kg): Fe – 90 ñeán 350, Cu – 20 ñeán 135, Zn – 100 ñeán 160, Mo – 15 ñeán 65. Phần 1:Tổng quan tài lieäu CBHD Tiến sĩ Hoaøng Quoác Khaùnh Hoïc vieân Hoaøng Thuïy Phöông Linh 26 Chaát khoâ cuûa teá baøo naám men goàm coù 23 ñeán 28% laø chaát höõu cô vaø 5 ñeán 7% chaát tro. Chaát höõu cô ôû ñaây goàm coù (%): protein 13 ñeán 14% , glucogen 6 ñeán 8%, xenluloza 1,8 ñeán 2%, chaát beùo 0,5 ñeán 2%. Protein : naám men coù haøm löôïng protein nguyeân lieäu trung bình khoaûng 50% (tính theo chaát khoâ) vaø khoaûng 45% protein hoaøn chænh. Caùc daãn xuaát cuûa axit nucleic nhö bazô purin vaø pyrimidin, caùc axit töï do ñeàu ñöôïc coi laø protein nguyeân lieäu. Nhö chuùng ta ñaõ bieát, haøm löôïng protein trong teá baøo raát cao. Caùc daïng protein hoaøn chænh tham gia vaøo thaønh phaàn caùc enzym ñeå chuyeån hoùa vaät chaát xaây döïng teá baøo cuõng nhö taïo thaønh caùc saûn phaåm leân men. Trong thaønh phaàn caùc protein coù ñuû caùc axit amin vaø ñaëc bieät laø 8 hoaëc 9 acid amin khoâng thay theá. Haøm löôïng caùc axit amin trong teá baøo naám men ôû giai ñoaïn cuoái leân men laø nhö sau (mg/g men khoâ ): lizin -7.5 ; arginin -1.3; histidin -11.0 ; axit asparaginic - 2.9; serin -2.7; glyxin -1.5; axit glutamic -3.9; alanin -8.7 ; prolin -2.0; tirozin-2.8; metionin -2.9; loxin – 5.4 ; sistein – veát v..v… Glycogen : laø nhöõng chaát döï tröõ nguoàn cacbon (hydratcacbon cuûa naám men ). Khi trong moâi tröôøng thieáu nguoàn cacbon dinh döôõng glycogen seõ ñöôïc huy ñoäng tham gia vaøo quaù trình tieâu hoùa cuûa naám men vaø giaûi phoùng ra nöôùc, khí cacbonic. Chaát beùo : chaát beùo trong teá baøo naám men coù caùc axit oleic, linoelic, palmitic. Trong chaát beùo coù tôùi 30 ñeán 40% phosphatit. Phosphor: Trong teá baøo naám men thaáy orthor- , pyro- vaø metaphosphat ôû daïng höõu cô vaø voâ cô. Chuùng laø thaønh phaàn cuûa axit nucleic, phospholipit vaø coenzym cuûa adenozinphosphat (AMP, ADP, ATP) vaø tiamin (vitamin B1). Trong Phần 1:Tổng quan tài lieäu CBHD Tiến sĩ Hoaøng Quoác Khaùnh Hoïc vieân Hoaøng Thuïy Phöông Linh 27 chaát nhaân (nucleoproteit) coù chöùa phosphor ôû daïng orthophosphate. Daïng naøy coøn ôû thaønh phaàn caùc enzym flavin, daïng pyrophosphate thaáy trong nhieàu coenzym ( Codenhydraza Koi, Ko2, cacboxylaza). Phosphor coøn thaáy caùc daïng khaùc nhau tham gia vaøo caùc quaù trình quan troïng trao ñoåi naêng löôïng cuûa teá baøo . Löu huyønh (S): löu huyønh laø thaønh phaàn cuûa nhieàu hôïp chaát raát quan troïng nhö caùc axit amin (sixtin , stein , metionin, vaø glutation), caùc vitamin (biotin , anevarin ). Trong thaønh phaàn enzym löu huyønh ôû daïng goác sulfite vaø tiolovic Magie: Magie coù taùc duïng hoaït hoùa nhieàu phosphataza vaø enolaza. Ion magie (Mg2+) coù aûnh höôûng gìn giöõ hoaït tính enzym khi ñun noùng. Magie vaø mangan (Mg, Mn) laøm taêng nhanh nhu caàu veà glucoza cuûa naám men. AÛnh höôûng cuûa Mg maïnh hôn khi noàng ñoä glucoza thaáp trong moâi tröôøng. Caùc moâi tröôøng dinh döôõng thöôøng coù 0,02 ñeán 0,05% Mg ôû daïng sulfat. Thaønh phaàn hoùa hoïc cuûa teá baøo naám men coù theå thay ñoåi phuï thuoäc vaøo thaønh phaàn moâi tröôøng dinh döôõng, möùc ñoä taêng tröôûng cuûa gioáng naám men vaø ñieàu kieän nuoâi caáy. Quan heä cuûa naám men vôùi caùc chaát coù trong moâi tröôøng chính laø moái töông taùc vaøo nhu caàu dinh döôõng vaø caùc enzym do chính caùc noøi (hay chuûng ) cuûa gioáng naám men, sinh ra trong quaù trình nuoâi caáy. Ñeå coù theå thu ñöôïc sinh khoái naám men hay caùc saûn phaåm leân men ngöôøi ta phaûi nghieân cöùu raát kyõ caùc yeâu caàu sinh lí cuûa naám men , tröôùc heát laø nhu caàu dinh döôõng vaø caùc ñieàu kieän cho sinh tröôûng vaø ñieàu kieän leân men cho hieäu suaát cao. Phần 1:Tổng quan tài lieäu CBHD Tiến sĩ Hoaøng Quoác Khaùnh Hoïc vieân Hoaøng Thuïy Phöông Linh 28 1.4.3 Moät soá naám men thöôøng öùng duïng trong coâng ngheä thöïc phaåm Trong töï nhieân coù moät soá gioáng vaø loaøi naám men hoã trôï cho vieäc saûn xuaát ra caùc saûn phaåm coù lôïi cho ñôøi soáng loaøi ngöôøi nhö röôïu, bia, nöôùc giaûi khaùt, men baùnh mì, men thöùc aên chaên nuoâi v.v… * Gioâáng Saccharomyces Meyen Gioáng naøy goàm caùc naám men coù theå leân men ñöôøng sinh ra röôïu etylic. Caùc loaøi cuûa gioáng naøy phoå bieán roäng raõi trong töï nhieân, ñaëc bieät moät soá noøi ñaõ ñöôïc chuùng ta nghieân cöùu vaø bieát khaù roõ. Caùc men naøy coù vai troø lôùn trong saûn xuaát caùc saûn phaåm leân men coù chöùa coàn. * Gioáng Pichia Hansen Gioáng men naøy taïo thaønh baøo töû ôû daïng baùn caàu hoaëc daïng coù nhieàu goùc caïnh, moãi nang coù 1-2 , hieám khi coù ñeán 4 baøo töû Caùc chuûng cuûa naám men naøy ñoàng hoùa ñöôøng theo con ñöôøng oxi hoùa. Ngoaøi ra chuùng coù theå oxi hoùa röôïu, axit höõu cô. Do vaäy chuùng phaùt trieån raát toát treân maët röôïu vang, bia vaø caùc loaïi dòch coù chöùa röôïu döôùi 12%. ÔÛ vang non, naám men naøy coù theå gaëp vôùi soá löôïng lôùn hôn nhieàu laàn so vôùi caùc gioáng naám men khaùc. Treân maët vang Pichia taïo thaønh maøng coù nhöõng haït boät maøu traéng, laøm thay ñoåi thaønh phaàn vaø höông vò cuûa vang. Noù taïo cho vang nhöõng axit höõu cô bay hôi vaø este cuûa nhöõng axit naøy. 1.4.4 Naám men baùnh mì 1.4.4.1 Gioáng naám men baùnh mì Caùc naám men ñöôïc duøng trong saûn xuaát thuoäc hoï Saccharomycetacea, gioáng Sacchromyces, loaøi cerevisiae. Trong coâng nghieäp duøng loaøi naøy vôùi nhieàu noøi (chuûng) khaùc nhau thuoäc men noåi. Moãi noøi coù moät vaøi ñaëc tính rieâng bieät. Noùi chung naám men duøng trong Phần 1:Tổng quan tài lieäu CBHD Tiến sĩ Hoaøng Quoác Khaùnh Hoïc vieân Hoaøng Thuïy Phöông Linh 29 saûn xuaát men baùnh mì caàn coù nhöõng tính chaát sau : sinh saûn nhanh, chòu ñöôïc trong moâi tröôøng ræ ñöôøng, coù löïc laøm nôû boät cao, ít bò thay ñoåi trong baûo quaûn, coù khaû naêng leân men ñöôïc ñöôøng saccharose, glucose, maltose, coù hoaït löïc enzyme zimase vaø maltase cao. Ngoaøi ra, kích thöôùc teá baøo cuûa naám men duøng trong saûn xuaát caàn phaûi töông ñoái lôùn ñeå coù theå taùch ñöôïc nhôø nhöõng maùy ly taâm ñóa bình thöôøng vaø sinh khoái eùp ñöôïc thaønh baùnh coù theå beõ gaõy ñöôïc khi ñoä aåm 75%. 1.4.4.2 Saûn xuaát men nöôùc vaø men eùp theo phöông phaùp thuû coâng Men nöôùc laø men baùnh mì ôû daïng loûng ñöôïc toå chöùc ôû caùc nhaø maùy baùnh mì vaø söû duïng theo nhu caàu tieâu duøng saûn xuaát taïi choã. Öu ñieåm cuûa men nöôùc laø quy trình saûn xuaát ñôn giaûn vaø giaù thaønh haï, coù theå cho chaát löôïng toát so vôùi men eùp vaø men khoâ, nhöng cuõng coù nhöõng nhöôïc ñieåm nhö khoâng baûo quaûn ñöôïc laâu vaø vaän chuyeån khoù khaên. Nguyeân lieäu ñeå saûn xuaát men nöôùc laø boät, thoùc maàm hoaëc cheá phaåm moác coù hoaït löïc amylaza, vi khuaån lactic (Lactobacterium delbruckii) vaø naám men Saccharomyces cerevisiae. 1. Vi khuaån Lactobacterium delbruckii (Thermobacterium cereale) duøng ñeå axit hoùa vaø caûi thieän thaønh phaàn dinh döôõng cuûa moâi tröôøng cho nuoâi caáy naám men ôû giai ñoaïn sau ñaây laø gioáng vi khuaån lactic leân men ñoàng hình cho saûn phaåm laø axit lactic. Caùc teá baøo vi khuaån hình que coù kích thöôùc (0.4 ñeán 0.7), (2.7 ñeán 7) μm khi coøn non thöôøng ñöùng rieâng leû, ñoâi khi keát vôùi nhau thaønh goùc vuoâng hoaëc keát thaønh chuoãi ngaén, khoâng chuyeån ñoäng, khoâng sinh baøo töû, nhieät ñoä toái thích cho sinh tröôûng laø 45 ñeán 470C taïo thaønh axit laø 52 ñeán 540C. Gioáng naøy raát keùn nguoàn nitô, ñaëc bieät laø caùc axit amin. Leân men ñöôïc glucose, fructose, maltose, saccharose, dextrin vaø cho saûn phaåm laø axit lactic. Phần 1:Tổng quan tài lieäu CBHD Tiến sĩ Hoaøng Quoác Khaùnh Hoïc vieân Hoaøng Thuïy Phöông Linh 30 Gioáng vi khuaån lactic naøy ñöôïc giöõ trong moâi tröôøng loûng laø dòch maïch nha (nöôùc malt) khoâng loïc coù noàng ñoä 120 Bx theâm moät ít CaCO3 trong oáng nghieäm hoặc ampul (daïng oáng tieâm vuoát moät ñaàu). Caáy gioáng vaøo moâi tröôøng ñeå ôû 50 ñeán 520C khoaûng 1 ñeán 2 ngaøy. Khi söû duïng ngöôøi ta tieán haønh nhaân gioáng töø oáng goác qua caùc hình tam giaùc ôû 50 ñeán 520 C khoaûng 1 ñeán 2 ngaøy. Khi söû duïng ngöôøi ta tieán haønh nhaân gioáng töø caùc goác qua caùc bình tam giaùc ôû 50 ñeán 520 C khoaûng 1 ñeán 2 ngaøy, roài chuyeån sang bình caàu, caùc thuøng nhaân gioáng … Moâi tröôøng nhaân gioáng ôû caùc giai ñoaïn sau laø dòch boät thuûy phaân baèng thoùc maàm hoaëc cheá phaåm moác. Laøm dòch boät thuûy phaân nhö sau : troän boät vôùi nöôùc theo tæ leä 1:3 (coù theå theâm boät ngoâ hoaëc boät ñaäu ñeå taêng thaønh phaàn dinh döôõng), naáu chín ñeå nguoäi tôùi 48 ñeán 500C theâm 3% thoùc maàm hoaëc 0,8 ñeán 1% cheá phaåm moác A. awamori hoaëc A. oryzae vaø dòch gioáng vi khuaån giöõ 8 ñeán 14 giôø. Dòch boät ñöôïc ñöôøng hoùa vaø ñoàng thôøi tích tuï axit, ñeán khi moâi tröôøng ñaït tôùi 11 ñeán 120 axit (10 = 1ml NaOH 1N/100 ml – dòch chuaån ) thì coù theå ñöa vaøo caáy naám men. 2. Gioáng men laø caùc chuûng thuoäc Sacchromyces cerevisiae ñöôïc caáy chuyeàn treân moâi tröôøng thaïch – malt ôû oáng nghieäm, ñeå khoaûng 28 ñeán 300C khoaûng 6 ñeán 12 giôø, roài tieán haønh nhaân gioáng. Töø oáng nghieäm men ñöôïc caáy vaøo ba bình tam giaùc coù 100 ml nöôùc malt ôû nhieät ñoä 300C trong 24 giôø, sau ñoù chuyeån sang caùc bình 5 ñeán 6 lít. Gioáng men sau khi nhaân gioáng ñöôïc chuyeån vaøo dòch boät thuûy phaân ñaõ axit hoùa laøm nguoäi tôùi 28 ñeán 300C (tæ leä gioáng men tieáp vaøo ñaây laø 5 ñeán 10%), giöõ ôû nhieät ñoä naøy khoaûng 14 ñeán 15 giôø khoâng suïc khí hoaëc coù suïc khí giaùn ñoaïn keát hôïp vôùi khuaáy. Ôû nhieät ñoä naøy vi khuaån lactic öa nhieät ngöøng phaùt trieån vaø ngöøng tích tuï axit. Naám men tieâu hoùa ñöôøng vaø axit lactic ñeå taêng cöôøng sinh Phần 1:Tổng quan tài lieäu CBHD Tiến sĩ Hoaøng Quoác Khaùnh Hoïc vieân Hoaøng Thuïy Phöông Linh 31 khoái, ñoàng thôøi coù leân men röôïu (tröôøng hôïp khoâng suïc khí löôïng sinh khoái tích tuï khoâng lôùn laém, 1ml coù khoaûng 150 ñeán 200 trieäu teá baøo ). Töø men nöôùc ta coù theå ñöa vaøo ly taâm ñeå thu men ôû daïng söõa hoaëc daïng nhaõo vaø töø ñoù ñem ñoùng thaønh baùnh chuyeân chôû ñi xa, giöõ nhieät ñoä döôùi 100C khoaûng 5 ñeán 7 ngaøy. 1.4.4.3 Caùc phöông phaùp baûo quaûn men gioáng Men gioáng caàn ñöôïc baûo quaûn ñeå giöõ ñöôïc khaû naêng soáng cuõng nhö hoaït löïc. Caùc phöông phaùp baûo quaûn ñöôïc aùp duïng nhaèm giöõ caùc ñaëc tính nuoâi caáy, hình thaùi vaø hoaït löïc khoâng bieán ñoåi. Coù moät soá phöông phaùp giöõ men gioáng nhö sau : Phöông phaùp thöù nhaát Giöõ gioáng thuaàn khieát treân moâi tröôøng thaïch nghieâng, caáy chuyeàn sau 12 ñeán 24 ngaøy sau khi ñaõ hoaït hoùa sô boä treân moâi tröôøng loûng. Moâi tröôøng thaïch nghieâng : nöôùc malt ñöôøng hoùa (coù 12% chaát khoâ ) – 49,5% ; ræ ñöôøng ñaõ xöû lyù (coù 6 ñeán 8% chaát khoâ ) – 49.5% ; dòch men töï phaân (khoaûng 9% chaát khoâ ) – 1% vaø thaïch 2% Moâi tröôøng loûng: ñeå hoaït hoùa naám men ngöôøi ta duøng dòch malt khoâng coù hublon coù haøm löôïng chaát khoâ 12%. Neáu khoâng caáy chuyeàn vaø hoaït hoùa kòp thôøi thì hoaït löïc maltaza vaø khaû naêng thích nghi vôùi ræ ñöôøng coù theå bò giaûm, hoaëc treân beà maët thaïch caùc teá baøo naám men sinh baøo töû, roài keát hôïp vôùi nhau laøm thay ñoåi tính chaát cuûa gioáng. Phöông phaùp thöù hai Giöõ teá baøo men trong dòch saccaroza 30% ñöôïc chuaån bò töø ñöôøng kính vôùi nöôùc maùy. Dòch ñöôøng ñöôïc cho vaøo bình thanh truøng. Sau ñoù caáy gioáng töø oáng thaïch nghieâng ñaõ nuoâi hai ngaøy baèng que caáy vaø giöõ nhieät ñoä bình thöôøng. Trong Phần 1:Tổng quan tài lieäu CBHD Tiến sĩ Hoaøng Quoác Khaùnh Hoïc vieân Hoaøng Thuïy Phöông Linh 32 ñieàu kieän naøy naám men haàu nhö khoâng phaùt trieån, khoâng leân men. Ñaây laø phöông phaùp giöõ naám men ôû traïng thaùi tieàm sinh ñoäc ñaùo vaø neáu dòch ñöôøng khoâng bò khoâ caïn thì coù theå giöõ ñöôïc 6 ñeán 12 thaùng maø khoâng phaûi caáy chuyeàn. Khi söû duïng coù theå duøng que caáy hoaëc pitet voâ truøng laáy dòch gioáng caáy chuyeàn vaøo moâi tröôøng loûng ñeå hoaït hoùa (giôùi thieäu ôû phöông phaùp thöù nhaát ). Sau 24 ÷ 36h giöõ ôû nhieät ñoä 300C dòch ñöôøng leân men vaø khi ñoù ta laïi caáy chuyeàn tieáp sang moâi tröôøng thaïch hoaëc caùc moâi tröôøng nhaân gioáng. Phöông phaùp thöù ba Baûo quaûn gioáng döôùi lôùp daàu vaselin hoaëc paraffin. Gioáng caáy treân moâi tröôøng thaïch nghieâng 2 ñeán 3 ngaøy ñöôïc ñoå phuû leân beà maët moät lôùp vaselin voâ truøng. Lôùp daàu khoaùng naøy giöõ cho moâi tröôøng thaïch khoûi bò khoâ vaø laøm giaûm quaù trình trao ñoåi chaát, nhöng naám men vaãn phaùt trieån moät caùch chaäm chaïp. phöông phaùp naøy coù theå giöõ men gioáng ñöôïc 6 thaùng ñeán 2 naêm, nhöõng ñaëc tính hoùa sinh vaø hình thaùi khoâng bò thay ñoåi, toác ñoä sinh saûn cuûa naám men thaäm chí coøn taêng leân. Ngöôøi ta thöôøng duøng daàu vaselin coù tæ troïng 0.8 ñeán 0.9 ñaõ ñöôïc ñun noùng ôû 1500C ñeå ñuoåi nöôùc coù trong daàu, roài haáp thanh truøng. Lôùp daàu treân beà maët moâi tröôøng khoâng quaù 1cm. OÁng gioáng coù vaselin coù theå ñeå ôû nhieät ñoä trong phoøng nhöng toát hôn caû laø giöõ ôû 4 ñeán 60C. Phöông phaùp thöù tö Giöõ gioáng ôû ñieàu kieän ñoâng khoâ. Dòch huyeàn phuø gioáng ñöôïc ñöïng trong oáng nghieäm – ampul ôû traïng thaùi ñoâng laïnh (- 400C), saáy khoâ döôùi ñieàu kieän laïnh vaø chaân khoâng cao tôùi ñoä aåm coøn 1.5 ñeán 2.6%. Sau ñoù gaén mieäng ampul döôùi chaân khoâng vaø voâ truøng. Baûo quaûn caùc ampul gioáng ôû nhieät ñoä trong phoøng Phần 1:Tổng quan tài lieäu CBHD Tiến sĩ Hoaøng Quoác Khaùnh Hoïc vieân Hoaøng Thuïy Phöông Linh 33 hoaëc ôû laïnh. Thôøi gian baûo quaûn tôùi 3 naêm khoâng phaûi caáy chuyeàn. Moät vaøi chuûng men ñöôïc baûo quaûn ñoâng khoâ coù tæ leä teá baøo soáng thaáp . 1.5 NHÖÕNG THAØNH TÖÏU NGHIEÂN CÖÙU VEÀ NAÁM MEN Theá kyû 20 ñaõ chöùng kieán moät cuoäc caùch maïng lôùn trong lónh vöïc caûi tieán coâng ngheä, ñaëc bieät trong coâng ngheä sinh hoïc. Kyõ ngheä di truyeàn mau choùng trôû thaønh muõi nhoïn trong lónh vöïc nghieân cöùu naám men, taïo ra nhieàu chuûng, gioáng môùi mang ñaëc tính öu vieät. Moät soá thaønh coâng ñaõ ñöôïc öùng duïng trong coâng ngheä saûn xuaát bia nhö : Baèng phöông phaùp ñoät bieán, Malzahn (1977) ñaõ tuyeån choïn ñöôïc caùc chuûng naám men bia coù khaû naêng keát laéng cao. Hockney vaø Friman (1980) cuõng ñaõ thu nhaän ñöôïc chuûng naám men bia coù khaû naêng taïo coàn cao töø quaù trình phaân laäp caùc theå ñoät bieán bôûi EMS. Söû duïng kó ngheä lai gheùp gen cho phaùt trieån caùc chuûng gioáng naám men coâng nghieäp Lewis vaø coäng söï, 1976, Russell, 1980 ñaõ xaùc ñònh ñöôïc caùc gen ñieàu khieån quaù trình keát laéng cuûa naám men. Töông töï nhö vaäy, caùc gen (DEX, STA) maõ hoùa cho saûn xuaát glucoamylaza ngoaïi baøo ñaõ ñöôïc xaùc ñònh vaø gaàn ñaây nhaát ngöôøi ta ñaõ taïo ñöôïc caùc chuûng naám men ña baøo mang caùc gen ñieàu khieån quaù trình ñoàng hoùa matolza (MALT – 6). Ngöôøi ta cuõng taïo neân moät chuûng naám men môùi coù khaû naêng beàn vöõng vôùi cyclohiximid baèng phöông phaùp ñöa vecto troäi naøy vaøo teá baøo naám men. Quaù trình lai gheùp naám men ñaõ kích thích gen troäi hôn P1, laøm taêng khaû naêng beàn vöõng ñoái vôùi axit decacboxylat cinamic vaø ñieàu naøy raát coù yù nghóa trong quaù trình taïo höông trong coâng ngheä saûn xuaát bia. Phần 1:Tổng quan tài lieäu CBHD Tiến sĩ Hoaøng Quoác Khaùnh Hoïc vieân Hoaøng Thuïy Phöông Linh 34 1.6 ÖÙNG DUÏNG CUÛA CAO NAÁM MEN Cao naám men laø moät chaát ñöôïc chieát xuaát töø dòch thuûy phaân teá baøo naám men vaø coâ ñaëc laïi. Cao naám men laø gia vò töï nhieân, chöùa caùc ribonucleotide nhö guanosine 5’ monophosphate (GMP) vaø inosine 5’- monophosphate (IMP) vaø caùc thaønh phaàn dinh döôõng khaùc nhö amino acid, nucleotide, vitamin vaø khoaùng chaát…ñaây laø nhöõng chaát goùp phaàn laøm taêng höông thôm, taêng vò ngon vaø taêng haøm löôïng dinh döôõng. Vì vaäy maø cao naám men laø moät thaønh phaàn döôøng nhö khoâng theå thieáu ñeå saûn xuaát caùc saûn phaåm gia vò töï nhieân hay nhieàu saûn phaåm dinh döôõng khaùc. Cao naám men ñöôïc söû duïng trong coâng ngheä thöïc phaåm ñeå boå sung dinh döôõng, taêng höông vò cho nhieàu saûn phaåm. Noù thöôøng ñöôïc theâm vaøo suùp, nöôùc chaám, nöôùc thòt, nöôùc haàm, thòt khoâ, thòt boø muoái, xuùc xích, hamburger, baùnh pate nhaân thòt, baùnh mì cuoän thòt, boät caø ri, thöïc phaåm cho em beù, baùnh qui, miso…Nhöõng naêm gaàn ñaây cao naám men coøn ñöôïc söû duïng trong coâng nghieäp leân men, boå sung vaøo thaønh phaàn moâi tröôøng nuoâi caáy vi sinh vaät, cuõng nhö trong thöùc aên cuûa vaät nuoâi, nguyeân lieäu trong myõ phaåm, saûn phaåm dinh döôõng cho thöïc vaät. 1.7 TIEÂU CHUAÅN ÑAÙNH GIAÙ CHAÁT LÖÔÏNG CUÛA HAÏT NEÂM 1.7.1 Chæ tieâu hoùa lyù STT Teân chæ tieâu Möùc chæ tieâu Ñôn vò tính 1 Ñoä aåm < = 2 % 2 Haøm löôïng muoái NaCl < = 55 % 3 Haøm löôïng tro khoâng tan trong HCl < = 0.1 % 4 Haøm löôïng ñöôøng toång < = 3 % Phần 1:Tổng quan tài lieäu CBHD Tiến sĩ Hoaøng Quoác Khaùnh Hoïc vieân Hoaøng Thuïy Phöông Linh 35 1.7.2 Chæ tieâu vi sinh STT Teân chæ tieâu Möùc chæ tieâu Ñôn vò tính 1 Toång soá vi khuaån hieáu khí < = 104 CFU / g maãu 2 Toång soá men moác < = 102 CFU / g maãu 3 E.Coli < = 3 CFU / g maãu 4 Salmonella Khoâng ñöôïc coù CFU / g maãu 5 Staphylococcus aureus < = 102 CFU / g maãu 1.7.3 Chæ tieâu caûm quan STT Teân chæ tieâu Yeâu caàu Phöông phaùp 1 Maøu saéc Maøu vaøng ñeán vaøng aùnh naâu 2 Traïng thaùi Daïng haït, kích thöôùc 1.8 mm, khoâng voùn cuïc 3 Vò Vò ngoït cuûa thòt vaø caùc gia vò khaùc, khoâng vò laï 4 Muøi Muøi thôm töï nhieân cuûa thòt vaø caùc gia vò khaùc, khoâng muøi laï Ñaùnh giaù caûm quan so vôùi maãu chuaån 1.8 ÑAÙNH GIAÙ CAÛM QUAN THÖÏC PHAÅM THEO TCVN 5104:90 Kieåm nghieäm baèng phöông phaùp caûm quan ñaõ coù töø laâu, nhöng ñaõ ñöôïc thöïc hieän döôùi nhöõng hình thöùc ñôn giaûn, thöôøng ñöôïc goïi laø thöû neám . Cuøng vôùi söï phaùt trieån coâng nghieäp cheá bieán thöïc phaåm caùc phöông phaùp caûm quan ñöôïc xaây döïng phaùt trieån thaønh phöông phaùp mang tính khoa hoïc vaø chính thöùc aùp duïng ñeå nghieân cöùu vaø ñaùnh giaù saûn phaåm. Caùc phöông phaùp caûm quan ñöôïc xaây döïng treân cô sôû söû duïng caùc cô quan giaùc quan ñeå “ño” caùc giaù trò caûm quan (muøi, vò, maøu saéc, hình thaùi) cuûa ñoái Phần 1:Tổng quan tài lieäu CBHD Tiến sĩ Hoaøng Quoác Khaùnh Hoïc vieân Hoaøng Thuïy Phöông Linh 36 töôïng ñöôïc “ño” nhö saûn phaåm nghieân cöùu, nguyeân lieäu, baùn thaønh phaåm, thaønh phaåm. Caùc keát quaû ño ñöôïc seõ ñöôïc xöû lyù ñeå keát luaän giaù trò caûm quan naøo ñoù hoaëc so saùnh keát quaû ño ñöôïc vôùi moät giaù trò khaùc, thöôøng goïi laø giaù trò chuaån hay giaù trò so saùnh. Ñoä tin caäy cuûa caùc keát quaû ñöôïc ñaùnh giaù treân nguyeân taéc xaùc suaát thoáng keâ. Quaù trình ñaùnh giaù ñöôïc trình baøy theo moät heä thoáng nhö sau: Thöïc phaåm ---------------- > khoa hoïc thöïc phaåm Kích thích Giaùc quan naõo ------------- > sinh lyù hoïc Traû lôøi Soá lieäu caûm quan ----------- > thoáng keâ hoïc Caùc phöông phaùp caûm quan thöôøng ñöôïc chia laøm ba nhoùm chính : caùc phöông phaùp sai bieät , caùc phöông phaùp öu tieân vaø phöông phaùp thaêm doø thò hieáu. 1.8.1 Caùc phöông phaùp sai bieät Goàm caùc phöông phaùp so saùnh, moâ taû, cho ñieåm hoaëc nhaän bieát caùc giaù trò caûm quan. Trong caùc phöông phaùp naøy, caùc caûm quan vieân phaûi coù khaû naêng phaùt hieän caùc giaù trò caûm quan moät caùch chính xaùc ñeå töø ñoù coù nhöõng keát luaän töông öùng. * Phöông phaùp tam giaùc Trong phöông phaùp tam giaùc coù ba maãu kí hieäu baèng maõ soá, vaø ñöôïc bieát raèng trong ba maãu naøy coù hai maãu gioáng nhau , maãu coøn laïi phaûi ñöôïc xaùc ñònh. * Phöông phaùp 2- 3 Trong phöông phaùp 2-3, coù ba maãu , trong ñoù coù moät maãu coù kí hieäu R (maãu chuaån ) vaø hai maãu kia kí hieäu baèng maõ soá . Phần 1:Tổng quan tài lieäu CBHD Tiến sĩ Hoaøng Quoác Khaùnh Hoïc vieân Hoaøng Thuïy Phöông Linh 37 Moät trong hai maãu kí hieäu baèng maõ soá gioáng nhö maãu chuaån R. Haõy xaùc ñònh maãu coøn laïi. * Phöông phaùp so saùnh caëp ñoâi Trong phöông phaùp so saùnh caëp ñoâi ,caùc maãu ñöôïc chuaån bò theo töøng caëp vaø ñöôïc kí hieäu baèng maõ soá. Trong moãi caëp coù moät maãu chuaån vaø moät maãu thöû, haõy xaùc ñònh trong hai maãu ñoù maãu naøo coù cöôøng ñoä lôùn hôn hoaëc beù hôn ñoái vôùi moät chæ tieâu naøo ñoù- ví duï nhö vò ngoït… Neáu so saùnh nhieàu laàn hai maãu vôùi nhau, haõy xeáp caùc giaù trí coù cöôøng ñoä taêng hay giaûm daàn theo thö töï. * Phöông phaùp xeáp thö töï Haõy xeáp thöù töï caùc maãu ñöôïc kyù hieäu baêng maõ soá theo cöôøng ñoä taêng hoaëc giaûm daàn ñoái vôùi moät chæ tieâu naøo ñoù. * Phöông phaùp so saùnh ña Trong phöông phaùp so saùnh ña, coù moät maãu chuaån kyù hieäu R vaø nhieàu maãu khaùc kyù hieäu baèng maõ soá. Haõy so saùnh töøng maãu coù maõ soá vôùi maãu chuaån vaø cho bieát maãu naøo gioáng hoaëc khaùc (hôn hoaëc keùm veà cöôøng ñoä) so vôùi maãu chuaån. * Phöông phaùp moâ taû vò Trong phöông phaùp naøy, chöõ hoaëc soá vôùi thang thích öùng ñöôïc duøng ñeå moâ taû muøi vò cuûa caùc saûn phaåm thöïc phaåm. Vôùi phöông phaùp naøy, coù theå xaùc ñònh ñöôïc söï sai bieät khaù nhoû giöõa hai maãu, noàng ñoä pha troän, möùc ñoä gioáng nhau, hoaëc caùc chæ tieâu caûm quan toång theå ñoái vôùi saûn phaåm. Caùc kieán thöùc veà muøi vò phaûi ñöôïc naém vöõng ñeå moâ taû, vì trong tröôøng hôïp naøy khoâng aùp duïng phaân tích thoáng keâ. Caùc caûm quan vieân phaûi ñöôïc huaán luyeän kyõ, coù trình ñoä cao. Phần 1:Tổng quan tài lieäu CBHD Tiến sĩ Hoaøng Quoác Khaùnh Hoïc vieân Hoaøng Thuïy Phöông Linh 38 * Phöông phaùp pha loaõng Phöông phaùp pha loaõng duøng ñeå xaùc ñònh giaù trò ngöôõng caûm phaùt hieän vaø ngöôõng caûm phaân bieät cuûa moät saûn phaåm. phöông phaùp naøy söû duïng caùc chaát vò chuaån ñeå pha loaõng vôùi caùc noàng ñoä khaùc nhau. Haõy neám nhöõng maãu coù noàng ñoä taêng daàn cho ñeán luùc phaùt hieän ñöôïc vò töông öùng. * Phöông phaùp cho ñieåm Caùc maãu coù kyù hieäu baêng maõ soá ñöôïc ñaùnh giaù vaø ñöôïc cho ñieåm theo moät thang ñieåm ñaõ ñöôïc moâ taû. Phöông phaùp naøy ñöôïc duøng phoå bieán ôû nöôùc ta ñeå ñaùnh giaù chaát löôïng saûn phaåm thöïc phaåm, do ñoù seõ ñöôïc trình baøy chi tieát ôû muïc 3-5. 1.8.2 Caùc phöông phaùp öu tieân Khaùc vôùi caùc phöông phaùp sai bieät, caùc phöông phaùp öu tieân duøng ñeå kieåm tra theo thò hieáu. Caâu traû lôøi sau khi kieåm tra thöôøng laø “thích” hoaëc “khoâng thích” ôû caùc möùc ñoä khaùc nhau. * Phöông phaùp so saùnh ñoâi Trong phöông phaùp so saùnh ñoâi ñeå kieåm tra thò hieáu, soá maãu gioáng nhö phöông phaùp so saùnh ñoâi sai bieät. Ngöôøi ñöôïc hoûi yù kieán seõ choïn maãu naøo hoï thích nhaát. * Phöông phaùp cho ñieåm Coù raát nhieàu loaïi thang ñeå moâ taû möùc ñoä thích hoaëc khoâng thích ñoái vôùi moät saûn phaåm. caùc thang ñöôïc hình thaønh baêng caùc töø moâ taû nhö “tuyeät”, “raát toát”, “toát”, “keùm” hay töông töï. Tuy nhieân, thang ñieåm coù theå ñöôïc quan taâm nhaát trong nhöõng naêm qua laø thang ñieåm “thích thuù” 9 ñieåm ñöôïc vieän thöïc phaåm Quatermaster (Myõ) ñeà xuaát. Phaûi Phần 1:Tổng quan tài lieäu CBHD Tiến sĩ Hoaøng Quoác Khaùnh Hoïc vieân Hoaøng Thuïy Phöông Linh 39 caàn raát nhieàu coâng phu ñeå tìm ra caùc töø ngöõ thích hôïp cho con ngöôøi nhaän xeùt veà söï thích thuù ñoái vôùi saûn phaåm thöïc phaåm. Chín khaùi nieäm ñoù laø: 1- Thích nhaát (like extremely) 2- Raát thích (like very much) 3- Thích vöøa phaûi (like moderately) 4- Hôi thích (like slightly) 5- Khoâng thích, khoâng chaùn (neither like no dislike) 6- Hôi chaùn (dislike slightly) 7- Khaù chaùn (dislike moderately) 8- Raát chaùn (dislike very much) 9- Chaùn nhaát (dislike extremely) Caùc khaùi nieäm ñöôïc ñaùnh soá thöù töï töø 1 (thích nhaát) ñeán 9 (chaùn nhaát) * Phöông phaùp xeáp thöù töï Gioáng nhö phöông phaùp xeáp thöù töï ñeå ñaùnh giaù sai bieät, nhöng khi xeáp thöù töï, haõy xeáp theo thöù töï moâ taû baèng töø nhö- thích nhaát, nhì, ba, tö… 1.8.3 Phöông phaùp thaêm doø thò hieáu ngöôøi tieâu duøng Phöông phaùp thaêm doø thì hieáu ngöôøi tieâu duøng ñöôïc aùp duïng ñeå xaùc ñònh möùc ñoä chaáp nhaän ñoái vôùi moät saûn phaåm. Suy cho cuøng, soá phaän cuûa moät saûn phaåm thöïc phaåm phuï thuoäc vaøo söï chaáp nhaän cuûa ngöôøi tieâu duøng, cho neân nghieân cöùu möùc ñoä chaáp nhaän cuûa ngöôøi tieâu duøng laø raát caàn thieát. Nghieân cöùu thaêm doø ngöôøi tieâu duøng khaùc haún vôùi ñaùnh giaù trong phoøng thí nghieäm, nôi caùc thaønh vieân hoäi ñoàng chöa caàn thieát phaûi döï tính ñeán phaûn öùng cuûa ngöôøi tieâu duøng. Lyù töôûng nhaát trong hoaït ñoäng thaêm doø thò hieáu ngöôøi tieâu duøng laø caàn coù söï tham gia cuûa nhieàu ngöôøi ôû nhieàu vuøng ñòa lyù khaùc nhau. Vì nhöõng lyù do neâu Phần 1:Tổng quan tài lieäu CBHD Tiến sĩ Hoaøng Quoác Khaùnh Hoïc vieân Hoaøng Thuïy Phöông Linh 40 treân, phöông phaùp thaêm doø thò hieáu ngöôøi tieâu duøng phaûi ñöôïc moät cô quan ñaëc bieät tieán haønh. 1.8.4 ÖÙng duïng caùc phöông phaùp caûm quan Tuøy theo muïc ñích vaø yeâu caàu, ñaùnh giaù caûm quan ñöôïc aùp duïng trong caùc tröôøng hôïp sau: - Trong saûn xuaát: Nhaèm theo doõi söï bieán ñoåi chaát löôïng saûn phaåm trong suoát quaù trình saûn xuaát cho ñeán luùc saûn phaåm xuaát xöôûng. Thoâng thöôøng trong saûn xuaát, caùc maãu nguyeân lieäu, baùn thaønh phaåm hay thaønh phaåm trong daây chuyeàn ñöôïc kieåm tra, so saùnh vôùi caùc maãu chuaån ñöôïc taïo ra trong quaù trình nghieân cöùu vaø ñöôïc thò tröôøng chaáp nhaän. - Trong nghieân cöùu: Ñöôïc tieán haønh ôû nhöõng phoøng kyõ thuaät cuûa caùc xí nghieäp, caùc trung taâm nghieân cöùu hoaëc caùc tröôøng, vieän. Ñoái vôùi caûm quan trong nghieân cöùu, caàn phaùt hieän nhöõng öu ñieåm hoaëc nhöôïc ñieåm cuûa saûn phaåm ñeå caûi tieán coâng thöùc pha cheá, qui trình coâng ngheä hoaëc ñeå tìm moät saûn phaåm môùi. - Trong thöông maïi: ñaùnh giaù caùc saûn phaåm trong caùc cuoäc trieån laõm, hoäi chôï ñeå xeùt thöôûng. Caùc chuyeân gia phaûi ñöôïc huaán luyeän thaønh thaïo, caùc ñieàu kieän kyõ thuaät ñeå tieán haønh caûm quan phaûi ñöôïc tuaân thuû ñeå caùc keát quaû ñöôïc tin caäy. - Trong huaán luyeän: Ñeå ñaøo taïo chuyeân gia, luyeän taäp caùc giaùc quan, thoâng thaïo caùc phöông phaùp, thao taùc vaø xöû lyù keát quaû. - Trong thaêm doø: Ñeå chuaån bò hoaëc tìm hieåu thì tröôøng ñoái vôùi nhöng saûn phaåm ñang saûn xuaát hoaëc giôùi thieäu saûn phaåm môùi. Trong caùc tröôøng hôïp noùi treân, ñaùnh giaù caûm quan ñöôïc söû duïng vôùi 5 muïc ñích sau: 1) Xaùc ñònh thò hieáu cuûa ngöôøi tieâu duøng Phần 1:Tổng quan tài lieäu CBHD Tiến sĩ Hoaøng Quoác Khaùnh Hoïc vieân Hoaøng Thuïy Phöông Linh 41 Ngöôøi tieâu duøng (khoâng ñöôïc huaán luyeän) seõ choïn maãu naøo hoï thích nhaát hoaëc maãu naøo ñöôïc hoaëc khoâng ñöôïc chaáp nhaän. Thöôøng coù xu höôùng ghi nhaän theo yù kieán cuûa ngöôøi tieâu duøng veà vieäc caûi tieán saûn phaåm. 2) Phaùt hieän söï sai bieät Traùi vôùi tröôøng hôïp xaùc ñònh thò hieáu, chæ caàn moät soá ít kieåm nghieäm vieân coù trình ñoä cao veà caûm quan ñeå xaùc ñònh söï sai bieät. Ñoä chính xaùc caàn thieát coù theå ñaït ñöôïc, neáu vieäc thöû nghieäm ñöôïc laëp laïi nhieàu laàn. 3) Sai bieät öu tieân Keát hôïp hai muïc ñích treân trong caùc tröôøng hôïp nghieân cöùu saûn phaåm môùi, caàn so saùnh nhieàu maãu vôùi nhau, hoäi ñoàng coù theå goàm töø 8 ñeán 20 ngöôøi coù kinh nghieäm, vöøa coù khaû naêng ñaïi dieän sô boä cho thò hieáu ngöôøi tieâu duøng, vöøa xaùc ñònh ñöôïc nhöõng sai bieät giöõa caùc maãu thöû. 4) Choïn maãu hoaëc qui trình toát nhaát Khi nhaø saûn xuaát thöïc phaåm muoán so saùnh saûn phaåm cuûa mình vôùi saûn phaåm cuûa caùc ñoái thuû hoaëc trong tröôøng hôïp thieát keá saûn phaåm, nhaø saûn xuaát caàn coù moät qui trình saûn xuaát toái öu, hoï coù theå söû duïng hoäi ñoàng “sai bieät öu tieân” nhö ñaõ neâu treân ñaây. Tuy nhieân caùc maãu phaûi ñöôïc xeáp thöù töï theo moät söï öu tieân hoaëc moät cöôøng ñoä naøo ñoù, thay vì cho ñieåm. 5) Xaùc ñònh möùc ñoä chaát löôïng Ñaây laø hình thöùc ñaùnh giaù ñöôïc söû duïng nhieàu nhaát. Muïc ñích ñaùnh giaù khoâng phaûi chæ ñeå so saùnh xem maãu naøy vôùi maãu khaùc, toát hôn hay xaáu hôn maãu kia maø theâm vaøo ñoù coøn phaûi xem xeùt maãu ñöôïc ñaùnh giaù ñaït ñöôïc möùc ñoä naøo cuûa moät thang ñieåm tuyeät ñoái naøo ñoù. Beân caïnh caùc saûn phaåm thöïc phaåm, phöông phaùp caûm quan (ngoaïi quan) coøn ñöôïc duøng ñeå ñaùnh giaù caùc chæ tieâu thaåm myõ cuûa caùc saûn phaåm tieâu duøng khaùc.